CN116963777A - 蜱传脑炎和相关病毒的广谱中和抗体 - Google Patents

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Abstract

本公开提供新型广谱中和抗蜱传脑炎病毒(TBEV)抗体。所公开的抗TBEV抗体代表了一种新的用于预防或治疗由各种蜱传黄病毒(包括TBEV)引起的疾病或感染的治疗策略。

Description

蜱传脑炎和相关病毒的广谱中和抗体
关于联邦资助研究的声明
本发明在国立卫生研究院授予的P01-AI138398和U19-AI111825号基金的资助下利用政府支持完成。政府对本发明享有一定权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年11月25日提交的美国临时申请第63/118,461号的权益，所有这些的公开内容特此通过引用以其整体并入。
发明领域
本发明涉及针对蜱传黄病毒(包括蜱传脑炎病毒(TBEV))的表位的抗体。
背景技术
蜱传黄病毒引起一系列新出现的感染性疾病，包括致命性脑炎。与其他黄病毒一样，TBEV包膜蛋白(E)由三个结构域EDI-III组成。蜱传脑炎病毒(TBEV)是由蜱传播的引起人类疾病的七种黄病毒之一。每年报告的病例超过10,000例，且近年来发病率呈上升趋势，并且该疾病在新的地理区域出现。
受感染的蜱的叮咬或食用受感染动物的未经巴氏消毒的牛奶导致双相疾病，其开始时会出现一段时间的流感样症状，然后发展为神经系统疾病(蜱传脑炎或TBE)。针对TBE没有特异性疗法，治疗仅限于支持疗法。对于那些幸存下来的人来说，长期后遗症很常见。尽管TBEV疫苗是可用的，但免疫需要定期加强，并且疫苗接种对年轻人和老年人的效果较差。疫苗接种需要间隔长达两年施用三剂独立剂量，并建议间隔3-5年施用一次加强剂量。此外，尽管接种了疫苗，仍会发生突破性TBEV感染。
因此，仍然强烈需要具有改善的中和效力和广度的抗TBEV抗体，这些抗体有效预防和治疗由蜱传黄病毒(例如TBEV)引起的疾病或感染。
发明概述
本公开通过提供广谱中和抗TBEV抗体或其抗原结合片段解决了上述多个方面的需求。
一方面，本公开提供了特异性结合TBEV抗原的分离的抗TBEV抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，TBEV抗原包含E蛋白第III结构域(EDIII)的侧脊。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段能够中和多种TBEV毒株。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链可变区，其具有与选自表2A-I、3和4中的那些氨基酸序列中的一个具有至少75％的同一性的氨基酸序列，或(ii)轻链可变区，其具有与选自表2A-I、3和4中的那些氨基酸序列中的一个具有至少75％的同一性的氨基酸序列。在一些实例中，抗体或其抗原结合片段包含：(i)选自表2A-I、3和4中的那些中的一个的三个重链CDR(HCDR 1-3)，和/或(ii)选自表2A-I、3和4中的那些中的一个的三个轻链CDR(LCDR 1-3)。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含选自表2A-I、3和4中的那些中的一个的六个CDR。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区的三个重链互补决定区(HCDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，所述重链可变区具有SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115或117的氨基酸序列；以及轻链可变区的三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116或118的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，其具有与SEQ IDNO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115或117的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；或具有SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115或117的氨基酸序列；和轻链可变区，其具有与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116或118的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；或具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116或118的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12、13-14、15-16、17-18、19-20、21-22、23-24、25-26、27-28、29-30、31-32、33-34、35-36、37-38、39-40、41-42、43-44、45-46、47-48、49-50、51-52、53-54、55-56、57-58、59-60、61-62、63-64、65-66、67-68、69-70、71-72、73-74、75-76、77-78、79-80、81-82、83-84、85-86、87-88、89-90、91-92、93-94、95-96、97-98、99-100、101-102、103-104、105-106、107-108、109-110、111-112、113-114、115-116或117-118的各自的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体是多价抗体，例如二价或双特异性抗体。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段进一步包含变体Fc恒定区。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体、人抗体、人源化抗体或人源化单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是单链抗体、Fab片段或Fab2片段。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段被可检测地标记或缀合至毒素、治疗剂、聚合物、受体、酶或受体配体。在一些实施方案中，聚合物是聚乙二醇(PEG)。
另一方面，本公开还提供了药物组合物，其包含上文所述的抗体或其抗原结合片段和任选的药学上可接受的载体或赋形剂。
在一些实施方案中，药物组合物包含两种或更多种上文所述的抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，每个抗体或其抗原结合片段均包含(i)选自表2A-I、3和4中的那些的抗体的HCDR 1-3和LCDR 1-3，或(ii)包含选自表2A-I、3和4中的那些的抗体的各自的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。
在一些实施方案中，两种或更多种抗体或其抗原结合片段包含：(1)第一抗体组，其包含：(i)包含重链可变区和轻链可变区的第一抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区和轻链可变区包含选自表2A-I、3和4中的那些的第一抗体的各自的氨基酸序列；和(ii)包含重链可变区和轻链可变区的第二抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区和轻链可变区包含选自表2A-I、3和4中的那些的第二抗体的各自的氨基酸序列；或(2)第二抗体组，其包含：(a)包含重链可变区和轻链可变区的第三抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区和轻链可变区包含选自表2A-I、3和4中的那些的抗体的各自的氨基酸序列；和(b)包含重链可变区和轻链可变区的第四抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区和轻链可变区包含选自表2A-I、3和4中的那些的抗体的各自的氨基酸序列，其中第三抗体不同于第四抗体。
在一些实施方案中，药物组合物还包含第二治疗剂。在一些实施方案中，第二治疗剂包括抗炎剂或抗病毒剂。在一些实施方案中，抗病毒剂包括：核苷类似物、类肽、寡肽、多肽、蛋白酶抑制剂、3C样蛋白酶抑制剂、木瓜蛋白酶样蛋白酶抑制剂或RNA依赖性RNA聚合酶的抑制剂。在一些实施方案中，抗病毒剂可包括：阿昔洛韦、更昔洛韦、阿糖腺苷、膦甲酸、西多福韦、金刚烷胺、利巴韦林、三氟胸苷、齐多夫定、去羟肌苷、扎西他滨或干扰素。在一些实施方案中，干扰素是干扰素-α或干扰素-β。
所述的药物组合物在制备用于由蜱传黄病毒(例如，TBEV)感染引起的病况的诊断、预防、治疗或其组合的药物中的用途也在本公开的范围内。
另一方面，本公开还提供了(i)编码上文描述的抗体或其抗原结合片段的多肽链的核酸分子；(ii)包含如所述的核酸分子的载体；和(iii)包含如所述的载体的培养的宿主细胞。
还提供了一种用于产生多肽(例如，抗TBEV抗体)的方法，包括：(a)获得如所述的培养的宿主细胞；(b)在允许由载体编码的多肽的表达和抗体或其片段的组装的条件下在培养基中培养所述培养的宿主细胞；和(c)从培养的细胞或细胞的培养基中纯化抗体或片段。
另一方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含药学上可接受的剂量单位的如上所述的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。在本公开的范围内还包括用于诊断、预后或监测受试者的蜱传黄病毒(例如，TBEV)治疗的试剂盒，其包含：如上所述的抗体或其抗原结合片段；和至少一种特异性结合所述抗体或其抗原结合片段的检测试剂。
在又一方面，本公开还提供了一种中和受试者中的蜱传脑炎病毒(例如，TBEV)的方法。该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的如上所述的抗体或其抗原结合片段或治疗有效量的如上所述的药物组合物。
在一些实施方案中，中和受试者中的蜱传黄病毒(例如，TBEV)的方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的如上所述的抗体或其抗原结合片段的第一抗体或其抗原结合片段和第二抗体或其抗原结合片段，其中第一抗体或其抗原结合片段和第二抗体或其抗原结合片段表现出协同活性；或治疗有效量的上文所述的药物组合物。
在又一方面，本公开还提供了预防或治疗蜱传黄病毒(例如，TBEV)感染的方法。该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的如上所述的抗体或其抗原结合片段或治疗有效量的如上所述的药物组合物。
在一些实施方案中，该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的如上所述的抗体或抗原结合片段的第一抗体或其抗原结合片段和第二抗体或其抗原结合片段，其中第一抗体或其抗原结合片段和第二抗体或其抗原结合片段表现出协同活性；或治疗有效量的上文所述的药物组合物。在一些实施方案中，第一抗体或其抗原结合片段在第二抗体或其抗原结合片段之前、之后或同时施用。
在一些实施方案中，第一抗体或其抗原结合片段和第二抗体或其抗原结合片段可以是包含重链可变区和轻链可变区的抗体或其抗原结合片段的任何组合，所述重链可变区和轻链可变区包含选自表2A-I、3和4中的那些的抗体的各自的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第二治疗剂包括抗炎剂或抗病毒剂。在一些实施方案中，抗病毒剂包括核苷类似物、类肽、寡肽、多肽、蛋白酶抑制剂、3C样蛋白酶抑制剂、木瓜蛋白酶样蛋白酶抑制剂或RNA依赖性RNA聚合酶抑制剂。在一些实施方案中，抗病毒剂可包括：阿昔洛韦、更昔洛韦、阿糖腺苷、膦甲酸、西多福韦、金刚烷胺、利巴韦林、三氟胸苷、齐多夫定、去羟肌苷、扎西他滨或干扰素。在一些实施方案中，干扰素是干扰素-α或干扰素-β。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段在第二治疗剂或疗法之前、之后或同时施用。在一些实施方案中，将抗体或其抗原结合片段静脉内、皮下或腹膜内施用于受试者。在一些实施方案中，预防性或治疗性施用抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，本公开还提供了一种检测样品中蜱传黄病毒(例如，TBEV)的存在的方法，其包括以下步骤：(i)使样品与上文所述的抗体或其抗原结合片段接触；和(ii)确定抗体或抗原结合片段与一种或多种蜱传黄病毒(例如，TBEV)抗原的结合，其中抗体与一种或多种蜱传黄病毒(例如，TBEV)抗原的结合指示样品中存在蜱传黄病毒(例如TBEV)。在一些实施方案中，样品是血液样品。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段与标记缀合。在一些实施方案中，检测步骤包括使二抗与抗体或其抗原结合片段接触，并且其中二抗包含标记。在一些实施方案中，标记包括荧光标记、化学发光标记、放射性标记和酶。
在一些实施方案中，检测步骤包括检测荧光或化学发光。在一些实施方案中，检测步骤包括竞争性结合测定或ELISA。
在一些实施方案中，该方法还包括将样品结合到固体支持物上。在一些实施方案中，固体支持物包括微粒、微珠、磁珠和亲和纯化柱。
前述概述并非旨在限定本公开的每一方面，并且额外的方面在其他部分中描述，例如以下详细描述。整个文件旨在作为一个统一的公开内容，并且应该理解，本文描述的特征的所有组合都是预期的，即使这些特征的组合没有在本文件的同一个句子、段落或部分中一起找到。本发明的其他特征和优点将从以下详细描述中变得明显。然而，应当理解，详细描述和具体实施例虽然指示了本公开的具体实施方案，但仅以举例说明的方式给出，因为在本公开的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员而言将从该详细描述中变得明显。
附图简要说明
图1A、1B、1C、1D和1E是一组图表，显示了用于TBEV抗体的筛查个体的结果。图1A是蜱传脑炎临床过程的示意图。黄色表示血清采集的大概时间。图1B显示了TBEV EDIII IgGELISA的结果。该图显示了相对于阴性对照的来自141名TBEV感染个体、10名TBEV疫苗接种者和168名随机供血者的样品的血清(1∶500稀释度)的光密度测量值(Y轴)。p值是通过单向ANOVA和Tukey检验计算的。水平线表示平均值。图1C显示了TBEV RVP中和筛选的结果。图表显示了相对于无血清对照的针对TBEV报告病毒颗粒(RVP；两个重复孔的平均值)的排序的血清中和活性(1∶600,000稀释度)。橙色框(左下)表示测试的141名TBEV感染个体和10名TBEV疫苗接种者中的28种最佳中和剂。p值通过双尾Mann-Whitney检验得出。图1D显示TBEVRVP中和曲线。该图显示了图1C中的28种最强效血清中的每一种的代表性中和曲线。代表2个实验，每个实验一式三份进行。误差条表示标准偏差。图1E显示前28名个体的排序的半数最大血清中和效价(NT50)。两个独立实验的平均值。在图1D和1E中，橙色表示用于抗体克隆的外周血单核细胞的供体。
图2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2H、2I、2J、2K、2L、2M、2N和2O是一组图表，显示了疫苗接种者的临床相关性和血清中和作用。图2A、2B、2C、2D、2E和2F显示相对于人口统计数据和可用临床信息绘制的血清TBEV EDIII ELISA数据(IgG)。图2G、2H、2I和2L显示相对于人口统计数据和可用临床信息绘制的血清TBEV RVP中和数据。图2C和2I显示疾病的严重程度；图2D和2J显示住院时测量的IgM滴度(IP)；图2E和2K显示住院时测量的IgG滴度(维也纳单位/mL)。对于图2A、2B、2D、2E、2G、2H、2J和2K使用双尾p检验；对于图2L和2F使用Mann-Whitney检验；对于图2C和2I，使用单向ANOVA和Tukey检验，来计算统计显著性。图2M显示了血清TBEV EDIII ELISA(IgG)和RVP中和数据之间的相关性。图2N显示来自接种疫苗的PBMC供体的血清的TBEV RVP中和曲线。代表两个实验，每个实验一式三份。均值加标准偏差。图2O是所有受感染和接种疫苗的PBMC供体的血清NT50的总结。
图3A、3B、3C和3D是一组图，显示了来自受感染和接种疫苗的个体的抗TBEV抗体。图3A显示了来自受感染供体的TBEV特异性B细胞的鉴定。代表性流式细胞术图显示在一个对照和六个TBEV感染供体中与AF647标记和PE标记的TBEV EDIII结合的B细胞。数字表示双阳性B细胞的百分比。门控策略如图4A所示。图3B显示抗体序列的克隆分析。饼图显示抗体序列的分布。中心的数字代表获得的抗体序列总数。彩色或灰色饼图切块对应于克隆相关序列，其中切块大小与序列数量成正比例。所有蓝色切块都是IGVH1-69；所有红色切块都是IGVH3-48/IGVK1-5。白色切块对应于不是克隆(单峰)的一部分的抗体序列。图3C和3D与图3A和3B相同，但针对的是一名健康对照和三名接种疫苗的供体。图3E显示抗体序列相关性。Circos图显示来自所有供体的序列，颜色编码如图3B和3D所示。连接线表示共有IGH和IGLV和J基因的抗体。紫色、绿色和灰色线分别将相关克隆相互连接、将克隆连接到单峰、将单峰连接到单峰。
图4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H和4I是一组显示分选策略和抗体序列分析的图。图4A显示了分选策略。使用前向和侧向散射对单个淋巴细胞进行门控。转储通道(dumpchannel)包括CD3、CD8、CD14、CD16和活力染料。对未能结合卵清蛋白(OVA-)但结合与PE和AF647荧光团偶联的TBEV EDIII诱饵的CD20+B细胞进行了纯化。图4B显示了每个供体的V基因体细胞核苷酸突变的数量(左)和CDR3的氨基酸长度(右)。图4C与图4B相同，但针对的是组合的所有供体。对于图4B和4C，水平线表示平均值。图4显示了来自组合的所有供体的抗体的IGH CDR3处的疏水性GRAVY分数分布，并与人类库进行了比较(Briney，B.，等人，(2019)Nature 566，393-397)。图4E显示了描绘V重链基因在来自受感染供体的TBEV抗体中的使用频率与人类库相比的条形图(Rubelt，F.，等人，(2012)PLoS One 7，e49774)。图4F和4G，与图4E相同，但针对的是Vκ和Vλ基因。在图4E、4F和4G中，橙色表示本研究中分离的抗TBEV抗体，而蓝色表示对照库；使用具有不等方差的双尾t检验计算p值。图4H显示了由WebLogo生成的来自受感染供体的抗体CDR3的序列标志。堆栈的高度表示给定位置的序列保守性，而堆栈内字母的高度表示该位置每个氨基酸的相对频率。图4I显示了在多个供体中发现的高度相似的抗体序列的实例。
图5A、5B、5C、5D、5E、5F和5G是一组显示了强效且广谱交叉反应的单克隆抗体的鉴定的图。图5A显示了分别来自受感染个体和疫苗接种个体的46个和13个单克隆抗体的TBEVWE EDIII ELISA结合曲线。数据代表2个实验。虚线是10-1074同种型对照。图5B显示总结图5A中的抗体对三个TBEV谱系EDIII：TBEVWE、TBEVFE和TBEVSI的EC50值的点图。2个实验的平均值。水平线表示平均值。图5C显示图5A中抗体相对于无抗体对照标准化的RVP中和曲线。数据代表2个实验，每个实验一式三份进行。误差条表示标准偏差。图5D显示总结了图A中的抗体对TBEVWE RVP中和的平均半数最大抑制浓度(IC50)的点图。两个实验的平均值。水平线表示平均IC50。双尾Mann-Whitney检验未发现统计学差异。图5E和5F显示体外TBEV中和。在图5E中，曲线代表连续稀释的抗体对病毒的中和作用。代表一式八份进行的两个独立实验。在图5F中，在指定抗体的存在下感染的PS细胞的代表性免疫荧光显微图像。绿色是病毒抗原，蓝色是细胞核。比例尺表示200μm。图5G显示抗TBEV抗体的交叉中和。该图显示了所选抗体针对对应于波瓦森LB(POWV-LB)、波瓦森DTV(POWV-DTV)、基萨那森林病(KFDV)、Langat(LGTV)、羊跳跃病(LIV)和鄂木斯克出血热病毒(OHFV)的RVP的IC50。两个独立实验的平均值。水平线表示平均IC50。在图5A、5B、5C、5D和5E中，蓝色和红色表示受感染供体来源的IGVH1-69/κ和IGVH3-48/IGVK1-5抗体；而紫色表示来自接种疫苗个体的IGHV1-69/κ抗体。抗体T036和T025分别以黄色和橙色显示。在图5B、5D和5G中，实心圆和三角形分别对应于源自受感染的或接种疫苗的供体的抗体。
图6A、6B、6C、6D、6E、6F、6G、6H和6I是一组显示抗体结合和中和的图。图6A显示59种抗体与TBEVFE和TBEVSi EDIII的ELISA结合曲线。数据代表两个实验。图6B显示对结合一组蜱传黄病毒EDIII的抗体的筛选，包括波瓦森LB(POWV-LB)、波瓦森鹿蜱(POWV-DTV)、基萨那森林病(KFDV)、Langat(LGTV)、羊跳跃病Ill(LIV)和鄂木斯克出血热(OHFV)。抗体以1μg/mL一式两份进行筛选。灰色表示相对于对照的结合。图6C显示针对与图6B中的相同的蜱传黄病毒组对应的RVP的抗体中和的筛选。以1μg/mL一式三份筛选抗体。灰色表示相对于对照的结合。图6D、6E、6F、6G、6H和6I显示所选抗体针对TBEV以外的蜱传黄病毒RVP的中和曲线。代表两个实验，一式三份。
图7A、7B、7C、7D和7E是一组显示T036增强TBEV感染的图。图7A显示了在T036IgG、F(ab′)2和F(ab)的存在下TBEV RVP感染的剂量依赖性增强。代表两个实验，以一式三份进行。误差条表示标准偏差。图7B显示病毒滴度的增强。该图显示了PS细胞在中和抗体T038、增强抗体T036或同种型对照10-1074的存在下孵育24或48小时后的Hypr-TBEV病毒滴度。使用单向ANOVA和Tukey检验计算p值。虚线表示测定的检测限。图7C显示增强的病毒抗原检测。在指定量的T036、T038或10-1074对照的存在下，感染Hypr-TBEV的PS细胞的代表性显微图像。比例尺表示200μm。图7D和7E显示融合环结合抗体4G2阻断了T036的增强作用。在图7D中，相对于无抗体对照，在抗体4G2、T036或4G2与T036的组合的存在下的TBEV RVP感染。代表两个实验。在图7E中，在4G2、T036或4G2和T036的组合的存在下，用Hypr-TBEV感染PS细胞后的细胞噬斑计数。对于图7D和7E，使用单向ANOVA和Tukey检验计算p值；图7D中的误差条表示一式三份的标准偏差。
图8A和8B是一组显示T036增强TBEV感染的图。图8A是显示PS细胞感染并在T036、中和抗体T038或同种型对照10-1074的存在下孵育24或48小时后TBEV Neudoerfl滴度的图。用单向ANOVA和Tukey检验计算p值。图8B显示了在指定抗体的存在下具有TBEVNeudoerfl的PS细胞的代表性免疫荧光显微图像。绿色是病毒抗原，蓝色是细胞核。比例尺表示200μm。
图9A、9B、9C和9D是一组显示了T025抗体识别暴露在成熟病毒结构上的TBEVEDIII上的侧脊表位的图。图9A显示TBEVWE EDIII的T025识别。T025与TBEVWE EDIII上的N末端区域(EDI-EDIII铰链、BC环和DE环)相互作用。图9B显示了T025表位。具有在T025Fab中残基以内的原子的TBEVWE EDIII残基在EDIII抗原的表面示意图上突出显示。CDRH3和CDRL3显示为带有棒状侧链的带状骨架。图9C显示T025识别与抗TBEV小鼠抗体19/1786相似的表位。T025表位以橙色阴影显示；19/1786表位以蓝色虚线标出。标记了在19/1786表位内但不在T025表位中的残基。表位被定义为含有在抗体残基中的一个原子的/>范围内的原子的残基。图9D显示了T025(PDB 5O6A)的cryo-EM结构的表面示意图，在选择的顶点(左)显示了5倍、3倍和2倍的二十面体对称算子，插图比较了T025和19/1786抗体的结合姿势(右)。插图：与19/1786VHVL结构域(PDB 5O6V)相互作用的病毒表面cryo-EM结构的指定部分(虚线框)的特写，其中用红色、黄色和蓝色标记E蛋白结构域，用蓝绿色和青色标记VHVL结构域。在对齐EDIII结构域(/>82个Cα原子)后，T025-TBEVWE EDIII晶体结构停靠在与二十面体2重对称轴相邻的病毒体EDIII上。T025VHVL以与19/1786VHVL相似的姿势结合EDIII。
图10A和10B是一组显示用T025进行预防和治疗的图。图10A显示T025在暴露前预防中有效。在用致死剂量的TBEV-Hypr感染前24小时，用T025或10-1074(同种型对照)治疗小鼠。上部，直方图显示随时间变化的疾病分数。抗体剂量显示在右侧。两个独立的实验相结合。下部，Kaplan Meyer生存曲线。通过Mantel-Cox检验计算p值(p＜0.0001)。图10B显示T025在感染后施用时保护小鼠。在感染后1、3或5天(DPI)，用30μg T025或对照10-1074治疗小鼠。三个实验结合起来，通过Mantel-Cox检验，+1DPI和+3DPI的p值都为p＜0.0001。
发明详述
本公开描述了具有意想不到的广谱中和活性的抗TBEV抗体。除了TBEV之外，这些抗体还可以中和其他新出现的蜱传黄病毒，包括Langat、羊跳跃病(louping ill)、鄂木斯克出血热(Omsk hemorrhagic fever)、基萨那森林病(Kyasanur forest disease)和波瓦森病毒(Powassan virus)。因此，所公开的抗体和抗原结合片段代表了一种新的治疗策略，用于预防或治疗由各种蜱传黄病毒(包括TBEV)引起的疾病或感染。
A.广谱中和抗TBEV抗体
抗体
本文公开的发明涉及广谱中和抗TBEV抗体或其抗原结合片段。这些抗体是指一类中和抗体，其中和多种蜱传黄病毒及其毒株。抗体能够预防性地和治疗性地保护受试者免受蜱传黄病毒(例如，TBEV)的致死攻击。
一方面，本公开提供了一种分离的抗TBEV抗体或其抗原结合片段，其特异性结合蜱传黄病毒(例如，TBEV)抗原。在一些实施方案中，抗原包含EDIII的侧脊。
下表2A-I、3和4中列出的是示例性抗TBEV抗体的重链(HC)可变区和轻链(LC)可变区的代表性氨基酸和/或核酸序列。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链可变区，其具有与选自表2A-I、3和4中的一种具有至少75％(例如，75％、50％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)同一性的氨基酸序列，和(ii)轻链可变区，其具有与选自表2A-I、3和4中的一种具有至少75％(例如，75％、50％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：(i)选自表2A-I、3和4中的那些中的一个的三个重链CDR(HCDR1-3)，和/或(ii)选自表2A-I、3和4中的那些中的一个的三个轻链CDR(LCDR 1-3)。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含选自表2A-I、3和4中的那些中的一个的六个CDR。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区的三个重链互补决定区(HCDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，所述重链可变区具有SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115或117的氨基酸序列；以及轻链可变区的三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116或118的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，其具有与SEQ IDNO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115或117的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；或具有SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115或117的氨基酸序列；和轻链可变区，其具有与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116或118的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；或具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116或118的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12、13-14、15-16、17-18、19-20、21-22、23-24、25-26、27-28、29-30、31-32、33-34、35-36、37-38、39-40、41-42、43-44、45-46、47-48、49-50、51-52、53-54、55-56、57-58、59-60、61-62、63-64、65-66、67-68、69-70、71-72、73-74、75-76、77-78、79-80、81-82、83-84、85-86、87-88、89-90、91-92、93-94、95-96、97-98、99-100、101-102、103-104、105-106、107-108、109-110、111-112、113-114、115-116或117-118的各自的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段进一步包含变体Fc恒定区。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人源化单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是单链抗体、Fab片段或Fab2片段。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段进一步包含变体Fc恒定区。抗体可以是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体或人源化单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体可以是单链抗体、Fab或Fab2片段。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以被可检测地标记或缀合至毒素、治疗剂、聚合物(例如，聚乙二醇(PEG))、受体、酶或受体配体。例如，本发明的抗体可以与毒素(例如破伤风毒素)偶联。此类抗体可用于治疗感染了在病原学上与蜱传黄病毒(例如，TBEV)相关的病毒的动物，包括人类。
在另一个实例中，本发明的抗体可以与可检测标签偶联。此类抗体可用于诊断测定以确定动物(例如人)是否感染了蜱传黄病毒(例如，TBEV)。可检测标签的实例包括：荧光蛋白(即，绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白)、荧光标志物(即，异硫氰酸荧光素、罗丹明、德克萨斯红)、放射性标记物(即，3H、32P、125I)、酶(即，β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、β-葡萄糖醛酸酶、碱性磷酸酶)或亲和标签(即抗生物素蛋白、生物素、链霉抗生物素蛋白)。将抗体与可检测标签偶联的方法是本领域已知的。Harlow等人，Antibodies：ALaboratory Manual，第319页(Cold Spring Harbor Pub.1988)。
片段
在一些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fv和单链Fv(scFv)片段，以及下文描述的其他片段，例如双抗体、三抗体、四体抗体和单结构域抗体。对于某些抗体片段的综述，请参见Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。对于scFv片段的综述，参见，例如，Pluckthun，in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg和Moore编，(Springer-Verlag，New York)，pp.269-315(1994)；还参见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，可以是二价的或双特异性的。参见，例如，EP 404，097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993。三抗体和四抗体也描述于Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在一些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(DOMANTIS，Inc.，Waltham，Mass.；参见，例如，美国专利号6,248,516)。
抗体片段可以通过多种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。
嵌合抗体和人源化抗体
在一些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物如猴子的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类别或亚类已从亲本抗体的类别发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在一些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非人抗体被人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)源自非人抗体，而FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被相应的来自非人抗体(例如，HVR残基所源自的抗体)的残基取代，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制造方法在例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中进行了综述，并且在例如以下文献中进行了进一步描述：Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)接枝)；Padlan，Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述“表面再建(resurfacing)”)；Dall′Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(描述“FR改组”)；以及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer，83：252-260(2000)(描述FR改组的“引导选择”方法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见，例如，Sims等人.J.Immunol.151：2296(1993))；源自轻链或重链可变区特定亚组的人抗体共有序列的框架区(参见，例如，Carter等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；和Presta等人.J.Immunol.，151：2623(1993))；人类成熟(体细胞突变的)框架区或人类种系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)))；和源自筛选FR文库的框架区(参见，例如，Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)和Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
人抗体
在一些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术或使用本文描述的技术来产生人抗体。人抗体一般描述于以下文献中：van Dijk和van deWinkel，Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)以及Lonberg，Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)。
可通过向转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已被修饰以响应于抗原攻击而产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其替代内源性免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被失活。对于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg，Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。还参见，例如，描述XENOMOUSE技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述HUMAB技术的美国专利号5,770,429；描述K-MMOUSE技术的美国专利号7,041,870，以及描述VELOCIMOUSE技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900)。来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区可以被进一步修饰，例如，通过与不同的人恒定区组合。
人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法来制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(参见，例如，Kozbor J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；和Boerner等人，J.Immunol.，147：86(1991))。通过人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也描述于Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)。其他方法包括例如在以下文献中描述的那些：美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni，XiandaiMianyixue，26(4)：265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)。人杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于以下文献中：Vollmers和Brandlein，Histology and Histopathology，20(3)：927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein，Methods and Findings in Experimental andClinical Pharmacology，27(3)：185-91(2005)。
还可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列生成人抗体。然后可以将此类可变结构域序列与所需的人恒定结构域组合。从抗体文库中选择人抗体的技术在下文描述。
可通过筛选具有所需一种或多种活性的抗体的组合文库来分离本发明的抗体。例如，本领域已知多种方法用于生成噬菌体展示文库并筛选此类文库以寻找具有所需结合特征的抗体。此类方法例如在Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O′Brien等人编，Human Press，Totowa，N.J.，2001)中进行了综述，并在例如以下文献中进行了进一步描述：McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks和Bradbury，Methods inMolecular Biology 248：161-175(Lo，ed.，Human Press，Totowa，N.J.，2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；以及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，VH和VL基因库通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以筛选抗原结合噬菌体，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)所述。噬菌体通常展示抗体片段，要么作为scFv片段要么作为Fab片段。来自免疫源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以克隆原始库(例如，从人类)以提供针对广泛的非自身还有自身抗原的单一抗体来源，而无需任何免疫，如Griffiths等人，EMBO J，12：725-734(1993)所述。最后，还可以通过从干细胞克隆未重排的V基因片段并使用包含随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区域并在体外完成重排来合成原始文库，如Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括例如美国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被认为是人抗体或人抗体片段。
变体
在一些实施方案中，涵盖本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质。可以通过将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任意组合以获得最终构建体，条件是最终构建体具有所需的特征，例如抗原结合。
取代、插入和缺失变体
在一些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。取代诱变的感兴趣的位点包括HVR和FR。保守取代在本文中定义。可以将氨基酸取代引入感兴趣的抗体，以及针对所需的活性筛选的产品中，例如，保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。
因此，本发明的抗体可包含本文所述的CDR、重链可变区或轻链可变区的一个或多个保守修饰。本发明所公开的肽、多肽或蛋白的保守修饰或功能等同物是指该肽、多肽或蛋白的多肽衍生物，例如具有一个或多个点突变、插入、缺失、截短、融合蛋白或其组合的蛋白。它基本上保留了亲本肽、多肽或蛋白(例如本发明中公开的那些)的活性。一般而言，保守修饰或功能等同物与亲本至少60％(例如，60％至100％之间的任何数字，包括端点在内，例如60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％)相同。因此，具有一个或多个点突变、插入、缺失、截短、融合蛋白或其组合的重链可变区或轻链可变区，以及具有变异区的抗体在本发明的范围内。
如本文所用，两个氨基酸序列之间的同源性百分比等同于两个序列之间的同一性百分比。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置数的函数(即，同源性％＝相同位置数/位置总数x 100)，同时考虑到空位数和每个空位的长度，其需要被引入以实现两个序列的最佳比对。两个序列之间的序列比较和同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成，如下面的非限制性实例中所述。
可以使用已被并入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表、空位长度罚分为12和空位罚分为4，来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。此外，可以使用已被纳入GCG软件包(可在www.gcg.com获得)中的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6，测定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。
另外地或可选地，本发明的蛋白序列还可以用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索，以例如识别相关序列。可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的XBLAST程序(2.0版)执行此类搜索。可以用XBLAST程序、得分＝50、字长＝3执行BLAST蛋白搜索，以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以使用Gapped BLAST，如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。(参见www.ncbi.nlm.nih.gov)。
如本文所用，术语“保守修饰”是指不显著影响或改变包含氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变，将修饰引入本发明的抗体中。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括：(i)具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，(ii)酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，(iii)不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，(iv)非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，(v)β支链侧链(例如、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和(vi)芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
非保守取代将需要将这些类别中的一类的成员换成另一类。
示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以方便地生成，例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，例如以下文献中描述的那些：Hoogenboom等人，in Methods inMolecular Biology 178：1-37(O′Brien等人，ed.，Human Press，Totowa，N.J.，(2001)。氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基到包含一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括将抗体的N-或C-末端与酶(例如，用于ADEPT)或增加抗体血清半衰期的多肽融合。
糖基化变体
在一些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或减少抗体被糖基化的程度。抗体糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点而方便地实现。
例如，可以制备无糖基化抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点的糖基化。这种糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。这种方法在Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中有更详细的描述。
可以通过使N297残基突变为另一个残基，例如N297A，和/或通过使相邻氨基酸例如298突变，从而减少N297上的糖基化来阻止N297上恒定区的糖基化。
另外地或备选地，可以制备具有改变类型的糖基化的抗体，例如具有减少的岩藻糖基残基量的低岩藻糖基化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已证明了这种改变的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。此类碳水化合物修饰可通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现。本领域已经描述了具有改变的糖基化机制的细胞，并且可以将其用作宿主细胞，在该宿主细胞中表达本文所述的重组抗体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hanai等人的EP 1,176,195描述了具有功能性破坏的FUT8基因的细胞系，该基因编码岩藻糖基转移酶，从而使在此类细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化。Presta的PCT公布WO 03/035835描述了一种变体中国仓鼠卵巢细胞系：Led 3细胞，其将岩藻糖附着到Asn(297)连接的碳水化合物的能力降低，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(另见Shields，R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人的PCT公布WO 99/54342描述了经工程化以表达糖蛋白修饰性糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnTIII))的细胞系，从而使在工程化细胞系中表达的抗体表现出增加的二等分GlcNac结构，这导致抗体增加的ADCC活性(另见Umana等人(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。
Fc区变体
本文所述抗体的可变区可以连接(例如，共价连接或融合)至Fc，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc，其可以是任何同种异型或异种异型(isoallotype)，例如，对于IgG1：Glm、Glml(a)、Glm2(x)、Glm3(f)、Glm17(z)；对于IgG2：G2m、G2m23(n)；对于IgG3：G3m、G3m21(g1)、G3m28(g5)、G3m11(b0)、G3m5(b1)、G3m13(b3)、G3m14(b4)、G3m10(b5)、G3m15(s)、G3m16(t)、G3m6(c3)、G3m24(c5)、G3m26(u)、G3m27(v)；以及对于K：Km、Km1、Km2、Km3(参见例如Jefferies等人(2009)mAbs 1∶1)。在一些实施方案中，本文所述的抗体可变区与结合一种或多种活化Fc受体(FcγI、FcγIIa或FcγIIIa)的Fc连接，从而刺激ADCC并可引起T细胞耗竭。在一些实施方案中，本文所述的抗体可变区与导致耗尽的Fc连接。
在一些实施方案中，本文所述的抗体可变区可以与包含一个或多个修饰的Fc连接，通常以改变抗体的一种或多种功能性质，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合，和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本文所述的抗体可以经化学修饰(例如，一个或多个化学部分可以附着到抗体)或经修饰以改变其糖基化，从而改变抗体的一种或多种功能性质。Fc区的残基编号是EU索引或Kabat的编号。
Fc区包括源自免疫球蛋白恒定区的结构域，优选人免疫球蛋白，包括恒定区的片段、类似物、变体、突变体或衍生物。合适的免疫球蛋白包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和其他类别，例如IgA、IgD、IgE和IgM。免疫球蛋白的恒定区定义为与免疫球蛋白C末端区同源的天然存在或合成产生的多肽，并可单独地或组合地包括CH1结构域、铰链、CH2结构域、CH3结构域或CH4结构域。在一些实施方案中，本发明的抗体具有不同于野生型IgA1的Fc区。抗体可以具有来自IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)或其他类别(例如IgA2、IgD、IgE和IgM)的Fc区。Fc可以是IgA1的突变形式。
免疫球蛋白的恒定区负责许多重要的抗体功能，包括Fc受体(FcR)结合和补体结合。重链恒定区主要分为五类，分类为IgA、IgG、IgD、IgE、IgM，每类都具有由同种型指定的特征效应子功能。例如，IgG分为四个亚类，称为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
Ig分子与多类细胞受体相互作用。例如，IgG分子与IgG类抗体特异的三类Fcγ受体(FcγR)，即FcγRI、FcγRII和FcγRIIL相互作用。据报道，IgG与FcγR受体结合的重要序列位于CH2和CH3结构域中。抗体的血清半衰期受该抗体与FcR结合的能力的影响。
在一些实施方案中，Fc区是变体Fc区，例如，相对于亲本Fc序列(例如，随后进行修饰以产生变体的未修饰的Fc多肽)进行了修饰的Fc序列，以提供所需的结构特征和/或生物活性。例如，可以在Fc区中进行修饰以生成Fc变体，其(a)具有增加或减少的ADCC，(b)增加或减少的CDC，(c)对Clq的亲和力增加或减少和/或(d)相对于亲本Fc，对Fc受体的亲和力增加或减少。这样的Fc区变体通常将在Fc区中包含至少一个氨基酸修饰。组合氨基酸修饰被认为是特别可取的。例如，变体Fc区可以在其中包括两个、三个、四个、五个或更多个取代，例如，本文确定的特定Fc区位置的取代。
变体Fc区还可包含序列改变，其中参与二硫键形成的氨基酸被移除或被其他氨基酸替换。这种去除可以避免与用于产生本文所述抗体的宿主细胞中存在的其他含半胱氨酸的蛋白反应。即使去除半胱氨酸残基，单链Fc结构域仍可形成非共价连接在一起的二聚体Fc结构域。在其他实施方案中，可以修饰Fc区以使其与选定的宿主细胞更相容。例如，可以去除典型的天然Fc区的N末端附近的PA序列，这可以被大肠杆菌中的消化酶(例如脯氨酸亚氨基肽酶)识别。在其他实施方案中，Fc结构域内的一个或多个糖基化位点可被去除。通常糖基化的残基(例如天冬酰胺)可产生细胞溶解反应。这样的残基可以被缺失或被未糖基化的残基(例如，丙氨酸)取代。在其他实施方案中，可以从Fc区去除参与与补体相互作用的位点，例如Clq结合位点。例如，可以缺失或取代人IgG1的EKK序列。在一些实施方案中，可以去除影响与Fc受体结合的位点，优选不是补救受体结合位点的位点。在其他实施方案中，Fc区可以经修饰以去除ADCC位点。ADCC位点是本领域已知的；关于IgG1中的ADCC位点参见，例如，Molec.Immunol.29(5)：633-9(1992)。变体Fc结构域的具体实例公开于例如WO 97/34631和WO 96/32478中。
在一个实施方案中，对Fc的铰链区进行修饰，从而使铰链区中半胱氨酸残基的数量被改变，例如，增加或减少。在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中进一步描述了这种方法。改变Fc铰链区中半胱氨酸残基的数量以例如促进轻链和重链的组装或增加或降低抗体的稳定性。在一个实施方案中，使抗体的Fc铰链区突变以降低抗体的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入到Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域，从而使相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合，该抗体具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。这种方法在Ward等人的美国专利号6,165,745中予以更详细的描述。
在其他实施方案中，通过用不同的氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变Fc区以改变抗体的效应子功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基替换，从而使抗体对效应子配体的亲和力改变但保留了亲本抗体的抗原结合能力。亲和力改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的CI组分。这种方法在Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中予以更详细的描述。
在另一个实例中，选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸可以用不同的氨基酸残基替换，从而使抗体改变了Clq结合和/或减少或消除了CDC。这种方法在Idusogie等人的美国专利号6,194,551中予以更详细的描述。
在另一实例中，改变氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基从而改变抗体固定补体的能力。这种方法在Bodmer等人的PCT公布WO 94/29351中予以进一步的描述。
在又一实例中，可通过修饰以下位置的一个或多个氨基酸来修饰Fc区以增加ADCC和/或增加对Fcγ受体的亲和力：234、235、236、238、239、240、241、243、244、245、247、248、249、252、254、255、256、258、262、263、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、299、301、303、305、307、309、312、313、315、320、322、324、325、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、433、434、435、436、437、438或439。示例性取代包括236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332D和332E。示例性变体包括239D/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T、267E/268F、267E/324T和267E/268F7324T。用于增强FcγR和补体相互作用的其他修饰包括但不限于取代298A、333A、334A、326A、247I、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、305I和396L。这些和其他修饰在Strohl，2009，Current Opinion in Biotechnology 20：685-691中进行了综述。
增加与Fcγ受体结合的Fc修饰包括在Fc区的氨基酸位置238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、279、280、283、285、298、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、312、315、324、327、329、330、335、337、3338、340、360、373、376、379、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439中的任何一个或多个位置的氨基酸修饰，其中Fc区中残基的编号是如abat(WO00/42072)中的EU索引的编号。
可以对Fc进行的其他Fc修饰是那些用于减少或消除与FcγR和/或补体蛋白的结合的修饰，从而减少或消除Fc介导的效应子功能，例如ADCC、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和CDC。示例性修饰包括但不限于在位置234、235、236、237、267、269、325和328处的取代、插入和缺失，其中编号是根据EU索引。示例性取代包括但不限于234G、235G、236R、237K、267R、269R、325L和328R，其中编号是根据EU索引。Fc变体可包含236R/328R。用于减少FcγR和补体相互作用的其他修饰包括取代297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233P和234V，以及通过突变或酶促手段或通过在不使蛋白糖基化的生物体(例如细菌)中产生来去除位置297处的糖基化。这些和其他修饰在Strohl，2009，Current Opinion in Biotechnology 20：685-691中进行了综述。
任选地，Fc区可以在本领域技术人员已知的另外的和/或备选的位置处包含非天然存在的氨基酸残基(参见例如美国专利号5,624,821；6,277,375；6,737,056；6,194,551；7,317,091；8,101,720；WO00/42072；WO01/58957；WO02/06919；WO04/016750；WO04/029207；WO04/035752；WO04/074455；WO04/099249；WO04/063351；WO05/070963；WO05/040217、WO05/092925和WO06/020114)。
也可以使用增强对抑制性受体FcγRIIb的亲和力的Fc变体。此类变体可为Fc融合蛋白提供与FcγRIIb细胞(包括例如B细胞和单核细胞)相关的免疫调节活性。在一个实施方案中，Fc变体提供相对于一种或多种活化受体选择性增强的对FcγRIIb的亲和力。用于改变与FcγRIIb结合的修饰包括在选自根据EU索引编号的234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328和332的位置处的一个或多个修饰。用于增强FcγRIIb亲和力的示例性取代包括但不限于234D、234E、234F、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y和332E。示例性取代包括235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W和328Y。用于增强与FcγRIIb结合的其他Fc变体包括235Y/267E、236D/267E、239D/268D、239D/267E、267E/268D、267E/268E和267E/328F。
Fc区对其配体的亲和力和结合性质可以通过本领域已知的多种体外测定方法(基于生物化学或免疫学的测定)来确定，包括但不限于平衡方法(例如，ELISA，或放射免疫测定)或动力学(例如，BIACORE分析)，以及其他方法，例如间接结合测定、竞争性抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱法(例如凝胶过滤)。这些和其他方法可以利用一种或多种被检查组分上的标记和/或采用多种检测方法，包括但不限于显色、荧光、发光或同位素标记。结合亲和力和动力学的详细描述可见于Paul，W.E.编，FundamentalImmunology，第4版，Lippincott-Raven，Philadelphia(1999)，其关注于抗体-免疫原相互作用。
在一些实施方案中，抗体被修饰以增加其生物半衰期。各种方法都是可能的。例如，这可以通过增加Fc区对FcRn的结合亲和力来完成。例如，可以使以下残基中的一个或多个突变：252、254、256、433、435、436，如美国专利号6,277,3755中所述。具体的示例性取代包括以下的一个或多个：T252L、T254S和/或T256F。备选地，为了增加生物半衰期，可以在CH1或CL区域内改变抗体以包含取自IgG Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述。增加与FcRn结合和/或改善药代动力学性质的其他示例性变体包括在位置259、308、428和434处的取代，包括例如259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y和434M。增加Fc与FcRn结合的其他变体包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等人，，2004，J.Biol.Chem.279(8)：6213-6216，Hinton等人.2006Journal of Immunology 176：346-356)、256A、272A、286A、305A、307A、307Q、311A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A(Shields等人，Journal of BiologicalChemistry，2001，276(9)：6591-6604)、252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、311S、433R、433S、433I、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/309P/311S(Dall Acqua等人.Journal of Immunology，2002，169：5171-5180，Dall′Acqua等人，2006，Journal of Biological Chemistry 281：23514-23524)。用于调节FcRn结合的其他修饰描述于Yeung等人，2010，J Immunol，182：7663-7671。在一些实施方案中，可以使用具有特定生物学特征的杂合IgG同种型。例如，可以通过在两种同种型不同的位置用来自IgG3的氨基酸取代CH2和/或CH3区中的IgG 1位置来构建IgG1/IgG3杂合变体。因此，可以构建包含一个或多个取代的杂合变体IgG抗体，例如274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、422I、435R和436F。在本文所述的其他实施方案中，可以通过在两种同种型不同的位置用来自IgG1的氨基酸取代CH2和/或CH3区中的IgG2位置来构建IgG1/IgG2杂合变体。因此，可以构建杂合变体IgG抗体，其包含一个或多个取代，例如，以下氨基酸取代中的一个或多个：233E、234L、235L、236G(是指在位置236处插入甘氨酸)和321h。
此外，FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn在人IgG1上的结合位点已经被绘制出来，并且具有改善的结合的变体已经被描述(参见Shields，R.L.等人(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。显示位置256、290、298、333、334和339的特定突变改善与FcγRIII的结合。此外，显示以下组合突变体改善FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A，已显示其表现出增强的FcγRIIIa结合和ADCC活性(Shields等人，2001)。已确定了与FcγRIIIa的结合强烈增强的其他IgG1变体，包括具有S239D/I332E和S239D/I332E/A330L突变的变体，它们显示出最大的对FcγRIIIa的亲和力增加，FcγRIIb结合减少，并且在食蟹猴中具有强细胞毒活性(Lazar等人，2006)。将三重突变引入抗体例如阿仑单抗(CD52-特异性)、曲妥珠单抗(HER2/neu-特异性)、利妥昔单抗(CD20-特异性)和西妥昔单抗(EGFR-特异性)转化为体外大幅增强的ADCC活性，以及S239D/I332E变体在猴子中显示出增强的耗尽B细胞的能力(Lazar等人，2006)。此外，已经鉴定出含有L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L突变的IgG1突变体，这些突变体在B细胞恶性肿瘤和乳腺癌模型中表现出增强的与FcγRIIIa的结合，并在表达人FcγRIIIa的转基因小鼠中伴随增强的ADCC活性(Stavenhagen等人，2007；Nordstrom等人，2011)。可以使用的其他Fc突变体包括：S298A/E333A/L334A、S239D/I332E、S239D/I332E/A330L、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L和M428L/N434S。
在一些实施方案中，选择与FcγR的结合减少的Fc。具有减少的FcγR结合的示例性Fc，例如IgG1 Fc，包含以下三个氨基酸取代：L234A、L235E和G237A。在一些实施方案中，选择具有减少的补体结合的Fc。补体结合减少的示例性Fc，例如IgG1 Fc，具有以下两个氨基酸取代：A330S和P331S。在一些实施方案中，选择基本上没有效应子功能的Fc，即它与FcγR的结合减少和补体结合减少。无效应子的示例性Fc，例如IgG1 Fc，包含以下五个突变：L234A、L235E、G237A、A330S和P331S。当使用IgG4恒定结构域时，通常优选包括取代S228P，其模拟IgG1中的铰链序列，从而稳定IgG4分子。
多价抗体
在一个实施方案中，本发明的抗体可以是单价或多价的(例如二价、三价等)。如本文所用，术语“价”是指与抗体相关的潜在靶结合位点的数量。每个靶结合位点特异性结合一个靶分子或靶分子上的特定位置或基因座。当抗体是单价时，分子的每个结合位点将特异性结合单个抗原位置或表位。当抗体包含多于一个的靶结合位点(多价)时，每个靶结合位点可以特异性结合相同或不同的分子(例如，可以结合不同的配体或不同的抗原，或相同抗原上的不同表位或位置)。参见，例如，U.S.P.N.2009/0130105。在每种情况下，至少一个结合位点将包含与DLL3同种型相关的表位、基序或结构域。
在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体，其中两条链具有不同的特异性，如Millstein等人，1983，Nature，305：537-539中所述。其他实施方案包括具有额外特异性的抗体，例如三特异性抗体。其他更复杂的相容性多特异性构建体及其制造方法阐述于以下文献：U.S.P.N.2009/0155255，以及WO 94/04690；Suresh等人，1986，Methods inEnzymology，121：210；和WO96/27011。
如上所述，多价抗体可以免疫特异性结合所需靶分子的不同表位，或者可以免疫特异性结合靶分子以及异源表位，例如异源多肽或固体支持材料。在一些实施方案中，多价抗体可包括双特异性抗体或三特异性抗体。双特异性抗体还包括交联的或“异源缀合(heteroconjugate)”抗体。例如，异源缀合物中的一种抗体可以与抗生物素蛋白偶联，另一种与生物素偶联。例如，此类抗体已被提议将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利号4,676,980)并用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可以使用任何方便的交联方法制备异源缀合抗体。合适的交联剂以及一些交联技术是本领域中众所周知的并且公开在美国专利号4,676,980。
在一些实施方案中，通过使用本领域普通技术人员熟知的方法，具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合，例如包含铰链、CH2和/或CH3区的至少部分的免疫球蛋白重链恒定结构域。
抗体衍生物
本文提供的抗体可被进一步修饰以包含本领域已知且容易获得的额外非蛋白质部分。适用于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。
水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于PEG、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇，及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而在制造中可能具有优点。聚合物可以具有任何分子量并且可以是支化的或未支化的。连接到抗体上的聚合物数量可能不同，如果连接了多于一种聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可以基于以下考虑来决定，所述考虑包括但不限于待改善的抗体的特定性质或功能、抗体衍生物是否将用于规定条件下的疗法中等。
在另一个实施方案中，提供了可以通过暴露于辐射而被选择性加热的抗体和非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。辐射可以具有任何波长并且包括但不限于不伤害普通细胞但将非蛋白质部分加热至接近抗体-非蛋白质部分的细胞被杀死的温度的波长。
本文所述抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。抗体可以被聚乙二醇化以例如增加抗体的生物学(例如，血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，通常使抗体或其片段与PEG例如PEG的反应性酯或醛衍生物在使一个或多个PEG基团附着于该抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，聚乙二醇化经由与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生化其他蛋白的任何形式的PEG，例如单(CI-CIO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在一些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是非糖基化抗体。聚乙二醇化蛋白的方法是本领域已知的并且可以应用于本文所述的抗体。参见，例如，Nishimura等人的EP 0154 316和Ishikawa等人的EP0401384。
本发明还包括与治疗剂、聚合物、可检测标记或酶缀合的本文所述的人单克隆抗体。在一个实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂。在一个实施方案中，该聚合物是PEG。
核酸、表达盒和载体
本发明提供了编码本发明的多肽、肽片段和偶联蛋白的分离的核酸片段。由于遗传密码的简并性，本发明的核酸片段还包括编码相同氨基酸的片段。例如，氨基酸苏氨酸由ACU、ACC、ACA和ACG编码，并因此是简并的。本发明旨在包括编码相同氨基酸的多核苷酸片段的所有变体。此类突变是本领域中已知的(Watson等人，Molecular Biology of theGene，Benjamin Cummings 1987)。突变还包括改变核酸片段以编码保守氨基酸变化，例如，亮氨酸取代为异亮氨酸等。此类突变也是本领域已知的。因此，本发明的基因和核苷酸序列包括天然存在的序列以及突变体形式。
本发明的核酸片段可以包含在载体中。载体可包括但不限于双链或单链线性或环状形式的任何质粒、噬菌粒、F因子、病毒、粘粒或噬菌体，其可以是或可以不是自传播或可移动的。载体还可以通过整合到细胞基因组中或存在于染色体外(例如，自主复制具有复制起点的质粒)来转化原核或真核宿主。
载体中的核酸区段可以在体外或宿主细胞如真核细胞或微生物例如细菌中用于转录的适当启动子或其他调控元件的控制下并可有效地连接至该用于转录的适当启动子或其他调控元件。该载体可以是在多个宿主中起作用的穿梭载体。载体也可以是克隆载体，其通常含有一个或少量限制性核酸内切酶识别位点，外源DNA序列可以在这些位点以可确定的方式插入。这种插入可以在不丧失克隆载体的基本生物学功能的情况下发生。克隆载体还可以包含适合用于鉴定和选择用克隆载体转化的细胞的标志基因。标志基因的实例是四环素抗性或氨苄青霉素抗性。许多克隆载体是可商购的(Stratagene，New EnglandBiolabs，Clonetech)。
也可以将本发明的核酸片段插入表达载体中。通常，表达载体包含编码细菌复制起点和抗生素抗性基因的原核DNA元件，以便在细菌宿主中扩增和选择表达载体；控制转录起始的调节元件，例如启动子；以及控制转录物加工的DNA元件，例如内含子或转录终止/聚腺苷酸化序列。
将核酸片段引入载体的方法是本领域中可获得的(Sambrook等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(2001))。简而言之，用一种或多种限制性内切酶(限制性内切核酸酶)处理待插入核酸片段的载体，以产生具有平端、带5′或3′突出端的“粘性”端或以上的任意组合的线性化载体。载体也可以用限制性内切酶处理，随后用另一种修饰酶处理，例如聚合酶、核酸外切酶、磷酸酶或激酶，以产生具有可用于将核酸片段连接到载体中的特征的线性化载体。待插入载体的核酸片段用一种或多种限制性内切酶处理以产生具有平端、具有5′或3′突出端的“粘性”端或以上任意组合的线性化片段。核酸片段也可以用限制性内切酶处理，随后用另一种DNA修饰酶处理。此类DNA修饰酶包括但不限于聚合酶、核酸外切酶、磷酸酶或激酶，以产生具有可用于将核酸片段连接到载体中的特征的核酸片段。
然后根据本领域可用的方法将处理过的载体和核酸片段连接在一起以形成含有核酸片段的构建体(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001))。例如，处理过的核酸片段和处理过的载体在合适的缓冲液和连接酶存在下组合。然后将混合物在合适的条件下孵育以允许连接酶将核酸片段连接到载体中。
本公开还提供了一种表达盒，其包含能够在体外或在宿主细胞中指导本发明的特定核酸区段表达的核酸序列。此外，可以将本发明的核酸区段插入表达盒中，从而产生反义信息。表达盒是可分离的单元，使得表达盒可以是线性形式并且对体外转录和翻译测定有功能。进行这些测定的材料和程序可从Promega Corp.(Madison，Wis.)商购获得。例如，可通过将核酸序列置于T7启动子的控制下然后使用T7RNA聚合酶产生体外转录物来产生体外转录物。然后可以通过使用兔网织红细胞裂解物在体外翻译该转录物。或者，可以将表达盒引入载体中，以允许表达盒在宿主细胞内复制和扩增，或者也允许核酸区段的体外转录和翻译。
这样的表达盒可以含有一个或多个允许将核酸区段置于调控序列的调控下的限制性位点。表达盒还可以包含有效地连接到核酸区段的终止信号以及核酸区段的正确翻译所需的调控序列。包含核酸区段的表达盒可以是嵌合的，意味着其至少一种组分相对于其至少一种其他成分是异源的。表达盒也可以是天然存在的但已经以可用于异源表达的重组形式获得的表达盒。表达盒中核酸区段的表达可在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，其仅在宿主细胞暴露于某些特定外部刺激时启动转录。
表达盒可以包括在转录的5′-3′方向上的转录和翻译起始区、核酸区段以及在体内和/或体外有功能的转录和翻译终止区。终止区可以与转录起始区是同来源的，可以与核酸区段是同来源的，或者可以源自另一个来源。
调控序列可以是位于编码序列上游(5′非编码序列)、内或下游(3′非编码序列)的多核苷酸序列，它影响转录、RNA加工或稳定性，或相关的编码序列的翻译。调控序列可包括但不限于增强子、启动子、阻遏物结合位点、翻译前导序列、内含子和聚腺苷酸化信号序列。它们可以包括天然和合成序列以及可以是合成和天然序列的组合的序列。虽然调控序列不限于启动子，但一些有用的调控序列包括组成型启动子、诱导型启动子、调节启动子、组织特异性启动子、病毒启动子和合成启动子。
启动子是一种核苷酸序列，它通过提供对RNA聚合酶和正确转录所需的其他因子的识别来控制编码序列的表达。启动子包括最小启动子，其仅由转录起始所需的所有基本元件组成，例如TATA盒和/或起始子，它是由TATA盒和其他用于指定转录起始位点的序列组成的短DNA序列，向其添加调节元件以控制表达。启动子可完全源自天然基因，或由源自自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至由合成DNA区段组成。启动子可包含参与响应于生理或发育条件而控制转录起始有效性的蛋白因子的结合的DNA序列。
本公开还提供了包含载体和表达盒的构建体。载体可以选自但不限于先前描述的任何载体。可以通过本领域已知和先前描述的方法向该载体中插入表达盒(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(2001))。在一个实施方案中，表达盒的调控序列可以源自表达盒所插入的载体以外的来源。在另一个实施方案中，包含载体和表达盒的构建体在将本发明的核酸区段插入本身包含调控序列的载体中后形成。因此，在将核酸区段插入载体后形成表达盒。含有调控序列的载体是可商购的，并且它们的使用方法是本领域已知的(Clonetech，Promega，Stratagene)。
另一方面，本公开还提供了(i)编码上文所述的抗体或其抗原结合片段的多肽链的核酸分子；(ii)包含如所述的核酸分子的载体；以及(iii)包含如所述的载体的培养的宿主细胞。
还提供了一种用于产生多肽(例如，抗TBEV抗体)的方法，包括：(a)获得所述的培养的宿主细胞；(b)在允许由载体编码的多肽表达和抗体或其片段的组装的条件下在培养基中培养培养的宿主细胞；和(c)从培养的细胞或细胞的培养基中纯化抗体或片段。
产生方法
可以使用重组方法和组合物来产生抗体，例如如美国专利号4,816,567中所述的。在一个实施方案中，提供了编码本文所述抗体的分离的核酸。这样的核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在又一个实施方案中，提供了一种或多种包含这样的核酸的载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供了包含这样的核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用以下转化)：(1)包含编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了一种制备抗体的方法，其中该方法包括在适合抗体表达的条件下培养包含编码如上文所述的抗体的核酸的宿主细胞，并任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗体。
对于抗体的重组生产，分离编码抗体的核酸，例如，如上所述的，并插入一个或多个载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)可以容易地对这样的核酸进行分离和测序。
如本文所述，例如在实施例中，编码所公开抗体的RNA可从恢复期或接种疫苗的供体中分离并逆转录成cDNA。然后可以通过重组DNA方法修饰cDNA，并将其克隆到一个或多个载体中以在宿主细胞中表达。可以分离重组表达的单克隆抗体并对其进行进一步纯化。至少归因于逆转录、PCR扩增和克隆过程中的一个或多个，每个重组制备和表达的抗体在重链可变区、轻链可变区或恒定区中具有至少一个或多个非天然发生的变化或突变，将其与天然抗体区分开来。这些突变使本文公开的抗体明显不同于任何天然存在的对应物。因此，本文公开的抗体是非天然存在的。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，抗体可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(另见Charlton，Methods in Molecular Biology，Vol.248(B.K.C.Lo，ed.，Humana Press，Totowa，N.J.，2003)，第245-254页，描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达后，抗体可从细菌细胞糊状物中以可溶性级分分离，并可进一步纯化。
除原核生物外，真核微生物例如丝状真菌或酵母也是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，包括糖基化途径已被“人源化”的真菌和酵母菌株，从而产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)，和Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，它们可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIES技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适应于悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。其他有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7)；人胚胎肾细胞系(如例如在Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977)中所述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(如例如在Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)所述；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括CHO细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。对于适合抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，Vol.248(B.K.C.Lo，ed.，Humana Press，Totowa，N.J.)，pp.255-268(2003)。
B.组合物和制剂
本发明的抗体，单独地或以与其他抗TBEV抗体的抗体混合物的形式，代表了一种极好的开发用于治疗人蜱传黄病毒(例如TBEV)感染的抗病毒疗法的方式。
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含与药学上可接受的载体一起配制的本文所述的本发明的抗体。该组合物可以任选地含有一种或多种另外的药物活性成分，例如另一种抗体或治疗剂。
在一些实施方案中，药物包含两种或更多种上文所述的抗体或其抗原结合片段，例如包含含有各自的本文所述的氨基酸序列的重链和轻链的抗体或其抗原结合片段的任何组合。
在一些实例中，每个抗体或其抗原结合片段均包含(i)选自表2A-I、3和4中的抗体的HCDR1-3和LCDR1-3，或(ii)包含选自表2A-I、3和4中的那些的抗体的各自的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。
本发明的药物组合物还可以在与例如另一种免疫刺激剂、抗病毒剂或疫苗等的联合治疗中施用。在一些实施方案中，组合物包含浓度为至少1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml、1-300mg/ml或100-300mg/ml的本发明抗体。
在一些实施方案中，第二治疗剂包括抗炎药或抗病毒化合物。在一些实施方案中，抗病毒化合物包括：核苷类似物、类肽、寡肽、多肽、蛋白酶抑制剂、3C样蛋白酶抑制剂、木瓜蛋白酶样蛋白酶抑制剂或RNA依赖性RNA聚合酶的抑制剂。在一些实施方案中，抗病毒化合物可包括：阿昔洛韦、更昔洛韦、阿糖腺苷、膦甲酸、西多福韦、金刚烷胺、利巴韦林、三氟胸苷、齐多夫定、去羟肌苷、扎西他滨或干扰素。在一些实施方案中，干扰素是干扰素-α或干扰素-β。
药物组合物在制备用于由蜱传黄病毒(例如，TBEV)引起的感染引起的疾病的诊断、预防、治疗或其组合的药物中的用途也在本公开的范围内。
药物组合物可包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、调味剂、包衣、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。合适赋形剂的选择和使用在以下文献中教导：Gennaro编，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版(LippincottWilliams & Wilkins 2003)，其公开内容通过引用并入本文。
优选地，药物组合物适合用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据给药途径，活性化合物可以包覆在材料中，以保护它免受酸和其他可能使其失活的自然条件的作用。如本文所用的短语“肠胃外施用”是指除经肠和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。或者，本文所述的本发明的抗体可以经由非肠胃外途径施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用。
本发明的药物组合物可以制成多种形式，包括片剂、硬或软明胶胶囊、水性溶液剂、混悬剂和脂质体以及其他缓释制剂，例如成型聚合物凝胶。可以配制口服剂型从而使抗体在通过胃以后释放到肠中。这样的制剂描述于美国专利号6,306,434以及其中包含的参考文献。
口服液体药物组合物可以是例如水性或油性混悬剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂或酏剂的形式，或者可以呈现为干燥产品以在使用前用水或其他合适的溶媒重构。这样的液体药物组合物可包含常规添加剂，例如悬浮剂、乳化剂、非水性溶媒(其可包括食用油)或防腐剂。
抗体可以配制用于肠胃外施用(例如，通过注射，例如推注或连续输注)，并且可以单位剂量形式与添加的防腐剂一起存在于安瓿、预装注射器、小体积输注容器或多剂量容器中。药物组合物可以采用诸如在油性或水性溶媒中的混悬剂、溶液剂或乳剂的形式，并且可以包含配制剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。适合用于直肠施用的药物组合物可制备成单位剂量栓剂。合适的载体包括盐水溶液和本领域常用的其他材料。
对于吸入施用，抗体可以方便地从吹入器、喷雾器或加压包装或其他方便的递送气雾喷雾的装置递送。加压包装可包含合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以递送经计量的量来确定。
或者，对于通过吸入或吹入施用，抗体可以采用干粉组合物的形式，例如调节剂和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。粉末组合物可以单位剂型存在于例如胶囊或药筒中，或者例如明胶或泡罩包装中，可以借助吸入器或吹入器从中施用粉末。对于鼻内施用，抗体可以经由液体喷雾，例如经由塑料瓶雾化器施用。
本发明的药物组合物还可以包含其他成分，例如调味剂、着色剂、抗微生物剂或防腐剂。应当理解，用于治疗所需的抗体量不仅会随着所选的特定载体而变化，而且会随着施用途径、所治疗病症的性质以及患者的年龄和状况而变化。最终，护理人员可以确定适当的剂量。此外，药物组合物可以配制为单一单位剂型。
本发明的药物组合物可以是无菌水性溶液或分散液的形式。它还可以配制成微乳剂、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。
本文所述的本发明的抗体可以作为持续释放制剂施用，在这种情况下需要较低频率的施用。剂量和频率的变化取决于抗体在患者体内的半衰期。一般来说，人抗体显示最长的半衰期，其次是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，在很长一段时间内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者在其余生中继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔给予相对高的剂量，直到疾病的进展减少或终止，并且优选地，直到患者表现出疾病症状的部分或完全改善。此后，可以对患者施用预防性方案。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的受试者和特定的施用方式而变化，并且通常是产生治疗性效果的组合物的量。通常，以100％计，该量的范围为约0.01％至约99％的活性成分，优选约0.1％至约70％，最优选约1％至约30％的活性成分，与药学上可接受的载体组合。
可以调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗性反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急情况按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物以易于施用和剂量均匀是特别有利的。本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有预定量的活性化合物，该预定量经过计算与所需的药物载体结合产生所需的治疗效果。或者，抗体可以作为持续释放制剂施用，在这种情况下需要较低频率的施用。对于抗体的施用，剂量范围为约0.0001至800mg/kg宿主体重，更通常为0.01至5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三个月一次或每三至六个月一次施用。本发明抗体的优选剂量方案包括经由静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，使用以下给药方案之一给予抗体：(i)每四周一次，共六个剂量，然后每三个月一次；(ii)每三周一次；(iii)一次3mg/kg体重，之后每三周1mg/kg体重。在一些方法中，调整剂量以达到约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，在一些方法中达到约25-300μg/ml。本发明抗体的“治疗有效剂量”优选导致降低疾病症状的严重程度、增加疾病无症状期的频率和持续时间、或预防因疾病折磨引起的损害或残疾。例如，为了治疗受试者的蜱传黄病毒(例如，TBEV)感染，“治疗有效剂量”优选相对于未治疗的受试者抑制宿主细胞的蜱传黄病毒(例如，TBEV)复制或摄取至少约20％，更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，并且仍然更优选至少约80％。治疗有效量的治疗性化合物可以中和蜱传黄病毒(例如，TBEV)，或以其他方式改善受试者的症状，受试者通常是人或可以是另一种哺乳动物。
药物组合物可以是控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。可使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
治疗性组合物可以经由医疗装置施用，例如(1)无针皮下注射装置(例如，US 5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；和4,596,556)；(2)微型输注泵(US 4,487,603)；(3)透皮装置(US 4,486,194)；(4)输注器具(US 4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透装置(US 4,439,196和4,475,196)；其公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，可以配制本文所述的人单克隆抗体以确保适当的体内分布。例如，为了确保本发明的治疗性化合物穿过血脑屏障，它们可以配制在脂质体中，脂质体可以另外包含靶向部分以增强向特定细胞或器官的选择性转运。参见，例如，US 4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；V.V.Ranade(1989)Clin.Pharmacol.29：685；Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038；Bloeman等人(1995)FEBSLett.357：140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180；Briscoe等人(1995)Am.Physiol.1233：134；Schreier等人(1994).Biol.Chem.269：9090；Keinanen和Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；以及Killion和Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
在一些实施方案中，初始剂量之后可以以可大致等于或小于初始剂量的量施用第二或多个后续剂量的抗体或其抗原结合片段，其中后续剂量间隔至少1天至3天；至少1周，至少2周；至少3周；至少4周；至少5周；至少6周；至少7周；至少8周；至少9周；至少10周；至少12周；或至少14周。
多种递送系统是已知的并且可用于施用本发明的药物组合物，例如，包封在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达突变体病毒的重组细胞、受体介导的内吞作用中(参见，例如，Wu等人(1987)J.Biol.Chem.262：4429-4432)。引入方法包括但不限于皮内、透皮、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。该组合物可以通过任何方便的途径施用，例如，通过输注或推注，通过上皮或粘膜皮肤内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。药物组合物也可以在囊泡特别是脂质体中递送(参见，例如，Langer(1990)Science 249：1527-1533)。
本文还考虑了使用纳米颗粒来递送本发明的抗体。抗体缀合的纳米颗粒可用于治疗性和诊断性应用。抗体缀合的纳米颗粒及其制备和使用方法详细描述在Arruebo，M.等人，2009(“Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications”，J.Nanomat.Volume 2009，文章ID 439389)，其通过引用并入本文。可以开发纳米颗粒并将其缀合到药物组合物中包含的抗体以靶向细胞。用于药物递送的纳米颗粒也已描述在例如US 8257740或US 8246995中，每一个均以其全文并入本文。
在某些情况下，药物组合物可以在控释系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料。在又一个实施方案中，可将控释系统放置在组合物的目标附近，因此仅需要全身剂量的一部分。
可注射制剂可包括用于静脉、皮下、皮内、颅内、腹腔内和肌内注射、滴注等的剂型。这些可注射制剂可以通过公众已知的方法制备。例如，可通过例如将上文所述的抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中来制备可注射制剂。作为注射用水性介质，例如有生理盐水、含有葡萄糖和其他助剂的等渗溶液等，其可以与适当的增溶剂例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如聚山梨酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等组合使用。作为油性介质，使用例如芝麻油、豆油等，其也可以与增溶剂如苯甲酸苄酯、苯甲醇等组合使用。如此制备的注射剂优选填充在合适的安瓿中。
本发明的药物组合物可以用标准针头和注射器皮下或静脉内递送。此外，关于皮下递送，笔式递送装置很容易用于递送本发明的药物组合物。这种笔式递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔式递送装置通常使用包含药物组合物的可更换药筒。一旦药筒内的所有药物组合物都已被施用并且药筒是空的，则可以容易地丢弃空药筒并用包含药物组合物的新药筒更换。然后可以重新使用笔式递送装置。在一次性笔式递送装置，没有可更换的药筒。相反，一次性笔式递送装置预填充有药物组合物，该药物组合物保存在装置内的储器中。一旦储器中的药物组合物被用空，整个装置就被丢弃。
许多可重复使用的笔和自动注射器递送装置可应用于皮下递送本发明的药物组合物。实例包括但当然不限于AUTOPENTM(Owen Mumford，Inc.，Woodstock，UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems，Burghdorf，瑞士)、HUMALOG MIX 75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lilly and Co.，Indianapolis，IN)、NOVOPENTMI、II和III(Novo Nordisk，Copenhagen，丹麦)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk，Copenhagen，丹麦)、BDTM笔(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)、OPTIPENTM、OPTIPENPROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(Sanofi-Aventis，Frankfurt，德国)，仅举几例。具有皮下递送本发明的药物组合物的应用的一次性笔式递送装置的实例包括但当然不限于SOLOSTARTM笔(Sanofi-Aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM Autoinjector(Amgen，Thousand Oaks，CA)、PENLETTM(Haselmeier，Stuttgart，德国)、EPIPEN(Dey，L.P.)以及HUMIRATM笔(Abbott Labs，Abbott Park，IL)，仅举几例。
有利地，将上文所述的用于口服或肠胃外用途的药物组合物制备成适合于活性成分剂量的单位剂量的剂型。这样的单位剂量的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿剂)、栓剂等。所含抗体的量通常为每个单位剂量的剂型约5至约500mg；特别是在注射剂形式中，优选含有约5至约300mg的抗体，而对于其他剂型，优选含有约10至约300mg的抗体。
C.使用方法
治疗方法
本文所述的抗体、组合物和制剂可用于中和蜱传黄病毒(例如TBEV)，从而治疗或预防由各种蜱传黄病毒(包括TBEV)引起的疾病或感染。
因此，在一个方面，本公开进一步提供了一种在受试者中中和蜱传黄病毒(例如，TBEV)的方法。该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的如上所述的抗体或其抗原结合片段或治疗有效量的如上所述的药物组合物。
另一方面，本公开还提供了预防或治疗蜱传黄病毒(例如，TBEV)感染的方法。该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的如上所述的抗体或其抗原结合片段或治疗有效量的如上所述的药物组合物。
例如，TBEV的中和可以经由以下来进行：(i)抑制TBEV与靶细胞的结合；(ii)抑制靶细胞摄取TBEV；(iii)抑制TBEV复制；以及(iv)抑制TBEV病毒颗粒从受感染细胞中释放。本领域技术人员具有进行任何测定以评估TBEV的中和的能力。
值得注意的是，可以通过多种测试来评估抗体的中和性质，这些测试都可以评估以下结果：(i)抑制TBEV与靶细胞的结合；(ii)抑制靶细胞摄取TBEV；(iii)抑制TBEV复制；以及(iv)抑制TBEV病毒颗粒从受感染细胞中释放。换句话说，实施不同的测试可能会导致观察到相同的结果，即TBEV的传染性丧失。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种中和受试者的TBEV的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的本发明的抗体。
本发明的另一个方面提供了一种治疗蜱传黄病毒(例如，TBEV)相关疾病的方法。此类方法包括治疗(例如，在TBEV感染之后)和预防(例如，在TBEV暴露、感染或病理之前)。例如，治疗个体的TBEV感染的治疗性和预防性方法包括治疗患有或处于患有TBEV感染或病状的风险中的个体、治疗患有TBEV感染的个体以及保护个体免受TBEV感染的方法，以减少或降低个体的TBEV感染的可能性，降低或减少个体对TBEV感染的易感性，或抑制或预防个体的TBEV感染，以及降低、减少、抑制或遏制TBEV从受感染的个体传播到未感染的个体。此类方法包括施用本发明的抗体或包含本文公开的抗体的组合物以治疗性或预防性地治疗(接种疫苗或免疫)患有或处于患有TBEV感染或病理的风险中的个体。因此，方法可以治疗TBEV感染或病理，或为个体提供保护免受感染(例如，预防性保护)。
在一个实施方案中，治疗蜱传黄病毒(例如，TBEV)相关疾病的方法包括以足以减轻与蜱传黄病毒(例如，TBEV)感染或病理相关的一种或多种生理病况或症状的量向有此需要的个体施用本文公开的抗体或治疗性组合物，从而治疗与蜱传黄病毒(例如，TBEV)相关的疾病。
在一个实施方案中，本文公开的抗体或治疗性组合物用于治疗蜱传黄病毒(例如，TBEV)相关疾病。在一些实施方案中，使用本文公开的抗体或治疗性组合物通过减少与TBEV感染或病理相关的一种或多种生理病况或症状来治疗TBEV相关疾病。在该实施方案的方面，以足以减少与TBEV感染或病理相关的一种或多种生理病况或症状的量施用本文公开的抗体或治疗性组合物，从而治疗基于TBEV的疾病。在该实施方案的其他方面，以一定量施用本文公开的抗体或治疗性组合物，所述量足以增加、诱导、增强、加强、促进或刺激TBEV清除或去除；或减少、降低、抑制、遏制、预防、控制或限制TBEV向另一个个体的传播。
与蜱传黄病毒(例如，TBEV)感染或病理相关的一种或多种生理病况或症状将对本文公开的治疗方法产生反应。蜱传黄病毒(例如，TBEV)感染或病理的症状根据感染阶段而变化。
在一些实施方案中，中和受试者中的蜱传黄病毒(例如，TBEV)的方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的如上所述的抗体或抗原结合片段的第一抗体或其抗原结合片段和第二抗体或其抗原结合片段，其中第一抗体或其抗原结合片段和第二抗体或其抗原结合片段表现出协同活性或治疗有效量的上文所述的药物组合物。
在一些实施方案中，预防或治疗蜱传黄病毒(例如，TBEV)感染的方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的如上文所述的抗体或其抗原结合片段的第一抗体或其抗原结合片段和第二抗体或其抗原结合片段，其中第一抗体或其抗原结合片段和第二抗体或其抗原结合片段表现出协同活性或治疗有效量的上文所述的药物组合物。在一些实施方案中，第一抗体或其抗原结合片段在第二抗体或其抗原结合片段之前、之后或同时施用。
在一些实施方案中，第一抗体或其抗原结合片段和第二抗体或其抗原结合片段可以是包含重链和轻链的抗体或其抗原结合片段的任何组合，所述重链和轻链包含本文所述的各自的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第二治疗剂包括抗炎药或抗病毒化合物。在一些实施方案中，抗病毒化合物包括：核苷类似物、类肽、寡肽、多肽、蛋白酶抑制剂、3C样蛋白酶抑制剂、木瓜蛋白酶样蛋白酶抑制剂或RNA依赖性RNA聚合酶的抑制剂。在一些实施方案中，抗病毒化合物可包括：阿昔洛韦、更昔洛韦、阿糖腺苷、膦甲酸、西多福韦、金刚烷胺、利巴韦林、三氟胸苷、齐多夫定、去羟肌苷、扎西他滨或干扰素。在一些实施方案中，干扰素是干扰素-α或干扰素-β。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段在第二治疗剂或疗法之前、之后或同时施用。在一些实施方案中，将抗体或其抗原结合片段静脉内、皮下或腹膜内施用于受试者。在一些实施方案中，预防性或治疗性地施用抗体或其抗原结合片段。
本文所述的抗体可与一种或多种其他抗TBEV病毒抗体一起使用以中和蜱传黄病毒(例如，TBEV)，从而治疗蜱传黄病毒(例如，TBEV)感染。
组合疗法
组合疗法可包括如上所述的抗TBEV抗体和任何可有利地与如上所述的抗体或抗体的生物活性片段组合的另外的治疗剂。抗体可以与一种或多种用于治疗与病毒感染如蜱传黄病毒(例如，TBEV)感染相关的疾病或病症的药物或疗法协同组合。在一些实施方案中，本发明的抗体可以与第二治疗剂组合以改善所述疾病的一种或多种症状。在一些实施方案中，抗体可以与第二抗体组合以在改善所述疾病的一种或多种症状方面提供协同活性。在一些实施方案中，第一抗体或其抗原结合片段在第二抗体或其抗原结合片段之前、之后或同时施用。
例如，本文所述的抗体可用于各种检测方法，以用于例如监测蜱传黄病毒(例如，TBEV)感染的进展；监测患者对此类感染的治疗的反应等。
在一些实施方案中，第二治疗剂是另一种针对蜱传黄病毒(例如，TBEV)蛋白或其片段的抗体。本文考虑到使用具有针对蜱传黄病毒(例如，TBEV)的广谱中和或抑制活性的抗体的组合(“混合物(cocktail)”)。在一些实施方案中，可以组合非竞争性抗体并施用于有此需要的受试者。在一些实施方案中，包含该组合的抗体结合蛋白上不同的非重叠表位。在一些实施方案中，第二抗体可在人血清中具有更长的半衰期。
如本文所用，术语“与……组合”是指可以在施用本发明的抗TBEV抗体之前、同时或之后施用另外的治疗活性组分。术语“与……组合”还包括顺序或同时施用抗TBEV抗体和第二治疗剂。
可在施用本发明的抗TBEV抗体之前将另外的治疗活性组分施用至受试者。例如，如果第一组分在第二组分施用之前1周、之前72小时、之前60小时、之前48小时、之前36小时、之前24小时、之前12小时、之前6小时、之前5小时、之前4小时、之前3小时、之前2小时、之前1小时、之前30分钟、之前15分钟、之前10分钟、之前5分钟或之前不到1分钟，则第一组分可被视为在第二组分“之前”施用。在其他实施方案中，可以在施用本发明的抗TBEV抗体之后将另外的治疗活性组分施用于受试者。例如，如果第一组分在第二组分施用之后1分钟、之后5分钟、之后10分钟、之后15分钟、之后30分钟、之后1小时、之后2小时、之后3小时、之后4小时、之后5小时、之后6小时、之后12小时、之后24小时、之后36小时、之后48小时、之后60小时、之后72小时施用，则第一组分可被视为在第二组分“之后”施用。在其他实施方案中，可以在施用本发明的抗TBEV抗体的同时将另外的治疗活性组分施用于受试者。出于本发明的目的，“同时”施用包括例如在约30分钟或更短的时间内以单一剂型或单独的剂型向受试者施用抗TBEV抗体和另外的治疗活性组分。如果以单独的剂型施用，每个剂型可以经由相同的途径施用(例如，抗TBEV抗体和另外的治疗活性组分可以静脉内施用等)；或者，每种剂型可以经由不同的途径施用(例如，可以静脉内施用抗TBEV抗体，并且可以口服施用另外的治疗活性组分)。在任何情况下，出于本公开的目的，以单一剂型、以通过相同途径的单独剂型或以通过不同途径的单独剂型施用组分都被认为是“同时施用”。出于本公开的目的，在施用另外的治疗活性成分“之前”、“同时”或“之后”(如上文所定义的那些术语)施用抗TBEV抗体被认为是与另外的治疗活性组分“组合”施用抗TBEV抗体。
本发明包括药物组合物，其中本发明的抗TBEV抗体与一种或多种如本文别处所述的另外的治疗活性组分共同配制。
施用方案
根据某些实施方案，可将单剂量的如上所述的抗TBEV抗体(或包含抗TBEV抗体和任何本文提及的另外的治疗活性剂的组合的药物组合物)施用于有此需要的受试者。根据本发明的某些实施方案，可在规定的时间进程内将多剂量的抗TBEV抗体(或包含抗TBEV抗体和任何本文提及的另外的治疗活性剂的组合的药物组合物)施用于受试者。根据本发明该方面的方法包括向受试者顺序施用多剂量的抗TBEV抗体。如本文所用，“顺序施用”意为在不同的时间点，例如，在以预定间隔(例如，小时、天、周或月)隔开的不同日期，将每个剂量的抗TBEV抗体施用于受试者。本公开提供的方法包括向患者顺序施用单次初始剂量的抗TBEV抗体，随后施用一次或多次第二剂量的抗TBEV抗体，并且任选地随后施用一次或多次第三剂量的抗TBEV抗体。
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”是指施用本发明的抗TBEV抗体的时间顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量(也称为“基线剂量”)；“第二剂量”是指在初始剂量之后施用的剂量；“第三剂量”是在第二剂量之后施用的剂量。初始剂量、第二剂量和第三剂量可能都含有相同量的抗TBEV抗体，但通常在施用频率方面可能彼此不同。然而，在一些实施方案中，初始剂量、第二剂量和/或第三剂量中包含的抗TBEV抗体的量在治疗过程期间彼此不同(例如，适当时向上或向下调整)。在一些实施方案中，两个或更多个(例如，2、3、4或5)剂量在治疗方案开始时作为“负荷剂量”施用，随后是基于较低频率施用的后续剂量(例如，“维持剂量”)。
在本发明的某些示例性实施方案中，在前一剂量之后1至48小时(例如，1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2或更长时间)施用每个第二和/或第三剂量。如本文所用，短语“前一剂量”意为在多次施用的顺序中，在按照该顺序中的下一个剂量(没有中间剂量)施用之前施用于患者的抗TBEV抗体的剂量。
根据本发明的该方面的方法可以包括向患者施用任何数量的第二和/或第三剂量的抗TBEV抗体。例如，在一些实施方案中，仅向患者施用单次第二剂量。在其他实施方案中，向患者施用两次或更多次(例如，2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次或更多次)第二剂量。同样地，在一些实施方案中，仅向患者施用单次第三剂量。在其他实施方案中，向患者施用两次或更多次(例如，2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次或更多次)第三剂量。
在本发明的一些实施方案中，向患者施用第二和/或第三剂量的频率可以在治疗方案的过程中变化。在治疗过程期间也可以由医生根据临床检查后个体患者的需要来调整施用频率。
抗体的诊断用途
所公开的抗TBEV抗体可用于检测和/或测量样品中的蜱传黄病毒(例如，TBEV)，例如用于诊断目的。一些实施方案考虑了本发明的一种或多种抗体在检测蜱传黄病毒(例如，TBEV)相关疾病或病症的测定中的用途。示例性TBEV诊断测定可以包括，例如，将从患者获得的样品与抗TBEV抗体接触，其中抗TBEV抗体用可检测标记或报告分子标记或用作捕获配体以选择性地从患者样品分离TBEV。或者，未标记的抗TBEV抗体可与本身带有可检测标记的二抗组合用于诊断应用。可检测标记或报告分子可以是放射性同位素，例如H、C、P、S或I；荧光或化学发光部分，例如异硫氰酸荧光素或罗丹明；或诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶等酶。可用于检测或测量样品中蜱传黄病毒(例如，TBEV)的具体示例性测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光活化细胞分选(FACS)。
在另一个方面，本公开还提供了一种用于检测样品中蜱传黄病毒(例如，TBEV)的存在的方法，包括以下步骤：(i)将样品与上文所述的抗体或其抗原结合片段接触；以及(ii)确定抗体或抗原结合片段与一种或多种蜱传黄病毒(例如，TBEV)抗原的结合，其中抗体与该一种或多种蜱传黄病毒(例如，TBEV)抗原的结合指示样品中存在蜱传黄病毒(例如，TBEV)。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段缀合至标记。在一些实施方案中，检测步骤包括使二抗与抗体或其抗原结合片段接触，并且其中二抗包含标记。在一些实施方案中，标记包括荧光标记、化学发光标记、放射性标记和酶。
在一些实施方案中，检测步骤包括检测荧光或化学发光。在一些实施方案中，检测步骤包括竞争性结合测定或ELISA。
在一些实施方案中，该方法还包括将样品结合到固体支持物上。在一些实施方案中，固体支持物包括微粒、微珠、磁珠和亲和纯化柱。
可用于蜱传黄病毒(例如，TBEV)诊断测定的样品包括在正常或病理状况下，可从患者获得的任何组织或液体样品，其含有可检测量的蜱传黄病毒(例如，TBEV)蛋白或其片段。通常，将测量从健康患者(例如，未患有与蜱传黄病毒(例如，TBEV)相关的疾病)获得的特定样品中的TBEV蛋白水平，以初步建立蜱传黄病毒(例如TBEV)的基线或标准水平。然后可以将蜱传黄病毒(例如，TBEV)的基线水平与从怀疑患有蜱传黄病毒(例如，TBEV)相关病况或与此类病况相关的症状的个体获得的样品中测量的蜱传黄病毒(例如，TBEV)水平进行比较。
对蜱传黄病毒(例如，TBEV)蛋白特异的抗体可以不包含另外的标记或部分，或者它们可以包含N-末端或C-末端标记或部分。在一个实施方案中，标记或部分是生物素。在结合测定中，标记(如果有的话)的位置可以确定肽相对于结合肽的表面的方向。例如，如果表面涂有抗生物素蛋白，则含有N-末端生物素的肽将定向为使肽的C-末端部分远离表面。
D.试剂盒
在另一个方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含药学上可接受的剂量单位的如上所述的抗体或其抗原结合片段或如上所述的药物组合物。用于诊断、预后或监测受试者的蜱传黄病毒(例如，TBEV)相关感染或疾病的治疗的试剂盒也在本公开的范围内，所述试剂盒包含：如上所述的抗体或其抗原结合片段；和至少一种特异性结合所述抗体或其抗原结合片段的检测试剂。
在一些实施方案中，试剂盒还包括容器，该容器包含组合物和任选的信息材料。信息材料可以是描述性的、指导性的、市场营销的或其他与本文所述的方法和/或药剂用于治疗益处的用途相关的材料。在一个实施方案中，试剂盒还包括如上所述的另外的治疗剂。例如，试剂盒包括含有组合物的第一容器和用于另外的治疗剂的第二容器。
试剂盒的信息材料的形式不受限。在一些实施方案中，信息材料可以包括关于组合物的生产、浓度、有效期、批次或生产地点信息等的信息。在一个实施方案中，信息材料涉及施用组合物的方法，例如，以合适的剂量、剂型或施用方式(例如，本文所述的剂量、剂型或施用方式)，以治疗有此需要的受试者。在一个实施方案中，说明书提供组合物或另外的治疗剂的给药方案、给药安排和/或施用途径。信息可以多种格式提供，包括印刷文本、计算机可读材料、视频记录或音频记录，或包含指向实质性材料的链接或地址的信息。
试剂盒可以包括一个或多个用于组合物的容器。在一些实施方案中，试剂盒包含用于组合物和信息材料的单独容器、分隔物或隔室。例如，组合物可以装在瓶子或小瓶中，并且信息材料可以装在塑料套筒或小包中。在其他实施方案中，试剂盒的单独元件包含在单个未分隔的容器内。例如，组合物包含在瓶子或小瓶中，所述瓶子或小瓶附有标签形式的信息材料。在一些实施方案中，试剂盒包括多个(例如，一包)个体容器，每个容器含有一个或多个单位剂型(例如，本文所述的剂型)的药剂。
试剂盒任选地包括适合用于施用组合物的装置或其他合适的递送装置。该装置可以预加载一种或两种药剂，或者可以是空的，但适合用于加载。这样的试剂盒可以任选地包含注射器以允许将包含在试剂盒内的抗体注射到动物例如人中。
E.定义
为了帮助理解根据本公开的组合物和方法的详细描述，提供了一些明确的定义以促进明确公开本公开的各个方面。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。
本文提及的术语“抗体”包括完全抗体及其任何抗原结合片段或单链。完全抗体是糖蛋白，其包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，散布着更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链可变区CDR和FR是HFR1、HCDR1、HFR2、HCDR2、HFR3、HCDR3、HFR4。轻链可变区CDR和FR是LFR1、LCDR1、LFR2、LCDR2、LFR3、LCDR3、LFR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(CIq)。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段或部分”(或简称为“抗体片段或部分”)是指保留特异性结合抗原的能力的一个或多个抗体片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。术语抗体的“抗原结合片段或部分”中包含的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHI结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，一种二价片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段；(iii)Fab′片段，其本质上是具有部分铰链区的Fab(参见FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul编，第3版，1993))；(iv)由VH和CHI结构域组成的Fd片段；(v)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(vi)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH结构域组成；(vii)分离的CDR；以及(viii)纳米体，一种包含单个可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但可以使用重组方法通过合成接头连接它们，使它们能够制成单个蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv或scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science 242：423-426；以及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883))。此类单链抗体也旨在被包含在术语抗体的“抗原结合片段或部分”内。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。
如本文所用，“分离的抗体”旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单个分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区都源自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也是源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”旨在不包括其中源自另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已被接枝到人框架序列上的抗体。
术语“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性的抗体，其具有可变区，其中框架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，人单克隆抗体可以通过杂交瘤产生，该杂交瘤包括从转基因非人动物例如转基因小鼠获得的B细胞，其具有与永生化细胞融合的包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
如本文所用，术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如(a)从针对人免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物(例如，小鼠)或由其制备的杂交瘤(下文进一步描述)分离的抗体，(b)从转化为表达人抗体的宿主细胞中分离的抗体，例如，从转染瘤中分离的抗体，(c)从重组的组合人抗体库中分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有可变区，其中框架区和CDR区源自人种系免疫球蛋白序列。然而，在一些实施方案中，可以对此类重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用针对人Ig序列转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列重组抗体是虽然源自人种系VH和VL序列并与人种系VH和VL序列相关，但可能不是天然存在于体内人抗体种系库内的序列。
术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或IgG1)。短语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性抗体”在本文中可与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何修饰形式，例如抗体与另一种剂或抗体的缀合物。术语“人源化抗体”意在是指这样的抗体，其中源自另一种哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列已被接枝到人框架序列上。可以在人框架序列内进行另外的框架区修饰。
术语“嵌合抗体”旨在指其中可变区序列源自一个物种而恒定区序列源自另一物种的抗体，例如其中可变区序列源自小鼠抗体而恒定区序列源自人抗体的抗体。该术语还可以是指一种抗体，其中其可变区序列或CDR源自一个来源(例如，IgA1抗体)，而恒定区序列或Fc源自不同的来源(例如，不同的抗体，如IgG、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体)。
本发明包括分离的或基本上纯化的核酸、肽、多肽或蛋白。在本发明的上下文中，“分离的”核酸、DNA或RNA分子或“分离的”多肽是脱离其天然环境而存在并因此不是自然的产物的核酸、DNA分子、RNA分子或多肽。分离的核酸、DNA分子、RNA分子或多肽可以以纯化形式存在或可以存在于非天然环境中，例如转基因宿主细胞。“纯化的”核酸分子、肽、多肽或蛋白或其片段在通过重组技术生产时基本上不含其他细胞材料或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。在一个实施方案中，“分离的”核酸不含在该核酸所源自的生物体的基因组DNA中天然侧接该核酸的序列(即，位于该核酸的5′和3′端的序列)。例如，在多种实施方案中，分离的核酸分子可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，该核苷酸序列天然侧接该核酸所源自的细胞的基因组DNA中的核酸分子。基本上不含细胞材料的蛋白、肽或多肽包括具有少于约30％、20％、10％或5％(按干重计)的污染蛋白的蛋白、肽或多肽的制剂。当重组生产本发明的蛋白或其生物活性部分时，优选培养基代表小于约30％、20％、10％或5％(按干重计)的化学前体或非目标蛋白化学品。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还包括已经过修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、聚乙二醇化或任何其他操作，例如与标记组分的缀合。如本文所用，术语“氨基酸”包括天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸和D或L旋光异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。
如本文所用的肽或多肽“片段”是指小于全长的肽、多肽或蛋白。例如，肽或多肽片段可具有至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约10个、至少约20个、至少约30个、至少约40个氨基酸长度，或其单个单位长度。例如，片段的长度可以是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或更多个氨基酸。肽片段的大小没有上限。然而，在一些实施方案中，肽片段的长度可以少于约500个氨基酸、少于约400个氨基酸、少于约300个氨基酸或少于约250个氨基酸。优选地，当用于接种动物时，肽片段可以引发免疫应答。肽片段可用于通过用与佐剂组合的肽片段、偶联至佐剂的肽片段或偶联至对氨基苯胂酸、对氨基苯磺酸、乙酰基或苦基的肽片段接种动物来激发免疫应答。肽片段可以包括非酰胺键并且可以是肽模拟物。
如本文所用，如本文所用的术语“缀合物(conjugate)”或“缀合(conjugation)”或“连接”是指两个或多个实体连接形成一个实体。缀合物包括肽-小分子缀合物以及肽-蛋白/肽缀合物。
如本文所用，术语“重组”是指通过本领域已知作为重组DNA技术的技术或方法产生、表达、分离或获得的本发明的抗体或其抗原结合片段，所述技术或方法包括例如DNA剪接和转基因表达。该术语是指在非人类哺乳动物(包括转基因非人类哺乳动物，例如转基因小鼠)或细胞(例如CHO细胞)表达系统中表达或从重组组合人类抗体文库中分离的抗体。
“核酸”或“多核苷酸”是指DNA分子(例如但不限于cDNA或基因组DNA)或RNA分子(例如但不限于mRNA)，包括DNA或RNA类似物。可以从核苷酸类似物合成DNA或RNA类似物。DNA或RNA分子可包括非天然存在的部分，例如修饰的碱基、修饰的主链、RNA中的脱氧核糖核苷酸等。核酸分子可以是单链或双链的。
当提及核酸或其片段时，术语“基本的同一性”或“基本上相同的”表示当与另一核酸(或其互补链)进行适当的核苷酸插入或缺失最佳比对时，核苷酸序列在至少约90％、更优选至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中具有同一性，如通过任何众所周知的序列同一性算法测量的，例如FASTA、BLAST或GAP，如下所述的。在某些情况下，与参考核酸分子具有基本的同一性的核酸分子可以编码具有与参考核酸分子编码的多肽相同或基本上相似的氨基酸序列的多肽。
当应用于多肽时，术语“基本的相似性”或“基本上相似的”是指两个肽序列，当最佳比对时，例如通过使用默认空位权重的程序GAP或BESTFIT，具有至少90％的序列同一性，甚至更优选至少95％、98％或99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被具有相似的化学性质(例如，电荷或疏水性)的具有侧链(R基团)的另一个氨基酸残基取代的取代。一般来说，保守氨基酸取代不会显著改变蛋白的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，可以向上调整相似性的百分比或程度以校正取代的保守性质。进行这种调整的方法是本领域技术人员所熟知的。参见，例如，Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331，其通过引用并入本文。具有相似化学性质的具有侧链的氨基酸组的实例包括：1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，和7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守替换是在以下文献中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化：Gonnet等人，(1992)Science256：1443 45，其通过引用并入本文。“适度保守”替换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
通常使用序列分析软件来测量多肽的序列相似性。蛋白分析软件使用分配给各种取代、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸取代)的相似性度量来匹配相似序列。例如，GCG软件包含GAP和BESTFIT等程序，这些程序可以采用默认参数来确定密切相关的多肽之间例如来自不同生物物种的同源多肽或野生型蛋白和其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如，GCG版本6.1。也可以使用具有默认或推荐参数的FASTA比较多肽序列；GCG版本6.1中的程序FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)，同上)。将本发明的序列与包含来自不同生物的大量序列的数据库进行比较时，另一种优选算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。参见，例如，Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410和(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402，每一篇都通过引用并入本文。
如本文所用，术语“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指固有结合亲和力，其反映结合对(例如，抗体和抗原)成员之间的1∶1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示。可通过本领域已知的常用方法，包括本文所述的那些方法，来测量亲和力。
术语“特异性结合”或“与……特异性结合”等指例如在生理条件下与单个表位结合但不与多于一个表位结合的抗体。因此，与多肽特异性结合的抗体将与存在于该多肽上但不存在于其他多肽上的表位结合。特异性结合的特征在于平衡解离常数为至少约1x10-8M或更小(例如，KD越小表示结合越紧密)。确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域熟知的并且包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。
例如，抗体以“高亲和力”与表位结合，即KD为1x 10-7M或更小，更优选5x 10-8或更小，更优选3x 10-8M或更小，更优选1x 10-8M或更小，更优选5x 10-9M或更小或甚至更优选1x10-9M或更小，如通过表面等离子共振例如BIACORE测定的。如本文所用，术语“基本上不结合”蛋白或细胞是指不结合或不以高亲和力结合蛋白或细胞，即以1x 10-6M或更大、更优选1x 10-5M或更大、更优选1x 10-4M或更大、更优选1x 10-3M或更大、甚至更优选1x 10-2M或更大的KD结合蛋白或细胞。
如本文所用，术语“Kassoc”或“Ka”旨在指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而如本文所用，术语“Kdis”或“Kd”旨在指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用，术语“KD”旨在指解离常数，其获自Kd与Ka的比率(即，Kd/Ka)并表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以使用本领域公认的方法来确定。确定抗体KD的优选方法是通过使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统，例如BIACORE系统。
“与另一种抗体竞争结合靶标”的抗体是指抑制(部分或完全)另一种抗体与靶标的结合的抗体。两种抗体是否相互竞争以结合靶标，即一种抗体是否以及在何种程度上抑制另一种抗体与靶标的结合，可以使用已知的竞争实验来确定。在一些实施方案中，一种抗体与另一种抗体竞争并抑制另一种抗体与靶标的结合至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。抑制或竞争水平可能会有所不同，取决于哪种抗体是“封闭抗体”(即首先与靶标孵育的冷抗体)。竞争测定可以如例如以下文献中所述的进行：EdHarlow和David Lane，Cold Spring Harb Protoc；2006或“Using Antibodies”中第11章，Ed Harlow和David Lane编，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，USA 1999。竞争抗体结合相同的表位、重叠的表位或相邻的表位(例如，如空间位阻所证明的)。其他竞争性结合测定包括：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见Stahli等人，Methods in Enzymology 9：242(1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Kirkland等人，J.Immunol.137：3614(1986))；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见Harlow和Lane，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press(1988))；使用1-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等人，Mol.Immunol.25(1)：7(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人，Virology 176：546(1990))；以及直接标记RIA。(Moldenhauer等人，Scand.J.Immunol.32：77(1990))。
如本文所用，术语“表位”是指与称为互补位的抗体分子的可变区中的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可具有多于一个表位。因此，不同的抗体可能结合抗原上的不同区域，并可能具有不同的生物学作用。术语“表位”还指抗原上B和/或T细胞响应的位点。它还指被抗体结合的抗原区域。表位可以定义为结构或功能的。功能表位通常是结构表位的一个子集，并且具有直接有助于相互作用的亲和力的那些残基。表位也可以是构象的，即由非线性氨基酸组成。在一些实施方案中，表位可以包括决定簇，这些决定簇是分子的化学活性表面组群，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在一些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位通常包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个独特空间构象的氨基酸。确定给定抗体结合什么表位(即表位作图)的方法是本领域众所周知的。确定表位空间构象的方法包括本领域的技术和本文所述的那些技术，例如，X射线晶体学和二维核磁共振(参见，例如，Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology，Vol.66，G.E.Morris，Ed.(1996))。
术语“表位作图”是指鉴定抗体-抗原识别的分子决定簇的过程。
与抗体或抗体片段相关的术语“结合表位”或“识别表位”是指抗原内连续或不连续的氨基酸区段。本领域技术人员理解这些术语不一定意味着抗体或抗体片段与表位序列内的每个氨基酸都直接接触。
与两种或更多种抗体相关的术语“结合相同的表位”意指抗体结合相同的、重叠的或包含连续或不连续的氨基酸区段。本领域技术人员理解短语“结合相同的表位”并不一定意味着抗体结合或接触完全相同的氨基酸。抗体接触的精确氨基酸可能不同。例如，第一抗体可以结合完全被第二抗体结合的氨基酸区段所包含的氨基酸区段。在另一个实例中，第一抗体结合与第二抗体结合的一个或多个区段显著重叠的一个或多个氨基酸区段。出于本文的目的，此类抗体被认为“结合相同的表位”。
如本文所用，术语“免疫应答”是指脊椎动物体内针对外来物质的生物学反应，该反应保护生物体免受这些物质和由它们引起的疾病。免疫应答由免疫系统的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞或中性粒细胞)和由这些细胞中的任何一种或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用介导，所述作用导致选择性靶向、结合、损害、破坏和/或从脊椎动物体内消除入侵病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或其他异常细胞，或者在自身免疫或病理性炎症的情况下，正常人体细胞或组织。免疫应答包括例如激活或抑制T细胞，例如效应T细胞或Th细胞，例如CD4+或CD8+T细胞，或抑制Treg细胞。
本文所用的术语“可检测标记”是指能够检测的分子，包括但不限于放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、生色团、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、生色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体(例如生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或半抗原)、嵌入染料等。术语“荧光剂”是指能够在可检测范围内显示荧光的物质或其一部分。
在许多实施方案中，术语“受试者”和“患者”可互换使用，而不管受试者是否已经或目前正在接受任何形式的治疗。如本文所用，术语“受试者”可指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠、非人灵长类动物(例如猴子，如猕猴、黑猩猩等)和人)。受试者可以是人或非人。在更多示例性方面，哺乳动物是人。如本文所用，表述“有此需要的受试者”或“有此需要的患者”是指表现出一种或多种病症(例如，神经元病症、自身免疫性疾病和心血管疾病)的症状或适应症的人或非人哺乳动物和/或被诊断患有炎症性疾病的人或非人哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。
如本文所用，术语“疾病”通常与术语“病症”和“病况”(如在医学病况中)同义并可互换使用，因为它们都反映人体或动物体或其部位之一的异常状况(例如，炎性病症)，其损害正常功能，通常表现为可区分的体征和症状，并导致人或动物的生命持续时间或质量下降。
如本文所用，术语“治疗”任何疾病或病症在一个实施方案中是指改善该疾病或病症(即，阻止或减少该疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个实施方案中，“治疗”是指改善至少一种身体参数，其可能不会被患者察觉。在又一个实施方案中，“治疗”是指调节疾病或病症，无论是身体上的(例如，可辨别症状的稳定)、生理上的(例如，身体参数的稳定)，还是两者兼而有之。在又一个实施方案中，“治疗”是指预防或延迟疾病或病症的发作或发展或进展。
术语“预防”、“预防性治疗”等是指降低受试者发展出病症或病况的可能性，该受试者没有发展出病症或病况，但具有风险或易发展出病症或病况。
本文使用的术语“减少”、“降低”或“抑制”通常是指减少达到统计显著量。然而，为避免疑义，“减少”、“降低”或“抑制”是指与参考水平相比减少了至少10％，例如减少了至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％，或高达且包括100％的减少(例如，与参考样品的水平相比不存在)，或与参考水平相比10-100％之间的任何减少。
如本文所用，术语“剂”表示化合物、化合物的混合物、生物大分子(例如核酸、抗体、蛋白或其部分，例如肽)，或由以下生物材料制成的提取物，例如细菌、植物、真菌或动物(尤其是哺乳动物)的细胞或组织。此类剂的活性可能使其适合作为“治疗剂”，其是在受试者中局部或全身起作用的生物学、生理学或药理学活性物质(或多种物质)。
如本文所用，术语“治疗剂”或“具有治疗能力的剂”可互换使用，并且是指在施用于受试者后赋予某些有益效果的分子或化合物。有益效果包括能够进行诊断确定；疾病、症状、病症或病理状况的改善；减少或预防疾病、症状、病症或病况的发作；并且通常抵消疾病、症状、病症或病理状况。
术语“治疗作用”是本领域公认的并且是指在动物、特别是哺乳动物、更特别是人中由药理活性物质引起的局部或全身作用。
术语“有效量”或“有效剂量”被定义为足以达到或至少部分达到所需效果的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是该药物在单独使用或与另一种治疗剂联合使用时促进疾病消退的任何量，疾病消退通过疾病症状严重程度的减轻、无疾病症状期的频率和持续时间的增加，或预防因疾病折磨而导致的损伤或残疾来证明。药物的“预防有效量”或“预防有效剂量”是药物在单独施用或与另一种治疗剂组合施用于有发展出疾病或患有疾病复发的风险的受试者时抑制疾病的发展或复发的量。治疗剂或预防剂促进疾病消退或抑制疾病发展或复发的能力可以使用技术人员已知的各种方法进行评价，例如在临床试验期间的人类受试者中，在动物模型系统中预测在人体中的功效，或通过在体外测定中测定该剂的活性。
剂量通常关于体重来表示。因此，表示为[g、mg或其他单位]/kg(或g、mg等)的剂量通常是指“每kg(或g、mg等)体重”的[g、mg或其他单位]，即使没有明确提及术语“体重”。
如本文所用，术语“组合物”或“药物组合物”是指至少一种可用于本发明内的组分与其他组分例如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、增稠剂和/或赋形剂的混合物。药物组合物有助于将本发明的一种或多种组分施用于生物体。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指不破坏组合物的生物活性或性质并且相对无毒的材料，例如载体或稀释剂，即，该材料可以施用至个体而不会引起不良的生物学效应或以有害方式与包含它的组合物的任何组分相互作用。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括参与在受试者体内携带或运输本发明的化合物或将本发明的化合物携带或运输到受试者以使其发挥其预期功能的药学上可接受的盐、药学上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。通常，将此类化合物从一个器官或身体的一部分携带或运输到另一个器官或身体的另一部分。每种盐或载体在与制剂的其他成分相容并且对受试者无害的意义上必须是“可接受的”。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，例如丙二醇；多元醇类，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；稀释剂；造粒剂；润滑剂；粘合剂；崩解剂；润湿剂；乳化剂；着色剂；释放剂；包衣剂；甜味剂；调味剂；芳香剂；防腐剂；抗氧化剂；增塑剂；胶凝剂；增稠剂；硬化剂；凝固剂；悬浮剂；表面活性剂；保湿剂；载体；稳定剂；和药物制剂中使用的其他无毒相容物质，或其任何组合。如本文所用，“药学上可接受的载体”还包括与本发明的一种或多种组分的活性相容并且对受试者是生理上可接受的任何和所有包衣、抗细菌剂和抗真菌剂以及吸收延迟剂等。补充的活性化合物也可以掺入组合物中。
如本文所用，除非上下文另有明确规定，否则“联合”疗法意指包括以协调的方式施用两种或更多种治疗剂，并且包括但不限于同时给药。具体而言，联合疗法包括共同施用(例如联合制剂的施用或单独治疗组合物的同时施用)和系列或相继施用，条件是一种治疗剂的施用以某种方式以另一种治疗剂的施用为条件。例如，一种治疗剂可以仅在不同的治疗剂已经被施用并且允许作用规定的时间段之后才被施用。参见，例如，Kohrt等人(2011)Blood 117：2423。
如本文所用，术语“共同施用”是指将至少两种剂或疗法施用至受试者。在一些实施方案中，两种或更多种剂/疗法的共同施用是同时进行的。在其他实施方案中，第一剂/疗法在第二剂/疗法之前施用。本领域技术人员理解所使用的各种剂/疗法的制剂和/或施用途径可以变化。
如本文所用，术语“接触”，当关于任何组分集使用时，包括将要接触的组分混合到相同混合物中(例如，添加到相同隔室或溶液中)，并且不一定需要所引用的组分之间的实际物理接触的任何过程。列举的组分可以以任何顺序或任何组合(或子组合)接触并且可以包括以下情况：随后从混合物中除去所列举的组分中的一种或一些，任选地在添加其他列举的组分之前。例如，“A与B和C接触”包括以下情况中的任何一种或全部：(i)A与C混合，然后将B加入到混合物中；(ii)A和B混合成混合物；从混合物中除去B，然后将C加入到混合物中；和(iii)A被添加到B和C的混合物中。
“样品”、“测试样品”和“患者样品”在本文中可互换使用。样品可以是血清、尿、血浆、羊水、脑脊髓液、细胞或组织的样品。这样的样品可以如从患者获得的那样直接使用，或者可以进行预处理，例如通过过滤、蒸馏、提取、浓缩、离心、干扰组分的灭活、添加试剂等，以如本文所讨论的某种方式或本领域已知的其他方式改变样品的性质。如本文所用的术语“样品”和“生物样品”一般是指被测试含有和/或怀凝含有目标分析物例如抗体的生物材料。样品可以是来自受试者的任何组织样品。样品可包含来自受试者的蛋白质。
如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中，例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中等，而不是在多细胞生物体中发生的事件。
如本文所用，术语“体内”是指发生在多细胞生物体例如非人动物内的事件。
如本文所用，单数形式“一”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“包括”、“包含”、“含有”或“具有”及其变体旨在涵盖其后列出的项目及其等同物以及额外的主题。
如本文所用，重复使用短语“在一个实施方案中”、“在各种实施方案中”、“在一些实施方案中”等。此类短语不一定指代相同的实施方案，但除非上下文另有说明，否则它们可能指代相同的实施方案。
如本文所用，术语“和/或”或“/”表示与该术语相关联的项目中的任何一项、项目的任何组合或所有项目。
如本文所用，词语“基本上”不排除“完全”，例如，“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，词语“基本上”可从本发明的定义中省略。
如本文所用，术语“每个”在指代项目集合时旨在确定集合中的单个项目，但不一定指代集合中的每个项目。如果明确披露或上下文明确另有规定，则可能会出现例外情况。
如本文所用，术语“大约”或“约”在应用于一个或多个目标值时，是指与所述参考值相似的值。在一些实施方案中，除非另有说明或从上下文中可以明显看出，术语“大约”或“约”是指在任一方向(大于或小于)上落在所述参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小值内的值范围(除非该数字超过可能值的100％)。除非本文另有说明，术语“约”旨在包括接近于所述范围的值，例如重量百分比，其在个体成分、组合物或实施方案的功能方面是等同的。
如本文所公开，提供了多个值的范围。应当理解，除非上下文另有明确规定，否则还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值，至下限单位的十分之一。在所述范围中的任何所述值或中间值与该所述范围内的任何其他所述值或中间值之间的每个较小范围均包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括或排除在该范围内，并且其中任一个、两个限值都包括在或都不包括在该较小范围内的每个范围也包括在本发明内，受限于所述范围内的任何具体排除的限值。在所述范围包括一个或两个限值的情况下，不包括其中一个或两个限值的范围也包括在本发明中。
除非另有声明，本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示任何未要求保护的元素对于本发明的实践是必不可少的。
除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均以任何合适的顺序进行。关于所提供的任何方法，该方法的步骤可以同时或顺序发生。当该方法的步骤顺序发生时，除非另有说明，否则这些步骤可以任何顺序发生。在方法包括步骤组合的情况下，除非本文另有说明，步骤的每一个组合或子组合都包含在本公开的范围内。
本文引用的每个出版物、专利申请、专利和其他参考文献在不与本公开不一致的程度上通过引用整体并入。本文公开的出版物仅提供其在本发明的申请日之前公开的内容。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于此类出版物。此外，提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要独立确认。
应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且将向本领域技术人员指明根据其进行的各种修改或变化，并且这些将被包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。
F.实施例
实施例1
本实施例描述了下文后续实施例中使用的材料和方法。
人类受试者和临床信息
在捷克共和国捷克布杰约维采根据捷克布杰约维采医院/>(批准号103/19)、捷克科学院生物中心(BiologyCenter of the Czech Academy of Sciences)(批准号1/2018)和洛克菲勒大学(IRB DRO-0984)伦理委员会批准的方案，在从以前因确诊TBEV感染而住院的个体或或从以前针对TBEV接种疫苗的个体获得知情同意之后获得外周血样品。在治疗医院获得临床数据，并根据以下等级对疾病的严重程度进行评价：轻度，流感样症状伴定义为脑膜炎的脑膜刺激，特征为发烧、疲劳、恶心、头痛、背痛、关节痛/肌痛和颈部或背部僵硬；中度，既往症状伴有定义为脑膜脑炎的震颤、眩晕、嗜睡和畏光；重度，长期的神经系统后果，包括共济失调、蹒跚、精神状态改变、记忆力减退、意识定量障碍和麻痹，揭示为脑炎、脑脊髓炎或脑脊髓神经根炎(Bogovic，P.和Strle，F.，(2015)World J Clin Cases 3，430-441；Ruzek，D.，等人，(2019)Antiviral Res 164，23-51)。/>
血液样品处理和储存
使用Ficoll通过梯度离心获得外周血单核细胞(PBMC)，并将其在冷冻培养基(90％FCS，10％DMSO)中储存在液氮中。在实验之前，将等分的血清(来自感染的、接种疫苗的和随机的血库供体)在56℃下热灭活1小时，然后在4℃下储存。
蛋白表达和纯化
如先前所报道在大肠杆菌中表达并从包涵体中纯化EDIII抗原(Robbiani，D.F.，等人，(2017)Cell 169，597-609 e511)；Sapparapu，G.，等人，(2016)Nature 540，443-447)。使用含有编码TBEV毒株Neudoerfl的残基299-397(TBEVWE；NC_001672.1)或毒株Sofjin的301-397(TBEVFE；UniProtKB P07720)和Vasilchenko(TBEVSi；AF069066)的密码子优化序列的表达载体来产生未标记的EDIII蛋白或含有C末端6XHis-Avitag的EDIII蛋白。类似地构建编码其他蜱传黄病毒(POWV毒株LB，GenBank L04636.1；POWV分离株DTV；KFDV毒株W-377，JF416960.1；LGTV毒株TP21-636，NC_003690.1；LIV分离株LI3/1，KP144331.1；OHFV毒株Bogoluvovska，NC_005062)的未标记的EDIII的构建体。将表达质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌中并用1mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)在37℃下诱导4小时。将细胞裂解并将包含包涵体的不溶性级分溶解并在400mM L-精氨酸、100mM Tris-碱pH 8.0、2mM EDTA、0.2mM苯基-甲基磺酰氟、5mM还原和0.5mM氧化的谷胱甘肽和10％甘油中在4℃下重折叠。通过尺寸排阻色谱法(Superdex 75；Cytiva)在20mM Tris pH 8.0、150mM NaCl、0.02％NaN3中纯化重折叠的蛋白。将EDIII浓缩至10-20mg/mL。
如先前研究中所述生产和纯化用于结构研究的T025F(ab)(Keeffe，J.R.，等人，(2018)Cell Rep 25，1385-1394.e1387；Robbiani，D.F.，等人，(2017)Cell 169，597-609e511；Robbiani，D.F.，等人，(2020)Nature 584，437-442；Wang，Q.，等人，(2020)Cell HostMicrobe 28，335-349.e336)。简而言之，通过用适当的重链和轻链质粒瞬时转染Expi293细胞(Life Technologies)来表达在重链的C末端含有6XHis纯化标签的F(ab)。使用Ni-NTA亲和色谱法(Cytiva)，然后在20mM Tris pH 8.0、150mM NaCl、0.02％NaN3中进行尺寸排阻色谱法(Superdex 200；Cytiva)，从表达上清液中纯化His标记的F(ab)。将Fab浓缩至大约15mg/mL。
序列分析
如先前所述分析抗体序列(Robbiani，D.F.，等人，(2020)Nature 584，437-442)；特别是，使用Igblastn v.1.14.0(Ye，J.，等人，(2013)Nucleic Acids Research 41，W34-W40)和Change-O toolkit v.0.4.5(Gupta，N.T.，等人，(2015)Bioinformatics 31，3356-3358)对序列进行修剪和加注释。使用内部R和Perl脚本(可在GitHub(https：//github.com/stratust/igpipeline)上获得)基于V和J基因对来自同一细胞的序列进行配对和分配克隆型。如先前所述，还使用内部R和Perl脚本分析了核苷酸体细胞超突变和CDR3长度(Robbiani，D.F.，等人，(2020)Nature 584，437-442)；超突变分析基于Igblastn中最接近的种系。使用Guy H.R.疏水性量表(Guy，H.R.(1985)Biophysical Journal 47，61-70；Kyte，J.，和Doolittle，R.F.，(1982)J Mol Biol 157，105-132)和R包肽(R packagePeptides)(https：//joumal.r-project.org/archive/2015/RJ-2015-001/RJ-2015-001.pdf)，基于本研究的776个IGH CDR3序列和记忆B细胞受体序列公共数据库的22,654,256个IGH CDR3序列(DeWitt，W.S.等人，(2016)PLOS ONE 11，e0160853)来计算疏水性GRAVY分数。使用Shapiro-Wilk检验采用来自本研究的所有CDR3序列GRAVY分数和从公共数据库中随机选择的5,000个GRAVY分数来确定分布。使用Wilcoxon非参数检验来检验疏水性的显著性差异。
将来自6个受感染供体的抗TBEV抗体中V基因的频率分布与序列读取存档登录号SRP010970(Rubelt，F.，等人，(2012)PLoS One 7，e49774)进行了比较。基于上述分析进行V基因分配，并使用具有独特CDR3的序列来计算6个受感染供体的频率。使用具有不等方差的双尾t检验来确定统计显著性。使用WebLogo(Crooks，G.E.，等人，(2004)Genome Res 14，1188-1190)从每个抗体组的左对齐CDR3序列生成序列标识。
蛋白生物素化
根据制造商的说明(Avidity)，使用生物素-蛋白连接酶BIRA试剂盒对Avi标记的TBEVFE EDIII进行生物素化，并与链霉抗生物素蛋白-PE(BD Biosciences，554061)和链霉抗生物素蛋白-Alexa Fluor 647(Biolegend，405237)缀合。根据制造商的说明(ThermoScientific，A39257)，使用EZ Sulfo-NHS-LC-Biotinylation试剂盒对卵清蛋白(Sigma，A5503-1G)进行生物素化，并与链霉抗生物素蛋白BV711(BD Biosciences，563262)缀合。在用于流式细胞术之前，通过ELISA确认生物素化。
单细胞分选
使用CD19微珠(Miltenyi Biotec，130-050-301)经由阳性选择对来自样品111的PBMC富集B细胞。通过阴性选择(Miltenyi Biotec，130-101-638)对来自所有其他供体的PBMC富集B细胞。所有选择方案均根据制造商的说明进行。在含有荧光团标记的EDIII和卵清蛋白的FACS缓冲液(1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)，2％小牛血清，1mM EDTA)中，并且在抗人抗体抗-CD3-APC-eFluro 780(Invitrogen，47-0037-41)、抗-CD8-APC-eFluro 780(Invitrogen，47-0086-42)、抗-CD14-APC-eFluro 780(Invitrogen，47-0149-42)、抗-CD16-APC-eFluro 780(Invitrogen，47-0168-41)、抗-CD20-PECy7(BD Biosciences，335793)和Zombie NIR(BioLegend，423105)的存在下，将富集的B细胞在冰上孵育30分钟。使用FACS Aria III(Becton Dickinson)将单个CD3-CD8-CD14-CD16-ZombieNIR-CD20+Ova-EDIII-PE+EDIII-AF647+B细胞分选到96孔板的个体孔中。每个孔含有4μL裂解缓冲液，其包含0.5X PBS、10mM DTT和3000单位/mL RNasin核糖核酸酶抑制剂(Promega，N2615)。将分选的细胞在干冰上快速冷冻，然后储存在-80℃。抗体序列源自记忆B细胞，因为它们起源于小CD20+细胞，并且使用IgG特异性引物对抗体基因进行PCR扩增。
抗体测序、克隆和表达
使用SuperScript III逆转录酶(Invitrogen，18080-044)对来自单个细胞的RNA进行逆转录。将所得eDNA储存在-20℃，直到通过巢式PCR扩增可变IGH、IGL和IGK基因，然后进行Sanger测序。如先前所述使用来自第一个PCR反应的扩增子作为模板进行巢式PCR扩增以及不依赖序列和连接克隆(SLIC)到抗体表达载体中(Robbiani，D.F.，等人，(2020)Nature 584，437-442)。如先前所详述的那样，生产和纯化重组单克隆抗体(Klein，F.，等人，(2014)J Exp Med 211，2361-2372)。使用PierceTMFab制备试剂盒(Thermo Scientific，44988)生成T036F(ab)和F(ab’)2。
用于生产报告病毒颗粒(RVP)的质粒
先前已从Ted Pierson(NIH)获得了编码海肾荧光素酶(pWNVII-Rep-REN-IB)和ZIKV CprME表达质粒的西尼罗河病毒亚基因组复制子表达质粒(Pierson，T.C.等人，(2006)Virology 346,53-65；Robbiani，D.F.等人，(2017)Cell 169，597-609 e511)。通过限制性内切酶消化和连接来操作ZIKV CprME表达质粒，以表达其他黄病毒的CprME，如下所示：
TBEV：对应于蜱传脑炎病毒，西欧亚型毒株Neudoerfl(GenBank NC_001672)的具有CprME编码序列的合成DNA(5′侧翼为多接头和Kozak序列GGAATTCGCGGCCGCCTCAGG(SEQID NO：237)以及3′侧翼为终止密码子和多接头TAATAGTTAATTAACTCGAGCCGCGG；“CprME侧翼”)用引物DFRp1532(5-GGAATTCGCGGCCGCCTCAGG)(SEQ ID NO：238)和DFRp1533(5-GCGGCTCGAGTTAATTAA)(SEQ ID NO：239)进行扩增，然后在质粒pPOWV-LB-CprME(见下文)的NotI和PacI位点克隆，得到pTBEV-WE-CprME。
POWV-LB：含有POWV LB毒株的CprME序列(下划线)的合成DNA(GenBank：L06436.1，具有4个同义变化(小写和粗体)以降低复杂性；
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(SEQ ID NO：240)
用引物DFRp1511(5-ATCTACGTATTAGTCATCGCTATTA)(SEQ ID NO：241)和DFRp1514(5-ACCGCGGCTCGAGTTAATTAA)(SEQ ID NO：242)进行PCR扩增，并在质粒pZIKV-HPF-CprME(Robbiani，D.F.等人，(2017)169，597-609e511)的Eeo105I和SacII位点进行克隆，得到pPOWV-LB-CprME。
POWV-DTV：利用三件式组装PCR策略。pZIKV-HFP-CprME中CMV启动子上游到C编码区开始紧邻的下游的DNA使用引物RU-O-24611(5’-CTTGACCGACAATTGCATGAAG-3’)(SEQ IDNO：243)和RU-O-26690 (SEQ ID NO：244)进行PCR扩增，得到融合CMV启动子与POWV-DTV C编码序列(在引物RU-O-26690中加粗)的片段。使用由Aaron Brault友情提供的并且是基于DTV的Spooner毒株的DTVp1作为模板(Kenney，J.L.等人，(2018)Vector Borne ZoonoticDis 18，371-381)，使用寡核苷酸RU-O-26689 (SEQ IDNO：245)和RU-O-26711/> (SEQ ID NO：246)通过PCR生成与CMV启动子重叠的片段-与紧邻DTV基因组内的SacII位点下游的区域融合的DTV C，粗体核苷酸表示引入同义突变以切开SacII位点。使用DTVp1作为模板和寡核苷酸RU-O-26710 粗体核苷酸表示同义突变)和RU-O-26688/> (SEQ ID NO：248)扩增DNA以生成与被切开的SacII位点至SacII位点后的包膜蛋白编码区的末端重叠的片段。对这三个DNA片段进行退火、延伸，然后使用引物RU-O-24611和RU-O-26688进行PCR扩增。所得DNA片段用SnaBI和SacII消化，并克隆到类似消化的pZIKV-HPF-CprME中以生成pPOWV-DTV-CprME。
KFDV：将具有基萨那(Kyasanur)发热疾病病毒毒株W-377(GenBank JF416960.1)的CprME侧翼序列的合成DNA用引物DFRp1532和DFRp1533进行扩增，然后在质粒pPOWV-LB-CprME(见上文)的NotI和PacI位点处克隆，得到pKFDV-W-377-CprME。
LGTV：将Langat病毒分离株TP21-636的CprME从Dr.Sonia Best友情提供的质粒(NIH/NIAID的Rocky Mountain Laboratories)用引物DFRp1563(5-GGAATTCGCGGCCGCCTCAGGATGGCCGGGAAGGCCGTTCTA)(SEQ ID NO：249)和DFRp1566(5-CCGCGGCTCGAGTTAATTAACTATTAGGCTCCAACCCCCAGAGTCAT)(SEQ ID NO：250)进行扩增，然后在质粒pPOWV-LB-CprME的NotI和PacI位点进行克隆，得到pLGTV-TP21-636-CprME。来自GenBank NC_003690的两个核苷酸突变(A590G和A1893C)。
LIV：带有羊跳跃病病毒分离株LI3/1(GenBank KP144331)的CprME侧翼序列的合成DNA用引物DFRp1532和DFRp1533进行扩增，然后在质粒pPOWV-LB-CprME的NotI和PacI位点进行克隆，得到pLIV-LI3/1-CprME。
OHFV：具有鄂木斯克出血热病毒分离株Bogoluvovska(GenBank NC_005062)的CprME侧翼序列的合成DNA用引物DFRp1532和DFRp1533进行扩增，然后在质粒pPOWV-LB-CprME的NotI和PacI位点进行克隆，得到pOHFV-CprME。
为了确认不存在PCR诱导的错误，所有PCR起源的区域都在最终质粒中进行了测序。
RVP生产
根据制造商的说明使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，1166803)，通过将1μgpWNVII-Rep-REN-IB质粒与3μg选择的黄病毒CprME质粒共转染到允许细胞系Lenti-X 293T中生产RVP。先前在胶原蛋白包被的6孔板中以1x106个细胞/孔的密度接种细胞24小时。转染并在37℃下孵育6小时后，通过抽吸去除多余的DNA-脂质复合物，并将培养基替换为含有20mM HEPES和10％FBS的DMEM(Gibco)。在接下来的72小时内，每隔24小时收获含有RVP的上清液，通过0.45微米过滤器过滤并在-80℃下冷冻，并将培养基替换为含有20mM HEPES和10％FBS的DMEM。随后将冷冻的RVP解冻并在Huh-7.5细胞上滴定，以确定在没有血清或抗体的情况下细胞表达1x106RLU时RVP的稀释度。
RVP中和测定
用在50μL的补充有10％FBS和1％非必需氨基酸(NEAA)的DMEM(Gibco)中的7,500个Huh-7.5细胞/孔接种96孔板。24小时后，将100μL稀释的RVP与100μL稀释的血清或抗体混合，在37℃下孵育1小时，然后将50μL的混合物一式三份添加到铺板的细胞中。将RVP在BA-1稀释剂(补充有1％BSA和100单位/mL的青霉素/链霉素的培养基199(Lonza))中适当稀释，以达到所需的RLU表达。在37℃下再孵育24小时后，从细胞中吸出培养基，替换为35μL裂解缓冲液(Promega，E2810)，并将板在-80℃下冷冻。使用海肾荧光素酶测定系统(Promega，E2810)，使用15μL随后解冻的裂解缓冲液进行海肾荧光素酶表达测量。将血清稀释至1∶600,000终浓度进行TBEV RVP中和筛选或连续稀释以生成曲线。重组单克隆抗体以10μg/mL的最终浓度使用，并按1∶3连续稀释用于中和测定。使用Prism软件(GraphPad)通过非线性回归分析确定半数最大中和效价(NT50)和半数最大抑制浓度(IC50)。在针对黄病毒RVP组的交叉中和筛选中，使用上文所述的方案以1μg/mL的最终浓度对重组抗体进行测定，将结果与无抗体对照进行比较。在使用抗体片段的实验中，使用等摩尔浓度的抗体片段和免疫球蛋白。在使用抗体组合的RVP实验中，以1μg/mL的最终浓度使用T036，并且以10μg/mL的最终浓度使用4G2(克隆D1-4G2-4-15；Sigma目录号MAB10216)。
ELISA测定
通过标准ELISA测量了血清IgG或重组IgG抗体与EDIII蛋白的结合。高结合96孔板(Costar，07-200-721)在室温下每孔用含250ng EDIII蛋白的PBS包被过夜；然后在室温下用含0.1mM EDTA、0.05％Tween和2％BSA的PBS封闭板2小时。将样品在PBS-T中稀释，添加到板中，并在室温下再孵育1小时。将与HRP缀合的二抗山羊抗人IgG F(ab’)2片段(JacksonImmunoresearch，109-036-088)在PBS-T中按1∶5,000稀释，添加到板中，并在室温下再次孵育1小时。在每个步骤之间，将板用PBS-T洗涤四次。最后使用TMB底物(ThermoScientific，34021)对板进行显色；使用1M硫酸终止反应，并在450nm读板。在1∶500稀释度下对血清筛选结合。将重组单克隆抗体稀释至10μg/mL并按1∶3连续稀释；使用Prism 8(GraphPad)通过非线性回归分析确定半数有效浓度(EC50)。对于交叉结合测定，根据上文所述的方案使用黄病毒EDIII蛋白组以1μg/mL对重组抗体进行测定。使用抗HIV单克隆抗体10-1074作为同种型对照(Mouquet，H.，等人，(2012)Proc Natl Acad Sci U S A 109，E3268-3277)。光密度＞2.5倍同种型对照信号的抗体被认为是交叉反应的。使用来自TestLine ClinicalDiagnostics的EIA TBE病毒IgG(TBG096)和EIA TBE病毒IgM(TBM096)试剂盒进行TBEV临床测试(表1A和1B)。
病毒和细胞
低传代TBEV毒株Hypr由捷克共和国捷克布杰约维采捷克科学院生物中心寄生虫学研究所虫媒病毒收集中心(http：//www.arboviruscollection.cz/index.php？lang＝en)提供。该病毒最初是在1953年从捷克共和国布尔诺(前捷克斯洛伐克)的一名10岁患病儿童的血液中分离出来的。低传代TBEV毒株Neudoerfl由奥地利维也纳医科大学(MedicalUniversity in Vienna，Austria)F.X.Heinz教授友情提供。该病毒最初在1971年从奥地利的蓖子硬蜱(Ixodes ricinus)中分离出来。在将其用于体外实验之前，病毒株在乳小鼠脑和/或BHK-21细胞中繁殖。
将PS细胞(猪肾稳定的)(Kozuch，O.和Mayer，V.，(1975)Acta Virol 19，498)在37℃下在补充有3％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和1％L-谷氨酰胺的Leibovitz(L-15)培养基(Sigma-Aldrich，Prague，捷克共和国)中培养。
噬斑测定
为了测定细胞培养上清液中的病毒滴度，如先前所述(De Madrid，A.T.，和Porterfield，J.S.(1969)Bull World Health Organ 40，113-121)进行了轻微修改(Formanova，P.P.，等人，(2019)J Neuroinflammation 16，205)进行了噬斑测定。简而言之，将10倍稀释的病毒加上PS细胞悬浮液(每孔1.3×105个细胞)添加到24孔组织培养板中。在37℃和0.5％CO2条件下孵育4小时后，每个孔用羧甲基纤维素(1.5％，在L-15培养基中)覆盖。在37℃和0.5％CO2下孵育5天后，使用萘黑使细胞单层可视化。病毒滴度表示为每毫升的噬斑形成单位(pfu)。
病毒中和试验(VNT)
如先前所述(Sirmarová，J.，等人，(2014)Ticks Tick Borne Dis 5，523-527)并进行了一些修改，来进行VNT。简而言之，将单克隆抗体(T025、T028、T034和T038)在L-15培养基中稀释至2.5μg/ml，然后在96孔板中按1∶2连续稀释。将稀释的单克隆抗体与每孔50pfu的TBEV-Hypr(足以引起90-95％的细胞溶解)在37℃下孵育90分钟。此后，每孔加入5x104个PS细胞。在37℃下孵育4天后，使用显微镜监测细胞病变效应(CPE)，并根据制造商的说明使用Cell Counting Kit-8(Dojindo Molecular Technologies，Inc.，Munich，德国)测量细胞活力。使用GraphPad Prism(7.04版本，GraphPad Software，San Diego，CA，USA)从两个独立实验计算半数最大抑制浓度(IC50)。
抗体对病毒生长的影响
将单克隆抗体(T036、T038和10-1074)在L-15培养基中稀释至0.5或0.05μg/ml，并与TBEV-Hypr(50pfu/孔)或TBEV-Neudoerfl(500pfu/孔或2,500pfu/孔)在96孔板中在37℃下孵育90分钟。孵育后，每孔加入5x104个PS细胞。在37℃和0.5％CO2条件下孵育24和48小时后，收获培养基，并如上文所述通过噬斑测定法测定病毒滴度，并将细胞单层用冷丙酮-甲醇(1∶1)固定，用10％胎牛血清封闭，并与小鼠抗黄病毒抗体(1∶250稀释，克隆D1-4G2-4-15；Sigma目录号MAB10216)孵育，如先前所述(Stefanik，M.，等人，(2020)Microorganisms8)。洗涤后，将细胞用与异硫氰酸荧光素(FITC；1∶500稀释，Sigma目录号AP181F)缀合的山羊抗小鼠二抗进行标记，并用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，稀释至1μg/mL)复染以使细胞核可视化。荧光信号用Olympus IX71落射荧光显微镜记录，并用ImageJ软件处理。
病毒细胞结合测定
将TBEV(毒株Hypr；100PFU)与单克隆抗体或抗体组合(T036和10-1074以0.5μg/ml最终浓度使用，D1-4G2-4-15[4G2]以10μg/ml最终浓度使用)在补充有3％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和1％L-谷氨酰胺的L-15培养基(Sigma-Aldrich，Prague，捷克共和国)中在37℃下孵育1.5小时。然后将TBEV-抗体复合物添加到6孔板中的预冷的汇合PS细胞单层(每孔1mL)中。在4℃下1小时后，去除接种物，用PBS洗涤细胞3次以去除未结合的病毒。添加补充有3％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1％L-谷氨酰胺和1.5％CMC的L-15培养基(每孔4.5ml)，并将温度调至37℃以允许感染细胞。在37℃和0.5％CO2条件下孵育5天后，使用萘黑对细胞单层进行染色，并对噬斑进行可视化和计数，以确定在孵育步骤期间与细胞结合的病毒颗粒数量。
统计分析
对于所有活病毒实验，用对数转换的数据进行ANOVA检验，然后是是Tukey多重比较检验和Student t检验。使用GraphPad Prism(版本7.04，GraphPad Software，SanDiego，CA，USA)进行分析。在其他情况下，使用指定的Mann-Whitney检验或ANOVA和Tukey多重比较检验对数据进行了分析，并且通过在GraphPad Prism(版本8.4.3，GraphPadSoftware，San Diego，CA，USA)中计算的对数秩(Mantel-Cox)检验分析了生存曲线的比较。p值＜0.05被认为具有显著性。
结晶、结构测定和精修
通过以1∶1的摩尔比混合Fab和抗原并在室温下孵育1-2小时来制备用于结晶的复合物。通过在22℃下将0.2μμL结晶复合物与0.2μL含0.1M柠檬酸三钠二水合物pH 5.0、10％PEG 6000在坐滴中相结合来获得T025Fab-TBEV-WE EDIII-His-Avitag复合物的晶体(空间群P21； α＝90°，β＝94.6°，γ＝90°；每个不对称单位一个分子)。通过在22℃下将0.2μL结晶复合物与0.2μL含0.1M柠檬酸三钠二水合物pH5.0、10％PEG 6000在坐滴中相结合来获得T025Fab-TBEV-FE EDIII-His-Avitag复合物的晶体(空间群P21212；/> α＝90°，β＝90°，γ＝90°；每个不对称单位一个分子)。通过在22℃下将0.2μL结晶复合物与0.2μL含5％(+/-)-2-甲基-2，4-戊二醇、0.1M HEPES pH 7.5、10％PEG 10,000在坐滴中相结合获得T025Fab-TBEV-Si EDIII复合物的晶体(空间群P21；/> α＝90°，β＝94.8°，γ＝90°；每个不对称单位一个分子)。用25％甘油对晶体进行冷冻保护。通过在22℃下将0.2μL结晶复合物与0.2μL含0.15M硫酸锂一水合物、0.1M柠檬酸pH 3.5、18％PEG 6,000在坐滴中相结合获得T036Fab-LIV EDIII复合物的晶体(空间群P1；/> α＝88.0°，β＝73.2°，γ＝70.6°；每个不对称单位两个分子)。将晶体逐步冷冻至25％的甘油进行保护，然后在液氮中冷冻保存。
使用Dectris Pilatus 6M检测器在斯坦福同步辐射光源(Stanford SynchrotronRadiation Lightsource，SSRL)光束线12-2处收集了X射线衍射数据(表6)。使用Mosflm(Battye，T.G.，等人，(2011)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 67，271-281)整合数据并使用CCP4(Winn，M.D.，等人，(2011)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 67，235-242)缩放数据。使用不同探测器距离对T036-LIV晶体收集来自同一晶体的四个180°数据集，然后使用CCP4合并和缩放。在PHASER(McCoy，A.，等人，(2007)J Appl Crystallogr 40，658-674)中使用来自PDB 2GHW的VHVL结构域、来自PDB 4OGX的CHCL结构域和来自PDB 6J5F的TBEV EDIII作为搜索模型，通过分子置换解析了T025-TBEV-WE EDIII复合物结构。使用迭代方法将模型精修至分辨率，该迭代方法涉及在Phenix(Adams，P.D.，等人，(2010)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66，213-221)中进行精修并使用Coot手动重建为模拟退火复合省略图(Emsley，P.，和Cowtan，K.，(2004)Acta Crystallogr D BiolCrystallogr 60，2126-2132)。无序且未包括在模型中的残基是HC残基214-219和6X His标签；LC的残基214；以及残基299-302、397，和TBEV-WE EDIII结构域的6X His标签和Avi标签。使用部分精修的T025-TBEV-WE EDIII结构作为分子置换模型类似地解析了T025-TBEV-FE EDIII和T025-TBEV-Si EDIII复合物结构。使用对T025-TBEV-WE EDIII描述的迭代方法，将T025-TBEV-FE EDIII模型精修到/>分辨率，将T025-TBEV-Si EDIII模型精修到分辨率。在PHASER(McCoy，A.，等人，(2007)J Appl Crystallogr 40，658-674)中使用来自PDB 4OB5的VHVL结构域、来自部分精修的T025-TBEV-WE EDIII结构的CHCL结构域和来自PDB 6J5F的TBEV EDIII作为搜索模型解析了T036-LIV EDIII复合物结构。使用如上文所述的迭代策略将模型精修至/>该迭代策略在精修的初始阶段期间包括非结晶对称性限制。无序且未包括在模型中的残基是HC残基128-133、188-190(链A)、214-219和6X His标签；LC的残基212-214(链L)或213-214(链B)；以及LIV EDIII结构域的残基301和397(链C)。此外，在未建模的非对称单元中在Fab的两个拷贝中在残基E98HC和S94LC附近在模拟退火省略图(Phenix)中存在额外的密度。使用Kabat编号方案进行Fab编号。叠加结构，计算RMSD，并使用PyMOL生成图形。使用PDBePISA(Krissinel，E.，和Henrick，K.，(2007)J MolBiol 372，774-797)确定掩埋表面积和氢键。Fab-抗原接触残基被鉴定为其中任何原子都在另一个蛋白上的原子的/>范围内的残基。用于分配氢键的距离和几何标准是距离和氢键角为90-270°。范德华相互作用允许的最大距离为/>
动物伦理声明
该研究符合所有相关的欧盟动物工作指南，并符合捷克关于使用实验动物和保护动物免受虐待的国家法律指南(动物福利法(Animal Welfare Act)第246/1992 Coll.号)。该方案是经寄生虫学研究所动物实验伦理委员会(Committee on the Ethics of AnimalExperimentation of the Institute of Parasitology)和捷克科学院动物实验项目批准部门专家委员会(Departmental Expert Committee for the Approval of Projects ofExperiments on Animals of the Czech Academy of Sciences)批准(许可证号4253/2019)。
小鼠和病毒接种
无特定病原体的BALB/c小鼠获自ENVIGO RMS B.V.(Horst，荷兰)。随意供应灭菌颗粒饲料和水。在所有实验中，使用了6-8周龄的雌性小鼠。小鼠被安置在单独通风的带有木屑垫料的塑料笼子(Techniplast)中，恒温为22℃，相对湿度为65％，在12小时光照/黑暗循环下。在实验中使用每组三只小鼠。在感染前一天或感染后一天对小鼠腹膜内接种在PBS中的单克隆抗体T025或10-1074，并皮下感染100pfu的TBEV-Hypr(在乳小鼠脑中繁殖8次)。随着时间的推移监测小鼠的症状和存活率，并在达到人道终点时实施安乐死。
实施例2
在TBEV感染队列中的血清学反应
对捷克共和国2011年和2018年爆发期间因TBE住院的141名个体的血清进行了分析。在疾病的脑炎阶段期间，在住院时获得样品(图1A)(Holzmann，H.，(2003)Vaccine 21，S36-S40)。与先前的报告(P.，等人，(2018)Travel Med Infect Dis 26，25-31；Bogovic，P.，和Strle，F.，(2015)World J Clin Cases 3 430-441)一致，该队列的特征是男性(61.1％)和老年个体(平均年龄＝49岁；表1A和1B)的发病率较高。从168名随机选择的血库供体和10名针对TBEV接种疫苗的个体(表1A和1B)获得了对照血清。通过ELISA以1∶500的稀释度筛选所有血清是否存在与TBEV的EDIII结合的IgG抗体(图1B)。受感染个体的信号显著高于接种疫苗组和血液供体组(通过使用Tukey校正的ANOVA，分别为p＝0.0159和p＜0.0001；图1B)。TBEV EDIII ELISA反应性和年龄或住院时间之间没有相关性(图2A-O)。
为了评价血清中和活性，使用表达荧光素酶的TBEV报告病毒颗粒(RVP；参见方法)，在1∶6x105稀释度下对从恢复和接种疫苗的个体中获得的样品筛选中和(Pierson，T.C.，等人，(2006)Virology 346 53-65)。中和活性范围从完全到检测不到，在疫苗接种者中显著较低(p＜0.0001；图1C)，并且在ELISA中与EDIII结合相关(p＝0.0004；图2M)。前28个感染个体的半数最大中和效价(NT50)在0.37-6.7x106之间变化(图1D-E)。相比之下，疫苗接种者的NT50为0.32-1.0x104(图2N-O)。得出的结论是，因TBEV感染而住院的个体表现出宽分布的EDIII结合和中和活性，其通常高于该队列中的疫苗接种者。
B细胞记忆汇聚在特异性抗体基因上
为了表征抗TBEV抗体，纯化了来自6个感染个体(图1D和1E中的橙色)和3个疫苗接种者(图3A-D和4A)的外周血的TBEV特异性B细胞。与疫苗接种者(1.28-5.95x 10-3％)相比，在感染组(0.067-0.31％)中循环CD20+B细胞之间TBEV EDIII特异性B细胞的频率更高。总体来说，776个IgG抗体重链和轻链基因对通过RT-PCR进行扩增并测序(实施例1，图3B和5D，以及表2A-2J)。IGVH和IGVL中的平均体细胞超突变分别为18个和9个核苷酸，CDR3长度是正常的(平均CDRH3长度为13.5，平均CDRL3长度为9.4)，并且疏水性与对照相比略有增加(p＜0.0001；图4B-D)(Briney，B.，等人，(2019)Nature 566,393-397；Rock，E.P.，等人，(1994)JExp Med 179，323-328)。与包括HIV-1、寨卡病毒、乙型肝炎和SARS-CoV-2在内的其他病毒病原体一样(Robbiani，D.F.，等人，(2017)Cell 169，597-609 e511；Robbiani，D.F.，等人，(2020)Nature 584，437-442；Scheid，J.F.，等人，(2011)Science(New York，NY)333，1633-1637；Wang，Q.，等人，(2020)Cell Host Microbe 28，335-349.e336；West，A.P.，等人，(2012)Proc Natl Acad Sci U S A 109，E2083-20990)，在扩增的B细胞克隆中发现了许多序列(37.9％，图3B和D)。
序列分析揭示了在个体内部和个体之间具有相似特征的抗体(图3B、3D和3E，表2A-2J和3)。例如，VH1-69和VH3-48分别占所有克隆序列的59.2％和7.5％(图3B和3D中的蓝色和红色阴影)。此外，在多个供体中发现了包含这些VH基因的相关序列(图3E中的紫色线)。VH1-69、VK2-28、VK1-33和VL4-69基因在受感染供体中的使用被显著过代表(p＜0.01)；VH3-48、VK1-5和VL2-14基因也得到富集，尽管不显著(图4E-G)。在一些情况下，包括克隆扩增的IGVH1-69/IGVK2-28和IGVH3-48/IGVK1-5抗体，个体供体之间的序列相似性延伸至IGH和IGL CDR3(表3，图4H和4I)。得出的结论是记忆B细胞对TBEV EDIII的应答向特定的抗体基因汇聚。
强效且广谱交叉反应的抗TBEV抗体
对59种抗体(46种来自康复期和13种来自接种疫苗的供体，表4)进行克隆、通过重组DNA方法修饰、表达，并在ELISA中测试与对应于所有3种TBEV亚型的EDIII蛋白的结合：西欧(TBEVWE)、远东(TBEVFE)和西伯利亚(TBEVSi；图5A和6A，以及表5)。59种抗体中除一种以外的所有抗体都与所有3种EDIII结合，具有相似的半数最大有效浓度(EC50)，范围为0.2至12ng/mL(图5B，表5)。
当测试针对TBEV RVP的中和活性时，从受感染供体获得的46种抗体中有43种被中和，IC50低至0.02ng/mL(图5C和5D，表5)。相比之下，从接种疫苗的供体获得的最佳抗体的IC50为8.3ng/mL。全部分离自受感染供体的七种抗体是强效的TBEV中和剂，IC50低于1ng/mL(图5D)。还评估了其中四种抗体对真实TBEV的中和作用(图5E和5F)。所有四种抗体都显示出强效的活性，IC50范围为35.9至268.8ng/mL(表5)。
为了确定TBEV抗体是否与相关病毒发生交叉反应，以单浓度(1μg/mL)对TBEV抗体筛选与Langat(LGTV)、羊跳跃病(LIV)、鄂木斯克出血热(OHFV)、基萨那森林病(KFDV)和波瓦森谱系I和II病毒(POWV-DTV和POWV-LB；参见方法和图6B和6C)的EDIII的结合。对于许多测试的抗体，观察到广谱交叉反应性(图6B)。为了确定抗体是否也具有广谱中和作用，针对与同一组蜱传病毒相对应的RVP筛选了抗体。当以1μg/ml的浓度进行测试时，大多数的IGHV1-69抗体中和了LGTV、LIV、POWV-LB和POWV-DTV，其中一种IGVH3-48/IGVK1-5抗体中和了除POWV-LB之外的所有RVP(图6B和6C)。对于几种交叉反应性抗体，针对黄病毒RVP组的IC50在个位数ng/mL范围内(图5G和图6D-I；表5)。例如，IGVH3-48/IGVK1-5抗体T056是LGTV、LIV和OHFV的强效中和剂，IC50值等于或小于1ng/mL。得出的结论是：一些TBEV中和抗体对蜱传黄病毒具有广谱活性。
抗体T036促进TBEV感染
与其他抗体形成对比，T036显示出TBEV和POWV-LB RVP感染的剂量依赖性增强(图7A和图6D)。还观察到采用T036F(ab′)2和F(ab)的增强，表明增强不需要二价结合和Fc结构域(图7A)。为了确定T036是否增强真正TBEV的感染，进行了噬斑减少测定。与T038(中和抗体)或同种型对照(图7B和7C；图8A和8B)相比，T036的添加增加了病毒生长。
A5是一种针对包膜结构域II(EDII)的小鼠单克隆抗体，它通过暴露E蛋白的融合环来增强病毒融合。它的活性可以被4G2抑制，4G2是一种融合环定向的小鼠单克隆抗体(Haslwanter，D.，等人，(2017)PLoS Pathog 13，e1006643-e1006643。为了确定人抗EDIII抗体T036的感染增强是否也可被4G2抑制，在T036或4G2单独或组合的存在下测量了TBEVRVP感染(图7D)。与T036在暴露融合环表位中的作用一致，当这两种抗体都存在时增强被抑制，但单独的4G2没有可检测的效果(图7D)。在病毒结合测定中使用真的TBEV获得了类似的结果(图7E)。结果表明T036通过需要暴露E蛋白融合环的机制增强TBEV感染。
抗体T025结构揭示了与侧脊表位的结合
为了深入了解人抗TBEV抗体的中和机制，解析了T025(一种广谱且强效的抗体)的Fab与TBEV的所有三种亚型的EDIII结构域复合的晶体结构(图9A-D和10A-B)。T025 Fab-TBEVWE EDIII复合物的结构揭示了：该抗体在EDI-EDIII铰链区附近的EDIII侧脊附近结合，使重链和轻链都与EDI-EDIII铰链和BC环接触，并且使轻链与EDIII的DE环接触(图9A)。抗体使用CDRH2、CDRH3、CDRL1和CDRL3接触EDIII，并在EDIII上掩埋的表面积(VH为VL为/>)。T025将Asp100HC和Trp94LC插入EDIII的裂缝中，与EDIII形成盐桥(Asp100HC-Lys311EDIII)和氢键(图9B)。与TBEVFE EDIII和TBEVSi EDIII复合的T025 Fab的晶体结构与T025-TBEVWE EDIII结构相似(对于519 Cα原子，/>对于516 Cα原子，/>)，与该病毒的这三个毒株之间在表位残基中具有100％的序列保守性一致(图10A-B)。
将T025 Fab-TBEVWE结构与结合TBEV病毒粒子的小鼠单克隆抗体(19/1786)的cryo-EM结构进行了比较(Füzik，T.，等人，(2018)Nat Commun 9，436)。T025和19/1786在VHVL中的氨基酸序列同一性＜65％，在CDR中的氨基酸序列同一性为47％，但通过EDIII的Cα原子对结构进行的结构比对表明这两种抗体识别相似的表位(图9C)并采用相似的姿势(图9D)。因此，较低分辨率的cryo-EM结构可用于推断有关T025如何结合和中和病毒的细节。除了与EDIII接触外，19/1786还与邻近亚基的EDI或EDII相互作用(Füzik，T.，等人，(2018)Nat Commun9，436)。这与T025在EDIII上相对较低的掩埋表面积(/>与的典型值相比)一起考虑(Ramaraj，T.，等人，(2012)Biochim Biophys Acta1824，520-532)，表明T025也与天然病毒粒子上的相邻结构域接触。与19/1786对病毒粒子的识别一样，病毒粒子上180个EDIII中的120个被T025结合也是有可能的。
抗体T025预防和治疗小鼠感染
为了确定抗EDIII抗体是否可以防止体内感染，在BALB/c小鼠中进行了预防实验。在用102pfu的TBEV(致死剂量)攻毒前24小时，小鼠接受分级剂量的T025(每只小鼠100至0.1μg)。所有用同种型对照抗体处理的小鼠均在第10天死亡(n＝6)。相比之下，即使是最低剂量的T025也具有保护作用；接受该抗体的24只小鼠中除了1只之外全部存活(p＜0.0001，图10A)。为了测试T025的治疗潜力，用102pfu的TBEV感染BALB/c小鼠，然后在之后的1、3或5天后注射30μg T025或同种型对照(图10B)。到第13天时，所有12只对照小鼠都死于感染。相比之下，感染后第1天用T025治疗的13只小鼠中有12只以及在感染后第3天治疗的13只小鼠中有4只存活。在感染后5天用T025治疗的所有小鼠都没有反应。因此，T025是一种广谱中和人抗TBEV抗体，可有效预防和治疗BALB/c小鼠的TBEV感染。
讨论
蜱传黄病毒可引起暴发性脑炎，目前对此尚无有效疗法。这组病毒在欧洲、亚洲和北美都是一个日益严重的公共卫生问题。在引起疾病的蜱传黄病毒中，TBEV在中欧和俄罗斯很普遍。尽管有大量关于针对TBEV的多克隆体液免疫应答的信息(Albinsson，B.，等人，(2018)Euro Surveill 23，pii＝17-00838；Holzmann，H.，(2003)Vaccine 21 S36-S40；Matveeva，V.A.，等人，(1995)Immunol 46，1-4；McAuley，A.J.，等人，(2017)NPJ Vaccines2，5；Remoli，M.E.，等人，(2014)Pathog Dis 73，1-3)，但是人们对自然感染或疫苗接种诱导的中和抗体反应的分子性质知之甚少或一无所知。本实施例描述了从6名恢复的个体和3名接种疫苗的个体的记忆B细胞中获得的776种抗体，其中有几种广谱且强效的蜱传黄病毒中和剂。这些数据提供了对人类抗体对TBEV和相关病原体的反应以及抗体诱导的中和和增强机制的见解。最后，广谱且强效的中和人单克隆抗体对体内保护和治疗非常有效，病具有巨大的临床应用潜力。
人类对病原体的中和抗体反应经常集中在相同的IGV基因上。实例包括针对HIV-1、流感、寨卡病毒、乙型肝炎病毒和SARS-CoV-2病毒的中和抗体(Robbiani，D.F.，等人，(2017)Cell 169，597-609e511；Robbiani，D.F.，等人，(2020)Nature 584，437-442；Scheid，J.F.，等人，(2011)Science(New York，NY)333，1633-1637；Tiller，T.，等人，(2007)Immunity 26，205-213；Wang，Q.，等人，(2020)Cell Host Microbe 28 335-349.e336；West，A.P.，等人，(2012)Proc Natl Acad Sci U S A 109，E2083-2090)。不同个体产生的针对TBEV的EDIII的抗体表现出很强的同源性，与SARS-CoV-2抗体一样，超出了IGV重链和轻链基因配对，并包括CDR3区域。
在针对TBEV的中和抗体中，VH1-69和VH3-48被高度过度代表。VH1-69与各种不同的轻链基因配对以产生在疫苗接种者和康复个体中发现的中和抗体。这组抗体的中和活性差异很大，范围为IC5012-1180ng/mL(几何平均值为186.2ng/mL)。VH1-69抗体在人类库中有很高的代表性，并且在针对流感、丙型肝炎和HIV-1的广谱中和抗体中也很常见(Chen，F.，等人，(2019)Curr Opin Virol 34，149-159)。抗TBEV VH3-48抗体与VH1-69的不同之处在于它们总是与相同的轻链VK1-5配对。VH3-48抗体也比VH1-69更有效，IC50范围为0.5-7.3ng/mL(几何平均值为2ng/mL)，并且它们是仅见于康复期个体。在被检查的疫苗接种者中不存在此类强效抗体，这与该组的血清中和效力水平较低一致。最后，VH3-48抗体也是几种相关的蜱传黄病毒的强效中和剂，包括KFDV、LGTV、LIV和OHFV，IC50为1-36ng/mL。
如果在感染前甚至是感染后施用针对多种不同的黄病毒(包括登革热和寨卡病毒)的抗体，则可以起到保护作用(Robbiani，D.F.，等人，(2017)Cell 169597-609 e511；Xu，M.，等人，(2017)NPJ Vaccines 2，2)。在俄罗斯和哈萨克斯坦，建议对被蜱虫叮咬3天内出现的个体施用TBEV超免疫血浆以进行暴露后预防(2008；Pen′evskaia，N.A.，和Rudakov，N.V.，(2010)Med Parazitol(Mosk)53-59)。这种干预的功效可能因供体血浆的批次而异(Rabel，P.O.，等人，(2012)Clin Vaccine Immunol 19 623-625；Ruzek，D.，等人，(2019)Antiviral Res 164，23-51)，一些国家在发生少量不良事件和担心出现疾病的抗体依赖性增强的可能性后停止其的使用(Arras，C.，等人，(1996)Lancet 347，1331；Kluger，G.，等人，(1995)Lancet 346，1502；Waldvogel，K.，等人，(1996)Eur J Pediatr 155，775-779)。小鼠单克隆抗体也可以预防TBEV，但尚未在临床上进行测试(Baykov，I.K..，等人，(2014)Vaccine 32，3589-3594；Levanov，L.N.，等人，(2010)Vaccine 28，5265-5271；Matveev，A.，等人，(2020)Vaccine 38，4309-4315)。这些实验因发现了人单克隆抗体而扩展了先前的工作，所述人单克隆抗体即使以低至～0.005mg/Kg的剂量施用时也能防止小鼠感染。值得注意的是，即使在感染后3天以～1.5mg/Kg的剂量施用时，这些抗体也抑制小鼠的疾病。
针对其他黄病毒(最重要的是登革热和寨卡病毒)的次优抗体水平与疾病的抗体依赖性增强(ADE)相关(Dejnirattisai，W.，等人，(2016)Nat Immunol 17，1102-1108；Harrison，S.C.，(2016)Nat Immunol 17，1010-1012；Katzelnick，L.C.，等人，(2017)Science(New York，NY)358，929-932；Katzelnick，L.C.，等人，(2020)Science(New York，NY)369，1123-1128；Sabin，A.B.，(1950)Bacteriol Rev 14，225-232；Stettler，K.，等人，(2016)Science(New York，NY)353，823-826)。还曾讨论过将ADE作为对部分个体在TBEV感染包括疫苗突破性感染后发生暴发性脑炎的原因(Ruzek，D.，等人，(2019)Antiviral Res164，23-51)。登革热感染中的ADE被认为是由增强病原体进入Fc受体表达细胞的免疫复合物介导的(Halstead，S.B.，(2014)Microbiol Spectr 2)。然而，抗体还可以通过诱导病毒表面蛋白的构象变化来增强感染，该构象变化促进病毒融合机制的参与(Guillon，C.，等人，(2002)J Virol 76，2827-2834；Wan，Y.，等人，(2020)J Virol 94，e02015-02019；Winarski，K.L.，等人，(2019)Proc Natl Acad Sci USA 116，15194-15199)。事实上，已经鉴定出针对TBEV的小鼠单克隆抗体，它通过这种机制得到增强(Haslwanter，D.，等人，(2017)PLoS Pathog 13，e1006643-e1006643)。人类感染TBEV会产生促进体外病毒感染的抗体，这一发现引发了这样的问题：这些抗体是否可以在TBE发病机制或临床血浆施用后罕见的不良事件中发挥作用。
目前的TBEV疫苗是30多年前开发的，由在鸡胚细胞上生长的灭活病毒组成。疫苗接种是TBEV特异性的，需要初免和两次加强，并根据使用的疫苗产生90-100％的血清转化(Loew-Baselli，A.，等人，(2009)Hum Vacc 5，551-556；Maikova，G.B.，等人，(2019)J MedVirol 91，190-200；Vorovitch，M.F.，等人，(2019)Adv Virol 2019，5323428)。建议在个体的一生中每3-5年进行一次额外的加强。广谱且强效的VH3-48抗体的存在表明，专门设计用于靶向这些抗体识别的表位的下一代疫苗可能对TBEV、KFDV、LGTV、LIV和OHFV普遍有效。最后，对蜱传黄病毒具有广谱活性的强效人抗体在处于高风险以及对疫苗无反应的个体中具有显著的临床应用潜力，并在用于感染早期阶段的治疗中具有显著的临床应用潜力。
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对最高分辨率壳层的统计数据在括号中显示。

Claims (41)

1.一种分离的抗蜱传脑炎病毒(TBEV)抗体或其抗原结合片段，其特异性结合TBEV抗原。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述TBEV抗原包含E蛋白的结构域III(EDIII)的侧脊。
3.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够中和多个TBEV毒株。
4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含具有以下氨基酸序列的重链可变区的三个重链互补决定区(HCDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)：SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115或117；以及具有以下氨基酸序列的轻链可变区的三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116或118。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区，其具有与以下氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列：SEQ IDNO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115或117；或具有以下氨基酸序列：SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115或117；和
轻链可变区，其具有与以下氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列：SEQ IDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116或118；或具有以下氨基酸序列：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116或118。
6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区包含SEQ ID NO：1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12、13-14、15-16、17-18、19-20、21-22、23-24、25-26、27-28、29-30、31-32、33-34、35-36、37-38、39-40、41-42、43-44、45-46、47-48、49-50、51-52、53-54、55-56、57-58、59-60、61-62、63-64、65-66、67-68、69-70、71-72、73-74、75-76、77-78、79-80、81-82、83-84、85-86、87-88、89-90、91-92、93-94、95-96、97-98、99-100、101-102、103-104、105-106、107-108、109-110、111-112、113-114、115-116或117-118中各自的氨基酸序列。
7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是二价或双特异性抗体。
8.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其还包含变体Fc恒定区。
9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单克隆抗体。
10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体、人源化单克隆抗体或人抗体。
11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单链抗体、Fab片段或Fab2片段。
12.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段被可检测地标记或缀合至毒素、治疗剂、聚合物、受体、酶或受体配体。
13.根据权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述聚合物是聚乙二醇(PEG)。
14.一种药物组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和任选的药学上可接受的载体或赋形剂。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述药物包含两种或更多种根据权利要求1至13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
16.根据权利要求14至15中任一项所述的药物组合物，其还包含第二治疗剂。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂包括抗炎剂或抗病毒剂。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述抗病毒剂包括：核苷类似物、类肽、寡肽、多肽、蛋白酶抑制剂、3C样蛋白酶抑制剂、木瓜蛋白酶样蛋白酶抑制剂或RNA依赖性RNA聚合酶的抑制剂。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述抗病毒剂选自：阿昔洛韦、更昔洛韦、阿糖腺苷、膦甲酸、西多福韦、金刚烷胺、利巴韦林、三氟胸苷、齐多夫定、去羟肌苷、扎西他滨和干扰素。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述干扰素是干扰素-α或干扰素-β。
21.根据权利要求14至20中任一项所述的药物组合物在制备用于因蜱传黄病毒感染引起的病况的诊断、预防、治疗或其组合的药物中的用途。
22.一种核酸分子，其编码权利要求1至13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的多肽链。
23.一种载体，其包含权利要求22所述的核酸分子。
24.一种培养的宿主细胞，其包含权利要求23所述的载体。
25.一种制备抗体或其抗原结合部分的方法，其包括：
获得权利要求24所述的培养的宿主细胞；
在培养基中在允许由载体编码的多肽的表达和抗体或其片段的组装的条件下培养所述培养的宿主细胞；和
从所述培养的细胞或细胞的培养基中纯化抗体或片段。
26.一种试剂盒，其包含药学上可接受的剂量单位的权利要求1至13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求14至20中任一项所述的药物组合物。
27.一种用于受试者中蜱传黄病毒感染的诊断、预后或监测治疗的试剂盒，其包含：权利要求1至13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；和至少一种特异性结合所述抗体或其抗原结合片段的检测试剂。
28.一种中和受试者中的蜱传黄病毒的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1至13中任一项所述的第一抗体或其抗原结合片段或治疗有效量的权利要求14至20中任一项所述的药物组合物。
29.一种预防或治疗蜱传黄病毒感染的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1至13中任一项所述的第一抗体或其抗原结合片段或治疗有效量的权利要求14至20中任一项所述的药物组合物。
30.根据权利要求28所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的第二抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗体或其抗原结合片段和所述第二抗体或其抗原结合片段表现出协同活性。
31.根据权利要求29所述的方法，其还包括向所述受试者施用治疗有效量的第二抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗体或其抗原结合片段和所述第二抗体或其抗原结合片段表现出协同活性。
32.根据权利要求30至31中任一项所述的方法，其中所述第一抗体或其抗原结合片段在所述第二抗体或其抗原结合片段之前、之后或同时施用。
33.根据权利要求28至32中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的第二治疗剂或疗法。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述第二治疗剂包括抗炎剂或抗病毒剂。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述抗病毒剂包括：核苷类似物、类肽、寡肽、多肽、蛋白酶抑制剂、3C样蛋白酶抑制剂、木瓜蛋白酶样蛋白酶抑制剂或RNA依赖性RNA聚合酶的抑制剂。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述抗病毒剂选自：阿昔洛韦、更昔洛韦、阿糖腺苷、膦甲酸、西多福韦、金刚烷胺、利巴韦林、三氟胸苷、齐多夫定、去羟肌苷、扎西他滨和干扰素。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述干扰素是干扰素-α或干扰素-β。
38.根据权利要求33至37中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段在第二治疗剂或疗法之前、之后或同时施用。
39.根据权利要求28至38中任一项所述的方法，其中将所述抗体或其抗原结合片段静脉内、皮下或腹膜内施用给所述受试者。
40.根据权利要求28至39中任一项所述的方法，其中预防性或治疗性地施用所述抗体或其抗原结合片段。
41.一种检测样品中蜱传黄病毒的存在的方法，其包括以下步骤：
使样品与权利要求1至13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触；和
确定所述抗体或抗原结合片段与一种或多种蜱传黄病毒抗原的结合，其中所述抗体与所述一种或多种蜱传黄病毒抗原的结合指示样品中蜱传黄病毒的存在。
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