CN116970081A - 一种抗人源cd132的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗人源CD132的单克隆抗体及其应用。本发明通过噬菌体筛选的方式，获得了可以靶向人CD132的单克隆嵌合体2D4和/或5H10，这两种抗体亲和力强，可以选择性抑制IL‑4、IL‑7、IL‑9、IL‑15和IL‑21。因此，可用于预防、中和或治疗与IL‑4、IL‑7、IL‑9、IL‑15和/或IL‑21细胞因子受体相关的自身免疫性疾病治疗药物中。其中，抗体2D4对IL‑21的抑制活性强于5H10，5H10对IL‑15的抑制活性弱于2D4。因此，2D4可能对于治疗以IL‑21大量分泌为重要病理生理改变的自身免疫性疾病更有价值，而5H10对IL‑15的弱抑制作用有利于保留自然杀伤细胞的功能，从而减轻该抗体可能对人体正常防御功能的过度抑制作用。

Description

一种抗人源CD132的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗人源CD132的单克隆抗体及其应用。
背景技术
CD132(IL2Rγ)，即白细胞介素2(interleukin-2，IL-2)受体的γ亚基，该亚基同时也是以下6种细胞因子受体复合物的γ亚基：IL2，IL-4，IL-7，IL-9，IL-15，IL-21。因此也被称为γc(commonγchain)。CD132在免疫细胞的发育、增殖、活化和免疫应答中发挥重要作用，广泛表达于多种免疫细胞类型，包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和树突状细胞等，尤其在T细胞、B细胞中优势表达。它与其他亚单位结合形成复合物，如IL-2/IL-15受体β链(IL-2/IL-15receptorβchain)、IL-4受体α链(IL-4receptorαchain)和IL-7受体α链(IL-7receptorαchain)等。这些复合物的形成促进了细胞间的信号传递和细胞因子的结合，进而调控细胞的增殖、分化和免疫功能。
与CD132相关的这6个细胞因子均在不同的炎症性疾病中发挥作用，其中阻断IL-21通路在自身免疫性疾病中的作用已经被广泛研究和应用。IL-21直接作用于B细胞，促进B细胞增殖、分化和抗体产生。IL-21是生发中心反应和生发中心B细胞形成和功能维持的主要调节剂，并在浆母细胞和浆细胞的分化和类别转换(CSR)中发挥核心作用。因此阻断IL-21在多种T、B细胞功能紊乱导致的自身免疫病中具有治疗作用。如在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)中，IL-21参与破坏性关节炎的发展。抑制IL21信号通路在RA治疗中显示出一定的疗效，可减轻关节炎症，改善关节功能。同时研究表明，阻断IL-21通路能够减轻干燥综合征(Sjogren's syndrome，SS)患者腺体的损伤。IL21在狼疮肾炎的的病理过程中发挥重要作用，包括促进炎症反应，加速肾脏损伤。阻断IL-21通路对狼疮肾炎的治疗具有潜在作用。IL-4在B细胞活化、存活和分化中起关键作用。它促进B细胞的存活，刺激记忆B细胞和分泌抗体的浆细胞的分化，驱动免疫球蛋白的类别转换。IL4刺激B细胞产生IgE抗体，在特应性皮炎、哮喘等过敏性疾病的发生发展中发挥重要作用，阻断IL-4疗法已用于治疗哮喘和过敏性疾病。而炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)的疾病发展则涉及IL21、IL7和IL9等炎性因子的上调，导致肠道屏障的破坏。
而作为上述炎性因子的共亚基，以CD132为靶点是多种自身免疫性疾病，尤其是类风湿关节炎、系统性红斑狼疮和炎症性肠病患者治疗的新方向。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种特异性高、亲和力强，阻断活性强的抗CD132的单克隆抗体，有助于抗CD132治疗的进一步发展，并提供更多临床和科研的检测选择。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种抗人源CD132的单克隆抗体，所述的单克隆抗体特异性结合人CD132，该抗体由轻链和重链组成。
其中，所述的轻链包含轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述的重链包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3。
具体的，所述的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:9-11所示；HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:4-6所示(第一组2D4)；
或者，所述的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:57-59所示；HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:52-54所示(第二组5H10)。
其中，所述的轻链，包含轻链可变区；所述的重链包含重链可变区。
具体的，
第一组2D4：轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，对应的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，对应的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
第二组5H10：轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:55所示，对应的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.56所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示，对应的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.51所示。
其中，所述的单克隆抗体的轻链恒定区为κ轻链，重链恒定区为IgG4。
具体的，所述得单克隆抗体的轻链恒定区和所述的单克隆抗体的重链恒定区为人源。
具体的，所述的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:80所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示；所述的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:78所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.79所示。
本发明还提供了编码上述单克隆抗体的核苷酸分子。
具体的，所述核苷酸分子包括编码本发明所述的单克隆抗体的核苷酸序列。
本发明还提供了一种表达上述核苷酸分子的重组DNA表达载体。
具体的，所述的重组DNA表达载体的DNA序列中包含编码抗人CD132抗体的上述重链可变区、重链恒定区、轻链可变区和轻链恒定区的氨基酸序列。
本发明还提供了含有上述核酸分子或重组DNA表达载体的宿主细胞。
具体的，所述的宿主细胞为哺乳动物细胞。
优选的，所述的哺乳动物细胞为HEK293细胞、CHO细胞或NS0细胞中的任意一种。
更优选的，所述的哺乳动物细胞为CHO细胞中的CHO-S细胞。
上述单克隆抗体在制备检测试剂或试剂盒中的应用也在本发明所保护的范围之内。
其中，所述的检测试剂或试剂盒中包含所述的单克隆抗体2D4和/或5H10。
上述单克隆抗体在制备用于消除、抑制或降低CD132活性的药物中的应用也在本发明所保护的范围之内。
上述单克隆抗体在制备用于预防、中和或治疗自身免疫性疾病治疗药物中的应用也在本发明所保护的范围之内。
其中，所述的自身免疫性疾病为与IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和/或IL-21细胞因子受体相关的免疫性疾病。
具体的，在一些实施例中，本发明所筛选得到的可以靶向结合人CD132的嵌合体抗人CD132抗体5H10和嵌合体抗人CD132抗体2D4均可以抑制IL-7刺激人外周血CD4+细胞下游STAT5磷酸化；可以抑制IL-21刺激人外周血CD4+细胞下游STAT3磷酸化；可以抑制IL-4刺激Ramos细胞表达CD23；可以抑制IL-15和IL-21刺激NK92细胞释放IFN-γ，其中2D4对IL-21的抑制作用强于5H10，而5H10对IL-15的抑制作用弱于2D4；可以抑制IL-9刺激M07E细胞增殖。
有益效果：
(1)本发明通过噬菌体筛选的方式，获得了两种(2D4和/或5H10)可以靶向人CD132的单克隆嵌合体，这两种抗体亲和力强，可以选择性抑制IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21。因此两种抗体都可用于预防、中和或治疗与IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和/或IL-21细胞因子受体相关的自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等)治疗药物中。
(2)本发明所筛选的两种抗体，2D4对IL-21的抑制活性强于5H10，而5H10对IL-15的抑制活性弱于2D4。因此，2D4可能对于治疗以IL-21大量分泌为重要病理生理改变的自身免疫性疾病(如狼疮肾炎)更有价值，而5H10对IL-15的弱抑制作用有利于保留自然杀伤细胞的功能(比如人体内NK细胞的存活高度依赖IL-15)，从而减轻该抗体可能对人体正常防御功能的过度抑制作用。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1HEK293细胞重组表达的人CD132胞外区蛋白抗原
图2-1初筛嵌合体抗人CD132抗体在恒定IL-7刺激下对人CD4+T细胞STAT磷酸化的抑制
图2-2初筛嵌合体抗人CD132抗体在恒定IL-21刺激下对人CD4+T细胞STAT磷酸化的抑制
图3初筛嵌合体抗人CD132抗体在恒定IL-4刺激下抑制Ramos细胞表达CD23
图4-1嵌合体抗人CD132抗体2D4和5H10在恒定IL-15刺激下对NK92细胞分泌IFN-γ的抑制
图4-2嵌合体抗人CD132抗体2D4和5H10在恒定IL-21刺激下对NK92细胞分泌IFN-γ的抑制
图5嵌合体抗人CD132抗体2D4和5H10在恒定IL-7刺激下对人CD4+T细胞STAT磷酸化的抑制
图6嵌合体抗人CD132抗体2D4和5H10在恒定IL-4刺激下抑制Ramos细胞表达CD23
图7嵌合体抗人CD132抗体2D4和5H10在恒定IL-9刺激下抑制M07E细胞增殖
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：人CD132胞外区蛋白在真核细胞的重组表达
合成含人CD132全长(Uniprot P31785，23-369)的质粒基因(HG10555-M，义翘神州)。以该质粒为模板，设计上游引物5’-atgttgaagccatcattaccattca-3’和下游引物5’-cgtggttatctctgttggctccatggg-3’，PCR扩增人CD132胞外片段(PCR反应体系：cDNA 2μl、上游引物1μl、下游引物1μl、Taq plus master mix 10μl、无酶水6μl。PCR扩增条件：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，循环35次；72℃5min；4℃维持)。扩增产物经NEBuilderHiFi DNA Assembly Master Mix(购于NEB，Cat：M0530L)酶连后，克隆到由康诺亚公司自主构建的真核表达质粒pSect-Nhis系统(c端6×his tag融合蛋白)中，得到pSect-Nhis-CD132重组质粒。
通过300μl聚乙烯亚胺PEI(购于biohub)携带验证成功的100μl重组质粒(PEI：重组质粒体积比＝3：1)瞬转入3×107个293细胞中(购于ATCC)，在37℃，5％CO2条件下培养4天。培养结束后将发酵液在4℃、4500rpm条件下离心30min，用0.22μm针头滤器过滤上清液。采用镍柱亲和层析纯化发酵液，然后换液到PBS缓冲液中。通过SDS-PAGE还原验证蛋白质量，如图1所示，为人CD132(cHis)重组蛋白SDS-PAGE结果，可以看出纯化后的人CD132重组蛋白纯度达到95％，目的条带位于55kDa左右，符合预期。所述的人CD132重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
LNTTILTPNGNEDTTADFFLTTMPTDSLSVSTLPLPEVQCFVFNVEYMNCTWNSSSEPQPTNLTLHYWYKNSDNDKVQKCSHYLFSEEITSGCQLQKKEIHLYQTFVVQLQDPREPRRQATQMLKLQNLVIPWAPENLTLHKLSESQLELNWNNRFLNHCLEHLVQYRTDWDHSWTEQSVDYRHKFSLPSVDGQKRYTFRVRSRFNPLCGSAQHWSEWSHPIHWGSNTSKENPFLFALEA
实施例2：动物免疫
取50μg实施例1纯化后的人CD132重组蛋白作为抗原与等量免疫佐剂(福氏佐剂)混合，取5只6周龄雌性Balb/C小鼠进行腹部皮下免疫注射。在初次免疫后，每隔两周进行一次加强免疫，四次免疫后，尾部取血测血清效价；或者初次免疫后，每隔一周使用基因枪进行加强免疫，以人CD132表达质粒混合金粉，在400psi压力下，对小鼠腹部裸露皮肤进行轰击，共免疫9次。
实施例3：抗体筛选
(1)制备抗体噬菌体展示文库
在实施例2对雌性Balb/C小鼠尾静脉冲击免疫后或基因枪最后冲击免疫后3天，断颈处死上述小鼠，收集小鼠脾脏与外周淋巴结；在PBS缓冲液中碾磨得到富含B细胞的悬浮液，离心收集B细胞，用Trizol RNA提取试剂盒从B细胞中提取总RNA，再用逆转录试剂盒(SuperScriptTM First-Strand Synthesis System,Cat:18080051)，利用康诺亚公司自主设计的重链特异性引物逆转录得到抗体重链cDNA文库(逆转录10μl体系：RNA 3μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、10mM dNTP Mix 1μl、Super ScriptIII RT 0.5μl、RNase OUT0.5μl、0.1M DTT 1μl、25mM MgCl2、10×RT buffer 1μl、无酶水补至10μl。逆转录条件：50℃反应50min，85℃终止反应5min后，立即插入冰中)。再以重链cDNA为模板，利用康诺亚公司自主设计的重链可变区引物PCR扩增抗体重链可变区片段。以此类似，利用轻链特异性引物逆转录得到抗体轻链cDNA库，以轻链cDNA为模板，利用康诺亚公司自主设计的轻链可变区引物PCR扩增抗体轻链可变区片段。利用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，使用DNA片段纯化试剂盒(Takara公司)对PCR产物(目的抗体基因片段)进行纯化。用限制性内切酶BspQI和SfiI双酶切纯化后的轻、重链片段，将其与经过相同双酶切的pDS载体(购于Addgene)进行连接得到pDS-Fab质粒。电转化(电转化条件：50μl感受态细胞+10ng质粒，电压2.5kV，电容25uF，电阻200Ω)入大肠杆菌TG1感受态细胞(购于TransGen)，电转后加入5-10mL LB培养基(含100μg/mL氨苄)，37℃振荡培养1小时，转化菌涂布LB平板(含100μg/mL氨苄)，37℃培养过夜。第二天统计平板上各稀释度(最终稀释浓度分别为：1:102、1:104、1:106、1:108)出现的菌落数以计算库容。
扩大培养已成功转入重组质粒pDS-Fab的TG1单菌落，37℃，220r/min培养至OD600nm达0.4-0.6，加入辅助噬菌体VCSM13(购于碧云天，噬菌体与细菌的数量比值为20:1)，37℃静置培养40min。将静置培养得到的培养物于10000rpm离心30min，重悬沉淀，30℃、220r/min过夜培养后，8000rpm离心取上清，并加入1/5体积的PGE/Nacl试剂，充分混匀，冰上孵育1h，8000rpm，4℃离心20min，收集沉淀，并以pH7.2的0.02mol/L PBS重悬，即为基于噬菌体VCSM13的小鼠鼠Fab噬菌体展示文库。取10μL测定滴度，其余以甘油稀释分装于-80℃保存备用，库容量最终为6×109。
以上重链、轻链所涉及的PCR反应体系如下：2×Dream Taq Green PCR MasterMix12.5μl、F primer(10μm)0.25μl、R primer(10μm)0.25μl、Template(cDNA)2μl、ddH2O10μl；所用PCR扩增条件为：95℃反应5min，再以95℃30S，58℃30S，72℃30S为一个循环，共重复30个循环，以72℃延伸10min，4℃保存。
(2)ELISA筛选结合人CD132的抗体
利用一系列重组人CD132蛋白的选择循环，由小鼠鼠Fab噬菌体展示文库里分离出抗人CD132的特异性Fab抗体。简而言之，取25μl 1mg/ml人CD132重组蛋白，加入到5ml PBS包被液(即0.05M pH9.5碳酸盐包被缓冲液)中，上下颠倒混匀，即为5μg/ml抗原包被液。将上述配制的人CD132抗原包被液包被至免疫管(Immunotube Maxisorp,Nunc)上，4℃过夜。用PBS缓冲液洗涤免疫管，然后用5％BSA封闭液封闭2小时。将利用终浓度为1％BSA封闭液配制的纯化噬菌体展示文库加入免疫管中，使之与包被的抗原结合1小时。用PBS-吐温(0.5％v/v)和PBS缓冲液进行多轮洗涤以除去未结合的噬菌体，用100mM三乙胺洗脱结合的噬菌体颗粒，然后用1M Tris-HCL(pH 7.4)缓冲液中和后感染大肠杆菌TG1细菌，以进行下一轮富集筛选。二轮筛选后，挑取1680个单克隆至96孔U型孔板中进行IPTG诱导表达，取上清液用于后续ELISA检测筛选。
取10μl 1mg/ml人CD132溶液，加入10ml 0.05M PH9.5碳酸盐包被缓冲液中，上下颠倒混匀，即为1μg/ml抗原包被液。将配好的抗原包被液加入96孔酶标板(ThermoMaxisorp)中，每孔100μl。将96孔酶标板用封板膜包裹后，置于4℃中孵育过夜。第二天取出酶标板，置于洗板机(BioTek,Synergy HT)上，PBS缓冲液洗涤3次；加入含2％BSA封闭液的PBS缓冲液，每孔200μl，室温封闭2小时。然后弃去其中的封闭液，PBS缓冲液重复洗涤3次。将上述诱导后的上清液依次加入相应的孔中，每孔50μl，室温孵育1小时，弃去上清，PBS-T、PBS缓冲液分别重复洗涤3次。向96孔酶标板中逐排加入TMB溶液(Sigma,Cat:T2885)，每孔100μl。37℃放置5分钟，立即向96孔酶标板中加入50μl 2M浓硫酸溶液终止反应。将96孔酶标板置于酶标仪(BioTek，Synergy HT)中，读取OD450的值，收集数据并使用Grap hPadPrism 5软件计算结果。结果发现，挑取的1680个单克隆进行IPTG诱导后，经ELISA检测到其中153个单克隆可以与人CD132抗原结合。
实施例4：嵌合体抗人CD132抗体的基因克隆和表达
(1)测序
提取上述153个阳性单克隆质粒，交由擎科生物公司测序后，根据抗体可变区差异程度共挑选出8个候选阳性克隆(2D4、2F10、2G4、4B9、5E11、5H10、6G6、6H10)用于后续构建嵌合抗体。得到的候选阳性克隆可变区序列为：
表1候选人CD132抗体的可变区序列(数字前面省略SEQ ID NO.**)
1)克隆2D4：
2D4重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码核苷酸如SEQ ID NO.3所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.4、5、6所示。
<----------FR1---------->CDR1<----FR2---->CDR2<----
EVQLKQSGAELVKPGASVKLSCTTSGFNIEDIYLHWVKQRPELGLEWIGRIDPANGKSNYDPKFQGKATIT
--------FR3------------>CDR3<---FR4--->
ADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCAALRFFGLDYWGQGTSVTVSS
核苷酸序列
GAGGTGCAGCTGAAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAACTTCTGGCTTCAACATCGAAGACATCTATCTACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACTGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAAAAGTAATTATGATCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCCGCACTACGATTCTTTGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
2D4轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其编码核苷酸如SEQ ID NO.8所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.9、10、11所示。
<--------FR1------->CDR1<-----FR2---->CDR2<------------
EMVLTQSPTIMSASPGEKVTISCSATSSVSYMYWYQQKPGSSPEPWIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYS
-FR3--------->CDR3<--FR4-->
LTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK
核苷酸序列
GAAATGGTTCTCACCCAGTCTCCAACAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATATCCTGCAGTGCCACCTCAAGTGTAAGTTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCGAACCCTGGATTTATCGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAA
2)克隆2F10：
2F10重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，其编码核苷酸如SEQ ID NO.13所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.14、15、16所示。
<----------FR1---------->CDR1<----FR2---->CDR2<----
EVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFRDYGMAWVRQAPGKGPEWVAFISNLAYSIYYADTVTGRFTIS
--------FR3------------>CDR3<---FR4-->
RENAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYCARNGVDGHWYFDVWGAGTTVTVSS
核苷酸序列
GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCCGTGACTACGGAATGGCGTGGGTTCGACAGGCTCCAGGGAAGGGGCCTGAGTGGGTAGCATTCATTAGCAATTTGGCATATAGCATCTACTATGCAGACACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCTAGAGAGAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGGAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACAGCCATGTACTACTGTGCAAGGAATGGGGTCGACGGCCACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
2F10轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，其编码核苷酸如SEQ ID NO.18所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.19、20、21所示。
<--------FR1------->CDR1<-----FR2---->CDR2<-------
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASVSCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSG
---FR3------------>CDR3<--FR4-->
SGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPITFGAGTRLEIK
核苷酸序列
GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCGTCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATATACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGATCACGTTCGGTGCTGGGACCAGACTGGAAATAAAA
3)克隆2G4：
2G4重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示，其编码核苷酸如SEQ ID NO.23所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.24、25、26所示。
<----------FR1---------->CDR1<----FR2---->CDR2<----
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGYTFSTYGMSWVRQTPDKRLELVAAISSNGGSTYYPDSVKGRFTIS
--------FR3------------>CDR3<---FR4-->
RDDAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCTRRTGTPAMDYWGQGTSVTVSS
核苷酸序列
GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGCGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATATACTTTCAGTACCTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTTGGTCGCAGCCATTAGTAGTAATGGTGGCAGTACCTATTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATTTCCAGAGACGATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTACAAGAAGAACTGGGACGCCTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
2G4轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示，其编码核苷酸如SEQ ID NO.28所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.29、30、31所示。
<--------FR1------->CDR1<----FR2---->CDR2<------------
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMHWYQQKPGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYS
-FR3--------->CDR3<--FR4-->
LTISSMEAEDAATYYCHQRSSYPLTFGAGTKLELK
核苷酸序列
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCATCAGCGGAGTAGTTACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
4)克隆4B9：
4B9重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示，其编码核苷酸如SEQ ID NO.33所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.34、35、36所示。
<----------FR1---------->CDR1<----FR2---->CDR2<----
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTPSGFNIEDTYIHWVKQRPERGLEWIGRIDPANGNAKYDPRFQGKANIP
--------FR3------------>CDR3<---FR4-->
ADTSSNTVYLQLSSLTSEDTAVYYCASTRHYGMDYWGQGTSVTVSS
核苷酸序列
GAGGTCCAACTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACACCTTCTGGCTTCAACATTGAAGACACCTATATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACGGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATGCTAAATATGACCCGAGGTTCCAGGGCAAGGCCAATATACCAGCAGACACATCCTCCAACACAGTCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCCTCTACGAGACACTATGGTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
4B9轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示，其编码核苷酸如SEQ ID NO.38所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.39、10、40所示。
<--------FR1------->CDR1<----FR2---->CDR2<-------------
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTISCSASSSVSYMYWFQQKPGSSPQPWIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSFS
-FR3--------->CDR3<--FR4-->
LTISSMEAEDAATYYCQQYHSYPLTFGAGTKLEIK
核苷酸序列
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATTTCCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCCAACCCTGGATTTATCGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTTCTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTATCATAGTTACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATCAAA
5)克隆5E11：
5E11重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示，其编码核苷酸如SEQ ID NO.42所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.43、44、26所示。
<----------FR1---------->CDR1<----FR2---->CDR2<----
EVKLVESGGGRVQPGGSLKLSCAVSGITFRNYGMSWVRQTPDKRLELVAAINSNGGSTYYPDSVKGRFTIS
--------FR3----------->CDR3<---FR4-->
RDDAKKTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARRTGTPAMDYWGQGTSVTVSS
核苷酸序列
GAAGTGAAGCTGGTGGAGTCGGGGGGAGGCAGAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGAATCACTTTCAGAAACTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTTGGTCGCAGCCATTAATAGTAATGGTGGCAGCACCTATTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACGATGCCAAGAAAACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAAGGACTGGGACGCCCGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
5E11轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.45所示，其编码核苷酸如SEQ ID NO.46所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.47、48、49所示。
<--------FR1------->CDR1<----FR2---->CDR2<-------------
QIVLSQSPAIMSASPGERVTMTCSASSSISYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPARFSGSGSGTSYS
-FR3--------->CDR3<--FR4-->
LTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPLTFGAGTKLELK
核苷酸序列
CAAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAGGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATAAGTTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAAAGGAGTAGTTACCCACTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
6)克隆5H10：
5H10重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.50所示，其编码核苷酸如SEQ ID NO.51所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.52、53、54所示。
<----------FR1---------->CDR1<----FR2---->CDR2<----
EVQLQQSGAELVRPGTSVKMSCKAAGYTFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGGGYTNYNEKFKGKATLT
--------FR3------------>CDR3<---FR4-->
ADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARGDYGSSWFPYWGQGTLVTVSA
核苷酸序列
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTAAGGCCTGGGACTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTGCTGGATACACCTTCACTAACTACTGGCTAGGTTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGACTTGAGTGGATTGGAGATATTTACCCTGGAGGTGGTTATACTAATTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCCTCCAGCACTGCCTACATGCAGCTCAGTAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCAAGAGGGGACTACGGTAGTAGCTGGTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
5H10轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.55所示，其编码核苷酸如SEQ ID NO.56所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.57、58、59所示。
<--------FR1------->CDR1<----FR2---->CDR2<-------------
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDF
-FR3--------->CDR3<--FR4-->
TLSINSVETEDFGMYFCQQSDSWLTFGAGTKLEIK
核苷酸序列
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAAAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAATGTATTTCTGTCAACAGAGTGACAGCTGGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATCAAA
7)克隆6G6：
6G6重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.60所示，其编码核苷酸如SEQ ID NO.61所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.62、63、64所示。
<----------FR1---------->CDR1<----FR2---->CDR2<----
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRKKANNHATYYAESVKGRFT
---------FR3------------->CDR3<---FR4-->
ISRDDSKSSVYLQMNRLRAEDTGIYYCIRRGNYGVAYWGQGTLVTVSA
核苷酸序列
GAAGTGAAGCTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCTTGTGCTGCCTCTGGATTCACTTTTAGTGACGCCTGGATGGACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGAAAAAAAGCTAATAATCATGCAACATACTATGCTGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAGGTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTATCAGGCGAGGTAACTACGGGGTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
6G6轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.65所示，其编码核苷酸如SEQ ID NO.66所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.67、68、69所示。
<--------FR1------->CDR1<----FR2---->CDR2<------------
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVRITCKASQDVGTAVAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDF-FR3--------->CDR3<--FR4-->
TLTISNVQSEDLADYFCHQYRSYPTFGAGTKLEIK
核苷酸序列
GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGAATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGGGTACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAACAACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATTAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGATTATTTCTGTCACCAATATAGAAGCTATCCCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATCAAA
8)克隆6H10：
6H10重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.70所示，其编码核苷酸如SEQ ID NO.71所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.72、44、26所示。
<----------FR1---------->CDR1<----FR2---->CDR2<---
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSNYGMSWVRQTPDKRLELVAAINSNGGSTYYPGSVKGRFTIS
---------FR3----------->CDR3<---FR4-->
RDDAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCTRRTGTPAMDYWGQGTSVTVSS
核苷酸序列
GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTTGGTCGCAGCCATTAATAGTAATGGTGGCAGCACCTATTATCCAGGCAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACGATGCCAAGAACACCCTTTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTACAAGAAGAACTGGGACGCCTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
6H10轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.73所示，其编码核苷酸如SEQ ID NO.74所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.75、76、77所示。
<--------FR1------->CDR1<----FR2---->CDR2<--------
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSG
---FR3------------->CDR3<--FR4-->
SGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK
核苷酸序列
GATATTGTGATGACGCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
(2)构建嵌合抗体
分别将不同阳性克隆的重链可变区克隆入由康诺亚公司自主研发的含有人IgG4亚型重链恒定区(氨基酸和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.78-79所示)和调节元件的pHCT1s载体(购于Addgene)，以在哺乳动物细胞中表达完整的IgG4亚型重链。类似地，分别将不同阳性克隆的轻链可变区克隆入含有人IgGκ轻链恒定区(氨基酸和核苷酸序列分别如SEQ IDNO.80-81所示)和调节元件的pHCT2载体(购于Addgene)，以在哺乳动物细胞中表达完整的IgGκ轻链。经测序正确后转染入CHO-S哺乳动物细胞(购于ATCC)中，IgG经表达分泌入expiCHO表达培养基(购于gibco公司)中，合并收集上清，过滤后纯化。采用ProteinA层析纯化IgG，将培养上清液加载于大小合适的ProteinA柱子上，用50mM Tris-HCl pH8.0，250mMNaCl洗涤，用0.1M Glycine-HCl pH3.0将结合的IgG洗脱下来。利用浓缩管将蛋白超滤浓缩，检测OD280，通过分光光度法测定IgG的浓度，结果见下表2。
表2瞬转纯化抗体产量结果
(3)Fortebio抗体亲和力测定
在96孔板中任选一列加入PBS缓冲液，100μl/孔，将96孔板放入探针支架盒中，避免探针触碰到支架。用PBS缓冲液将biotin标记的固化物人CD132稀释至5μg/ml；取新的96孔板，按列加入稀释好的固化物，每孔加入100μl。用PBS缓冲液将抗体稀释至50μg/ml，然后按1:1梯度稀释，分别做50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、0μg/ml共6个浓度梯度，每孔加入100μl，根据具体分析物的结合能力可做适当调整。取新的96孔板，第1列和第2列加入PBS缓冲液，100μl/孔(基线和解离均为同一种缓冲液)，第3列加入稀释好的固化物，第4列加入梯度稀释的分析物，第11列为10mM HCL PH1.9，第12列为PBS缓冲液。SA探针与biotin固化物结合非常牢固，再生时，固化物仍然结合在探针上，因此只需固化一次即可重复使用。然后在Fortebio software软件中建立实验方法，之后运行实验程序检测。抗体亲和力检测结果见下表3。
表3抗体亲和力检测结果
编号 KD(nM) Kon(1/Ms) Kdis(1/s)
2D4 3.02 1.88E+5 5.68E-4
2F10 13.2 6.54E+4 8.62E-4
2G4 8.38 1.68E+5 1.41E-3
4B9 6.14 1.35E+5 8.30E-4
5E11 12.9 1.12E+5 1.44E-3
5H10 1.56 2.12E+5 3.31E-4
6G6 17.7 1.48E+5 2.62E-3
6H10 15.5 1.44E+5 2.24E-3
由表3可见，2D4、2F10、2G4、4B9、5E11、5H10共6个抗体的KD值均小于15nM，提示其对人CD132抗原亲和力较强。
实施例5：初步评估嵌合抗人CD132抗体对IL-7和IL-21信号传导的抑制作用
蛋白磷酸化流式细胞术可以同时分析细胞内磷酸蛋白和细胞表面标志物，以进一步分析目标细胞亚群中的细胞信号传导。因此可以运用该技术分析人外周血中CD4+的T细胞被γc家族的细胞因子刺激之后STAT磷酸化的强弱程度。
为了初步评估嵌合体抗人CD132抗体的体外特性，通过蛋白磷酸化流式细胞术测定测量实施例4中进一步选出的亲和力较强的6个嵌合体(2D4、2F10、2G4、4B9、5E11、5H10)阻断由IL-7和IL-21诱导的CD4+T细胞活化的能力。
通过密度梯度离心从新鲜全血中分离人外周血单个核细胞(PBMC)。将全血与PBS缓冲液以1：1稀释，添加至含有FicollPaquePLUS(Healthcare)的离心管中离心以分离PBMC。将含有PBMC的上层转移到新的离心管中，并用PBS缓冲液洗涤两次。然后将PBMC以浓度约5.0×106个细胞/mL重悬在RPMI 1640完全培养基(上海培源生物科技)中，平板接种在96孔板中(60μL细胞/孔；约30000个细胞/孔)。
在RPMI 1640完全培养基中制备抗体的连续稀释液，最终抗体浓度从200nM开始，共设置3个浓度，分别为200nM，20nM和2nM，并将其添加到上述接种好的PBMC细胞中(60μL)，制备PBMC细胞悬液。另取新的RPMI 1640完全培养基，在RPMI 1640完全培养基中制备固定的细胞因子浓度，并将其分别添加到上述PBMC细胞悬液中使得IL-7的最终浓度为0.6nM，IL-21的最终浓度为1nM，每个孔的最终体积为120μL。
在向PBMC细胞中依次添加抗体和细胞因子之后，将它们在37℃下孵育30分钟使得PBMC激活(STAT磷酸化)。然后通过向每个孔添加100μL 37℃的fixbufferⅠ(BD)停止刺激，并在37℃下孵育细胞10分钟(固定步骤)。然后用染色缓冲液洗涤细胞两次，每孔加入140μL-20℃的渗透缓冲液Ⅲ来透化细胞，冰上孵育30分钟。然后再用染色缓冲液洗涤两次。为了能够分析用于测量STAT磷酸化的CD4+T细胞群，用抗CD3-PE(BD；1/200)和相关的抗磷酸-STAT-AlexaFluor647(BD)的混合物对细胞染色。其中，-抗磷酸STAT3(1/10)：用于被IL-21刺激的细胞；-抗磷酸STAT5(1/20)：用于被IL-7刺激的细胞。将样品在室温下在暗处保持45分钟。然后对细胞离心，并用染色缓冲液洗涤两次。
使用HTS附件(BD)在LSRFortessaX-20细胞分析仪上获取样品数据。使用FlowJoX软件(TreeStar，OR)进行数据分析。将CD4+T细胞限定为完整细胞、单线态(singlet)、CD4+；并在该细胞群中分析STAT磷酸化(MFI＝平均荧光强度)。结果见图2-1和2-2。
从图中可以看出，嵌合体抗人CD132抗体2D4、4B9和5H10均可以抑制IL-7刺激人外周血CD4+细胞下游STAT5磷酸化以及IL-21刺激人外周血CD4+细胞下游STAT3磷酸化。
实施例6：初步评估嵌合抗人CD132抗体对IL4信号传导的抑制作用
IL-4可以刺激Ramos细胞表达CD23，故可以运用该特点评估抗体对IL-4信号传导的抑制作用。将Ramos细胞系(ATCC)用含10％FBS的RPMI 1640完全培养基于37℃、5％CO2条件下培养，控制细胞浓度为每1ml含有2×105-2×106个细胞，将其接种于96孔平底细胞培养板中，每孔100μl。再向每孔中分别加入200nM，20nM和2nM的抗人CD132抗体2D4、4B9和5H10。与细胞共孵育30分钟后，加入50μl终浓度为2.67nM的IL-4，于37℃、5％CO2条件下培养48小时。
将上述培养好的细胞转移至U型96孔细胞培养板中，于4℃、300g离心3分钟，弃上清，用流式缓冲液(含4％小牛血清的PBS缓冲液)洗涤细胞两次，每孔200μl。取封闭液(含有100μg/ml hIgG的缓冲液)50μl加入细胞中，冰浴封闭10分钟，300g离心3分钟弃上清，然后加入抗人CD23 FITC抗体稀释液(BD EBVCS-5)每孔50μl，冰浴封闭20分钟；300g离心3分钟弃上清后，流式缓冲液洗涤细胞两次，每孔200μl；取PI染色液加入细胞中，每孔100μl，冰浴避光5分钟，300g离心3分钟弃上清，每孔200μl流式缓冲液洗涤细胞两次后，再每孔100μlPBS缓冲液重悬细胞，流式细胞仪读取平均荧光强度，记录测定结果。结果如图3所示，嵌合体抗人CD132抗体2D4、5H10可以抑制IL-4刺激Ramos细胞表达CD23。
实施例7：嵌合体抗人CD132抗体2D4、5H10抑制NK92细胞分泌IFN-γ
用生长培养基(根据普诺赛的说明书制备，但不含IL-2)在96孔板中接种2×104个NK-92细胞(普诺赛CL-0530)，并在37℃下在5％CO2中孵育饥饿过夜。第二天，将抗人CD132抗体2D4、5H10分别在生长培养基(不含IL-2)中从400nM至0.2nM以3倍梯度连续稀释，添加到NK-92细胞中并孵育30分钟。孵育后，将2.5nM IL-15、250pM IL-21分别添加到含有不同抗体的NK-92细胞中。在37℃下，在5％CO2中孵育72h后，采用ELISA测IFN-γ的分泌。
使用人IFN-γELISA试剂盒(BD货号555142)，在96孔酶标板上以1:250包被捕获抗体(capture antibody)，4℃孵育过夜。次日PBS缓冲液洗涤3次后，用10％FBS室温封闭1小时，PBS缓冲液接着洗3次，然后分别加入100μl样品(细胞上清)和标准品，室温孵育2小时，然后用PBS缓冲液洗5遍，以1:250比例将5AV-HRP加入含0.4％的检测抗体(DetectionAntibody)的稀释液中。最后，室温孵育1小时，PBS缓冲液洗7遍，加入100μl显色液(TMB溶液，Sigma货号T2885)，37℃放置10分钟后加入50μl 2M浓硫酸溶液终止反应，立即放于酶标仪中读取OD450的值，图4-1至4-2表明，嵌合体抗人CD132抗体2D4和5H10均可以抑制IL-15和IL-21刺激NK92细胞释放IFN-γ，其中2D4对IL-21的抑制作用强于5H10，而5H10对IL-15的抑制作用弱于2D4。
实施例8：人CD4+T细胞(人PBMC)中STAT磷酸化的流式细胞术分析
为了进一步评估嵌合体抗人CD132抗体5H10和2D4的体外特性，通过蛋白磷酸化流式细胞术进一步测定它们阻断由IL-7诱导的CD4+T细胞活化的能力。且由于实施例7中已利用NK92细胞系系统评价了5H10和2D4对IL-21的抑制能力，故本次蛋白磷酸化流式细胞术仅进一步评估两种抗体对IL-7的抑制活性。
具体实验步骤详见实施例5，仅抗体浓度有所改变，在RPMI 1640完全培养基中制备抗体的连续稀释液，将抗体从200nM至0.03nM以3倍梯度连续稀释。
使用HTS附件(BD)在LSRFortessaX-20细胞分析仪上获取样品数据。使用FlowJoX软件(TreeStar，OR)进行数据分析。将CD4+T细胞限定为完整细胞、单线态(singlet)、CD4+；并在该细胞群中分析STAT5磷酸化(MFI＝平均荧光强度)，结果见图5。
从图中可以看出，抗人CD132抗体2D4和5H10均可以显著抑制IL-7刺激人外周血CD4+细胞下游STAT5磷酸化，且2D4的IC50值为1.14nM，5H10的IC50值为1.73nM。
实施例9：嵌合体抗人CD132抗体5H10和2D4抑制IL-4刺激Ramos细胞表达CD23
具体实验步骤同实施例6，仅抗体浓度有所改变，在RPMI 1640完全培养基中制备抗体的连续稀释液，将抗体从200nM至0.03nM以3倍梯度连续稀释。
结果如图6所示，抗人CD132抗体2D4和5H10显著抑制IL-4刺激Ramos细胞表达CD23。
实施例10：嵌合体抗CD132抗体5H10和2D4抑制IL-9刺激M07E细胞增殖
将M07E细胞系(ATCC)用含5％FBS浓度的RPMI 1640完全培养基于37℃、5％CO2条件下培养，控制细胞浓度为每1ml含有8×104个细胞，将其接种于96孔平底细胞培养板中，每孔100μl。再向每孔中分别加入50μl从200nM至0.064nM连续稀释的嵌合体抗人CD132抗体2D4和5H10，与细胞共孵育30分钟后，加入50μl终浓度为70pM的IL-9配体，于37℃、5％CO2条件下培养96小时。
取出细胞培养板在室温下平衡10分钟，使用96孔黑色平底微孔板(corning货号：3686)，每孔接种100μl培养后的细胞悬液。融解冻存的CellTiter-LumiTM发光法检测试剂(购于诺维赞公司)，平衡至室温。向每孔加入100μl CellTiter-LumiTM发光法检测试剂，室温振荡2分钟，以促进细胞的裂解。室温(约25℃)孵育10分钟，使发光信号趋于稳定。放于酶标仪中进行化学发光检测，结果如图7所示，从图7可以以看出，嵌合体抗CD132抗体2D4和5H10均可以抑制IL-9刺激M07E细胞增殖。
综上，本发明公开一种可以靶向结合人CD132的单克隆抗体，5H10和/或2D4抗体都可以抑制IL-7、IL-15、IL-21、IL-9和IL-4，其中5H10对IL-15的抑制作用弱于2D4，而2D4对IL-21的抑制作用强于5H10，2D4抗体对IL-21的抑制效果更卓越。因此，2D4可能对于治疗以IL-21大量分泌为重要病理生理改变的自身免疫性疾病(如狼疮肾炎)更有价值，而5H10对IL-15的弱抑制作用有利于保留自然杀伤细胞的功能(比如人体内NK细胞的存活高度依赖IL-15)，从而减轻该抗体可能对人体正常防御功能的过度抑制作用。
本发明提供了一种抗人源CD132的单克隆抗体及其应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一种抗人源CD132的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体特异性结合人CD132，该抗体由轻链和重链组成，
其中，所述的轻链包含轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述的重链包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3；
第一组：LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:9-11所示；HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:4-6所示；
或者，
第二组：LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:57-59所示；HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:52-54所示。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的轻链，包含轻链可变区；所述的重链包含重链可变区，
其中，第一组：轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
第二组：轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:55所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体的轻链恒定区为κ轻链，重链恒定区为IgG4。
4.一种编码权利要求1-3任意一项所述的单克隆抗体的核苷酸分子。
5.一种表达权利要求4所述的核苷酸分子的重组DNA表达载体。
6.一种含有权利要求5所述的重组DNA表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，优选HEK293细胞、CHO细胞或NS0细胞中的任意一种，更优选CHO细胞中的CHO-S细胞。
7.一种含有权利要求1-3任意一项所述的单克隆抗体的检测试剂。
8.权利要求1-3任意一项所述的单克隆抗体在制备用于消除、抑制或降低CD132活性的药物中的应用。
9.权利要求1-3任意一项所述的单克隆抗体在制备用于预防、中和或治疗自身免疫性疾病治疗药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的自身免疫性疾病为与IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和/或IL-21细胞因子受体相关的免疫性疾病。
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