JP2023551459A - ダニ媒介脳炎ウイルスおよび関連ウイルスに対する広域中和抗体 - Google Patents

ダニ媒介脳炎ウイルスおよび関連ウイルスに対する広域中和抗体 Download PDF

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Abstract

本開示は、新規な広域中和抗ダニ媒介脳炎ウイルス(TBEV)抗体を提供する。開示される抗TBEV抗体は、TBEVを含む様々なダニ媒介フラビウイルスによって引き起こされる疾患または感染を予防または治療するための新規な治療戦略を表す。

Description

連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号P01-AI138398お
よびU19-AI111825の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に対
して一定の権利を有する。
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりそのすべての開示全体が本明細書に組み込まれる、2020年1
1月25日に出願された米国仮出願第63/118,461号明細書の利益を主張する。
本発明は、ダニ媒介脳炎ウイルス(TBEV)を含む、ダニ媒介フラビウイルスのエピ
トープに対する抗体に関する。
ダニ媒介フラビウイルスは、致死性脳炎を含む一連の新興感染性疾患の原因である。他
のフラビウイルスと同様に、TBEVエンベロープ(E)は、3つの構造ドメインEDI
~IIIから構成される。ダニ媒介脳炎ウイルス(TBEV)は、ヒトの疾患を引き起こ
すダニによって伝染する7つのフラビウイルスのうちの1つである。年間10,000例
を超える症例が報告されており、近年では、発生率が増加し、新たな地理的地域で該疾患
が出現する傾向がある。
感染したダニの咬傷、または感染した動物由来の低温殺菌されていない乳の摂取は、イ
ンフルエンザ様症状の期間から始まり、続いて神経疾患(ダニ媒介脳炎、すなわち、TB
E)が発症する、二相性の疾病を引き起こす。TBEに対する具体的な治療法はなく、治
療は支持療法に限定される。生存している個体では、長期の続発症が一般的である。TB
EVワクチンが利用可能であるが、免疫は定期的な追加免疫を必要とし、ワクチン接種は
若齢者および高齢者ではあまり効果的ではない。ワクチン接種は、最大2年にわたって間
隔を空けた3回の別個の用量の投与を必要とし、3~5年の間隔でブースター投与が推奨
される。さらに、ワクチン接種の甲斐なく、ブレイクスルーTBEV感染が起こる。
したがって、TBEVなどのダニ媒介フラビウイルスによって引き起こされる疾患また
は感染の予防および治療に有効な、中和効力および範囲が改善された抗TBEV抗体が依
然として強く必要とされている。
本開示は、広域中和抗TBEV抗体またはその抗原結合断片を提供することによって、
いくつかの態様で上記の必要性に対処する。
一態様では、本開示は、TBEV抗原に特異的に結合する単離された抗TBEV抗体ま
たはその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態では、TBEV抗原は、Eタンパ
ク質のドメインIII(EDIII)の外側隆起部(lateral ridge)を含
む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、複数のTBEV株を中和
することができる。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、(i)表2A~I、3およ
び4のものから選択されるものに対して少なくとも75%の同一性を有するアミノ酸配列
を有する重鎖可変領域、または(ii)表2A~I、3および4のものから選択されるも
のに対して少なくとも75%の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む
。いくつかの例では、抗体またはその抗原結合断片は、(i)表2A~I、3および4の
ものから選択されるものの3つの重鎖CDR(HCDR1~3)、ならびに/または(i
i)表2A~I、3および4のものから選択されるものの3つの軽鎖CDR(LCDR1
~3)を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、表2A~I、
3および4のものから選択されるものの6つのCDRを含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号1、3、5、7、
9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35
、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、
63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、8
9、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111
、113、115または117のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の3つの重鎖相補性
決定領域(HCDR)(HCDR1、HCDR2およびHCDR3)と、配列番号2、4
、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32
、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、
60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、8
6、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、
110、112、114、116または118のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の3
つの軽鎖CDR(LCDR1、LCDR2およびLCDR3)とを含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号1、3、5、7、
9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35
、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、
63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、8
9、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111
、113、115もしくは117のアミノ酸配列に対して少なくとも75%の同一性を有
するアミノ酸配列を有するか、または配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、
17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、4
3、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69
、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、
97、99、101、103、105、107、109、111、113、115もしく
は117のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号2、4、6、8、10、12
、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、
40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、6
6、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92
、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、11
4、116もしくは118のアミノ酸配列に対して少なくとも75%の同一性を有するア
ミノ酸配列を有するか、または配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18
、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、
46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、7
2、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98
、100、102、104、106、108、110、112、114、116もしくは
118のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号1~2、3~4、
5~6、7~8、9~10、11~12、13~14、15~16、17~18、19~
20、21~22、23~24、25~26、27~28、29~30、31~32、3
3~34、35~36、37~38、39~40、41~42、43~44、45~46
、47~48、49~50、51~52、53~54、55~56、57~58、59~
60、61~62、63~64、65~66、67~68、69~70、71~72、7
3~74、75~76、77~78、79~80、81~82、83~84、85~86
、87~88、89~90、91~92、93~94、95~96、97~98、99~
100、101~102、103~104、105~106、107~108、109~
110、111~112、113~114、115~116、または117~118のそ
れぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、多価抗体、例えば、二価抗体または二重特異性抗体
である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、変異体Fc定常領域
をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの
実施形態では、抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはヒト化モノクローナル
抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、一本鎖抗体、Fab断片またはFab2
断片である。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、毒素、治療剤、高分子、受
容体、酵素または受容体リガンドに検出可能に標識またはコンジュゲートされる。いくつ
かの実施形態では、高分子はポリエチレングリコール(PEG)である。
別の態様では、本開示はまた、上記の抗体またはその抗原結合断片と、場合により薬学
的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、上記の抗体またはその抗原結合断片のうちの
2つ以上を含む。いくつかの例では、各抗体またはその抗原結合断片は、(i)表2A~
I、3および4のものから選択される抗体のHCDR1~3およびLCDR1~3、また
は(ii)表2A~I、3および4のものから選択される抗体のそれぞれのアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片のうちの2つ以上は、(1)(
i)表2A~I、3および4のものから選択される第1の抗体のそれぞれのアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む第1の抗体もしくはその抗原結合断片と、
(ii)表2A~I、3および4のものから選択される第2の抗体のそれぞれのアミノ酸
配列を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む第2の抗体もしくはその抗原結合断片
とを含む第1の抗体セット、または(2)(a)表2A~I、3および4のものから選択
される抗体のそれぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む第3
の抗体もしくはその抗原結合断片と、(b)表2A~I、3および4のものから選択され
る抗体のそれぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む第4の抗
体もしくはその抗原結合断片とを含む第2の抗体セットを含み、第3の抗体は、第4の抗
体とは異なる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、第2の治療剤をさらに含む。いくつかの実施
形態では、第2の治療剤は、抗炎症剤または抗ウイルス剤を含む。いくつかの実施形態で
は、抗ウイルス剤は、ヌクレオシド類似体、ペプトイド、オリゴペプチド、ポリペプチド
、プロテアーゼ阻害剤、3C様プロテアーゼ阻害剤、パパイン様プロテアーゼ阻害剤、ま
たはRNA依存性RNAポリメラーゼの阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、抗ウイ
ルス剤は、アシクロビル、ガンシクロビル、ビダラビン、ホスカルネット、シドホビル、
アマンタジン、リバビリン、トリフルオロチミジン、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタ
ビンまたはインターフェロンを含み得る。いくつかの実施形態では、インターフェロンは
、インターフェロン-αまたはインターフェロン-βである。
ダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)感染に起因する病態の診断、予防、治療
またはそれらの組合せのための医薬品の調製における記載される医薬組成物の使用も本開
示の範囲内である。
別の態様では、本開示はまた、(i)上記の抗体またはその抗原結合断片のポリペプチ
ド鎖をコードする核酸分子、(ii)記載される核酸分子を含むベクター、および(ii
i)記載されるベクターを含む培養された宿主細胞を提供する。
また、ポリペプチド(例えば、抗TBEV抗体)を産生する方法であって、(a)記載
の培養された宿主細胞を得ること、(b)ベクターによってコードされるポリペプチドを
発現させる、および抗体またはその断片を集合させる条件下で、培地中で、培養された宿
主細胞を培養すること、および(c)培養された細胞、または細胞の培地から、抗体また
は断片を精製することを含む方法も提供される。
別の態様では、本開示は、上記の抗体もしくはその抗原結合断片または医薬組成物の薬
学的に許容される用量単位を含むキットを提供する。対象におけるダニ媒介フラビウイル
ス(例えば、TBEV)の診断、予後、または治療のモニタリングのためのキットであっ
て、記載される抗体またはその抗原結合断片と、抗体またはその抗原結合断片に特異的に
結合する少なくとも1つの検出試薬とを含むキットも本開示の範囲内である。
さらに別の態様では、本開示は、対象においてダニ媒介脳炎ウイルス(例えば、TBE
V)を中和する方法をさらに提供する。該方法は、それを必要とする対象に、上記の抗体
もしくはその抗原結合断片の治療有効量または医薬組成物の治療有効量を投与することを
含む。
いくつかの実施形態では、対象においてダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)
を中和する方法は、それを必要とする対象に、上記の抗体または抗原結合断片の第1の抗
体またはその抗原結合断片および第2の抗体またはその抗原結合断片の治療有効量を投与
することを含み、第1の抗体またはその抗原結合断片および第2の抗体またはその抗原結
合断片は、上記の医薬組成物の相乗活性または治療有効量を示す。
さらに別の態様では、本開示は、ダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)感染を
予防または治療する方法をさらに提供する。該方法は、それを必要とする対象に、上記の
抗体もしくはその抗原結合断片の治療有効量または医薬組成物の治療有効量を投与するこ
とを含む。
いくつかの実施形態では、該方法は、それを必要とする対象に、上記の抗体または抗原
結合断片の第1の抗体またはその抗原結合断片および第2の抗体またはその抗原結合断片
の治療有効量を投与することを含み、第1の抗体またはその抗原結合断片および第2の抗
体またはその抗原結合断片は、上記の医薬組成物の相乗活性または治療有効量を示す。い
くつかの実施形態では、第1の抗体またはその抗原結合断片は、第2の抗体もしくはその
抗原結合断片の前、後、または第2の抗体もしくはその抗原結合断片と同時に投与される
いくつかの実施形態では、第1の抗体またはその抗原結合断片および第2の抗体または
その抗原結合断片は、表2A~I、3および4のものから選択される抗体のそれぞれのア
ミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片の
任意の組合せであり得る。
いくつかの実施形態では、第2の治療剤は、抗炎症剤または抗ウイルス剤を含む。いく
つかの実施形態では、抗ウイルス剤は、ヌクレオシド類似体、ペプトイド、オリゴペプチ
ド、ポリペプチド、プロテアーゼ阻害剤、3C様プロテアーゼ阻害剤、パパイン様プロテ
アーゼ阻害剤、またはRNA依存性RNAポリメラーゼの阻害剤を含む。いくつかの実施
形態では、抗ウイルス剤は、アシクロビル、ガンシクロビル、ビダラビン、ホスカルネッ
ト、シドホビル、アマンタジン、リバビリン、トリフルオロチミジン、ジドブジン、ジダ
ノシン、ザルシタビンまたはインターフェロンを含み得る。いくつかの実施形態では、イ
ンターフェロンは、インターフェロン-αまたはインターフェロン-βである。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、第2の治療剤もしくは治療
の前、後、または第2の治療剤もしくは治療と同時に投与される。いくつかの実施形態で
は、抗体またはその抗原結合断片は、対象に静脈内、皮下または腹腔内投与される。いく
つかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、予防的または治療的に投与される
別の態様では、本開示は、試料中のダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)の存
在を検出する方法であって、(i)試料を上記の抗体またはその抗原結合断片と接触させ
る工程と、(ii)1つ以上のダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)抗原への抗
体または抗原結合断片の結合を決定する工程とを含み、1つ以上のダニ媒介フラビウイル
ス(例えば、TBEV)抗原への抗体の結合が、試料中のダニ媒介フラビウイルス(例え
ば、TBEV)の存在を示す方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、試料は血
液試料である。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、標識にコンジュゲートされ
る。いくつかの実施形態では、検出する工程は、二次抗体を抗体またはその抗原結合断片
と接触させることを含み、二次抗体は標識を含む。いくつかの実施形態では、標識には、
蛍光標識、化学発光標識、放射性標識および酵素が含まれる。
いくつかの実施形態では、検出する工程は、蛍光または化学発光を検出することを含む
。いくつかの実施形態では、検出する工程は、競合結合アッセイまたはELISAを含む
いくつかの実施形態では、該方法は、試料を固体支持体に結合させることをさらに含む
。いくつかの実施形態では、固体支持体には、微粒子、マイクロビーズ、磁気ビーズおよ
び親和性精製カラムが含まれる。
前述の概要は、本開示のすべての態様を定義することを意図するものではなく、追加の
態様が、以下の詳細な説明などの他のセクションで説明される。文書全体は、統一された
開示として関連することが意図されており、特徴の組合せがこの文書の同じ文、または段
落、またはセクション内で一緒に見出されない場合であっても、本明細書に記載された特
徴のすべての組合せが企図されることを理解されたい。本発明の他の特徴および利点は、
以下の詳細な説明から明らかになるであろう。ただし、本開示の趣旨および範囲内の様々
な変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになるため、詳細な説明および特
定の例は、本開示の特定の実施形態を示しているが、単なる例示として与えられているこ
とを理解されたい。
図1A、1B、1C、1Dおよび1Eは、TBEV抗体について個体をスクリーニングした結果を示す一連の図である。図1Aは、ダニ媒介脳炎の臨床経過の概略図である。血清採取のおおよその時間(黄色)。図1Bは、TBEV EDIII IgG ELISAの結果を示す。グラフは、TBEV感染個体141例、TBEVワクチン接種者10例、および無作為血液ドナー168例(1:500希釈)由来の試料について、陰性対照血清と比較して光学密度測定(Y軸)を示す。一元配置ANOVA、続いてTukeyの検定によってp値を計算した。水平線は平均を示す。図1Cは、TBEV RVP中和スクリーニングの結果を示す。グラフは、無血清対照と比較して、TBEVレポーターウイルス粒子(RVP;二連ウェルの平均)に対するランク付けされた血清中和活性(1:600,000希釈)を示す。オレンジ色のボックス(左下)は、試験したTBEV感染個体141例およびTBEVワクチン接種者10例のうちの28の最良の中和剤を示す。p値は、両側Mann-Whitney検定によるものである。図1Dは、TBEV RVP中和曲線を示す。プロットは、図1Cからの28の最も強力な血清の各々について代表的な中和曲線を示す。それぞれ三連で行った2つの実験の代表。エラーバーは標準偏差を示す。図1Eは、上位28の個体について、ランク付けされた最大半量血清中和力価(NT50)を示す。2つの独立した実験の平均。図1Dおよび図1Eでは、オレンジ色は、抗体クローニングのための末梢血単核細胞のドナーを示す。 図1A、図1B、図1C、図1D、および図1Eは、TBEV抗体について個体をスクリーニングした結果を示す一連の図である。図1Aは、ダニ媒介脳炎の臨床経過の概略図である。血清採取のおおよその時間(黄色)。図1Bは、TBEV EDIII IgG ELISAの結果を示す。グラフは、TBEV感染個体141例、TBEVワクチン接種者10例、および無作為血液ドナー168例(1:500希釈)由来の試料について、陰性対照血清と比較して光学密度測定(Y軸)を示す。一元配置ANOVA、続いてTukeyの検定によってp値を計算した。水平線は平均を示す。図1Cは、TBEV RVP中和スクリーニングの結果を示す。グラフは、無血清対照と比較して、TBEVレポーターウイルス粒子(RVP;二連ウェルの平均)に対するランク付けされた血清中和活性(1:600,000希釈)を示す。オレンジ色のボックス(左下)は、試験したTBEV感染個体141例およびTBEVワクチン接種者10例のうちの28の最良の中和剤を示す。p値は、両側Mann-Whitney検定によるものである。図1Dは、TBEV RVP中和曲線を示す。プロットは、図1Cからの28の最も強力な血清の各々について代表的な中和曲線を示す。それぞれ三連で行った2つの実験の代表。エラーバーは標準偏差を示す。図1Eは、上位28の個体について、ランク付けされた最大半量血清中和力価(NT50)を示す。2つの独立した実験の平均。図1Dおよび図1Eでは、オレンジ色は、抗体クローニングのための末梢血単核細胞のドナーを示す。 図1A、図1B、図1C、図1D、および図1Eは、TBEV抗体について個体をスクリーニングした結果を示す一連の図である。図1Aは、ダニ媒介脳炎の臨床経過の概略図である。血清採取のおおよその時間(黄色)。図1Bは、TBEV EDIII IgG ELISAの結果を示す。グラフは、TBEV感染個体141例、TBEVワクチン接種者10例、および無作為血液ドナー168例(1:500希釈)由来の試料について、陰性対照血清と比較して光学密度測定(Y軸)を示す。一元配置ANOVA、続いてTukeyの検定によってp値を計算した。水平線は平均を示す。図1Cは、TBEV RVP中和スクリーニングの結果を示す。グラフは、無血清対照と比較して、TBEVレポーターウイルス粒子(RVP;二連ウェルの平均)に対するランク付けされた血清中和活性(1:600,000希釈)を示す。オレンジ色のボックス(左下)は、試験したTBEV感染個体141例およびTBEVワクチン接種者10例のうちの28の最良の中和剤を示す。p値は、両側Mann-Whitney検定によるものである。図1Dは、TBEV RVP中和曲線を示す。プロットは、図1Cからの28の最も強力な血清の各々について代表的な中和曲線を示す。それぞれ三連で行った2つの実験の代表。エラーバーは標準偏差を示す。図1Eは、上位28の個体について、ランク付けされた最大半量血清中和力価(NT50)を示す。2つの独立した実験の平均。図1Dおよび図1Eでは、オレンジ色は、抗体クローニングのための末梢血単核細胞のドナーを示す。 図2A、図2B、図2C、図2D、図2E、図2F、図2G、図2H、図2I、図2J、図2K、図2L、図2M、図2N、および図2Oは、ワクチン接種者における臨床的相関および血清中和を示す一連の図である。図2A、図2B、図2C、図2D、図2Eおよび図2Fは、背景因子情報および利用可能な臨床情報に対してプロットされた血清TBEV EDIII ELISAデータ(IgG)を示す。図2G、図2H、図2Iおよび図2Lは、背景因子情報および利用可能な臨床情報に対してプロットされた血清TBEV RVP中和データを示す。図2Cおよび図2Iは、疾患の重症度を示す。図2Dおよび図2Jは、入院時に測定されたIgM力価(IP)を示す。図2Eおよび図2Kは、入院時に測定されたIgG力価(ウイーン単位(Vienna unit)/mL)を示す。図2A、図2B、図2D、図2E、図2G、図2H、図2Jおよび図2Kでは両側p検定を使用して、図2Lおよび図2FではMann-Whitney検定を使用して、図2Cおよび図2IではTukeyの検定を用いた一元配置ANOVAを使用して、統計的有意性を計算した。図2Mは、血清TBEV EDIII ELISA(IgG)とRVP中和データとの間の相関を示す。図2Nは、ワクチン接種PBMCドナー由来の血清によるTBEV RVP中和曲線を示す。三連での2つの実験の代表。標準偏差を伴う平均。図2Oは、感染ドナーおよびワクチン接種PBMCドナー全例に関する血清NT50の要約である。 図2A、図2B、図2C、図2D、図2E、図2F、図2G、図2H、図2I、図2J、図2K、図2L、図2M、図2N、および図2Oは、ワクチン接種者における臨床的相関および血清中和を示す一連の図である。図2A、図2B、図2C、図2D、図2Eおよび図2Fは、背景因子情報および利用可能な臨床情報に対してプロットされた血清TBEV EDIII ELISAデータ(IgG)を示す。図2G、図2H、図2Iおよび図2Lは、背景因子情報および利用可能な臨床情報に対してプロットされた血清TBEV RVP中和データを示す。図2Cおよび図2Iは、疾患の重症度を示す。図2Dおよび図2Jは、入院時に測定されたIgM力価(IP)を示す。図2Eおよび図2Kは、入院時に測定されたIgG力価(ウイーン単位(Vienna unit)/mL)を示す。図2A、図2B、図2D、図2E、図2G、図2H、図2Jおよび図2Kでは両側p検定を使用して、図2Lおよび図2FではMann-Whitney検定を使用して、図2Cおよび図2IではTukeyの検定を用いた一元配置ANOVAを使用して、統計的有意性を計算した。図2Mは、血清TBEV EDIII ELISA(IgG)とRVP中和データとの間の相関を示す。図2Nは、ワクチン接種PBMCドナー由来の血清によるTBEV RVP中和曲線を示す。三連での2つの実験の代表。標準偏差を伴う平均。図2Oは、感染ドナーおよびワクチン接種PBMCドナー全例に関する血清NT50の要約である。 図2A、図2B、図2C、図2D、図2E、図2F、図2G、図2H、図2I、図2J、図2K、図2L、図2M、図2N、および図2Oは、ワクチン接種者における臨床的相関および血清中和を示す一連の図である。図2A、図2B、図2C、図2D、図2Eおよび図2Fは、背景因子情報および利用可能な臨床情報に対してプロットされた血清TBEV EDIII ELISAデータ(IgG)を示す。図2G、図2H、図2Iおよび図2Lは、背景因子情報および利用可能な臨床情報に対してプロットされた血清TBEV RVP中和データを示す。図2Cおよび図2Iは、疾患の重症度を示す。図2Dおよび図2Jは、入院時に測定されたIgM力価(IP)を示す。図2Eおよび図2Kは、入院時に測定されたIgG力価(ウイーン単位(Vienna unit)/mL)を示す。図2A、図2B、図2D、図2E、図2G、図2H、図2Jおよび図2Kでは両側p検定を使用して、図2Lおよび図2FではMann-Whitney検定を使用して、図2Cおよび図2IではTukeyの検定を用いた一元配置ANOVAを使用して、統計的有意性を計算した。図2Mは、血清TBEV EDIII ELISA(IgG)とRVP中和データとの間の相関を示す。図2Nは、ワクチン接種PBMCドナー由来の血清によるTBEV RVP中和曲線を示す。三連での2つの実験の代表。標準偏差を伴う平均。図2Oは、感染ドナーおよびワクチン接種PBMCドナー全例に関する血清NT50の要約である。 図3A、図3B、図3C、および図3Dは、感染個体およびワクチン接種個体から得られた抗TBEV抗体を示す一連の図である。図3Aは、感染ドナー由来のTBEV特異的B細胞の同定を示す。対照1例およびTBEV感染ドナー6例におけるAF647およびPE標識TBEV EDIIIに結合するB細胞を示す代表的なフローサイトメトリープロット。数字は、二重陽性B細胞のパーセンテージを示す。ゲーティング戦略を図4Aに示す。図3Bは、抗体配列のクローン分析を示す。円グラフは、抗体配列の分布を示す。中央の数字は、得られた抗体配列の総数を表す。色付きまたは灰色の扇形は、クローン関連配列に対応し、扇形のサイズは配列の数に比例する。青色の扇形はいずれもIGVH1-69であり、赤色の扇形はいずれもIGVH3-48/IGVK1-5である。白色の扇形は、クローン(シングレット)の一部ではない抗体配列に対応する。図3Cおよび図3Dは、図3Aおよび図3Bと同じであるが、健常対照1例およびワクチン接種ドナー3例に関するものである。図3Eは、抗体配列の関連性を示す。Circosプロットは、図3Bおよび図3Dのように色分けされた、ドナー全例から得られた配列を示す。接続線は、IGH VおよびJ遺伝子ならびにIGL VおよびJ遺伝子を共有する抗体を示す。紫色、緑色および灰色の線は、それぞれ、関連するクローンを互いに、クローンをシングレットに、およびシングレットをシングレットに接続する。 図3A、図3B、図3C、および図3Dは、感染個体およびワクチン接種個体から得られた抗TBEV抗体を示す一連の図である。図3Aは、感染ドナー由来のTBEV特異的B細胞の同定を示す。対照1例およびTBEV感染ドナー6例におけるAF647およびPE標識TBEV EDIIIに結合するB細胞を示す代表的なフローサイトメトリープロット。数字は、二重陽性B細胞のパーセンテージを示す。ゲーティング戦略を図4Aに示す。図3Bは、抗体配列のクローン分析を示す。円グラフは、抗体配列の分布を示す。中央の数字は、得られた抗体配列の総数を表す。色付きまたは灰色の扇形は、クローン関連配列に対応し、扇形のサイズは配列の数に比例する。青色の扇形はいずれもIGVH1-69であり、赤色の扇形はいずれもIGVH3-48/IGVK1-5である。白色の扇形は、クローン(シングレット)の一部ではない抗体配列に対応する。図3Cおよび図3Dは、図3Aおよび図3Bと同じであるが、健常対照1例およびワクチン接種ドナー3例に関するものである。図3Eは、抗体配列の関連性を示す。Circosプロットは、図3Bおよび図3Dのように色分けされた、ドナー全例から得られた配列を示す。接続線は、IGH VおよびJ遺伝子ならびにIGL VおよびJ遺伝子を共有する抗体を示す。紫色、緑色および灰色の線は、それぞれ、関連するクローンを互いに、クローンをシングレットに、およびシングレットをシングレットに接続する。 図4A、図4B、図4C、図4D、図4E、図4F、図4G、図4H、および図4Iは、選別戦略および抗体配列分析を示す一連の図である。図4Aは、選別戦略を示す。前方散乱および側方散乱を使用して、単一リンパ球をゲーティングした。ダンプチャネルには、CD3、CD8、CD14、CD16および生存色素を含めた。オボアルブミンに結合しなかったが(OVA)、PEおよびAF647フルオロフォアの両方と結合したTBEV EDIIIベイトに結合したCD20B細胞を精製した。図4Bは、各ドナーについて、V遺伝子体細胞ヌクレオチド変異の数(左)と、CDR3のアミノ酸長(右)とを示す。図4Cは図4Bと同様であるが、ドナー全例を合わせたものである。図4Bおよび図4Cでは、水平線は平均を示す。図4は、ヒトレパートリーと比較した、合わせたドナー全例由来の抗体のIGH CDR3での疎水性GRAVYスコアの分布を示す(Briney,B.,et al.,(2019)Nature 566,393-397)。図4Eは、ヒトレパートリーと比較した、感染ドナー由来のTBEV抗体におけるV重鎖遺伝子使用頻度を示す棒グラフを示す(Rubelt,F.,et al.,(2012)PLoS One 7,e49774)。図4Fおよび図4Gは、図4Eと同様であるが、VκおよびVλ遺伝子に関する。図4E、図4Fおよび図4Gでは、オレンジ色はこの試験で単離された抗TBEV抗体を示し、青色は対照レパートリーを示す。不等分散を用いた両側t検定を使用して計算したp値。図4Hは、WebLogoによって生成された、感染ドナー由来の抗体CDR3の配列ロゴを示す。スタックの高さは、所与の位置での配列保存を示し、スタック内の文字の高さは、その位置での各アミノ酸の相対頻度を示す。図4Iは、複数のドナーにわたって見られる極めて類似した抗体配列の例を示す。 図4A、図4B、図4C、図4D、図4E、図4F、図4G、図4H、および図4Iは、選別戦略および抗体配列分析を示す一連の図である。図4Aは、選別戦略を示す。前方散乱および側方散乱を使用して、単一リンパ球をゲーティングした。ダンプチャネルには、CD3、CD8、CD14、CD16および生存色素を含めた。オボアルブミンに結合しなかったが(OVA)、PEおよびAF647フルオロフォアの両方と結合したTBEV EDIIIベイトに結合したCD20B細胞を精製した。図4Bは、各ドナーについて、V遺伝子体細胞ヌクレオチド変異の数(左)と、CDR3のアミノ酸長(右)とを示す。図4Cは図4Bと同様であるが、ドナー全例を合わせたものである。図4Bおよび図4Cでは、水平線は平均を示す。図4は、ヒトレパートリーと比較した、合わせたドナー全例由来の抗体のIGH CDR3での疎水性GRAVYスコアの分布を示す(Briney,B.,et al.,(2019)Nature 566,393-397)。図4Eは、ヒトレパートリーと比較した、感染ドナー由来のTBEV抗体におけるV重鎖遺伝子使用頻度を示す棒グラフを示す(Rubelt,F.,et al.,(2012)PLoS One 7,e49774)。図4Fおよび図4Gは、図4Eと同様であるが、VκおよびVλ遺伝子に関する。図4E、図4Fおよび図4Gでは、オレンジ色はこの試験で単離された抗TBEV抗体を示し、青色は対照レパートリーを示す。不等分散を用いた両側t検定を使用して計算したp値。図4Hは、WebLogoによって生成された、感染ドナー由来の抗体CDR3の配列ロゴを示す。スタックの高さは、所与の位置での配列保存を示し、スタック内の文字の高さは、その位置での各アミノ酸の相対頻度を示す。図4Iは、複数のドナーにわたって見られる極めて類似した抗体配列の例を示す。 図4A、図4B、図4C、図4D、図4E、図4F、図4G、図4H、および図4Iは、選別戦略および抗体配列分析を示す一連の図である。図4Aは、選別戦略を示す。前方散乱および側方散乱を使用して、単一リンパ球をゲーティングした。ダンプチャネルには、CD3、CD8、CD14、CD16および生存色素を含めた。オボアルブミンに結合しなかったが(OVA)、PEおよびAF647フルオロフォアの両方と結合したTBEV EDIIIベイトに結合したCD20B細胞を精製した。図4Bは、各ドナーについて、V遺伝子体細胞ヌクレオチド変異の数(左)と、CDR3のアミノ酸長(右)とを示す。図4Cは図4Bと同様であるが、ドナー全例を合わせたものである。図4Bおよび図4Cでは、水平線は平均を示す。図4は、ヒトレパートリーと比較した、合わせたドナー全例由来の抗体のIGH CDR3での疎水性GRAVYスコアの分布を示す(Briney,B.,et al.,(2019)Nature 566,393-397)。図4Eは、ヒトレパートリーと比較した、感染ドナー由来のTBEV抗体におけるV重鎖遺伝子使用頻度を示す棒グラフを示す(Rubelt,F.,et al.,(2012)PLoS One 7,e49774)。図4Fおよび図4Gは、図4Eと同様であるが、VκおよびVλ遺伝子に関する。図4E、図4Fおよび図4Gでは、オレンジ色はこの試験で単離された抗TBEV抗体を示し、青色は対照レパートリーを示す。不等分散を用いた両側t検定を使用して計算したp値。図4Hは、WebLogoによって生成された、感染ドナー由来の抗体CDR3の配列ロゴを示す。スタックの高さは、所与の位置での配列保存を示し、スタック内の文字の高さは、その位置での各アミノ酸の相対頻度を示す。図4Iは、複数のドナーにわたって見られる極めて類似した抗体配列の例を示す。 図4A、図4B、図4C、図4D、図4E、図4F、図4G、図4H、および図4Iは、選別戦略および抗体配列分析を示す一連の図である。図4Aは、選別戦略を示す。前方散乱および側方散乱を使用して、単一リンパ球をゲーティングした。ダンプチャネルには、CD3、CD8、CD14、CD16および生存色素を含めた。オボアルブミンに結合しなかったが(OVA)、PEおよびAF647フルオロフォアの両方と結合したTBEV EDIIIベイトに結合したCD20B細胞を精製した。図4Bは、各ドナーについて、V遺伝子体細胞ヌクレオチド変異の数(左)と、CDR3のアミノ酸長(右)とを示す。図4Cは図4Bと同様であるが、ドナー全例を合わせたものである。図4Bおよび図4Cでは、水平線は平均を示す。図4は、ヒトレパートリーと比較した、合わせたドナー全例由来の抗体のIGH CDR3での疎水性GRAVYスコアの分布を示す(Briney,B.,et al.,(2019)Nature 566,393-397)。図4Eは、ヒトレパートリーと比較した、感染ドナー由来のTBEV抗体におけるV重鎖遺伝子使用頻度を示す棒グラフを示す(Rubelt,F.,et al.,(2012)PLoS One 7,e49774)。図4Fおよび図4Gは、図4Eと同様であるが、VκおよびVλ遺伝子に関する。図4E、図4Fおよび図4Gでは、オレンジ色はこの試験で単離された抗TBEV抗体を示し、青色は対照レパートリーを示す。不等分散を用いた両側t検定を使用して計算したp値。図4Hは、WebLogoによって生成された、感染ドナー由来の抗体CDR3の配列ロゴを示す。スタックの高さは、所与の位置での配列保存を示し、スタック内の文字の高さは、その位置での各アミノ酸の相対頻度を示す。図4Iは、複数のドナーにわたって見られる極めて類似した抗体配列の例を示す。 図4A、図4B、図4C、図4D、図4E、図4F、図4G、図4H、および図4Iは、選別戦略および抗体配列分析を示す一連の図である。図4Aは、選別戦略を示す。前方散乱および側方散乱を使用して、単一リンパ球をゲーティングした。ダンプチャネルには、CD3、CD8、CD14、CD16および生存色素を含めた。オボアルブミンに結合しなかったが(OVA)、PEおよびAF647フルオロフォアの両方と結合したTBEV EDIIIベイトに結合したCD20B細胞を精製した。図4Bは、各ドナーについて、V遺伝子体細胞ヌクレオチド変異の数(左)と、CDR3のアミノ酸長(右)とを示す。図4Cは図4Bと同様であるが、ドナー全例を合わせたものである。図4Bおよび図4Cでは、水平線は平均を示す。図4は、ヒトレパートリーと比較した、合わせたドナー全例由来の抗体のIGH CDR3での疎水性GRAVYスコアの分布を示す(Briney,B.,et al.,(2019)Nature 566,393-397)。図4Eは、ヒトレパートリーと比較した、感染ドナー由来のTBEV抗体におけるV重鎖遺伝子使用頻度を示す棒グラフを示す(Rubelt,F.,et al.,(2012)PLoS One 7,e49774)。図4Fおよび図4Gは、図4Eと同様であるが、VκおよびVλ遺伝子に関する。図4E、図4Fおよび図4Gでは、オレンジ色はこの試験で単離された抗TBEV抗体を示し、青色は対照レパートリーを示す。不等分散を用いた両側t検定を使用して計算したp値。図4Hは、WebLogoによって生成された、感染ドナー由来の抗体CDR3の配列ロゴを示す。スタックの高さは、所与の位置での配列保存を示し、スタック内の文字の高さは、その位置での各アミノ酸の相対頻度を示す。図4Iは、複数のドナーにわたって見られる極めて類似した抗体配列の例を示す。 図4A、図4B、図4C、図4D、図4E、図4F、図4G、図4H、および図4Iは、選別戦略および抗体配列分析を示す一連の図である。図4Aは、選別戦略を示す。前方散乱および側方散乱を使用して、単一リンパ球をゲーティングした。ダンプチャネルには、CD3、CD8、CD14、CD16および生存色素を含めた。オボアルブミンに結合しなかったが(OVA)、PEおよびAF647フルオロフォアの両方と結合したTBEV EDIIIベイトに結合したCD20B細胞を精製した。図4Bは、各ドナーについて、V遺伝子体細胞ヌクレオチド変異の数(左)と、CDR3のアミノ酸長(右)とを示す。図4Cは図4Bと同様であるが、ドナー全例を合わせたものである。図4Bおよび図4Cでは、水平線は平均を示す。図4は、ヒトレパートリーと比較した、合わせたドナー全例由来の抗体のIGH CDR3での疎水性GRAVYスコアの分布を示す(Briney,B.,et al.,(2019)Nature 566,393-397)。図4Eは、ヒトレパートリーと比較した、感染ドナー由来のTBEV抗体におけるV重鎖遺伝子使用頻度を示す棒グラフを示す(Rubelt,F.,et al.,(2012)PLoS One 7,e49774)。図4Fおよび図4Gは、図4Eと同様であるが、VκおよびVλ遺伝子に関する。図4E、図4Fおよび図4Gでは、オレンジ色はこの試験で単離された抗TBEV抗体を示し、青色は対照レパートリーを示す。不等分散を用いた両側t検定を使用して計算したp値。図4Hは、WebLogoによって生成された、感染ドナー由来の抗体CDR3の配列ロゴを示す。スタックの高さは、所与の位置での配列保存を示し、スタック内の文字の高さは、その位置での各アミノ酸の相対頻度を示す。図4Iは、複数のドナーにわたって見られる極めて類似した抗体配列の例を示す。 図4A、図4B、図4C、図4D、図4E、図4F、図4G、図4H、および図4Iは、選別戦略および抗体配列分析を示す一連の図である。図4Aは、選別戦略を示す。前方散乱および側方散乱を使用して、単一リンパ球をゲーティングした。ダンプチャネルには、CD3、CD8、CD14、CD16および生存色素を含めた。オボアルブミンに結合しなかったが(OVA)、PEおよびAF647フルオロフォアの両方と結合したTBEV EDIIIベイトに結合したCD20B細胞を精製した。図4Bは、各ドナーについて、V遺伝子体細胞ヌクレオチド変異の数(左)と、CDR3のアミノ酸長(右)とを示す。図4Cは図4Bと同様であるが、ドナー全例を合わせたものである。図4Bおよび図4Cでは、水平線は平均を示す。図4は、ヒトレパートリーと比較した、合わせたドナー全例由来の抗体のIGH CDR3での疎水性GRAVYスコアの分布を示す(Briney,B.,et al.,(2019)Nature 566,393-397)。図4Eは、ヒトレパートリーと比較した、感染ドナー由来のTBEV抗体におけるV重鎖遺伝子使用頻度を示す棒グラフを示す(Rubelt,F.,et al.,(2012)PLoS One 7,e49774)。図4Fおよび図4Gは、図4Eと同様であるが、VκおよびVλ遺伝子に関する。図4E、図4Fおよび図4Gでは、オレンジ色はこの試験で単離された抗TBEV抗体を示し、青色は対照レパートリーを示す。不等分散を用いた両側t検定を使用して計算したp値。図4Hは、WebLogoによって生成された、感染ドナー由来の抗体CDR3の配列ロゴを示す。スタックの高さは、所与の位置での配列保存を示し、スタック内の文字の高さは、その位置での各アミノ酸の相対頻度を示す。図4Iは、複数のドナーにわたって見られる極めて類似した抗体配列の例を示す。 図4A、図4B、図4C、図4D、図4E、図4F、図4G、図4H、および図4Iは、選別戦略および抗体配列分析を示す一連の図である。図4Aは、選別戦略を示す。前方散乱および側方散乱を使用して、単一リンパ球をゲーティングした。ダンプチャネルには、CD3、CD8、CD14、CD16および生存色素を含めた。オボアルブミンに結合しなかったが(OVA)、PEおよびAF647フルオロフォアの両方と結合したTBEV EDIIIベイトに結合したCD20B細胞を精製した。図4Bは、各ドナーについて、V遺伝子体細胞ヌクレオチド変異の数(左)と、CDR3のアミノ酸長(右)とを示す。図4Cは図4Bと同様であるが、ドナー全例を合わせたものである。図4Bおよび図4Cでは、水平線は平均を示す。図4は、ヒトレパートリーと比較した、合わせたドナー全例由来の抗体のIGH CDR3での疎水性GRAVYスコアの分布を示す(Briney,B.,et al.,(2019)Nature 566,393-397)。図4Eは、ヒトレパートリーと比較した、感染ドナー由来のTBEV抗体におけるV重鎖遺伝子使用頻度を示す棒グラフを示す(Rubelt,F.,et al.,(2012)PLoS One 7,e49774)。図4Fおよび図4Gは、図4Eと同様であるが、VκおよびVλ遺伝子に関する。図4E、図4Fおよび図4Gでは、オレンジ色はこの試験で単離された抗TBEV抗体を示し、青色は対照レパートリーを示す。不等分散を用いた両側t検定を使用して計算したp値。図4Hは、WebLogoによって生成された、感染ドナー由来の抗体CDR3の配列ロゴを示す。スタックの高さは、所与の位置での配列保存を示し、スタック内の文字の高さは、その位置での各アミノ酸の相対頻度を示す。図4Iは、複数のドナーにわたって見られる極めて類似した抗体配列の例を示す。 図4A、図4B、図4C、図4D、図4E、図4F、図4G、図4H、および図4Iは、選別戦略および抗体配列分析を示す一連の図である。図4Aは、選別戦略を示す。前方散乱および側方散乱を使用して、単一リンパ球をゲーティングした。ダンプチャネルには、CD3、CD8、CD14、CD16および生存色素を含めた。オボアルブミンに結合しなかったが(OVA)、PEおよびAF647フルオロフォアの両方と結合したTBEV EDIIIベイトに結合したCD20B細胞を精製した。図4Bは、各ドナーについて、V遺伝子体細胞ヌクレオチド変異の数(左)と、CDR3のアミノ酸長(右)とを示す。図4Cは図4Bと同様であるが、ドナー全例を合わせたものである。図4Bおよび図4Cでは、水平線は平均を示す。図4は、ヒトレパートリーと比較した、合わせたドナー全例由来の抗体のIGH CDR3での疎水性GRAVYスコアの分布を示す(Briney,B.,et al.,(2019)Nature 566,393-397)。図4Eは、ヒトレパートリーと比較した、感染ドナー由来のTBEV抗体におけるV重鎖遺伝子使用頻度を示す棒グラフを示す(Rubelt,F.,et al.,(2012)PLoS One 7,e49774)。図4Fおよび図4Gは、図4Eと同様であるが、VκおよびVλ遺伝子に関する。図4E、図4Fおよび図4Gでは、オレンジ色はこの試験で単離された抗TBEV抗体を示し、青色は対照レパートリーを示す。不等分散を用いた両側t検定を使用して計算したp値。図4Hは、WebLogoによって生成された、感染ドナー由来の抗体CDR3の配列ロゴを示す。スタックの高さは、所与の位置での配列保存を示し、スタック内の文字の高さは、その位置での各アミノ酸の相対頻度を示す。図4Iは、複数のドナーにわたって見られる極めて類似した抗体配列の例を示す。 図5A、図5B、図5C、図5D、図5E、図5F、および図5Gは、強力かつ広範囲に交差反応性のモノクローナル抗体の同定を示す一連の図である。図5Aは、感染個体およびワクチン接種個体由来の46個および13個のモノクローナル抗体に関するTBEVWE EDIII ELISA結合曲線をそれぞれ示す。データは、2つの実験の代表である。点線は、10-1074アイソタイプ対照である。図5Bは、3つのTBEV系統EDIII:TBEVWE、TBEVFEおよびTBEVSIに対する図5Aの抗体のEC50値を要約するドットプロットを示す。2つの実験の平均。水平線は平均値を示す。図5Cは、無抗体対照に対して正規化された、図5Aの抗体のRVP中和曲線を示す。データは、それぞれ三連で行った2つの実験の代表である。エラーバーは標準偏差を示す。図5Dは、A.2つの実験の平均における抗体によるTBEVWE RVP中和に関する平均最大半量阻害濃度(IC50)を要約するドットプロットを示す。水平線は平均IC50を示す。両側Mann-Whitney検定によって統計的な差は見られなかった。図5Eおよび図5Fは、インビトロでのTBEV中和を示す。図5Eでは、曲線は、段階希釈抗体によるウイルス中和を表す。八連で行った2つの独立した実験の代表。図5Fでは、示された抗体の存在下で感染したPS細胞の代表的な免疫蛍光顕微鏡画像。緑色はウイルス抗原であり、青色は細胞核である。スケールバーは200μmを示す。図5Gは、抗TBEV抗体による交差中和を示す。グラフは、ポワッサンLBウイルス(POWV-LB)、ポワッサンDTVウイルス(POWV-DTV)、キャサヌール森林病ウイルス(KFDV)、ランガットウイルス(LGTV)、跳躍病ウイルス(LIV)およびオムスク出血熱ウイルス(OHFV)に対応するRVPに対する選択された抗体のIC50を示す。2つの独立した実験の平均。水平線は平均IC50を示す。図5A、図5B、図5C、図5Dおよび図5Eでは、青色および赤色は、感染ドナー由来IGVH1-69/κ抗体およびIGVH3-48/IGVK1-5抗体を示し、紫色は、ワクチン接種個体由来のIGHV1-69/κ抗体を示す。抗体T036およびT025をそれぞれ黄色およびオレンジ色で示す。図5B、図5Dおよび図5Gでは、黒丸および三角形は、それぞれ感染ドナーまたはワクチン接種ドナーに由来する抗体に対応する。 図5A、図5B、図5C、図5D、図5E、図5F、および図5Gは、強力かつ広範囲に交差反応性のモノクローナル抗体の同定を示す一連の図である。図5Aは、感染個体およびワクチン接種個体由来の46個および13個のモノクローナル抗体に関するTBEVWE EDIII ELISA結合曲線をそれぞれ示す。データは、2つの実験の代表である。点線は、10-1074アイソタイプ対照である。図5Bは、3つのTBEV系統EDIII:TBEVWE、TBEVFEおよびTBEVSIに対する図5Aの抗体のEC50値を要約するドットプロットを示す。2つの実験の平均。水平線は平均値を示す。図5Cは、無抗体対照に対して正規化された、図5Aの抗体のRVP中和曲線を示す。データは、それぞれ三連で行った2つの実験の代表である。エラーバーは標準偏差を示す。図5Dは、A.2つの実験の平均における抗体によるTBEVWE RVP中和に関する平均最大半量阻害濃度(IC50)を要約するドットプロットを示す。水平線は平均IC50を示す。両側Mann-Whitney検定によって統計的な差は見られなかった。図5Eおよび図5Fは、インビトロでのTBEV中和を示す。図5Eでは、曲線は、段階希釈抗体によるウイルス中和を表す。八連で行った2つの独立した実験の代表。図5Fでは、示された抗体の存在下で感染したPS細胞の代表的な免疫蛍光顕微鏡画像。緑色はウイルス抗原であり、青色は細胞核である。スケールバーは200μmを示す。図5Gは、抗TBEV抗体による交差中和を示す。グラフは、ポワッサンLBウイルス(POWV-LB)、ポワッサンDTVウイルス(POWV-DTV)、キャサヌール森林病ウイルス(KFDV)、ランガットウイルス(LGTV)、跳躍病ウイルス(LIV)およびオムスク出血熱ウイルス(OHFV)に対応するRVPに対する選択された抗体のIC50を示す。2つの独立した実験の平均。水平線は平均IC50を示す。図5A、図5B、図5C、図5Dおよび図5Eでは、青色および赤色は、感染ドナー由来IGVH1-69/κ抗体およびIGVH3-48/IGVK1-5抗体を示し、紫色は、ワクチン接種個体由来のIGHV1-69/κ抗体を示す。抗体T036およびT025をそれぞれ黄色およびオレンジ色で示す。図5B、図5Dおよび図5Gでは、黒丸および三角形は、それぞれ感染ドナーまたはワクチン接種ドナーに由来する抗体に対応する。 図6A、図6B、図6C、図6D、図6E、図6F、図6G、図6H、および図6Iは、抗体の結合および中和を示す一連の図である。図6Aは、59個の抗体に関するTBEVFEおよびTBEVSi EDIIIに対するELISA結合曲線を示す。データは2つの実験の代表である。図6Bは、ポワッサンLBウイルス(POWV-LB)、ポワッサンシカダニウイルス(POWV-DTV)、キャサヌール森林病ウイルス(KFDV)、ランガットウイルス(LGTV)、跳躍病ウイルス(LIV)およびオムスク出血熱ウイルス(OHFV)を含むダニ媒介フラビウイルスEDIIIのパネルに結合する抗体のスクリーニングを示す。抗体を1μg/mLで二連でスクリーニングした。灰色は、対照を上回る結合を示す。図6Cは、図6Bと同じダニ媒介フラビウイルスのパネルに対応するRVPに対する抗体中和に関するスクリーニングを示す。抗体を1μg/mLで三連でスクリーニングした。灰色は、対照を上回る結合を示す。図6D、図6E、図6F、図6G、図6Hおよび図6Iは、TBEV以外のダニ媒介フラビウイルスRVPに対する選択された抗体の中和曲線を示す。三連での2つの実験の代表。 図6A、図6B、図6C、図6D、図6E、図6F、図6G、図6H、および図6Iは、抗体の結合および中和を示す一連の図である。図6Aは、59個の抗体に関するTBEVFEおよびTBEVSi EDIIIに対するELISA結合曲線を示す。データは2つの実験の代表である。図6Bは、ポワッサンLBウイルス(POWV-LB)、ポワッサンシカダニウイルス(POWV-DTV)、キャサヌール森林病ウイルス(KFDV)、ランガットウイルス(LGTV)、跳躍病ウイルス(LIV)およびオムスク出血熱ウイルス(OHFV)を含むダニ媒介フラビウイルスEDIIIのパネルに結合する抗体のスクリーニングを示す。抗体を1μg/mLで二連でスクリーニングした。灰色は、対照を上回る結合を示す。図6Cは、図6Bと同じダニ媒介フラビウイルスのパネルに対応するRVPに対する抗体中和に関するスクリーニングを示す。抗体を1μg/mLで三連でスクリーニングした。灰色は、対照を上回る結合を示す。図6D、図6E、図6F、図6G、図6Hおよび図6Iは、TBEV以外のダニ媒介フラビウイルスRVPに対する選択された抗体の中和曲線を示す。三連での2つの実験の代表。 図7A、図7B、図7C、図7D、および図7Eは、T036がTBEV感染を増強することを示す一連の図である。図7Aは、T036 IgG、F(ab’)2およびF(ab)の存在下でのTBEV RVP感染の用量依存的増強を示す。三連で行われた2つの実験の代表。エラーバーは標準偏差を示す。図7Bは、ウイルス力価の増強を示す。プロットは、中和抗体T038、増強抗体T036またはアイソタイプ対照10-1074の存在下でPS細胞を24または48時間インキュベートした後のHypr-TBEVウイルス力価を示す。一元配置ANOVAおよびTukeyの検定を使用してp値を計算した。破線は、アッセイの検出限界を表す。図7C。ウイルス抗原の検出の増強。示された量のT036、T038または10-1074対照の存在下でHypr-TBEVに感染したPS細胞の代表的な顕微鏡画像。スケールバーは200μmを示す。図7Dおよび図7E。融合ループ結合抗体4G2は、T036による増強作用を遮断する。図7Dでは、抗体4G2、T036、またはT036と組み合わせた4G2の存在下での、無抗体対照と比較したTBEV RVP感染。2つの実験の代表。図7Eでは、4G2、T036、または4G2とT036との組合せの存在下での、PS細胞をHypr-TBEVに感染させた後の細胞プラーク数。図7Dおよび図7Eでは、一元配置ANOVAおよびTukeyの検定を使用してp値を計算した。Dのエラーバーは、三連の標準偏差を示す。 図7A、図7B、図7C、図7D、および図7Eは、T036がTBEV感染を増強することを示す一連の図である。図7Aは、T036 IgG、F(ab’)2およびF(ab)の存在下でのTBEV RVP感染の用量依存的増強を示す。三連で行われた2つの実験の代表。エラーバーは標準偏差を示す。図7Bは、ウイルス力価の増強を示す。プロットは、中和抗体T038、増強抗体T036またはアイソタイプ対照10-1074の存在下でPS細胞を24または48時間インキュベートした後のHypr-TBEVウイルス力価を示す。一元配置ANOVAおよびTukeyの検定を使用してp値を計算した。破線は、アッセイの検出限界を表す。図7C。ウイルス抗原の検出の増強。示された量のT036、T038または10-1074対照の存在下でHypr-TBEVに感染したPS細胞の代表的な顕微鏡画像。スケールバーは200μmを示す。図7Dおよび図7E。融合ループ結合抗体4G2は、T036による増強作用を遮断する。図7Dでは、抗体4G2、T036、またはT036と組み合わせた4G2の存在下での、無抗体対照と比較したTBEV RVP感染。2つの実験の代表。図7Eでは、4G2、T036、または4G2とT036との組合せの存在下での、PS細胞をHypr-TBEVに感染させた後の細胞プラーク数。図7Dおよび図7Eでは、一元配置ANOVAおよびTukeyの検定を使用してp値を計算した。Dのエラーバーは、三連の標準偏差を示す。 図7A、図7B、図7C、図7D、および図7Eは、T036がTBEV感染を増強することを示す一連の図である。図7Aは、T036 IgG、F(ab’)2およびF(ab)の存在下でのTBEV RVP感染の用量依存的増強を示す。三連で行われた2つの実験の代表。エラーバーは標準偏差を示す。図7Bは、ウイルス力価の増強を示す。プロットは、中和抗体T038、増強抗体T036またはアイソタイプ対照10-1074の存在下でPS細胞を24または48時間インキュベートした後のHypr-TBEVウイルス力価を示す。一元配置ANOVAおよびTukeyの検定を使用してp値を計算した。破線は、アッセイの検出限界を表す。図7C。ウイルス抗原の検出の増強。示された量のT036、T038または10-1074対照の存在下でHypr-TBEVに感染したPS細胞の代表的な顕微鏡画像。スケールバーは200μmを示す。図7Dおよび図7E。融合ループ結合抗体4G2は、T036による増強作用を遮断する。図7Dでは、抗体4G2、T036、またはT036と組み合わせた4G2の存在下での、無抗体対照と比較したTBEV RVP感染。2つの実験の代表。図7Eでは、4G2、T036、または4G2とT036との組合せの存在下での、PS細胞をHypr-TBEVに感染させた後の細胞プラーク数。図7Dおよび図7Eでは、一元配置ANOVAおよびTukeyの検定を使用してp値を計算した。Dのエラーバーは、三連の標準偏差を示す。 図8Aおよび図8Bは、T036がTBEV感染を増強することを示す一連の図である。図8Aは、PS細胞を感染させ、T036、中和抗体T038またはアイソタイプ対照10-1074の存在下で24または48時間インキュベートした後のTBEV Neudoerfl力価を示すプロットである。一元配置ANOVAおよびTukeyの検定を用いてp値を計算した。図8Bは、示された抗体の存在下でのTBEV Neudoerflを用いたPS細胞の代表的な免疫蛍光顕微鏡画像を示す。緑色はウイルス抗原であり、青色は細胞核である。スケールバーは200μmを示す。 図8Aおよび図8Bは、T036がTBEV感染を増強することを示す一連の図である。図8Aは、PS細胞を感染させ、T036、中和抗体T038またはアイソタイプ対照10-1074の存在下で24または48時間インキュベートした後のTBEV Neudoerfl力価を示すプロットである。一元配置ANOVAおよびTukeyの検定を用いてp値を計算した。図8Bは、示された抗体の存在下でのTBEV Neudoerflを用いたPS細胞の代表的な免疫蛍光顕微鏡画像を示す。緑色はウイルス抗原であり、青色は細胞核である。スケールバーは200μmを示す。 図9A、図9B、図9C、および図9Dは、T025抗体が、成熟型ウイルス構造上に露出しているTBEV EDIII上の外側隆起部エピトープを認識することを示す一連の図である。図9Aは、TBEVWE EDIIIのT025認識を示す。T025は、TBEVWE EDIIIのN末端領域(EDI-EDIIIヒンジ、BCループおよびDEループ)と相互作用する。図9Bは、T025エピトープを示す。T025 Fab内の残基から4Å以内の原子を有するTBEVWE EDIII残基をEDIII抗原の表面表示上で強調している。CDRH3およびCDRL3は、スティック側鎖(stick side chain)を有するリボン骨格として示されている。図9Cは、T025が、抗TBEVマウス抗体19/1786と同様のエピトープを認識することを示す。T025エピトープは、オレンジ色の濃淡で示されている。19/1786エピトープは、青色破線で囲まれている。T025エピトープではなく、19/1786エピトープ内の残基を標識している。エピトープは、抗体上の残基内の原子から4Å以内の原子を含有する残基として定義される。図9Dは、選択された頂点に5回、3回および2回正二十面体対称演算子によって示されたT025の低温EM構造(PDB 5O6A)の表面表示を示し(左)、挿入図は、T025および19/1786抗体の結合ポーズを比較している(右)。挿入図:19/1786 Vドメイン(PDB 5O6V)と相互作用する、ウイルス表面の低温EM構造の示された部分(点線のボックス)の拡大図、Eタンパク質ドメインは赤色、黄色および青色に標識、Vドメインは暗青緑色およびシアン色に標識。EDIIIドメインのアラインメント後に、T025-TBEVWE EDIII結晶構造を、正二十面体2回対称軸に隣接するビリオンEDIIIにドッキングさせた(RMSD=0.97Å、82個のCα原子)。T025 Vは、19/1786 Vと同様のポーズでEDIIIに結合する。 図9A、図9B、図9C、および図9Dは、T025抗体が、成熟型ウイルス構造上に露出しているTBEV EDIII上の外側隆起部エピトープを認識することを示す一連の図である。図9Aは、TBEVWE EDIIIのT025認識を示す。T025は、TBEVWE EDIIIのN末端領域(EDI-EDIIIヒンジ、BCループおよびDEループ)と相互作用する。図9Bは、T025エピトープを示す。T025 Fab内の残基から4Å以内の原子を有するTBEVWE EDIII残基をEDIII抗原の表面表示上で強調している。CDRH3およびCDRL3は、スティック側鎖(stick side chain)を有するリボン骨格として示されている。図9Cは、T025が、抗TBEVマウス抗体19/1786と同様のエピトープを認識することを示す。T025エピトープは、オレンジ色の濃淡で示されている。19/1786エピトープは、青色破線で囲まれている。T025エピトープではなく、19/1786エピトープ内の残基を標識している。エピトープは、抗体上の残基内の原子から4Å以内の原子を含有する残基として定義される。図9Dは、選択された頂点に5回、3回および2回正二十面体対称演算子によって示されたT025の低温EM構造(PDB 5O6A)の表面表示を示し(左)、挿入図は、T025および19/1786抗体の結合ポーズを比較している(右)。挿入図:19/1786 Vドメイン(PDB 5O6V)と相互作用する、ウイルス表面の低温EM構造の示された部分(点線のボックス)の拡大図、Eタンパク質ドメインは赤色、黄色および青色に標識、Vドメインは暗青緑色およびシアン色に標識。EDIIIドメインのアラインメント後に、T025-TBEVWE EDIII結晶構造を、正二十面体2回対称軸に隣接するビリオンEDIIIにドッキングさせた(RMSD=0.97Å、82個のCα原子)。T025 Vは、19/1786 Vと同様のポーズでEDIIIに結合する。 図9A、図9B、図9C、および図9Dは、T025抗体が、成熟型ウイルス構造上に露出しているTBEV EDIII上の外側隆起部エピトープを認識することを示す一連の図である。図9Aは、TBEVWE EDIIIのT025認識を示す。T025は、TBEVWE EDIIIのN末端領域(EDI-EDIIIヒンジ、BCループおよびDEループ)と相互作用する。図9Bは、T025エピトープを示す。T025 Fab内の残基から4Å以内の原子を有するTBEVWE EDIII残基をEDIII抗原の表面表示上で強調している。CDRH3およびCDRL3は、スティック側鎖(stick side chain)を有するリボン骨格として示されている。図9Cは、T025が、抗TBEVマウス抗体19/1786と同様のエピトープを認識することを示す。T025エピトープは、オレンジ色の濃淡で示されている。19/1786エピトープは、青色破線で囲まれている。T025エピトープではなく、19/1786エピトープ内の残基を標識している。エピトープは、抗体上の残基内の原子から4Å以内の原子を含有する残基として定義される。図9Dは、選択された頂点に5回、3回および2回正二十面体対称演算子によって示されたT025の低温EM構造(PDB 5O6A)の表面表示を示し(左)、挿入図は、T025および19/1786抗体の結合ポーズを比較している(右)。挿入図:19/1786 Vドメイン(PDB 5O6V)と相互作用する、ウイルス表面の低温EM構造の示された部分(点線のボックス)の拡大図、Eタンパク質ドメインは赤色、黄色および青色に標識、Vドメインは暗青緑色およびシアン色に標識。EDIIIドメインのアラインメント後に、T025-TBEVWE EDIII結晶構造を、正二十面体2回対称軸に隣接するビリオンEDIIIにドッキングさせた(RMSD=0.97Å、82個のCα原子)。T025 Vは、19/1786 Vと同様のポーズでEDIIIに結合する。 図10Aおよび図10Bは、T025による予防および治療を示す一連の図である。図10Aは、T025が曝露前予防に有効であることを示す。致死量のTBEV-Hyprによる感染の24時間前に、T025または10-1074(アイソタイプ対照)を用いてマウスを処置した。上部のヒストグラムは、経時的な疾患スコアを示す。抗体用量を右側に示す。2つの独立した実験を組み合わせた。下部、Kaplan Meyer生存曲線。Mantel-Cox検定を用いてp値を計算した(p<0.0001)。図10Bは、T025が感染後に投与された場合にマウスを保護することを示す。感染の1、3または5日後に、30μgのT025または対照10-1074を用いてマウスを処置した(DPI)。3つの実験を組み合わせた。+1DPIおよび+3DPIの両方について、Mantel-Cox検定によりp<0.0001。 図10Aおよび図10Bは、T025による予防および治療を示す一連の図である。図10Aは、T025が曝露前予防に有効であることを示す。致死量のTBEV-Hyprによる感染の24時間前に、T025または10-1074(アイソタイプ対照)を用いてマウスを処置した。上部のヒストグラムは、経時的な疾患スコアを示す。抗体用量を右側に示す。2つの独立した実験を組み合わせた。下部、Kaplan Meyer生存曲線。Mantel-Cox検定を用いてp値を計算した(p<0.0001)。図10Bは、T025が感染後に投与された場合にマウスを保護することを示す。感染の1、3または5日後に、30μgのT025または対照10-1074を用いてマウスを処置した(DPI)。3つの実験を組み合わせた。+1DPIおよび+3DPIの両方について、Mantel-Cox検定によりp<0.0001。 図10Aおよび図10Bは、T025による予防および治療を示す一連の図である。図10Aは、T025が曝露前予防に有効であることを示す。致死量のTBEV-Hyprによる感染の24時間前に、T025または10-1074(アイソタイプ対照)を用いてマウスを処置した。上部のヒストグラムは、経時的な疾患スコアを示す。抗体用量を右側に示す。2つの独立した実験を組み合わせた。下部、Kaplan Meyer生存曲線。Mantel-Cox検定を用いてp値を計算した(p<0.0001)。図10Bは、T025が感染後に投与された場合にマウスを保護することを示す。感染の1、3または5日後に、30μgのT025または対照10-1074を用いてマウスを処置した(DPI)。3つの実験を組み合わせた。+1DPIおよび+3DPIの両方について、Mantel-Cox検定によりp<0.0001。
本開示は、予想外の広域中和活性を有する抗TBEV抗体を記載する。これらの抗体は
また、TBEVに加えて、他の新興のダニ媒介フラビウイルス、例えば、ランガットウイ
ルス、跳躍病ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、キャサヌール森林病ウイルスおよびポ
ワッサンウイルスを中和する。したがって、開示される抗体および抗原結合断片は、TB
EVを含む様々なダニ媒介フラビウイルスによって引き起こされる疾患または感染を予防
または治療するための新規な治療戦略を表す。
A.広域中和抗TBEV抗体
抗体
本明細書に開示される発明は、広域中和抗TBEV抗体またはその抗原結合断片を含む
。これらの抗体は、複数のダニ媒介フラビウイルスおよびその株を中和する中和抗体のク
ラスを指す。該抗体は、ダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)による致死的な攻
撃から対象を予防的および治療的に保護することができる。
一態様では、本開示は、ダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)抗原に特異的に
結合する単離された抗TBEV抗体またはその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施
形態では、抗原は、EDIIIの外側隆起部を含む。
以下の表2A~I、3および4に列挙するのは、例示的な抗TBEV抗体の重鎖(HC
)可変領域および軽鎖(LC)可変領域の代表的なアミノ酸および/または核酸配列であ
る。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、(i)表2A~I、3およ
び4から選択されるものに対して少なくとも75%(例えば、75%、50%、85%、
90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)の同一性を有する
アミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、(ii)表2A~I、3および4から選択される
ものに対して少なくとも75%(例えば、75%、50%、85%、90%、92%、9
4%、95%、96%、97%、98%、99%)の同一性を有するアミノ酸配列を有す
る軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、(
i)表2A~I、3および4のものから選択されるものの3つの重鎖CDR(HCDR1
~3)、ならびに/または(ii)表2A~I、3および4のものから選択されるものの
3つの軽鎖CDR(LCDR1~3)を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその
抗原結合断片は、表2A~I、3および4のものから選択されるものの6つのCDRを含
む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号1、3、5、7、
9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35
、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、
63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、8
9、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111
、113、115または117のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の3つの重鎖相補性
決定領域(HCDR)(HCDR1、HCDR2およびHCDR3)と、配列番号2、4
、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32
、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、
60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、8
6、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、
110、112、114、116または118のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の3
つの軽鎖CDR(LCDR1、LCDR2およびLCDR3)とを含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号1、3、5、7、
9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35
、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、
63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、8
9、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111
、113、115もしくは117のアミノ酸配列に対して少なくとも75%の同一性を有
するアミノ酸配列を有するか、または配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、
17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、4
3、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69
、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、
97、99、101、103、105、107、109、111、113、115もしく
は117のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号2、4、6、8、10、12
、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、
40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、6
6、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92
、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、11
4、116もしくは118のアミノ酸配列に対して少なくとも75%の同一性を有するア
ミノ酸配列を有するか、または配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18
、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、
46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、7
2、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98
、100、102、104、106、108、110、112、114、116もしくは
118のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号1~2、3~4、
5~6、7~8、9~10、11~12、13~14、15~16、17~18、19~
20、21~22、23~24、25~26、27~28、29~30、31~32、3
3~34、35~36、37~38、39~40、41~42、43~44、45~46
、47~48、49~50、51~52、53~54、55~56、57~58、59~
60、61~62、63~64、65~66、67~68、69~70、71~72、7
3~74、75~76、77~78、79~80、81~82、83~84、85~86
、87~88、89~90、91~92、93~94、95~96、97~98、99~
100、101~102、103~104、105~106、107~108、109~
110、111~112、113~114、115~116、または117~118のそ
れぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、変異体Fc定常領域をさら
に含む。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形
態では、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト化モノクローナル抗体である。いく
つかの実施形態では、抗体は、一本鎖抗体、Fab断片またはFab2断片である。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、変異体Fc定常領域をさら
に含む。抗体はモノクローナル抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、キメ
ラ抗体、ヒト化抗体またはヒト化モノクローナル抗体であり得る。いくつかの実施形態で
は、抗体は、一本鎖抗体、FabまたはFab2断片であり得る。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、毒素、治療剤、高分子(例
えば、ポリエチレングリコール(PEG))、受容体、酵素または受容体リガンドに検出
可能に標識またはコンジュゲートされ得る。例えば、本発明の抗体は、毒素(例えば、破
傷風毒素)に結合され得る。そのような抗体は、ダニ媒介フラビウイルス(例えば、TB
EV)に病原学的に関連するウイルスに感染しているヒトを含む動物を治療するために使
用され得る。
別の例では、本発明の抗体は、検出可能なタグに結合され得る。そのような抗体は、ヒ
トなどの動物がダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)に感染しているかどうかを
決定するために、診断アッセイ内で使用され得る。検出可能なタグの例には、蛍光タンパ
ク質(すなわち、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質)、蛍
光マーカー(すなわち、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、テキサスレッ
ド)、放射性標識(すなわち、3H、32P、125I)、酵素(すなわち、β-ガラク
トシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼ)または親和性タグ(すなわち、アビジン、ビオチン、ストレプトアビジン)が含ま
れる。抗体を検出可能なタグに結合する方法は、当技術分野で公知である。Harlow
et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,p
age 319(Cold Spring Harbor Pub.1988).
断片
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体は抗体断片である。抗体断片には
、限定するものではないが、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv
および一本鎖Fv(scFv)断片、ならびに以下に記載される他の断片、例えば、ダイ
アボディ、トリアボディテトラボディおよび単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断
片の概説については、Hudson et al.,Nat.Med.9:129-13
4(2003)を参照されたい。scFv断片の概説については、例えば、Pluckt
hun,in The Pharmacology of Monoclonal An
tibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds
.,(Springer-Verlag,New York),pp.269-315(
1994)を参照されたい。また、国際公開第93/16185号パンフレットならびに
米国特許第5,571,894号明細書および米国特許第5,587,458号明細書を
参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増加した
FabおよびF(ab’)2断片の説明については、米国特許第5,869,046号明
細書を参照されたい。
ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る、2つの抗原結合部位を有する抗体
断片である。例えば、欧州特許第404,097号明細書、国際公開第1993/011
61号パンフレット、Hudson et al.,Nat.Med.9:129-13
4(2003)、およびHollinger et al.,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)を参照されたい。トリア
ボディおよびテトラボディも、Hudson et al.,Nat.Med.9:12
9-134(2003)に記載されている。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメ
インの全部もしくは一部を含む抗体断片である。いくつかの実施形態では、単一ドメイン
抗体はヒト単一ドメイン抗体である(DOMANTIS,Inc.,Waltham,M
ass.;例えば、米国特許第6,248,516号明細書を参照)。
抗体断片は、本明細書に記載されるように、限定するものではないが、インタクトな抗
体のタンパク質分解消化、および組換え宿主細胞(例えば、大腸菌(E.coli)また
はファージ)による産生を含む様々な技術によって作製され得る。
キメラ抗体およびヒト化抗体
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体はキメラ抗体である。特定のキメ
ラ抗体が、例えば、米国特許第4,816,567号明細書、およびMorrison
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-68
55(1984))に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例え
ば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギまたは非ヒト霊長類、例えば、サルに由来する
可変領域)と、ヒト定常領域とを含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサ
ブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変化した「クラススイッチ」抗体である
。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
いくつかの実施形態では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は
、親非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させ
るためにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、HVR、例えば、CDR(またはその一
部)が非ヒト抗体に由来し、FR(またはその一部)がヒト抗体配列に由来する1つ以上
の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、場合により、ヒト定常領域の少なくとも一部も含
む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体内の一部のFR残基は、例えば、抗体の特異性
または親和性を回復させるかまたは改善するために、非ヒト抗体(例えば、HVR残基が
由来する抗体)由来の対応する残基によって置換される。
ヒト化抗体およびその作製方法は、例えば、Almagro and Fransso
n,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)に概説されてお
り、さらに、例えば、Riechmann et al.,Nature 332:32
3-329(1988);Queen et al.,Proc.Nat’l Acad
.Sci.USA 86:10029-10033(1989);米国特許第5,821
,337号明細書、米国特許第7,527,791号明細書、米国特許第6,982,3
21号明細書および米国特許第7,087,409号明細書;Kashmiri et
al.,Methods 36:25-34(2005)(特異性決定領域(SDR)グ
ラフティングを記載);Padlan,Mol.Immunol.28:489-498
(1991)(「リサーフェイシング」を記載);Dall’Acqua et al.
,Methods 36:43-60(2005)(「FRシャッフリング」を記載);
ならびにOsbourn et al.,Methods 36:61-68(2005
)およびKlimka et al.,Br.J.Cancer,83:252-260
(2000)(FRシャッフリングに対する「ガイド選択」手法を記載)に記載されてい
る。
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域には、限定するものではないが、
「ベストフィット」法(例えば、Sims et al.J.Immunol.151:
2296(1993)を参照)を使用して選択されたフレームワーク領域;軽鎖可変領域
または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレ
ームワーク領域(例えば、Carter et al.Proc.Natl.Acad.
Sci.USA,89:4285(1992);およびPresta et al.J.
Immunol.,151:2623(1993)を参照);ヒト成熟(体細胞変異)フ
レームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域(例えば、Almagro a
nd Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(20
08)を参照);およびFRライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領
域(例えば、Baca et al.,J.Biol.Chem.272:10678-
10684(1997)およびRosok et al.,J.Biol.Chem.2
71:22611-22618(1996)を参照)が含まれる。
ヒト抗体
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、
当技術分野で公知の様々な技術を使用して、または本明細書に記載の技術を使用して産生
され得る。ヒト抗体は、一般に、van Dijk and van de Winke
l,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)およびL
onberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008
)に記載されている。
ヒト抗体は、抗原負荷に応答して、インタクトなヒト抗体、またはヒト可変領域を有す
るインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与
することによって調製され得る。そのような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン
遺伝子座を置換するか、または染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに
組み込まれたヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有する。そのようなトラ
ンスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般に不活性化されてい
る。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Lonb
erg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)を参照された
い。また、例えば、XENOMOUSE技術を記載している米国特許第6,075,18
1号明細書および米国特許第6,150,584号明細書;HUMAB技術を記載してい
る米国特許第5,770,429号明細書;K-M MOUSE技術を記載している米国
特許第7,041,870号明細書、ならびにVELOCIMOUSE技術)を記載して
いる米国特許出願公開第2007/0061900号明細書を参照されたい。そのような
動物によって生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定
常領域と組み合わせることによってさらに改変され得る。
ヒト抗体はまた、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製され得る。ヒトモノクロ
ーナル抗体を産生するためのヒトミエローマ細胞株およびマウス-ヒトヘテロミエローマ
細胞株が記載されている。(例えば、Kozbor J.Immunol.,133:3
001(1984);Brodeur et al.,Monoclonal Anti
body Production Techniques and Applicati
ons,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York
,1987);およびBoerner et al.,J.Immunol.,147:
86(1991)を参照。)ヒトB細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体
も、Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3
557-3562(2006)に記載されている。追加の方法には、例えば、米国特許第
7,189,826号明細書(ハイブリドーマ細胞株由来のモノクローナルヒトIgM抗
体の産生を記載)およびNi,Xiandai Mianyixue,26(4):26
5-268(2006)(ヒト-ヒトハイブリドーマを記載)に記載されているものが含
まれる。ヒトハイブリドーマ技術(トリオーマ技術)はまた、Vollmers and
Brandlein,Histology and Histopathology,
20(3):927-937(2005)およびVollmers and Brand
lein,Methods and Findings in Experimenta
l and Clinical Pharmacology,27(3):185-91
(2005)に記載されている。
ヒト抗体はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるFvクロ
ーン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。次いで、そのような可変ド
メイン配列を所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト
抗体を選択するための技術は、以下に記載される。
本発明の抗体は、所望の単数または複数の活性を有する抗体についてコンビナトリアル
ライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージディス
プレイライブラリーを作製し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラ
リーをスクリーニングするための様々な方法が当技術分野で公知である。そのような方法
は、例えば、Hoogenboom et al.,in Methods in Mo
lecular Biology 178:1-37(O’Brien et al.,
ed.,Human Press,Totowa,N.J.,2001)に概説されてお
り、さらに、例えば、McCafferty et al.,Nature 348:5
52-554;Clackson et al.,Nature 352:624-62
8(1991);Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-
597(1992);Marks and Bradbury,in Methods
in Molecular Biology 248:161-175(Lo,ed.,
Human Press,Totowa,N.J.,2003);Sidhu et a
l.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee e
t al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);
Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):
12467-12472(2004);およびLee et al.,J.Immuno
l.Methods 284(1-2):119-132(2004)に記載されている
特定のファージディスプレイ法では、Winter et al.,Ann.Rev.
Immunol.,12:433-455(1994)に記載されているように、VH遺
伝子およびVL遺伝子のレパートリーが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって別個
にクローニングされ、ファージライブラリーでランダムに再度組み合わされ、次いでこれ
が、抗原結合ファージについてスクリーニングされ得る。ファージは、典型的には、sc
Fv断片またはFab断片のいずれかとして抗体断片を提示する。免疫化された供給源由
来のライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に対する高親和性抗体
を提供する。あるいは、Griffiths et al.,EMBO J,12:72
5-734(1993)に記載されているように、免疫化することなく、ナイーブレパー
トリーをクローニングして(例えば、ヒト由来)、広範囲の非自己抗原および自己抗原に
対する単一の抗体源を提供することができる。最後に、Hoogenboom and
Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)によって
記載されているように、幹細胞から再編成されていないV遺伝子セグメントをクローニン
グし、ランダム配列を含有するPCRプライマーを使用して高度に可変のCDR3領域を
コードし、インビトロで再編成を達成することによって、ナイーブライブラリーを合成的
に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載している特許公報には、
例えば、米国特許第5,750,373号明細書ならびに米国特許公開第2005/00
79574号、米国特許公開第2005/0119455号明細書、米国特許公開第20
05/0266000号明細書、米国特許公開第2007/0117126号明細書、米
国特許公開第2007/0160598号明細書、米国特許公開第2007/02377
64号明細書、米国特許公開第2007/0292936号明細書および米国特許公開第
2009/0002360号明細書が含まれる。ヒト抗体ライブラリーから単離された抗
体または抗体断片は、本明細書ではヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。
変異体
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図され
る。例えば、抗体の結合親和性および/または他の生物学的特性を改善することが望まし
い場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切
な改変を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。そのような
改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および/または抗体のアミ
ノ酸配列内の残基への挿入、および/または抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が含まれ
る。最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を有する限り、最終構築物に到達するた
めに、欠失、挿入および置換の任意の組合せを行うことができる。
置換、挿入および欠失変異体
いくつかの実施形態では、1つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。
置換変異誘発のための関心部位には、HVRおよびFRが含まれる。保存的置換は、本明
細書で定義される。アミノ酸置換を目的の抗体に導入し、所望の活性、例えば、保持され
た/改善された抗原結合、低下した免疫原性、または改善された抗体依存性細胞媒介性細
胞傷害(ADCC)および補体依存性細胞傷害(CDC)について生成物をスクリーニン
グしてもよい。
したがって、本発明の抗体は、本明細書に記載されるCDR、重鎖可変領域または軽鎖
可変領域の1つ以上の保存的改変を含むことができる。本発明で開示されるペプチド、ポ
リペプチドまたはタンパク質の保存的改変または機能的等価物とは、該ペプチド、ポリペ
プチドまたはタンパク質のポリペプチド誘導体、例えば、1つ以上の点変異、挿入、欠失
、切断、融合タンパク質またはそれらの組合せを有するタンパク質を指す。それは、親ペ
プチド、親ポリペプチドまたは親タンパク質(本発明に開示されるものなど)の活性を実
質的に保持する。一般に、保存的改変または機能的等価物は、親と少なくとも60%(例
えば、60%~100%(両端の値を含む)の任意の数、例えば、60%、70%、75
%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%および99%)同一であ
る。したがって、1つ以上の点変異、挿入、欠失、切断、融合タンパク質またはそれらの
組合せを有する重鎖可変領域または軽鎖可変領域、および変異体領域を有する抗体は本発
明の範囲内である。
本明細書で使用される場合、2つの配列間のパーセント相同性は、2つのアミノ酸配列
間のパーセント同一性に等しい。2つの配列間のパーセント同一性は、ギャップの数およ
び各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一位置の数の関数であり(す
なわち、%相同性=同一位置の数/位置の総数×100)、これは、2つの配列の最適ア
ラインメントのために導入される必要がある。2つの配列間の配列の比較およびパーセン
ト同一性の決定は、以下の非限定的な例に記載されるように、数学的アルゴリズムを用い
て達成することができる。
2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、PAM120重み残基表、ギャップ長ペ
ナルティ12およびギャップペナルティ4を使用して、ALIGNプログラム(バージョ
ン2.0)に組み込まれているE.Meyers and W.Miller(Comp
ut.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))のアルゴリズムを使用
して決定することができる。さらに、2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Bl
ossum 62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれかと、ギャップ
重み16、14、12、10、8、6または4、および長さ重み1、2、3、4、5また
は6とを使用して、GCGソフトウェアパッケージ(www.gcg.comで入手可能
)のGAPプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch(
J.Mol.Biol.48:444-453(1970))アルゴリズムを使用して決
定することができる。
追加的または代替的に、本発明のタンパク質配列は、例えば、関連配列を同定するため
に、公開データベースに対して検索を行うための「クエリ配列」としてさらに使用され得
る。そのような検索は、Altschul,et al.(1990)J.Mol.Bi
ol.215:403-10のXBLASTプログラム(バージョン2.0)を使用して
行われ得る。BLASTタンパク質検索は、本発明の抗体分子に相同なアミノ酸配列を得
るために、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3で行われ得る。比較目
的のためにギャップ付きアラインメントを得るために、Altschul et al.
,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-340
2に記載されているように、Gapped BLASTを利用することができる。BLA
STおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム
のデフォルトパラメータ(例えば、XBLASTおよびNBLAST)を使用することが
できる。(www.ncbi.nlm.nih.govを参照)。
本明細書で使用される場合、用語「保存的改変」は、アミノ酸配列を含有する抗体の結
合特性に顕著に影響を及ぼさないまたはそれを顕著に変化させないアミノ酸改変を指す。
そのような保存的改変は、アミノ酸の置換、付加および欠失を含む。改変は、当技術分野
で公知の標準的な技術、例えば、部位特異的変異誘発およびPCR媒介変異誘発によって
、本発明の抗体に導入され得る。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖
を有するアミノ酸残基によって置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸
残基のファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、(i)塩基性
側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)を有するアミノ酸、(ii)酸性側鎖
(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、(iii)非荷電極性側鎖(例えば、グリ
シン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプ
トファン)、(iv)非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン
、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、(v)β分岐側鎖(例えば、スレオニン
、バリン、イソロイシン)、および(vi)芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルア
ラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。
非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う
例示的な置換変異体は、例えば、Hoogenboom et al.,in Met
hods in Molecular Biology 178:1-37(O’Bri
en et al.,ed.,Human Press,Totowa,N.J.,(2
001)に記載されているものなど、ファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を使
用して簡便に生成され得る親和性成熟抗体である。アミノ酸配列挿入には、1個の残基か
ら、100個以上の残基を含有するポリペプチドに及ぶ長さのアミノ末端融合および/ま
たはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含ま
れる。末端挿入の例には、N末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の
他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させる酵素(例えば、ADEPT用)また
はポリペプチドに対する抗体のN末端またはC末端への融合が含まれる。
グリコシル化変異体
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程
度を増加または減少させるように変化させられる。抗体へのグリコシル化部位の付加また
は欠失は、1つ以上のグリコシル化部位が作製または除去されるようにアミノ酸配列を変
化させることによって簡便に達成され得る。
例えば、アグリコシル化(aglycoslated)抗体を作製することができる(
すなわち、抗体はグリコシル化を欠く)。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の
親和性を増加させるように変化させることができる。そのような炭水化物改変は、例えば
、抗体配列内のグリコシル化の1つ以上の部位を変化させることによって達成することが
できる。例えば、1つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらす
1つ以上のアミノ酸置換を行って、それによって、その部位でグリコシル化を排除するこ
とができる。そのようなアグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。
そのような手法は、Co et al.による米国特許第5,714,350号明細書お
よび米国特許第6,350,861号明細書にさらに詳細に記載されている。
N297上の定常領域のグリコシル化は、N297残基を別の残基、例えば、N297
Aに変異させることによって、および/または隣接アミノ酸、例えば、298を変異させ
、それによって、N297上のグリコシル化を減少させることによって防止され得る。
追加的または代替的に、グリコシル化の種類が変化した抗体、例えば、フコシル残基の
量が減少した低フコシル化抗体、または二分GlcNac構造が増加した抗体を作製する
ことができる。そのような変化したグリコシル化パターンは、抗体のADCC能力を増加
させることが実証されている。そのような炭水化物改変は、例えば、グリコシル化機構が
変化した宿主細胞内で抗体を発現させることによって達成することができる。グリコシル
化機構が変化した細胞は、当技術分野で記載されており、本明細書に記載の組換え抗体を
発現し、それによって、グリコシル化が変化した抗体を産生する宿主細胞として使用され
得る。例えば、Hanai et al.による欧州特許第1,176,195号明細書
は、そのような細胞株内で発現される抗体が低フコシル化(hypofucosylat
ion)を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードする機能的に破壊されたF
UT8遺伝子を有する細胞株を記載している。PrestaによるPCT公開国際公開第
03/035835号パンフレットは、Asn(297)連結炭水化物にフコースを付着
させる能力が低下し、その宿主細胞内で発現される抗体の低フコシル化ももたらす変異体
チャイニーズハムスター卵巣細胞株Led 3細胞を記載している(Shields,R
.L.et al.(2002)J.Biol.Chem.277:26733-267
40も参照)。Umana et al.によるPCT公開国際公開第99/54342
号パンフレットは、操作された細胞株内で発現される抗体が、二分GlcNac構造の増
加を示し、これにより、抗体のADCC活性が増加するように、糖タンパク質改変グリコ
シルトランスフェラーゼ(例えば、β(1,4)-N-アセチルグルコサミニルトランス
フェラーゼIII(GnTIII))を発現するように操作された細胞株を記載している
(Umana et al.(1999)Nat.Biotech.17:176-18
0も参照)。
Fc領域変異体
本明細書に記載の抗体の可変領域は、任意のアロタイプまたはイソアロタイプ、例えば
、IgG1では:G1m、G1m1(a)、G1m2(x)、G1m3(f)、G1m1
7(z);IgG2では:G2m、G2m23(n);IgG3では:G3m、G3m2
1(g1)、G3m28(g5)、G3m11(b0)、G3m5(b1)、G3m13
(b3)、G3m14(b4)、G3m10(b5)、G3m15(s)、G3m16(
t)、G3m6(c3)、G3m24(c5)、G3m26(u)、G3m27(v);
およびKでは:Km、Km1、Km2、Km3であり得るFc、例えば、IgG1 Fc
、IgG2 Fc、IgG3 FcまたはIgG4 Fcに連結(例えば、共有結合また
は融合)され得る(例えば、Jefferies et al.(2009)mAbs
1:1を参照)。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体可変領域は、1つ以上
の活性化Fc受容体(FcγI、FcγllaまたはFcγIIIa)に結合するFcに
連結され、それによって、ADCCを刺激し、T細胞枯渇を引き起こし得る。いくつかの
実施形態では、本明細書に記載の抗体可変領域は、枯渇を引き起こすFcに連結される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体可変領域は、典型的には、抗体の1つ
以上の機能的特性、例えば、血清半減期、補体結合、Fc受容体結合および/または抗原
依存性細胞傷害性を変化させるために、1つ以上の改変を含むFcに連結され得る。さら
に、本明細書に記載の抗体は、抗体の1つ以上の機能的特性を変化させるために、化学的
に改変され得るか(例えば、1つ以上の化学部分を抗体に結合させることができる)、ま
たはそのグリコシル化を変化させるように改変され得る。Fc領域内の残基のナンバリン
グは、KabatのEUインデックスのナンバリングである。
Fc領域は、定常領域の断片、類似体、変異体、変異種または誘導体を含む、免疫グロ
ブリン、好ましくは、ヒト免疫グロブリンの定常領域に由来するドメインを包含する。好
適な免疫グロブリンには、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、ならびにIgA、
IgD、IgEおよびIgMなどの他のクラスが含まれる。免疫グロブリンの定常領域は
、免疫グロブリンC末端領域に相同な天然に存在するまたは合成的に産生されたポリペプ
チドとして定義され、CH1ドメイン、ヒンジ、CH2ドメイン、CH3ドメインまたは
CH4ドメインを別個にまたは組み合わせて含むことができる。いくつかの実施形態では
、本発明の抗体は、野生型IgA1のFc領域以外のFc領域を有する。抗体は、IgG
(例えば、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4)、またはIgA2、IgD、
IgEおよびIgMなどの他のクラスのFc領域由来のFc領域を有することができる。
Fcは、IgA1の変異種であり得る。
免疫グロブリンの定常領域は、Fc受容体(FcR)結合および補体結合を含む多くの
重要な抗体機能を担う。それぞれアイソタイプによって指定される特徴的なエフェクター
機能を有するIgA、IgG、IgD、IgE、IgMとして分類される、重鎖定常領域
の5つの主要なクラスが存在する。例えば、IgGは、IgG1、IgG2、IgG3お
よびIgG4として知られる4つのサブクラスに分離される。
Ig分子は、複数のクラスの細胞受容体と相互作用する。例えば、IgG分子は、抗体
のIgGクラスに特異的な3つのクラスのFcγ受容体(FcγR)、すなわち、Fcγ
RI、FcγRIIおよびFcγRIILと相互作用する。FcγR受容体へのIgGの
結合のための重要な配列は、CH2ドメインおよびCH3ドメインに位置することが報告
されている。抗体の血清半減期は、その抗体がFcRに結合する能力によって影響を受け
る。
いくつかの実施形態では、Fc領域は、所望の構造的特徴および/または生物学的活性
を提供するために、変異体Fc領域、例えば、親Fc配列(例えば、後に改変されて変異
体を生成する未改変Fcポリペプチド)と比較して改変された(例えば、アミノ酸の置換
、欠失および/または挿入による)Fc配列である。例えば、親Fcと比較して、(a)
ADCCが増加もしくは減少している、(b)CDCが増加もしくは減少している、(c
)C1qに対する親和性が増加もしくは減少している、および/または(d)Fc受容体
に対する親和性が増加もしくは減少しているFc変異体を生成するために、Fc領域に対
して改変を行ってもよい。そのようなFc領域変異体は、一般に、Fc領域に少なくとも
1つのアミノ酸改変を含む。アミノ酸改変の組合せが特に望ましいと考えられる。例えば
、変異体Fc領域は、その中に、例えば、本明細書で同定される特定のFc領域位置の2
、3、4、5またはそれ以上の置換を含み得る。
変異体Fc領域はまた、ジスルフィド結合形成に関与するアミノ酸が除去されるかまた
は他のアミノ酸によって置換される配列変化を含み得る。そのような除去は、本明細書に
記載の抗体を産生するために使用される宿主細胞内に存在する他のシステイン含有タンパ
ク質との反応を回避し得る。システイン残基が除去されても、一本鎖Fcドメインは、非
共有結合的に一緒に保持された二量体Fcドメインを依然として形成することができる。
他の実施形態では、Fc領域は、選択された宿主細胞とさらに適合性になるように改変さ
れ得る。例えば、大腸菌の消化酵素、例えば、プロリンイミノペプチダーゼによって認識
され得る、典型的な天然Fc領域のN末端付近のPA配列を除去してもよい。他の実施形
態では、Fcドメイン内の1つ以上のグリコシル化部位が除去され得る。典型的にはグリ
コシル化された残基(例えば、アスパラギン)は、細胞溶解性応答を付与し得る。そのよ
うな残基は、欠失され得るか、または非グリコシル化残基(例えば、アラニン)によって
置換され得る。他の実施形態では、補体との相互作用に関与する部位、例えば、C1q結
合部位が、Fc領域から除去され得る。例えば、ヒトIgG1のEKK配列を欠失させる
かまたは置換してもよい。いくつかの実施形態では、Fc受容体への結合に影響を及ぼす
部位、好ましくは、サルベージ受容体結合部位以外の部位が除去され得る。他の実施形態
では、Fc領域は、ADCC部位を除去するように改変され得る。ADCC部位は当技術
分野で公知である。例えば、IgG1のADCC部位に関して、Molec.Immun
ol.29(5):633-9(1992)を参照されたい。変異体Fcドメインの特定
の例は、例えば、国際公開第97/34631号パンフレットおよび国際公開第96/3
2478号パンフレットに開示されている。
一実施形態では、Fcのヒンジ領域は、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化させ
られる、例えば、増加または減少するように改変される。この手法は、Bodmer e
t al.による米国特許第5,677,425号明細書にさらに記載されている。Fc
のヒンジ領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の集合を容易にするよ
うに、または抗体の安定性を増加もしくは減少させるように変化させられる。一実施形態
では、抗体のFcヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるように変異させられ
る。さらに具体的には、抗体が天然のFc-ヒンジドメインSpA結合と比較して損なわ
れたブドウ球菌プロテインA(SpA)結合を有するように、Fc-ヒンジ断片のCH2
-CH3ドメイン界面領域に1つ以上のアミノ酸変異が導入される。この手法は、War
d et al.による米国特許第6,165,745号明細書にさらに詳細に記載され
ている。
さらに他の実施形態では、Fc領域は、少なくとも1つのアミノ酸残基を異なるアミノ
酸残基によって置換して抗体のエフェクター機能を変化させることによって変化させられ
る。例えば、アミノ酸残基234、235、236、237、297、318、320お
よび322から選択される1つ以上のアミノ酸は、抗体がエフェクターリガンドに対して
変化した親和性を有するが、親抗体の抗原結合能を保持するように、異なるアミノ酸残基
によって置換され得る。親和性が変化するエフェクターリガンドは、例えば、Fc受容体
、または補体のC1成分であり得る。この手法は、ともにWinter et al.に
よる米国特許第5,624,821号明細書および米国特許第5,648,260号明細
書にさらに詳細に記載されている。
別の例では、アミノ酸残基329、331および322から選択される1つ以上のアミ
ノ酸は、抗体がC1q結合を変化させ、および/またはCDCを減少させるかもしくは無
効にするように、異なるアミノ酸残基によって置換され得る。この手法は、Idusog
ie et al.による米国特許第6,194,551号明細書にさらに詳細に記載さ
れている。
別の例では、アミノ酸位置231および239内の1つ以上のアミノ酸残基を変化させ
て、それによって、抗体が補体を固定する能力を変化させる。この手法は、Bodmer
et al.によるPCT公開国際公開第94/29351号パンフレットにさらに記
載されている。
さらに別の例では、Fc領域は、以下の位置、すなわち、234、235、236、2
38、239、240、241、243、244、245、247、248、249、2
52、254、255、256、258、262、263、264、265、267、2
68、269、270、272、276、278、280、283、285、286、2
89、290、292、293、294、295、296、298、299、301、3
03、305、307、309、312、313、315、320、322、324、3
25、326、327、329、330、331、332、333、334、335、3
37、338、340、360、373、376、378、382、388、389、3
98、414、416、419、430、433、434、435、436、437、4
38または439で1つ以上のアミノ酸を改変することによって、ADCCを増加させる
ために、および/またはFcγ受容体に対する親和性を増加させるために改変され得る。
例示的な置換には、236A、239D、239E、268D、267E、268E、2
68F、324T、332Dおよび332Eが含まれる。例示的な変異体には、239D
/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T
、267E/268F、267E/324T、および267E/268F7324Tが含
まれる。FcγRおよび補体相互作用を増強するための他の改変には、限定するものでは
ないが、置換298A、333A、334A、326A、247I、339D、339Q
、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L
、305Iおよび396Lが含まれる。これらおよび他の改変は、Strohl,200
9,Current Opinion in Biotechnology 20:68
5-691に概説されている。
Fcγ受容体への結合を増加させるFc改変には、Fc領域のアミノ酸位置238、2
39、248、249、252、254、255、256、258、265、267、2
68、269、270、272、279、280、283、285、298、289、2
90、292、293、294、295、296、298、301、303、305、3
07、312、315、324、327、329、330、335、337、3338、
340、360、373、376、379、382、388、389、398、414、
416、419、430、434、435、437、438または439のいずれか1つ
以上でのアミノ酸改変が含まれ、Fc領域内の残基のナンバリングは、abat(国際公
開第00/42072号パンフレット)のようなEUインデックスのナンバリングである
Fcに対して行われ得る他のFc改変には、FcγRおよび/または補体タンパク質へ
の結合を減少させるかまたは除去し、それによって、ADCC、抗体依存性細胞食作用(
ADCP)およびCDCなどのFc媒介エフェクター機能を低下させるかまたは除去する
ためのものがある。例示的な改変には、限定するものではないが、位置234、235、
236、237、267、269、325および328での置換、挿入および欠失が含ま
れ、ナンバリングはEUインデックスに従う。例示的な置換には、限定するものではない
が、234G、235G、236R、237K、267R、269R、325Lおよび3
28Rが含まれ、ナンバリングはEUインデックスに従う。Fc変異体は、236R/3
28Rを含み得る。FcγRおよび補体相互作用を減少させるための他の改変には、置換
297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、
309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233Pお
よび234V、ならびに変異的もしくは酵素的手段による、またはタンパク質をグリコシ
ル化しない細菌などの生物内の産生による、位置297でのグリコシル化の除去が含まれ
る。これらおよび他の改変は、Strohl,2009,Current Opinio
n in Biotechnology 20:685-691に概説されている。
場合により、Fc領域は、当業者に公知の追加の位置および/または代替の位置に非天
然アミノ酸残基を含み得る(例えば、米国特許第5,624,821号明細書、米国特許
第6,277,375号明細書、米国特許第6,737,056号明細書、米国特許第6
,194,551号明細書、米国特許第7,317,091号明細書、米国特許第8,1
01,720号明細書、国際公開第00/42072号パンフレット、国際公開第01/
58957号パンフレット、国際公開第02/06919号パンフレット、国際公開第0
4/016750号パンフレット、国際公開第04/029207号パンフレット、国際
公開第04/035752号パンフレット、国際公開第04/074455号パンフレッ
ト、国際公開第04/099249号パンフレット、国際公開第04/063351号パ
ンフレット、国際公開第05/070963号パンフレット、国際公開第05/0402
17号パンフレット、国際公開第05/092925号パンフレットおよび国際公開第0
6/020114号パンフレットを参照)。
阻害性受容体FcγRIIbに対する親和性を増強するFc変異体も使用され得る。そ
のような変異体は、例えば、B細胞および単球を含むFcγRIIb細胞に関連する免疫
調節活性を有するFc融合タンパク質を提供し得る。一実施形態では、Fc変異体は、1
つ以上の活性化受容体と比較して、FcγRIIbに対する選択的に増強された親和性を
提供する。FcγRIIbへの結合を変化させるための改変は、EUインデックスに従っ
て、234、235、236、237、239、266、267、268、325、32
6、327、328および332からなる群から選択される位置に1つ以上の改変を含む
。FcγRIIb親和性を増強するための例示的な置換には、限定するものではないが、
234D、234E、234F、234W、235D、235F、235R、235Y、
236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、
267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Yお
よび332Eが含まれる。例示的な置換には、235Y、236D、239D、266M
、267E、268D、268E、328F、328Wおよび328Yが含まれる。Fc
γRllbへの結合を増強するための他のFc変異体には、235Y/267E、236
D/267E、239D/268D、239D/267E、267E/268D、267
E/268E、および267E/328Fが含まれる。
そのリガンドに対するFc領域の親和性および結合特性は、限定するものではないが、
平衡法(例えば、ELISAまたはラジオイムノアッセイ)または動態(例えば、BIA
CORE分析)を含む、当技術分野で公知の様々なインビトロアッセイ法(生化学的また
は免疫学的ベースのアッセイ)、ならびに間接結合アッセイ、競合阻害アッセイ、蛍光共
鳴エネルギー移動(FRET)、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー(例えば、ゲル
濾過)などの他の方法によって決定され得る。これらおよび他の方法は、検査される成分
のうちの1つ以上に対する標識を利用してもよく、および/または限定するものではない
が、発色標識、蛍光標識、発光標識もしくは同位体標識を含む様々な検出方法を使用して
もよい。結合親和性および動態の詳細な説明は、抗体-免疫原相互作用に焦点を当ててい
るPaul,W.E.,ed.,Fundamental Immunology,4t
h Ed.,Lippincott-Raven,Philadelphia(1999
)に見出され得る。
いくつかの実施形態では、抗体は、その生物学的半減期を増加させるように改変される
。様々な手法が可能である。例えば、これは、FcRnに対するFc領域の結合親和性を
増加させることによって行われ得る。例えば、米国特許第6,277,375号明細書に
記載されているように、以下の残基、すなわち、252、254、256、433、43
5、436のうちの1つ以上を変異させることができる。具体的な例示的な置換には、T
252L、T254Sおよび/またはT256Fのうちの1つ以上が含まれる。あるいは
、生物学的半減期を増加させるために、Presta et al.による米国特許第5
,869,046号明細書および米国特許第6,121,022号明細書に記載されてい
るように、抗体をCH1領域またはCL領域内で変化させて、IgGのFc領域のCH2
ドメインの2つのループから得られるサルベージ受容体結合エピトープを含有させること
ができる。FcRnへの結合を増加させ、および/または薬物動態特性を改善する他の例
示的な変異体は、例えば、259I、308F、428L、428M、434S、434
H、434F、434Yおよび434Mを含む、位置259、308、428および43
4での置換を含む。FcRnへのFc結合を増加させる他の変異体には、250E、25
0Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton et al,,200
4,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216、Hinton et
al.2006 Journal of Immunology 176:346-3
56)、256A、272A、286A、305A、307A、307Q、311A、3
12A、376A、378Q、380A、382A、434A(Shields et
al,Journal of Biological Chemistry,2001,
276(9):6591-6604)、252F、252T、252Y、252W、25
4T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、31
1S、433R、433S、433I、433P、433Q、434H、434F、43
4Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/30
9P/311S(Dall Acqua et al.Journal of Immu
nology,2002,169:5171-5180、Dall’Acqua et
al.,2006,Journal of Biological Chemistry
281:23514-23524)が含まれる。FcRn結合を調節するための他の改
変は、Yeung et al.,2010,J Immunol,182:7663-
7671に記載されている。いくつかの実施形態では、特定の生物学的特性を有するハイ
ブリッドIgGアイソタイプが使用され得る。例えば、IgG1/IgG3ハイブリッド
変異体は、CH2および/またはCH3領域内のIgG1位置を、2つのアイソタイプが
異なる位置でIgG3由来のアミノ酸によって置換することによって構築され得る。した
がって、1つ以上の置換、例えば、274Q、276K、300F、339T、356E
、358M、384S、392N、397M、422I、435Rおよび436Fを含む
ハイブリッド変異体IgG抗体が構築され得る。本明細書に記載される他の実施形態では
、IgG1/IgG2ハイブリッド変異体は、CH2および/またはCH3領域内のIg
G2位置を、2つのアイソタイプが異なる位置でIgG1由来のアミノ酸によって置換す
ることによって構築され得る。したがって、1つ以上の置換、例えば、以下のアミノ酸置
換、すなわち、233E、234L、235L、236G(位置236でのグリシンの挿
入を指す)および321hのうちの1つ以上を含むハイブリッド変異体IgG抗体が構築
され得る。
さらに、FcγRl、FcγRII、FcγRIIIおよびFcRnに対するヒトIg
G1上の結合部位がマッピングされており、結合が改善された変異体が記載されている(
Shields,R.L.et al.(2001)J.Biol.Chem.276:
6591-6604を参照)。位置256、290、298、333、334および33
9での特異的変異は、FcγRIIIへの結合を改善することが示された。さらに、以下
の組合せ変異種、すなわち、FcγRIIIa結合およびADCC活性の増強を示すこと
が示されているT256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K22
4A、およびS298A/E333A/K334Aは、FcγRIII結合を改善するこ
とが示された(Shields et al.,2001)。カニクイザルでは、Fcγ
RIIIaに対する親和性の最大の増加と、FcγRIIb結合の減少と、強い細胞傷害
活性とを示したS239D/I332EおよびS239D/I332E/A330L変異
を有する変異体を含む、FcγRIIIaに対する結合が強く増強された他のIgG1変
異体が同定されている(Lazar et al.,2006)。アレムツズマブ(CD
52-特異的)、トラスツズマブ(HER2/neu特異的)、リツキシマブ(CD20
特異的)およびセツキシマブ(EGFR特異的)などの抗体に三重変異を導入すると、イ
ンビトロで大幅に増強されたADCC活性に変換され、S239D/I332E変異体は
、サルでは、B細胞を枯渇させる能力の増強を示した(Lazar et al.,20
06)。さらに、B細胞悪性腫瘍および乳癌のモデルでは、ヒトFcγRIIIaを発現
するトランスジェニックマウスにおいてFcγRIIIaへの結合の増強と、付随して増
強されたADCC活性とを示す、L235V、F243L、R292P、Y300Lおよ
びP396L変異を含有するIgG1変異種が同定されている(Stavenhagen
et al.,2007;Nordstrom et al.,2011)。使用され
得る他のFc変異種には、S298A/E333A/L334A、S239D/I332
E、S239D/I332E/A330L、L235V/F243L/R292P/Y3
00L/P396L、およびM428L/N434Sが含まれる。
いくつかの実施形態では、FcγRへの結合が減少したFcが選択される。FcγR結
合が減少した例示的なFc、例えば、IgG1 Fcは、以下の3つのアミノ酸置換、す
なわち、L234A、L235EおよびG237Aを含む。いくつかの実施形態では、補
体結合が減少したFcが選択される。補体結合が減少した例示的なFc、例えば、IgG
1 Fcは、以下の2つのアミノ酸置換、すなわち、A330SおよびP331Sを有す
る。いくつかの実施形態では、本質的にエフェクター機能を有しない、すなわち、Fcγ
Rへの結合が減少し、補体結合が減少したFcが選択される。例示的なFc、例えば、I
gG1 Fcは、エフェクターレスであり、以下の5つの変異、すなわち、L234A、
L235E、G237A、A330SおよびP331Sを含む。IgG4定常ドメインを
使用する場合、通常、IgG1のヒンジ配列を模倣し、それによって、IgG4分子を安
定化する置換S228Pを含むことが好ましい。
多価抗体
一実施形態では、本発明の抗体は、一価または多価(例えば、二価、三価など)であり
得る。本明細書で使用される場合、用語「結合価」は、抗体に関連する潜在的な標的結合
部位の数を指す。各標的結合部位は、1つの標的分子、または標的分子上の特定の位置も
しくは遺伝子座に特異的に結合する。抗体が一価である場合、分子の各結合部位は、単一
の抗原位置またはエピトープに特異的に結合する。抗体が複数の標的結合部位を含む場合
(多価)、各標的結合部位は、同じまたは異なる分子に特異的に結合し得る(例えば、異
なるリガンドもしくは異なる抗原、または同じ抗原上の異なるエピトープもしくは位置に
結合し得る)。例えば、米国特許第2009/0130105号明細書を参照されたい。
いずれの場合にも、結合部位のうちの少なくとも1つは、DLL3イソ型に関連するエピ
トープ、モチーフまたはドメインを含む。
一実施形態では、抗体は、Millstein et al.,1983,Natur
e,305:537-539に記載されているように、2つの鎖が異なる特異性を有する
二重特異性抗体である。他の実施形態は、三重特異性抗体などの追加の特異性を有する抗
体を含む。他のさらに精緻で互換性のある多重特異性構築物、およびそれらの作製方法は
、米国特許第2009/0155255号明細書、ならびに国際公開第94/04690
号パンフレット、Suresh et al.,1986,Methods in En
zymology,121:210、および国際公開第96/27011号パンフレット
に記載されている。
上記のように、多価抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープに免疫特異的に結合し
得るか、または標的分子および異種エピトープ、例えば、異種ポリペプチドもしくは固体
支持体材料の両方に免疫特異的に結合し得る。いくつかの実施形態では、多価抗体は、二
重特異性抗体または三重特異性抗体を含み得る。二重特異性抗体には、架橋抗体または「
ヘテロコンジュゲート」抗体も含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートでは、抗体の一
方をアビジンに、他方をビオチンに結合させることができる。そのような抗体は、例えば
、免疫系細胞を望ましくない細胞に対して標的化し(米国特許第4,676,980号明
細書)、HIV感染を治療する(国際公開第91/00360号パンフレット、国際公開
第92/200373号パンフレットおよび欧州特許第03089号明細書)ために提案
されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋方法を使用して作製され得
る。好適な架橋剤は、当技術分野で周知であり、いくつかの架橋技術とともに、米国特許
第4,676,980号明細書に開示されている。
いくつかの実施形態では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗体-抗原結
合部位)が、当業者に周知の方法を使用して、ヒンジ、CH2および/またはCH3領域
のうちの少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインなどの免疫グロブリン定
常ドメイン配列に融合される。
抗体誘導体
本明細書に提供される抗体は、当技術分野で公知であり、容易に入手可能な追加の非タ
ンパク質性部分を含有するようにさらに改変され得る。抗体の誘導体化に適した部分には
、限定するものではないが、水溶性高分子が含まれる。
水溶性高分子の非限定的な例には、限定するものではないが、PEG、エチレングリコ
ール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン
、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-
1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモ
ポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか)、およびデキストランまたはポリ(n-
ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、
ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール
(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられ
る。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性のために、製造時
に利点を有し得る。高分子は、任意の分子量であってよく、分岐状であっても分岐状でな
くてもよい。抗体に結合する高分子の数は変動し得、複数の高分子が結合する場合、それ
らは同じまたは異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用される高分子の数および
/または種類は、限定するものではないが、改善される抗体の特定の特性または機能、抗
体誘導体が定義された条件下で治療に使用されるかどうかなどを含む考慮事項に基づいて
決定され得る。
別の実施形態では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る、抗体と非タンパク
質性部分とのコンジュゲートが提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分はカー
ボンナノチューブである(Kam et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 102:11600-11605(2005))。放射線は、任意の波長で
あってよく、限定するものではないが、通常の細胞に害を及ぼさないが、抗体-非タンパ
ク質性部分に近位の細胞が死滅する温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長を含む。
本明細書に記載の抗体の別の改変はペグ化である。抗体をペグ化して、例えば、抗体の
生物学的(例えば、血清)半減期を増加させることができる。抗体をペグ化するために、
抗体またはその断片を、典型的には、1つ以上のPEG基が抗体または抗体断片に結合す
るようになる条件下で、PEG、例えば、PEGの反応性エステルまたはアルデヒド誘導
体と反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性PEG分子(または類似の反応性水溶性
高分子)とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行われる。本明細書で使用され
る場合、用語「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質を誘導体化するために使用
されているPEGの形態のいずれか、例えば、モノ(CI-CIO)アルコキシ-もしく
はアリールオキシ-ポリエチレングリコール、またはポリエチレングリコール-マレイミ
ドを包含することが意図される。いくつかの実施形態では、ペグ化される抗体は、アグリ
コシル化抗体である。タンパク質をペグ化する方法は、当技術分野で公知であり、本明細
書に記載の抗体に適用され得る。例えば、Nishimura et al.による欧州
特許第0154316号明細書、およびIshikawa et al.による欧州特許
第0401384号明細書を参照されたい。
本発明はまた、治療剤、高分子、検出可能な標識または酵素にコンジュゲートされた、
本明細書に記載のヒトモノクローナル抗体を包含する。一実施形態では、治療剤は細胞傷
害剤である。一実施形態では、高分子はPEGである。
核酸、発現カセットおよびベクター
本発明は、本発明のポリペプチド、ペプチド断片および結合されたタンパク質をコード
する単離された核酸セグメントを提供する。本発明の核酸セグメントはまた、遺伝暗号の
縮重に起因して同じアミノ酸をコードするセグメントを含む。例えば、アミノ酸スレオニ
ンは、ACU、ACC、ACAおよびACGによってコードされ、したがって、縮重され
ている。本発明は、同じアミノ酸をコードするポリヌクレオチドセグメントのあらゆる変
形例を含むことが意図される。そのような変異は当技術分野で公知である(Watson
et al.,Molecular Biology of the Gene,Be
njamin Cummings 1987)。変異はまた、保存的アミノ酸変化、例え
ば、イソロイシンに対するロイシンの置換などをコードするための核酸セグメントの変化
を含む。このような変異も当技術分野で公知である。したがって、本発明の遺伝子および
ヌクレオチド配列は、天然に存在する配列および変異種形態の両方を含む。
本発明の核酸セグメントは、ベクター内に含有され得る。ベクターは、限定するもので
はないが、自己伝達性または可動性であってもなくてもよい二本鎖または一本鎖の線状ま
たは環状形態の任意のプラスミド、ファージミド、F因子、ウイルス、コスミドまたはフ
ァージを含み得る。ベクターはまた、細胞ゲノムへの組込みによって原核生物宿主もしく
は真核生物宿主を形質転換し得るか、または染色体外に存在し得る(例えば、複製起点を
有する自律複製プラスミド)。
ベクター内の核酸セグメントは、インビトロでの、または宿主細胞、例えば、真核細胞
もしくは微生物、例えば、細菌内の転写のための適切なプロモーターまたは他の調節エレ
メントの制御下にあり、それらに作動可能に連結され得る。ベクターは、複数の宿主内で
機能するシャトルベクターであってよい。ベクターはまた、典型的には、外来DNA配列
が決定可能な様式で挿入され得る1つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含
有するクローニングベクターであってもよい。そのような挿入は、クローニングベクター
の本質的な生物学的機能を失うことなく起こり得る。クローニングベクターはまた、クロ
ーニングベクターによって形質転換された細胞の同定および選択に使用するのに適したマ
ーカー遺伝子を含有し得る。マーカー遺伝子の例には、テトラサイクリン耐性またはアン
ピシリン耐性がある。多くのクローニングベクターが市販されている(Stratage
ne、New England Biolabs、Clonetech)。
本発明の核酸セグメントはまた、発現ベクターに挿入され得る。典型的には、発現ベク
ターは、細菌複製起点をコードする原核生物DNAエレメント、および細菌宿主内の発現
ベクターの増幅および選択を提供する抗生物質耐性遺伝子;転写開始を制御する調節エレ
メント、例えば、プロモーター;ならびに転写物のプロセシングを制御するDNAエレメ
ント、例えば、イントロン、または転写終結/ポリアデニル化配列を含有する。
核酸セグメントをベクターに導入する方法は、当技術分野で利用可能である(Samb
rook et al.,Molecular Cloning:A Laborato
ry Manual,3rd edition,Cold Spring Harbor
Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001))。要約
すると、1つ以上の制限酵素(制限エンドヌクレアーゼ)を用いて、核酸セグメントが挿
入されるベクターを処理して、平滑末端、5’もしくは3’オーバーハングを有する「ス
ティッキー」末端、または上記の任意の組合せを有する線状ベクターを作製する。ベクタ
ーを制限酵素を用いて処理し、続いて、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、ホスファタ
ーゼまたはキナーゼなどの別の改変酵素を用いて処理して、ベクターへの核酸セグメント
のライゲーションに有用な特性を有する線状ベクターを作製してもよい。1つ以上の制限
酵素を用いて、ベクターに挿入される核酸セグメントを処理して、平滑末端、5’もしく
は3’オーバーハングを有する「スティッキー」末端、または上記の任意の組合せを有す
る線状セグメントを作製する。核酸セグメントを制限酵素を用いて処理し、続いて、別の
DNA改変酵素を用いて処理してもよい。そのようなDNA改変酵素には、限定するもの
ではないが、ベクターへの核酸セグメントのライゲーションに有用な特性を有する核酸セ
グメントを作製するためのポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、ホスファターゼまたはキ
ナーゼが含まれる。
次いで、処理されたベクターおよび核酸セグメントを一緒にライゲーションして、当技
術分野で利用可能な方法に従って核酸セグメントを含有する構築物を形成する(Samb
rook et al.,Molecular Cloning:A Laborato
ry Manual,3rd edition,Cold Spring Harbor
Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001))。例え
ば、処理された核酸断片および処理されたベクターを、好適な緩衝液およびリガーゼの存
在下で組み合わせる。次いで、混合物を適切な条件下でインキュベートして、リガーゼが
核酸断片をベクターにライゲーションすることを可能にする。
本開示はまた、インビトロで、または宿主細胞内で、本発明の特定の核酸セグメントの
発現を導くことができる核酸配列を含有する発現カセットを提供する。また、本発明の核
酸セグメントは、アンチセンスメッセージが生成されるように発現カセットに挿入され得
る。発現カセットは、発現カセットが線状形態であり、インビトロ転写および翻訳アッセ
イのために機能的であり得るような単離可能な単位である。これらのアッセイを行うため
の材料および手順は、Promega Corp.(ウィスコンシン州マディソン)から
市販されている。例えば、インビトロ転写物は、核酸配列をT7プロモーターの制御下に
置き、次いで、T7 RNAポリメラーゼを使用してインビトロ転写物を産生することに
よって産生され得る。次いで、この転写物は、ウサギ網状赤血球抽出液の使用によってイ
ンビトロで翻訳され得る。あるいは、発現カセットは、宿主細胞内での発現カセットの複
製および増幅、または核酸セグメントのインビトロ転写および翻訳も可能にするベクター
に組み込まれ得る。
そのような発現カセットは、調節配列の調節下での核酸セグメントの配置を可能にする
1つまたは複数の制限部位を含有し得る。発現カセットはまた、核酸セグメントに作動可
能に連結された終結シグナル、および核酸セグメントの適切な翻訳に必要な調節配列を含
有し得る。核酸セグメントを含有する発現カセットはキメラであってもよく、これは、そ
の成分のうちの少なくとも1つが、その他の成分のうちの少なくとも1つに対して異種で
あることを意味する。発現カセットはまた、天然に存在するが、異種発現に有用な組換え
形態で得られたものであってもよい。発現カセット内の核酸セグメントの発現は、宿主細
胞が何らかの特定の外部刺激に曝露された際にのみ転写を開始する構成的プロモーターま
たは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。
発現カセットは、転写の5’-3’方向に、転写および翻訳開始領域と、核酸セグメン
トと、インビボおよび/またはインビトロで機能的な転写および翻訳終結領域とを含み得
る。終結領域は、転写開始領域とともに天然であってよいか、核酸セグメントとともに天
然であってよいか、または別の供給源に由来してもよい。
調節配列は、コード配列の上流(5’非コード配列)、内部、または下流(3’非コー
ド配列)に位置し、関連するコード配列の転写、RNAプロセシングもしくは安定性、ま
たは翻訳に影響を及ぼすポリヌクレオチド配列であり得る。調節配列には、限定するもの
ではないが、エンハンサー、プロモーター、リプレッサー結合部位、翻訳リーダー配列、
イントロンおよびポリアデニル化シグナル配列が含まれ得る。それらは、天然配列および
合成配列、ならびに合成配列および天然配列の組合せであり得る配列を含み得る。調節配
列はプロモーターに限定されないが、いくつかの有用な調節配列には、構成的プロモータ
ー、誘導性プロモーター、調節プロモーター、組織特異的プロモーター、ウイルスプロモ
ーターおよび合成プロモーターが含まれる。
プロモーターは、RNAポリメラーゼ、および適切な転写に必要な他の因子の認識を提
供することによってコード配列の発現を制御するヌクレオチド配列である。プロモーター
は、転写開始に必要なあらゆる基本エレメント、例えば、TATAボックス、および/ま
たはTATAボックスと、転写開始部位を特定するのに役立つ他の配列とから構成される
短いDNA配列であるイニシエーターのみからなる最小プロモーターを含み、プロモータ
ーには、発現の制御のために調節エレメントが付加される。プロモーターは、天然の遺伝
子に完全に由来し得るか、または天然に見出される様々なプロモーターに由来する様々な
エレメントから構成され得るか、または合成DNAセグメントから構成され得る。プロモ
ーターは、生理学的条件または発達条件に応答して転写開始の有効性を制御するタンパク
質因子の結合に関与するDNA配列を含有し得る。
本開示はまた、ベクターおよび発現カセットを含有する構築物を提供する。ベクターは
、限定するものではないが、前述の任意のベクターから選択され得る。このベクターには
、当技術分野で公知であり、以前に記載された方法(Sambrook et al.,
Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3r
d edition,Cold Spring Harbor Press,Cold
Spring Harbor,N.Y.(2001))によって、発現カセットが挿入さ
れ得る。一実施形態では、発現カセットの調節配列は、発現カセットが挿入されるベクタ
ー以外の供給源に由来し得る。別の実施形態では、本発明の核酸セグメントを、それ自体
が調節配列を含有するベクターに挿入すると、ベクターおよび発現カセットを含有する構
築物が形成される。したがって、核酸セグメントをベクターに挿入すると、発現カセット
が形成される。調節配列を含有するベクターは市販されており、それらの使用方法は当技
術分野で公知である(Clonetech、Promega、Stratagene)。
別の態様では、本開示はまた、(i)上記の抗体またはその抗原結合断片のポリペプチ
ド鎖をコードする核酸分子、(ii)記載される核酸分子を含むベクター、および(ii
i)記載されるベクターを含む培養された宿主細胞を提供する。
また、ポリペプチド(例えば、抗TBEV抗体)を産生する方法であって、(a)記載
の培養された宿主細胞を得ること、(b)ベクターによってコードされるポリペプチドを
発現させる、および抗体またはその断片を集合させる条件下で、培地中で、培養された宿
主細胞を培養すること、および(c)培養された細胞、または細胞の培地から、抗体また
は断片を精製することを含む方法も提供される。
産生方法
抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号明細書に記載されているように、組
換え方法および組成物を使用して産生され得る。一実施形態では、本明細書に記載の抗体
をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ
酸配列および/またはVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖および/または重鎖
)をコードし得る。さらなる実施形態では、そのような核酸を含む1つ以上のベクター(
例えば、発現ベクター)が提供される。さらなる実施形態では、そのような核酸を含む宿
主細胞が提供される。そのような一実施形態では、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含む
アミノ酸配列と、抗体のVHを含むアミノ酸配列とをコードする核酸を含むベクター、ま
たは(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクター、およ
び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む(例えば
、それらによって形質転換されている)。一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、例え
ば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはリンパ球系細胞(例えば、Y0、
NS0、Sp20細胞)である。一実施形態では、抗体を作製する方法であって、抗体の
発現に適した条件下で、上で提供される抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養する
こと、および場合により抗体を宿主細胞(または宿主細胞培養培地)から回収することを
含む方法が提供される。
抗体の組換え産生のために、例えば、上記のような抗体をコードする核酸は、単離され
、宿主細胞内でのさらなるクローニングおよび/または発現のために1つ以上のベクター
に挿入される。そのような核酸は、従来の手順を使用して(例えば、抗体の重鎖および軽
鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使
用することによって)容易に単離され配列決定され得る。
本明細書、例えば、実施例に記載されるように、開示される抗体をコードするRNAは
、回復期ドナーまたはワクチン接種ドナーから単離され、cDNAに逆転写され得る。次
いで、cDNAは、組換えDNA法によって改変され、宿主細胞内での発現のために1つ
以上のベクターにクローニングされ得る。組換え発現モノクローナル抗体は、単離され、
さらなる精製に供され得る。少なくとも逆転写、PCR増幅およびクローニングプロセス
のうちの1つ以上に起因して、組換え作製され、発現された抗体の各々は、それを天然の
抗体と区別する、重鎖可変領域、軽鎖可変領域または定常領域に少なくとも1つ以上の非
天然の変化または変異を有する。これらの変異は、本明細書に開示される抗体を天然に存
在する対応物とは著しく異なるものにする。したがって、本明細書に開示される抗体は、
天然に存在しない。
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適した宿主細胞には、本明細書
に記載の原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、特にグリコシル化および
Fcエフェクター機能が必要でない場合、細菌内で産生され得る。細菌内での抗体断片お
よびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第5,648,237号明細書、
米国特許第5,789,199号明細書および米国特許第5,840,523号明細書を
参照されたい。(大腸菌内での抗体断片の発現を記載しているCharlton,Met
hods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.
Lo,ed.,Humana Press,Totowa,N.J.,2003),pp
.245-254も参照されたい。)発現後、抗体は、可溶性画分内の細菌細胞ペースト
から単離され得、さらに精製され得る。
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、グリコシル化経路が「ヒト
化」されており、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をも
たらす真菌株および酵母株を含む、抗体をコードするベクターのための好適なクローニン
グ宿主または発現宿主である。Gerngross,Nat.Biotech.22:1
409-1414(2004)、およびLi et al.,Nat.Biotech.
24:210-215(2006)を参照されたい。
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物(無脊椎動物および脊椎
動物)に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。昆
虫細胞に関連して、特にスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frug
iperda)細胞のトランスフェクションのために使用され得る多数のバキュロウイル
ス株が同定されている。
植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第5,959,
177号明細書、米国特許第6,040,498号明細書、米国特許第6,420,54
8号明細書、米国特許第7,125,978号明細書および米国特許第6,417,42
9号明細書(トランスジェニック植物において抗体を産生するためのPLANTIBOD
IES技術を記載)を参照されたい。
脊椎動物細胞も宿主として使用され得る。例えば、懸濁状態で増殖するように適合され
た哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例には、SV40
(COS-7)によって形質転換されたサル腎臓CV1株;ヒト胚腎臓株(例えば、Gr
aham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977)に記載され
ている293または293細胞);ベビーハムスター腎臓細胞(BHK);マウスセルト
リ細胞(例えば、Mather,Biol.Reprod.23:243-251(19
80)に記載されているTM4細胞);サル腎臓細胞(CV1);アフリカミドリザル腎
臓細胞(VERO-76);ヒト子宮頸癌細胞(HELA);イヌ腎臓細胞(MDCK;
バッファローラット肝細胞(BRL 3A);ヒト肺細胞(W138);ヒト肝細胞(H
ep G2);マウス乳腺腫瘍(MMT 060562);例えば、Mather et
al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)
に記載されているTRI細胞;MRC 5細胞;およびFS4細胞がある。他の有用な哺
乳動物宿主細胞株には、DHFR-CHO細胞(Urlaub et al.,Proc
.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))を含むCHO細
胞、ならびにミエローマ細胞株、例えば、Y0、NS0およびSp2/0が含まれる。抗
体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki a
nd Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.2
48(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,N.J.
),pp.255-268(2003)を参照されたい。
B.組成物および製剤
本発明の抗体は、単独で、またはヒトのダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)
感染の治療のための追加の抗TBEV抗体を含む抗体カクテル中で、抗ウイルス療法を開
発するための優れた方法になる。
別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化される、本明細書に
記載される本発明の抗体を含む医薬組成物を提供する。組成物は、場合により、別の抗体
または治療剤などの1つ以上の追加の薬学的に活性な成分を含有してもよい。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、上記の抗体またはその抗原結合断片のうちの
2つ以上、例えば、本明細書に記載のそれぞれのアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含
む抗体またはその抗原結合断片の任意の組合せを含む。
いくつかの例では、各抗体またはその抗原結合断片は、(i)表2A~I、3および4
のものから選択される抗体のHCDR1~3およびLCDR1~3、または(ii)表2
A~I、3および4のものから選択される抗体のそれぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変
領域および軽鎖可変領域を含む。
本発明の医薬組成物はまた、例えば、別の免疫刺激剤、抗ウイルス剤またはワクチンな
どとの併用療法で投与することもできる。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくと
も1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、
150mg/ml、200mg/ml、1~300mg/ml、または100~300m
g/mlの濃度で本発明の抗体を含む。
いくつかの実施形態では、第2の治療剤は、抗炎症薬または抗ウイルス化合物を含む。
いくつかの実施形態では、抗ウイルス化合物は、ヌクレオシド類似体、ペプトイド、オリ
ゴペプチド、ポリペプチド、プロテアーゼ阻害剤、3C様プロテアーゼ阻害剤、パパイン
様プロテアーゼ阻害剤、またはRNA依存性RNAポリメラーゼの阻害剤を含む。いくつ
かの実施形態では、抗ウイルス化合物は、アシクロビル、ガンシクロビル、ビダラビン、
ホスカルネット、シドホビル、アマンタジン、リバビリン、トリフルオロチミジン、ジド
ブジン、ジダノシン、ザルシタビンまたはインターフェロンを含み得る。いくつかの実施
形態では、インターフェロンは、インターフェロン-αまたはインターフェロン-βであ
る。
ダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)によって引き起こされる感染に起因する
病態の診断、予防、治療またはそれらの組合せのための医薬品の調製における医薬組成物
の使用も本開示の範囲内である。
医薬組成物は、任意の数の賦形剤を含むことができる。使用され得る賦形剤には、担体
、界面活性剤、増粘剤または乳化剤、固体結合剤、分散助剤または懸濁助剤、可溶化剤、
着色剤、香味剤、コーティング、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、保存剤、等張剤およびそれら
の組合せが含まれる。好適な賦形剤の選択および使用は、その開示が参照により本明細書
に組み込まれるGennaro,ed.,Remington:The Science
and Practice of Pharmacy,20th Ed.(Lippi
ncott Williams&Wilkins 2003)に教示されている。
好ましくは、医薬組成物は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投
与または表皮投与(例えば、注射または注入による)に適している。投与経路に応じて、
活性化合物は、それを不活性化し得る酸および他の自然条件の作用から保護するために何
らかの材料でコーティングされ得る。本明細書で使用される「非経口投与」という語句は
、通常は注射による経腸投与および局所投与以外の投与様式を意味し、限定するものでは
ないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気
管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射およ
び注入を含む。あるいは、本明細書に記載される本発明の抗体は、非経口以外の経路、例
えば、局所、表皮または粘膜投与経路によって、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌
下または局所投与され得る。
本発明の医薬組成物は、錠剤、硬質または軟質ゼラチンカプセル、水溶液、懸濁剤およ
びリポソームならびに他の徐放性製剤、例えば、成形高分子ゲルを含む多くの形態で調製
され得る。経口剤形は、抗体が胃を通過した後に腸に放出されるように製剤化され得る。
そのような製剤は、米国特許第6,306,434号明細書、およびそこに含まれる参考
文献に記載されている。
経口液体医薬組成物は、例えば、水性もしくは油性懸濁剤、溶液、エマルジョン、シロ
ップもしくはエリキシルの形態であってよいか、または使用前に水もしくは他の好適なビ
ヒクルを用いて構成するための乾燥製品として提供されてもよい。そのような液体医薬組
成物は、懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル(食用油を含み得る)または保存剤などの従
来の添加剤を含有し得る。
抗体は、非経口投与(例えば、注射、例えば、ボーラス注射または連続注入による)の
ために製剤化され得、アンプル、プレフィルドシリンジ、小容量注入容器、または保存剤
が加えられた複数回投与容器の単位剤形で提供され得る。医薬組成物は、油性または水性
ビヒクル中の懸濁剤、溶液またはエマルジョンなどの形態をとってもよく、懸濁化剤、安
定化剤および/または分散剤などの調合剤を含有してもよい。直腸投与に適した医薬組成
物は、単位用量坐剤として調製され得る。好適な担体には、生理食塩水、および当技術分
野で一般的に使用される他の材料が含まれる。
吸入による投与の場合、抗体は、注入器、ネブライザーもしくは加圧パック、またはエ
アロゾルスプレーを送達する他の簡便な手段から簡便に送達され得る。加圧パックは、好
適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ
テトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスを含んでもよい。加圧エアロゾ
ルの場合、投与量単位は、計量された量を送達するための弁を提供することによって決定
され得る。
あるいは、吸入または吹送による投与では、抗体は、乾燥粉末組成物、例えば、調節物
質とラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物の形態をとってもよ
い。粉末組成物は、例えば、カプセルもしくはカートリッジ、または例えば、ゼラチンも
しくはブリスターパック内の単位剤形で提供され得、そこから吸入器または注入器を用い
て粉末が投与され得る。鼻腔内投与の場合、抗体は、液体スプレーを介して、例えば、プ
ラスチックボトルアトマイザーを介して投与され得る。
本発明の医薬組成物はまた、香味料、着色料、抗微生物剤または保存剤などの他の成分
を含有し得る。治療に使用するのに必要な抗体の量は、選択された特定の担体だけでなく
、投与経路、治療される病態の性質、ならびに患者の年齢および病態によっても変動する
ことが理解されるであろう。最終的に、付き添いの医療提供者は、適切な投与量を決定し
得る。さらに、医薬組成物は、単一単位剤形として製剤化され得る。
本発明の医薬組成物は、滅菌水溶液または分散液の形態であり得る。本発明の医薬組成
物はまた、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の秩序構
造で製剤化され得る。
本明細書に記載される本発明の抗体は、徐放性製剤として投与され得、この場合、必要
とされる投与頻度は少なくなる。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じ
て変動する。一般に、ヒト抗体は最も長い半減期を示し、次いでヒト化抗体、キメラ抗体
および非ヒト抗体が続く。投与量および投与頻度は、治療が予防的であるかまたは治療的
であるかに応じて変動し得る。予防用途では、比較的低い投与量が、長期間にわたって比
較的低頻度の間隔で投与される。一部の患者は、生涯にわたって治療を受け続ける。治療
用途では、疾患の進行が低減または終了するまで、好ましくは、患者が疾患の症状の部分
的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い投与量が必要とされること
がある。その後、患者に予防的レジメンを投与することができる。
単一剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、治療
される対象、および特定の投与様式に応じて変動し、一般に、治療効果をもたらす組成物
の量である。一般に、100パーセントのうち、この量は、薬学的に許容される担体と組
み合わせて、活性成分の約0.01%~約99%、好ましくは活性成分の約0.1%~約
70%、最も好ましくは約1%~約30%の範囲である。
投与量レジメンは、最適な所望の応答(例えば、治療応答)をもたらすように調整され
得る。例えば、単回ボーラスを投与することができるか、いくつかの分割用量を経時的に
投与することができるか、または治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例的
に減少もしくは増加させることができる。投与の容易さ、および投与量の均一性のために
、非経口組成物を単位剤形で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される単
位剤形とは、治療される対象のための単位投与量として適した物理的に別個の単位を指す
。各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定
量の活性化合物を含有する。あるいは、抗体は、徐放性製剤として投与され得、この場合
、必要とされる投与頻度は少なくなる。抗体の投与のために、投与量は、宿主体重の約0
.0001~800mg/kg、さらに通常は0.01~5mg/kgの範囲である。例
えば、投与量は、0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg
/kg体重もしくは10mg/kg体重、または1~10mg/kgの範囲内であり得る
。例示的な治療レジメンは、1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回、4週間に1回
、1ヶ月に1回、3ヶ月に1回、または3~6ヶ月に1回の投与を伴う。本発明の抗体の
好ましい投与量レジメンには、静脈内投与による1mg/kg体重または3mg/kg体
重が含まれ、抗体は、以下の投与スケジュールのうちの1つを使用して投与される:(i
)6回の投与量について4週間ごと、次いで3ヶ月ごと;(ii)3週間ごと;(iii
)3mg/kg体重を1回、続いて3週間ごとに1mg/kg体重。いくつかの方法では
、投与量は、約1~1000μg/ml、いくつかの方法では約25~300μg/ml
の血漿抗体濃度を達成するように調整される。本発明の抗体の「治療有効投与量」は、好
ましくは、疾患症状の重症度の低下、疾患症状のない期間の頻度および持続期間の増加、
または疾患の苦痛に起因する機能障害もしくは障害の予防をもたらす。例えば、対象のダ
ニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)感染の治療のために、「治療有効投与量」は
、好ましくは、未治療の対象と比較して、ダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)
の複製または宿主細胞による取込みを少なくとも約20%、さらに好ましくは少なくとも
約40%、さらになお好ましくは少なくとも約60%、さらに一層好ましくは少なくとも
約80%阻害する。治療有効量の治療用化合物は、ダニ媒介フラビウイルス(例えば、T
BEV)を中和するか、または他の方法で、典型的にはヒトであるかもしくは別の哺乳動
物であり得る対象の症状を改善することができる。
医薬組成物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御
放出製剤であり得る。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラ
ーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性生体適合性高分子を使用する
ことができる。例えば、Sustained and Controlled Rele
ase Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,e
d.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978を参照され
たい。
治療用組成物は、医療機器、例えば、参照によりその開示が本明細書に組み込まれる(
1)無針皮下注射装置(例えば、米国特許第5,399,163号明細書、米国特許第5
,383,851号明細書、米国特許第5,312,335号明細書、米国特許第5,0
64,413号明細書、米国特許第4,941,880号明細書、米国特許第4,790
,824号明細書および米国特許第4,596,556号明細書);(2)マイクロ注入
ポンプ(米国特許第4,487,603号明細書);(3)経皮装置(米国特許第4,4
86,194号明細書);(4)注入装置(米国特許第4,447,233号明細書およ
び米国特許第4,447,224号明細書);および(5)浸透圧装置(米国特許第4,
439,196号明細書および米国特許第4,475,196号明細書)を介して投与さ
れ得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるヒトモノクローナル抗体は、インビボ
での適切な分布を確実にするように製剤化され得る。例えば、本発明の治療用化合物は、
血液脳関門を通過することを確実にするために、特定の細胞または器官への選択的輸送を
増強するための標的化部分をさらに含み得るリポソームに製剤化され得る。例えば、米国
特許第4,522,811号明細書;米国特許第5,374,548号明細書;米国特許
第5,416,016号明細書;および米国特許第5,399,331号明細書;V.V
.Ranade(1989)Clin.Pharmacol.29:685;Umeza
wa et al.,(1988)Biochem.Biophys.Res.Comm
un.153:1038;Bloeman et al.(1995)FEBS Let
t.357:140;M.Owais et al.(1995)Antimicrob
.Agents Chemother.39:180;Briscoe et al.(
1995)Am.Physiol.1233:134;Schreier et al.
(1994).Biol.Chem.269:9090;Keinanen and L
aukkanen(1994)FEBS Lett.346:123;ならびにKill
ion and Fidler(1994)Immunomethods 4:273を
参照されたい。
いくつかの実施形態では、初期用量の後に、抗体またはその抗原結合断片の第2の用量
または複数の後続用量が、初期用量とほぼ同じであり得るか、または初期用量よりも少な
い量であり得る量で投与されてもよく、後続用量は、少なくとも1日~3日、少なくとも
1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも5週間、
少なくとも6週間、少なくとも7週間、少なくとも8週間、少なくとも9週間、少なくと
も10週間、少なくとも12週間、または少なくとも14週間隔てられる。
様々な送達系、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、変異種ウイルスを発
現することができる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシスへのカプセル化が、公知
であり、本発明の医薬組成物を投与するために使用され得る(例えば、Wu et al
.(1987)J.Biol.Chem.262:4429-4432を参照)。導入方
法には、限定するものではないが、皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内
、硬膜外および経口経路が含まれる。組成物は、任意の簡便な経路によって、例えば、注
入またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜ライニング(例えば、口腔粘膜、直
腸粘膜および腸粘膜など)を介した吸収によって投与され得、他の生物学的に活性な薬剤
と一緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。医薬組成物は、小胞、
特にリポソームでも送達され得る(例えば、Langer(1990)Science
249:1527-1533を参照)。
本明細書では、本発明の抗体を送達するためのナノ粒子の使用も企図される。抗体コン
ジュゲートナノ粒子は、治療用途および診断用途の両方に使用され得る。抗体コンジュゲ
ートナノ粒子、ならびに調製および使用の方法は、参照により本明細書に組み込まれるA
rruebo,M.,et al.2009(“Antibody-conjugate
d nanoparticles for biomedical applicati
ons“ in J.Nanomat.Volume 2009,Article ID
439389)によって詳細に記載されている。ナノ粒子を開発し、医薬組成物に含有
される抗体にコンジュゲートさせて、細胞を標的としてもよい。薬物送達のためのナノ粒
子は、例えば、それぞれその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第8257740号
明細書または米国特許第8246995号明細書にも記載されている。
特定の状況では、医薬組成物は、制御放出系で送達され得る。一実施形態では、ポンプ
が使用され得る。別の実施形態では、高分子材料を使用することができる。さらに別の実
施形態では、制御放出系を組成物の標的の近くに配置し、したがって、必要とするのは全
身用量の一部のみとすることができる。
注射剤には、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、腹腔内、筋肉内注射、点滴などのための剤
形が含まれ得る。これらの注射剤は、公知の方法によって調製され得る。例えば、注射剤
は、例えば、注射に従来使用されている滅菌水性媒体または油性媒体中に上記の抗体また
はその塩を溶解、懸濁または乳化することによって調製され得る。注射用水性媒体として
は、例えば、生理食塩水、アルコール(例えば、エタノール)、多価アルコール(例えば
、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン性界面活性剤[例えば、
ポリソルベート80、HCO-50(硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン(50mol)
付加物)]などのような適切な可溶化剤と組み合わせて使用され得るグルコースおよび他
の助剤などを含有する等張液などがある。油性媒体としては、例えば、安息香酸ベンジル
、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用され得るゴマ油、大豆油などが
使用される。このようにして調製された注射液は、適切なアンプルに充填されることが好
ましい。
本発明の医薬組成物は、標準的な針およびシリンジを用いて皮下または静脈内送達され
得る。さらに、皮下送達に関して、ペン送達装置は、本発明の医薬組成物を送達する点で
用途を容易に有する。そのようなペン送達装置は、再使用可能または使い捨て可能であり
得る。再使用可能なペン送達装置は、一般に、医薬組成物を収容する交換可能なカートリ
ッジを利用する。カートリッジ内の医薬組成物が残らず投与され、カートリッジが空にな
ると、空のカートリッジを容易に廃棄し、医薬組成物を収容する新しいカートリッジと交
換することができる。次いで、ペン送達装置を再使用することができる。使い捨て可能な
ペン送達装置では、交換可能なカートリッジは存在しない。むしろ、使い捨て可能なペン
送達装置は、装置内のリザーバに保持された医薬組成物によって予め充填される。リザー
バから医薬組成物が空になると、装置全体が廃棄される。
多数の再使用可能なペンおよび自動注入装置送達装置は、本発明の医薬組成物の皮下送
達に用途を有する。例には、ほんの数例を挙げると、AUTOPEN(商標)(Owen
Mumford,Inc.、ウッドストック、英国)、DISETRONIC(商標)
ペン(Disetronic Medical Systems、ブルクドルフ、スイス
)、HUMALOG MIX 75/25(商標)ペン、HUMALOG(商標)ペン、
HUMALIN 70/30(商標)ペン(Eli Lilly and Co.、イン
ディアナ州インディアナポリス)、NOVOPEN(商標)I、IIおよびIII(No
vo Nordisk、コペンハーゲン、デンマーク)、NOVOPEN JUNIOR
(商標)(Novo Nordisk、コペンハーゲン、デンマーク)、BD(商標)ペ
ン(Becton Dickinson、ニュージャージー州フランクリン・レイクス)
、OPTIPEN(商標)、OPTIPEN PRO(商標)、OPTIPEN STA
RLET(商標)ならびにOPTICLIK(商標)(Sanofi-Aventis、
フランクフルト、ドイツ)が挙げられるが、これらに限定されないことは確かである。本
発明の医薬組成物の皮下送達に用途を有する使い捨て可能なペン送達装置の例には、ほん
の数例を挙げると、SOLOSTAR(商標)ペン(Sanofi-Aventis)、
FLEXPEN(商標)(Novo Nordisk)およびKWIKPEN(商標)(
Eli Lilly)、SURECLICK(商標)Autoinjector(Amg
en、カリフォルニア州サウザンドオークス)、PENLET(商標)(Haselme
ier、シュツットガルト、ドイツ)、EPIPEN(Dey,L.P.)ならびにHU
MIRA(商標)Pen(Abbott Labs、イリノイ州アボットパーク)が挙げ
られるが、これらに限定されないことは確かである。
有利には、上記の経口または非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の用量に適合
するのに適した単位用量の剤形に調製される。単位用量におけるそのような剤形には、例
えば、錠剤、丸剤、カプセル、注射液(アンプル)、坐剤などが含まれる。含有される抗
体の量は、一般に、単位用量における剤形当たり約5~約500mgである。特に注射液
の形態では、抗体は、他の剤形については約5~約300mg、および約10~約300
mgで含有されることが好ましい。
C.使用方法
治療方法
本明細書に記載の抗体、組成物および製剤は、ダニ媒介フラビウイルス(例えば、TB
EV)を中和し、それによって、TBEVを含む様々なダニ媒介フラビウイルスによって
引き起こされる疾患または感染を治療または予防するために使用され得る。
したがって、一態様では、本開示は、対象においてダニ媒介フラビウイルス(例えば、
TBEV)を中和する方法をさらに提供する。該方法は、それを必要とする対象に、上記
の抗体もしくはその抗原結合断片の治療有効量または医薬組成物の治療有効量を投与する
ことを含む。
別の態様では、本開示は、ダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)感染を予防ま
たは治療する方法をさらに提供する。該方法は、それを必要とする対象に、上記の抗体も
しくはその抗原結合断片の治療有効量または医薬組成物の治療有効量を投与することを含
む。
例えば、TBEVの中和は、(i)標的細胞へのTBEV結合を阻害すること、(ii
)標的細胞によるTBEV取込みを阻害すること、(iii)TBEV複製を阻害するこ
と、および(iv)感染細胞からのTBEVウイルス粒子の放出を阻害することによって
行われ得る。当業者であれば、TBEVの中和を評価するための任意のアッセイを行う能
力を有する。
特に、抗体の中和特性は、様々な試験によって評価され得、様々な試験はいずれも、(
i)標的細胞へのTBEV結合の阻害、(ii)標的細胞によるTBEV取込みの阻害、
(iii)TBEV複製の阻害、および(iv)感染細胞からのTBEVウイルス粒子放
出の阻害の結果を評価し得る。換言すれば、様々な試験を実施すると、同じ結果、すなわ
ち、TBEVの感染性の喪失という観察結果がもたらされ得る。したがって、一実施形態
では、本発明は、対象においてTBEVを中和する方法であって、本明細書に記載される
本発明の抗体の治療有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。
本発明の別の態様は、ダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)関連疾患を治療す
る方法を提供する。そのような方法は、治療的(例えば、TBEV感染後)および予防的
(例えば、TBEV曝露、感染または病状の前)を含む。例えば、TBEV感染について
個体を治療する治療的および予防的方法には、TBEV感染もしくは病状を有するかもし
くは有するリスクがある個体の治療、TBEV感染を有する個体の治療、およびTBEV
感染から個体を保護する方法、個体のTBEV感染の確率を低下もしくは減少させる方法
、TBEV感染に対する個体の感受性を低下もしくは減少させる方法、または個体のTB
EV感染を阻害もしくは予防する方法、および感染個体から非感染個体へのTBEVの伝
播を低下させるか、減少させるか、阻害するか、もしくは抑制する方法が含まれる。その
ような方法は、本発明の抗体、または本明細書に開示される抗体を含む組成物を投与して
、TBEV感染または病状を有するかまたは有するリスクがある個体を治療的または予防
的に治療する(ワクチン接種するまたは免疫する)ことを含む。したがって、方法は、T
BEV感染もしくは病状を治療するか、または感染から個体を保護することができる(例
えば、予防的保護)。
一実施形態では、ダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)関連疾患を治療する方
法は、それを必要とする個体に、ダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)感染また
は病状に関連する1つ以上の生理学的病態または症状を低減するのに十分な量で本明細書
に開示される抗体または治療用組成物を投与し、それによって、ダニ媒介フラビウイルス
(例えば、TBEV)関連疾患を治療することを含む。
一実施形態では、本明細書に開示される抗体または治療用組成物は、ダニ媒介フラビウ
イルス(例えば、TBEV)関連疾患を治療するために使用される。いくつかの実施形態
では、本明細書に開示される抗体または治療用組成物の使用は、TBEV感染または病状
に関連する1つ以上の生理学的病態または症状を低減することによって、TBEV関連疾
患を治療する。この実施形態の態様では、本明細書に開示される抗体または治療用組成物
の投与は、TBEV感染または病状に関連する1つ以上の生理学的病態または症状を低減
し、それによって、TBEVに基づく疾患を治療するのに十分な量である。この実施形態
の他の態様では、本明細書に開示される抗体または治療用組成物の投与は、TBEVのク
リアランスもしくは除去を増加させるか、誘導するか、増強するか、増大するか、促進す
るか、もしくは刺激するか、または別の個体へのTBEVの伝播を低下させるか、減少さ
せるか、阻害するか、抑制するか、予防するか、制御するか、もしくは制限するのに十分
な量である。
ダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)感染または病状に関連する1つ以上の生
理学的病態または症状は、本明細書に開示される治療方法に応答する。ダニ媒介フラビウ
イルス(例えば、TBEV)感染または病状の症状は、感染の段階に応じて変動する。
いくつかの実施形態では、対象においてダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)
を中和する方法は、それを必要とする対象に、上記の抗体または抗原結合断片の第1の抗
体またはその抗原結合断片および第2の抗体またはその抗原結合断片の治療有効量を投与
することを含み、第1の抗体またはその抗原結合断片および第2の抗体またはその抗原結
合断片は、上記の医薬組成物の相乗活性または治療有効量を示す。
いくつかの実施形態では、ダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)感染を予防ま
たは治療する方法は、それを必要とする対象に、上記の抗体または抗原結合断片の第1の
抗体またはその抗原結合断片および第2の抗体またはその抗原結合断片の治療有効量を投
与することを含み、第1の抗体またはその抗原結合断片および第2の抗体またはその抗原
結合断片は、上記の医薬組成物の相乗活性または治療有効量を示す。いくつかの実施形態
では、第1の抗体またはその抗原結合断片は、第2の抗体もしくはその抗原結合断片の前
、後、または第2の抗体もしくはその抗原結合断片と同時に投与される。
いくつかの実施形態では、第1の抗体またはその抗原結合断片、および第2の抗体また
はその抗原結合断片は、本明細書に記載のそれぞれのアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖
を含む抗体またはその抗原結合断片の任意の組合せであり得る。
いくつかの実施形態では、第2の治療剤は、抗炎症薬または抗ウイルス化合物を含む。
いくつかの実施形態では、抗ウイルス化合物は、ヌクレオシド類似体、ペプトイド、オリ
ゴペプチド、ポリペプチド、プロテアーゼ阻害剤、3C様プロテアーゼ阻害剤、パパイン
様プロテアーゼ阻害剤、またはRNA依存性RNAポリメラーゼの阻害剤を含む。いくつ
かの実施形態では、抗ウイルス化合物は、アシクロビル、ガンシクロビル、ビダラビン、
ホスカルネット、シドホビル、アマンタジン、リバビリン、トリフルオロチミジン、ジド
ブジン、ジダノシン、ザルシタビンまたはインターフェロンを含み得る。いくつかの実施
形態では、インターフェロンは、インターフェロン-αまたはインターフェロン-βであ
る。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、第2の治療剤もしくは治療
の前、後、または第2の治療剤もしくは治療と同時に投与される。いくつかの実施形態で
は、抗体またはその抗原結合断片は、対象に静脈内、皮下または腹腔内投与される。いく
つかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、予防的または治療的に投与される
本明細書に記載される抗体は、ダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)を中和し
、それによって、ダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)感染を治療するために、
他の抗TBEVウイルス抗体のうちの1つ以上とともに使用され得る。
併用療法
併用療法は、記載されるような抗TBEV抗体と、記載されるような抗体、または抗体
の生物学的に活性な断片と有利に組み合わせられ得る任意の追加の治療剤とを含み得る。
抗体は、ダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)感染などのウイルス感染に関連す
る疾患または障害を治療するために使用される1つ以上の薬物または療法と相乗的に組み
合わせられ得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、上記疾患の1つ以上の症状
を改善するために、第2の治療剤と組み合わせられ得る。いくつかの実施形態では、抗体
は、上記疾患の1つ以上の症状を改善する点で相乗活性を提供するために、第2の抗体と
組み合わせられ得る。いくつかの実施形態では、第1の抗体またはその抗原結合断片は、
第2の抗体もしくはその抗原結合断片の前、後、または第2の抗体もしくはその抗原結合
断片と同時に投与される。
例えば、本明細書に記載される抗体は、例えば、ダニ媒介フラビウイルス(例えば、T
BEV)感染の進行のモニタリング、そのような感染の治療に対する患者の応答のモニタ
リングなどに使用するための様々な検出方法に使用され得る。
いくつかの実施形態では、第2の治療剤は、ダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBE
V)タンパク質またはその断片に対する別の抗体である。本明細書では、ダニ媒介フラビ
ウイルス(例えば、TBEV)に対する広域中和または阻害活性を有する抗体の組合せ(
「カクテル」)を使用することが企図される。いくつかの実施形態では、非競合抗体を組
み合わせ、それを必要とする対象に投与してもよい。いくつかの実施形態では、組合せを
含む抗体は、タンパク質上の異なる重複しないエピトープに結合する。いくつかの実施形
態では、第2の抗体は、ヒト血清中でさらに長い半減期を有し得る。
本明細書で使用される場合、用語「と組み合わせて」は、追加の治療活性成分が、本発
明の抗TBEV抗体の投与前、投与と同時、または投与後に投与され得ることを意味する
。用語「と組み合わせて」はまた、抗TBEV抗体および第2の治療剤の連続または同時
投与を含む。
追加の治療活性成分は、本発明の抗TBEV抗体の投与前に対象に投与され得る。例え
ば、第1の成分が第2の成分の投与の1週間前、72時間前、60時間前、48時間前、
36時間前、24時間前、12時間前、6時間前、5時間前、4時間前、3時間前、2時
間前、1時間前、30分前、15分前、10分前、5分前、または1分未満前に投与され
る場合、第1の成分は、第2の成分「の前に」投与されると見なされ得る。他の実施形態
では、追加の治療活性成分は、本発明の抗TBEV抗体の投与後に対象に投与され得る。
例えば、第1の成分が第2の成分の投与の1分後、5分後、10分後、15分後、30分
後、1時間後、2時間後、3時間後、4時間後、5時間後、6時間後、12時間後、24
時間後、36時間後、48時間後、60時間後、72時間後に投与される場合、第1の成
分は、第2の成分「の後に」投与されると見なされ得る。さらに他の実施形態では、追加
の治療活性成分は、本発明の抗TBEV抗体の投与と同時に対象に投与され得る。本発明
の目的のための「同時」投与は、例えば、単一剤形で、または互いに約30分以下以内に
対象に投与される別個の剤形で、抗TBEV抗体および追加の治療活性成分を対象に投与
することを含む。別個の剤形で投与される場合、各剤形は、同じ経路を介して投与され得
る(例えば、抗TBEV抗体および追加の治療活性成分の両方は、静脈内などに投与され
得る)。あるいは、各剤形は、異なる経路を介して投与され得る(例えば、抗TBEV抗
体は静脈内投与されてもよく、追加の治療活性成分は経口投与されてもよい)。いずれの
場合も、本開示の目的のために、成分を単一剤形で、同じ経路によって別個の剤形で、ま
たは異なる経路によって別個の剤形で投与することは、いずれも「同時投与」と見なされ
る。本開示の目的のために、追加の治療活性成分の投与「の前に」、「と同時に」、また
は「の後に」(これらの用語は本明細書中上記で定義される)抗TBEV抗体を投与する
ことは、追加の治療活性成分「と組み合わせて」抗TBEV抗体を投与することと見なさ
れる。
本発明は、本発明の抗TBEV抗体が、本明細書中の他の箇所に記載されるような追加
の治療活性成分のうちの1つ以上と共製剤化される医薬組成物を含む。
投与レジメン
特定の実施形態によれば、記載されるような抗TBEV抗体(または抗TBEV抗体と
本明細書に記載される追加の治療活性剤のいずれかとの組合せを含む医薬組成物)の単回
用量が、それを必要とする対象に投与され得る。本発明の特定の実施形態によれば、抗T
BEV抗体(または抗TBEV抗体と本明細書に記載される追加の治療活性剤のいずれか
との組合せを含む医薬組成物)の複数回用量が、定義された時間経過にわたって対象に投
与され得る。本発明のこの態様による方法は、抗TBEV抗体の複数回用量を対象に連続
投与することを含む。本明細書で使用される場合、「連続投与する」は、抗TBEV抗体
の各用量を異なる時点、例えば、所定の間隔(例えば、数時間、数日、数週間または数ヶ
月)だけ隔てられた異なる日に対象に投与することを意味する。本開示は、抗TBEV抗
体の単回初期用量、続いて、抗TBEV抗体の1つ以上の二次用量、場合により、抗TB
EV抗体の1つ以上の三次用量を患者に連続投与することを含む方法を提供する。
用語「初期用量」、「二次用量」および「三次用量」は、本発明の抗TBEV抗体の投
与の時間的順序を指す。したがって、「初期用量」は、治療レジメンの開始時に投与され
る用量(「ベースライン用量」とも呼ばれる)であり、「二次用量」は、初期用量の後に
投与される用量であり、「三次用量」は、二次用量の後に投与される用量である。初期用
量、二次用量および三次用量はいずれも、同じ量の抗TBEV抗体を含有し得るが、一般
に、投与頻度に関して互いに異なり得る。ただし、いくつかの実施形態では、初期用量、
二次用量および/または三次用量に含有される抗TBEV抗体の量は、治療の経過中に互
いに異なる(例えば、適切であれば上下に調整される)。いくつかの実施形態では、2つ
以上(例えば、2、3、4または5つ)の用量が、治療レジメンの開始時に「負荷用量」
として投与され、続いて、さらに少ない頻度ベースで投与される後続用量(例えば、「維
持用量」)が投与される。
本発明の特定の例示的な実施形態では、各二次用量および/または三次用量は、直前の
用量の1~48時間(例えば、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、
5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、1
1.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、1
6.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、2
1.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、2
6.5またはそれ以上)後に投与される。本明細書で使用される「直前の用量」という語
句は、一連の複数回投与で、介在する用量を伴わず、その順番のまさに次の用量の投与の
前に患者に投与される抗TBEV抗体の用量を意味する。
本発明のこの態様による方法は、抗TBEV抗体の任意の数の二次用量および/または
三次用量を患者に投与することを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、単一の二
次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、2つ以上(例えば、2、3、4、5
、6、7、8またはそれ以上)の二次用量が患者に投与される。同様に、いくつかの実施
形態では、単一の三次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、2つ以上(例え
ば、2、3、4、5、6、7、8またはそれ以上)の三次用量が患者に投与される。
本発明のいくつかの実施形態では、二次用量および/または三次用量が患者に投与され
る頻度は、治療レジメンの経過にわたって変動し得る。投与の頻度はまた、臨床検査後の
個々の患者の必要性に応じて、医師によって治療の経過中に調整され得る。
抗体の診断用途
開示される抗TBEV抗体は、例えば、診断目的では、試料中のダニ媒介フラビウイル
ス(例えば、TBEV)を検出および/または測定するために使用され得る。いくつかの
実施形態は、ダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)関連疾患または障害を検出す
るためのアッセイにおける本発明の1つ以上の抗体の使用を企図する。TBEVの例示的
な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を抗TBEV抗体と接触させることを
含み得、抗TBEV抗体は、検出可能な標識もしくはレポーター分子によって標識される
か、または患者試料からTBEVを選択的に単離するための捕捉リガンドとして使用され
る。あるいは、非標識抗TBEV抗体は、それ自体が検出可能に標識されている二次抗体
と組み合わせて診断用途に使用され得る。検出可能な標識またはレポーター分子は、放射
性同位体、例えば、H、C、P、SもしくはI;蛍光部分もしくは化学発光部分、例えば
、フルオレセインイソチオシアネートもしくはローダミン;または酵素、例えば、アルカ
リホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはルシフ
ェラーゼであり得る。試料中のダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)を検出また
は測定するために使用され得る具体的な例示的なアッセイには、酵素結合免疫吸着測定法
(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)および蛍光標識細胞分取(FACS)
が含まれる。
別の態様では、本開示は、試料中のダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)の存
在を検出する方法であって、(i)試料を上記の抗体またはその抗原結合断片と接触させ
る工程と、(ii)1つ以上のダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)抗原への抗
体または抗原結合断片の結合を決定する工程とを含み、1つ以上のダニ媒介フラビウイル
ス(例えば、TBEV)抗原への抗体の結合が、試料中のダニ媒介フラビウイルス(例え
ば、TBEV)の存在を示す方法をさらに提供する。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、標識にコンジュゲートされ
る。いくつかの実施形態では、検出する工程は、二次抗体を抗体またはその抗原結合断片
と接触させることを含み、二次抗体は標識を含む。いくつかの実施形態では、標識には、
蛍光標識、化学発光標識、放射性標識および酵素が含まれる。
いくつかの実施形態では、検出する工程は、蛍光または化学発光を検出することを含む
。いくつかの実施形態では、検出する工程は、競合結合アッセイまたはELISAを含む
いくつかの実施形態では、該方法は、試料を固体支持体に結合させることをさらに含む
。いくつかの実施形態では、固体支持体には、微粒子、マイクロビーズ、磁気ビーズおよ
び親和性精製カラムが含まれる。
ダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)診断アッセイに使用され得る試料には、
正常または病理学的条件下で検出可能な量のダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV
)タンパク質またはその断片のいずれかを含有する、患者から得られる任意の組織または
体液試料が含まれる。一般に、健康な患者(例えば、ダニ媒介フラビウイルス(例えば、
TBEV)に関連する疾患に罹患していない患者)から得られた特定の試料中のTBEV
タンパク質のレベルを測定して、ダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)のベース
ラインレベルまたは標準レベルを最初に確立する。次いで、ダニ媒介フラビウイルス(例
えば、TBEV)のこのベースラインレベルと、ダニ媒介フラビウイルス(例えば、TB
EV)関連病態、またはそのような病態に関連する症状を有すると疑われる個体から得ら
れた試料中で測定されたダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)のレベルとを比較
することができる。
ダニ媒介フラビウイルス(例えば、TBEV)タンパク質に特異的な抗体は、追加の標
識もしくは部分を含有しなくてもよいか、またはN末端もしくはC末端の標識もしくは部
分を含有してもよい。一実施形態では、標識または部分はビオチンである。結合アッセイ
では、標識(存在する場合)の位置は、ペプチドが結合している表面に対するペプチドの
配向を決定し得る。例えば、表面がアビジンによってコーティングされている場合、N末
端ビオチンを含有するペプチドは、ペプチドのC末端部分が表面に対して遠位になるよう
に配向される。
D.キット
別の態様では、本開示は、上記の抗体もしくはその抗原結合断片または医薬組成物の薬
学的に許容される用量単位を含むキットを提供する。対象のダニ媒介フラビウイルス(例
えば、TBEV)関連感染もしくは疾患の診断、予後、または治療のモニタリングのため
のキットであって、記載される抗体またはその抗原結合断片と、抗体またはその抗原結合
断片に特異的に結合する少なくとも1つの検出試薬とを含むキットも本開示の範囲内であ
る。
いくつかの実施形態では、キットはまた、組成物と場合により情報資料とを収容する容
器を含む。情報資料は、本明細書に記載の方法および/または治療上の利益のための薬剤
の使用に関する記述的資料、指導的資料、マーケティング資料または他の資料であり得る
。一実施形態では、上記のように、キットは追加の治療剤も含む。例えば、キットは、組
成物を収容する第1の容器と、追加の治療剤のための第2の容器とを含む。
キットの情報資料は、その形態が限定されない。いくつかの実施形態では、情報資料は
、組成物の生成に関する情報、濃度、有効期限、バッチまたは製造場所情報などを含むこ
とができる。一実施形態では、情報資料は、それを必要とする対象を治療するために、例
えば、好適な用量、剤形または投与様式(例えば、本明細書に記載される用量、剤形また
は投与様式)で組成物を投与する方法に関する。一実施形態では、説明書は、組成物また
は追加の治療剤の投与レジメン、投与スケジュールおよび/または投与経路を提供する。
情報は、印刷されたテキスト、コンピュータ可読資料、ビデオ記録、もしくはオーディオ
記録、または実体的な資料へのリンクもしくはアドレスを含む情報を含む様々な形式で提
供され得る。
キットは、組成物用の1つ以上の容器を含むことができる。いくつかの実施形態では、
キットは、組成物および情報資料のための別個の容器、仕切りまたは区画を含む。例えば
、組成物は、ボトルまたはバイアルに収容され得、情報資料は、プラスチックスリーブま
たはパケットに収容され得る。他の実施形態では、キットの別個の要素は、単一の分割さ
れていない容器内に収容される。例えば、組成物は、ラベルの形態で情報資料が取り付け
られたボトルまたはバイアルに収容される。いくつかの実施形態では、キットは、各々が
薬剤の1つ以上の単位剤形(例えば、本明細書に記載される剤形)を収容する複数(例え
ば、パック)の個々の容器を含む。
キットは、場合により、組成物の投与に適した装置、または他の好適な送達装置を含む
。装置は、薬剤の一方もしくは両方が予め充填されて提供されてもよいか、または空であ
ってもよいが、充填に適していてもよい。そのようなキットは、場合により、キット内に
含まれる抗体をヒトなどの動物に注射することを可能にするためのシリンジを含んでもよ
い。
E.定義
本開示による組成物および方法の詳細な説明の理解を助けるために、いくつかの明示的
な定義が提供されて、本開示の様々な態様の明確な開示を容易にする。別途定義しない限
り、本明細書で使用されるあらゆる技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野
の当業者が通常理解するものと同一の意味を有する。
本明細書で言及される用語「抗体」は、抗体全体およびその任意の抗原結合断片または
一本鎖を含む。抗体全体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも2本の
重(H)鎖および2本の軽(L)鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域
(本明細書ではVHと略される)および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、
3つのドメイン、CH1、CH2およびCH3から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域
(本明細書ではVLと略される)および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、
1つのドメイン、CLから構成される。VH領域およびVL領域は、フレームワーク領域
(FR)と呼ばれる保存度の高い領域が散在する、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる
超可変領域にさらに細分され得る。各VHおよびVLは、アミノ末端からカルボキシ末端
に向かって、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順序で
配置された3つのCDRおよび4つのFRから構成される。重鎖可変領域CDRおよびF
Rは、HFR1、HCDR1、HFR2、HCDR2、HFR3、HCDR3、HFR4
である。軽鎖可変領域CDRおよびFRは、LFR1、LCDR1、LFR2、LCDR
2、LFR3、LCDR3、LFR4である。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互
作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞(例えば、エ
フェクター細胞)と、古典的補体系の第1の成分(C1q)とを含む宿主組織または因子
への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
本明細書で使用される抗体の「抗原結合断片または部分」(または単に「抗体断片また
は部分」)という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の1つ以上の断
片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって行われ得ることが示されてい
る。抗体の「抗原結合断片または部分」という用語に包含される結合断片の例には、(i
)Fab断片、VLドメイン、VHドメイン、CLドメインおよびCH1ドメインからな
る一価断片;(ii)F(ab’)2断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結
された2つのFab断片を含む二価断片;(iii)本質的にヒンジ領域の一部を有する
FabであるFab’断片(FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul
ed.,3rd ed.1993)を参照);(iv)VHドメインおよびCH1ドメ
インからなるFd断片;(v)抗体の単一アームのVLドメインおよびVHドメインから
なるFv断片、(vi)VHドメインからなるdAb断片(Ward et al.,(
1989)Nature 341:544-546);(vii)単離されたCDR;な
らびに(viii)ナノボディ、単一の可変ドメインと2つの定常ドメインとを含有する
重鎖可変領域が挙げられる。さらに、Fv断片の2つのドメインと、VLと、VHとは別
個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え方法を使用して、VL領域および
VH領域が対になって一価分子を形成する単一タンパク質鎖としてそれらが作製されるこ
とを可能にする合成リンカーによって連結され得る(一本鎖FvまたはscFvとして知
られる)。例えば、Bird et al.(1988)Science 242:42
3-426;およびHuston et al.(1988)Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 85:5879-5883)を参照されたい。そのような一本鎖
抗体はまた、抗体の「抗原結合断片または部分」という用語に包含されることが意図され
る。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を使用して得られ、断片は、インタ
クトな抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
本明細書で使用される「単離された抗体」は、様々な抗原特異性を有する他の抗体を実
質的に含まない抗体を指すことが意図される。単離された抗体は、他の細胞材料および/
または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物
」は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエ
ピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
用語「ヒト抗体」は、フレームワーク領域およびCDR領域の両方がヒト生殖系列免疫
グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことが意図される。さらに、抗体
が定常領域を含有する場合、その定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する
。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ
酸残基(例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によって、または
インビボでの体細胞変異によって導入された変異)を含み得る。ただし、本明細書で使用
される用語「ヒト抗体」は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCDR配
列がヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むことを意図するものではな
い。
用語「ヒトモノクローナル抗体」は、フレームワーク領域およびCDR領域の両方がヒ
ト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する、単一の結合特異性を示す抗
体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖
導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動
物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたB細胞を含むハイブリドーマによっ
て産生され得る。
本明細書で使用される用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段によって調製、発現、作
製または単離されるあらゆるヒト抗体、例えば、(a)ヒト免疫グロブリン遺伝子につい
てトランスジェニックもしくはトランスクロモソーマル(transchromosom
al)である動物(例えば、マウス)、またはそれから調製されたハイブリドーマから単
離された抗体(以下にさらに記載される)、(b)ヒト抗体を発現するように形質転換さ
れた宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、(c)組換えコ
ンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および(d)他のDNA配列
へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製
、発現、作製または単離された抗体を含む。そのような組換えヒト抗体は、フレームワー
ク領域およびCDR領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する
。ただし、いくつかの実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発
(または、ヒトIg配列についてトランスジェニックな動物を使用する場合、インビボ体
細胞変異誘発)に供され得、したがって、組換え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ
酸配列は、ヒト生殖系列VH配列およびVL配列に由来し、関連するが、インビボでヒト
抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在し得ない配列である。
用語「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス(例え
ば、IgMまたはIgG1)を指す。「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗
体」という語句は、本明細書では、用語「抗原に特異的に結合する抗体」と区別なく使用
される。
用語「ヒト抗体誘導体」は、ヒト抗体の任意の改変形態、例えば、抗体と別の薬剤また
は抗体とのコンジュゲートを指す。用語「ヒト化抗体」は、マウスなどの別の哺乳動物種
の生殖系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を
指すことが意図される。ヒトフレームワーク配列内で追加のフレームワーク領域改変を行
うことができる。
用語「キメラ抗体」は、可変領域配列が1つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由
来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由
来する抗体を指すことが意図される。該用語はまた、その可変領域配列またはCDRが1
つの供給源(例えば、IgA1抗体)に由来し、定常領域配列またはFcが異なる供給源
(例えば、IgG抗体、IgA2抗体、IgD抗体、IgE抗体またはIgM抗体などの
異なる抗体)に由来する抗体を指すことができる。
本発明は、単離されたまたは実質的に精製された核酸、ペプチド、ポリペプチドまたは
タンパク質を包含する。本発明に関連して、「単離された」核酸、DNA分子もしくはR
NA分子または「単離された」ポリペプチドは、その天然環境から離れて存在し、したが
って、天然の産物ではない核酸、DNA分子、RNA分子またはポリペプチドである。単
離された核酸、DNA分子、RNA分子またはポリペプチドは、精製された形態で存在し
てもよいか、または例えば、トランスジェニック宿主細胞などの非天然環境に存在しても
よい。「精製された」核酸分子、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質またはその
断片は、組換え技術によって産生された場合、他の細胞材料もしくは培養培地を実質的に
含まないか、または化学合成された場合、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含
まない。一実施形態では、「単離された」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムDNA内
の核酸(すなわち、核酸の5’末端および3’末端に位置する配列)に天然に隣接する配
列を含まない。例えば、様々な実施形態では、単離された核酸分子は、核酸が由来する細
胞のゲノムDNA内の核酸分子に天然に隣接する約5kb未満、約4kb未満、約3kb
未満、約2kb未満、約1kb未満、約0.5kb未満または約0.1kb未満のヌクレ
オチド配列を含有し得る。細胞材料を実質的に含まないタンパク質、ペプチドまたはポリ
ペプチドは、(乾燥重量で)約30%未満、約20%未満、約10%未満または約5%未
満の混入タンパク質を有するタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドの調製物を含む。
本発明のタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え産生される場合、好ましく
は培養培地は、(乾燥重量で)約30%未満、約20%未満、約10%未満または約5%
未満の化学前駆体、または目的のタンパク質以外の化学物質を表す。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では区別なく
使用されて、任意の長さのアミノ酸の高分子を指す。高分子は、直鎖状または分岐状であ
ってよく、改変アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。該
用語はまた、改変されたアミノ酸高分子、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化
、脂質付加、アセチル化、リン酸化、ペグ化、または標識成分とのコンジュゲーションな
どの任意の他の操作を包含する。本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、グリ
シン、およびDまたはL光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣
物を含む天然および/もしくは非天然または合成アミノ酸を含む。
本明細書で使用されるペプチド「断片」またはポリペプチド「断片」は、全長未満のペ
プチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。例えば、ペプチド断片またはポリペプチ
ド断片は、少なくとも約3、少なくとも約4、少なくとも約5、少なくとも約10、少な
くとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40アミノ酸長、またはその単一単位長
を有することができる。例えば、断片は、6、7、8、9、10、11、12、13、1
4、15、16、17またはそれ以上のアミノ酸長であり得る。ペプチド断片のサイズに
上限はない。ただし、いくつかの実施形態では、ペプチド断片は、約500アミノ酸未満
、約400アミノ酸未満、約300アミノ酸未満または約250アミノ酸未満の長さであ
り得る。好ましくは、ペプチド断片は、動物に接種するために使用される場合、免疫応答
を誘発することができる。ペプチド断片は、アジュバントと組み合わせたペプチド断片、
アジュバントに結合したペプチド断片、またはアルサニル酸、スルファニル酸、アセチル
基もしくはピクリール基に結合したペプチド断片を動物に接種することによって免疫応答
を誘発するために使用され得る。ペプチド断片は、非アミド結合を含むことができ、ペプ
チド模倣物であり得る。
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される用語「コンジュゲート」または「コ
ンジュゲーション」または「連結された」は、1つの実体を形成するための2つ以上の実
体の結合を指す。コンジュゲートは、ペプチド-小分子コンジュゲートおよびペプチド-
タンパク質/ペプチドコンジュゲートの両方を包含する。
本明細書で使用される用語「組換え」は、例えば、DNAスプライシングおよびトラン
スジェニック発現を含む組換えDNA技術として当技術分野で公知の技術または方法によ
って作製されるか、発現されるか、単離されるか、または得られる、本発明の抗体または
その抗原結合断片を指す。該用語は、非ヒト哺乳動物(トランスジェニック非ヒト哺乳動
物、例えば、トランスジェニックマウスを含む)もしくは細胞(例えば、CHO細胞)発
現系内で発現されるか、または組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離さ
れる抗体を指す。
「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、DNA分子(例えば、限定するものではない
が、cDNAまたはゲノムDNA)またはRNA分子(例えば、限定するものではないが
、mRNA)を指し、DNA類似体またはRNA類似体を含む。DNA類似体またはRN
A類似体は、ヌクレオチド類似体から合成され得る。DNA分子またはRNA分子は、天
然に存在しない部分、例えば、改変塩基、改変骨格、RNA内のデオキシリボヌクレオチ
ドなどを含み得る。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。
核酸またはその断片に言及する場合の用語「実質的な同一性」または「実質的に同一」
は、別の核酸(またはその相補鎖)との適切なヌクレオチド挿入または欠失と最適にアラ
インメントした場合、以下に説明されるように、配列同一性の任意の周知のアルゴリズム
、例えば、FASTA、BLASTまたはGAPによって測定した場合に、ヌクレオチド
塩基の少なくとも約90%、さらに好ましくは少なくとも約95%、96%、97%、9
8%または99%にヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子に対して実
質的な同一性を有する核酸分子は、特定の例では、参照核酸分子によってコードされるポ
リペプチドと同じまたは実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得
る。
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的な類似性」または「実質的に類似する」
は、2つのペプチド配列が、デフォルトのギャップ重みを使用するプログラムGAPまた
はBESTFITなどによって最適にアラインメントされた場合、少なくとも90%の配
列同一性、さらになお好ましくは少なくとも95%、98%または99%の配列同一性を
共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によ
って異なる。「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、類似の化学的特性(例え
ば、電荷または疎水性)を有する側鎖(R基)を有する別のアミノ酸残基によって置換さ
れているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的
に変化させない。2つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、類似
性のパーセントまたは程度は、置換の保存的性質を補正するために上方に調整され得る。
この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み
込まれるPearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307
-331を参照されたい。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例には
、1)脂肪族側鎖:グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン;2)脂
肪族-ヒドロキシル側鎖:セリンおよびスレオニン;3)アミド含有側鎖:アスパラギン
およびグルタミン;4)芳香族側鎖:フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン
;5)塩基性側鎖:リジン、アルギニンおよびヒスチジン;6)酸性側鎖:アスパルテー
トおよびグルタメート、ならびに7)硫黄含有側鎖:システインおよびメチオニンが挙げ
られる。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニル
アラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタメート-アスパル
テート、およびアスパラギン-グルタミンである。あるいは、保存的置換は、参照により
本明細書に組み込まれるGonnet et al.(1992)Science 25
6:1443 45に開示されているPAM250対数尤度行列(log-likeli
hood matrix)において正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的
な」置換は、PAM250対数尤度行列において負ではない値を有する任意の変化である
ポリペプチドの配列類似性は、典型的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定され
る。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失および
他の改変に割り当てられた類似性の尺度を使用して類似配列をマッチングする。例えば、
GCGソフトウェアは、GAPおよびBESTFITなどのプログラムを含み、これをデ
フォルトパラメータとともに使用して、密接に関連するポリペプチド間、例えば、異なる
生物種由来の相同ポリペプチド間、または野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列
相同性または配列同一性を決定することができる。例えば、GCG Version 6
.1を参照されたい。ポリペプチド配列はまた、GCG Version 6.1のプロ
グラムであるFASTAを使用して、デフォルトパラメータまたは推奨パラメータと比較
され得る。FASTA(例えば、FASTA2およびFASTA3)は、クエリ配列と検
索配列との間の最良の重複の領域のアラインメントおよびパーセント配列同一性を提供す
る(Pearson(2000)上記)。本発明の配列と、異なる生物由来の多数の配列
を含むデータベースとを比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメ
ータを使用するコンピュータプログラムBLAST、特にBLASTPまたはTBLAS
TNである。例えば、各々参照により本明細書に組み込まれるAltschul et
al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410および(1997)
Nucleic Acids Res.25:3389-3402を参照されたい。
本明細書で使用される場合、用語「親和性」は、分子の単一の結合部位(例えば、抗体
)とその結合パートナー(例えば、抗原)との間の非共有結合相互作用の総和の強さを指
す。別段の指定がない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメ
ンバー(例えば、抗体および抗原)間の1:1相互作用を反映する固有の結合親和性を指
す。そのパートナーYに対する分子Xの親和性は、一般に、解離定数(KD)によって表
され得る。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当技術分野で公知の一般的な方
法によって測定され得る。
用語「特異的に結合する」または「に特異的に結合する」などは、例えば、生理学的条
件下で単一のエピトープに結合するが複数のエピトープに結合しない抗体を指す。したが
って、ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、そのポリペプチド上に存在するが他のポ
リペプチド上には存在しないエピトープに結合する。特異的結合は、少なくとも約1×1
-8M以下の平衡解離定数を特徴とし得る(例えば、KDが小さいほど、結合が密であ
ることを示す)。2つの分子が特異的に結合するかどうかを決定する方法は、当技術分野
で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。
例えば、抗体は、表面プラズモン共鳴、例えば、BIACOREによって決定される場
合、「高い親和性」で、すなわち、1×10-7M以下、さらに好ましくは5×10-8
M以下、さらに好ましくは3×10-8M以下、さらに好ましくは1×10-8M以下、
さらに好ましくは5×10-9M以下、またはさらになお好ましくは1×10-9M以下
のKDでエピトープに結合する。タンパク質または細胞に「実質的に結合しない」という
用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質または細胞に結合しないかまたは高い親
和性で結合しない、すなわち、1×10-6M以上、さらに好ましくは1×10-5M以
上、さらに好ましくは1×10-4M以上、さらに好ましくは1×10-3M以上、さら
になお好ましくは1×10-2M以上のKDでタンパク質または細胞に結合することを意
味する。
本明細書で使用される用語「Kassoc」または「Ka」は、特定の抗体-抗原相互
作用の会合速度を指すことが意図されるのに対して、本明細書で使用される用語「Kdi
s」または「Kd」は、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度を指すことが意図される。
本明細書で使用される用語「KD」は、Kd対Ka(すなわち、Kd/Ka)の比から得
られ、モル濃度(M)として表される解離定数を指すことが意図される。抗体のKD値は
、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定され得る。抗体のKDを決定するた
めの好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を使用すること、好ましくはBIACOREシ
ステムなどのバイオセンサシステムを使用することによるものである。
「標的への結合について別の抗体と競合する」抗体とは、標的への他の抗体の結合を(
部分的または完全に)阻害する抗体を指す。2つの抗体が標的への結合について互いに競
合するかどうか、すなわち、一方の抗体が、標的への他方の抗体の結合を阻害するかどう
か、およびどの程度阻害するかは、公知の競合実験を使用して決定され得る。いくつかの
実施形態では、抗体は、標的に対する別の抗体と競合し、標的に対する別の抗体の結合を
少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%
または100%阻害する。阻害または競合のレベルは、どの抗体が「ブロッキング抗体」
(すなわち、標的と最初にインキュベートされる冷抗体)であるかに応じて異なり得る。
競合アッセイは、例えば、Ed Harlow and David Lane,Col
d Spring Harb Protoc;2006、またはChapter 11
of “Using Antibodies“ by Ed Harlow and D
avid Lane,Cold Spring Harbor Laboratory
Press,Cold Spring Harbor,NY,USA 1999に記載さ
れているように行われ得る。競合抗体は、同じエピトープ、重複するエピトープ、または
隣接するエピトープに結合する(例えば、立体障害によって証明されるように)。他の競
合結合アッセイには、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ(RIA)、固相直接ま
たは間接酵素イムノアッセイ(EIA)、サンドイッチ競合アッセイ(Stahli e
t al.,Methods in Enzymology 9:242(1983)を
参照);固相直接ビオチン-アビジンEIA(Kirkland et al.,J.I
mmunol.137:3614(1986)を参照);固相直接標識アッセイ、固相直
接標識サンドイッチアッセイ(Harlow and Lane,Antibodies
:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor
Press(1988)を参照);1-125標識を使用する固相直接標識RIA(Mo
rel et al.,Mol.Immunol.25(1):7(1988)を参照)
;固相直接ビオチン-アビジンEIA(Cheung et al.,Virology
176:546(1990));および直接標識RIAが含まれる。(Moldenh
auer et al.,Scand.J.Immunol.32:77(1990))
本明細書で使用される用語「エピトープ」は、パラトープとして知られる抗体分子の可
変領域内の特定の抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原が、複数の
エピトープを有し得る。したがって、様々な抗体が、抗原上の様々な領域に結合し得、様
々な生物学的効果を有し得る。用語「エピトープ」はまた、B細胞および/またはT細胞
が応答する、抗原上の部位を指す。それはまた、抗体によって結合される抗原の領域を指
す。エピトープは、構造的または機能的として定義され得る。機能的エピトープは、一般
に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有す
る。エピトープはまた、立体構造的であってよく、すなわち、非直鎖アミノ酸から構成さ
れ得る。いくつかの実施形態では、エピトープは、分子の化学的に活性な表面基、例えば
、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基である決定基を含み得、いくつか
の実施形態では、特定の三次元構造特性および/または特定の電荷特性を有し得る。エピ
トープは、典型的には、固有の空間的立体構造に少なくとも3、4、5、6、7、8、9
、10、11、12、13、14または15個のアミノ酸を含む。所与の抗体がどのエピ
トープに結合しているかを決定する方法(すなわち、エピトープマッピング)は、当技術
分野で周知である。エピトープの空間的立体構造を決定する方法には、当技術分野におけ
る技術、ならびに本明細書に記載の技術、例えば、X線結晶解析法および2次元核磁気共
鳴が含まれる(例えば、Epitope Mapping Protocols in
Methods in Molecular Biology,Vol.66,G.E.
Morris,Ed.(1996)を参照)。
用語「エピトープマッピング」は、抗体-抗原認識のための分子決定基の同定プロセス
を指す。
抗体または抗体断片に関して、用語「エピトープに結合する」または「エピトープを認
識する」は、抗原内のアミノ酸の連続または不連続セグメントを指す。当業者であれば、
該用語が、抗体または抗体断片がエピトープ配列内のあらゆるアミノ酸と直接接触してい
ることを必ずしも意味しないことを理解している。
2つ以上の抗体に関して、用語「同じエピトープに結合する」は、抗体がアミノ酸の同
じ、重複する、または包含する連続または不連続セグメントに結合することを意味する。
当業者であれば、「同じエピトープに結合する」という語句が、抗体が正確に同じアミノ
酸に結合するかまたは接触することを必ずしも意味しないことを理解している。抗体が接
触する正確なアミノ酸は異なり得る。例えば、第1の抗体は、第2の抗体によって結合さ
れるアミノ酸のセグメントによって完全に包含される、アミノ酸のセグメントに結合する
ことができる。別の例では、第1の抗体は、第2の抗体によって結合される1つ以上のセ
グメントと顕著に重複する、アミノ酸の1つ以上のセグメントに結合する。本明細書の目
的のために、そのような抗体は、「同じエピトープに結合する」と見なされる。
本明細書で使用される場合、用語「免疫応答」は、外来因子に対する脊椎動物内の生物
学的応答を指し、この応答は、これらの因子、およびそれらによって引き起こされる疾患
から生物を保護する。免疫応答は、免疫系の細胞(例えば、Tリンパ球、Bリンパ球、ナ
チュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞または好中
球)およびこれらの細胞または肝臓のいずれかによって産生される可溶性巨大分子(抗体
、サイトカインおよび補体を含む)の作用によって媒介され、侵入している病原体、病原
体に感染した細胞もしくは組織、癌性もしくは他の異常な細胞、または自己免疫もしくは
病理学的炎症の場合、正常なヒト細胞もしくは組織の選択的標的化、それらへの結合、損
傷、それらの破壊、および/または脊椎動物の体からのそれらの排除をもたらす。免疫反
応には、例えば、T細胞、例えば、エフェクターT細胞もしくはTh細胞、例えば、CD
4+もしくはCD8+T細胞の活性化もしくは阻害、またはTreg細胞の阻害が含まれ
る。
本明細書で使用される用語「検出可能な標識」は、限定するものではないが、放射性同
位体、蛍光体、化学発光体(chemiluminescer)、発色団、酵素、酵素基
質、酵素補因子、酵素阻害剤、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド(例えば
、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはハプテン)、インターカレーター性色
素などを含む検出可能な分子を指す。用語「蛍光体」は、検出可能な範囲の蛍光を示すこ
とができる物質またはその一部を指す。
多くの実施形態では、用語「対象」および「患者」は、対象が任意の形態の治療を受け
ているかまたは現在受けているかに関係なく、区別なく使用される。本明細書で使用され
る場合、用語「対象(subject)」および「対象(subjects)」は、限定
するものではないが、哺乳動物(例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサ
ギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラットおよびマウス、非ヒト霊長類
(例えば、カニクイザル、チンパンジーなどのサル)およびヒト)を含む任意の脊椎動物
を指し得る。対象は、ヒトまたは非ヒトであり得る。さらに例示的な態様では、哺乳動物
はヒトである。本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」または「それを必
要とする患者」という表現は、障害(例えば、ニューロン障害、自己免疫疾患および心血
管疾患)の1つ以上の症状もしくは徴候を示す、および/または炎症性障害と診断された
ヒトまたは非ヒト哺乳動物を意味する。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である
。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
本明細書で使用される場合、用語「疾患」は、いずれも、正常な機能を損なう、ヒトも
しくは動物の身体またはその一部の異常な状態(例えば、炎症性障害)を反映し、典型的
には徴候および症状を区別することによって表され、ヒトまたは動物の寿命または生活の
質を低下させるという点で、(医学的病態のように)用語「障害」および「病態」と一般
に同義であることが意図され、区別なく使用される。
本明細書で使用される場合、任意の疾患または障害を「治療する」またはそれらの「治
療」という用語は、一実施形態では、疾患または障害を改善すること(すなわち、疾患、
またはその臨床症状のうちの少なくとも1つの発症を停止または減少させること)を指す
。別の実施形態では、「治療する」または「治療」は、患者が認識できない可能性がある
少なくとも1つの物理的パラメータを改善することを指す。さらに別の実施形態では、「
治療する」または「治療」は、物理的に、(例えば、認識可能な症状の安定化)、生理学
的に、(例えば、物理的パラメータの安定化)、またはその両方で疾患または障害を調節
することを指す。さらに別の実施形態では、「治療する」または「治療」は、疾患または
障害の発現または発症または進行を予防するかまたは遅延させることを指す。
用語「予防する(prevent)」、「予防する(preventing)」、「予
防(prevention)」、「予防的治療(prophylactic treat
ment)」などは、障害または病態を有しないが、障害または病態を発症するリスクが
あるかまたは発症しやすい対象において障害または病態を発症する確率を低下させること
を指す。
用語「低下する(decrease)」、「減少した(reduced)」、「減少(
reduction)」、「低下する(decrease)」または「阻害する(inh
ibit)」はいずれも、本明細書では一般に、統計的に有意な量の低下を意味するため
に使用される。ただし、誤解を避けるために、「減少した(reduced)」、「減少
(reduction)」または「低下する(decrease)」または「阻害する(
inhibit)」は、参照レベルと比較して少なくとも10%の低下、例えば、少なく
とも約20%、もしくは少なくとも約30%、もしくは少なくとも約40%、もしくは少
なくとも約50%、もしくは少なくとも約60%、もしくは少なくとも約70%、もしく
は少なくとも約80%、もしくは少なくとも約90%、もしくは100%以下の低下(例
えば、参照試料と比較して存在しないレベル)、または参照レベルと比較して10~10
0%の任意の低下を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「薬剤」は、化学化合物、化学化合物の混合物、生物
学的巨大分子(例えば、核酸、抗体、タンパク質またはその一部、例えば、ペプチド)、
または細菌、植物、真菌、もしくは動物(特に哺乳動物)の細胞もしくは組織などの生物
学的材料から作製された抽出物を意味する。そのような薬剤の活性によって、そのような
薬剤は、対象において局所的または全身的に作用する生物学的、生理学的または薬理学的
に活性な物質(または複数の物質)である「治療剤」として好適になり得る。
本明細書で使用される場合、用語「治療剤(therapeutic agent)」
、「治療可能な薬剤(therapeutic capable agent)」または
「治療剤(treatment agent)」は、区別なく使用され、対象への投与時
に何らかの有益な効果を与える分子または化合物を指す。有益な効果には、診断判定の有
効化;疾患、症状、障害または病理学的状態の改善;疾患、症状、障害または病態の発現
を低減または予防すること;および一般に、疾患、症状、障害または病理学的状態に対抗
することが含まれる。
用語「治療効果」は、当技術分野で認識されており、薬理学的に活性な物質によって引
き起こされる、動物、特に哺乳動物、さらに具体的にはヒトにおける局所的または全身的
な効果を指す。
用語「有効量」、「有効用量」または「有効投与量」は、所望の効果を達成する、また
は少なくとも部分的に達成するのに十分な量として定義される。薬物または治療剤の「治
療有効量」または「治療有効投与量」は、単独でまたは別の治療剤と組み合わせて使用さ
れる場合、疾患症状の重症度の低下、疾患症状のない期間の頻度および持続期間の増加、
または疾患の苦痛に起因する機能障害もしくは障害の予防によって証明される疾患の後退
を促進する任意の量の薬物である。薬物の「予防有効量」または「予防有効投与量」は、
疾患を発症するリスクがあるかまたは疾患が再発するリスクがある対象に単独でまたは別
の治療剤と組み合わせて投与した場合に、疾患の発症または再発を阻害する量の薬物であ
る。疾患の後退を促進するか、または疾患の発症もしくは再発を阻害する治療剤または予
防剤の能力は、例えば、臨床試験中のヒト対象に対して、ヒトにおける有効性を予測する
動物モデル系に対して、またはインビトロアッセイで薬剤の活性をアッセイすることによ
って、当業者に公知の様々な方法を使用して評価され得る。
用量は、体重に関連して表されることが多い。したがって、[g、mgまたは他の単位
]/kg(またはg、mgなど)として表される用量は、用語「体重」が明示的に言及さ
れていなくても、通常、[g、mgまたは他の単位]「/kg(またはg、mgなど)体
重」を指す。
本明細書で使用される場合、用語「組成物」または「医薬組成物」は、本発明内で有用
な少なくとも1つの成分と、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤および/
または賦形剤などの他の成分との混合物を指す。医薬組成物は、生物に本発明の1つ以上
の成分を投与するのを容易にする。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、組成物の生物学的活性ま
たは特性を無効にせず、比較的非毒性である担体または希釈剤などの材料を指し、すなわ
ち、材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことがないか、またはそれが含有さ
れる組成物の成分のいずれとも有害な様式で相互作用することなく個体に投与され得る。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、その意図された機能
を果たし得るように本発明の化合物を対象内にまたは対象に運ぶまたは輸送することに関
与する、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される材料、組成物または担体、例えば、
液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料を含む。典型的に
は、そのような化合物は、1つの器官、または身体の一部から、別の器官、または身体の
一部に運ばれるかまたは輸送される。各塩または担体は、製剤の他の成分と適合性であり
、対象に有害ではないという意味で「許容され」なければならない。薬学的に許容される
担体として機能し得る材料のいくつかの例には、糖、例えば、ラクトース、グルコースお
よびスクロース;デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン;
セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチル
セルロースおよび酢酸セルロース;トラガント粉末;麦芽;ゼラチン;タルク;賦形剤、
例えば、カカオバターおよび坐剤ワックス;油、例えば、落花生油、綿実油、ベニバナ油
、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油;グリコール、例えば、プロピレングリコ
ール;ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレ
ングリコール;エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル;寒天;緩
衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム;アルギン酸;パイロジェ
ンフリー水;等張食塩水;リンガー液;エチルアルコール;リン酸緩衝液;希釈剤;造粒
剤;潤滑剤;結合剤;崩壊剤;濡れ剤;乳化剤;着色剤;剥離剤;コーティング剤;甘味
剤;香味剤;香料;保存剤;酸化防止剤;可塑剤;ゲル化剤;増粘剤;硬化剤;固化剤;
懸濁化剤;界面活性剤;保水剤;担体;安定剤;ならびに医薬製剤に使用される他の非毒
性適合性物質、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。本明細書で使用される場合、
「薬学的に許容される担体」はまた、本発明の1つ以上の成分の活性と適合性であり、対
象にとって生理学的に許容される、ありとあらゆるコーティング、抗細菌剤および防カビ
剤、ならびに吸収遅延剤などを含む。補助的な活性化合物も組成物に組み込まれ得る。
本明細書で使用される「併用」療法は、文脈から明らかでない限り、協調した様式での
2つ以上の治療剤の投与を包含することを意味し、限定するものではないが、同時投与を
含む。具体的には、併用療法は、ある治療剤の投与が別の治療剤の投与に対して何らかの
方法で調整されるという条件で、同時投与(例えば、共製剤の投与、または別個の治療用
組成物の同時投与)および順次または連続投与の両方を包含する。例えば、ある治療剤は
、異なる治療剤が投与され、所定の期間にわたって作用させられた後にのみ投与され得る
。例えば、Kohrt et al.(2011)Blood 117:2423を参照
されたい。
本明細書で使用される場合、用語「同時投与」または「同時投与された」は、対象への
少なくとも2つの薬剤または療法の投与を指す。いくつかの実施形態では、2つ以上の薬
剤/療法の同時投与は同時である。他の実施形態では、第1の薬剤/療法は、第2の薬剤
/療法の前に投与される。当業者であれば、使用される様々な薬剤/療法の製剤化および
/または投与経路が変動し得ることを理解している。
本明細書で使用される場合、用語「接触させる」は、任意の一連の成分に関して使用さ
れる場合、接触させる成分が同じ混合物に混合される(例えば、同じ区画または溶液に加
えられる)任意のプロセスを含み、列挙された成分間の実際の物理的接触を必ずしも必要
としない。列挙された成分は、任意の順序または任意の組合せ(または部分的組合せ)で
接触させることができ、列挙された成分のうちの1つまたはいくつかが、場合により他の
列挙された成分を加える前に混合物から続いて除去される状況を含むことができる。例え
ば、「AをBおよびCと接触させる」は、以下の状況のいずれかおよび全部を含む:(i
)AをCと混合し、次いで、Bを混合物に加える;(ii)AおよびBを混合物に混合し
、Bを混合物から除去し、次いで、Cを混合物に加える;ならびに(iii)AをBとC
との混合物に加える。
「試料」、「試験試料」および「患者試料」は、本明細書では区別なく使用され得る。
試料は、血清、尿血漿、羊水、脳脊髄液、細胞または組織の試料であり得る。そのような
試料は、本明細書に説明されるように、または当技術分野で公知のように何らかの方法で
試料の特性を改変するために、患者から得られたものとして直接使用され得るか、または
濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、干渉成分の不活性化、試薬の添加などによって前処
理され得る。本明細書で使用される用語「試料」および「生物学的試料」は、一般に、抗
体などの目的の分析物について試験されているおよび/またはそれを含有すると疑われる
生物学的材料を指す。試料は、対象由来の任意の組織試料であり得る。試料は、対象由来
のタンパク質を含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「インビトロ」は、多細胞生物内ではなく、人工的な
環境、例えば、試験管または反応容器内、細胞培養物中などで起こる事象を指す。
本明細書で使用される場合、用語「インビボ」は、非ヒト動物などの多細胞生物内で起
こる事象を指す。
本明細書で使用される場合、単数形「a」、「and」および「the」は、文脈上明
らかに別段の指示がない限り、複数の参照対象を含む。
本明細書で使用される場合、用語「含む(including)」、「含む(comp
rising)」、「含有する(containing)」または「有する(havin
g)」およびその変形例は、特に明記しない限り、その後に列挙される項目およびその均
等物ならびに追加の主題を包含することを意味する。
本明細書で使用される場合、「一実施形態では」、「様々な実施形態では」、「いくつ
かの実施形態では」などの語句は、繰り返し使用される。そのような語句は、必ずしも同
じ実施形態を指すわけではないが、文脈上別段の指示がない限り、同じ実施形態を指し得
る。
本明細書で使用される場合、用語「および/または」または「/」は、この用語が関連
する項目のいずれか1つ、項目の任意の組合せ、または項目のすべてを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「実質的に」は、「完全に」を排除するものではなく
、例えば、「実質的に」Yを「含まない」組成物は、Yを完全に含まなくてもよい。必要
に応じて、用語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
本明細書で使用される場合、用語「各」は、項目の集合に関して使用される場合、集合
内の個々の項目を識別することが意図されるが、必ずしも集合内のすべての項目を指すと
は限らない。明示的な開示または文脈がそうでないことを明らかに指示する場合、例外が
発生する可能性がある。
本明細書で使用される場合、用語「およそ」または「約」は、目的の1つ以上の値に適
用される場合、記載された基準値と同様の値を指す。いくつかの実施形態では、用語「お
よそ」または「約」は、特に指示しない限り、または文脈から明らかでない限り(そのよ
うな数が可能な値の100%を超える場合を除く)、記載された基準値のいずれかの方向
(超または未満)で25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%
、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%
、1%またはそれ以下に入る値の範囲を指す。本明細書で別段の指定がない限り、用語「
約」は、個々の成分、組成物または実施形態の機能性に関して同等な列挙された範囲に近
い値、例えば、重量パーセントを含むことが意図される。
本明細書に開示されるように、値のいくつかの範囲が提供される。文脈上明確に別段の
指示がない限り、その範囲の上限と下限との間の、その下限の単位の10分の1までの各
介在する値も具体的に開示されていることが理解される。記載された範囲内の任意の記載
された値または介在する値と、その記載された範囲内の任意の他の記載された値または介
在する値との間の小さい方の各範囲は、本発明に包含される。これらの小さい方の範囲の
上限および下限は、独立して該範囲に含まれ得るか、または除外され得、いずれかの限界
、いずれでもない限界、または両方の限界が小さい方の範囲に含まれる各範囲もまた、本
発明内に包含され、記載された範囲内の任意の具体的に除外される限界に従属する。記載
された範囲が限界のうち一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかま
たは両方を除く範囲も本発明に含まれる。
本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的な言語(例えば、「など」)の使
用は、単に本発明をさらに良好に明らかにすることを意図するものであり、別段請求され
ない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいかなる言語も、特
許請求されていない要素を本発明の実施に必須であると示すと解釈されるべきではない。
本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書で別段の指定がない限り、または文脈
と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で行われる。提供される方法のいずれかに
関して、方法の工程は、同時にまたは連続して行われてもよい。方法の工程が連続して行
われる場合、特に明記しない限り、工程は任意の順序で行われてもよい。方法が工程の組
合せを含む場合、本明細書で特に明記しない限り、工程のありとあらゆる組合せまたは部
分的組合せが本開示の範囲内に包含される。
本明細書で引用される各刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、本開示と矛盾
しない限り、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書に開示された刊行物は、本発
明の出願日前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書中のいかなるものも、先
行発明によるそのような刊行物に本発明が先行する権利がないことの承認として解釈され
るべきではない。さらに、提供される刊行日は実際の刊行日とは異なることがあり、実際
の刊行日は独立して確認する必要があることがある。
本明細書に記載された例および実施形態は例示のみを目的としており、それに照らして
様々な修正または変更が当業者に示され、本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請
求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。
F.実施例
[実施例1]
この実施例は、以下の後続の実施例で使用される材料および方法を説明する。
ヒト対象および臨床情報
TBEV感染が確認されて以前に入院した個体から、またはHospital in
Ceske Budejovice(承認番号103/19)、Biology Cen
ter of the Czech Academy of Sciences(承認番
号1/2018)およびRockefeller University(IRB DR
O-0984)の倫理委員会によって承認されたプロトコルの下でチェコ共和国チェスケ
ー・ブジェヨヴィツェでTBEVに対して以前にワクチン接種された個体から同意を得て
、末梢血の試料を得た。治療病院で臨床データを取得し、以下の尺度に従って疾患の重症
度を評価した:軽度、発熱、疲労、吐き気、頭痛、背痛、関節痛/筋痛、および頸部また
は背部の硬直を特徴とする、髄膜炎として定義される、髄膜刺激を伴うインフルエンザ様
症状;中等度、髄膜脳炎として定義される、振戦、眩暈、傾眠および羞明を伴う以前の症
状;重度、脳炎、脳脊髄炎または脳脊髄神経根炎として明らかにされた、運動失調、揺動
、精神状態の変化、記憶喪失、意識の定量的障害、および麻痺を含む、長期の神経学的結
果(Bogovic,P.,and Strle,F.,(2015)World J
Clin Cases 3,430-441;Ruzek,D.,et al.,(20
19)Antiviral Res 164,23-51)。
血液試料の処理および保存
末梢血単核細胞(PBMC)を、Ficollを使用する勾配遠心分離によって得、凍
結培地(90%FCS、10%DMSO)中の液体窒素中で保存した。実験の前に、血清
のアリコート(感染血液バンクドナー、ワクチン接種血液バンクドナーおよびランダム血
液バンクドナー由来)を56℃で1時間熱不活化し、次いで、4℃で保存した。
タンパク質の発現および精製
EDIII抗原を大腸菌内で発現させ、以前に報告されたように封入体から精製した(
Robbiani,D.F.,et al.,(2017)Cell 169,597-
609 e511);Sapparapu,G.,et al.,(2016)Natu
re 540,443-447)。TBEV株Neudoerfl(TBEVWE;NC
_001672.1)の残基299~397、またはSofjin株(TBEVFE;U
niProtKB P07720)およびVasilchenko株(TBEVSi;A
F069066)の残基301~397をコードするコドン最適化配列を含有する発現ベ
クターを使用して、タグなしEDIIIタンパク質、またはC末端6XHis-Avit
agを含有するEDIIIタンパク質を産生した。他のダニ媒介フラビウイルスのタグな
しEDIIIをコードする構築物を同様に構築した(POWV株LB、GenBank
L04636.1;POWV単離物DTV;KFDV株W-377、JF416960.
1;LGTV株TP21-636、NC_003690.1;LIV単離物LI3/1、
KP144331.1;OHFV株Bogoluvovska、NC_005062)。
発現プラスミドをBL21(DE3)大腸菌に形質転換し、1mMイソプロピルβ-D-
1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を用いて37℃で4時間誘導した。細胞を溶解
し、封入体を含有する不溶性画分を可溶化し、4℃で400mM L-アルギニン、10
0mM Tris塩基pH8.0、2mM EDTA、0.2mMフェニル-メチルスル
ホニルフルオリド、5mM還元型および0.5mM酸化型グルタチオン、ならびに10%
グリセロール中でリフォールディングした。20mM Tris pH8.0、150m
M NaCl、0.02%NaN中のサイズ排除クロマトグラフィー(Superde
x 75;Cytiva)によって、リフォールディングしたタンパク質を精製した。E
DIIIを10~20mg/mLに濃縮した。
以前の試験に記載されているように、構造試験のためのT025 F(ab)を生成お
よび精製した(Keeffe,J.R.,et al.,(2018)Cell Rep
25,1385-1394.e1387;Robbiani,D.F.,et al.
,(2017)Cell 169,597-609 e511;Robbiani,D.
F.,et al.,(2020)Nature 584,437-442;Wang,
Q.,et al.,(2020)Cell Host Microbe 28,335
-349.e336)。要約すると、適切な重鎖プラスミドおよび軽鎖プラスミドを用い
てExpi293細胞(Life Technologies)を一過性にトランスフェ
クトすることによって、重鎖のC末端に6XHis精製タグを含有するF(ab)を発現
させた。Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィー(Cytiva)、続いて、2
0mM Tris pH8.0、150mM NaCl、0.02%NaN中のサイズ
排除クロマトグラフィー(Superdex 200;Cytiva)を使用して、発現
上清からHisタグ付きF(ab)を精製した。Fabを約15mg/mLに濃縮した。
配列分析
以前に記載されたように抗体配列を分析した(Robbiani,D.F.,et a
l.,(2020)Nature 584,437-442)。特に、配列をトリミング
し、Igblastn v.1.14.0(Ye,J.,et al.,(2013)N
ucleic Acids Research 41,W34-W40)およびChan
ge-O toolkit v.0.4.5(Gupta,N.T.,et al.,(
2015)Bioinformatics 31,3356-3358)を使用してアノ
テーションした。同じ細胞由来の配列を対にし、GitHub(https://git
hub.com/stratust/igpipeline)で入手可能であった、組織
内のRおよびPerlスクリプトを使用して、VおよびJ遺伝子に基づくクローン型に割
り当てた。ヌクレオチド体細胞高頻度変異およびCDR3長も、以前に記載されたように
、組織内のRおよびPerlスクリプトを使用して分析した(Robbiani,D.F
.,et al.,(2020)Nature 584,437-442)。高頻度変異
分析は、Igblastnの最も近い生殖系列に基づくものであった。この試験からの7
76個のIGH CDR3配列、およびメモリーB細胞受容体配列の公開データベースか
らの22,654,256個のIGH CDR3配列に基づいて(DeWitt,W.S
.,et al.,(2016)PLOS ONE 11,e0160853)、Guy
H.R.疎水性スケール(Guy,H.R.(1985)Biophysical J
ournal 47,61-70;Kyte,J.,and Doolittle,R.
F.,(1982)J Mol Biol 157,105-132)およびR pac
kage Peptides(https://journal.r-project.
org/archive/2015/RJ-2015-001/RJ-2015-001
.pdf)を使用して、疎水性GRAVYスコアを計算した。この試験からの全CDR3
配列GRAVYスコア、および公開データベースからの無作為に選択された5,000個
のGRAVYスコアを用いたShapiro-Wilk検定を使用して分布を決定した。
Wilcoxonのノンパラメトリック検定を使用して、疎水性の有意差を試験した。
感染ドナー6例に由来する抗TBEV抗体内のV遺伝子の頻度分布と、Sequenc
e Read ArchiveアクセッションSRP010970とを比較した(Rub
elt,F.,et al.,(2012)PLoS One 7,e49774)。V
遺伝子の割当ては上記の分析に基づくものであり、固有のCDR3を有する配列を使用し
て感染ドナー6例について頻度を計算した。不等分散を用いた両側t検定を使用して統計
的有意性を決定した。WebLogo(Crooks,G.E.,et al.,(20
04)Genome Res 14,1188-1190)を使用して、各抗体セットか
らの左アラインメントCDR3配列から配列ロゴを生成した。
タンパク質ビオチン化
製造者の指示(Avidity)に従ってBiotin-Protein Ligas
e BIRAキットを使用して、Aviタグ付きTBEVFE EDIIIをビオチン化
し、ストレプトアビジン-PE(BD Biosciences、554061)および
ストレプトアビジン-Alexa Fluor 647(Biolegend、4052
37)にコンジュゲートした。製造者の指示に従ってEZ Sulfo-NHS-LC-
Biotinylationキット(Thermo Scientific、A3925
7)を使用してオボアルブミン(Sigma、A5503-1G)をビオチン化し、スト
レプトアビジンBV711(BD Biosciences、563262)にコンジュ
ゲートした。フローサイトメトリーに使用する前にELISAによってビオチン化を確認
した。
単一細胞選別
CD19マイクロビーズ(Miltenyi Biotec、130-050-301
)を使用する陽性選択によって、試料111由来のPBMCをB細胞について濃縮した。
陰性選択によって(Miltenyi Biotec、130-101-638)、他の
全ドナー由来のPBMCをB細胞について濃縮した。選択プロトコルはいずれも、製造者
の指示に従って行った。抗ヒト抗体抗CD3-APC-eFluro 780(Invi
trogen、47-0037-41)、抗CD8-APC-eFluro 780(I
nvitrogen、47-0086-42)、抗CD14-APC-eFluro 7
80(Invitrogen、47-0149-42)、抗CD16-APC-eFlu
ro 780(Invitrogen、47-0168-41)、抗CD20-PECy
7(BD Biosciences、335793)およびZombie NIR(Bi
oLegend、423105)の存在下で、フルオロフォア標識EDIIIおよびオボ
アルブミンを含むFACS緩衝液(1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、2%仔ウシ血
清、1mM EDTA)中、濃縮したB細胞を氷上で30分間インキュベートした。FA
CS Aria III(Becton Dickinson)を使用して、96ウェル
プレートの個々のウェルに、単一のCD3CD8CD14CD16Zombie
NIRCD20OvaEDIII-PEEDIII-AF647B細胞を選別
した。各ウェルに、0.5×PBSと、10mM DTTと、3000単位/mL RN
asinリボヌクレアーゼ阻害剤(Promega、N2615)とを含む4μLの溶解
緩衝液を含有させた。選別した細胞をドライアイス上で瞬間凍結し、次いで、-80℃で
保存した。抗体配列は、小さなCD20細胞に由来するため、メモリーB細胞に由来し
、IgG特異的プライマーを使用して抗体遺伝子をPCR増幅した。
抗体の配列決定、クローニングおよび発現
SuperScript III Reverse Transcriptase(I
nvitrogen、18080-044)を使用して、単一細胞由来のRNAを逆転写
した。ネステッドPCRとそれに続くサンガー配列決定によって、可変IGH遺伝子、可
変IGL遺伝子および可変IGK遺伝子を増幅するまで、得られたcDNAを-20℃で
保存した。以前に記載されたような抗体発現ベクターへのネステッドPCR増幅およびS
equence-and Ligation-Independent Cloning
(SLIC)のための鋳型として、第1のPCR反応から得られたアンプリコンを使用し
た(Robbiani,D.F.,et al.,(2020)Nature 584,
437-442)。以前に詳述されたように、組換えモノクローナル抗体を産生し、精製
した(Klein,F.,et al.,(2014)J Exp Med 211,2
361-2372)。Pierce(商標)Fab Preparationキット(T
hermo Scientific、44988)を使用して、T036 F(ab)お
よびF(ab’)2を生成した。
レポーターウイルス粒子(RVP)の生成のためのプラスミド
ウミシイタケルシフェラーゼをコードするウエストナイルウイルスサブゲノムレプリコ
ン発現プラスミド(pWNVII-Rep-REN-IB)およびZIKV CprME
発現プラスミドは、前もってTed Pierson(NIH)から入手していた(Pi
erson,T.C.,et al.,(2006)Virology 346,53-
65;Robbiani,D.F.,et al.,(2017)Cell 169,5
97-609 e511)。ZIKV CprME発現プラスミドを制限酵素消化および
ライゲーションによって操作して、以下のように他のフラビウイルスのCprMEを発現
させた:
TBEV:ダニ媒介脳炎ウイルス、Western Europeanサブタイプ株N
eudoerfl(GenBank NC_001672)に対応するCprMEコード
配列(5’ではポリリンカーおよびコザック配列GGAATTCGCGGCCGCCTC
AGG(配列番号237)が隣接し、3’では終止コドンおよびポリリンカーTAATA
GTTAATTAACTCGAGCCGCGGが隣接している;「CprME隣接」)を
有する合成DNAをプライマーDFRp1532(5-GGAATTCGCGGCCGC
CTCAGG)(配列番号238)およびDFRp1533(5-GCGGCTCGAG
TTAATTAA)(配列番号239)を用いて増幅した後、プラスミドpPOWV-L
B-CprME(下記を参照)のNotI部位およびPacI部位でクローニングし、p
TBEV-WE-CprMEを得た。
POWV-LB:POWV LB株(GenBank:L06436.1、複雑さを低
減するために、4つの同義の変化は小文字および太字とした;
Figure 2023551459000002
Figure 2023551459000003
のCprME配列(下線)を含有する合成DNAをプライマーDFRp1511(5-A
TCTACGTATTAGTCATCGCTATTA)(配列番号241)およびDFR
p1514(5-ACCGCGGCTCGAGTTAATTAA)(配列番号242)を
用いてPCR増幅し、プラスミドpZIKV-HPF-CprME(Robbiani,
D.F.,et al.,(2017)169,597-609 e511)のEco1
05I部位およびSacII部位でクローニングし、pPOWV-LB-CprMEを得
た。
POWV-DTV:3ピースアセンブリPCR戦略を利用した。pZIKV-HFP-
CprME内のCMVプロモーターの上流からCコード領域の開始点のすぐ下流までのD
NAを、
Figure 2023551459000004
を用いてPCR増幅し、CMVプロモーターをPOWV-DTV Cコード配列(プライ
マーRU-O-26690内の太字)と融合した断片を得た。Aaron Brault
の厚意により提供された鋳型DTVp1(Kenney,J.L.,et al.,(2
018)Vector Borne Zoonotic Dis 18,371-381
)を使用し、DTVのSpooner株に基づいて、
Figure 2023551459000005
を使用するPCRによって、DTVゲノム内のSacII部位のすぐ下流の領域へのCM
Vプロモーター-DTV C融合物と重複する断片を生成した。太字のヌクレオチドは、
SacII部位を除去するために導入された同義変異を示す。鋳型としてのDTVp1、
ならびに
Figure 2023551459000006
を使用してDNAを増幅して、死滅したSacII部位からエンベロープタンパク質コー
ド領域の末端まで重複する断片と、続いてSacII部位とを生成した。3つのDNA断
片をアニーリングし、伸長させ、次いで、プライマーRU-O-24611およびRU-
O-26688を使用してPCR増幅した。得られたDNA断片をSnaBIおよびSa
cIIによって消化し、同様に消化したpZIKV-HPF-CprMEにクローニング
してpPOWV-DTV-CprMEを生成した。
KFDV:Kyasanur熱疾患ウイルスW-377株(GenBank JF41
6960.1)のCprME隣接配列を有する合成DNAをプライマーDFRp1532
およびDFRp1533を用いて増幅した後、プラスミドpPOWV-LB-CprME
(上記を参照)のNotI部位およびPacI部位でクローニングし、pKFDV-W-
377-CprMEを得た。
LGTV:プライマーDFRp1563(5-GGAATTCGCGGCCGCCTC
AGGATGGCCGGGAAGGCCGTTCTA)(配列番号249)およびDFR
p1566(5-CCGCGGCTCGAGTTAATTAACTATTAGGCTCC
AACCCCCAGAGTCAT)(配列番号250)を用いて、Sonja Best
博士(Rocky Mountain Laboratories of NIH/NI
AID)の厚意により提供されたプラスミドからランガットウイルス単離物TP21-6
36のCprMEを増幅した後、プラスミドpPOWV-LB-CprMEのNotI部
位およびPacI部位でクローニングし、pLGTV-TP21-636-CprMEを
得た。GenBank NC_003690からの2つのヌクレオチド変異(A590G
およびA1893C)。
LIV:跳躍病ウイルス単離物LI3/1(GenBank KP144331)のC
prME隣接配列を有する合成DNAをプライマーDFRp1532およびDFRp15
33を用いて増幅した後、プラスミドpPOWV-LB-CprMEのNotI部位およ
びPacI部位でクローニングし、pLIV-LI3/1-CprMEを得た。
OHFV:オムスク出血熱ウイルスBogoluvovska株(GenBank N
C_005062)のCprME隣接配列を有する合成DNAをプライマーDFRp15
32およびDFRp1533を用いて増幅した後、プラスミドpPOWV-LB-Cpr
MEのNotI部位およびPacI部位でクローニングし、pOHFV-CprMEを得
た。
PCR誘導エラーがないことを確認するために、全PCR由来領域を最終プラスミドに
おいて配列決定した。
RVP産生
製造者の指示に従ってLipofectamine 2000(Invitrogen
、1166803)を使用して、1μgのpWNVII-Rep-REN-IBプラスミ
ドを3μgの最適なフラビウイルスCprMEプラスミドとともに許容細胞株Lenti
-X 293Tに共トランスフェクトすることによって、RVPを産生した。コラーゲン
をコーティングした6ウェルプレートに、1×10細胞/ウェルで24時間前に細胞を
播種した。トランスフェクション、および37℃での6時間のインキュベーションの後、
過剰なDNA-脂質複合体を吸引によって除去し、培地を20mM HEPESおよび1
0%FBSを含有するDMEM(Gibco)と交換した。次の72時間にわたって、2
4時間間隔で、RVP含有上清を回収し、0.45ミクロンフィルターに通して濾過し、
-80℃で凍結し、培地を20mM HEPESおよび10%FBSを含有するDMEM
と交換した。凍結RVPを後に解凍し、Huh-7.5細胞を用いて滴定して、細胞が血
清または抗体の非存在下で1×10 RLUを発現するRVPの希釈度を決定した。
RVP中和アッセイ
10%FBSおよび1%非必須アミノ酸(NEAA)を補充した50μLのDMEM(
Gibco)中、7,500 Huh-7.5細胞/ウェルを96ウェルプレートに播種
した。24時間後、100μLの希釈したRVPを100μLの希釈した血清または抗体
と合わせ、37℃で1時間インキュベートし、次いで、播種した細胞に50μLの混合物
を三連で加えた。RVPをBA-1希釈剤(1%BSAと100単位/mLペニシリン/
ストレプトマイシンを補充したMedium 199(Lonza))で適切に希釈して
、所望のRLU発現を達成する。37℃でさらに24時間インキュベートした後、培地を
細胞から吸引し、35μLの溶解緩衝液(Promega、E2810)と交換し、プレ
ートを-80℃で凍結した。Renilla Luciferase Assay Sy
stem(Promega、E2810)を使用して、ウミシイタケルシフェラーゼ発現
測定に、その後に解凍した溶解緩衝液15μLを使用した。血清をTBEV RVP中和
スクリーニングのために最終濃度1:600,000に希釈するか、または段階希釈して
曲線を作成した。組換えモノクローナル抗体を10μg/mLの最終濃度で使用し、中和
アッセイのために1:3に段階希釈した。Prismソフトウェア(GraphPad)
を使用した非線形回帰分析によって、最大半量中和力価(NT50)および最大半量阻害
濃度(IC50)を決定した。フラビウイルスRVPのパネルに対する交差中和スクリー
ニングでは、上記のプロトコルを使用して、1μg/mLの最終濃度で組換え抗体をアッ
セイし、結果を無抗体対照と比較した。抗体断片を使用した実験では、等モル濃度の抗体
断片および免疫グロブリンを使用した。抗体の組合せを使用するRVP実験では、T03
6を1μg/mLで使用し、4G2(クローンD1-4G2-4-15;Sigmaカタ
ログMAB10216)を10μg/mLの最終濃度で使用した。
ELISAアッセイ
標準的なELISAによって、EDIIIタンパク質に対する血清IgG抗体または組
換えIgG抗体の結合を測定した。PBS中250ngのEDIIIタンパク質/ウェル
によって、高結合性96ウェルプレート(Costar、07-200-721)を室温
で一晩コーティングした。次いで、プレートをPBS中の0.1mM EDTA、0.0
5%Tween、および2%BSAを用いて室温で2時間ブロッキングした。試料をPB
S-Tで希釈し、プレートに加え、室温でさらに1時間インキュベートした。HRPにコ
ンジュゲートした二次ヤギ抗ヒトIgG F(ab’)断片(Jackson Imm
unoresearch、109-036-088)をPBS-Tで1:5,000に希
釈し、プレートに加え、再び室温で1時間インキュベートした。各工程の合間に、PBS
-Tを用いてプレートを4回洗浄した。TMB基質(ThermoScientific
、34021)を使用してプレートを最終的に現像した。1M硫酸を使用して反応を停止
させ、プレートを450nmで読み取った。血清を1:500希釈で結合についてスクリ
ーニングした。組換えモノクローナル抗体を10μg/mLに希釈し、1:3に段階希釈
した。Prism 8(GraphPad)を使用した非線形回帰分析によって、半有効
濃度(EC50)を決定した。交差結合アッセイのために、フラビウイルスEDIIIタ
ンパク質のパネルを使用して上記のプロトコルに従って、組換え抗体を1μg/mLでア
ッセイした。抗HIVモノクローナル抗体10-1074をアイソタイプ対照として使用
した(Mouquet,H.,et al.,(2012)Proc Natl Aca
d Sci U S A 109,E3268-3277)。アイソタイプ対照シグナル
の2.5倍を超える光学密度を有する抗体を交差反応性と見なした。TestLine
Clinical DiagnosticsのEIA TBEウイルスIgG(TBG0
96)キットおよびEIA TBEウイルスIgM(TBM096)キットを使用して、
TBEV臨床試験(表1Aおよび表1B)を行った。
ウイルスおよび細胞
低継代TBEV株Hyprは、チェコ共和国チェスケー・ブジェヨヴィツェのColl
ection of Arboviruses,Institute of Paras
itology,Biology Centre of the Czech Acad
emy of Sciences(http://www.arboviruscoll
ection.cz/index.php?lang=en)によって提供された。該ウ
イルスは、1953年に、チェコ共和国(旧チェコスロヴァキア)ブルノで、罹患した1
0歳の小児の血液から最初に単離された。低継代TBEV株Neudoerflは、F.
X.Heinz教授(オーストリア、ウィーンの医科大学)の厚意により提供された。該
ウイルスは、1971年にオーストリアでダニイクソデス・リシヌス(Ixodes r
icinus)から最初に単離された。インビトロ実験で使用する前に、ウイルス株を哺
乳マウス脳および/またはBHK-21細胞内で増殖させた。
3%ウシ胎児血清、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン
および1%L-グルタミンを補充したLeibovitz(L-15)培地(Sigma
-Aldrich、プラハ、チェコ共和国)中37℃で、PS細胞(ブタ腎臓安定性)(
Kozuch,O.and Mayer,V.,(1975)Acta Virol 1
9,498)を培養した。
プラークアッセイ
細胞培養上清中のウイルス力価を決定するために、わずかな改変を加えて(Forma
nova,P.P.,et al.,(2019)J Neuroinflammati
on 16,205)、以前に記載されたように(De Madrid,A.T.,an
d Porterfield,J.S.(1969)Bull World Healt
h Organ 40,113-121)プラークアッセイを行った。要約すると、10
倍希釈のウイルス+PS細胞懸濁液(1.3×10細胞/ウェル)を24ウェル組織培
養プレートに加えた。0.5%CO、37℃で4時間インキュベートした後、各ウェル
にカルボキシメチルセルロース(L-15培地中1.5%)を重ねた。37℃および0.
5%COで5日間インキュベートした後、ナフタレンブラックを使用して細胞単層を可
視化した。ウイルス力価をプラーク形成単位(pfu)/ミリリットルとして表した。
ウイルス中和試験(VNT)
いくつかの改変を加えて、以前に記載されたように(Sirmarova,J.,et
al.,(2014)Ticks Tick Borne Dis 5,523-52
7)VNTを行った。要約すると、モノクローナル抗体(T025、T028、T034
およびT038)をL-15培地で2.5μg/mlに希釈し、次いで、96ウェルプレ
ート内で1:2に段階希釈した。希釈したモノクローナル抗体を50pfu/ウェルのT
BEV-Hypr(90~95%の細胞溶解を引き起こすのに十分)とともに37℃で9
0分間インキュベートした。その後、1ウェル当たり5×10個のPS細胞を加えた。
37℃で4日間インキュベートした後、細胞変性効果(CPE)を顕微鏡によりモニタリ
ングし、製造者の指示に従ってCell Counting Kit-8(Dojind
o Molecular Technologies,Inc.、ミュンヘン、ドイツ)
を使用して細胞生存率を測定した。GraphPad Prism(バージョン7.04
、GraphPad Software、カリフォルニア州サンディエゴ、米国)を使用
して八連で行った2つの独立した実験から、最大半量阻害濃度(IC50)を計算した。
ウイルス増殖に対する抗体の効果
モノクローナル抗体(T036、T038および10-1074)をL-15培地で0
.5または0.05μg/mlに希釈し、96ウェルプレート内でTBEV-Hypr(
50pfu/ウェル)またはTBEV-Neudoerfl(500pfu/ウェルまた
は2,500pfu/ウェル)とともに37℃で90分間インキュベートした。インキュ
ベーション後、1ウェル当たり5×10個のPS細胞を加えた。37℃および0.5%
COで24および48時間インキュベートした後、培養培地を回収し、上記のようにプ
ラークアッセイによってウイルス力価を決定し、細胞単層を冷アセトン-メタノール(1
:1)によって固定し、10%ウシ胎児血清を用いてブロッキングし、以前に記載された
ように(Stefanik,M.,et al.,(2020)Microorgani
sms 8)マウス抗フラビウイルス抗体(1:250希釈、D1-4G2-4-15;
SigmaカタログMAB10216)とともにインキュベートした。洗浄後、細胞をフ
ルオレセインイソチオシアネート(FITC;1:500希釈、SigmaカタログAP
181F)にコンジュゲートした二次ヤギ抗マウス抗体によって標識し、4’,6-ジア
ミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、1μg/mLに希釈)を用いて対比染色し
て、細胞核を可視化した。蛍光シグナルをOlympus IX71落射蛍光顕微鏡を用
いて記録し、ImageJソフトウェアによって処理した。
ウイルス細胞結合アッセイ
TBEV(Hypr株;100PFU)を、3%ウシ胎児血清、100U/mLペニシ
リン、100μg/mLストレプトマイシンおよび1%L-グルタミンを補充したL-1
5培地(Sigma-Aldrich、プラハ、チェコ共和国)中でモノクローナル抗体
、または組み合わせた抗体とともに37℃で1.5時間プレインキュベートした(T03
6および10-1074を0.5μg/mlで使用し、D1-4G2-4-15[4G2
]を10μg/mlの最終濃度で使用した)。次いで、6ウェルプレート内の予め冷却し
たコンフルエントなPS細胞単層に、TBEV-抗体複合体を加えた(1ウェル当たり1
mL)。4℃で1時間後、接種材料を除去し、PBSを用いて細胞を3回洗浄して未結合
ウイルスを除去した。3%ウシ胎児血清、100U/mLペニシリン、100μg/mL
ストレプトマイシンおよび1%L-グルタミンを補充したL-15培地と1.5%のCM
Cとを加え(4.5ml/ウェル)、温度を37℃に変化させて細胞を感染させた。37
℃および0.5%COで5日間インキュベートした後、細胞単層をナフタレンブラック
を使用して染色し、プラークを可視化および計数して、インキュベーション工程中に細胞
に結合したウイルス粒子の数を決定した。
統計分析
生ウイルス実験ではいずれも、対数変換データを用いて、ANOVA、続いてTuke
yの多重比較検定およびStudentのt検定を行った。GraphPad Pris
m(バージョン7.04、GraphPad Software、カリフォルニア州サン
ディエゴ、米国)を分析に使用した。そうでなければ、指定されるように、Mann-W
hitney検定またはANOVAおよびTukeyの多重比較検定を使用してデータを
分析し、GraphPad Prism(バージョン8.4.3、GraphPad S
oftware、カリフォルニア州サンディエゴ、米国)で計算したLog-rank(
Mantel-Cox)検定によって生存曲線の比較を分析した。p値<0.05を有意
と見なした。
結晶化、構造決定および精密化
Fabと抗原とを1:1のモル比で混合し、室温で1~2時間インキュベートすること
によって、結晶化のための複合体を生成した。シッティングドロップ中22℃で0.2μ
Lの結晶化複合体と0.2μLの0.1Mクエン酸ナトリウム三塩基二水和物pH5.0
、10%PEG 6000とを合わせることによって、T025 Fab-TBEV-W
E EDIII-His-Avitag複合体(空間群P2;a=55.5Å、b=6
6.7Å、c=91.2Å、α=90°、β=94.6°、γ=90°;非対称単位当た
り1分子)の結晶を得た。シッティングドロップ中22℃で0.2μLの結晶化複合体と
0.2μLの0.1Mクエン酸ナトリウム三塩基二水和物pH5.0、10%PEG 6
000とを合わせることによって、T025 Fab-TBEV-FE EDIII-H
is-Avitag複合体(空間群P22;a=56.96Å、b=69.72Å
、c=180.20Å、α=90°、β=90°、γ=90°;非対称単位当たり1分子
)の結晶を得た。シッティングドロップ中22℃で0.2μLの結晶化複合体と0.2μ
Lの5%(+/-)-2-メチル-2,4-ペンタンジオール、0.1M HEPES
pH7.5、10%PEG 10,000とを合わせることによって、T025 Fab
-TBEV-Si EDIII複合体(空間群P2;a=55.4Å、b=67.2Å
、c=91.2Å、α=90°、β=94.8°、γ=90°;非対称単位当たり1分子
)の結晶を得た。結晶を25%グリセロールを用いて凍結保護した。シッティングドロッ
プ中22℃で0.2μLの結晶化複合体と0.2μLの0.15M硫酸リチウム一水和物
、0.1Mクエン酸pH3.5、18% PEG 6,000とを合わせることによって
、T036 Fab-LIV EDIII複合体(空間群P1;a=67.0Å、b=6
7.9Å、c=82.4Å、α=88.0°、β=73.2°、γ=70.6°;非対称
単位当たり2分子)の結晶を得た。結晶を25%グリセロールに段階的に凍結保護した後
、液体窒素中で凍結保存した。
Dectris Pilatus 6M検出器を使用して、Stanford Syn
chrotron Radiation Lightsource(SSRL)ビームラ
イン12-2でX線回折データ(表6)を収集した。データを、Mosflm(Batt
ye,T.G.,et al.,(2011)Acta Crystallogr D
Biol Crystallogr 67,271-281)を使用して統合し、CCP
4(Winn,M.D.,et al.,(2011)Acta Crystallog
r D Biol Crystallogr 67,235-242)を使用してスケー
リングした。同じ結晶から得られた4つの180°データセットを、T036-LIV結
晶について異なる検出器距離を使用して収集し、次いで、CCP4を使用してマージおよ
びスケーリングした。PHASER(McCoy,A.,et al.,(2007)J
Appl Crystallogr 40,658-674)での検索モデルとしてP
DB 2GHW由来のVドメインと、PDB 4OGX由来のCドメインと
、PDB 6J5F由来のTBEV EDIIIとを使用した分子置換によって、T02
5-TBEV-WE EDIII複合体構造を解明した。Phenix(Adams,P
.D.,et al.,(2010)Acta Crystallogr D Biol
Crystallogr 66,213-221)における精密化と、Coot(Em
sley,P.,and Cowtan,K.,(2004)Acta Crystal
logr D Biol Crystallogr 60,2126-2132)を使用
した模擬アニーリング複合材省略マップへの手動再構築とを伴う反復手法を使用して、モ
デルを2.24Å分解能まで精密化した。モデルに含まれず、無秩序であった残基は、H
C残基214~219および6X Hisタグ;LCの残基214;および残基299~
302、397、ならびにTBEV-WE EDIIIドメインの6X Hisタグおよ
びAviタグであった。部分的に精密化されたT025-TBEV-WE EDIII構
造を分子置換モデルとして使用して、T025-TBEV-FE EDIIIおよびT0
25-TBEV-Si EDIII複合体構造を同様に解明した。T025-TBEV-
FE EDIIIモデルを2.35Å分解能に精密化し、T025-TBEV-WE E
DIIIについて記載した反復手法を使用してT025-TBEV-Si EDIIIモ
デルを1.86Å分解能まで精密化した。PHASER(McCoy,A.,et al
.,(2007)J Appl Crystallogr 40,658-674)での
検索モデルとしてPDB 4OB5由来のVドメインと、部分的に精密化されたT
025-TBEV-WE EDIII構造由来のCドメインと、PDB 6J5F
由来のTBEV EDIIIとを使用した分子置換によって、T036-LIV EDI
II複合体構造を解明した。精密化の初期段階中に非結晶学的対称性制約を含む上記の反
復戦略を使用して、モデルを2.4Åまで精密化した。モデルに含まれず、無秩序であっ
た残基は、HC残基128~133、188~190(鎖A)、214~219、および
6X Hisタグ;LCの残基212~214(鎖L)または213~214(鎖B);
ならびにLIV EDIIIドメインの残基301および397(鎖C)であった。さら
に、モデル化されなかった非対称単位内のFabの両コピー内の残基E98HCおよびS
94LCの近くの模擬アニーリング省略マップ(Phenix)では、余分な密度が存在
した。KabatナンバリングスキームをFabナンバリングに使用した。構造を重ね合
わせ、RMSDを計算し、PyMOLを使用して図を作成した。PDBePISA(Kr
issinel,E.,and Henrick,K.,(2007)J Mol Bi
ol 372,774-797)を使用して、埋没表面積および水素結合を決定した。任
意の原子が他のタンパク質上の原子から4Å以内にある残基としてFab抗原接触残基を
同定した。水素結合を割り当てるために使用した距離および形状の基準は、<4.0Åの
距離、および90~270°の水素結合角であった。ファンデルワールス相互作用にとっ
て許容される最大距離は4.0Åであった。
動物倫理に関する声明
この研究は、動物を扱う作業に関するあらゆる関連する欧州連合のガイドラインに準拠
し、実験動物の使用および虐待からの動物の保護に関するチェコ国内法ガイドライン(A
nimal Welfare Act No.246/1992 Coll.)に従うも
のであった。プロトコルは、Committee on the Ethics of
Animal Experimentation of the Institute
of ParasitologyおよびDepartmental Expert Co
mmittee for the Approval of Projects of
Experiments on Animals of the Czech Acad
emy of Sciences(許可番号4253/2019)によって承認された。
マウスおよびウイルス接種
ENVIGO RMS B.V.(ホルスト、オランダ)から、特定の病原体を含まな
いBALB/cマウスを入手した。滅菌ペレットの食餌と水とを自由に摂取させた。いず
れの実験でも、6~8週齢の雌マウスを使用した。マウスを、22℃の一定温度、65%
の相対湿度、および12時間の明暗サイクル下で、個別に換気され、木材チップの敷料を
備えたプラスチックケージ(Techniplast)に収容した。1群当たりマウス3
匹を実験に使用した。マウスに、感染の1日前または1日後に200ul PBS中のモ
ノクローナル抗体T025または10-1074を腹腔内接種し、100pfuのTBE
V-Hyprを皮下感染させた(哺乳マウス脳内で8回増殖させた)。マウスを症状およ
び生存について経時的にモニタリングし、人道的エンドポイントに達した際に安楽死させ
た。
[実施例2]
TBEV感染コホートにおける血清学的応答
2011年および2018年のチェコ共和国におけるアウトブレイク中にTBEで入院
した個体141例の血清を分析した。入院時、疾患の脳炎期中に試料を得た(図1A)(
Holzmann,H.,(2003)Vaccine 21,S36-S40)。以前
の報告(Bogovic,P.,et al.,(2018)Travel Med I
nfect Dis 26,25-31;Bogovic,P.,and Strle,
F.,(2015)World J Clin Cases 3 430-441)と一
致して、コホートは、男性(61.1%)および高齢個体(平均年齢=49歳;表1Aお
よび表1B)の方が発生率が高いことを特徴とした。また、ランダムに選択した血液バン
クドナー168例、およびTBEVに対してワクチン接種した個体10例から対照血清を
得た(表1Aおよび表1B)。TBEVのEDIIIに結合するIgG抗体の存在につい
て、全血清を1:500の希釈でELISAによってスクリーニングした(図1B)。感
染個体におけるシグナルは、ワクチン接種群および血液ドナー群よりも有意に高かった(
Tukeyの補正を使用したANOVAにより、それぞれp=0.0159およびp<0
.0001;図1B)。TBEV EDIII ELISA反応性と年齢または入院期間
との間に相関はなかった(図2A~O)。
血清中和活性を評価するために、ルシフェラーゼ発現TBEVレポーターウイルス粒子
(RVP;「方法」を参照)を使用して、回復したワクチン接種個体から得られた試料を
中和のために1:6×10希釈でスクリーニングした(Pierson,T.C.,e
t al.,(2006)Virology 346 53-65)。完全から検出不能
までの範囲の中和活性は、ワクチン接種者では有意に低く(p<0.0001;図1C)
、ELISAにおけるEDIII結合と相関していた(p=0.0004;図2M)。上
位28例の感染個体の最大半量中和力価(NT50)は、0.37~6.7×10まで
変動した(図1D~E)。対照的に、ワクチン接種者は、0.32~1.0×10のN
50を示した(図2N~O)。このコホートでは、TBEV感染のために入院した個体
は、ワクチン接種者よりも一般に高いEDIII結合および中和活性の広範囲な分布を示
すとの結論を下した。
B細胞メモリーは特異的抗体遺伝子に収束する
抗TBEV抗体を特性評価するために、感染個体6例(図1Dおよび図1Eのオレンジ
色)およびワクチン接種者3例の末梢血からTBEV特異的B細胞を精製した(図3A~
Dおよび図4A)。循環CD20B細胞では、TBEV EDIII特異的B細胞の頻
度は、ワクチン接種者(1.28~5.95×10-3%)よりも感染群(0.067~
0.31%)の方が高かった。合計で776個のIgG抗体重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子
対をRT-PCRによって増幅し、配列決定した(実施例1、図3Bおよび図5D、なら
びに表2A~表2J)。IGVHおよびIGVLでは平均体細胞高頻度変異はそれぞれ1
8および9ヌクレオチドであり、CDR3の長さは正常であり(平均CDRH3長さ13
.5、および平均CDRL3長さ9.4)、疎水性は対照と比較してわずかに増加してい
た(p<0.0001;図4B~D)(Briney,B.,et al.,(2019
)Nature 566,393-397;Rock,E.P.,et al.,(19
94)J Exp Med 179,323-328)。HIV-1、ジカ、B型肝炎お
よびSARS-CoV-2を含む他のウイルス病原体と同様に(Robbiani,D.
F.,et al.,(2017)Cell 169,597-609 e511;Ro
bbiani,D.F.,et al.,(2020)Nature 584,437-
442;Scheid,J.F.,et al.,(2011)Science(New
York,NY)333,1633-1637;Wang,Q.,et al.,(2
020)Cell Host Microbe 28,335-349.e336;We
st,A.P.,et al.,(2012)Proc Natl Acad Sci
U S A 109,E2083-20990)、配列の多くは拡大増殖B細胞クローン
に見出された(37.9%、図3BおよびD)。
配列分析により、個体内および個体間で類似の特徴を有する抗体が明らかにされた(図
3B、図3Dおよび図3E、表2A~表2Jおよび表3)。例えば、VH1-69および
VH3-48は、それぞれ全クローン配列の59.2%および7.5%を占めた(図3B
および図3Dの青色および赤色の濃淡)。さらに、これらのVH遺伝子を含有する関連配
列が複数のドナーに見出された(図3Eの紫色の線)。感染ドナーでは、VH1-69、
VK2-28、VK1-33およびVL4-69遺伝子の使用は、有意に大きな比率を占
めた(p<0.01)。VH3-48、VK1-5およびVL2-14遺伝子も濃縮され
たが、有意ではなかった(図4E~G)。クローン拡大増殖させたIGVH1-69/I
GVK2-28抗体およびIGVH3-48/IGVK1-5抗体を含むいくつかの場合
では、個々のドナー間の配列類似性は、IGH CDR3およびIGL CDR3に拡大
した(表3、図4Hおよび図4I)。TBEV EDIIIに対するメモリーB細胞応答
は、特異的抗体遺伝子に収束するとの結論を下した。
強力かつ広範囲に交差反応性の抗TBEV抗体
59個の抗体(46個は回復期由来、13個はワクチン接種ドナー由来、表4)をクロ
ーニングし、組換えDNA法によって改変し、発現させ、3つ全部のTBEVサブタイプ
:Western European(TBEVWE)、Far Eastern(TB
EVFE)およびSiberian(TBEVSi;図5Aおよび図6Aならびに表5)
に対応するEDIIIタンパク質への結合についてELISAで試験した。59個の抗体
のうちの1個を除く全部が、0.2~12ng/mLの範囲の同様の最大半量有効濃度(
EC50)で3つ全部のEDIIIに結合した(図5B、表5)。
TBEV RVPに対する中和活性について試験した際に、感染ドナーから得られた4
6個の抗体のうち43個が中和し、IC50は0.02ng/mLと低かった(図5Cお
よび図5D、表5)。対照的に、ワクチン接種ドナーから得られた最良の抗体は、8.3
ng/mLのIC50を有した。いずれも感染ドナーから単離された7個の抗体は、TB
EVの強力な中和剤であり、IC50は1ng/mL未満であった(図5D)。真正のT
BEVの中和についても、これらの抗体のうちの4個を評価した(図5Eおよび図5F)
。4個の抗体はいずれも強力な活性を示し、IC50は35.9~268.8ng/mL
の範囲であった(表5)。
TBEV抗体が関連ウイルスと交差反応するかどうかを決定するために、ランガットウ
イルス(LGTV)、跳躍病ウイルス(LIV)、オムスク出血熱ウイルス(OHFV)
、キャサヌール森林病ウイルス(KFDV)、ならびにポワッサン系統IおよびIIウイ
ルス(POWV-DTVおよびPOWV-LB;「方法」ならびに図6Bおよび図6Cを
参照)のEDIIIへの結合について、単一濃度(1μg/mL)でTBEV抗体をスク
リーニングした。試験した抗体の多くに、広範囲の交差反応性が観察された(図6B)。
また、抗体が広域中和しているかどうかを決定するために、ダニ媒介ウイルスの同じパネ
ルに対応するRVPに対して抗体をスクリーニングした。1μg/mlの濃度で試験した
場合、ほとんどのIGHV1-69抗体はLGTV、LIV、POWV-LBおよびPO
WV-DTVを中和し、IGVH3-48/IGVK1-5抗体の1つはPOWV-LB
を除く全RVPを中和した(図6Bおよび図6C)。フラビウイルスRVPパネルに対す
るIC50は、いくつかの交差反応性抗体では1桁のng/mL範囲であった(図5Gお
よび図6D~I;表5)。例えば、IGVH3-48/IGVK1-5抗体T056は、
LGTV、LIVおよびOHFVの強力な中和剤であり、IC50値は1ng/mL以下
である。いくつかのTBEV中和抗体は、ダニ媒介フラビウイルスに対して広範囲に活性
であるとの結論を下した。
抗体T036はTBEV感染を促進する
他の抗体とは対照的に、T036は、TBEV感染およびPOWV-LB RVP感染
の用量依存的増強を示した(図7Aおよび図6D)。増強は、T036 F(ab’)2
およびF(ab)でも観察され、二価結合もFcドメインも増強に必要ではないことが示
された(図7A)。T036が真正のTBEVの感染を増強するかどうかを決定するため
に、プラーク減少アッセイを行った。T036を加えると、T038(中和抗体)または
アイソタイプ対照と比較した場合、ウイルス増殖が増加した(図7Bおよび図7C;図8
Aおよび図8B)。
エンベロープドメインII(EDII)に対するマウスモノクローナル抗体であるA5
は、Eタンパク質の融合ループを露出させることによってウイルス融合を増強する。その
活性は、4G2、融合ループ特異的マウスモノクローナルによって阻害され得る(Has
lwanter,D.,et al.,(2017)PLoS Pathog 13,e
1006643-e1006643。ヒト抗EDIII抗体であるT036による感染の
増強が4G2によって阻害され得るかどうかも決定するために、単独でまたは組み合わせ
てT036または4G2の存在下で、TBEV RVP感染を測定した(図7D)。融合
ループエピトープの露出に果たすT036の役割と一致して、両抗体が存在する場合に増
強が阻害されたが、4G2単独では検出可能な効果はなかった(図7D)。ウイルス結合
アッセイでは、真正のTBEVを使用して同様の結果が得られた(図7E)。結果は、T
036が、Eタンパク質の融合ループの露出を必要とする機構によってTBEV感染を増
強することを示している。
抗体T025構造は、外側隆起部エピトープへの結合を明らかにする
ヒト抗TBEV抗体による中和の機構への洞察を得るために、TBEVの3つ全部のサ
ブタイプのEDIIIドメインと複合体を形成した、広域かつ強力な抗体であるT025
のFabの結晶構造を解明した(図9A~Dおよび図10A~B)。T025 Fab-
TBEVWE EDIII複合体の構造から、抗体が、EDI-EDIIIヒンジ領域の
近傍のEDIIIの外側隆起部付近に結合し、重鎖および軽鎖の両方をEDI-EDII
IヒンジおよびBCループに接触させ、軽鎖をEDIIIのDEループに接触させること
が明らかにされた(図9A)。抗体は、CDRH2、CDRH3、CDRL1およびCD
RL3を使用してEDIIIと接触し、598Åの表面積をEDIII上に埋没させる
(Vによる333Å、およびVによる265Å)。T025は、Asp100
およびTrp94LCをEDIIIの裂け目に挿入し、EDIIIに対して塩橋(As
p100HC-Lys311EDIII)および水素結合を作る(図9B)。TBEV
EDIIIおよびTBEVSi EDIIIと複合体を形成したT025 Fabの
結晶構造は、T025-TBEVWE EDIII構造に類似しており(RMSD=それ
ぞれ519個のCα原子について0.53Å、および516個のCα原子について0.2
5Å)、エピトープ残基におけるこれらの3つのウイルス株間の100%の配列保存と一
致した(図10A~B)。
T025 Fab-TBEVWE構造と、TBEVビリオンに結合したマウスモノクロ
ーナル抗体(19/1786)の3.9Å低温EM構造とを比較した(Fuzik,T.
,et al.,(2018)Nat Commun 9,436)。T025および1
9/1786は、Vでは<65%のアミノ酸配列同一性、CDRでは47%のアミ
ノ酸配列同一性によって関連しているが、EDIIIのCα原子による構造の構造アライ
ンメントは、2つの抗体が類似のエピトープを認識し(図9C)、類似のポーズをとる(
図9D)ことを示している。したがって、T025がウイルスにどのように結合し、ウイ
ルスを中和するかに関して詳細を推定するために、さらに低い分解能の低温EM構造を使
用することができる。EDIIIとの接触に加えて、19/1786は、隣接サブユニッ
トのEDIまたはEDIIのいずれかと相互作用した(Fuzik,T.,et al.
,(2018)Nat Commun 9,436)。これは、T025によるEDII
I上の比較的低い埋没表面積(約1100Åの典型的な値と比較して約600Å)と
合わせて(Ramaraj,T.,et al.,(2012)Biochim Bio
phys Acta 1824,520-532)、T025が、天然ビリオン上の隣接
ドメインとも接触することを示す。19/1786によるビリオンの認識と同様に、ビリ
オン上の180個のEDIIIのうちの120個が、T025によって結合され得る可能
性もある。
抗体T025はマウスの感染を予防および処置する
抗EDIII抗体がインビボで感染から保護することができるかどうかを決定するため
に、BALB/cマウスを対象に予防実験を行った。10pfuのTBEV(致死量)
による負荷の24時間前に、マウスに段階的な用量のT025(100~0.1μg/マ
ウス)を投与した。アイソタイプ対照抗体によって処置したマウスはいずれも、10日目
までに死亡した(n=6)。対照的に、T025は、最低用量であっても保護的であった
。抗体を投与したマウス24匹のうち1匹を除く全頭が生存した(p<0.0001、図
10A)。T025の治療の可能性を試験するために、BALB/cマウスに10pf
uのTBEVを感染させ、次いで、1、3または5日後に30μgのT025またはアイ
ソタイプ対照を注射した(図10B)。対照マウス12匹全頭が、13日目までに感染し
た。対照的に、1日目にT025によって処置したマウス13匹のうち12匹、および感
染後3日目に処置したマウス13匹のうち4匹が生存した。感染の5日後にT025によ
って処置したマウス全頭は応答しなかった。したがって、広域中和ヒト抗TBEV抗体で
あるT025は、BALB/cマウスでは、TBEV感染の予防および処置に有効である
考察
ダニ媒介フラビウイルスは、有効な治療法がない劇症型脳炎を引き起こす可能性がある
。ヨーロッパ、アジアおよび北米では、この群のウイルスの公衆衛生上の懸念が高まって
いる。疾患を引き起こすダニ媒介フラビウイルスの中では、TBEVは、中央ヨーロッパ
およびロシアで流行している。TBEVに対するポリクローナル体液性免疫応答に関する
多くの情報が存在するが(Albinsson,B.,et al.,(2018)Eu
ro Surveill 23,pii=17-00838;Holzmann,H.,
(2003)Vaccine 21 S36-S40;Matveeva,V.A.,e
t al.,(1995)Immunol 46,1-4;McAuley,A.J.,
et al.,(2017)NPJ Vaccines 2,5;Remoli,M.E
.,et al.,(2014)Pathog Dis 73,1-3)、自然感染また
はワクチン接種によって誘導される中和抗体応答の分子的性質は、ほとんどまたは全く理
解されていない。この実施例は、回復した個体6例、およびワクチン接種個体3例のメモ
リーB細胞から得られた776個の抗体を記載し、その中にはダニ媒介フラビウイルスの
いくつかの広域かつ強力な中和剤がある。データは、TBEVおよび関連病原体に対する
ヒト抗体応答、ならびに抗体によって誘導される中和および増強の機構に対する洞察を提
供する。最後に、広域かつ強力な中和ヒトモノクローナル抗体は、インビボでの保護およ
び治療に極めて有効であり、臨床使用のための大きな可能性を有する。
病原体に対するヒト中和抗体応答は、同じIGV遺伝子に収束することが多い。例には
、HIV-1ウイルス、インフルエンザウイルス、ジカウイルス、B型肝炎ウイルスおよ
びSARS-CoV-2ウイルスに対する中和抗体が挙げられる(Robbiani,D
.F.,et al.,(2017)Cell 169,597-609 e511;R
obbiani,D.F.,et al.,(2020)Nature 584,437
-442;Scheid,J.F.,et al.,(2011)Science(Ne
w York,NY)333,1633-1637;Tiller,T.,et al.
,(2007)Immunity 26,205-213;Wang,Q.,et al
.,(2020)Cell Host Microbe 28 335-349.e33
6;West,A.P.,et al.,(2012)Proc Natl Acad
Sci U S A 109,E2083-2090)。様々な個体によって産生された
、TBEVのEDIIIに対する抗体は、SARS-CoV-2抗体と同様に、IGV重
鎖遺伝子およびIGV軽鎖遺伝子の対合を超え、CDR3領域を含む強い相同性を示す。
TBEVに対する中和抗体の中では、VH1-69およびVH3-48は、極めて大き
な比率を占めた。VH1-69を様々な異なる軽鎖遺伝子と対にして、ワクチン接種者お
よび回復した個体の間で見出される中和抗体を産生した。この群の抗体では、中和活性が
IC50 12~1180ng/mL(幾何平均186.2ng/mL)の範囲で広く変
動した。VH1-69抗体は、ヒトレパートリーでは高度に表され、インフルエンザ、C
型肝炎およびHIV-1に対する広域中和抗体の間でも一般的である(Chen,F.,
et al.,(2019)Curr Opin Virol 34,149-159)
。抗TBEV VH3-48抗体は、同じ軽鎖VK1-5と常に対になっていたという点
でVH1-69と異なっていた。VH3-48抗体はまた、VH1-69よりも強力であ
り、IC50は0.5~7.3ng/mL(幾何平均2ng/mL)の範囲であり、回復
期個体でのみ見出された。試験したワクチン接種者では、このクラスの強力な抗体が存在
しなかったことは、この群では血清中和効力が低下していることと一致する。最後に、V
H3-48抗体はまた、KFDV、LGTV、LIVおよびOHFVを含むいくつかの関
連するダニ媒介フラビウイルスの強力な中和剤であり、IC50は1~36ng/mLで
ある。
デングおよびジカを含むいくつかの異なるフラビウイルスに対する抗体は、感染前およ
び感染後に投与された場合であっても保護的であり得る(Robbiani,D.F.,
et al.,(2017)Cell 169 597-609 e511;Xu,M.
,et al.,(2017)NPJ Vaccines 2,2)。ロシアおよびカザ
フスタンでは、ダニ咬傷の3日以内に受診する個体に対して、曝露後予防のために、TB
EV過剰免疫血漿の投与が推奨されている(2008;Pen’evskaia,N.A
.,and Rudakov,N.V.,(2010)Med Parazitol(M
osk)53-59)。この介入の有効性は、ドナー血漿のバッチごとに異なり得(Ra
bel,P.O.,et al.,(2012)Clin Vaccine Immun
ol 19 623-625;Ruzek,D.,et al.,(2019)Anti
viral Res 164,23-51)、その使用は、少数の有害事象、および疾患
の抗体依存性増強の可能性に関する懸念の後に、一部の国で中止された(Arras,C
.,et al.,(1996)Lancet 347,1331;Kluger,G.
,et al.,(1995)Lancet 346,1502;Waldvogel,
K.,et al.,(1996)Eur J Pediatr 155,775-77
9)。マウスモノクローナル抗体も、TBEVから保護することができるが、臨床では試
験されていない(Baykov,I.K..,et al.,(2014)Vaccin
e 32,3589-3594;Levanov,L.N.,et al.,(2010
)Vaccine 28,5265-5271;Matveev,A.,et al.,
(2020)Vaccine 38,4309-4315)。この実験は、マウスでは約
0.005mg/Kgという低い用量で投与された場合であっても感染を予防するヒトモ
ノクローナル抗体の発見によって、以前の研究を拡大する。注目すべきことに、これらの
抗体はまた、マウスでは、約1.5mg/Kgの用量で感染の3日後に投与された場合で
あっても疾患を抑制する。
他のフラビウイルス、最も重要なことにはデング、場合によってはジカに対する最適以
下の抗体レベルは、疾患の抗体依存性増強(ADE)に関連する(Dejniratti
sai,W.,et al.,(2016)Nat Immunol 17,1102-
1108;Harrison,S.C.,(2016)Nat Immunol 17,
1010-1012;Katzelnick,L.C.,et al.,(2017)S
cience(New York,NY)358,929-932;Katzelnic
k,L.C.,et al.,(2020)Science(New York,NY)
369,1123-1128;Sabin,A.B.,(1950)Bacteriol
Rev 14,225-232;Stettler,K.,et al.,(2016
)Science(New York,NY)353,823-826)。ADEはまた
、ワクチンブレークスルーを含む、TBEV感染後に一部の個体で発生する劇症型脳炎に
対する説明として議論されている(Ruzek,D.,et al.,(2019)An
tiviral Res 164,23-51)。デング感染では、ADEは、Fc受容
体発現細胞への病原体侵入を増強する免疫複合体によって媒介されると考えられている(
Halstead,S.B.,(2014)Microbiol Spectr 2)。
ただし、抗体はまた、ウイルス表面タンパク質の立体構造変化を誘導し、これにより、ウ
イルス融合機構の関与を促進することによって感染を増強する可能性がある(Guill
on,C.,et al.,(2002)J Virol 76,2827-2834;
Wan,Y.,et al.,(2020)J Virol 94,e02015-02
019;Winarski,K.L.,et al.,(2019)Proc Natl
Acad Sci USA 116,15194-15199)。実際、TBEVに対
するマウスモノクローナル抗体が同定されており、このマウスモノクローナル抗体はこの
機構によって増強される(Haslwanter,D.,et al.,(2017)P
LoS Pathog 13,e1006643-e1006643)。TBEVに感染
したヒトがインビトロでウイルス感染を促進する抗体を産生するという発見は、そのよう
な抗体が、TBEの病因、または臨床での血漿投与後に見られるまれな有害事象に何らか
の役割を果たし得るかどうかという疑問を提起する。
現在のTBEVワクチンは、30年超前に開発されたものであり、ニワトリ胚細胞を用
いて増殖させた不活化ウイルスからなる。ワクチン接種は、TBEV特異的であり、プラ
イミングと2回の追加免疫とを必要とし、使用されるワクチンに応じて90~100%の
セロコンバージョンをもたらす(Loew-Baselli,A.,et al.,(2
009)Hum Vacc 5,551-556;Maikova,G.B.,et a
l.,(2019)J Med Virol 91,190-200;Vorovitc
h,M.F.,et al.,(2019)Adv Virol 2019,53234
28)。個体の寿命にわたって、3~5年ごとに追加免疫が推奨される。広域かつ強力な
VH3-48抗体の存在は、これらの抗体によって認識されるエピトープを標的とするよ
うに特別に設計された次世代ワクチンが、TBEV、KFDV、LGTV、LIVおよび
OHFVに対して普遍的に有効であり得ることを示している。最後に、ダニ媒介フラビウ
イルスに対して広範囲の活性を有する強力なヒト抗体は、リスクが高くワクチンに応答し
ない個体に対する臨床使用、および感染の初期段階における治療のための大きな可能性を
有する。
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Claims (41)

  1. ダニ媒介脳炎ウイルス(TBEV)抗原に特異的に結合する単離されたTBEV抗体ま
    たはその抗原結合断片。
  2. 前記TBEV抗原が、Eタンパク質のドメインIII(EDIII)の外側隆起部を含
    む、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  3. 前記抗体またはその抗原結合断片が、複数のTBEV株を中和することができる、請求
    項1または2に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  4. 配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、2
    7、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53
    、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、
    81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、10
    5、107、109、111、113、115または117のアミノ酸配列を有する重鎖
    可変領域の3つの重鎖相補性決定領域(HCDR)(HCDR1、HCDR2およびHC
    DR3)と、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、2
    4、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50
    、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、
    78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102
    、104、106、108、110、112、114、116または118のアミノ酸配
    列を有する軽鎖可変領域の3つの軽鎖CDR(LCDR1、LCDR2およびLCDR3
    )とを含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  5. 配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、2
    7、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53
    、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、
    81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、10
    5、107、109、111、113、115もしくは117のアミノ酸配列に対して少
    なくとも75%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、または配列番号1、3、5、7
    、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、3
    5、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61
    、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、
    89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、11
    1、113、115もしくは117のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、
    配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、
    28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、5
    4、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80
    、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、
    106、108、110、112、114、116もしくは118のアミノ酸配列に対し
    て少なくとも75%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、または配列番号2、4、6
    、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、3
    4、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60
    、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、
    88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、11
    0、112、114、116もしくは118のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含
    む、請求項1~4のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  6. 配列番号1~2、3~4、5~6、7~8、9~10、11~12、13~14、15
    ~16、17~18、19~20、21~22、23~24、25~26、27~28、
    29~30、31~32、33~34、35~36、37~38、39~40、41~4
    2、43~44、45~46、47~48、49~50、51~52、53~54、55
    ~56、57~58、59~60、61~62、63~64、65~66、67~68、
    69~70、71~72、73~74、75~76、77~78、79~80、81~8
    2、83~84、85~86、87~88、89~90、91~92、93~94、95
    ~96、97~98、99~100、101~102、103~104、105~106
    、107~108、109~110、111~112、113~114、115~116
    、または117~118のそれぞれのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領
    域を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  7. 前記抗体が、二価抗体または二重特異性抗体である、請求項1~6のいずれか一項に記
    載の抗体またはその抗原結合断片。
  8. 変異Fc定常領域をさらに含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の抗体またはその
    抗原結合断片。
  9. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項1~8のいずれか一項に記載の抗体また
    はその抗原結合断片。
  10. 前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体またはヒト抗体であ
    る、請求項1~9のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  11. 前記抗体が、一本鎖抗体、Fab断片またはFab2断片である、請求項1~10のい
    ずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  12. 前記抗体またはその抗原結合断片が、毒素、治療剤、高分子、受容体、酵素または受容
    体リガンドに検出可能に標識またはコンジュゲートされる、請求項1~11のいずれか一
    項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  13. 前記高分子がポリエチレングリコール(PEG)である、請求項12に記載の抗体また
    はその抗原結合断片。
  14. 請求項1~13のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と、必要に応じて
    薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、医薬組成物。
  15. 前記医薬組成物が、2つ以上の請求項1~13のいずれか一項に記載の抗体またはその
    抗原結合断片を含む、請求項14に記載の医薬組成物。
  16. 前記医薬組成物が、第2の治療剤をさらに含む、請求項14または15に記載の医薬組
    成物。
  17. 前記第2の治療剤が、抗炎症剤または抗ウイルス剤を含む、請求項16に記載の医薬組
    成物。
  18. 前記抗ウイルス剤が、ヌクレオシド類似体、ペプトイド、オリゴペプチド、ポリペプチ
    ド、プロテアーゼ阻害剤、3C様プロテアーゼ阻害剤、パパイン様プロテアーゼ阻害剤、
    またはRNA依存性RNAポリメラーゼの阻害剤を含む、請求項17に記載の医薬組成物
  19. 前記抗ウイルス剤が、アシクロビル、ガンシクロビル、ビダラビン、ホスカルネット、
    シドホビル、アマンタジン、リバビリン、トリフルオロチミジン、ジドブジン、ジダノシ
    ン、ザルシタビンおよびインターフェロンからなる群から選択される、請求項18に記載
    の医薬組成物。
  20. 前記インターフェロンが、インターフェロン-αまたはインターフェロン-βである、
    請求項19に記載の医薬組成物。
  21. ダニ媒介フラビウイルス感染に起因する病態の診断、予防、治療またはそれらの組合せ
    のための医薬品の調製における、請求項14~20のいずれか一項に記載の医薬組成物の
    使用。
  22. 請求項1~13のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片のポリペプチド鎖
    をコードする核酸分子。
  23. 請求項22に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  24. 請求項23に記載のベクターを含む、培養された宿主細胞。
  25. 抗体またはその抗原結合部分を調製する方法であって、
    請求項24に記載の培養された宿主細胞を得ること、
    前記ベクターによってコードされるポリペプチドを発現させる、および抗体またはその
    断片を集合させる条件下で、培地中で、前記培養された宿主細胞を培養すること、および
    前記培養された細胞、または前記細胞の前記培地から、前記抗体または断片を精製する
    ことを含む、方法。
  26. 請求項1~13のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片または請求項1
    4~20のいずれか一項に記載の医薬組成物の薬学的に許容される用量単位を含む、キッ
    ト。
  27. 対象のダニ媒介フラビウイルス感染の診断、予後、または治療のモニタリングのための
    キットであって、請求項1~13のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と
    、前記抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する少なくとも1つの検出試薬とを含
    む、キット。
  28. 対象においてダニ媒介フラビウイルスを中和する方法であって、それを必要とする対象
    に、請求項1~13のいずれか一項に記載の第1の抗体もしくはその抗原結合断片の治療
    有効量、または請求項14~20のいずれか一項に記載の医薬組成物の治療有効量を投与
    することを含む、方法。
  29. ダニ媒介フラビウイルス感染を予防または治療する方法であって、それを必要とする対
    象に、請求項1~13のいずれか一項に記載の第1の抗体もしくはその抗原結合断片の治
    療有効量、または請求項14~20のいずれか一項に記載の医薬組成物の治療有効量を投
    与することを含む方法。
  30. 第2の抗体またはその抗原結合断片の治療有効量を前記対象に投与することをさらに含
    み、前記第1の抗体またはその抗原結合断片および前記第2の抗体またはその抗原結合断
    片が、相乗活性を示す、請求項28に記載の方法。
  31. 第2の抗体またはその抗原結合断片の治療有効量を前記対象に投与することをさらに含
    み、前記第1の抗体またはその抗原結合断片および前記第2の抗体またはその抗原結合断
    片が、相乗活性を示す、請求項29に記載の方法。
  32. 前記第1の抗体またはその抗原結合断片が、前記第2の抗体もしくはその抗原結合断片
    の前、後、または前記第2の抗体もしくはその抗原結合断片と同時に投与される、請求項
    30または31に記載の方法。
  33. 第2の治療剤または療法の治療有効量を前記対象に投与することをさらに含む、請求項
    28~32のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記第2の治療剤が、抗炎症剤または抗ウイルス剤を含む、請求項33に記載の方法。
  35. 前記抗ウイルス剤が、ヌクレオシド類似体、ペプトイド、オリゴペプチド、ポリペプチ
    ド、プロテアーゼ阻害剤、3C様プロテアーゼ阻害剤、パパイン様プロテアーゼ阻害剤、
    またはRNA依存性RNAポリメラーゼの阻害剤を含む、請求項34に記載の方法。
  36. 前記抗ウイルス剤が、アシクロビル、ガンシクロビル、ビダラビン、ホスカルネット、
    シドホビル、アマンタジン、リバビリン、トリフルオロチミジン、ジドブジン、ジダノシ
    ン、ザルシタビンおよびインターフェロンからなる群から選択される、請求項34に記載
    の方法。
  37. 前記インターフェロンが、インターフェロン-αまたはインターフェロン-βである、
    請求項36に記載の方法。
  38. 前記抗体またはその抗原結合断片が、前記第2の治療剤もしくは治療の前、後、または
    前記第2の治療剤もしくは治療と同時に投与される、請求項33~37のいずれか一項に
    記載の方法。
  39. 前記抗体またはその抗原結合断片が、前記対象に静脈内、皮下または腹腔内投与される
    、請求項28~38のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記抗体またはその抗原結合断片が、予防的または治療的に投与される、請求項28~
    39のいずれか一項に記載の方法。
  41. 試料中のダニ媒介フラビウイルスの存在を検出する方法であって、
    試料を請求項1~13のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と接触させ
    る工程と、
    1つ以上のダニ媒介フラビウイルス抗原への前記抗体または抗原結合断片の結合を決定
    する工程と、を含み、
    前記1つ以上のダニ媒介フラビウイルス抗原への前記抗体の結合が、前記試料中の前記
    ダニ媒介フラビウイルスの存在を示す、方法。
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