CN116963778A - 包含光敏剂单元的生物缀合物、其制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含光敏剂单元(特别是酞菁单元)和与其缀合的弹性蛋白样多肽的生物缀合物，所述弹性蛋白样多肽包含出现至少一次的具有式Xaa1PXaa2Xaa3G的单体单元，其中P代表脯氨酰基残基，G代表甘氨酰基残基，Xaa2代表甘氨酰基残基或丙氨酰基残基，并且Xaa1代表缬氨酰基残基且Xaa3代表具有式‑(CH2)z‑S‑R’侧链的含硫氨基酸残基，或者Xaa3代表缬氨酰基残基且Xaa1代表具有式‑(CH2)z‑S‑R’侧链的含硫氨基酸残基。该生物缀合物显示出特别可用于通过光动力治疗来治疗疾病。
Description
技术领域
本发明属于治疗领域，特别是光动力治疗领域。更特别地，本发明涉及包含光敏剂和生物大分子载体的生物缀合物，其显示出特别可用作光动力治疗的光敏组分，特别可用于治疗皮肤疾病、眼疾病或可应用该光动力治疗进行治疗的任何疾病。本发明还涉及制备这样的生物缀合物的方法，以及其用于通过光动力治疗来治疗疾病的用途。本发明的另一目的是包含可药用载剂中的这样的生物缀合物的药物组合物。
背景技术
光动力治疗(photodynamic therapy，PDT)是具有高选择性的有吸引力的非侵入性的疾病治疗替代物。光动力治疗尤其可用于治疗癌症，由于其与常规方法(如手术、化学治疗和放射治疗)相比，显示出更低的副作用。
光动力治疗需要三种互相作用的组分：可光激活的化合物(称为光敏剂)，适当波长的光以及氧。这些组分虽然单独无毒，但是当组合使用时产生高度有毒的活性氧物质(reactive oxygen species，ROS)(例如单线态氧(1O2))：由于通过在适当波长(通常为600至800nm)处的光选择性地激活积累在肿瘤部位处的光敏剂，能量或电子从所激活光敏剂的激发三重态转移至附近的分子氧。产生的活性氧物质对周围微环境造成多重氧化损伤。这在癌症治疗的特殊情况中具有双重作用。损害恶性细胞的代谢功能导致这些细胞的凋亡和/或坏死。还表明在光动力治疗抗癌治疗之后发生的小规模炎症激活对抗恶性细胞的天然免疫系统，导致肿瘤的完全破坏并限制肿瘤恢复的风险。
连同低暗毒性，光动力治疗的成功主要依赖于所使用光敏剂的光物理特性，并且特别是其消光系数(ε)，单线态氧(1O2)产生量子产率(ΦΔ)等，以及依赖于其在靶部位处的有效积累。
现有技术，特别是在来自Mukerji Ratul et al.,Biomaterials,2015,79:79-87的出版物中提出，在肿瘤部位处形成来自包含重组弹性蛋白样多肽的生物聚合物的稳定的水凝胶库(hydrogel depot)，所述弹性蛋白样多肽包含含有携带放射性载荷(radioactivepayload)的周期性半胱氨酸残基(cELP)并在其N端处与特异性光敏剂氯e6缀合。本文献的目的在于增强携带放射性载荷的cELP在肿瘤部位处的停留，以便进行放射性核素治疗。这通过以下实现：在体内注射生物聚合物，并且实现光敏剂的光动力刺激，以便诱导cELP的半胱氨酸残基的巯基的原位二硫交联，所述交联使生物聚合物稳定成稳定的水凝胶。这样的方法改善了后续放射性核素治疗的效率。然而，通过光动力治疗进行疾病治疗并不是最佳的，因为光敏剂固定化于所形成的水凝胶中。
在现有技术提出的光敏剂中，酞菁(一类第二代光敏剂)被认为是非常强效的。酞菁是卟啉的合成衍生物，由四个吡咯亚单位构成，每个亚单位与另外的苯并环融合并通过氮原子连接。它们呈现出数种使其成为光动力治疗的理想化合物的光物理特性。特别地，它们是稳健的并且是非常通用性的分子，在670至770nm处具有强吸收，其使得高单线态氧产生。数种基于酞菁的光敏剂(例如Photosens、Photocyanine、Pc 4、700DX)已批准用于临床使用或者处于临床试验的后期阶段。
这些光治疗剂(在分子水平上和作为纳米级的制剂二者)的进一步开发目前是令人强烈感兴趣的。
由于其固有的疏水性，酞菁分子在生理介质中具有强的聚集倾向。为了允许该类型的光敏剂的全身施用，现有技术已提出开发具有亲水性特性的酞菁衍生物。然而，酞菁骨架的不受控制的聚集倾向及其低摩尔质量，导致该类型的光敏剂的不受控制的生物分布，并且导致在将光动力治疗应用于癌症治疗的特殊情况下在肿瘤部位处的低积累。
数项研究，特别如van der Meel et al.,Nature Nanotechnology 2019,14(11),1007-1017中或Ibrahimova et al.,Nanoscale 2017,9(31),11180-11186中所述，还表明光敏剂的大分子缀合物或纳米载体改善了其生物分布、生物利用度和治疗结局，通过增加其在生理流体中的溶解度和血浆半衰期以及通过避免其快速肾清除来实现。然而，迄今为止所提出的光敏剂递送系统的效率仍然不够令人满意，特别是当光敏剂是酞菁时。
本发明旨在通过提出用于在靶部位处有效递送光敏剂的新技术来克服由现有技术提出的用于递送酞菁(并且更通常是光敏剂)的系统的缺点，特别是上述缺点，以这样的方式获得光动力治疗治疗(特别是基于酞菁的那些)的临床有效性的强的改善。
本发明人发现，该目的以及更多的目的可通过以下实现：将光敏剂与特定多肽共价偶联，更准确地与存在至少一个特定的含硫氨基酸残基(更准确地，具有含硫醚基团的侧链的氨基酸残基)并显示出最低临界共溶温度(lower critical solution temperature，LCST)相变行为的重组弹性蛋白样多肽偶联。所得的具有低LCST的疏水性生物缀合物在生理体温下自发地自组装成颗粒。然而，其在光敏剂于光动力治疗过程的光辐照步骤期间激活时被非常相同的由该光敏剂产生的活性氧物质氧化后，在生理体温下有利地转变成可溶/不稳定的亲水性化合物。然后，含硫氨基酸残基的硫醚基团的特异性氧化成亚砜导致生物缀合物的亲水性提高，所述生物缀合物显示出LCST具有从大约到远高于生理体温的值，因此触发颗粒在生理体温下的分解。由此获得的以其游离解离形式的分解的生物缀合物，然后能够更容易地扩散到致密组织中，从而有利地允许进行有效的第二光辐照步骤。光敏剂的这样的再激活然后可更深入的在病变组织中造成相当大的损害并使治疗的治疗益处最大化。
发明概述
根据第一方面，本发明涉及光敏剂单元和与其缀合的弹性蛋白样多肽，所述弹性蛋白样多肽包含出现至少一次的具有式(A)的单体单元：
XaaiPXaa2Xaa3G (A)
其中P代表脯氨酰基残基，G代表甘氨酰基残基，Xaa2代表甘氨酰基残基或丙氨酰基残基，并且：
-Xaa1代表缬氨酰基残基且Xaa3代表具有式-(CH2)z-S-R’侧链的含硫氨基酸残基，其中z等于1或2，并且R’代表直链、支链和/或环状的C1-C22烃基，其是饱和和/或不饱和、芳族或非芳族的、任选取代有、任选间插有一个或更多个杂原子和/或者包含至少一个杂原子或包含含有至少一个杂原子之基团的一个或更多个基团。
-或者Xaa3代表缬氨酰基残基且Xaa1代表具有式-(CH2)z-S-R’侧链的含硫氨基酸残基，其中z等于1或2，并且R’如上所限定。
在本发明的一些具体实施方案中，所述光敏剂选自卟啉、酞菁、基于氟硼吡咯(bodipy)的光敏剂和亚甲蓝。
光敏剂可以是维替泊芬(verteporfin)。
在本发明的一些具体实施方案中，所述光敏剂单元通过接头与所述弹性蛋白样多肽共价连接。
所述弹性蛋白样多肽可具有式(B)：
Z-[VPXaa2Xaa3G]x-OH (B)
其中：x是1至200的整数，Z代表包含1至20个氨基酸残基的肽片段，V代表缬氨酰基残基，P代表脯氨酰基残基，G代表甘氨酰基残基，Xaa2代表甘氨酰基残基或丙氨酰基残基，并且Xaa3代表选自缬氨酰基残基和具有式-(CH2)z-S-R’侧链的含硫氨基酸残基的可变氨基酸残基，z和R’如以上所限定，Xaa3使得-[VPXaa2Xaa3G]x肽片段中缬氨酰基残基/含硫氨基酸残基的摩尔比为0/1至10/1。
本发明的另一方面涉及制备根据本发明的生物缀合物的方法，其包括：
-对弹性蛋白样多肽的N端末端进行修饰以引入末端炔基，所述弹性蛋白样多肽包含出现至少一次的具有式(A)的单体单元：Xaa1PXaa2Xaa3G(A)，其中P、G、Xaa1、Xaa2和Xaa3如以上所限定，
-使光敏剂分子官能化以引入叠氮基，
-以及在如此修饰的弹性蛋白样多肽与如此官能化的光敏剂之间实现Huisgen铜(I)催化的炔烃-叠氮环加成反应。
制备根据本发明的生物缀合物的替代方法包括使光敏剂分子官能化以引入N-羟基琥珀酰亚胺激活的酯基，以及实现所述激活的基团与弹性蛋白样多肽的N端氨基的直接偶联，所述弹性蛋白样多肽包含出现至少一次的具有式(A)的单体单元：Xaa1PXaa2Xaa3G(A)，其中P、G、Xaa1、Xaa2和Xaa3如以上所限定。
本发明的另一方面是根据本发明的生物缀合物用于通过光动力治疗来治疗疾病，特别是用于治疗皮肤疾病、眼疾病或可显示出可使用该光动力治疗进行治疗的任何疾病的用途。本发明的生物缀合物可特别地用于治疗癌症。
本发明的第四方面是包含可药用载剂中的根据本发明生物缀合物的药物组合物。
附图简述
图1示意性地示出了通过实施根据本发明生物缀合物的光动力治疗来治疗癌症的方法的不同步骤。
图2示出了根据本发明的生物缀合物(TT1-ELP)以及其在甲硫氨酰基残基的硫原子化学氧化之后的衍生物(对照化合物TT1-ELP(O))的表征分析的结果。A)TT1-ELP与TT1-ELP(O)的叠加MALDI质谱。提供了ELP的谱以用于比较。B)SDS-PAGE分析。C)TT1-ELP在DMSO中的尺寸排阻色谱图(折射率(refractive index，RI)检测和UV检测(在607nm处))。D)TT1-ELP(O)在DMSO中的尺寸排阻色谱图(RI检测和UV检测(在607nm处))。E)在25℃下，TT1-ELP和TT1-ELP(O)在PBS缓冲液中的重叠吸收光谱。
图3示出了在用红光光辐照之后根据本发明的生物缀合物(TT1-ELP)的表征分析的结果。A)在5、10、15、20和30分钟期间在光辐照之后TT1-ELP的堆叠1H NMR谱(D2O，室温，200MHz)。B)TT1-ELP在光辐照之前和之后(TT1-ELPPhOx)在DMSO中的SEC色谱图(RI检测)。C)在光辐照之前(TT1-ELP)和之后(TT1-ELPPhOx)生物缀合物的SDS-PAGE分析(考马斯蓝染色)。
图4示出了显示如通过动态光散射测量的根据本发明的生物缀合物TT1-ELP的尺寸分布(强度)的图。A)在光辐照之前，在20℃和37℃下。B)在光辐照之后，在37℃下。
图5示出了根据本发明生物缀合物(TT1-ELP)的以下的结果：A)通过Cordouan(165°657nm，环境温度)获取的动态光散射；B)在PBS中于15℃下在HOPG基底上的温度控制的高速(Temperature-Controlled High-Speed)AFM(液体)图像。
图6示出了根据本发明的生物缀合物(TT1-ELP[M1V3-60]和TT1-ELP[M1V3-80])的表征分析的结果。A)在20℃下在D2O中的1H NMR谱。B)SDS-PAGE分析。
图7示出了a/根据本发明的生物缀合物(VP-ELP)以及b/其在甲硫氨酰基残基的硫原子化学氧化之后的衍生物(对照化合物VP-ELP-M(O))的MALDI质谱。
图8示出了根据本发明的生物缀合物VP-ELP在DMSO中的尺寸排阻色谱(折射率(RI)检测和UV检测(在607nm处))。
图9示出了在a/中，维替泊芬(VP)以3μM在DMF中的吸收光谱；在b/中，弹性蛋白样多肽(elastin-like polypeptide，ELP)、包含该弹性蛋白样多肽的根据本发明的生物缀合物(VP-ELP)及其在甲硫氨酰基残基的硫原子化学氧化之后的衍生物(对照化合物VP-ELP-M(O))以3mg/ml在4℃下在PBS缓冲液中的重叠吸收光谱。
图10示出了显示以下的图：在a/中，根据本发明的生物缀合物VP-ELP的2mg/ml溶液在冷却程序和加热程序(heating ramp)期间在750nm处的吸光度；在b/中，其在甲硫氨酰基残基的硫原子化学氧化之后的衍生物(对照化合物VP-ELP-M(O))的2mg/ml溶液在冷却程序和加热程序期间在750nm处的吸光度；以及在c/中，该生物缀合物及其该衍生物的浊点温度(cloud point temperature，TCP)相对于质量浓度。
图11示出了，在a/中，在15℃下于PBS pH 7.4中在不同的时间点(在光辐照之前和在光辐照5、10和15分钟之后)，存在根据本发明的生物缀合物VP-ELP的情况下的SOSG(1O2传感器)荧光光谱；在b/中，在15℃下于PBS pH 7.4中在不同的时间点(在光辐照之前和在光辐照10和15分钟之后)，存在弹性蛋白样多肽ELP的情况下的SOSG荧光光谱；在c/中，ELP和VP-ELP在激光光辐照不同时间点时的SOSG荧光强度。
图12示出了显示以下的图：在加热程序时，在辐照之前(“无辐照”)、在辐照10分钟之后(“10分钟辐照”)、在辐照30分钟之后(“30分钟辐照”)在PBS缓冲液pH 7.4中1mg/ml的根据本发明的生物缀合物VP-ELP，以及其在甲硫氨酰基残基的硫原子化学氧化之后的衍生物(对照化合物VP-ELP-M(O))(“对照”)的Z-平均值作为温度的函数。
发明详述
根据本发明的生物缀合物包含直接地或通过接头彼此缀合，即通过稳定的共价连接彼此连接的以下：
-光敏剂单元
-和弹性蛋白样多肽，其包含出现至少一次，优选数次，特别是1至200次的具有式(A)的单体单元：
Xaa1PXaa2Xaa3G (A)
其中P代表脯氨酰基残基，G代表甘氨酰基残基，Xaa2代表甘氨酰基残基或丙氨酰基残基，并且：
·Xaa1代表缬氨酰基残基且Xaa3代表含硫氨基酸残基，其可以为天然或非天然的氨基酸残基，任选经修饰，具有式-(CH2)z-S-R’的侧链，其中z等于1或2并且R’代表直链、支链和/或环状的C1-C22烃基，其为饱和和/或不饱和、芳族或非芳族的、任选取代有、任选间插有一个或更多个杂原子和/或者包含至少一个杂原子或包含含有至少一个杂原子之基团的一个或更多个基团，
·或者Xaa3代表缬氨酰基残基且Xaa1代表含硫氨基酸残基，其可以为天然或非天然的氨基酸残基，任选经修饰，具有式-(CH2)z-S-R’的侧链，其中z等于1或2并且R’代表直链、支链和/或环状的C1-C22烃基，其为饱和和/或不饱和、芳族或非芳族的、任选取代有、任选间插有一个或更多个杂原子和/或者包含至少一个杂原子或包含含有至少一个杂原子之基团的一个或更多个基团。
重组弹性蛋白样多肽是来源于原弹性蛋白(弹性蛋白的可溶性前体)的疏水结构域的人工蛋白质聚合物。它们包含具有氨基酸序列-Xaa4-Pro-Xaa5-Xaa6-Gly-(SEQ ID No:1)的重复五肽片段，其中Xaa5表示甘氨酰基残基或丙氨酰基残基，并且Xaa4和Xaa6各自表示可以是除脯氨酰基残基或其衍生物之外的任何天然或非天然氨基酸残基的可变氨基酸残基，Xaa4和Xaa6中的至少一者是缬氨酰基残基。
这些受自然启发的经遗传改造的重组弹性蛋白样多肽由于其可控的分子量、生物相容性、可生物降解性、非免疫原性和刺激响应性特性，而因此是生物医学应用特别是药物递送应用的显著的智能多肽。另外，它们可在对其分子组成的精确控制下以成本效益方式大规模地生产。
本发明的弹性蛋白样多肽包含至少一个具有式-(CH2)z-S-R’侧链的含硫氨基酸残基。其优选包含数个这样的残基，优选沿多肽骨架规则地分布的，特别是2至200个这样的残基。
在本说明书中，按照惯例，短语“含硫氨基酸残基”将用于表示具有式-(CH2)z-S-R’侧链的含硫氨基酸残基，其中z和R’如本文所限定。
术语“光敏剂”在本文中用于以常规方式表示这样的化合物，其具有将电子激发时所得到的能量(通过光辐照促进)转移至周围的氧分子，导致产生单线态氧和其他活性氧物质(ROS)的能力。
优选地，光敏剂选自酞菁、卟啉、基于氟硼吡咯的光敏剂和亚甲蓝。在本发明的一些具体实施方案中，光敏剂是苯并卟啉或其衍生物，例如维替泊芬。
在本发明的一些优选实施方案中，在Xaa1的侧链中或在Xaa3的侧链中，R’代表直链或支链的烷基，特别是C1-C3烷基，例如甲基。
在式(A)中，Xaa1和Xaa3可以是这样的：
-Xaa1代表缬氨酰基残基且Xaa3代表选自甲硫氨酰基残基、S-烷基-高半胱氨酰基残基和S-烷基-半胱氨酰基残基的氨基酸残基，所述烷基优选为直链或支链的烷基，特别是C1-C3直链或支链的烷基，例如甲基，
-或者Xaa3代表缬氨酰基残基且Xaa1代表选自甲硫氨酰基残基、S-烷基-高半胱氨酰基残基和S-烷基-半胱氨酰基残基的氨基酸残基，所述烷基优选为直链或支链烷基，特别是C1-C3直链或支链烷基，例如甲基。
在本发明的一些具体实施方案中，在式(A)中，Xaa1代表缬氨酰基残基，Xaa2代表甘氨酰基残基并且Xaa3代表甲硫氨酰基残基。然后本发明的弹性蛋白样多肽包含出现至少一次、优选数次、特别是1至200次的具有氨基酸序列VPGMG(SEQ ID No:2)的单体单元，其对应于化学式(I)：
更一般地，根据本发明的弹性蛋白样多肽优选包含由1至200个具有以下氨基酸序列的单元重复组成的肽片段：
VPXaa2XaaG(SEQ ID No：3)
其中Xaa2表示甘氨酰基残基或丙氨酰基残基，并且Xaa表示可以是除脯氨酰基残基之外的任何氨基酸残基的可变氨基酸残基，前提是至少一个Xaa残基是具有式-(CH2)z-S-R’侧链的含硫氨基酸残基，z和R’如以上所限定，特别是甲硫氨酰基残基。
由于在弹性蛋白样多肽骨架中的至少一个，并且优选数个，优选周期性间隔的这样的含硫氨基酸残基的存在，本发明的生物缀合物具有高度有利的温度和单线态氧响应性，使其特别可用于涉及光动力治疗治疗的医学应用。
在本发明的一些具体实施方案中，弹性蛋白样多肽不含未经取代的半胱氨酸残基，即，具有巯基-SH的半胱氨酸残基。
当本发明的生物缀合物用于光动力治疗过程时，弹性蛋白样多肽用作载体以将生物缀合物的光敏剂单元携带至靶部位，特别是肿瘤部位。
在生理体温下，本发明的生物缀合物不发生裂解，并且弹性蛋白样多肽确保在靶部位处对光敏剂浓度的定量控制，特别是通过阻止其在到达靶部位之前不受控制的积累和外泄。
本发明的生物缀合物在所治疗对象的体内自组装成颗粒。当对光敏剂单元进行光辐照时，生物缀合物被体内产生的单线态氧氧化。更准确地，生物缀合物的易于氧化并因此对活性氧物质高度敏感的一个或数个含硫氨基酸残基(特别是甲硫氨酰基残基)的疏水性硫醚基团被氧化成亲水性亚砜基团，该氧化反应通过生物缀合物本身的光敏剂单元来催化。
然后本发明利用根据本发明的特定弹性蛋白样多肽的反相变行为。事实上，这些多肽呈现出较低的临界溶液温度行为：在给定浓度(浊点，通常称为Tt或TCP)下低于其临界聚集温度，其链是可溶的并且大多是固有无序的，而在高于Tt以时疏水性塌陷。由于含硫氨基酸残基的硫醚基团对氧化的敏感性，因此其可以容易地氧化成亚砜，将具有低Tt的疏水性包含含硫氨基酸的多肽转变成具有高Tt的亲水性亚砜衍生物。
因此，在光辐照之后，有利地观察到生物缀合物的转变温度提高至约生理体温至远高于生理体温的值。该提高触发了已在所治疗对象体内形成的生物缀合物颗粒的分解。可以假设，通过颗粒分解所释放的单独的生物缀合分子接下来能够更深入地扩散到组织中，特别是扩散到肿瘤中，从而改善靶部位的第二光辐照步骤的效率。
此外，生物缀合物颗粒的分解还可由局部低温触发。
本发明人还观察到本发明的生物缀合物即使在长期的光治疗期间也仍能保持稳定。
在本发明的一些具体实施方案中，弹性蛋白样多肽具有式(B)：
Z-[VPXaa2Xaa3G]x-OH (B)
其中：
Z代表包含1至20个氨基酸残基的肽片段，
V代表缬氨酰基残基，P代表脯氨酰基残基，G代表甘氨酰基残基，
Xaa2代表甘氨酰基残基或丙氨酰基残基，
并且Xaa3代表选自缬氨酰基残基和具有式-(CH2)z-S-R’侧链的含硫氨基酸残基的可变氨基酸残基，其中z和R’如以上所限定，
Xaa3使得[VPXaa2Xaa3G]x肽片段中的缬氨酰基残基/含硫氨基酸残基的摩尔比为0/1至10/1，
并且x是1至200，特别是10至200，并且更特别是15至80，优选30至60，更优选35至45的整数，并且例如约40。在本发明的另一些实施方案中，x是20至40的整数。
[VPXaa2Xaa3G]x肽片段中Xaa3位置处的缬氨酰基残基/含硫氨基酸残基的摩尔比可以是1/1至5/1，更特别是2/1至4/1。例如其等于3/1。
特别地，在式(B)中，Xaa3可代表选自甲硫氨酰基残基和缬氨酰基残基的可变氨基酸残基，Xaa3使得[VPXaa2Xaa3G]x肽片段中的缬氨酰基残基/甲硫氨酰基残基的摩尔比为0/1至10/1，特别是1/1至5/1，更特别为2/1至4/1，并且例如等于3/1。
在本发明的一些具体实施方案中，在式(B)中，Z表示包含氨基酸序列MW的肽片段。然后该氨基酸序列优选地位于Z的C端处。
Z可包含具有氨基酸序列MW的肽片段。
在本发明的一些具体实施方案中，弹性蛋白样多肽具有式(C)：
Z-[VPGVGVPGXaa3G(VPGVG)2]y (C)
其中：
Z、V、P、G如以上所限定，
Xaa3表示具有式-(CH2)z-S-R’侧链的含硫氨基酸残基，z和R’如以上所限定，特别是甲硫氨酰基残基，
并且y是2至20，特别是5至15的整数。
在本发明的一些具体实施方案中，弹性蛋白样多肽具有化学通式(Ia)：
其中x是1至200，特别是10至200，并且更特别是15至80的整数，例如等于40、60或80，R代表选自-(CH2)z-S-R’和-CH(CH3)2的可变基团，并且R使得式(Ia)的弹性蛋白样多肽中的-CH(CH3)2/-(CH2)z-S-R’的摩尔比是0/1至10/1，特别是1/1至5/1，更特别是2/1至4/1并且例如等于3/1。
在本发明的一些具体实施方案中，在式(Ia)中，R代表选自-(CH2)2-S-CH3和-CH(CH3)2的可变基团，并且R使得式(Ia)的弹性蛋白样多肽中的-CH(CH3)2/-(CH2)2-S-CH3的摩尔比是0/1至10/1，特别是1/1至5/1，更特别是2/1至4/1并且例如等于3/1。
在本发明的一些具体实施方案中，弹性蛋白样多肽具有选自以下序列的氨基酸序列：
-MGTELAAASEFTHMW[VPGXaa3G]20(SEQ ID No：4)，
-MW[VPGVGVPGXaa3G(VPGVG)2]5(SEQ ID No：5)，
-MW[VPGVGVPGXaa3G(VPGVG)2]10(SEQ ID No：6)，
-MW[VPGVGVPGXaa3G(VPGVG)2]15(SEQ ID No：7)，
-和MW[VPGVGVPGXaa3G(VPGVG)2]20(SEQ ID No：8)，
其中Xaa3表示具有式-(CH2)z-S-R’侧链的含硫氨基酸残基，z和R’如以上所限定。
本发明的弹性蛋白样多肽例如可具有选自以下序列的氨基酸序列：
-MGTELAAASEFTHMW[VPGMG]20(SEQ ID No：9)，
-MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]5(SEQ ID No：10)，
-MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]10(SEQ ID No：11)，
-MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]15(SEQ ID No：12)，
-和MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]20(SEQ ID No：13)。
这些多肽中的一些特别描述于WO-A-2017/021334中或EP 3 759 153中。
特别有利的弹性蛋白样多肽是以上序列SEQ ID No：11的氨基酸序列的多肽，其具有化学式(Ib)：
所述多肽在其N端处或在其C端处与光敏剂单元缀合。
另一特别有利的弹性蛋白样多肽是以上序列SEQ ID No：13的氨基酸序列的多肽，其具有化学式(Ic)：
所述多肽在其N端处或在其C端处与光敏剂单元缀合。
在本发明的一些具体实施方案中，光敏剂单元通过接头与弹性蛋白样多肽共价连接。
本文中将接头限定为能够共价结合本发明生物缀合物的光敏剂单元和弹性蛋白样多肽的化学结构。
接头可以是羰基，在一端与光敏剂单元特别是其芳族环共价连接，在另一端与弹性蛋白样多肽的N端氨基共价连接。
接头另外可具有通式(II)：
其中：
代表与光敏剂单元连接的共价键，
代表与弹性蛋白样多肽连接的共价键，
m是1至5的整数，优选等于3，
并且n是1至6的整数，优选等于2。
弹性蛋白样多肽可在其C端处与光敏剂单元缀合。
在本发明的一些具体实施方案中，弹性蛋白样多肽在其N端末端处与光敏剂单元缀合。
根据本发明的光敏剂可以是亚甲蓝。
其另外可以是基于硼-亚甲基二吡咯(氟硼吡咯)的光敏剂。这样的具有式(III)核心的化合物是本领域技术人员公知的：
根据本发明的光敏剂另外可以是卟啉例如卟吩(式(IV))或其任何衍生物：
优选地，光敏剂是苯并卟啉或其衍生物。
在本发明的一些具体实施方案中，光敏剂是维替泊芬。本说明书中使用的术语维替泊芬涵盖下式(Xa)和(Xb)维替泊芬异构体中的每一者，以及这些异构体的任何混合物：
维替泊芬是用于治疗癌症的具有合适和相关光物理特性的光敏剂。
可将根据本发明的生物缀合物的维替泊芬单元与金属原子(例如锌原子)或类金属原子络合。本文中的类金属意指不是金属但在一个或更多个相关方面中具有与金属特性相当的特性的化学元素。类金属的实例包括硅和锗，等。
在本发明的另一些具体实施方案中，光敏剂是酞菁。酞菁是一组共享式(V)结构的化合物：
/>
根据本发明生物缀合物的酞菁单元优选地是周环取代的酞菁单元(peripherally-substituted phthalocyanine unit)。“周环取代的”在本文中的意指酞菁结构的六元环中的至少一者被除氢原子之外的取代基取代。优选地，酞菁结构的两个、三个或所有四个六元环均携带至少一个除氢原子之外的取代基。
在许多溶剂中，与未经取代的酞菁相比，周环取代的酞菁具有特别是更高溶解度的优点，这显示出对于易于制备本发明生物缀合物而言特别有用。
本发明生物缀合物的酞菁单元可以是轴向取代或非轴向取代的。“轴向取代的”酞菁单元在本文中被定义为携带取代基的酞菁单元，所述取代基相对于酞菁结构的平面轴向位于由酞菁络合的金属或类金属上。
在本发明的一些具体实施方案中，酞菁单元是锌-酞菁单元。
本发明的生物缀合物的酞菁单元可具有通式(V’)：
其中：
M代表金属或类金属原子，
R2、R3、R4、R5和R6可以是相同或不同的，各自代表：氢原子、-COOH、-C≡C-COOH、-CH＝CHCOOH、具有1至12个碳原子的直链或支链烷基、-OR7、-SR7或-NR7R8，其中R7和R8可以是相同或不同的，各自代表氢原子、具有1至12个碳原子的直链或支链烷基、或者任选地被一个或更多个R9基团取代的苯基，所述R9基团独立地选自具有1至12个碳原子的直链或支链烷基、-OR10、-SR10、和-NR11R12，其中R10、R11和R12可以是相同或不同的，各自代表氢原子或具有1至12个碳原子的直链或支链烷基。
或者，R3和R4，以及R5和R6中的一对或两对与相邻的碳原子连接并且与其连接的环一起形成芳族稠环体系，
并且R1代表参与所述酞菁单元与所述弹性蛋白样多肽直接或通过接头连接的共价键。
以上通式(V’)以及代表本文中所述酞菁的所有其他通式涵盖分子的所有可能的区域异构体(regioisomer)，或其混合物。术语“区域异构体”是指在不同位置中具有相同官能团或取代基的位置异构体。
本文中的类金属意指不是金属但在一个或更多个相关方面中具有与金属特性相当的特性的化学元素。类金属的实例包括硅和锗，等。
在本发明的另一些实施方案中，酞菁单元可具有式(V”)的游离碱形式：
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6如以上所限定。
本发明的生物缀合物的酞菁单元可特别地具有通式(V’a)：
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6如以上所限定。
在式(V’)、(V”)和(V’a)的酞菁单元中，基团R1和R2可独立地位于相应六元环的四个位置中的任一者中。类似地，基团R3、R4、R5和R6可独立地位于酞菁单元的相应六元环中每一者的四个位置中的任一者中。
在本发明的一些特别优选的实施方案中，R3、R4、R5和R6基团中的至少一个基团(优选至少两个基团)是直链或支链的C1-C12烷基，优选C4烷基并且更优选叔丁基。
在一些具体实施方案中，独立地位于相应六元环中每一者的四个位置中的任一者上的R3和R5基团是叔丁基，而R4和R6基团独立地是氢原子、具有1至12个碳原子的直链或支链烷基、-OR7、-SR7或-NR7R8，其中R7和R8如以上所限定。
最优选地，酞菁单元具有通式(V’b)：
其中R1如以上所限定。
在本发明的一些具体实施方案中，生物缀合物具有通式(VI)：
其中，接头表示接头基团，
PS表示光敏剂单元，
x是1至200，特别是10至200，并且更特别是15至80的整数，例如等于40、60或80，
R表示选自-(CH2)z-S-R’和-CH(CH3)2的可变基团，z和R’如以上所限定，R使得生物缀合物中的-CH(CH3)2/-(CH2)z-S-R’的摩尔比是0/1至10/1，特别是1/1至5/1，更特别是2/1至4/1并且例如等于3/1。
在本发明的一些优选实施方案中，在式(VI)中，R表示选自-(CH2)2-S-CH3和-CH(CH3)2的可变基团，R使得生物缀合物中的-CH(CH3)2/-(CH2)2-S-CH3的摩尔比是0/1至10/1，特别是1/1至5/1，更特别是2/1至4/1并且例如等于3/1。
根据本发明的生物缀合物可具有式(VI’)：
其中接头、M、R2、R3、R4、R5和R6如以上所限定，
x是1至200，特别是10至200，并且更特别是15至80的整数，例如等于40、60或80，
并且R表示选自-(CH2)2-S-CH3和-CH(CH3)2的可变基团，R使得生物缀合物中的-CH(CH3)2/-(CH2)2-S-CH3的摩尔比是0/1至10/1，特别是1/1至5/1，更特别是2/1至4/1并且例如等于3/1。
本发明的生物缀合物可特别地具有通式(VI”)：
其中M、R、R2、R3、R4、R5、R6、m和n如以上所限定，并且x是1至200，特别是10至200，并且更特别是15至80的整数，例如等于40、60或80。
特别有利的根据本发明的生物缀合物具有通式(VI”a)：
其中R如以上所限定，并且x是1至200，特别是10至200，并且更特别是15至80的整数，例如等于40、60或80。
本发明的生物缀合物另外可具有式(VI’b)：
其中R如以上所限定，并且x是1至200，特别是10至200，并且更特别是15至80的整数，例如等于40、60或80。
式(VI”a)和(VI’b)二者的生物缀合物均具有以可控方式和以工业规模易于制备的优点。
根据本发明的另一些生物缀合物具有相应的式(XIa)和(XIb)：
其中：
接头表示共价键或化学结构，其共价结合光敏剂单元与弹性蛋白样多肽，
x是1至200，特别是10至200，并且更特别是15至80的整数，例如等于40、60或80，
并且R表示选自-(CH2)2-S-CH3和-CH(CH3)2的可变基团，R使得生物缀合物中的-CH(CH3)2/-(CH2)2-S-CH3的摩尔比是0/1至10/1，特别是1/1至5/1，更特别是2/1至4/1并且例如等于3/1。
特别地，式(XIa)和(XIb)的这样的生物缀合物的混合物落入本发明的领域内。
本发明的生物缀合物可特别地具有通式(XI’)：
其中R如以上所限定，并且x是1至200，特别是10至200，并且更特别是15至80的整数，例如等于40、60或80。
特别地，式(XI’a)和(XI’b)的这样的生物缀合物的混合物落入本发明的领域内。
式(XIa)、(XIb)、并且特别是(XI’a)、(XI’b)的生物缀合物特别易于制备。
更一般地，本发明的生物缀合物是非免疫原性、生物相容性和可生物降解的。
它们可有利地以可再生的方式，以窄的摩尔质量分布容易地产生。
本发明的生物缀合物可以以本领域技术人员已知的任何方式进行制备。
优选地，光敏剂单元(例如维替泊芬单元或酞菁单元)经由一个或数个酰胺键与弹性蛋白样多肽直接或通过接头连接。
用于制备根据本发明生物缀合物的第一方法包括以下步骤：
-对弹性蛋白样多肽的N端末端进行修饰以引入末端炔基，所述弹性蛋白样多肽包含出现至少一次的具有式(A)的单体单元：Xaa1PXaa2Xaa3G(A)，其中P、G、Xaa1、Xaa2和Xaa3如以上所限定，
-使光敏剂分子(特别是酞菁，优选周环取代的酞菁，此外优选锌酞菁)官能化以引入叠氮基；
-以及在如此修饰的弹性蛋白样多肽与如此官能化的光敏剂之间实现Huisgen铜(I)催化的炔烃-叠氮环加成(copper(I)-catalyzed alkyne-azide cycloaddition，CuAAC)反应。
根据本发明的方法还可响应于下述特征中的一者或更多者，单独地或以其各自的技术操作组合来实施。
本领域技术人员已知包含出现至少一次的具有式(A)的单体单元，特别是出现至少一次的氨基酸序列VPGMG(SEQ ID No：2)的弹性蛋白样多肽以及用于其制备和其纯化的方法。它们特别描述于WO 2017/021334中，以及用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中重组产生它们的方法。
在本发明的方法中实施的弹性蛋白样多肽可具有关于本发明的生物缀合物(涉及所述生物缀合物的弹性蛋白样多肽部分)的上述任何特征或任何特征组合。
用于本发明方法的特别优选的弹性蛋白样多肽具有式(B)：
Z-[VPXaa2Xaa3G]x-OH (B)
其中：
x是1至200的整数
Z代表包含1至20个氨基酸残基的肽片段，
V代表缬氨酰基残基，P代表脯氨酰基残基，G代表甘氨酰基残基，
Xaa2代表甘氨酰基残基或丙氨酰基残基，
并且Xaa3代表选自缬氨酰基残基和具有式-(CH2)z-S-R’侧链的含硫氨基酸残基的可变氨基酸残基，
Xaa3使得[VPXaa2Xaa3G]x肽片段中的缬氨酰基残基/含硫氨基酸残基的摩尔比是0/1至10/1。
弹性蛋白样多肽可特别地具有氨基酸序列
MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]10(SEQ ID No：11)。
在本发明的一些具体实施方案中，对弹性蛋白样多肽N端末端进行修饰的步骤通过使所述弹性蛋白样多肽与通式(VII)化合物反应来进行：
其中n是1至6的整数，优选等于2，该反应在这样的条件下进行：为了形成涉及弹性蛋白样多肽的末端氮原子和通式(V)化合物的羰基碳原子的酰胺键。
特别可用于本发明方法中的通式(VII)化合物是式(VIIa)4-戊炔酸琥珀酰亚胺酯：
酰胺化反应可通过本领域技术人员已知的任何方法进行。
例如，其可根据数个，优选全部以下特征进行：
-在极性非质子溶剂(例如二甲基亚砜)中，
-在存在碱(例如叔胺，例如N，N-二异丙基乙胺)的情况下，
-在环境温度下，
-持续数小时(例如2至48小时，优选6至24小时)的时间段。
如此获得的经修饰的炔基-(弹性蛋白样多肽)可通过任何方法(例如通过透析)从反应介质中回收。
在本发明的方法中实施的光敏剂分子可具有关于本发明的生物缀合物(涉及生物缀合物的光敏剂单元)的上述任何特征或任何特征组合。所述光敏剂分子例如是酞菁或维替泊芬。
使所述光敏剂分子(特别是所述酞菁)官能化以引入叠氮基的步骤可以以本领域技术人员已知的任何方法进行。
在本发明的一些特别优选的实施方案中，在本发明的方法中用作起始物质的光敏剂是羧基-酞菁。“羧基-酞菁”意指这样的酞菁，其使得六元环之一携带羧基。
用于本发明方法的特别优选的羧基-酞菁是周环取代的羧基-Zn(II)-酞菁，其优选具有通式(VIII)：
其中R2、R3、R4、R5、R6如以上所限定。
酞菁例如可具有式(VIIIa)：
式(VIII)和(VIIIa)涵盖分子的所有区域异构体和这样的区域异构体的所有混合物。
式(VIIIa)(9(10),16(17),23(24)-三叔丁基-2-羧基-5,28:14,19-二亚氨基-7,12:21,26-二次氮基-四苯并[c,h,m,r][1,6,11,16]四氮杂环二十碳烯酸(tetraazacycloeicosinato)-(2-)-N29,N30,N31,N32锌(II))的酞菁例如可按照Cid et al.,Angewandte Chemie International Edition 2007,46(44),8358-8362的出版物中所述进行制备。
其具有特别突出的光物理特性。特别地，显示出在其UV-可见光谱中约680nm具有吸收系数极好的带(Q带，ε为约105M-1.cm-1)，其落入所谓的治疗光学窗中。在二甲基亚砜中测量的该酞菁的单线态氧量子产率增长最高达ΦΔ＝0.72。叔丁基的存在不仅使分子聚集体的形成最小化，而且还提高了化合物在有机溶剂中的溶解度。
该酞菁还利用其结构中反应性羧基官能团的存在而易于官能化的优点。
式(VIIIa)的酞菁可以以八种区域异构体形式存在。
在一些具体实施方案中，在本发明的方法中用作起始物质的酞菁选自这八种形式或其任意混合物，即为以下：
-9,16,23-三叔丁基-2-羧基-5,28:14,19-二亚氨基-7,12:21,26-二次氮基-四苯并[c,h,m,r][1,6,11,16]四氮杂环二十碳烯酸-(2-)-N29,N30,N31,N32锌(II)；
-9,16,24-三叔丁基-2-羧基-5,28:14,19-二亚氨基-7,12:21,26-二次氮基-四苯并[c,h,m,r][1,6,11,16]四氮杂环二十碳烯酸-(2-)-N29,N30,N31,N32锌(II)；
-9,17,23-三叔丁基-2-羧基-5,28:14,19-二亚氨基-7,12:21,26-二次氮基-四苯并[c,h,m,r][1,6,11,16]四氮杂环二十碳烯酸-(2-)-N29,N30,N31,N32锌(II)；
-9,17,24-三叔丁基-2-羧基-5,28:14,19-二亚氨基-7,12:21,26-二次氮基-四苯并[c,h,m,r][1,6,11,16]四氮杂环二十碳烯酸-(2-)-N29,N30,N31,N32锌(II)；
-10,16,23-三叔丁基-2-羧基-5,28:14,19-二亚氨基-7,12:21,26-二次氮基-四苯并[c,h,m,r][1,6,11,16]四氮杂环二十碳烯酸-(2-)-N29,N30,N31,N32锌(II)；
-10,16,24-三叔丁基-2-羧基-5,28:14,19-二亚氨基-7,12:21,26-二次氮基-四苯并[c,h,m,r][1,6,11,16]四氮杂环二十碳烯酸-(2-)-N29,N30,N31,N32锌(II)；
-10,17,23-三叔丁基-2-羧基-5,28:14,19-二亚氨基-7,12:21,26-二次氮基-四苯并[c,h,m,r][1,6,11,16]四氮杂环二十碳烯酸-(2-)-N29,N30,N31,N32锌(II)；
-10,17,24-三叔丁基-2-羧基-5,28:14,19-二亚氨基-7,12:21,26-二次氮基-四苯并[c,h,m,r][1,6,11,16]四氮杂环二十碳烯酸-(2-)-N29,N30,N31,N32锌(II)；
-以及其任意混合物。
在本发明的一些具体实施方案中，使所述酞菁官能化的步骤通过使羧基酞菁与通式(IX)化合物反应来进行：
其中m是1至5的整数，优选等于3，
所述反应在这样的条件下进行：为了形成涉及通式(IX)化合物的伯胺的氮原子与酞菁的羧基的碳原子的酰胺键。
在本发明的方法中特别有用的的式(IX)化合物是式(IXa)的3-叠氮基丙胺：
酰胺化反应可以以本领域技术人员已知的任何方式进行。
在本发明的一些具体实施方案中，酞菁根据数个(优选全部以下)特征与通式(IX)化合物反应：
-在存在偶联剂(例如{[(Z)-(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基)氨基]氧基}-N,N-二甲基(吗啉-4-基)甲亚胺鎓六氟磷酸盐(methaniminium hexafluorophosphate)(COMU))的情况下，
-在存在碱(例如叔胺，例如N,N-二异丙基乙胺)的情况下，
-在极性非质子溶剂(例如二甲基甲酰胺)中，
-在环境温度下，
-持续数小时(例如16至28小时)的时间段。
如此获得的官能化的叠氮-酞菁可通过任何方法(例如通过用合适的溶剂萃取)从反应介质中回收，并且任选地通过快速柱色谱进行纯化。
对于在经修饰的弹性蛋白样多肽与如此获得的官能化的光敏剂之间的Huisgen铜(I)催化的炔烃-叠氮环加成反应的反应条件本身是经典的。
该反应例如可根据数个(优选全部)以下特征进行：
-在环境温度下，
-在极性非质子溶剂(例如二甲基亚砜)中，
-在存在铜催化体系(例如五水合硫酸铜和抗坏血酸钠的混合物)的情况下，
-持续数小时，例如2至72小时。
如此获得的生物缀合物可通过任何常规方法本身从反应介质中回收并且任选地进行纯化。
制备根据本发明生物缀合物的第二方法包括：使光敏剂分子特别是酞菁或维替泊芬(优选含有游离羧酸基团)官能化以引入N-羟基琥珀酰亚胺-激活的酯基团，以及实现所述活化基团与弹性蛋白样多肽的N端氨基的直接偶联，所述弹性蛋白样多肽包含出现至少一次的具有以上限定的式(A)的单体单元。
在该第二方法中用作起始物质的光敏剂(特别是酞菁或维替泊芬)和弹性蛋白样多肽可具有关于用于制备根据本发明生物缀合物的第一方法中的上述任何特征或任何特征组合。
使光敏剂(特别是酞菁或维替泊芬)官能化以引入N-羟基琥珀酰亚胺-活化的酯基可通过本领域技术人员已知的任何方法进行。其优选通过以下进行：在标准条件下，使用二氯甲烷作为溶剂，在存在N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的情况下，使式(VIIIa)的酞菁或维替泊芬与N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)反应。
如此激活的光敏剂(特别是激活的酞菁或维替泊芬)与弹性蛋白样多肽的偶联可通过本身用于使N-羟基琥珀酰亚胺活化的酯与伯胺反应以形成酰胺键的任何常规方法进行。
该反应例如可根据数个(优选全部)以下特征进行：
-在环境温度下，
-在极性非质子溶剂(例如二甲基亚砜)中，
-在存在碱(例如N,N-二异丙基乙胺)的情况下，
-持续数小时，例如2至48小时，
-在惰性气氛下，例如在氮N2气氛下。
如此获得的生物缀合物可通过任何常规方法本身从反应介质中回收并且任选地进行纯化。
制备根据本发明生物缀合物的另一种方法(适合于其中光敏剂包含羧基的实施方案(如维替泊芬))包括：在存在合适的偶联剂的情况下通过使光敏剂的羧基与弹性蛋白样多肽的N端氨基反应形成酰胺。作为这样的偶联试剂，特别优选通常用于肽合成的试剂，例如HCTU或HTBU。
该反应优选在两个连续步骤中进行，其包括使光敏剂(例如维替泊芬)与偶联试剂反应的第一步骤，以及使该第一步骤的反应产物与弹性蛋白样多肽反应的第二步骤。
第一步骤可在极性非质子溶剂(例如二甲基甲酰胺)中进行。优选在室温下和/或持续30至120分钟(例如约1小时)的时间进行。
第二步骤可例如根据一个或数个(优选全部)以下特征进行：
-在环境温度下，
-在极性非质子溶剂(例如二甲基甲酰胺)中，
-在存在碱(例如N,N-二异丙基乙胺)的情况下，
-持续数小时，例如12至60小时，优选30至50小时，
-在惰性气氛下，例如在氩气氛下。
本发明的生物缀合物显示出可用于许多应用，特别是用于医学应用，更特别是用作光动力治疗治疗的光敏剂。
本发明的生物缀合物可特别地用于在有此需要的对象(特别是哺乳动物并且更特别是人对象)中通过光动力治疗来治疗疾病。其可特别地用于通过光动力治疗来治疗皮肤疾病、眼疾病、或该光动力治疗显示出适用以进行治疗的任何其他疾病。例如，其可用于通过光动力治疗来治疗癌症。
本发明的生物缀合物可通过经典的任何施用途径本身施用于对象。其例如可通过经口、肠胃外、表面、鼻内、直肠或肺途径施用于有此需要的对象。
在通过光动力治疗来治疗疾病(特别是癌症)的背景下，肠胃外施用途径(包括皮下、硬膜下、静脉内、肌内、鞘内、腹膜内、脑内、动脉内和病灶内施用途径)是特别优选的。
在一些特别优选的实施方案中，本发明的生物缀合物通过注射在所述对象身体的靶部位(例如肿瘤部位)中而施用于待治疗的对象。
举例来说，对于使用本发明的生物缀合物来治疗卵巢癌，所述生物缀合物优选通过直接注射在腹膜腔中而施用于待治疗的对象。
在癌症治疗(例如乳腺癌或脑癌治疗)领域，本发明的生物缀合物另外可以在肿瘤手术之后通过表面施加来施用。
本发明还可以在通过光动力治疗在有此需要的对象中治疗疾病(特别是皮肤或眼疾病或者癌症)的方法的方面中表现，所述方法包括：
-向所述对象施用治疗有效量的本发明的生物缀合物，特别是通过直接注射在靶部位(例如肿瘤部位)处，
-然后在用于激活光敏剂单元的合适波长(特别是用红光)下对所述靶部位进行光辐照。
“治疗有效量”在本文中意指当施用于对象以治疗疾病时足以进行对疾病的这样的治疗的生物缀合物的量。本发明的生物缀合物的治疗有效量将取决于数种因素，例如待治疗对象的疾病及其严重程度、年龄、重量等，所使用的特定生物缀合物，施用途径及形式等。对于每个个体的情况，将由实践者确定本发明的生物缀合物的治疗有效量。
在本发明的一些特别优选的实施方案中，治疗疾病的方法包括两个连续的光辐照步骤，这些步骤彼此相隔数分钟或数小时进行。
在该光动力治疗的背景下，与单独的或与不同纳米载体缀合的光敏剂(例如酞菁)相比，本发明的生物缀合物有利地改善了治疗的临床有效性。
以癌症作为待治疗疾病的实例，在图1中示出了本发明的方法用于治疗疾病的不同步骤。本发明的生物缀合物分子10在施用于对象时在身体生理温度(对于人对象为约37℃)下自发地自组装成颗粒11。积累在肿瘤部位处的这些颗粒的分解可通过用红光12进行局部光辐照，并随后由生物缀合物的光敏剂单元产生的单线态氧13氧化含硫氨基酸残基来远程触发，这导致生物缀合物转变温度的提高。通过光敏剂单元释放的活性氧物质引起肿瘤内细胞的死亡。同时，从颗粒中单独释放的可溶性生物缀合物分子10更深入的扩散到肿瘤部位中，并提高了用红光12进行第二光辐照步骤的效力。然后，生物缀合物的光敏剂单元的再激活(导致产生氧活性物质(例如单线态氧13)的新的步骤)可对肿瘤团块(tumormass)造成相当大的损害并使治疗的治疗益处最大化。
本发明的另一方面是包含可药用载剂中的根据本发明生物缀合物的药物组合物。
本文中的“可药用”意指当施用于哺乳动物(包括人)时，载剂不会表现出任何不良、变应性或其他不期望的作用。
本发明的组合物可以为适合于经口、肠胃外、鼻内、舌下、直肠、经皮、吸入或吹入施用的任何形式。优选地，其为适合于肠胃外施用于对象(特别是施用于哺乳动物，更特别是施用于人对象)，优选直接施用于组织病变(例如肿瘤)的形式。
鉴于以下实施例，本发明的特征和优点将更清楚地显现，所述实施例仅出于举例说明的目的提供，并且绝不限制本发明。
A/酞菁作为光敏剂
材料
使用以下试剂：氯化钠(NaCl，VWR，100％)，乙酸铵(C2H3O2NH4，Sigma-Aldrich，BioXtra 98％)，冰乙酸(CH3CO2H，Chem-Labs Limited)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，Sigma-Aldrich，99％)，五水硫酸铜(II)(Cu2SO45H2O，Acros Organics，98％)，(+)-L-抗坏血酸钠(C6H7NaO6，Sigma-Aldrich，98％)，3-叠氮基丙胺(C3H8N4，TCI Europe，>95.0％)，(C12H19F6N4O4P，Sigma-Aldrich，97％)。
使用以下溶剂无需进一步纯化：乙醇(EtOH，VWR化学品，分析级，100％)，二氯甲烷(DCM，Sigma-Aldrich，分析级，99.9％)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF，Fluka，99.8％)，乙腈(ACN，VWR化学品，HPLC级，99.9％)，乙醚(Et2O，VWR化学品，97％)，二甲基亚砜(DMSO，Sigma-Aldrich，99.9％)，1,4-二氧六环(HPLC-用BHT稳定，Carlo Erba)，正己烷(99％用于分析，Carlo Erba)。
光敏剂是酞菁，本文中称为TT1，9(10),16(17),23(24)-三叔丁基-2-羧基-5,28:14,19-二亚氨基-7,12:21,26-二次氮基四苯并[c,h,m,r][1,6,11,16]四氮杂环二十碳烯酸-(2)-N29,N30,N31,N32锌(II)(区域异构体的混合物)。
其具有上文中所示的式(VIIIa)。
弹性蛋白样多肽(本文中称为ELP)具有化学式：
其中R表示选自-(CH2)2-S-CH3和-CH(CH3)2的可变基团，R使得方括号中每个单元中-CH(CH3)2/-(CH2)2-S-CH3的摩尔比等于3/1，
以及氨基酸序列SEQ ID No:11。
分析方法
核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)：用Bruker III HD(具有5mm Prodigy cryo探头的液态400MHz NMR)和Bruker />I(具有5mm BBFO探头的液态400MHz NMR谱仪)获取1H NMR 400MHz谱。氘代氯仿(CDCl3，Euriso-top，99.8％)、氘代二甲基亚砜(d-DMSO，Euriso-top，99.8％)和氘代水(D2O，Euriso-top，99.8％)用作溶剂和锁定(lock)的参考物。
尺寸排阻色谱(Size Exclusion Chromatography，SEC)：DMSO中的测量在配备有二极管阵列检测器DAD的来自Thermo 的/>3000系统上进行。该系统还包括来自Wyatt technology的多角度光散射检测器MALS和差示折射率检测器dRI。将聚合物在Tosoh TSK G3000HHR和G2000HHR(7.8*300)柱(排阻限为200Da至60 000Da)上进行分离，流量为0.5mL/分钟。柱温保持在80℃。来自PSS的右旋糖酐用作标准品。二甲基亚砜(DMSO+溴化锂LiBr 1g/L)用作洗脱液。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate– polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析：将15μL的Precision Plus蛋白标准品(尺寸标记)和20μL的每个样品加载到制胶盘(BIO-RAD，4至20％TGX />凝胶)上。将Tris-甘氨酸-SDS缓冲液(TGS1×)用作上样缓冲液。
基质辅助激光解吸/电离质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry，MALDIMS)：MALDI-MS谱通过CESAMO(Bordeaux，France)在AutoflexmaX TOF质谱仪(Bruker Daltonics)上进行，该质谱仪配备有在355nm处发射的三倍频Nd:YAG激光器。谱以线性正离子模式记录，其中加速电压为19kV。将样品以4mg/ml溶解在水中。通过进行以下制备SA基质(芥子酸)溶液：将10mg溶解在1ml的乙腈/0.1％水性TFA 50/50中。将溶液以基质与样品的10:10体积比组合。将1至2微升的所获得溶液沉积到样品靶标上并真空干燥。
UV-Vis光谱：通过在配备有多单元热电温度控制器的Agilent Cary 100UV-Vis分光光度计上跟踪600或500nm处吸收的浊度相对于温度来确定转变温度(transitiontemperatures，Tt)。在磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)中在以3种浓度的酞菁(10、20和30μM)缀合反应之前和之后，在10至60℃的温度范围内以每分钟1℃的扫描速率测量浊度。
动态光散射(dynamic light scattering，DLS)：在吸收池中在恒定位置(在1×PBS pH 7.4中在30μM浓度下的恒定散射体积)处以90°角在Nano ZS 90仪器(HeNe激光632.8nm,Malvern)上进行TT1-ELP(在20℃和37℃下)和TT1-ELPPhOx(在37℃下)的DLS测量。从使用类CONTIN算法的二阶累积量拟合获得Z-平均流体动力学直径(hydrodynamicdiameter，DH)和多分散性指数(polydispersity index，PDI)的值。
原子力显微术(Atomic Force Microscopy，AFM)：使用Dimension Bruker AFM系统进行温度控制的液体原子力显微术测量。使用具有典型尖端半径为5nm的硅悬臂(ScanAsyst-Fluid+，Bruker)，在峰值力轻敲模式(Peak Force tapping mode)下获得生物缀合物的形貌图像(topography image)。悬臂共振(cantilever resonance)为150kHz并且弹性系数(spring constant)为0.7N/m。样品通过以下来制备：将50μM生物缀合物溶液滴注到新切割的云母或HOPG表面(购自Agar Scientific)上，其直接用于成像。在特定温度下在液体环境中实现AFM成像过程。使用外部加热台(Bruker)以在基底表面处实现目标温度。
实施例1-酞菁TT1的官能化
TT1通过Cid et al.，Angewandte Chemie International Edition 2007，46(44)，8358-8362中所述的方法获得。
根据以下合成反应方案进行TT1的官能化以引入叠氮基：
在氩气氛下在室温下，将COMU(16.8mg，0.039mmol)添加至TT1(20mg，0.025mmol)、新鲜蒸馏的DIPEA(5.3μL)在无水DMF(0.5mL)中的混合物。然后，逐滴添加3-叠氮基丙胺(4.0mg，0.04mmol)。将反应混合物搅拌24小时。将混合物用DCM(2mL)稀释并用1N HCl(2×5mL)、1N NaHCO3(2×5mL)和饱和NaCl(2×5mL)萃取。然后将DCM经MgSO4干燥，去除溶剂，并将粗制物通过快速柱色谱在硅胶(二氧六环/正己烷＝50∶50)上直接纯化以得到16.4mg的作为深蓝色固体的1(产率：75％)。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.91(m，1H)，9,55-9,30(m，8H)，8,71(m，1H)，8,37(m，3H)，3,63(m，2H)，2.07-2.02(m，2H)，1.78(s，27H)，1.24(m，2H)ppm.。
HR-MS(MALDI-TOF，DCTB)：C48H46N12OZn：[M]+：m/z的计算值：870.3209，实测值870.3204。
UV/Vis：(THF)：λmax(nm)(ε)＝673(4.70)；607(4.68)，348(4.08)。
实施例2-ELP的N端修饰
ELP如Petitdemange et al.，Biomacromolecules 2017，18(2)，544-550中所述获得并纯化。
根据以下合成反应方案进行ELP的修饰以在其N端末端处引入炔基：
向ELP(20mg，1.17μmol)在无水DMSO(2mL)中的溶液添加N，N-二异丙基乙胺(1mg，1.170μmol)，并通过氮气鼓泡(nitrogen bubbling)使溶液脱气。将4-戊炔酸琥珀酰亚胺酯(4mg，23.48μmol)添加到反应混合物中，并在室温下在氮气下搅拌72小时。然后将溶液用15mL H2O稀释，并在透析袋(截止MWCO 3.5kDa)中相对于Milli-Q水透析72小时。将该溶液冻干以产生炔烃-ELP的白色产物(19mg，95％)。
1H NMR(400MHz，D2O)：δ4.47-4.44(m，11H αCH Me)，4.37-4.32(m，80H αCH Val，Pro)，4.09-4.07(d，30H αCH Valxaa)，3.94-3.82(br m，αCH2 Gly，δCH2 Pro)，3.64-3.62(m，δCH2 Pro)，2.54-2.36(br m，γCH2 Met，CH2CH2C≡CH)，2.23-2.21(m，βCH2 Pro)，2.05-1.83(m，βCH2 Met，βCH2 Pro，γCH2 Pro，βCH2 Val，εCH3 Met，CH2CH2C≡CH)，0.90-0.84(m，420H，γCH3 Val)。
实施例3-TT1-ELP生物缀合物的合成和纯化
该偶联反应根据以下合成方案进行：
将炔烃-ELP(1当量)和1(2当量)溶解于无水DMSO(10mg/mL)中，并添加CuSO4.5H2O(1当量)和抗坏血酸钠(2当量)，并且通过冻-融-冻循环使溶液脱气。在氮气下在室温下将溶液在搅拌下放置72小时。通过Cupisorb珠和随后的过滤去除过量的铜(cupper)。将反应溶液相对于Milli-Q水透析(截止MWCO 3.5kDa)48小时并冻干。将最终产物通过可逆相变循环(inverse transition cycling，ITC)进行纯化，然后冻干。
ITC纯化如下进行。
将蓝色产物溶解在5mL 1M NaCl溶液中并将其置于加热浴(40℃)中。将浮动的生物缀合物在38℃(3800RPM速度)下离心10分钟。将上清液丢弃，并将深蓝色沉淀物溶解在3mL冷水中。将溶液在4℃(3800RPM速度)下离心30分钟，并将沉淀物丢弃。将数滴1M NaCl溶液添加到上清液中并置于加热浴中。将积聚的生物缀合物在38℃(3800RPM速度)下离心10分钟。最后，将上清液丢弃，并将沉淀物溶解在冷的Milli-Q水中，并在透析袋(截止MWCO3.5kDa)中相对于Milli-Q水透析24小时以去除过量的盐。将该溶液冻干以获得纯的蓝色生物缀合物TT1-ELP。
纯的生物缀合物的产率：16mg，80％。
1H NMR(400MHz，D2O，5℃)：δ4.38(br m，11H αCH Me)，4.28-4.25(m，80H αCH Val，Pro)，4.00-3.99(d，30H αCH Valxaa)，3.80-3.77(br m，200H αCH2 Gly，δCH2 Pro)，3.54(br，40HδCH2 Pro)，2.47-2.35(br m，22H γCH2 Met)，2.16(br m，40H βCH2 Pro)，1.93-1.80(br m，240H βCH2 Met，βCH2 Pro，γCH2 Pro，βCH2 Val，εCH3 Met)，0.83-0.70(m，420H，γCH3 Val).。
SEC(DMSO，LiBr 1g/L，标准品：右旋糖酐)Mn＝20120Da，Mw/Mn＝1.129。
MALDI MS：理论MW＝18032.96Da，实验性[M+H]+＝18033.521Da。水中的UV吸收λmax＝337，633nm，无荧光。
通过MALDI MS、SDS-PAGE和SEC分析来确定ELP链末端处的定量修饰和过量的用于反应的TT1的完全去除，如在图2中所示。
MALDI MS分析显示出ELP与TT1-ELP的单电荷物质[M+H]+之间的位移为993.3Da，这与理论值(997.5Da)合理的一致(图2-A))。SDS-PAGE分析显示出对过量的用于反应的TT1的成功去除(图2-B))。TT1-ELP的SEC色谱图(RI检测)显示出单峰的峰分布(图2-C))。在较短的保留时间小肩(small shoulder)的存在归因于由于TT1平面骨架的π-π堆叠引起的TT1-ELP的聚集。在607nm处的吸收也表明TT1成功地与ELP链末端连接(图2-C))。
实施例4-比较化合物TT1-ELP(O)
为了研究本发明的生物缀合物在其甲硫氨酰基残基氧化之后的特征，使用除了11个甲硫氨酰基残基的所有硫原子均氧化成亚砜形式之外具有与TT1-ELP相同结构的比较化合物TT1-ELP(O)。
为此，如Petitdemange et al.，Biomacromolecules 2017，18(2)，544-550的公开中所述，ELP首先与过氧化氢反应以产生ELP(O)，其中甲硫氨酰基残基的所有硫原子均具有亚砜形式。
然后根据以下反应方案，通过如实施例1中所述的相同方法在其N端处修饰ELP(O)：
向ELP(O)(40mg，2.32μmol)在无水DMSO(2mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(0.3mg，2.32μmol)，并随后添加4-戊炔酸琥珀酰亚胺酯(9mg，46.48μmol)。将反应混合物在室温下在氩气下搅拌72小时。然后将溶液用15mL H2O稀释，并在透析袋(截止MWCO 3.5kDa)中相对于Milli-Q水透析72小时。将该溶液冻干以产生白色产物炔烃-ELP(O)(30mg，75％)。
1H NMR(400MHz，D2O，25℃)：δ4.29-4.23(m，80H，αCH Val，Pro)，4.09-3.99(d，30H，αCH VPGVG)，2.85-2.73(m，22H，CH2S Met)，2.38-2.29(br m，γCH2 Met，CH2CH2C≡CH)，2.56(s，33H，SCH3 Met)，0.82-0.75(br m，420H，CH3 Val).。
1H NMR分析确定了ELP的定量氧化以及N端链末端的完全官能化。
TT1-叠氮与炔烃-ELP(O)的缀合如在实施例3中所述的进行，并通过MALDI MS、SDS-PAGE、SEC、NMR和UV-Vis谱分析确定，如在图2中所示。
MALDI MS分析显示，ELP与TT1-ELP(O)的单电荷物质[M+H]+之间的位移为1,174Da，与理论值(1,177Da)良好的一致(图2-A))。TT1-ELP(O)的SEC色谱图(RI检测)显示出与607nm下的UV检测器信号重叠的窄的单峰峰分布，指示TT1的成功缀合(图2-D))。
TT1-ELP和TT1-ELP(O)生物缀合物在环境温度下的光学表征显示出，在PBS缓冲液(pH 7.4，λabs＝337和633nm)下，吸收最大值没有差异(图2-E))。由于与多肽的缀合、具有较高离子强度的水性环境以及TT1链末端的堆积，因此生物缀合物的吸收峰变得较宽，并且从673nm(THF中的TT1)蓝移至633nm(PBS中的缀合物)。
实施例5—TT1-ELP的光辐照
将根据本发明的生物缀合物TT1-ELP在D2O中的溶液用红光发射二极管进行辐照。1H NMR光谱术用于跟踪甲硫氨酰基残基的选择性氧化。
将3mg的TT1-ELP溶解在0.5mL的D2O中，并将其转移至NMR管。在LED(LuzchemLEDi，红区630至640nm，辐照度＞2100W/m2)辐照之前以及LED辐照30分钟期间每5分钟之后获取1H NMR谱，以通过200MHz 1H NMR监测在环境温度下甲硫氨酰基残基的光氧化。所得生物缀合物在本文中称为TT1-ELPPhOx。
通过归因于硫醚形式(-SCH3)中与硫相邻的甲基的质子在2.1ppm处的共振峰向亚砜形式(-S(O)CH3)的2.6ppm的偏移来监测在5、10、15、20和30分钟中红色发射LED辐照期间亚砜的形成，在图3A)中示出。
在5分钟内观察到约50％的氧化，而30分钟辐照导致ELP的11个甲硫氨酰基残基的完全氧化。
TT1-ELP和TT1-ELPPhOx的重叠SEC色谱图显示出窄的单峰的峰分布，其确定了氧化过程的选择性而在骨架中没有任何交联或降解的痕迹(图3-B))。在SEC中示出的且也在SDS-PAGE凝胶(图3-C))中观察到的二聚体量的增加可能是由于TT1链末端之间的强的疏水性相互作用引起。
实施例6—起始转变温度
在10至60℃的温度范围内分别跟踪600和500nm下的吸光度在磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)中通过浊度测量来测量在TT1缀合之前和之后ELP的热响应特征。测量在TT1-ELP于10℃下完全可溶的三种浓度(10、20和30μM)下进行。
对TT1-ELP(O)(通过甲硫氨酰基的化学氧化获得)和TT1-ELPPhOx(通过对甲硫氨酰基光辐照触发的氧化获得)进行相同的分析。
结果在表1中示出。
表1-在PBS中在不同浓度下ELP和不同生物缀合物的起始转变温度
在所研究的浓度下，ELP的转变温度(Tt)为35至38℃，接近生理体温。在TT1缀合之后，发现Tt下降约10℃，TT1-ELP的Tt为10μM时的29℃至30μM时的27℃。这预期是由于TT1的强的疏水特征引起。
动态光散射表明在高于TT1-ELP的Tt时形成了1.5μm的稳定颗粒，表明TT1-ELP当在体内使用时应是自组装的。
在临床应用中，这些智能的自组装颗粒可在肿瘤处局部低温(localcryothermia)时分解，以使TT1-ELP生物缀合物在应用光动力治疗之前更深入地扩散到肿瘤团块中。
令人感兴趣地，TT1-ELP颗粒的分解还可通过近红外光活化TT1时产生的1O2对甲硫氨酰基残基的氧化来触发。实际上，如与未氧化的生物缀合物相比，在与用于TT1-ELP的那些相似的条件下测量的化学氧化缀合物TT1-ELP(O)的热响应行为显示Tt具有巨大的跳跃(约17℃)。由于Tt为约45℃，远高于体温，因此氧化的生物缀合物TT1-ELP(O)在37℃下应是可溶的。
将光氧化的生物缀合物TT1-ELPPhOx的热响应特征与起始TT1-ELP生物缀合物和经化学氧化的参考化合物TT1-ELP(O)的热响应特征进行比较。在PBS中在30μM下的Tt从TT1-ELP的35℃转移到44℃，与化学合成的亚砜形式TT1-ELP(O)1获得的值完全一致。由亚砜形成产生的ELP骨架的物理化学特性的剧烈变化(改变缀合物的相变温度)将导致颗粒不稳定和分解。
实施例7—尺寸分布分析
为了模拟TT1-ELP的自组装和光氧化触发的分解谱，在生理条件(PBS pH 7.4在37℃下)中对TT1-ELP和TT1-ELPPhOx进行动态光散射(DLS)测量。结果在图4中示出。
溶液温度升高至37℃导致PBS(pH 7.4)中大颗粒(1.5μm流体动力学直径)的形成，而温度回降至20℃导致这些聚集体的分解，如在图4-A)中所示。
相比之下，在37℃下在PBS(pH 7.4)中TT1-ELPPhOx的DLS分析表明单链或小尺寸二聚体/多聚体的存在，而未检测到约1.5μm的聚集体，如在图4-B)中所示。
由于在环境温度下在PBS中TT1-ELP直接溶解时TT1的堆积倾向，因此在通过657nm激光以165°角进行的DLS测量中观察到具有窄的尺寸分布(PDI 0.2)的60nm胶束(图5-A))。温度控制的高速AFM成像甚至在15℃下也确定了胶束的存在，如在图5-B)中所示。
以上结果表明，在TT1的特定光辐照下，ELP被氧化成其亚砜衍生物ELP(O)，在生理体温下自组装成颗粒的疏水性的根据本发明的TT1-ELP生物缀合物转变成亲水性、可溶性的TT1-ELP(O)衍生物。
本发明的生物缀合物的多响应行为的实验认证显示出在临床应用方面是非常令人感兴趣的。实际上，在光动力治疗的背景下，由于甲硫氨酰基残基氧化和Tt的提高，因此在肿瘤部位积累的TT1-ELP自组装颗粒在局部光辐照时分解。然后，可溶性的光氧化生物缀合物分子将更容易且更深入地扩散到肿瘤组织中，包括在致密的肿瘤中，并且允许进行第二光辐照步骤。然后，TT1的再激活可对肿瘤团块造成相当大的损害。
实施例8—制备根据本发明生物缀合物的替代方法
步骤1：酞菁TT1的激活
TT1通过Cid et al.,Angewandte Chemie International Edition 2007,46(44),8358-8362中描述的方法获得。
根据以下合成反应方案进行TT1的官能化以引入N-羟基琥珀酰亚胺激活的酯：
对于该激活反应，在标准条件下在室温下在惰性气氛下，使用二氯甲烷作为溶剂，在存在N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)的情况下，使TT1与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应。将该溶液用二氯甲烷稀释并用H2O洗涤。将有机相用Na2SO4干燥，并在减压下去除溶剂。将所得粗制物通过柱色谱在硅胶(二氧六环:己烷，1:1)上进行纯化以得到作为深绿色固体的官能化TT1，称为TT1-NHS(80％)。
步骤2：TT1-ELP生物缀合物的合成和纯化
本实验中使用两种ELP：
ELP[M1V3-60]，其具有下式：
和ELP[M1V3-80]，其具有下式：
该偶联反应根据以下合成方案进行：
向ELP[M1V3-60]/ELP[M1V3-80](100mg，1当量)和TT1-NHS(1.2当量)在无水DMSO(25mg.mL-1浓度)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(1当量)，并通过氩气鼓泡使溶液脱气，持续5分钟。在室温下在N2下，将反应混合物搅拌48小时。然后使溶液在乙醚中沉淀。将沉淀物溶解在3mL水中，并在100G柱上进行纯化。将收集的样品冻干并通过可逆相变循环(ITC)进行另外的纯化。将TT1-ELP生物缀合物沉淀物溶解在20mL H2O中，并在透析袋(截止分子量15kDa)中相对于超纯水透析48小时并冻干。
TT1-ELP[M1V3-60]：101mg，3.85μmol，98％
TT1-ELP[M1V3-80]：96mg，2.84μmol，94％。
这些生物缀合物的表征结果示于图6(在20℃下在D2O中的1H NMR谱，在图6-A)中，SDS-PAGE分析，在图2-B))中。这些结果表明根据本发明生物缀合物的成功合成。
B/维替泊芬作为光敏剂
材料
以下试剂按原样使用：N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，Sigma-Aldrich，99％)、O-(1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HCTU，Sigma-Aldrich，>98％)、单线态氧传感器绿色探针试剂(Singlet Oxygen Sensor Green Reagent，SOSG，ThermoFisher)。
使用以下溶剂无需另外的纯化：N,N-二甲基甲酰胺(DMF，Fluka，99.8％)、乙醚(Et2O，VWR化学品，97％)、二甲基亚砜(DMSO，Sigma-Aldrich，99.9％)、甲醇(MeOH，Sigma-Aldrich，99.9％)。
光敏剂是维替泊芬(以其式(Xa)和(Xb)的两种异构体的混合物使用)，本文中称为VP(MedChemExpress，99.98％)(3-[(23S,24R)-14-乙烯基-5-(3-甲氧基-3-氧代丙基)-22,23-双(甲氧基羰基)-4,10,15,24-四甲基-25,26,27,28-四氮杂六环[16.6.1.13,6.18,11.113,16.019,24]二十八碳(octacosa)-1,3,5,7,9,11(27),12,14,16,18(25),19,21-十二碳烯-9-基]丙酸)。
弹性蛋白样多肽是ELP[M1V3-80]，其具有下式：
其根据先前报道的程序在大肠杆菌细菌中重组产生，例如，如文献WO 2017/021334中所述。
分析方法
尺寸排阻色谱(SEC)：DMSO中的SEC分析在配备有二极管阵列检测器(diode arraydetector，DAD)的来自Thermo 的/>3000系统上进行。该系统还包括来自Wyatt technology的多角度光散射检测器(multiangle light scatteringdetector，MALS)和差示折射率检测器(differential refractive index detector，dRI)。将缀合物在Tosoh TSK G3000HHR和G2000HHR(7.8×300)柱(排阻限为200至60,000Da)上进行分离，流量为0.5mL.分钟-1。将柱温维持在80℃。来自PSS的右旋糖酐用作标准品。二甲基亚砜(DMSO)+溴化锂1g.L-1用作洗脱液。
基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI MS)：MALDI-MS谱在配备有SMART bean II激光器(Nd:YAG，355nm)的Autoflex maX TOF质谱仪(Bruker Daltonics，Germany)上在CESAMO(Bordeaux，France)进行。谱以线性正离子模式记录，其中加速电压为19kV。将样品以10mg/mL溶解在水中。通过将10mg芥子酸溶解在1mL的乙腈/0.1％水性TFA 50/50v/v中来制备SA基质(芥子酸)溶液。将溶液以基质与样品为90:10体积比组合。将1.5μl所获得溶液沉积到MALDI板上并风干。
UV-Vis光谱：通过在配备有多单元热电温度控制器的Agilent Cary 100UV-Vis分光光度计上跟踪750nm处的吸光度相对于温度来确定不同缀合物的浊点温度(cloud pointtemperature，TCP)。在10至50℃的温度范围内以2℃.分钟-1的扫描速率以三种浓度(0.5、1和2mg/mL，对应于14.5、29和58μM)在磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)中测量浊度。将TCP确定为其中吸光度开始提高的起始温度。
通过UV光谱术的VP校准曲线：通过测量DMF中数种VP溶液(13.9μM、6.9μM、3.5μM、1.7μM、0.9μM)在690nm下的吸光度来计算DMF中VP的摩尔消光系数。所获得的等式为y＝35934x+0.0136，R2等于0.998。因此，所限定的εVP-690nm为35,394M-1.cm-1。然后，将1mg/mL的VP-ELP生物缀合物溶解在DMF中。如果转化率为100％，则1mg/mL溶液的所得浓度应为29μM。测量VP-ELP的吸光度，并计算相应的浓度以获得转化率。
动态光散射(DLS)：在吸收池中在恒定位置(在PBS，pH 7.4中在2mg/mL下的恒定散射体积)处以173°角在NanoZS仪器(HeNe激光器632.8nm，Malvern，U.K.)上进行VP-ELP、VP-ELP-M(O)或经光辐照的VP-ELP的DLS分析。从使用类CONTIN算法的二阶累积量拟合获得Z-平均流体动力学直径(DH)的值。将通过DLS温度上升(temperature ramp)(10至50℃)测量的TCP限定为其中尺寸和DCR开始提高的起始温度。
光辐照实验：将VP-ELP或ELP溶解在PBS pH 7.4中以获得0.125mg/mL溶液，并将其转移到最终体积为2mL的石英吸收池中。将SOSG(MeOH中3mM)添加至VP-ELP和ELP溶液，最终SOSG浓度等于0.4μM。将条件优化以避免吸收现象。与其他分析相比浓度因此降低。在搅拌下用690nm激光(35mW，90mA)进行辐照。
荧光测量：在15℃下，在添加单线态氧传感器绿色探针(SOSG)(空白)之前、在添加SOSG之后立即但在光辐照之前(T0)、以及在30分钟期间在不同光辐照时间之后(在辐照5、10、15、20、30分钟之后)获取溶液的荧光光谱。SOSG的激发波长为504nm。光谱荧光的记录条件为：扫描速度为100nm/分钟、响应为0.2秒、发射和激发带宽为2.5nm以及数据间隔为0.5nm。
实施例9—VP-ELP[M1V3-80]生物缀合物的合成和纯化
根据以下合成方案进行该偶联反应：
将VP(42.6mg，59.3μmol，10当量)和HCTU(24.5mg，59.3μmol，10当量)溶解在10mL无水DMF中，并在室温下搅拌1小时。
在15分钟期间将ELP[M1V3-80](200mg，5.93μmol，1当量)溶解在30mL含有DIPEA(1.5μL，1.5当量)的无水DMF中，并随后添加激活的VP在DMF中的溶液。在氩气氛下在室温下，将溶液在搅拌下放置约40小时。然后用乙醚沉淀溶液，并在减压下干燥沉淀物。将固体溶解在冷水中，并使用透析管(MWCO 3.5kDa)相对于超纯水透析2天。将溶液冻干以获得作为绿色粉末的VP-ELP缀合物VP-ELP[M1V3-80](170mg，85％总产率，90％转化率)。
实施例10—比较化合物VP-ELP[M(O)1V3-80]
为了研究本发明生物缀合物在其甲硫氨酰基残基氧化之后的特征，使用除ELP的11个甲硫氨酰基残基的所有硫原子均被氧化成亚砜形式之外具有与VP-ELP[M1V3-80]相同结构的比较化合物VP-ELP[M(O)1V3-80]。根据实施例4中所述的方法从ELP[M1V3-80]获得ELP[M(O)1V3-80]。进行与实施例9中所述相同的方法来合成和纯化VP-ELP-M(O)生物缀合物VP-ELP[M(O)1V3-80]。
实施例11—特征/特性
如下表征实施例9的VP-ELP生物缀合物和实施例10的VP-ELP-M(O)生物缀合物。
MALDI MS分析结果在图7中示出，在a/中为VP-ELP，在b/中为VP-ELP-M(O)。VP-ELP的MALDI MS谱显示出对应于VP-ELP的在34,602处的主峰，和对应于未反应ELP的在33,895处的第二小的峰。这两个峰之间的质量差与VP的理论摩尔质量(718.8g/mol)一致。VP-ELP-M(O)缀合物获得了相似的结果，其中主峰在34,787处并且第二小的峰在34,074处。
在DMSO中VP-ELP的SEC分析示出了单峰的峰，如在图8中所示。
单独的VP和缀合物的吸光度光谱在图9中分别在a/和b/中示出。VP具有在约690nm表现出优异的吸收系数的Q带，而其UV-Vis吸收光谱提供了宽的治疗光学窗，具有数个吸收峰。这些特性与光动力治疗相关。在b/中示出的光谱的吸收带的比较表面VP成功地与ELP以及与氧化的ELP连接。
在10至50℃的温度范围内跟踪在750nm下的吸光度，在磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)中通过浊度测定来测量在VP缀合之后ELP和ELP-M(O)的热响应特征。测量在VP-ELP和VP-ELP-M(O)于10℃下完全溶解的三种浓度(0.5、1和2mg/mL)下进行。结果在图10中示出，在a/中为VP-ELP，在b/中为VP-ELP-M(O)。两种生物缀合物的TCP作为浓度的函数在c/中示出。在VP缀合之后，VP-ELP的TCP为约22℃。当ELP被氧化时，发现TCP提高约14℃，VP-ELP-M(O)的TCP为约36℃。在生理体温下，VP-ELP-M(O)处于其中其可容易地分解的不稳定的区域。
对生物缀合物产生单线态氧(1O2)的能力进行测定，该能力是为了实现光动力或放射动力治疗(PDT/RDT)所必需的特性。为此，在介质中添加单线态氧传感器绿色探针(SOSG)。事实上，该传感器与1O2反应并在525nm处发射荧光。在光辐照期间跟踪荧光产生。示出了所测量的荧光强度作为发射波长的函数的图在图11中示出，在a/中为VP-ELP，在b/中为单独的ELP。当ELP与VP缀合时，辐照时间越长，荧光强度越高(a/)。在另一方面，在存在单独的ELP的情况下在辐照下，荧光强度是稳定的(b/)。该观察结果表明，本发明的VP-ELP生物缀合物成功地产生了1O2，如还通过在图11中c/中的图所示，其示出了VP-ELP和ELP的所测量的荧光强度作为时间的函数。
通过DLS测量突出示出了VP-ELP光辐照的第二个结果，其结果在图12中示出。在不同的辐照时间点(在辐照之前、在10分钟辐照之后和在30分钟辐照之后)之后针对上升温度(ramp temperature)(10至50℃)测量目标的Z-平均值。在辐照之前(“无辐照”)，VP-ELP在低温下形成簇(cluster)，然后随温度升高而形成大的聚集体。由此确定的TCP为约28℃。在辐照期间，VP-ELP的TCP提高。在辐照30分钟之后，VP-ELP(“30分钟辐照”)的Z-平均值曲线与VP-ELP-M(O)(“对照”)的相似，其中TCP为约35℃。VP-ELP形成小的不稳定寡聚物(在生理体温下自发分解)。因此，VP产生的1O2诱导ELP骨架上存在的甲硫氨酸残基的氧化，这与光敏剂TT1的研究结果一致。
这些结果表明，VP-ELP在生理体温下自发地自组装成颗粒，并且在光动力治疗过程的光辐照步骤之后，其具有为约生理体温的值的LCST，从而触发了该颗粒在生理体温下的分解。
序列表
<110> UNIVERSITE DE BORDEAUX
INSTITUT POLYTECHNIQUE DE BORDEAUX
CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MADRID
<120> 包含光敏剂单元的生物缀合物、其制备方法及其用途
<130> 34281 WO
<150> EP 21305116.2
<151> 2021-01-29
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弹性蛋白样多肽的单体单元
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa表示可变氨基酸残基，其可以是除脯氨酰基残基或其衍生物之外的任何天然或非天然的氨基酸残基，特别是缬氨酸残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是甘氨酸或丙氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa表示可变氨基酸残基，其可以是除脯氨酰基残基或其衍生物之外的任何天然或非天然的氨基酸残基，特别是缬氨酸残基
<400> 1
Xaa Pro Xaa Xaa Gly
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弹性蛋白样多肽的单体单元
<400> 2
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<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弹性蛋白样多肽的单体单元
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是甘氨酸或丙氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa表示可变氨基酸残基，其可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸，特别是具有式-(CH2)z-S-R’侧链的含硫氨基酸残基，其中z是1或2并且R'是C1-C22烃基
<400> 3
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弹性蛋白样多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(114)
<223> Xaa表示具有式-(CH2)z-S-R'侧链的含硫氨基酸残基，其中z是1或2并且R'是C1-C22烃基
<400> 4
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<212> PRT
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<220>
<223> 弹性蛋白样多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(91)
<223> Xaa表示具有式-(CH2)z-S-R'侧链的含硫氨基酸残基，其中z是1或2并且R'是C1-C22烃基
<400> 5
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<212> PRT
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<220>
<223> 弹性蛋白样多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(191)
<223> Xaa表示具有式-(CH2)z-S-R'侧链的含硫氨基酸残基，其中z是1或2并且R'是C1-C22烃基
<400> 6
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弹性蛋白样多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(291)
<223> Xaa表示具有式-(CH2)z-S-R'侧链的含硫氨基酸残基，其中z是1或2并且R'是C1-C22烃基
<400> 7
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<211> 402
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弹性蛋白样多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(391)
<223> Xaa表示具有式-(CH2)z-S-R'侧链的含硫氨基酸残基，其中z是1或2并且R'是C1-C22烃基
<400> 8
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Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Xaa Gly
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<220>
<223> 弹性蛋白样多肽
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<223> 弹性蛋白样多肽
<400> 10
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35 40 45
Pro Gly Met Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
50 55 60
Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
65 70 75 80
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly Val Pro Gly Val
85 90 95
Gly Val Pro Gly Val Gly
100
<210> 11
<211> 202
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弹性蛋白样多肽
<400> 11
Met Trp Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly Val Pro Gly Val
1 5 10 15
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly
20 25 30
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
35 40 45
Pro Gly Met Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
50 55 60
Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
65 70 75 80
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly Val Pro Gly Val
85 90 95
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly
100 105 110
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
115 120 125
Pro Gly Met Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
130 135 140
Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
145 150 155 160
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly Val Pro Gly Val
165 170 175
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly
180 185 190
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
195 200
<210> 12
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弹性蛋白样多肽
<400> 12
Met Trp Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly Val Pro Gly Val
1 5 10 15
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly
20 25 30
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
35 40 45
Pro Gly Met Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
50 55 60
Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
65 70 75 80
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly Val Pro Gly Val
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Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly
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165 170 175
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly
180 185 190
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
195 200 205
Pro Gly Met Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
210 215 220
Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
225 230 235 240
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly Val Pro Gly Val
245 250 255
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly
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Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
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<213> 人工序列
<220>
<223> 弹性蛋白样多肽
<400> 13
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Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
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Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
225 230 235 240
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly Val Pro Gly Val
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Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly
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Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
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Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
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Pro Gly Met Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
370 375 380
Gly Val Gly Val Pro Gly Met Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
385 390 395 400
Val Gly
Claims (16)
1.生物缀合物，其包含光敏剂单元和与光敏剂单元缀合的弹性蛋白样多肽，所述弹性蛋白样多肽包含出现至少一次的具有式(A)的单体单元：
Xaa1PXaa2Xaa3G (A)
其中P代表脯氨酰基残基，G代表甘氨酰基残基，Xaa2代表甘氨酰基残基或丙氨酰基残基，并且：
-Xaa1代表缬氨酰基残基且Xaa3代表具有式-(CH2)z-S-R’侧链的含硫氨基酸残基，其中z等于1或2，并且R’代表直链、支链和/或环状的C1-C22烃基，其是饱和和/或不饱和、芳族或非芳族的、任选取代有、任选间插有一个或更多个杂原子和/或者包含至少一个杂原子或包含含有至少一个杂原子之基团的一个或更多个基团；
-或者Xaa3代表缬氨酰基残基且Xaa1代表具有式-(CH2)z-S-R’侧链的含硫氨基酸残基，其中z等于1或2，并且R’如以上所限定。
2.根据权利要求1所述的生物缀合物，其中R’代表C1-C3烷基。
3.根据权利要求1或2所述的生物缀合物，其中，在式(A)中：
-Xaa1代表缬氨酰基残基且Xaa3代表选自甲硫氨酰基残基、S-烷基-高半胱氨酰基残基和S-烷基-半胱氨酰基残基的氨基酸残基，
-或者Xaa3代表缬氨酰基残基且Xaa1代表选自甲硫氨酰基残基、S-烷基-高半胱氨酰基残基和S-烷基-半胱氨酰基残基的氨基酸残基。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的生物缀合物，其中所述光敏剂选自酞菁、卟啉、基于氟硼吡咯的光敏剂和亚甲蓝。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的生物缀合物，其中所述光敏剂单元通过接头与所述弹性蛋白样多肽共价连接。
6.根据权利要求1或5中任一项所述的生物缀合物，其中所述弹性蛋白样多肽在其N端末端处与所述光敏剂单元缀合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的生物缀合物，其中所述弹性蛋白样多肽具有式(B)：
Z[VPXaa2Xaa3G]x-OH (B)
其中，
x是1至200的整数，
Z代表包含1至20个氨基酸残基的肽片段，
V代表缬氨酰基残基，P代表脯氨酰基残基，G代表甘氨酰基残基，
Xaa2代表甘氨酰基残基或丙氨酰基残基，
并且Xaa3代表选自缬氨酰基残基和具有式-(CH2)z-S-R’侧链的含硫氨基酸残基的可变氨基酸残基，z和R’如权利要求1或2中所限定，
Xaa3使得该[VPXaa2Xaa3G]x肽片段中缬氨酰基残基/含硫氨基酸残基的摩尔比为0/1至10/1。
8.根据权利要求7所述的生物缀合物，其中，在式(B)中，Z代表具有氨基酸序列MW的肽片段。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的生物缀合物，其中所述弹性蛋白样多肽具有选自以下序列的氨基酸序列：
MGTELAAASEFTHMW[VPGMG]20(SEQ ID No：9)，MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]5(SEQ ID No：10)，MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]10(SEQ ID No：11)，MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]15(SEQ ID No：12)和MW[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]20(SEQ ID No：13)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的生物缀合物，其中所述光敏剂单元是具有通式(V’)的酞菁单元：
其中：
M代表金属或类金属原子，
R2、R3、R4、R5和R6可以是相同或不同的，各自代表：氢原子、-COOH、-C≡C-COOH、-CH＝CHCOOH、具有1至12个碳原子的直链或支链烷基、-OR7、-SR7或-NR7R8，其中R7和R8可以是相同或不同的，各自代表氢原子、具有1至12个碳原子的直链或支链烷基、或任选地被一个或更多个R9基团取代的苯基，所述R9基团独立地选自具有1至12个碳原子的直链或支链烷基、-OR10、-SR10和-NR11R12，其中R10、R11和R12可以是相同或不同的，各自代表氢原子或具有1至12个碳原子的直链或支链烷基，
或者，R3和R4、以及R5和R6中的一对或两对与相邻的碳原子连接，并与其所连接的环一起形成芳族稠环体系，
并且R1代表参与所述酞菁单元与所述弹性蛋白样多肽连接的共价键。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的生物缀合物，其中所述光敏剂单元是维替泊芬。
12.制备根据权利要求1至11中任一项所述生物缀合物的方法，特征在于，所述方法包括：
-对弹性蛋白样多肽的N端末端进行修饰以引入末端炔基，所述弹性蛋白样多肽包含出现至少一次的具有式(A)的单体单元：Xaa1PXaa2Xaa3G(A)，其中P、G、Xaa1、Xaa2和Xaa3如权利要求1至3中任一项所限定，
-使光敏剂分子官能化以引入叠氮基，
-以及在如此修饰的弹性蛋白样多肽与如此官能化的光敏剂之间实现Huisgen铜(I)催化的炔烃-叠氮环加成反应。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的生物缀合物，其用于通过光动力治疗来治疗疾病，特别是用于治疗皮肤疾病或眼疾病。
14.根据权利要求13中所述应用的生物缀合物，其中所述生物缀合物通过注射在待治疗对象的身体靶部位中来施用。
15.药物组合物，其包含可药用载剂中的根据权利要求1至11中任一项所述的生物缀合物。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其为适合于肠胃外施用于对象的形式。
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