CN116964453A - 用于对饮食品样本、环境样本或生物体样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供能够在短时间内简便且有效地对饮食品样本、环境样本或生物体样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测的方法。该方法包括基于抗原抗体反应对样本中的至少2个以上不同属的细菌的有无和/或存在量同时进行检测的工序。

Description

用于对饮食品样本、环境样本或生物体样本中的细菌的有无 和/或存在量进行检测的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及用于对饮食品样本、环境样本或生物体样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测的方法和试剂盒。

背景技术

以往，作为对饮食品样本、环境样本或生物体样本的细菌的有无和存在量进行检测、或者对由细菌所致的污染度进行判定的方法，已知有对样本进行培养来确认细菌的增殖的培养法(例如专利文献1：日本特开昭63-233774号公报；专利文献2：国际公开第2019/142848号)；对样本中的细菌的细胞内ATP(腺苷三磷酸)进行检测的ATP法(例如专利文献3：日本特开平11-239493号公报；专利文献4：日本特开2009-136205号公报)等。

但是，现有的培养法需要培养设备，并且在检测出结果之前需要数天～1周的时间，在检查地点、精力和时间方面存在问题。另外还具有仅能生长符合培养条件(培养基成分、需氧性/厌氧性气氛、设定温度等)的特定细菌、不能同时检测广泛菌属的细菌的问题。另外，由于ATP不仅存在于细菌细胞中、而且还存在于真核细胞(动物细胞、植物细胞)等中，因此现有的ATP法具有难以在来自饮食品或环境的真核细胞中识别细菌的问题。

作为要求进行饮食品样本、环境样本或生物体样本中的细菌的有无和/或存在量的检测的实际场景，如饮食品、环境的卫生管理中的细菌检查那样，还存在不是对各种细菌单独进行检测、而需要对多个属的细菌整体且迅速地进行检测的场景(例如，总菌数、常规细菌数、大肠杆菌群、肠杆菌科菌群的检测)。因此，若存在能够对于饮食品、环境、生物体等中存在的多个属的细菌一并进行检测的方法，则其技术意义和有用性高。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开昭63-233774号公报

专利文献2：国际公开第2019/142848号

专利文献3：日本特开平11-239493号公报

专利文献4：日本特开2009-136205号公报

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的一个方式的目的在于提供能够在短时间内简便且有效地对于饮食品样本、环境样本、生物体样本等样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测的方法和试剂盒。

用于解决课题的手段

本发明人进行了深入研究，结果想到，通过基于抗原抗体反应对于样本中的多个属的不同细菌的有无和/或存在量同时进行检测，能够在短时间内简便且有效地对于样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测。并且想到，通过将与各种细菌广泛地产生抗原抗体反应的通用性抗体和与特定细菌产生特异性抗原抗体反应的1种或2种以上的特异性抗体合用来进行使用，可由其他成分中识别出样本中的1种或多种细菌，对其有无或存在量迅速且简便地进行检测。在此基础上，通过实际制作与多个属的细菌产生抗原抗体反应的抗体并使用这些抗体，证实了能够在短时间内简便且有效地对样本中的多个属的不同细菌的有无和/或存在量进行检测，实现了本发明。

即，本发明的主旨如下。

[项1]一种用于对选自饮食品样本、环境样本以及生物体样本的样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测的方法，其中，该方法包括：

检测工序，基于抗原抗体反应对样本中的至少2个以上不同属的细菌的有无和/或存在量同时进行检测。

[项2]如项1所述的方法，其中，在上述检测工序中，对选自由埃希氏菌(Escherichia)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、沙雷氏菌(Serratia)属、拉恩氏菌(Rahnella)属、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属、李斯特菌(Listeria)属、肠杆菌(Enterobacter)属以及沙门氏菌(Salmonella)属组成的组中的2个以上不同属的细菌同时进行检测。

[项3]如项1或2所述的方法，其中，上述作为检测对象的2个以上的属的细菌包含革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌这两者。

[项4]如项1～3中任一项所述的方法，其中，在上述检测工序中，对于至少3个以上、或者4个以上、或者5个以上、或者6个以上、或者7个以上、或者8个以上、或者9个以上、或者10个以上、或者11个以上的不同属的细菌同时进行检测。

[项5]如项1～4中任一项所述的方法，其中，上述检测工序包括：

使与来源于上述2个以上的属的细菌的成分产生抗原抗体反应的抗体与样本接触的工序；以及

对于在接触后的样本中产生的抗原抗体反应的有无和/或强度进行测定的工序。

[项6]如项5所述的方法，其中，上述抗体是与上述2个以上的属的细菌的核糖体蛋白L7/L12产生抗原抗体反应的抗体。

[项7]如项5或6所述的方法，其中，在上述抗体与样本接触前，进一步包括：

将样本中的细菌溶菌的工序。

[项8]如项5～7中任一项所述的方法，其中，上述抗体不与可能存在于样本中的1种或2种以上的非细菌来源成分产生交叉反应。

[项9]如项8所述的方法，其中，不与上述抗体产生交叉反应的非细菌来源成分是来源于病毒、植物和/或动物的有机物成分。

[项10]如项5～9中任一项所述的方法，其中，上述抗体为单克隆抗体或其片段、或者它们的衍生物。

[项11]如项10所述的方法，其中，上述单克隆抗体或其片段、或者它们的衍生物分别包含：

作为重链可变区序列的与选自序列编号1、序列编号3以及序列编号5中的至少任一氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；以及

作为轻链可变区序列的与选自序列编号2、序列编号4以及序列编号6中的至少任一氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列。

[项12]如项11所述的方法，其中，上述单克隆抗体或其片段、或者它们的衍生物中，

作为重链可变区序列具有与序列编号1的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，作为轻链可变区序列具有与序列编号2的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；或者

作为重链可变区序列具有与序列编号3的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，作为轻链可变区序列具有与序列编号4的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；或者

作为重链可变区序列具有与序列编号5的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，作为轻链可变区序列具有与序列编号6的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列。

[项13]如项5～12中任一项所述的方法，其中，上述方法包括通过下述工序(I)和工序(II)对样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测的步骤，

工序(I)：通过样本、与固相载体连结的捕捉用抗体、以及具有检测用标记的检测用抗体的抗原抗体反应，捕捉样本中的细菌，同时对样本中的细菌进行标记，

工序(II)：基于检测用标记对样本中的检测对象细菌进行检测，

而且，捕捉用抗体和检测用抗体中，一者的抗体是与1种或2种以上的检测对象细菌产生抗原抗体反应的1种或2种以上的特异性抗体，另一者的抗体是与包括上述检测对象细菌在内的5个以上的属的细菌产生抗原抗体反应的1种或2种以上的通用性抗体，

并且，上述通用性抗体或上述特异性抗体中的任一者为项5～12任一项中记载的抗体。

[项14]如项13所述的方法，其中，上述工序(I)包括：

(Ia-1)使样本与检测用抗体接触，通过检测用抗体与细菌的抗原抗体反应而对样本中的细菌进行标记的工序；以及

(Ia-2)使包含利用检测用抗体进行了标记的细菌的样本与捕捉用抗体接触，通过捕捉用抗体与细菌-检测用抗体复合体的抗原抗体反应而捕捉样本中的细菌的工序。

[项15]如项13所述的方法，其中，上述工序(I)包括：

(Ib-1)使样本与捕捉用抗体接触，通过捕捉用抗体与细菌的抗原抗体反应而捕捉样本中的细菌的工序；以及

(Ib-2)使包含利用捕捉用抗体进行了捕捉的细菌的样本与检测用抗体接触，通过检测用抗体与细菌-捕捉用抗体复合体的抗原抗体反应而对样本中的细菌进行标记的工序。

[项16]如项13～15中任一项所述的方法，其中，捕捉用抗体为通用性抗体，检测用抗体为特异性抗体。

[项17]如项13～15中任一项所述的方法，其中，检测用抗体为通用性抗体，捕捉用抗体为特异性抗体。

[项18]如项13～17中任一项所述的方法，其中，通用性抗体至少与选自埃希氏菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、沙雷氏菌(Serratia)属、拉恩氏菌(Rahnella)属、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属、李斯特菌(Listeria)属、肠杆菌(Enterobacter)属以及沙门氏菌(Salmonella)属中的5个以上的属的细菌产生抗原抗体反应。

[项19]如项13～18中任一项所述的方法，其中，特异性抗体至少与选自埃希氏菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、沙雷氏菌(Serratia)属、拉恩氏菌(Rahnella)属、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属、李斯特菌(Listeria)属、肠杆菌(Enterobacter)属以及沙门氏菌(Salmonella)属中的1个以上的属的细菌产生特异性抗原抗体反应。

[项20]如项13～19中任一项所述的方法，其中，通用性抗体分别包含：

作为重链可变区序列的与选自序列编号1、序列编号3以及序列编号5中的至少任一氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；以及

作为轻链可变区序列的与选自序列编号2、序列编号4以及序列编号6中的至少任一氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列。

[项21]如项20所述的方法，其中，通用性抗体中，

作为重链可变区序列具有与序列编号1的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，作为轻链可变区序列具有与序列编号2的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；或者

作为重链可变区序列具有与序列编号3的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，作为轻链可变区序列具有与序列编号4的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；或者

作为重链可变区序列具有与序列编号5的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，作为轻链可变区序列具有与序列编号6的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列。

[项22]如项13～21中任一项所述的方法，其中，特异性抗体分别包含：

作为重链可变区序列的与选自序列编号7、序列编号9、序列编号11以及序列编号13中的至少任一氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；以及

作为轻链可变区序列的与选自序列编号8、序列编号10、序列编号12以及序列编号14中的至少任一氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列。

[项23]如项22所述的方法，其中，特异性抗体中，

作为重链可变区序列具有与序列编号7的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，作为轻链可变区序列具有与序列编号8的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；或者

作为重链可变区序列具有与序列编号9的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，作为轻链可变区序列具有与序列编号10的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；或者

作为重链可变区序列具有与序列编号11的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，作为轻链可变区序列具有与序列编号12的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；或者

作为重链可变区序列具有与序列编号13的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，作为轻链可变区序列具有与序列编号14的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列。

[项24]一种用于对由选自饮食品样本、环境样本以及生物体样本的样本的细菌所致的污染度进行判定的方法，其中，该方法包括以下工序：

利用项1～23中任一项所述的方法，基于抗原抗体反应对上述样本中的至少2个以上的属的细菌的有无和/或存在量同时进行检测。

[项25]一种试剂盒，其是用于利用项5～12中任一项所述的方法对选自饮食品样本、环境样本以及生物体样本的样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测的试剂盒，其中，该试剂盒包含项5～12任一项中记载的抗体。

[项26]一种试剂盒，其是用于利用项13～23中任一项所述的方法对选自饮食品样本、环境样本以及生物体样本的样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测的试剂盒，其中，该试剂盒包含项13～23任一项中记载的捕捉用抗体和检测用抗体，并且上述捕捉用抗体和检测用抗体中的一者为上述通用性抗体，另一者为上述特异性抗体。

[项27]如项26所述的试剂盒，其中，

该试剂盒进一步包含用于使样本展开、进行样本与捕捉用抗体的接触的膜载体，

该试剂盒按照下述方式构成：

在上述载体上设置有固定了捕捉用抗体的检测线，

并且，利用单一的检测线对于样本中的2种以上的细菌进行检测。

[项28]如项26或27所述的试剂盒，其中，上述试剂盒为免疫层析试剂盒。

[项29]如项28所述的试剂盒，其中，

上述的捕捉用抗体和检测用抗体按照可与作为检测对象的样本中的细菌的核糖体蛋白L7/L12一起进行抗原抗体反应而形成三明治结构的方式进行选择，

上述免疫层析试剂盒包含：用于使样本展开、进行样本与捕捉用抗体的接触的不溶性膜载体；以及设于上述不溶性膜载体上、附着有上述检测用抗体的结合垫，

并且，相对于上述不溶性膜载体上的上述结合垫，在层析展开方向上固定有上述捕捉用抗体。

[项30]一种制造方法，其是用于制造项29所述的免疫层析试剂盒的方法，其中，该方法至少包括下述工序：

将附着有上述检测用抗体的上述结合垫层积在上述不溶性膜载体上的工序；以及

相对于上述不溶性膜载体上的上述结合垫，在层析展开方向上固定上述捕捉用抗体的工序。

[项31]如项30所述的制造方法，其中，作为上述捕捉用抗体使用上述特异性抗体，作为上述检测用抗体使用上述通用性抗体。

[项32]如项30或31所述的制造方法，其中，上述特异性抗体是至少与选自埃希氏菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、沙雷氏菌(Serratia)属、拉恩氏菌(Rahnella)属、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属、李斯特菌(Listeria)属、肠杆菌(Enterobacter)属以及沙门氏菌(Salmonella)属中的1个以上的属的检测对象细菌产生特异性抗原抗体反应的抗体。

[项33]如项30～32中任一项所述的制造方法，其中，上述通用性抗体至少与选自埃希氏菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、沙雷氏菌(Serratia)属、拉恩氏菌(Rahnella)属、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属、李斯特菌(Listeria)属、肠杆菌(Enterobacter)属以及沙门氏菌(Salmonella)属中的5个以上的检测对象细菌产生特异性抗原抗体反应。

发明的效果

根据本发明的方法，能够在短时间内简便且有效地对饮食品样本、环境样本或生物体样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测。

附图说明

图1是示出条带状的检测机构的示意性构成的截面图，其是作为侧流方式的免疫层析检测装置的检测机构的一例。

具体实施方式

以下根据具体的实施方式对本发明进行详细说明。但是本发明并不限于以下的实施方式，可在不脱离本发明主旨的范围内以任意的方式实施。

需要说明的是，本说明书中引用的包括授权公报、专利申请公开公报以及非专利公报在内的全部文献通过其整体的援用而在所有目的中被并入到本说明书中。

另外，本说明书中记载的表示氨基酸序列的序列式中，除了另有记载的情况以外，均以单字母密码来表示氨基酸。

本发明的一个方式涉及用于对饮食品样本、环境样本或生物体样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测的方法(下文中，为方便起见，称为“本发明的方法”)。本发明的方法包括基于抗原抗体反应对样本中的多个属的细菌的有无和/或存在量同时进行检测。根据一个方式，这样的基于抗原抗体反应的检测例如通过使与样本中的来源于多个属的细菌的成分产生抗原抗体反应的抗体(以下为方便起见称为“本发明的抗体”)与样本接触、对接触后的样本中产生的抗原抗体反应的有无和/或强度进行测定来进行。若使用本发明的方法，例如能够在短时间内简便且有效地对由于饮食品样本、环境样本或生物体样本的细菌所致的污染度进行判定。

另外，这样的用于实施本发明的方法的、包含本发明的抗体的试剂盒(本发明的试剂盒)也是本发明的对象。

下文中，首先对这样的本发明的方法进行说明，之后对本发明的方法中使用的本发明的抗体进行说明，接着对本发明的方法中特别优选的方式(本发明的方法(2))进行说明，其后对本发明的方法中使用的试剂盒进行说明。

[1.用于对样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测的方法(1)]

本发明的方法是用于对选自饮食品样本、环境样本以及生物体样本的样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测的方法。本发明的方法包括基于抗原抗体反应对样本中的多个属的细菌的有无和/或存在量同时进行检测。需要说明的是，使用本发明的方法可以对例如由该样本的细菌所致的污染度进行判定。

作为样本，可以举出饮食品样本、环境样本或生物体样本(下文中，有时为方便起见将饮食品样本和环境样本统一简称为“饮食品·环境样本”，为方便起见将饮食品样本、环境样本以及生物体样本统一简称为“饮食品·环境·生物体样本”)。饮食品样本的种类没有特别限制，作为示例，可以举出由肉、鱼、蔬菜、副食、加工饮食品、调味料等食材、水、茶、咖啡、果汁、酒类等饮料等取得的样本。环境样本的种类也没有特别限制，作为示例，可以举出饮食品制造设备、饮食提供场所、医疗设备、医疗场所等环境下将手指、工作服、工作鞋、指甲刷、砧板、菜刀、把手、传送带、包装材、作业机、床、水龙头、淋浴、医疗器具等的表面利用含浸有液性介质(水、生理等渗液、乙醇等)的清洁棉、清洁布等采集用具(拭子)进行擦拭而得到的样本；以及自来水、井水、河川、温泉的水等液态样本等。生物体样本的种类没有特别限制，可以举出全血、血清、血浆、尿、便、手、唾液、咳痰、汗、鼻汁、咽拭子、鼻腔吸引液、肺清洗液等来自人或非人类动物的样本。这样的饮食品·环境·生物体样本可能被广泛种类的细菌污染。

如上所述，为了对这样的饮食品·环境·生物体样本的细菌污染进行检测，以往需要使用培养法或ATP法。但是，培养法需要培养设备和复杂的培养作业，并且在检测出结果之前需要数天～1周的时间，而且仅能够检测符合培养条件的特定的细菌。关于ATP法，由于在真核细胞(动物细胞、植物细胞)等中也存在ATP，因此难以在来源于饮食品、环境、生物体的真核细胞中识别细菌。

本发明的方法中，基于抗原抗体反应对样本中的多个属的细菌的有无和/或存在量同时进行检测。本发明中的“抗原抗体反应”是指抗体与其抗原特异性结合。通过使用抗原抗体反应，能够通过简便的设备和操作在现场即时地对样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测。另外，本发明中的多个种或多个属的细菌的“同时”检测是指对多个种或多个属的细菌一并进行检测，不一定限于时间上的同时检测。另外，2个以上的属的细菌的“同时”检测不仅包括最终检测2个以上的属的细菌的方式，而且还包括即使最终检测的细菌例如为单一属，也使用与2个以上的属的细菌一并(即“同时”)产生抗原抗体反应的抗体(即后述的通用性抗体)进行检测的方式。本发明中，通过恰当地选择使用与作为检测对象的来源于多个属的细菌的成分产生特异性抗原抗体反应的抗体(本发明的抗体)，能够对作为检测对象的多个属的细菌同时进行检测，并且能够降低由细菌以外的成分所致的伪阳性、提高检测灵敏度和检测精度。其结果，能够在短时间内简便且有效地对因多个属的细菌所致的样本的污染度进行判定。

作为基于本发明的方法的细菌，可以举出在饮食品·环境·生物体样本中的特别是属于作为检测需求高的代表性细菌属的埃希氏菌(Escherichia)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、沙雷氏菌(Serratia)属、拉恩氏菌(Rahnella)属、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属、李斯特菌(Listeria)属、肠杆菌(Enterobacter)属以及沙门氏菌(Salmonella)属(下文中，为方便起见，称为“特定细菌属”)的细菌。本发明的方法中，优选对于与这些特定细菌属中的至少2个以上的属(多个属)的细菌的抗原抗体反应进行检测，其中特别优选对于与至少3个以上、或者4个以上、或者5个以上、或者6个以上、或者7个以上、或者8个以上、或者9个以上、或者10个以上的属、尤其是11个特定细菌属的全部细菌的抗原抗体反应进行检测。

作为埃希氏菌(Escherichia)属的细菌，可以举出大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli,EC)、艾伯特埃希菌(Escherichia albertii,E.albertii)等。本发明的方法在对于与埃希氏菌(Escherichia)属的细菌的抗原抗体反应进行检测的情况下，对于与它们中的1种或2种以上的任意细菌的抗原抗体反应进行检测即可，优选至少对于与大肠杆菌(Escherichia coli)的抗原抗体反应进行检测。

作为葡萄球菌(Staphylococcus)属的细菌，可以举出金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus,SA)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,S.epidermidis)、银白色葡萄球菌(Staphylococcus argenteus,S.argenteus)等。本发明的方法对于与葡萄球菌(Staphylococcus)属的细菌的抗原抗体反应进行检测的情况下，对于与它们中的1种或2种以上的任意细菌的抗原抗体反应进行检测即可，优选至少对于与金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗原抗体反应进行检测。

作为假单胞菌(Pseudomonas)属的细菌，可以举出绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa,P.aeruginosa,PA)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens,P.fluorescens)、磷光假单胞菌(Pseudomonas phosphorescence,P.phosphorescence)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida,P.putida)等。本发明的方法对于与假单胞菌(Pseudomonas)属的细菌的抗原抗体反应进行检测的情况下，对于与它们中的1种或2种以上的任意细菌的抗原抗体反应进行检测即可，优选至少对于与绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)的抗原抗体反应进行检测。

作为芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌，可以举出枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis,B.subtilis,BS)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus,B.cereus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis,B.licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium,B.megaterium)等。本发明的方法在对于与芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌的抗原抗体反应进行检测的情况下，对于与它们中的1种或2种以上的任意细菌的抗原抗体反应进行检测即可，优选至少对于与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的抗原抗体反应进行检测。

作为克雷伯氏菌(Klebsiella)属的细菌，可以举出肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae,K.pneumoniae,KP)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca,K.oxytoca)、产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes,K.aerogenes)等。本发明的方法对于与克雷伯氏菌(Klebsiella)属的细菌的抗原抗体反应进行检测的情况下，对于与它们中的1种或2种以上的任意细菌的抗原抗体反应进行检测即可，优选至少对于与肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)的抗原抗体反应进行检测。

作为沙雷氏菌(Serratia)属的细菌，可以举出液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens,S.liquefaciens,SL)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens,S.marcescens)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola,S.fonticola)等。本发明的方法对于与沙雷氏菌(Serratia)属的细菌的抗原抗体反应进行检测的情况下，对于与它们中的1种或2种以上的任意细菌的抗原抗体反应进行检测即可，优选至少对于与液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)的抗原抗体反应进行检测。

作为拉恩氏菌(Rahnella)属的细菌，可以举出水生拉恩氏菌(Rahnellaaquatilis,R.aquatilis,RA)、维多利亚拉恩氏菌(Rahnella victoriana,R.victoriana)、布氏拉恩氏菌(Rahnella bruchi,R.bruchi)等。本发明的方法对于与拉恩氏菌(Rahnella)属的细菌的抗原抗体反应进行检测的情况下，对于与它们中的1种或2种以上的任意细菌的抗原抗体反应进行检测即可，优选至少对于与水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)的抗原抗体反应进行检测。

作为柠檬酸杆菌(Citrobacter)属的细菌，可以举出弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii,C.freundii,CF)、无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacteramalonaticus,C.amalonaticus)、差异柠檬酸杆菌(Citrobacter diversus,C.diversus)等。本发明的方法对于与柠檬酸杆菌(Citrobacter)属的细菌的抗原抗体反应进行检测的情况下，对于与它们中的1种或2种以上的任意细菌的抗原抗体反应进行检测即可，优选至少对于与弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)的抗原抗体反应进行检测。

作为李斯特菌(Listeria)属的细菌，可以举出单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,L.monocytogenes,LM)、无害李斯特菌(Listeria innocua,L.innocua)、伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii,L.ivanovii)等。本发明的方法对于与李斯特菌(Listeria)属的细菌的抗原抗体反应进行检测的情况下，对于与它们中的1种或2种以上的任意细菌的抗原抗体反应进行检测即可，优选至少对于与单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)的抗原抗体反应进行检测。

作为肠杆菌(Enterobacter)属的细菌，可以举出阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae,E.cloacae,ECL)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes,E.aerogenes)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii,E.sakazakii)等。本发明的方法对于与肠杆菌(Enterobacter)属的细菌的抗原抗体反应进行检测的情况下，对于与它们中的1种或2种以上的任意细菌的抗原抗体反应进行检测即可，优选至少对于与阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)的抗原抗体反应进行检测。

作为沙门氏菌(Salmonella)属的细菌，可以举出肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis,S.enteritidis,SE)、婴儿沙门氏菌(Salmonella infantis,S.infantis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,S.typhimurium)等。本发明的方法对于与沙门氏菌(Salmonella)属的细菌的抗原抗体反应进行检测的情况下，对于与它们中的1种或2种以上的任意细菌的抗原抗体反应进行检测即可，优选至少对于与肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)的抗原抗体反应进行检测。

除了上述细菌以外，作为能够利用本发明的方法进行检测的细菌属，可以举出但不限于肠球菌(Enterococcus)属、莫拉氏菌(Moraxella)属、气单胞菌(Aeromonas)属、乳酸杆菌(Lactobacillus)属、微球菌(Micrococcus)属、不动杆菌(Acinetobacter)属、弯曲菌(Campylobacter)属、变形杆菌(Proteus)属以及弧菌(Vibrio)属等。

需要说明的是，根据本发明的一个方式，作为检测对象的细菌，可以包含属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌(以下称为“肠杆菌科细菌”)。作为本方式中的特别是检测需求高的肠杆菌科细菌没有限定，可以举出饮食品、环境中的特别是属于作为检测需求高的代表性肠内细菌属的大肠杆菌属、克雷伯氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属以及沙雷氏菌属等的肠杆菌科细菌。另外，作为在本方式中能够检测的其他肠杆菌科细菌没有限定，例如可以举出属于耶尔辛氏菌属、欧文氏菌属、哈夫尼亚菌属、摩根氏菌属、肥杆菌属、普罗威登斯菌属、志贺氏菌属、气单胞菌属以及坚固杆菌属等的肠杆菌科细菌。

需要说明的是，作为一个方式，优选包含革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌这两者作为检测对象的多个属的细菌。两者的细胞膜·细胞壁的结构显著不同，因此难以利用现有技术同时检测这两者，但根据本发明的方法，若对于检测中使用的抗体恰当地进行设计，则也能够对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌同时进行检测。

根据本发明的方法，通过基于抗原抗体反应对于饮食品·环境·生物体样本中的细菌的有无和/或存在量同时进行检测，与现有的培养法和ATP法相比，能够在短时间内简便且有效地对样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测。另外，若使用本发明的方法，能够极其迅速且简便地对例如由于饮食品·环境·生物体样本的细菌所致的污染度进行判定。

[2.与样本中的来源于多个属的细菌的成分产生抗原抗体反应的抗体]

本发明的方法中，基于抗原抗体反应对样本中的多个属的细菌的有无和/或存在量同时进行检测的手法没有特别限定。根据一个方式，这样的基于抗原抗体反应的检测通过使与来源于多个属的细菌的成分产生抗原抗体反应的抗体(本发明的抗体)与样本接触、对接触后的样本中产生的抗原抗体反应的有无和/或强度进行测定而适当地进行。以下对这样的本发明的抗体进行说明。

本发明中的“抗体”是识别特定的抗原或物质并与其结合的蛋白质，有时也称为免疫球蛋白(Ig)。常见的抗体通常具有通过二硫键相互结的2个轻链(轻链)和2个重链(重链)。轻链中存在被称为λ链和κ链的两种，重链中存在被称为γ链、μ链、α链、δ链以及ε链的五种。根据该重链的种类，抗体中存在分别为IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE这5种同型。

重链分别包含重链恒定(CH)区和重链可变(VH)区。轻链分别包含轻链恒定(CL)区和轻链可变(VL)区。轻链恒定(CL)区由单一的结构域构成。重链恒定(CL)区由3个结构域、即CH1、CH2和CH3构成。轻链可变(VL)区和重链可变(VH)区分别由被称为框架区(FR)的保守性高的4个区(FR-1、FR-2、FR-3、FR-4)、以及被称为互补决定区(CDR)的超可变性的3个区(CDR-1、CDR-2、CDR-3)构成。重链恒定(CH)区具有3个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)以及4个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4)，它们从氨基末端到羧基末端按照FR-H1、CDR-H1、FR-H2、CDR-H2、FR-H3、CDR-H3、FR-H4的顺序排列。轻链恒定(CL)区具有3个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)以及4个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3、FR-L4)，它们从氨基末端到羧基末端按照FR-L1、CDR-L1、FR-L2、CDR-L2、FR-L3、CDR-L3、FR-L4的顺序排列。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。

本发明的抗体可以为多克隆抗体、也可以为单克隆抗体，优选为单克隆抗体。多克隆抗体通常是由利用抗原免疫后的动物的血清制备的抗体，其是结构不同的各种抗体分子种的混合物。另一方面，单克隆抗体是指由包含具有特定氨基酸序列的轻链可变(VL)区和重链可变(VH)区的组合的单一种类的分子构成的抗体。单克隆抗体可以由抗体产生细胞来源的克隆产生，还可以取得具有编码抗体的蛋白质的氨基酸的基因序列的核酸分子并使用该核酸分子进行基因工程制作。另外，使用重链和轻链、或者它们的可变区或CDR等基因信息来进行用于抗体的结合性或特异性的提高的修饰等也是本领域技术人员熟知的技术。

另外，本发明的抗体可以为抗体的片段和/或衍生物。作为抗体的片段，可以举出F(ab’)₂、Fab、Fv等。作为抗体的衍生物，可以举出在轻链和/或重链的恒定区部分人工导入氨基酸突变的抗体、对轻链和/或重链的恒定区的结构域构成进行修饰的抗体、在每1分子中具有2个以上的Fc区的抗体、糖链修饰抗体、双特异性抗体、抗体或抗体的片段与抗体以外的蛋白质结合而成的抗体偶联物、抗体酶、串联scFv、双特异性串联scFv、双链抗体(Diabody)等。进而，在上述抗体或其片段或者衍生物为非人类动物来源的情况下，将该CDR以外的序列的一部分或全部置换成人抗体的对应序列的嵌合体抗体或人源化抗体也包含在本发明的抗体中。需要说明的是，除非另有说明，本发明中简称为“抗体”的情况下，也包括抗体的片段和/或衍生物。

本发明的抗体与某种细菌产生抗原抗体反应是指将该细菌所具有的某些成分作为抗原进行特异性结合。成为本发明的抗体的抗原的细菌成分没有限制。可以为在细菌的细胞外露出的细胞壁、细胞膜等中包含的成分，也可以是不在细菌的细胞外露出的细胞质、细胞器、核等中包含的成分。本发明的抗体与不在细菌的细胞外露出的成分产生抗原抗体反应的情况下，为了使该细菌成分与本发明的抗体产生抗原抗体反应，可以在本发明的抗体与饮食品·环境·生物体样本接触前，对样本实施使细菌溶菌的处理。关于该细菌的溶菌处理如下文所述。

本发明的抗体优选为与至少选自埃希氏菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、沙雷氏菌(Serratia)属、拉恩氏菌(Rahnella)属、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属、李斯特菌(Listeria)属、肠杆菌(Enterobacter)属以及沙门氏菌(Salmonella)属中的5个以上、或者6个以上、或者7个以上、或者8个以上、或者9个以上、或者10个以上、或者11个以上的属的细菌产生抗原抗体反应的抗体。关于这些属的具体细菌种如上所述。

其中，本发明的抗体优选与上述说明的特定细菌属和/或选择细菌属的某些细菌的核糖体蛋白产生抗原抗体反应。其中优选与核糖体蛋白L7/L12产生抗原抗体反应。本发明中的“核糖体蛋白L7/L12”、或单纯“L7/L12”是在微生物的蛋白质合成中所必需的核糖体蛋白的1种，是在各种细菌中共同具有的蛋白质。关于针对上述细菌的核糖体蛋白L7/L12产生抗原抗体反应的抗体及其制作方法，例如可以参照本发明人以前的专利申请的专利公报即国际公开第2000/006603号等的记载。

成为本发明的抗体的抗原的细菌成分没有限制。可以为在细菌的细胞外露出的细胞壁、细胞膜等中包含的成分，也可以为不在细菌的细胞外露出的细胞质、细胞器、核等中包含的成分。本发明的抗体与不在细菌的细胞外露出的成分产生抗原抗体反应的情况下，为了使该细菌的成分与本发明的抗体产生抗原抗体反应，可以在本发明的抗体与饮食品·环境·生物体样本接触前，对样本实施使细菌溶菌的处理。关于该细菌的溶菌处理如下文所述。

本发明的抗体与作为检测对象的细菌的抗原抗体反应的程度没有特别限制，只要可产生至少能够通过公知的某些检测方法进行检测的程度的抗原抗体反应即可。作为对抗体与细菌的抗原抗体反应进行检测的方法没有限定，可以举出后述的各种公知的免疫学测定方法。

另外，本发明的抗体优选不与可能存在于样本中的1种或2种以上的非细菌来源成分产生交叉反应。作为该非细菌来源成分的示例没有限制，例如可以举出来源于病毒、植物和/或动物的各种生物体有机化合物且为细菌所不具有的化合物。作为该生物体有机化合物的具体例，可以举出蛋白质、糖类、糖蛋白、脂质、复合脂质、核酸等。本发明的抗体优选不与这些非细菌来源成分中的至少1种、或者2种以上、通常3种以上、进而4种以上、或者5种以上、或者6种以上、或者7种以上、或者8种以上、尤其9种以上、特别10种以上的非细菌来源的生物体有机化合物产生交叉反应。

由于抗体的抗原特异性极高，因此对于特异性捕捉特定的抗原是有效的，但据认为其不适用于多种不同的对象物质的检测等。而且，由于作为饮食品检查时的检测对象的细菌的属以及种类极其多样，因此以往认为非常难以通过抗原抗体反应同时检测这样的多个属的细菌。但是，如后述的实施例所记载，本发明人成功取得了与作为饮食品样本或环境样本的检查时的检测对象的多个属的细菌产生抗原抗体反应、能够用于这些细菌的同时检测的抗体。这样的见解是与现有的技术常识相反的极其意外的见解。

对本发明的抗体的结构没有特别限制，优选如下所述。需要说明的是，仅由以下说明的结构的特征来限定的抗体也包含在本发明的抗体中。

具体地说，本发明的抗体中，作为重链和轻链的各可变区的氨基酸序列，优选具有以下的氨基酸序列。

作为重链可变区(VH)的氨基酸序列，优选具有与选自序列编号1、序列编号3以及序列编号5中的任意1个氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列。其中，作为VH序列，特别优选为选自序列编号1、序列编号3以及序列编号5中的任意1个氨基酸序列。

作为轻链可变区(VL)的氨基酸序列，优选具有与选自序列编号2、序列编号4以及序列编号6中的任意1个氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列。其中，作为VL序列，特别优选为选自序列编号2、序列编号4以及序列编号6中的任意1个氨基酸序列。

其中，作为优选的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列的组合没有限制，可以将具有与选自序列编号1、序列编号3以及序列编号5中的任意1个氨基酸序列具有80％以上的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的重链可变区(VH)与具有与选自序列编号2、序列编号4以及序列编号6中的任意1个氨基酸序列具有80％以上的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的轻链可变区(VL)任意组合，其中特别优选为以下的任一组合。

·具有与序列编号1的氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的重链可变区(VH)与具有与序列编号2的氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的轻链可变区(VL)的组合。

·具有与序列编号3的氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的重链可变区(VH)与具有与序列编号4的氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的轻链可变区(VL)的组合。

·具有与序列编号5的氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的重链可变区(VH)与具有与序列编号6的氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的轻链可变区(VL)的组合。

需要说明的是，本发明中，2个氨基酸序列的“同源性”是指在对两氨基酸序列进行比对时，各对应部位出现相同或类似的氨基酸残基的比例，2个氨基酸序列的“相同性”是指在对两氨基酸序列进行比对时，各对应部位出现相同的氨基酸残基的比例。需要说明的是，2个氨基酸序列的“同源性”和“相同性”例如可使用BLAST(Basic Local Alignment SearchTool)程序(Altschul et al.,J.Mol.Biol.,(1990),215(3):403-10)等来求出。

另外，作为由某一抗体的重链和轻链的各可变序列鉴定各CDR序列的方法，例如可以举出Kabat法(Kabat et al.,The Journal of Immunology,1991,Vol.147,No.5,pp.1709-1719)、Chothia法(Al-Lazikani et al.,Journal of Molecular Biology,1997,Vol.273,No.4,pp.927-948)。这些方法是本领域的技术常识，例如也可参照Dr.AndrewC.R.Martin’s Group的网页(http://www.bioinf.org.uk/abs/)等。

需要说明的是，作为与某一氨基酸类似的氨基酸，例如可以举出在基于氨基酸的极性、荷电性以及尺寸的下述分类中属于同一组内的氨基酸(各氨基酸的种类均以单字母密码来表示)。

·芳香族氨基酸：F、H、W、Y；

·脂肪族氨基酸：I、L、V；

·疏水性氨基酸：A、C、F、H、I、K、L、M、T、V、W、Y；

·带电氨基酸：D、E、H、K、R等；

·带正电氨基酸：H、K、R；

·带负电氨基酸：D、E；

·极性氨基酸：C、D、E、H、K、N、Q、R、S、T、W、Y；

·小型氨基酸：A、C、D、G、N、P、S、T、V等；

·超小型氨基酸：A、C、G、S。

另外，作为与某一氨基酸类似的氨基酸，例如还可以举出在基于氨基酸侧链的种类的下述分类中属于同一组内的氨基酸(各氨基酸的种类均以单字母密码来表示表示。)。

·具有脂肪族侧链的氨基酸：G、A、V、L、I；

·具有芳香族侧链的氨基酸：F、Y、W；

·具有含硫侧链的氨基酸：C、M；

·具有脂肪族羟基侧链的氨基酸：S、T；

·具有碱性侧链的氨基酸：K、R、H；

·酸性氨基酸以及它们的酰胺衍生物：D、E、N、Q。

制作本发明的抗体的方法没有特别限制。本发明的抗体为多克隆抗体的情况下，可以使用作为检测对象的细菌来源的成分来制作。作为可使用的细菌来源的成分，可以举出细菌的菌体本身、将其溶菌而成的溶解物、其基于电泳的分级物等。在使用细菌溶解物基于电泳的分级物的情况下，对使用哪一级分没有限制，例如优选选择使用与分子量约10～20kDa附近相当的级分。另外，作为细菌来源成分，优选使用细菌中包含的核糖体蛋白，特别优选使用核糖体蛋白L7/L12。将这些细菌来源的成分根据需要与佐剂一起接种在动物中，回收其血清，由此可以得到包含与上述规定的多种细菌产生抗原抗体反应的抗体(多克隆抗体)的抗血清。作为所接种的动物，为绵羊、马、山羊、兔子、小鼠、大鼠等，在多克隆抗体制作中，特别优选绵羊、兔子等。另外，由所得到的抗血清进行抗体的精制·分级，以与所期望的细菌产生抗原抗体反应、以及与来源于饮食品、环境或者生物体的其他成分不产生交叉反应作为指标，通过公知的方法适当地进行筛选，由此能够得到特异性更优异的所期望的抗体。进而，也可以分离出产生所期望的抗体分子的抗体产生细胞，与骨髓瘤细胞进行细胞融合而制作具有自主增殖能力的杂交瘤，由此得到单克隆抗体。另外，作为不必进行对动物的致敏的方法，也可利用下述技术：使用表达抗体的重链可变(VH)区或轻链可变(VL)区或者它们的一部分的噬菌体文库，取得与作为检测对象的细菌来源的成分特异性结合的抗体或由特定氨基酸序列构成的噬菌体克隆，由该信息制作抗体。

另外，若通过上述过程得到所期望的抗体，则可使用公知的氨基酸序列分析法对于该抗体的结构、具体地说对重链恒定(CH)区、重链可变(VH)区、轻链恒定(CL)区和/或轻链可变(VL)区的氨基酸序列的一部分或全部进行分析。对于这样得到的所期望的抗体的氨基酸序列进行用于提高抗体的结合性、特异性的修饰等的方法也是本领域技术人员公知的。进而，也可以利用所期望的抗体的氨基酸序列的全部或一部分(特别是重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区的全部或一部分、尤其是各CDR的氨基酸序列)，根据需要与公知抗体的氨基酸序列的一部分(特别是重链恒定(CH)区和轻链恒定(CL)区、以及根据需要的重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区的各FR的氨基酸序列)进行组合，由此设计出具有同样的抗原特异性的可能性高的其他抗体。

若确定所期望的抗体的氨基酸序列，则也可通过公知的方法制作具有编码该所期望的抗体的氨基酸序列的全部或一部分的碱基序列的核酸分子，使用该核酸分子来制作基因工程抗体。进而，也可以由该碱基序列制作用于表达所期望的抗体的各构成要素的载体、质粒等，导入至宿主细胞(哺乳类细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞、微生物细胞等)中，使其产生该抗体。另外，为了提高所得到的抗体的性能或避免副作用而在抗体的恒定区的结构中引入修饰或进行糖链部分的修饰也可利用本领域技术人员熟知的技术适当地进行。

需要说明的是，以上说明的本发明的抗体的制造方法、编码本发明的抗体的核酸分子、包含该核酸分子的载体或质粒、包含该核酸分子、载体或质粒的细胞、以及产生本发明的抗体的杂交瘤等也是本发明的对象。

需要说明的是，本说明书中记载的抗体的制作·修饰等技术对于本领域技术人员均是公知的，例如可参照Antibodies；A laboratory manual,E.Harlow et al.,ColdSpring Harbor Laboratory Press(2014)等的记载。另外，本说明书中记载的分子生物学技术(例如氨基酸序列分析法、核酸分子的设计·制作法、载体和质粒的设计·制作法等)对于本领域技术人员也均是公知的，例如可以参照Molecular Cloning,A laboratorymanual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Shambrook,J.et al.(1989)等的记载。

像这样使用识别各细菌的核糖体蛋白并产生抗原抗体反应的抗体(本发明的抗体)，使其与样本接触来检测抗原抗体反应的方式是本发明的方法的优选方式。此处，在本发明的抗体与样本接触之前，使样本中存在的细菌的核糖体蛋白在细菌的细胞膜外露出，由此可以提高检测灵敏度。因此，后述的使用本发明的抗体的本发明的方法的优选方式中，可以在本发明的抗体与样本接触之前，对样本实施使细菌溶菌的处理。作为该细菌的溶菌处理没有限定，可以举出加热处理、超声波处理、利用表面活性剂的化学处理等。溶菌处理中使用的条件可以根据样本中包含的细菌的种类适当地确定。另外，在使用本发明的抗体的本发明的方法的优选方式中，使用本发明的抗体与饮食品·环境·生物体样本接触的方法也是任意的。

在使用本发明的抗体的本发明的方法的优选方式中，用于检测抗原抗体反应的免疫学测定方法没有限定。作为免疫学的测定方法的示例没有限定，可以为使用单一抗体的方法，也可以为使用两种以上的抗体的方法。

作为使用单一抗体的免疫学测定方法的示例没有限定，可以举出使用负载有细菌的抗原的微孔板，确认基于抗体的抗原抗体反应的ELISA(酶结合免疫吸附)法；在传感器表面负载抗体(或抗原)，以电学(例如交流阻抗法、FET(场效应晶体管)法等)或光学(例如SPR(表面等离子共振)法等)确认其与抗原(或抗体)的抗原抗体反应的生物传感器等各种公知的免疫学测定，对于任一者均可使用本发明的方法。

作为使用两种以上的抗体的免疫学测定方法的示例没有限定，可以举出使用负载有抗体的微孔板的ELISA法；使用负载有抗体的胶乳颗粒(例如聚苯乙烯胶乳颗粒等)的胶乳颗粒凝集测定方法；使用负载有抗体的膜等的免疫层析法；使用利用着色颗粒或具有显色能力的颗粒、酶或荧光体等标记的检测用抗体、以及固定于磁气微粒等固相载体的捕捉用抗体的三明治分析法等各种公知的免疫学测定方法。需要说明的是，在三明治分析法等将检测用抗体以及捕捉用抗体这两种以上的抗体合用的免疫学测定方法的情况下，本发明的抗体可以用作捕捉用抗体，也可以用作检测用抗体。

[3.用于对样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测的方法(2)]

特别是在本发明中，作为三明治分析法，优选使用通过下述工序对样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测的方法，所述工序为：通过样本、与固相载体连结的捕捉用抗体、以及具有检测用标记的检测用抗体的抗原抗体反应而捕捉样本中的细菌，同时对样本中的细菌进行标记的工序；以及基于检测用标记对样本中的检测对象细菌进行检测的工序。以下对于该方法(下文中，为方便起见，将其简称为“本发明的方法(2)”)进行说明。

本发明的方法(2)是包括通过下述工序对样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测的方法，所述工序为：(I)通过样本、与固相载体连结的捕捉用抗体、以及具有检测用标记的检测用抗体的抗原抗体反应，捕捉样本中的细菌，同时对样本中的细菌进行标记的工序；以及(II)基于检测用标记对样本中的检测对象细菌进行检测的工序。本方法中，进而使捕捉用抗体和检测用抗体中的一者的抗体为与1种或2种以上的检测对象细菌产生抗原抗体反应的1种或2种以上的特异性抗体，另一者的抗体为与包括上述检测对象细菌在内的5个以上的属的细菌产生抗原抗体反应的1种或2种以上的通用性抗体。

作为本发明的方法(2)的一个方式(为方便起见，有时将其称为“方式A”)，上述工序(I)可以包括下述工序：

(Ia-1)使样本与检测用抗体接触，通过检测用抗体与细菌的抗原抗体反应而对样本中的细菌进行标记的工序；以及

(Ia-2)使包含利用检测用抗体进行了标记的细菌的样本与捕捉用抗体接触，通过捕捉用抗体与细菌-检测用抗体复合体的抗原抗体反应而捕捉样本中的细菌的工序。

作为本发明的方法(2)的另一方式(为方便起见，有时将其称为“方式B”)，上述工序(I)可以包括下述工序：

(Ib-1)使样本与捕捉用抗体接触，通过捕捉用抗体与细菌的抗原抗体反应而捕捉样本中的细菌的工序；以及

(Ib-2)使包含利用捕捉用抗体进行了捕捉的细菌的样本与检测用抗体接触，通过检测用抗体与细菌-捕捉用抗体复合体的抗原抗体反应而对样本中的细菌进行标记的工序。

在任一方式中，均可以是捕捉用抗体为通用性抗体、检测用抗体为特异性抗体，也可以是检测用抗体为通用性抗体、捕捉用抗体为特异性抗体。另外，在上述通用性抗体和特异性抗体中，均可使任一者为本发明的抗体。其中，根据本发明的一个方式，本发明的抗体不受限定，但优选作为通用性抗体使用。需要说明的是，除非另有说明，本说明书中的“特异性抗体”是指与作为最终检测对象的1种或2种以上的细菌(检测对象细菌)产生抗原抗体反应的抗体，“通用性抗体”是指与包含上述检测对象细菌的5个以上、或者6个以上、或者7个以上、或者8个以上、或者9个以上、或者10个以上、或者11个以上的属的细菌产生抗原抗体反应的抗体。

本发明的方法(2)中，选择方式A和方式B中的哪种方式根据实际使用的免疫测定方法的种类、样本的种类来决定即可。作为免疫测定方法没有限定，可以举出使用负载有抗体的微孔板的ELISA(酶结合免疫吸附)法；使用负载有抗体的胶乳颗粒(例如聚苯乙烯胶乳颗粒等)的胶乳颗粒凝集测定方法；使用负载有抗体的膜等的免疫层析法；使用利用着色颗粒或具有显色能力颗粒、酶或荧光体等标记的检测用抗体、固定于磁气微粒等固相载体的捕捉用抗体的三明治分析法等各种公知的免疫学测定方法。

以下特别以作为免疫测定方法使用免疫层析法、涉及实施方式A的本发明的方法(2)的情况为例进行说明，使用其他免疫测定方法的情况下，可以适当地变更各特征来实施。

在上述工序(Ia-1)中、即使样本与检测用抗体接触并通过检测用抗体与细菌的抗原抗体反应对样本中的细菌进行标记的工序中，使具有检测用标记的检测用抗体与样本接触，通过检测用抗体与细菌的抗原抗体反应而对样本中的细菌进行标记。使样本与检测用抗体接触的方法没有限制，通常通过在含浸有检测用抗体的部件区导入作为水系样本而制备的样本并维持一定时间来实施即可。具体的方式根据工序(a)的捕捉方式等而不同，作为示例，在固定有捕捉用抗体的固相载体(多孔膜)的上游配置附着有检测用抗体的结合垫，将作为水系样本制备的样本导入至结合垫部使其透过，由此使样本与检测用抗体接触即可。作为另一示例，作为固相载体使用流路的情况下，在固定于流路上的捕捉用抗体的位置的上游侧、或者向固相载体的导入之前，使作为水系样本制备的样本与检测用抗体接触即可。

在上述工序(Ia-2)中、即使包含利用检测用抗体进行了标记的细菌的样本与捕捉用抗体接触并通过捕捉用抗体与细菌-检测用抗体复合体的抗原抗体反应而捕捉样本中的细菌的工序中，使捕捉用抗体与样本接触，通过捕捉用抗体与细菌的抗原抗体反应而捕捉样本中的细菌。使样本与捕捉用抗体接触的方法没有限制，通常通过在捕捉用抗体存在的区域导入作为水系样本制备的样本并维持一定时间来实施即可。具体的方式根据捕捉用抗体的固相载体的种类等而不同，作为示例，作为固相载体使用多孔膜，在固定有捕捉用抗体的多孔膜导入细菌-检测用抗体复合体并使其透过，由此使样本中的细菌被固定于多孔膜的捕捉用抗体捕捉即可。作为另一示例，可以在作为固相载体的流路上的一个区域固定捕捉用抗体，使细菌-检测用抗体复合体在该流路中流通，由此使样本中的细菌被固定于该流路上的一个区域的捕捉用抗体捕捉。

上述工序(II)中、即基于检测用标记对样本中的检测对象细菌进行检测的工序中，基于该检测用标记对利用捕捉用抗体捕捉并利用检测用抗体进行了标记的检测对象的细菌进行检测。该检测法没有特别限制，根据检测用标记的种类适当地选择即可，例如在使用胶体金等金属胶体作为检测用标记的情况下，通过目视或照相机等任意的方法对于与检测对象细菌结合的胶体金的有无或存在量进行检测即可。

根据以上说明的本发明的方法(2)，通过将与多种细菌广泛产生抗原抗体反应的通用性抗体与仅与特定种的细菌产生特异性抗原抗体反应的特异性抗体适当地组合，能够从样本中的其他细菌、其他成分中识别出所期望的细菌，简便且有效地进行检测。特别是通过将多种特异性抗体恰当地组合使用，能够与各种所期望的组合的细菌相对应地进行检测系统的设计。另外，根据使用捕捉用抗体以及检测用抗体的免疫测定方法，能够利用任意的免疫测定方法来实施本发明的方法(2)。

具体地说，将本发明的抗体作为上述通用性抗体使用的情况下，准备与包括作为最终检测对象的细菌在内的广泛的属的(通常为5个属以上的)细菌产生抗原抗体反应(即特异性较低)的本发明的抗体，将其作为通用性抗体，并且准备在通用性抗体产生抗原抗体反应的细菌中与最终检测对象的细菌产生特异性抗原抗体反应、与其他细菌不产生抗原抗体反应的抗体，将其作为特异性抗体，将它们组合使用即可。

如上所述，通用性抗体可以作为捕捉用抗体使用、也可以作为检测用抗体使用，优选作为检测用抗体使用。检测用抗体中需要实施检测用标记，需要根据所使用的抗体种进行标记条件(pH、盐浓度、缓冲液种类等)的优化。通过使用通用性抗体作为检测用抗体，即使检测对象的细菌发生变化，也能够使用相同的通用性抗体，因此无需进行该标记条件的优化，在制造三明治分析用的试剂盒方面具有有利的效果。

另一方面，将上述通用性抗体作为上述特异性抗体使用的情况下，准备与作为最终检测对象的2个属以上的细菌产生抗原抗体反应、与除此以外的属的细菌不产生抗原抗体反应(即特异性比较高)的本发明的抗体，将其作为特异性抗体，并且准备除了检测对象的细菌以外，还与其他(本发明的抗体不产生抗原抗体反应)的广泛的属的细菌产生抗原抗体反应的抗体，将其作为通用性抗体，将它们组合使用即可。

本发明的方法(2)中，特异性抗体优选仅与有限的属的细菌产生抗原抗体反应。具体地说，特异性抗体产生抗原抗体反应的细菌的范围与作为检测对象的细菌的范围一致。仅使用单一的特异性抗体的情况下，该特异性抗体产生抗原抗体反应的细菌的范围与作为检测对象的细菌的范围一致。另一方面，在将2种以上的特异性抗体合用的情况下，只要在将这些特异性抗体分别产生抗原抗体反应的细菌的范围组合的情况下与作为检测对象的细菌的范围一致即可。特别是根据后者的方式，通过将分别与其他细菌产生抗原抗体反应的多种特异性抗体适当地组合，能够对作为检测对象的细菌的范围进行各种调整，是极为有利的。

本发明的方法(2)中，各个特异性抗体与至少1个属的细菌产生抗原抗体反应即可。各特异性抗体产生抗原抗体反应的具体的细菌属没有限定，优选至少与选自埃希氏菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、沙雷氏菌(Serratia)属、拉恩氏菌(Rahnella)属、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属、李斯特菌(Listeria)属、肠杆菌(Enterobacter)属以及沙门氏菌(Salmonella)属中的1个以上的属的细菌产生抗原抗体反应。

本发明的方法(2)中，各个通用性抗体优选为至少与选自埃希氏菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、沙雷氏菌(Serratia)属、拉恩氏菌(Rahnella)属、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属、李斯特菌(Listeria)属、肠杆菌(Enterobacter)属以及沙门氏菌(Salmonella)属中的5个以上、或者6个以上、或者7个以上、或者8个以上、或者9个以上、或者10个以上、或者11个以上的属的细菌产生抗原抗体反应的抗体。

本发明的方法(2)中，通用性抗体以及特异性抗体的结构没有特别限定，作为重链和轻链的各可变区的氨基酸序列，优选具有以下的氨基酸序列。

作为通用性抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列，优选具有与选自序列编号1、序列编号3以及序列编号5中的任意1个氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列。其中，作为VH序列，特别优选为选自序列编号1、序列编号3以及序列编号5中的任意1个氨基酸序列。

作为通用性抗体的轻链可变区(VL)的氨基酸序列，优选具有与选自序列编号2、序列编号4以及序列编号6中的任意1个氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列。其中，作为VL序列，特别优选为选自序列编号2、序列编号4以及序列编号6中的任意1个氨基酸序列。

关于作为通用性抗体优选的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列的组合没有限制，可以将具有与选自序列编号1、序列编号3以及序列编号5中的任意1个氨基酸序列具有80％以上的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的重链可变区(VH)与具有与选自序列编号2、序列编号4以及序列编号6中的任意1个氨基酸序列具有80％以上的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的轻链可变区(VL)任意地组合，其中特别优选以下任一组合。

·具有与序列编号1的氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的重链可变区(VH)与具有与序列编号2的氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的轻链可变区(VL)的组合。

·具有与序列编号3的氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的重链可变区(VH)与具有与序列编号4的氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的轻链可变区(VL)的组合。

·具有与序列编号5的氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的重链可变区(VH)与具有与序列编号6的氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的轻链可变区(VL)的组合。

另一方面，作为特异性抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列，优选具有与选自序列编号7、序列编号9、序列编号11以及序列编号13中的任意1个氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列。其中，作为VH序列，特别优选为与选自序列编号7、序列编号9、序列编号11以及序列编号13中的任意1个氨基酸序列相同的序列。

作为特异性抗体的轻链可变区(VL)的氨基酸序列，优选具有与选自序列编号8、序列编号10、序列编号12以及序列编号14中的任意1个氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列。其中，作为VL序列，特别优选为与选自序列编号8、序列编号10、序列编号12以及序列编号14中的任意1个氨基酸序列相同的序列。

关于作为特异性抗体优选的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列的组合没有限制，可以将具有与选自序列编号7、序列编号9、序列编号11以及序列编号13中的任意1个氨基酸序列具有80％以上的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的重链可变区(VH)与具有与选自序列编号8、序列编号10、序列编号12以及序列编号14中的任意1个氨基酸序列具有80％以上的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的轻链可变区(VL)任意地组合，其中特别优选以下任一组合。

·具有与序列编号7的氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的重链可变区(VH)与具有与序列编号8的氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的轻链可变区(VL)的组合。

·具有与序列编号9的氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的重链可变区(VH)与具有与序列编号10的氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的轻链可变区(VL)的组合。

·具有与序列编号11的氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的重链可变区(VH)与具有与序列编号12的氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的轻链可变区(VL)的组合。

·具有与序列编号13的氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的重链可变区(VH)与具有与序列编号14的氨基酸序列具有80％以上、尤其85％以上、进而90％以上、尤其95％以上、或者96％以上、或者97％以上、或者98％以上、或者99％以上、特别100％的同源性(优选相同性)的氨基酸序列的轻链可变区(VL)的组合。

[4.用于对样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测的试剂盒]

用于在上述本发明的方法中使用的包含上述本发明的抗体的试剂盒(本发明的试剂盒)也是本发明的对象。

本发明的试剂盒中，除了本发明的抗体以外，还包括使用本发明的抗体实施本发明的方法所需要的1种或2种以上的试剂、检测用装置或其构成部件、和/或记载了用于实施本发明的方法的过程的用法说明。该试剂的种类、用法说明的记载内容、以及本发明的试剂盒中包含的其他构成要素根据多个属的细菌的检测中使用的具体的免疫学测定方法的种类适当地决定即可。

本发明的试剂盒包含检测用装置或其构成部件的情况下，由该试剂盒构成的装置是具备使用本发明的抗体实施本发明的方法所需要的构成要素的装置(以下，为方便起见，简称为“本发明的装置”)。本发明的装置的具体构成要素可以根据作为本发明方法的具体实施方式的免疫学测定方法的种类适当地调整。如上所述，作为免疫学测定方法的示例没有限定，可以举出使用负载有抗体的微孔板的ELISA(酶结合免疫吸附)法；使用负载有抗体的胶乳颗粒(例如聚苯乙烯胶乳颗粒等)的胶乳颗粒凝集测定方法；使用负载有抗体的膜等的免疫层析法；使用利用着色颗粒或具有显色能力的颗粒、酶或荧光体等标记的检测用抗体、固定于磁气微粒等固相载体的捕捉用抗体的三明治分析法；使用1种抗体的ELISA法、生物传感器法等各种公知的免疫学测定方法，具备为了实施该各种免疫学测定方法所需要的构成要素的装置为本发明的装置。

另外，作为能够同时且简易地对样本中的多个属的细菌的有无和/或存在量进行检测的装置的具体例，可以举出侧流方式的装置、以及流通方式的装置。此处，侧流方式是相对于包含在表面固定有捕捉用抗体的检测区的膜使检测对象样本和检测用抗体平行地展开，对于被膜的检测区捕捉的目的物质进行检测的方法。另一方面，流通方式是使检测对象样本和检测用抗体垂直通过在表面固定有捕捉用抗体的膜，对于被膜的表面捕捉的目的物质进行检测的方法。本发明的方法对于侧流方式的装置和流通方式的装置中的任一者均可应用。

侧流方式的装置和流通方式的免疫层析检测装置均是公知的，对于本公开中说明的事项以外的过程，可以由本领域技术人员基于技术常识适当地设计。以下参照附图对侧流方式的免疫层析检测装置的检测机构的示意性构成进行说明，但它们终究不过是检测过程的示意性构成的一例，侧流方式的免疫层析检测装置的构成并不受附图例示方式的任何限定。

图1是示出作为侧流方式的免疫层析检测装置的检测机构的一例的条带状的检测机构的示意性构成的截面图。图1的检测机构10中，在层析展开用的不溶性膜载体1上的条带长度方向一端侧(样本流B的上游侧)配置条带状的检测用抗体含浸部件(结合垫)2(在该垫中含浸有检测用抗体)以及样本添加用部件(样品垫)3，在另一端侧(样本流B的下游侧)配置吸收用部件(吸收垫)4。在不溶性膜载体1上的条带长度方向中央部配置有固定了捕捉用抗体的部位5、根据需要固定了对照试剂的部位6。需要说明的是，对照试剂是不与被分析物质结合而与检测用抗体结合的试剂。若将样本A施加在样本添加用部件(样品垫)3上，则样本A通过检测用抗体含浸部件(结合垫)2而沿样本流A的方向流过不溶性膜载体1。此时，样本中的被分析物质(本发明中为检测对象的细菌)与检测用抗体结合，形成被分析物质-检测用抗体复合体。若样本A通过捕捉用抗体固定部位5，则样本中的被分析物质与捕捉用抗体结合，形成捕捉用抗体-被分析物质-检测用抗体复合体。此外，若样本A通过对照试剂固定部位6，则检测用抗体中的未与被分析物质结合的部分与对照试剂6结合。由此能够确认到检查的结束(即样本A通过了捕捉用抗体5)。此处，通过利用公知的手段对存在于捕捉用抗体固定部位5的捕捉用抗体-被分析物质-检测用抗体复合体中的检测用抗体所具有的标记进行检测，能够检测被分析物质的有无或存在量。可以根据需要利用公知的方法对检测用抗体的标记进行增敏而使检测变得容易。

捕捉用抗体中使用的固相载体的种类没有特别限制，具体地说，可以举出由纤维素、硝酸纤维素、乙酸纤维素、尼龙、PVDF(聚偏二氟乙烯)、玻璃纤维等构成的多孔膜；由玻璃、塑料、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、硅等构成的流路；丝、纸、纤维等。

使抗体与固相载体连结的方法也没有特别限制，具体地说，可以举出基于利用抗体的疏水性的物理吸附的固定、基于利用抗体的官能团的化学结合的固定等方法。

检测用抗体中使用的检测用标记的种类也没有特别限制，根据检测方法适当地选择即可，具体地说，可以举出胶体金、胶体铂、胶体钯等金属胶体；胶体硒、氧化铝胶体、氧化硅胶体等非金属胶体；着色树脂颗粒、染料胶体、着色脂质体等不溶性粒状物质；碱性磷酸酯酶、过氧化酶、荧光素酶等显色反应催化剂酶；荧光色素、放射性同位素；化学发光标记、生物发光标记、电化学发光标记等。

对抗体附加标记的方法也没有特别限制，具体地说，可以举出利用抗体的疏水性的物理吸附、利用抗体的官能团的化学结合等方法。

需要说明的是，检测用抗体含浸部件(结合垫)2和样本添加用部件(样品垫)3也可以任意省略。本机构中在不具有检测用抗体含浸部件(结合垫)2的情况下，将样本A和检测用抗体以预先混合的状态或分开的状态同时或依次施加至不溶性膜载体1上的一端，由此可以进行与上述检查同样的检查。

另外，将捕捉用抗体与检测用抗体替换也能够构建可进行同样检测的检测试剂盒。即，可以使捕捉用抗体为通用性抗体、检测用抗体为特异性抗体，也可以使检测用抗体为通用性抗体、捕捉用抗体为特异性抗体。另外，可以使上述通用性抗体和特异性抗体中的任一者或两者为本发明的抗体，这一点如上所述。

其中更优选如上述那样使检测用抗体为通用性抗体。作为示例，在使用胶体金作为检测用标记的情况下，需要根据所使用的抗体种进行标记条件(pH、盐浓度、封闭剂、缓冲液种类、分散液种类、离心条件等)的过度优化。另一方面，由于捕捉用抗体仅在不溶性膜载体上进行涂布·干燥，因此不需要根据抗体种进行过度的条件优化。本发明的通用性抗体不论细菌种如何均广泛地进行抗原抗体反应，因此即使检测对象的细菌发生变化，也能够使用相同的通用性抗体(检测用抗体)，因此不必进行该过度的标记条件优化，对制造免疫层析试剂盒发挥出非常有利的效果。

在以上说明的本发明的一个方式的侧流方式的免疫层析检测方法和装置中，能够将作为检测对象的2个以上的属的细菌在单一的检测线(图1的示例中为捕捉用抗体固定部位5)上一并进行检测。在现有的侧流方式的免疫层析检测方法和装置中，在对多个检测对象物进行检测的情况下，必须针对各检测对象物分别设置检测线(图1的示例中为捕捉用抗体固定部位5)，进而需要设置与检测对象物的数目相对应的检测线。因此会招致装置的大型化，而且在检测对象物的数目过多的情况下，利用一台装置的检测根本难以进行或不可能进行。与之相对，在本发明的一个方式的侧流方式的免疫层析检测方法和装置中，通过将检测用抗体和捕捉用抗体的组合适当地组合，能够利用单一的检测线同时进行多个属的检测对象细菌的检测。由此能够进行装置的小型化，并且即使在检测对象细菌的种数·属数多的情况下，在原理上也能够利用一台装置进行检测，能够利用单一的检测线对检测对象细菌的总量进行判定。

另外，本发明还提供一种用于制造上述免疫层析试剂盒的方法，其至少包括下述工序：将附着有上述检测用抗体的上述结合垫层积在上述不溶性膜载体上的工序；以及相对于上述不溶性膜载体上的上述结合垫在层析展开方向上固定上述捕捉用抗体的工序。

此处，上述捕捉用抗体和检测用抗体中，可以将任一者作为上述特异性抗体、将任一者作为上述通用性抗体，但优选作为上述捕捉用抗体使用上述特异性抗体、作为上述检测用抗体使用上述通用性抗体。

此处，作为上述特异性抗体，优选为至少与选自埃希氏菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、沙雷氏菌(Serratia)属、拉恩氏菌(Rahnella)属、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属、李斯特菌(Listeria)属、肠杆菌(Enterobacter)属以及沙门氏菌(Salmonella)属中的1个以上的属的检测对象细菌产生特异性抗原抗体反应的抗体。

另外，作为通用性抗体，优选为至少与选自埃希氏菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、沙雷氏菌(Serratia)属、拉恩氏菌(Rahnella)属、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属、李斯特菌(Listeria)属、肠杆菌(Enterobacter)属以及沙门氏菌(Salmonella)属中的5个以上的属的检测对象细菌产生特异性抗原抗体反应。

根据上述本发明的免疫层析试剂盒的制造方法，在对多种变体的免疫层析试剂盒进行制造/量产时，能够共同使用相同的通用性抗体作为检测用抗体，因此仅通过进行捕捉用抗体的选择即能够制造出多种免疫层析试剂盒，从这方面出发也是极为有效的。

实施例

以下举出实施例更详细地说明本发明。但是，本发明并不受以下的实施例的束缚，可在不脱离本发明的主旨的范围内以任意的方式进行实施。

[1.抗体的制作]

·通用性抗体A(PA51B2)的制作

作为免疫原的细菌使用绿脓杆菌(PA)。参照国际公开第2000/06603号公报中记载的方法制作针对绿脓杆菌的核糖体蛋白L7/L12的抗体。具体地说，将利用重组有编码绿脓杆菌的核糖体蛋白L7/L12的全长氨基酸序列的DNA的表达载体进行了转化的大肠杆菌利用LB培养基等进行培养，通过亲和柱利用表达载体来源的标签序列以融合蛋白的形式进行纯化。将该绿脓杆菌L7/L12全长蛋白质作为免疫原，按照取得杂交瘤的常规方法利用PBS制备成免疫原的浓度为0.4mg/mL，加入同量的弗氏佐剂，按照免疫原量为50μg/次的方式对小鼠进行4次免疫。通过试验采血确认到血清抗体价上升后，摘出小鼠的脾脏细胞。将所摘出的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，取得各种杂交瘤。

将所取得的各种杂交瘤用HAT培养基培养，使用培养上清中的抗体进行筛选。关于筛选，通过将多个属的细菌溶解物作为抗原进行了固相化的ELISA法实施，选择出产生与大肠杆菌(EC)、金黄色葡萄球菌(SA)、绿脓杆菌(PA)、枯草芽孢杆菌(BS)、肺炎克雷伯氏菌(KP)、液化沙雷氏菌(SL)、水生拉恩氏菌(RA)、弗氏柠檬酸杆菌(CF)、单核细胞增多性李斯特菌(LM)、阴沟肠杆菌(ECL)以及肠炎沙门氏菌(SE)这11个菌种的细菌溶解物同时显示出反应性的抗体的杂交瘤。按照单克隆抗体产生的常规方法对于所选择的杂交瘤利用添加有10％胎牛血清(FBS)的TIL MediaI培养基进行培养，施用至小鼠腹腔内，回收腹水。将回收的腹水通过离心而分离出悬浮物·红细胞后，利用网孔0.45μm的过滤器进行过滤。使所得到的滤液通过Protein G柱而使抗体被吸附，由此由小鼠腹水中纯化获得对应于本发明的抗体的通用性抗体A(PA51B2)。

·通用性抗体B(LP54A3)的制作

作为免疫原的细菌使用军团菌(LP)，将军团菌的核糖体蛋白L7/L12作为免疫原，除此以外利用与通用性抗体A的取得过程同样的过程制作对应于本发明的抗体的通用性抗体B(LP54A3)。

·通用性抗体C(CP141A190.1)的制作

作为免疫原的细菌使用披衣菌(CP)，将披衣菌的核糖体蛋白L7/L12作为免疫原，除此以外利用与通用性抗体A的取得过程同样的过程制作对应于本发明的抗体的通用性抗体C(CP141A190.1)。

·特异性抗体A(HI142D11.3)的制作

作为免疫原的细菌使用流感嗜血杆菌(HI)。参照国际公开第2000/06603号公报中记载的方法制作针对流感嗜血杆菌的核糖体蛋白L7/L12的抗体。具体地说，将利用重组有编码流感嗜血杆菌的核糖体蛋白L7/L12的全长氨基酸序列的DNA的表达载体进行了转化的大肠杆菌利用LB培养基等进行培养，通过亲和柱利用表达载体来源的标签序列以融合蛋白的形式进行纯化。将该流感嗜血杆菌L7/L12全长蛋白质作为免疫原，按照取得杂交瘤的常规方法利用PBS制备成免疫原的浓度为0.4mg/mL，加入同量的弗氏佐剂，按照免疫原量为50μg/次的方式对小鼠进行4次免疫。通过试验采血确认到血清抗体价上升后，摘出小鼠的脾脏细胞。将所摘出的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，取得各种杂交瘤。

将所取得的各种杂交瘤用HAT培养基培养，使用培养上清中的抗体进行筛选。关于筛选，通过上述ELISA法实施，选择出产生与9个菌种(大肠杆菌(EC)、绿脓杆菌(PA)、肺炎克雷伯氏菌(KP)、液化沙雷氏菌(SL)、水生拉恩氏菌(RA)、弗氏柠檬酸杆菌(CF)、单核细胞增多性李斯特菌(LM)、阴沟肠杆菌(ECL)以及肠炎沙门氏菌(SE))的细菌溶解物同时显示出反应性的抗体的杂交瘤。按照单克隆抗体产生的常规方法对于所选择的杂交瘤利用添加有10％胎牛血清(FBS)的TIL MediaI培养基进行培养，施用至小鼠腹腔内，回收腹水。将回收的腹水通过离心而分离出悬浮物·红细胞后，利用网孔0.45μm的过滤器进行过滤。使所得到的滤液通过Protein G柱而使抗体被吸附，由此，所得到的特异性抗体A(HI142D11.3)由小鼠腹水中纯化获得。

·特异性抗体B(SA75B2)的制作

同样地，作为免疫原的细菌使用金黄色葡萄球菌(SA)，利用与上述同样的过程取得各种杂交瘤后，选择出产生与2个菌种(金黄色葡萄球菌(SA)和枯草芽孢杆菌(BS))的细菌溶解物显示出反应性的抗体的杂交瘤。其后利用与上述同样的过程制作特异性抗体B(SA75B2)。

·特异性抗体C(PA78A2)的制作

作为免疫原的细菌使用绿脓杆菌(PA)，将绿脓杆菌的核糖体蛋白L7/L12作为免疫原，除此以外利用与通用性抗体A的取得过程同样的过程取得各种杂交瘤，之后选择出产生与绿脓杆菌(PA)1个菌种的细菌溶解物显示出反应性的抗体的杂交瘤。其后利用与上述同样的过程制作特异性抗体C(PA78A2)。

·特异性抗体D(EC50C1)的制作

同样地，作为免疫原的细菌使用大肠杆菌(EC)，将大肠杆菌的核糖体蛋白L7/L12作为免疫原，除此以外利用与通用性抗体A的取得过程同样的过程取得各种杂交瘤，之后选择出产生与大肠杆菌(EC)、肺炎克雷伯氏菌(KP)、液化沙雷氏菌(SL)、水生拉恩氏菌(RA)、弗氏柠檬酸杆菌(CF)、阴沟肠杆菌(ECL)以及肠炎沙门氏菌(SE)这7个菌种的细菌溶解物显示出反应性的抗体的杂交瘤。其后利用与上述同样的过程制作特异性抗体D(EC50C1)。

·通用性抗体A～C以及特异性抗体A～D的重链和轻链各可变序列的氨基酸序列 确定

对于利用上述过程制作的通用性抗体A～C(本发明的抗体)以及特异性抗体A～D，按照常规方法确定重链和轻链各可变序列的氨基酸序列的一例。各氨基酸序列与各序列编号的对应如下所示。

·通用性抗体A(PA51B2)：

重链可变序列·氨基酸序列(序列编号1)

轻链可变序列·氨基酸序列(序列编号2)

·通用性抗体B(LP54A3)：

重链可变序列·氨基酸序列(序列编号3)

轻链可变序列·氨基酸序列(序列编号4)

·通用性抗体C(CP141A190.1)：

重链可变序列·氨基酸序列(序列编号5)

轻链可变序列·氨基酸序列(序列编号6)

·特异性抗体A(HI142D11.3)：

重链可变序列·氨基酸序列(序列编号7)

轻链可变序列·氨基酸序列(序列编号8)

·特异性抗体B(SA75B2)：

重链可变序列·氨基酸序列(序列编号9)

轻链可变序列·氨基酸序列(序列编号10)

·特异性抗体C(PA78A2)：

重链可变序列·氨基酸序列(序列编号11)

轻链可变序列·氨基酸序列(序列编号12)

·特异性抗体D(EC50C1)：

重链可变序列·氨基酸序列(序列编号13)

轻链可变序列·氨基酸序列(序列编号14)

[2.抗体与细菌的抗原抗体反应的检测1/溶菌抗原固相ELISA]

使用利用上述过程制作的通用性抗体A～C(本发明的抗体)以及特异性抗体A～D，利用ELISA法取得与多个属的细菌的反应性的相关数据。作为多个属的细菌，选择在饮食品或环境样本中的检测频率高的大肠杆菌(EC)、金黄色葡萄球菌(SA)、绿脓杆菌(PA)、枯草芽孢杆菌(BS)、肺炎克雷伯氏菌(KP)、液化沙雷氏菌(SL)、水生拉恩氏菌(RA)、弗氏柠檬酸杆菌(CF)、单核细胞增多性李斯特菌(LM)、阴沟肠杆菌(ECL)以及肠炎沙门氏菌(SE)这11个菌种。由ATCC购入上述各细菌并培养，分别按各自为1×e⁸cfu/mL进行准备，混悬在PBS中。通过超声波处理将各细菌溶菌，利用网孔0.45μm的过滤器进行过滤除去碎片，由此得到各细菌的细菌溶解物。

在ELISA用的96孔聚苯乙烯微板的各孔中将上述细菌溶解物各自滴加50μL，固相化于微板底面。将各孔用PBS-T(加入有Tween 20的PBS)清洗3次后，利用加入有1％BSA(牛血清白蛋白)的PBS实施封闭处理。封闭后，用PBS-T清洗3次，之后将10μg/mL的通用性抗体A～C以及特异性抗体A、B在各孔中各自滴加50μL，进行1小时抗原抗体反应。反应后，用PBS-T清洗3次，之后将0.5μg/mL的标记有作为检测用酶的HRP(辣根过氧化物酶)的2次抗体(山羊抗小鼠IgG)各自滴加50μL，进行反应。反应后，用PBS-T清洗5次，之后将作为显色底物的TMB(四甲基联苯胺)与过氧化氢的混合物在各孔中各自滴加100μL，进行显色反应。10分钟后，在各孔中滴加作为反应停止液的盐酸，之后用读板仪测定各孔在450nm的吸光度。

将测定结果示于下表1。根据该表所示的结果显示出，与不含菌的样本相比，通用性抗体A～C与上述各细菌的样本灵敏度良好地(吸光度对于任一菌均为0.3以上，大多数情况下为1.0以上)发生反应。即确认到了，利用不同细菌进行免疫而取得的通用性抗体A～C均可与上述各细菌的样本产生抗原抗体反应(能够检测)。另一方面，特异性抗体A～D仅与特定的细菌显示出抗原抗体反应性。

[表1]

表1

-：吸光度小于0.3

+：吸光度0.3以上

[3.抗体与细菌的抗原抗体反应的检测2/重组抗原固相ELISA]

使用利用上述过程制作的通用性抗体A～C(本发明的抗体)以及特异性抗体A～D，利用ELISA法取得与多个属的细菌的核糖体蛋白L7/L12的反应性的相关数据。作为多个属的细菌，选择在饮食品或环境样本中的检测频率高的大肠杆菌(EC)、金黄色葡萄球菌(SA)、绿脓杆菌(PA)、枯草芽孢杆菌(BS)、肺炎克雷伯氏菌(KP)、液化沙雷氏菌(SL)、水生拉恩氏菌(RA)、弗氏柠檬酸杆菌(CF)、单核细胞增多性李斯特菌(LM)、阴沟肠杆菌(ECL)以及肠炎沙门氏菌(SE)这11个菌种。将利用重组有编码各菌种的核糖体蛋白L7/L12的氨基酸序列的DNA的表达载体进行了转化的大肠杆菌利用LB培养基等进行培养，通过亲和柱利用表达载体来源的标签序列以融合蛋白的形式进行纯化，由此取得各菌种的核糖体蛋白L7/L12。

在ELISA用的96孔聚苯乙烯微板的各孔中将10ng/mL的各菌种的核糖体蛋白L7/L12各自滴加50μL，在底面固相化。用PBS-T(加入有Tween20的PBS)将各孔清洗3次后，用加入有1％BSA(牛血清白蛋白)的PBS实施封闭处理。封闭后，用PBS-T清洗3次，之后将10μg/mL的通用性抗体A～C以及特异性抗体A～D中的任一者在各孔中各自滴加50μL，进行1小时抗原抗体反应。反应后，用PBS-T清洗3次，之后将0.5μg/mL的标记有作为检测用酶的HRP(辣根过氧化物酶)的2次抗体(山羊抗小鼠IgG)各自滴加50μL，进行反应。反应后，用PBS-T清洗5次，之后将作为显色底物的TMB(四甲基联苯胺)与过氧化氢的混合物在各孔中各自滴加100μL，进行显色反应。10分钟后，在各孔中滴加作为反应停止液的盐酸后，利用读板仪测定各孔在450nm的吸光度。

将测定结果示于下表2。根据该表显示出，与不含菌的样本相比，通用性抗体A～C与上述各细菌的样本灵敏度良好地(吸光度对于任一菌均为0.3以上，大多数情况下为1.0以上)发生反应。即确认到了，利用不同细菌进行免疫而取得的通用性抗体A～C均可与上述各细菌样本的核糖体蛋白L7/L12产生抗原抗体反应(能够检测)。另一方面，特异性抗体A～D仅与特定细菌显示出抗原抗体反应性。

[表2]

表2

-：吸光度小于0.3

+：吸光度0.3以上

[4.抗体与饮食品·环境样本中的非细菌成分的交叉反应性的验证/固相ELISA]

使用利用上述过程制作的通用性抗体A～C(本发明的抗体)以及特异性抗体A～D，利用ELISA法取得与各种饮食品·环境样本中的非细菌成分(饮食品·环境成分)的反应性的相关数据。作为食品样本，由超市购入活鱼(鰤鱼、鲹鱼)、生面条(炒面)、生蛋、副食(马铃薯沙拉)、蔬菜(黄瓜(果菜)、胡萝卜(根菜)、以及莴苣(叶菜))、精肉及加工肉(牛肋排肉、牛梅花肉、猪通脊、鸡胸肉、以及火腿)来进行使用。将这些食材各称量25g，装入市售的均质袋中，加入225ml的PBS进行均质处理。将均质处理液的一部分用网孔0.45μm的过滤器去除包含细菌的固体物质，由此制成ELISA用的不包含细菌的食品样品。作为饮料样本，由超市购入牛奶和茶来进行使用。将这些饮料分别按照1/10的浓度混悬在PBS中，利用网孔0.45μm的过滤器去除包含细菌的固体物质，制成ELISA用的不包含细菌的饮料样品。作为环境样本，将手指、砧板、菜刀、冰箱的把手使用市售的擦拭用试剂盒(ELMEX公司制造Pro·mediaST-25、PBS)擦拭样本表面，混悬在试剂盒附带的PBS中后，用网孔0.45μm的过滤器去除包含细菌的固体物质，由此制成ELISA用的不含细菌的环境样品。

将上述饮食品样品和环境样品在ELISA用的96孔聚苯乙烯微板的各孔中各自滴加50μL，固相化于微板底面。将各孔用PBS-T清洗3次后，用加入有1％BSA的PBS实施封闭处理。封闭后，用PBS-T清洗3次，之后将10μg/mL的通用性抗体A～C以及特异性抗体A～D在各孔中各自滴加50μL，进行1小时反应。反应后，用PBS-T清洗3次，之后将0.5μg/mL的标记有作为检测用酶的HRP的2次抗体(山羊抗小鼠IgG)各自滴加50μL，进行反应。反应后，用PBS-T清洗5次后，将作为显色底物的TMB与过氧化氢的混合物在各孔中各自滴加100μL，进行显色反应。10分钟后，将作为反应停止液的盐酸滴加至各孔中，之后利用读板仪测定各孔在450nm的吸光度。

将测定结果示于下表3。由该表所示的结果显示出，通用性抗体A～C与不包含上述细菌的饮食品·环境样本中的任一成分均不发生反应(吸光度均小于0.3)。与上述实施例的结果合并可确认到，通用性抗体A～C均与上述饮食品·环境样本中的任一非细菌成分(饮食品·环境成分)不发生反应、仅与作为检测对象的特定的多个属的细菌发生反应，即能够高选择性地对饮食品·环境样本中的作为检测对象的特定的多个属的细菌的有无和/或存在量进行检测。另外，特异性抗体A～D也与饮食品·环境样本中的非细菌成分中的任一者均未显示出交叉反应性。

[表3]

表3

-：吸光度小于0.3

+：吸光度0.3以上

[5.免疫层析检测试剂盒的制作]

·免疫层析检测试剂盒的制作：

将对应于本发明的抗体的上述通用性抗体A作为2次抗体(检测用抗体)，将上述特异性抗体A～D作为1次抗体(捕捉用抗体)，按照下述表4的(a)～(c)中记载的组合进行使用，制作3种免疫层析检测试剂盒(a)～(c)。另外，更换1次抗体和2次抗体中使用的抗体的种类，按照下述表4的(d)～(f)中记载的组合进行使用，制作出能够进行同样检测的检测试剂盒。特别通过使用共用的通用性抗体A作为检测用抗体，不必进行针对每种抗体的标记条件的过度优化，能够简便地构建各种检测试剂盒。

[表4]

·免疫层析图谱展开用膜载体的制作：

制备在10mM磷酸钠缓冲液溶液中包含1次抗体((a)为特异性抗体C、(b)为特异性抗体D、(c)为特异性抗体A、B的混合物)1.5mg/mL以及海藻糖3％(v/v)的溶液。将所得到的溶液按照每1cm²的液量为1μL的量涂布至被切割成宽度2.5cm、长度15cm的市售的硝酸纤维素膜，进行干燥，制成免疫层析展开用膜载体。

·胶体金标记检测用抗体和胶体金标记检测用抗体含浸部件的制作：

在管中加入市售的胶体金溶液(粒径60nm)后，加入100mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)进行混合。向其中加入2次抗体(通用性抗体A)1/10量并进行混合，制备抗体浓度0.1mg/mL的溶液。将该溶液在室温下静置30分钟，使抗体结合在胶体金颗粒表面。其后按照胶体金溶液中的最终浓度为0.1％的方式加入酪蛋白溶液并进行混合，静置60分钟，由此实施封闭处理。将该溶液以8000g离心分离20分钟后，用移液管去除上清。向其中加入胶体金分散液(0.25％酪蛋白、40mM NaCl、5％蔗糖、10mM Tris-HCl(pH8.2))，将其混合进行再分散，制备胶体金标记检测用抗体溶液。使该检测用抗体溶液渗入到市售的玻璃纤维片中，之后进行干燥，制成胶体金标记检测用抗体含浸部件。

·免疫层析检测试剂盒的装配：

除了利用上述过程制作的免疫层析展开用膜载体以及胶体金标记检测用抗体含浸部件以外，进一步准备作为样本添加用部件的棉布、以及作为吸收用部件的滤纸。之后，将这些部件贴合至市售的聚乙烯基材后，以5mm宽度进行切割，制作具有与图1同样构成的检测机构的免疫层析检测试剂盒。

[6.基于免疫层析检测试剂盒的细菌的检测]

分别使用上述制作的免疫层析检测试剂盒(a)～(c)，进行多个属的细菌的检测。作为细菌，选择在饮食品·环境样本中的检测频率高的大肠杆菌(EC)、金黄色葡萄球菌(SA)、绿脓杆菌(PA)、枯草芽孢杆菌(BS)、肺炎克雷伯氏菌(KP)、液化沙雷氏菌(SL)、水生拉恩氏菌(RA)、弗氏柠檬酸杆菌(CF)、单核细胞增多性李斯特菌(LM)、阴沟肠杆菌(ECL)以及肠炎沙门氏菌(SE)这11个菌种。将上述11个菌种分别按各自为1×e⁸cfu/mL进行准备，混悬在PBS中。利用超声波处理将各细菌溶菌，得到11个菌种的细菌溶解物(免疫层析分析用细菌样品)。另外，准备未加入有细菌溶解物的PBS溶液作为不含菌的样品。在这些各样品中添加作为免疫层析展开用的Tween20以使最终浓度为1％，制作免疫层析用的样品。

将所制作的样品(不含菌的样品以及11种细菌溶解物的样品)添加至上述免疫层析检测试剂盒的样本添加用部件区，30分钟后，目视确认膜载体的捕捉用抗体涂布部位的线显色。

将所制作的样品(不含菌的样品以及11种细菌溶解物的样品)添加到上述条件(a)～(c)的免疫层析检测试剂盒的样本添加用部件区，30分钟后，目视确认膜载体的捕捉用抗体涂布部位的线显色。将结果示于下表5。根据该表的结果，如预期那样，利用检测试剂盒(a)仅检测到绿脓杆菌(PA)这1个菌种，利用检测试剂盒(b)检测到属于肠杆菌科细菌的7个菌种，利用检测试剂盒(c)检测到全部11个菌种(全部细菌)。即显示出，通过将仅与限定的属的细菌产生抗原抗体反应的特异性抗体(上述的特异性抗体A(PA78A2)、特异性抗体B(EC50C1)、特异性抗体C(HI142D11.3)、特异性抗体D(SA75B2))与通用性抗体(与多数属的细菌广泛地产生抗原抗体反应的抗体)(上述的通用性抗体A(PA51B2))根据目的制成免疫层析检测试剂盒，能够简便·迅速地对检测目标细菌进行检测。

如上所述，即使检测对象的菌种改变，也能够使用共用的通用性抗体(进一步优选作为检测用抗体使用)，通过与对应于检测对象菌种的特异性抗体(进一步优选作为捕捉用抗体使用)进行组合，能够在不进行过度的条件研究的情况下制造出能够检测对象菌种的免疫层析试剂盒。需要说明的是，对于使用了上述表4的(d)～(f)的组合的检测试剂盒，也得到了同样的结果。

[表5]

表5

-：目视阴性

+：目视阳性

[7.基于免疫层析检测试剂盒的抗体与饮食品·环境成分的交叉反应性的验证]

分别使用上述制作的免疫层析检测试剂盒(a)～(c)，取得与各种饮食品·环境样本中的非细菌成分(饮食品·环境成分)的反应性相关的数据。作为食品样本，由超市购入活鱼(鰤鱼、鲹鱼)、生面条(炒面)、生蛋、副食(马铃薯沙拉)、蔬菜(黄瓜(果菜)、胡萝卜(根菜)、以及莴苣(叶菜))、精肉及加工肉(牛肋排肉、牛梅花肉、猪通脊、鸡胸肉、以及火腿)来进行使用。将这些食材各称量25g，装入市售的均质袋中，加入225ml的PBS进行均质处理。将均质处理液的一部分用网孔0.45μm的过滤器去除包含细菌的固体物质，由此制成免疫层析用样品。作为饮料样本，由超市购入牛奶和茶来进行使用。将这些饮料分别按照1/10的浓度混悬在PBS中，利用网孔0.45μm的过滤器去除包含细菌的固体物质，由此制成免疫层析用样品。作为环境样本，将手指、砧板、菜刀、冰箱的把手使用市售的擦拭用试剂盒(ELMEX公司制造Pro·mediaST-25、PBS)擦拭样本表面，混悬在试剂盒附带的PBS中后，用网孔0.45μm的过滤器去除包含细菌的固体物质，由此制成免疫层析用样品。

将上述制作的各种饮食品·环境样本的免疫层析用样品添加至上述免疫层析检测试剂盒(a)～(c)各自的样本添加用部件区，30分钟后，目视确认膜载体的捕捉用抗体涂布部位的线显色。将结果示于表6。如预期那样，检测试剂盒(a)～(c)对于上述饮食品·环境样本中的成分未显示出交叉反应性。与上述实施例合并确认到，将上述通用性抗体与特异性抗体组合而制作出的免疫层析检测试剂盒(a)～(c)与上述饮食品·环境样本中的非细菌成分(饮食品·环境成分)不发生反应，能够以高选择性简便·迅速地仅对于作为检测对象的多个属的细菌进行检测。需要说明的是，对于使用了上述表4的(d)～(f)的组合的检测试剂盒也得到了同样的结果。

[表6]

表6

-：目视阴性

+：目视阳性

工业实用性

本发明能够在要求对饮食品·环境·生物体样本中的多个属的细菌同时且简便地进行检测的领域、主要是医疗、饮食品的领域中广泛应用，其在产业上的有用性极高。

符号的说明

10 检测机构

1 层析展开用不溶性膜载体

2 检测用抗体含浸部件(结合垫)

3 样本添加用部件(样品垫)

4吸收用部件(吸收垫)

5 捕捉用抗体固定部位

6 对照试剂固定部位

A 样本

B 样本流

序列表

<110> 旭化成株式会社

<120> 用于对饮食品样本、环境样本或生物体样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测的方法和试剂盒

<130> 200620WO01

<150> JP 2021-004806

<151> 2021-01-15

<150> JP 2021-004815

<151> 2021-01-15

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA51B2 VH

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Pro Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Ser

20 25 30

Trp Met His Trp Thr Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile His Pro Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Arg Val Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Thr Tyr

65 70 75 80

Val Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gly Asp Phe Asp Ala Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 2

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA51B2 VL

<400> 2

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Arg Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 3

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LP54A3 VH

<400> 3

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Met Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ala Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Val Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Ser

65 70 75 80

Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Glu Ser Leu Asp Asp Met Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LP54A3 VL

<400> 4

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Val Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Leu Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CP141A190.1 VH

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Ser Asn

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Ala Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ser Arg Gly Asp Phe Asp Glu Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 6

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CP141A190.1 VL

<400> 6

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Asn Val Asn Ser Asp

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Asn Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro

85 90 95

Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HI142D11.3 VH

<400> 7

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Pro Arg Pro Tyr Gly Tyr Val Gly Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HI142D11.3 VL

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Asn Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Asp Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SA75B2 VH

<400> 9

Glu Val Leu Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

His Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Val Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala

115

<210> 10

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SA75B2 VL

<400> 10

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 11

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA78A2 VH

<400> 11

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Phe Leu Asn Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ile Asp Ile

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Ser Ala Asn Gly Lys Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ser Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Ser Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ala

<210> 12

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA78A2 VL

<400> 12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ile Leu Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 13

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EC50C1 VH

<400> 13

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asp Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Trp Ala Tyr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EC50C1 VL

<400> 14

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Arg Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

Claims (33)

1.一种用于对选自饮食品样本、环境样本以及生物体样本的样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测的方法，其中，该方法包括：

检测工序，基于抗原抗体反应对样本中的至少2个以上不同属的细菌的有无和/或存在量同时进行检测。

2.如权利要求1所述的方法，其中，在所述检测工序中，对选自由埃希氏菌(Escherichia)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、沙雷氏菌(Serratia)属、拉恩氏菌(Rahnella)属、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属、李斯特菌(Listeria)属、肠杆菌(Enterobacter)属以及沙门氏菌(Salmonella)属组成的组中的2个以上不同属的细菌同时进行检测。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述作为检测对象的2个以上的属的细菌包含革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌这两者。

4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，在所述检测工序中，对至少3个以上、或者4个以上、或者5个以上、或者6个以上、或者7个以上、或者8个以上、或者9个以上、或者10个以上、或者11个以上的不同属的细菌同时进行检测。

5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述检测工序包括：

使与来源于所述2个以上的属的细菌的成分产生抗原抗体反应的抗体与样本接触的工序；以及

对于在接触后的样本中产生的抗原抗体反应的有无和/或强度进行测定的工序。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述抗体是与所述2个以上的属的细菌的核糖体蛋白L7/L12产生抗原抗体反应的抗体。

7.如权利要求5或6所述的方法，其中，在所述抗体与样本接触前，进一步包括：

将样本中的细菌溶菌的工序。

8.如权利要求5～7中任一项所述的方法，其中，所述抗体不与可能存在于样本中的1种或2种以上的非细菌来源成分产生交叉反应。

9.如权利要求8所述的方法，其中，不与所述抗体产生交叉反应的非细菌来源成分是来源于病毒、植物和/或动物的有机物成分。

10.如权利要求5～9中任一项所述的方法，其中，所述抗体为单克隆抗体或其片段、或者它们的衍生物。

11.如权利要求10所述的方法，其中，所述单克隆抗体或其片段、或者它们的衍生物分别包含：

作为重链可变区序列的与选自序列编号1、序列编号3以及序列编号5中的至少任一氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；以及

作为轻链可变区序列的与选自序列编号2、序列编号4以及序列编号6中的至少任一氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列。

12.如权利要求11所述的方法，其中，所述单克隆抗体或其片段、或者它们的衍生物中，

作为重链可变区序列具有与序列编号1的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，作为轻链可变区序列具有与序列编号2的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；或者

作为重链可变区序列具有与序列编号3的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，作为轻链可变区序列具有与序列编号4的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；或者

作为重链可变区序列具有与序列编号5的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，作为轻链可变区序列具有与序列编号6的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列。

13.如权利要求5～12中任一项所述的方法，其中，所述方法包括通过下述工序(I)和工序(II)对样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测的步骤，

工序(I)：通过样本、与固相载体连结的捕捉用抗体、以及具有检测用标记的检测用抗体的抗原抗体反应，捕捉样本中的细菌，同时对样本中的细菌进行标记，

工序(II)：基于检测用标记对样本中的检测对象细菌进行检测，

而且，捕捉用抗体和检测用抗体中，一者的抗体是与1种或2种以上的检测对象细菌产生抗原抗体反应的1种或2种以上的特异性抗体，另一者的抗体是与包括所述检测对象细菌在内的5个以上的属的细菌产生抗原抗体反应的1种或2种以上的通用性抗体，

并且，所述通用性抗体或所述特异性抗体中的任一者为权利要求5～12任一项中记载的抗体。

14.如权利要求13所述的方法，其中，所述工序(I)包括：

(Ia-1)使样本与检测用抗体接触，通过检测用抗体与细菌的抗原抗体反应而对样本中的细菌进行标记的工序；以及

(Ia-2)使包含利用检测用抗体进行了标记的细菌的样本与捕捉用抗体接触，通过捕捉用抗体与细菌-检测用抗体复合体的抗原抗体反应而捕捉样本中的细菌的工序。

15.如权利要求13所述的方法，其中，所述工序(I)包括：

(Ib-1)使样本与捕捉用抗体接触，通过捕捉用抗体与细菌的抗原抗体反应而捕捉样本中的细菌的工序；以及

(Ib-2)使包含利用捕捉用抗体进行了捕捉的细菌的样本与检测用抗体接触，通过检测用抗体与细菌-捕捉用抗体复合体的抗原抗体反应而对样本中的细菌进行标记的工序。

16.如权利要求13～15中任一项所述的方法，其中，捕捉用抗体为通用性抗体，检测用抗体为特异性抗体。

17.如权利要求13～15中任一项所述的方法，其中，检测用抗体为通用性抗体，捕捉用抗体为特异性抗体。

18.如权利要求13～17中任一项所述的方法，其中，通用性抗体至少与选自埃希氏菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、沙雷氏菌(Serratia)属、拉恩氏菌(Rahnella)属、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属、李斯特菌(Listeria)属、肠杆菌(Enterobacter)属以及沙门氏菌(Salmonella)属中的5个以上的属的细菌产生抗原抗体反应。

19.如权利要求13～18中任一项所述的方法，其中，特异性抗体至少与选自埃希氏菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、沙雷氏菌(Serratia)属、拉恩氏菌(Rahnella)属、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属、李斯特菌(Listeria)属、肠杆菌(Enterobacter)属以及沙门氏菌(Salmonella)属中的1个以上的属的细菌产生特异性抗原抗体反应。

20.如权利要求13～19中任一项所述的方法，其中，通用性抗体分别包含：

作为重链可变区序列的与选自序列编号1、序列编号3以及序列编号5中的至少任一氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；以及

作为轻链可变区序列的与选自序列编号2、序列编号4以及序列编号6中的至少任一氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列。

21.如权利要求20所述的方法，其中，通用性抗体中，

作为重链可变区序列具有与序列编号1的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，作为轻链可变区序列具有与序列编号2的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；或者

作为重链可变区序列具有与序列编号3的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，作为轻链可变区序列具有与序列编号4的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；或者

作为重链可变区序列具有与序列编号5的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，作为轻链可变区序列具有与序列编号6的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列。

22.如权利要求13～21中任一项所述的方法，其中，特异性抗体分别包含：

作为重链可变区序列的与选自序列编号7、序列编号9、序列编号11以及序列编号13中的至少任一氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；以及

作为轻链可变区序列的与选自序列编号8、序列编号10、序列编号12、以及序列编号14中的至少任一氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列。

23.如权利要求22所述的方法，其中，特异性抗体中，

作为重链可变区序列具有与序列编号7的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，作为轻链可变区序列具有与序列编号8的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；或者

作为重链可变区序列具有与序列编号9的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，作为轻链可变区序列具有与序列编号10的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；或者

作为重链可变区序列具有与序列编号11的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，作为轻链可变区序列具有与序列编号12的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列；或者

作为重链可变区序列具有与序列编号13的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，作为轻链可变区序列具有与序列编号14的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列。

24.一种用于对由选自饮食品样本、环境样本以及生物体样本的样本的细菌所致的污染度进行判定的方法，其中，该方法包括以下工序：

利用权利要求1～23中任一项所述的方法，基于抗原抗体反应对所述样本中的1个或2个以上的属的细菌的有无和/或存在量同时进行检测。

25.一种试剂盒，其是用于利用权利要求5～12中任一项所述的方法对选自饮食品样本、环境样本以及生物体样本的样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测的试剂盒，其中，该试剂盒包含权利要求5～12任一项中记载的抗体。

26.一种试剂盒，其是用于利用权利要求13～23中任一项所述的方法对选自饮食品样本、环境样本以及生物体样本的样本中的细菌的有无和/或存在量进行检测的试剂盒，其中，该试剂盒包含权利要求13～23任一项中记载的捕捉用抗体和检测用抗体，并且所述捕捉用抗体和检测用抗体中的一者为所述通用性抗体，另一者为所述特异性抗体。

27.如权利要求26所述的试剂盒，其中，

该试剂盒进一步包含用于使样本展开、进行样本与捕捉用抗体的接触的不溶性膜载体，

该试剂盒按照下述方式构成：

在所述不溶性膜载体上设置有固定了捕捉用抗体的检测线，并且

利用单一的检测线对于样本中的2种以上的细菌进行检测。

28.如权利要求26或27所述的试剂盒，其中，所述试剂盒为免疫层析试剂盒。

29.如权利要求28所述的试剂盒，其中，

所述的捕捉用抗体和检测用抗体按照可与作为检测对象的样本中的细菌的核糖体蛋白L7/L12一起进行抗原抗体反应而形成三明治结构的方式进行选择，

所述免疫层析试剂盒包含：用于使样本展开、进行样本与捕捉用抗体的接触的不溶性膜载体；以及设于所述不溶性膜载体上、附着有所述检测用抗体的结合垫，

并且，相对于所述不溶性膜载体上的所述结合垫，在层析展开方向上固定有所述捕捉用抗体。

30.一种制造方法，其是用于制造权利要求29所述的免疫层析试剂盒的方法，其中，该方法至少包括下述工序：

将附着有所述检测用抗体的所述结合垫层积在所述不溶性膜载体上的工序；以及

相对于所述不溶性膜载体上的所述结合垫，在层析展开方向上固定所述捕捉用抗体的工序。

31.如权利要求30所述的制造方法，其中，作为所述捕捉用抗体使用所述特异性抗体，作为所述检测用抗体使用所述通用性抗体。

32.如权利要求30或31所述的制造方法，其中，所述特异性抗体是至少与选自埃希氏菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、沙雷氏菌(Serratia)属、拉恩氏菌(Rahnella)属、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属、李斯特菌(Listeria)属、肠杆菌(Enterobacter)属以及沙门氏菌(Salmonella)属中的1个以上的属的检测对象细菌产生特异性抗原抗体反应的抗体。

33.如权利要求30～32中任一项所述的制造方法，其中，所述通用性抗体至少与选自埃希氏菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、沙雷氏菌(Serratia)属、拉恩氏菌(Rahnella)属、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属、李斯特菌(Listeria)属、肠杆菌(Enterobacter)属以及沙门氏菌(Salmonella)属中的5个以上的属的检测对象细菌产生特异性抗原抗体反应。