CN116953905A - 一种斜光片成像系统 - Google Patents

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CN116953905A CN202310829018.1A CN202310829018A CN116953905A CN 116953905 A CN116953905 A CN 116953905A CN 202310829018 A CN202310829018 A CN 202310829018A CN 116953905 A CN116953905 A CN 116953905A
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Abstract

本发明公开了一种斜光片成像系统。该系统包括：光源模块，光片产生模块，主物镜模块，第二物镜模块，图像采集模块以及光片倾斜角扩展模块。光片倾斜角扩展模块包括具备反射、折射或者衍射功能的光学元件，设置在所述主物镜前端，用于扩展从主物镜出射的照明光片的倾斜角。本发明展示了多种光片倾斜角扩展模块设计方案。一方面，可以应用于斜照明光片本身静止不动、样本扫描的体积成像应用场景；另一方面，也针对需要主动扫描斜光片以实施三维体积成像的应用场景，展示了满足去扫描探测条件的设计方案。对于这两类应用场景，本发明能够极大提升斜照明光片相对于主光轴的倾斜角度，优化斜光片成像系统整体的空间分辨率、荧光收集效率和三维体积成像速度。

Description

一种斜光片成像系统
技术领域
本发明实施例涉及光学三维显微成像技术领域，尤其涉及一种照明光片倾斜角不受主物镜孔径角限制的斜光片成像系统。
背景技术
基于单个主物镜架构的斜光片显微镜(oblique plane microscopy,OPM)、扫掠共焦对准平面激发(swept confocally-aligned planar excitation,SCAPE)显微镜、扫描斜光片照明显微镜(scanning oblique plane illumination(SOPI)microscopy)等成像方法，具备比常规正交双物镜光片显微镜更高的时空分辨率。扫描斜光片显微镜充分利用了高数值孔径(numerical aperture,NA)显微物镜充裕的孔径角，使用同一个物镜(即主物镜，primary objective)既生成相对于主光轴倾斜的照明光片，又收集该斜照明光片所激发的(后向)荧光或散射光信号，在继承了常规光片显微镜的低光毒性优势的同时提供了开放的样本空间，可以兼容包括线虫、斑马鱼、果蝇、小鼠、大鼠、豚鼠、猴子等在内的不同尺度的模式动物和各种生物医学和临床成像场景。
斜光片显微镜进一步引入了共轭映射于主物镜后焦面的检流计扫描振镜，通过振镜的一维扫描运动驱动斜激发光片的(通常是远心)平移扫描；该振镜同时也将从该倾斜像面发出的后向荧光去扫描，使得第二物镜重建的倾斜中间图像在扫描过程中保持不动，以便在主物镜和生物样本保持相对静止的前提下实施三维层析扫描成像，既避免了对活体生物样品的扰动，又规避了步进移动主物镜或生物样本时机械惯量对速度的局限，极大提升了实际所能取得的三维体积成像速率(通常可达约10体积/秒×200光片/体积)。
斜光片显微镜体积速度优势的核心原理，是将位于主物镜焦点区的扫描斜照明光片所激发的荧光或散射光信号，中继到第二物镜焦点区并去扫描重建得到静止的中间图像，再经第三物镜耦联并映射到面阵探测器上采集。记中间图像相对于第二物镜主光轴的倾斜角为α，则第三物镜的光轴须与中间图像垂直，即与第二物镜主光轴成90-α的夹角。倾斜度α越大，第三物镜与第二物镜的光轴夹角90-α越小，则第三物镜接收立体锥角与第二物镜的会聚立体锥角(二者皆由物镜本身的孔径角决定)的重合程度越高，即成像系统整体的等效孔径角越高，相应地得到更高的三维空间分辨率、荧光收集效率和三维体积成像速度等。
扩展斜光片系统的等效孔径角主要有两类方法。一是采用孔径角(正比于数值孔径)尽可能大的第二和第三物镜。然后，市售商品物镜中具备更大孔径角的一般是高倍显微物镜，其视场范围相应较小，且往往伴随着工作距离的牺牲，导致第二、第三物镜在空间上无法相容；而定制设计与开发兼具高数值孔径、大视场和长工作距的显微物镜则成本高且周期长。
鉴于中间图像相对于第二物镜光轴的倾斜角度α与照明光片相对于主物镜的倾斜角β呈正相关，提升照明角度β，便成为扩展斜光片成像系统的等效孔径角、提升空间分辨率和荧光收集效率的另一类有效方法。照明光片的倾斜角度β受限于主物镜本身的孔径角，且实际中为避免边缘视场照明光片的渐晕衰减，β一般取主物镜孔径角的四分之三左右。
照明光片倾斜角的提升，对于构建大视场扫描斜光片显微镜尤为关键。能够容纳若干毫米横向视场的市售低倍率显微物镜的孔径角也往往较小，如果直接套用标准的斜光片显微镜设计思路，则势必导致更小的照明光片倾斜角β1和中间图像倾斜角β2，使得整体成像系统的等效孔径角变得很小(甚至等于零)，难以甚至无法实施高效率、高速的大视场斜光片三维层析成像。
综上，如何在不影响探测光路和收集效率的前提下，突破主物镜孔径角的限制，大幅提升激发光片的倾斜角，对于研制下一代高速、高收集效率、高分辨率(尤其是大视场)斜光片显微成像系统具有重要意义，本发明因此而来。
发明内容
本发明提供一种斜光片成像系统，以实现在不影响去扫描探测光路的前提下，极大提升斜照明光片相对于主光轴的倾斜角度，进而优化斜光片成像系统整体的空间分辨率、荧光收集效率和三维体积成像速度。
本发明实施例提供了一种斜光片成像系统，该系统包括：
光源模块，用于提供光源；
光片产生模块，设置在光源的出射光路上，用于将光源模块发射的光转换为光片的形式；
主物镜模块，包括直接面向成像样本的主物镜、将主扫描器件的扫描运动传送到主物镜后端的照明中继光学系统，以及将主物镜收集的背向信号光传送回主扫描器件的探测光路中继系统；
第二物镜模块，包括第二物镜和与之配套的中继光学系统，所述中继光学系统用于将从主物镜模块返回的信号光中继传输到第二物镜的后端，然后经由第二物镜并在第二物镜的焦点区重建形成静止的中间图像；
图像采集模块，用于采集和探测所述静止的中间图像；
光片倾斜角扩展模块，包括具备反射、折射或者衍射功能的光学元件，设置在所述主物镜前端，用于扩展从主物镜出射的照明光片的倾斜角。
可选的，所述照明中继光学系统和所述探测中继光学系统为同一套光路，所述光学倾斜角扩展模块为至少一个平凡反射元件，或者至少一个非平凡反射元件；
所述平凡反射元件为基于镜面反射工作原理且出射角等于入射角的反射元件；所述非平凡反射元件为包括反射光栅、反射棱栅、数字微镜器件、反射式超平面在内的、出射角由入射角和元件微观结构共同决定的反射元件；
当斜光片进行自主扫描时，所述系统还包括主扫描器件，所述光学倾斜角扩展模块还包括线性位移装置；
所述主扫描器件用于驱动和控制斜照明光片在成像样本中的位置并进行扫描运动；
所述线性位移装置用于驱动至少一个平凡反射元件或者至少一个非平凡反射元件与主扫描器件同步移动，以满足去扫描条件。
可选的，所述照明中继光学系统和所述探测中继光学系统为同一套光路，所述光学倾斜角扩展模块为至少一个平凡反射元件和至少一个非平凡反射元件的组合；
所述平凡反射元件为基于镜面反射工作原理且出射角等于入射角的反射元件；所述非平凡反射元件为包括反射光栅、反射棱栅、数字微镜器件、反射式超平面在内的、出射角由入射角和元件微观结构共同决定的反射元件；
当斜光片进行自主扫描时，所述系统还包括主扫描器件，所述主扫描器件用于驱动和控制斜照明光片在成像样本中的位置并进行扫描运动；
通过控制光学倾斜角扩展模块中平凡与非平凡反射元件的结构和位置参数，以满足去扫描条件；
或者在所述光学倾斜角扩展模块设置线性位移装置，用于驱动至少一个平凡反射元件和/或至少一个非平凡反射元件与主扫描器件同步移动，以满足去扫描条件。
可选的，所述照明中继光学系统和所述探测中继光学系统为同一套光路，所述光学倾斜角扩展模块为至少一个衍射元件；
当斜光片进行自主扫描时，所述系统还包括主扫描器件，所述光学倾斜角扩展模块还包括线性位移装置；
所述主扫描器件用于驱动和控制斜照明光片在成像样本中的位置并进行扫描运动；
所述线性位移装置用于驱动至少一个衍射元件与主扫描器件同步移动，以满足去扫描条件。
可选的，所述照明中继光学系统和所述探测中继光学系统为同一套光路，所述光学倾斜角扩展模块为至少一个折射元件，所述折射元件具备至少一次折射功能；
当斜光片进行自主扫描时，所述系统还包括主扫描器件，所述光学倾斜角扩展模块还包括线性位移装置；
所述主扫描器件用于驱动和控制斜照明光片在成像样本中的位置并进行扫描运动；
所述线性位移装置用于驱动至少一个折射元件与主扫描器件同步移动，以满足去扫描条件。
可选的，所述照明中继光学系统和所述探测中继光学系统为同一套光路，所述光学倾斜角扩展模块包括能够发生多次反射和/或多次折射和/或多次衍射的特殊棱镜；
当斜光片进行自主扫描时，所述系统还包括主扫描器件，所述光学倾斜角扩展模块还包括线性位移装置；
所述主扫描器件用于驱动和控制斜照明光片在成像样本中的位置并进行扫描运动；
所述线性位移装置用于驱动所述特殊棱镜与主扫描器件同步移动，以满足去扫描条件。
可选的，所述照明中继光学系统和所述探测中继光学系统为分立的光路，所述光学倾斜角扩展模块包括：一个或者多个平凡反射元件和/或一个或者多个非平凡反射元件和/或一个或者多个衍射元件和/或一个或者多个透射式光片偏转元件；
所述平凡反射元件为基于镜面反射工作原理且出射角等于入射角的反射元件；所述非平凡反射元件为包括反射光栅、反射棱栅、数字微镜器件、反射式超平面在内的、出射角由入射角和元件微观结构共同决定的反射元件；
当斜光片进行自主扫描时，所述系统还包括主扫描器件，所述主扫描器件用于驱动和控制斜照明光片在成像样本中的位置并进行扫描运动；
通过分别控制照明中继光学系统和探测中继光学系统的放大率，以满足去扫描条件；
或者在所述光学倾斜角扩展模块中设置线性位移装置，通过所述线性位移装置驱动所述光学倾斜角扩展模块中的光学元件与主扫描器件同步移动，以满足去扫描条件。
可选的，所述主扫描器件为多边形扫描棱镜，所述照明中继光学系统中的照明光路与所述探测光路中继系统中的探测光路分别使用所述多边形扫描棱镜的不同反射面。
可选的，所述系统包括两个分立的扫描器，所述照明中继光学系统中的照明光路和所述探测光路中继系统中的探测光路分别使用独立的扫描器；两个扫描器采用相同或者不同的扫描速度同步工作。
可选的，所述光片产生模块还包括动态调焦装置。
本发明的有益效果：
本发明通过在主物镜前端设置具备反射、折射或者衍射功能的光学元件来扩展从主物镜出射的照明光片的倾斜角。与现有的斜光片显微镜相比，本发明中照明光片的倾斜角不再受限于主物镜的孔径角，可以自由扩展至接近垂直于主物镜光轴入射，使得后续探测光路中第二物镜会聚锥角与第三物镜收集锥角的重合程度显著提升，进而提升整个扫描斜光片成像系统的等效数值孔径、三维空间分辨率、信号光(荧光或散射光)的收集效率、成像速度等重要性能指标。本发明亦可应用于在保证同等荧光收集效率和体积成像速度的前提下降低激发光剂量，从而减少对成像样本——尤其是活体模式动物和活体组织——的光漂白和光损伤，有利于对活体样本的重复、长时程跟踪观测。
本发明所提出的照明光片倾斜角扩展方案对于大视场斜光片显微镜的研制尤为关键。由于能够提供若干毫米视场的商品物镜通常孔径角也较小，如果直接沿用标准斜光片显微镜的设计思路，则会严重限制整机系统的等效孔径角，难以甚至无法实施高效率高速三维层析成像。应用本发明的倾斜角扩展方案，则能够生成倾斜角远大于主物镜孔径角的照明光片，最终大幅提升整体成像系统的等效数值孔径、三维空间分辨率、信号光收集效率、三维体积成像速度等核心性能指标。
附图说明
图1为本发明实施例提供的一种斜光片成像系统结构示意图；
图2a为照明与探测中继光学系统简并时基于单个平凡反射元件的光片倾斜角扩展模块及斜光片成像系统结构示意图；
图2b为解释图2a中平凡反射元件引起光片扫描方向反转的原理图；
图2c为解释通过同步平移该平凡反射元件使得垂轴面位移保持不变的原理图；
图3a为照明与探测中继光学系统简并时基于单个衍射元件的光片倾斜角扩展模块及斜光片成像系统结构示意图；
图3b为解释图3a中衍射元件不改变光片扫描方向、但会改变垂轴面位移量的原理图；
图3c为解释通过同步平移该衍射元件使得垂轴面位移保持不变的原理图；
图4a为照明与探测中继光学系统简并时基于单个折射元件的光片倾斜角扩展模块及斜光片成像系统结构示意图；
图4b为解释三棱镜不改变光片扫描方向、但会改变垂轴面位移量的原理图；
图4c为解释通过同步平移该三棱镜使得光片的垂轴面位移保持不变的原理图；
图5a为基于单个二次反射棱镜的光片倾斜角扩展模块的结构示意图；
图5b为基于单个三次反射棱镜的光片倾斜角扩展模块的结构示意图；
图5c为解释通过同步平移该三次反射棱镜使得光片的垂轴面位移保持不变的原理图；
图6a为照明与探测中继光学系统简并时基于多个平凡反射元件的光片倾斜角扩展模块及斜光片成像系统结构示意图；
图6b为解释两次反射导致斜光片在垂轴面内的扫描位移量发生改变的原理图；
图6c为解释通过同步平移第二个平凡反射元件使得光片的垂轴面位移量保持不变的原理图；
图7a为照明与探测中继光学系统简并时组合使用平凡与非平凡反射元件的光片倾斜角扩展模块及斜光片成像系统结构示意图；
图7b为解释通过优化光栅的位置、角度、线对密度等参数使得光片的垂轴面位移量保持不变的原理图；
图8为照明与探测中继光学系统分立时基于单个平凡反射元件的光片倾斜角扩展模块及斜光片成像系统结构示意图；
图9a为照明与探测中继光学系统分立时基于单个非平凡反射元件的光片倾斜角扩展模块的结构示意图；
图9b为照明与探测光学系统分立时基于单个特殊透射式光片偏转元件的光片倾斜角扩展模块的示意图；
图10为照明与探测中继光学系统分立时基于多面转镜的斜光片成像系统结构示意图；
图11为照明与探测中继光学系统分立、且分别配备了独立扫描器的斜光片成像系统结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本发明相关的部分而非全部结构。
具体参见图1，本发明实施例提供的一种斜光片成像系统可以包括以下模块：
光源模块：优选使用激光光源，也可以采用发光二极管、灯，以及经过光纤传导后出射的各种光源。光源模块可以包含多组物理上分离的光源设备，可以包含多个波长成分，或者直接采用宽谱光源(如超连续谱光源)等。
主扫描器件：既用于驱动和控制斜照明光片在成像样本中的位置和进行扫描运动，又用于将探测到的信号光去扫描，使得第二物镜重建的中间图像保持静止。该扫描器优先选用具有足够通光口径的检流计扫描振镜，其他可行的选择包括(但不限于)微机电系统(MEMS)扫描器、旋转楔形棱镜、多边形扫描器等。
主物镜模块：该模块主要包括第一物镜(即主物镜)和与之配套的中继光学系统；其中主物镜直接面向成像样本，中继光学系统一般选用具备合适放大倍率的4f-系统，包括用于将扫描器的扫描运动传送到主物镜后端的照明中继光学系统，和用于将主物镜收集的背向信号光传送回主扫描器件的探测光路中继系统，背向信号光经去扫描后进入下述第二物镜模块。在一些实施例中，照明和探测中继光学系统是基于同一组透镜和/或4f-系统的；在另一些实施例中，照明中继光学系统和探测中继光学系统是分立的，可以独立设计。
第二物镜模块：该模块主要包含第二物镜和与之配套的中继光学系统；其中，中继光学系统一般选用具备合适放大倍率的4f-系统，用于将从主物镜模块返回的信号光中继传输到第二物镜的后端，再经由第二物镜在其焦点区重建形成静止的中间图像。
图像采集模块：用于采集和探测上述的静止中间图像，一般包括图像放大光路、滤光片和图像传感器。其中图像传感器的选择包括(但不限于)电荷耦合器件(charge-coupled device,CCD)、互补金属氧化物半导体(complementary metal oxidesemiconductor,CMOS)、单光子雪崩二极管(single photon avalanche diode,SPAD)或SPAD阵列、光电倍增管(photomultiplier,PMT)或PMT阵列、硅光电倍增管(siliconphotomultiplier,SiPM)或SiPM阵列；图像放大光路用于将中间图像映射到图像传感器上，完成信号接收和图像采集。
光片倾斜角扩展模块：该模块可以被部署在主物镜的前端，具备反射、折射或者衍射功能的光学元件，例如可以包含一个或多个反射、折射或衍射元件，利用精准设计的若干次反射、折射和/或衍射，改变从主物镜出射的照明光片的前进方向，使得其最终能以更大的、超越主物镜孔径角限制的倾斜角入射到待成像样品中，同时规避对探测光路的遮挡和/或引入明显像差等干扰。
本发明有两大类应用场景，说明如下：
1)对于斜光片本身静止不动、样品扫描的体积成像应用场景，如成像样品装载在位移台驱动下平移，或者用于成像微流控系统中的流动样品等，第二物镜重建的重建图像自然保持静止，因此无需考虑去扫描探测条件，仅实现照明光片倾斜角扩展即可；此时扫描斜光片成像系统中主扫描器件可以省略，或者替换为非扫描光学元件(如反射镜)。
2)对于需要主动扫描斜光片实施三维体积成像的应用场景，在照明光片倾斜角扩展的基础上，还需要考虑去扫描探测条件。需要注意的是，在常规的斜光片成像系统中，照明光路与探测光路共用主扫描器件和主物镜模块，且二者自主扫描器件至成像样品段的光路是完全重合的；由光路的可逆性，去扫描探测条件自动满足。在引入光片倾斜角扩展模块后，为规避对探测光路的遮挡或其他干扰，后向收集的信号光一般不再经过该倾斜角扩展模块，打破了上述的光路可逆性，因而需要借助特殊设计，使得从斜照明光片返回的信号光仍能被主扫描器件去扫描，以保证第二物镜重建的中间图像保持静止。
对于后续详细描述的本发明所有实施例，默认都可以应用于上述第一种(即样品扫描)应用场景，且成像光路可以相应简化，不再一一赘述。
在本发明的第一类实施例中，桥接主扫描器件与主物镜的照明中继光学系统与探测中继光学系统简并为同一套光路。此时照明光路从主扫描器件到主物镜后端(或后焦面)的放大率与探测光路从主物镜后端(或后焦面)到主扫描器件的放大率/>呈倒数关系，即/>
假设主扫描器件被共轭映射到主物镜的后焦面，且主扫描器件导致的光束偏转角为α(正负代表偏转方向)，则从主物镜出射的光片在垂轴面内的扫描位移为 其中f1代表主物镜的有效焦距。如果要满足去扫描探测条件，则经过光片倾斜角扩展模块之后的斜照明光片的垂轴面扫描位移/>应该与扩展前相等，即从而背向信号光的主光线返回到主扫描器件时的偏转角/> 即与主扫描器件主动产生的光束偏转角相同，从而满足去扫描探测条件。
为满足上述去扫描探测条件，在一些实施例中，这些反射、折射或衍射元件中的一个或者多个需要沿着特定的轨迹与主扫描器件同步移动；在另一些实施例中，通过优化设计这些反射、折射或衍射元件的性能参数和安装方位等，可以在无需借助额外运动控制器件的前提下保证斜照明光片的扫描运动满足去扫描条件。
在本发明的第二类实施例中，照明与探测中继光学系统是两套分立的光路系统，其放大率可以相互独立地设计与调整，从而可以兼容更多不同类型的光片倾斜角扩展方案，更加灵活多变地实现去扫描探测条件。进一步，分立的照明中继光学系统和探测中继光学系统可以使用主扫描器件(如多面转镜)的不同反射面，甚至直接使用分立的(同步运转)扫描器件，为光片倾斜角扩展和实现去扫描探测条件提供更多的光路设计自由度。
在本发明的一些实施例中，前述的光片产生模块可以包含一个动态调焦装置，该变焦装置与(主)扫描器件同步工作，保证在扫描过程中照明光片的光腰始终位于主物镜的焦平面或其他指定垂轴面的附近，以优化所得三维体积图像的综合空间分辨率。
在本发明的一些实施例中，在引入光片倾斜角扩展模块后去扫描条件无法完全满足，导致第二物镜重建的中间图像在扫描过程中不能保持完全静止，而是存在沿第三物镜光轴方向的小幅度抖动。在这种情况下，可以在前述图像采集模块的光路中引入景深扩展机制，如利用三次相位板、锥透镜、可变形反射镜或空间光调制器等装置调制图像采集光路的光瞳函数以拓展其成像景深，避免反复重新对焦，提升图像采集和整机系统的体积成像速度。
在本发明的第一大类实施例中，斜光片成像系统照明光路与探测光路共用主扫描器件、主物镜，以及桥接二者的中继光学系统。如前所述，对于需要主动扫描斜光片实施三维体积成像的应用场景，去扫描条件要求照明光片在通过光片倾斜角扩展模块前后其垂轴扫描位移保持不变。基于这一要求，至少可以衍生如下几种实施例。
实施例1
图2a展示了一种基于单个平凡反射元件的光片倾斜角扩展模块，以及对应的整体斜光片成像系统实施例。在本实施例中，从光片产生模块出射的照明光片由刀刃拣选反射镜261和透镜221入射到主扫描器件24，反射后沿着由透镜211和透镜212组成的照明/探测共用中继光学系统入射到主物镜21的后端，然后从主物镜前端的一侧出射，在平凡反射元件201表面反射后，以更大的倾斜角入射到成像样品中。通过将平凡反射元件201安装在主物镜前端一侧并尽量靠近边缘，避免(或者最小化)对探测光路的遮挡。
照明光片与成像样本作用后，产生的荧光或背向散射光——以下统称为背向信号光——通过主物镜21、探测中继光学系统(透镜211和透镜212)、主扫描器件24后进入由透镜221、透镜222和第二物镜22组成的第二物镜模块，并在第二物镜焦点区重建得到中间图像231。该中间图像再经由第三物镜23和镜筒透镜232映射到图像传感器25上被采集记录。图2a中在第二物镜22和中间图像231之间，用灰色阴影标记了第二物镜会聚光锥的可收集部分；注意灰色阴影的上下边界分别被第二、第三物镜的孔径角框定。这里得益于照明光片倾斜角的显著提升，第二物镜会聚光锥(立体)角的可收集部分超过了50％。
需要指出的是，如图2b所示，该平凡反射元件201如果保持静止不动，则照明光片的扫描方向会被反转。对于需要主动扫描斜光片实施三维体积成像的应用场景，可以在光片倾斜角扩展模块中加装线性位移装置驱动反射镜201沿主光轴方向与主扫描器件24同步往复移动(见图2c)，以控制斜照明光片的垂轴面位移在经过反射镜201前后保持不变(即如图2c所示，A2B2＝A1B1)。
需要说明的是，在本发明专利中，所述平凡反射元件为基于镜面反射工作原理且出射角等于入射角的反射元件(如金属膜反射镜、介质膜反射镜、全反射棱镜等)；所述非平凡反射元件为包括反射光栅、反射棱栅、数字微镜器件、反射式超平面在内的、出射角由入射角和元件微观结构共同决定的反射元件。
本实施例中的平凡反射元件201可以选用金属膜反射镜、介质膜反射镜或全反射(棱)镜，也可以选用具备合适形状参数的反射棱镜，亦或相关领域的技术人员熟悉的任一其他设计。实施例中的各透镜系统可以采用凸透镜、凹透镜、柱形透镜或离轴抛物面反射镜等，以及相关领域的技术人员熟悉的任一其他设计。
在一些替代实施例中，光片倾斜角扩展模块也可以采用反射式(闪耀)光栅、棱栅、超表面、超透镜，或者数字微镜器件(digital micromirror devices,DMD)等非平凡反射元件；此时成像系统的整体光路对应于将图2a中的反射元件201替换为任一上述非平凡反射器件。如前所述，对于需要主动扫描斜光片实施三维体积成像的应用场景，可以在光片倾斜角扩展模块中加装线性位移装置驱动所选非平凡反射元件与主扫描器件同步往复移动，以控制斜照明光片的垂轴面位移在经过该非平凡反射元件前后保持不变。
实施例2
图3a展示了一种基于单个衍射元件的光片倾斜角扩展模块，以及对应的整体斜光片成像系统实施例。在实施例中，照明光片从主物镜21的前端出射后经过透射式衍射光栅202后偏转，以更大的倾斜角β2入射到成像样本中。该透射式光栅同样安装在主物镜前端的一侧，以避免(或最小化)对探测光路的遮挡。实施例的其余光路与图2a所示的实施例相同，相关技术细节和对应的替代实施方案此处不再赘述。
如图3b所示，本实施例光片倾斜角扩展模块所采用的透射式衍射光栅不会改变照明光片的扫描位移方向，因此不仅适用于样本扫描、斜光片静止的成像场景，也可用于基于斜照明光片主动扫描的应用场景。但需要注意的，照明光片经透射光栅偏折后，其垂轴面位移量一般会发生放缩(如图3b所示，A2B2≠A1B1)；具体的放缩比例与照明光片经过透射光栅时的入射与出射角、光栅的线对密度，以及最终入射到成像样本中的倾斜角β2等都有关系。
对于需要斜光片自主扫描的应用场景，可以引入线性位移装置驱动透射式光栅202与主扫描器件和斜照明光片同步移动，使得经过光栅202偏转后斜照明光片的垂轴面位移量保持不变(即如图3c所示，A3B3＝A1B1)，以满足去扫描条件。对于某些特殊情形，如光栅202与主光轴垂直(即与焦平面平行)时，斜照明光片在穿过光栅前后的垂轴面位移量保持不变，此时去扫描条件自然满足，无需额外引入线性位移装置。
本实施例中，透射式光栅202可以优先采用闪耀光栅，使得更多照明光能量集中到所需的照明光片中。在一些替代实施例中，透射式衍射光栅202可以替换为其他如衍射光学元件、棱栅、超透镜、超表面等透射式元件，以及相关领域技术人员清楚的任意其他能够调控出射方向的光学器件。
实施例3
前述基于衍射元件的实施例不可避免的会将进入倾斜角扩展模块前的照明光能量分散到多个衍射极上，导致照明光能量有效利用率的降低。鉴于此，图4a展示了一种基于单个折射元件的光片倾斜角扩展模块，以及对应的整体斜光片成像系统实施例。
本实施例中的单个折射元件优先选用三棱镜203。照明光片从主物镜21前端靠近边缘处出射后被三棱镜203两次折射，通过设计与优化三棱镜的折射率、顶角等参数，可以调控照明光片沿更大的倾斜角β2入射到成像样本中。注意三棱镜203应尽量靠近主物镜21前端的边缘，以避免(或最小化)对探测光路的遮挡。本实施例的其余光路与如图2a和图3a所示的前两个实施例相同，这里不再赘述。
如图4b所示，本实施例光片倾斜角扩展模块所采用的三棱镜不会改变照明光片的扫描位移方向，因此不仅适用于样本扫描、斜光片静止的成像场景，也可用于基于斜照明光片主动扫描的应用场景。需要注意的，照明光片经三棱镜偏折后，其垂轴面位移量一般会发生放缩(如图4b所示，A2B2≠A1B1)；具体的放缩比例与照明光片相对于三棱镜两侧腰面的入射和出射角、三棱镜本身的折射率和顶角，以及最终入射到成像样本中的倾斜角β2等都有关系。对于需要斜光片自主扫描的应用场景，为满足去扫描条件，可以引入线性位移装置驱动三棱镜203与主扫描器件和斜照明光片同步移动，使得经过三棱镜203偏转后的斜照明光片的垂轴面位移量保持不变，即如图4c所示的A3B3＝A1B1。
实施例4
除前述的单次反射元件、单一衍射元件或简单棱镜，光片倾斜角扩展模块也可以采用能提供多次(全)反射、折射或衍射的特殊棱镜实现。图5a展示了利用二次反射棱镜204构建的光片倾斜角扩展模块；该图重点展示了二次反射棱镜204相关的照明光路，从主物镜以上的光路与图2a至图4a相同，此处从略。
如图5a所示，照明光片从主物镜出射后，从二次反射棱镜204的上侧面垂直入射进入棱镜内部，在棱镜内部发生两次反射或全反射后，垂直于棱镜左侧斜面出射。设该二次反射棱镜204的上侧面与(发生第一次全反射的)右侧斜面夹角为θ，易得垂直于左侧斜面出射的照明光片相对于主光轴的倾斜角为2θ。通过合理选择反射棱镜204的折射率和夹角θ，即可实现照明光片倾斜角的提升，并避免或最小化对探测光路的遮挡和干扰。
如图5a所示，本实施例所采用的二次反射棱镜不会改变照明光片的扫描位移方向，因此不仅适用于样本扫描、斜光片静止的成像场景，也可用于基于斜照明光片主动扫描的应用场景。但需要注意的，照明光片经反射棱镜偏折获得更大的倾斜角后，其垂轴面扫描位移量会增大；如图5a所示，A2B2＝A1B1/cos 2θ。在这种情况下，可以在光片倾斜角扩展模块中加装线性位移装置驱动反射棱镜204沿主光轴方向往复移动(即图5a中上下移动)，以调节和控制斜照明光片的垂轴面位移在经过反射棱镜204前后保持不变。
图5b展示了基于一种三次反射棱镜的实施例；该图同样省略了自主物镜以上的光路。照明光片从主物镜出射后，从等腰棱镜205的一侧腰面垂直入射进入棱镜内部，在棱镜内部发生三次全反射后，垂直于棱镜左侧腰面出射。假设进入棱镜前的入射光片传播方向与主光轴平行，并记等腰棱镜205的侧面与底面夹角为θ，则易得经三次反射从该棱镜左侧斜面出射的照明光片相对于主光轴的倾斜角为2θ-π/2。通过合理选择等腰棱镜205的折射率和底角θ，并在无法满足全反射时引入表面镀膜，可以调控实现照明光片倾斜角的提升，并避免或最小化对探测光路的遮挡和干扰。需要注意的，如图5b所示，如果该三次反射棱镜保持静止，则经过三次反射后照明光片的扫描方向会发生反转。因此，对于需要主动扫描斜光片实施三维体积成像的应用场景，可以在光片倾斜角扩展模块中加装线性位移装置驱动等腰棱镜205与主扫描器件24(即与扫描的光片本身)同步往复移动，以控制斜照明光片的垂轴面位移在经过等腰棱镜205前后保持不变(如图5c所示)。
图5a-c所示的实施例中的二次反射棱镜204和三次反射棱镜205在替代实施例中可以替换为满足倾斜角扩展需求的任一其他形状的多次反射棱镜，发生在其内表面的反射可以是全反射，也可以是依靠外表面镀膜的普通镜面反射。
在替代实施例中，照明光片进出棱镜时的入射角和出射角都可以自由设计，不必是如图5a-c所示的垂直入射与出射，而是可以在棱镜表面发生折射。进一步，还可以通过在棱镜表面引入全息光栅或是直接与光栅组合使用等方式引入光栅衍射，灵活调控和提升出射照明光片相对于主光轴的倾斜角。
实施例5
图6展示了一种基于多个平凡反射元件的光片倾斜角扩展模块，以及对应的整体斜光片成像系统实施例。在该实施例中，照明光片首先被安置于主物镜前端一侧的反射元件206反射，之后沿着(接近)垂直于主光轴的方向前进，在被安置于主物镜前端对侧的反射元件207反射后入射到成像样品中。通过调整照明光片从主物镜前端的初始出射方向、反射元件206和207的方位等，可以大幅提升光片进入样品的倾斜角度，且可以明显超过主物镜的孔径角极限；同时反射元件206和207分置于主物镜两侧，可以避免或尽量减小对探测光路的干扰或遮挡。
照明光片在样品中激发的背向信号光被主物镜接收，然后经透镜212和211到达主扫描器件24；注意信号光不再经过用于照明光片倾斜角扩展的反射镜206和207，这也是本发明的关键优点之一。信号光经过主扫描器件24后，进入由透镜221、透镜222和第二物镜22组成的探测光路，然后在第二物镜的焦点区重建出对应于激发光片的倾斜实像231。实施例的其余光路部分与前文图2-图5所示的实施例相似，相关技术细节和对应的替代实施方案此处不再赘述。
需要指出的是，如图6a-c中所示的实施例中，光片在反射元件206和207之间的前进方向近似与主光轴垂直。在替代实施例中，相关领域的技术人员可以根据实际情况，灵活调整光片的具体朝向和光路细节，达到同等的倾斜角扩展效果。
如图6b所示，照明光片经过两次反射后，其扫描方向保持不变，本实施例的倾斜角扩展模块不仅适用于样本扫描、斜光片静止的成像场景，也可用于基于斜照明光片主动扫描的应用场景。但值得注意的是，一束光(或光片)在普通(平凡)反射镜上反射前后的切向位移(即在垂直于其光束前进方向的平面内的位移，记为d)是不变的。再记光片在反射前后相对于主光轴的倾斜角分别为β1和β2，易得反射前后斜光片在(相对于主光轴的)垂轴面内的扫描位移分别为等于d/cosβ1和d/cosβ2，所以在倾斜角扩展之后(即β2＞β1)其扫描位移必然随之扩大，即图6b中的A2B2＝d/cosβ2＞d/cosβ1＝A1B1。
对于需要斜光片自主扫描的应用场景，为满足去扫描条件，可以加装线性位移装置以驱动反射元件207与主扫描器件同步运动，使得倾斜角扩展后的激发光片的横向扫描位移(图6c，A3B3)与提升前的扫描位移A1B1相同。无论激发光片扫描到何处，信号光返回到主扫描器件时都能被精确去扫描，保证了第二物镜重建的中间图像在激发光片扫描的过程中保持静止，最大化图像采集效率和三维体积成像速度。
本实施例的平凡反射元件206和207可以选用金属膜反射镜、介质膜反射镜或全反射(棱)镜，也可以选用具备合适形状参数的反射棱镜，或相关领域的技术人员清楚的任一其他设计。
实施例6
从针对上一实施例的理论分析可知，如果能够引入某种非平凡反射元件，使得反射后光片的切向位移d2小于反射前的切向位移d1，即d2＜d1，则有可能通过调整反射后照明光片的倾斜角β2使得d2/cosβ2＝d1/cosβ1，从而无需加装线性位移装置也可保证去扫描条件成立。
图7a展示了该策略的一种实施例。该图仅给出了从主扫描器24至第一物镜21和光片倾斜角扩展模块的光路，并示意了照明光片的两个扫描位置；整体光路的其余部分与图6a相同，此处从略。在该实施例中，照明光片首先被安置于主物镜前端一侧的反射元件206反射，之后沿着(接近)垂直于主光轴的方向前进，在被安置于主物镜前端对侧的非平凡反射元件208反射后入射到成像样品中。由于照明光片经过两次反射后扫描方向保持不变(如图7b所示)，本实施例的倾斜角扩展模块不仅适用于样本扫描、斜光片静止的成像场景，也同样适用于基于斜照明光片主动扫描的应用场景。
在图7展示的本实施例中，非平凡反射元件208优先选用反射式衍射光栅。当照明光片入射到反射光栅208之后，将产生对应于不同的衍射极的多个激发光片副本；通过优化光栅的位置、角度、线对密度和闪耀角等参数，可以使得：1)大部分衍射能量集中于某一衍射极(常见如+1或-1级)；2)对应该衍射极的(副本)照明光片能以更大的倾斜角入射到成像样本中，3)该副本激发光片的垂轴扫描位移与从主物镜出射的(倾斜角扩展之前的)照明光片的扫描位移保持相等(如图7b所示)，从而满足去扫描条件。
在替代实施例中，非平凡反射器件208也可以选用反射式棱栅、反射式超表面(meta-surface)或超透镜、数字微镜器件(digital micromirror devices,DMD)等，或是透射式衍射元件(如光栅、超表面、超透镜等)与平凡反射元件的组合，或是相关领域技术人员清楚的任一其他设计。
另外，在如图2至图7所示的本大类所有实施例和相应的替代实施例中：
(1)主扫描器件24优先选用检流计扫描振镜；在替代实施例中，主扫描器件24也可以选用微机电系统(MEMS)扫描器、旋转楔形棱镜、多边形扫描器，或者相关领域技术人员清楚的任一其他设计。
(2)从光片产生模块出射的照明光片可以从第二物镜模块的扫描透镜221和镜筒透镜222之间利用刀刃拣选反射镜261引入照明光路以最小化对探测光路的遮挡，也可以从光路中其他等价位置利用刀刃拣选反射镜261或者二向色镜等光学元件引入。
(3)对于需要满足去扫描探测的成像场景，用于驱动(非)平凡反射元件、衍射元件或棱镜等与主扫描器件同步移动的线性位移装置可以采用无论何种工作原理的线性电机，如线性伺服电机、线性步进电机、音圈电机、压电电机等。
在本发明的第二大类实施例中，照明光路与探测光路依然共用主扫描器件、主物镜，但桥接二者的照明中继光学系统与探测中继光学系统是分立的，于是照明光路从主扫描器件到主物镜后焦面的放大率与探测光路从主物镜后焦面到主扫描器件的放大率/>不再绑定为互为倒数关系，而是可以独立灵活设计。
如此分立的照明与探测中继光学系统显然适用于扫描成像样本而照明光片保持不动的应用场景。对于需要主动扫描斜光片实施三维体积成像的应用场景，如前所述，去扫描条件要求照明光片在通过光片倾斜角扩展模块前后其垂轴扫描位移保持不变。记σt为扫描光片经过倾斜角扩展模块后其切向位移的放缩比例(可正可负，负号代表位移方向反转)，则去扫描条件转换为：
式中β1为光片从主物镜出射时的初始倾斜角，β2为经过倾斜角提升模块后的光片倾斜角；一般地，β2＞β1。尤其需要指出的是，和/>可以具有相反的符号，为满足去扫描条件提供了更多灵活度。
以分立中继光学系统和公式(1)为基础，可以派生出多种不同实施方案，以下结合配图详细说明。
实施例7
图8展示了基于分立中继光路设计策略的第一种实施例，其中光片倾斜角扩展模块采用了单个平凡反射元件207。从光片生成模块出射的光片需要从特定的角度入射到主扫描器件24(优先选用检流计扫描振镜)上，反射后进入由透镜271、反射镜275、透镜272、透镜273、透镜274构成的照明中继光学系统，并被中继到主物镜后端；从主物镜前端出射的照明光片经平凡反射元件207反射后以更大的倾斜角入射到成像样本中。照明光片在样本中激发的背向信号光(荧光或散射光)由主物镜直接接收，后经基于由透镜211和透镜212组成的4f-系统的探测中继光学系统返回到主扫描器件24；经主扫描器件反射后的探测光路与前述实施例相似，此处不再赘述。
注意单次平凡反射不改变扫描光片的切向位移大小，但会反转其扫描方向，即公式(1)中的放缩系数σt＝-1。对于主动扫描斜光片实施三维体积成像的应用场景，通过调整与设计照明中继光学系统和探测中继光学系统的放大率，使得即可满足去扫描探测的要求。
在本实施例中，照明中继光学系统由两组4f系统级联构成且包含一次会反转扫描方向的镜面反射；其中一组4f系统采用了凹透镜加凸透镜的组合，从而最终的探测中继光学系统则由包含凸透镜212和凸透镜211的4f系统构成，于是在替代实施例中，照明中继光路和探测中继光路都可以由一组或任意多组4f系统构成，且所涉及的4f系统可以由凸透镜、凹透镜、柱形透镜或离轴抛物面反射镜等组成，或采用相关领域技术人员清楚的任一其他设计。
本实施例中的光片倾斜角扩展单元仅包含单个平凡反射元件207。该平凡反射元件优先选用金属膜反射镜、介质膜反射镜或全反射(棱)镜，也可以选用具备合适形状参数的多次反射棱镜，亦或是相关领域的技术人员熟悉的任一其他设计。
在一些替代实施例中，光片倾斜角扩展单元亦可包含两个或更多的平凡反射元件，即有可能使得光片切向扫描位移放缩比例σt＝+1。和/>的大小和符号，则可以通过合理选择各组成透镜的有效焦距，以及引入合适次数的镜面反射等进行调整。
实施例8
图9a展示了基于分立中继光路设计策略的第二种实施例。此处仅展示了从主物镜后焦面到成像样品的部分光路；整体光路的其余部分与图8所示的实施例相同，不再重复。
在本实施例中，主物镜前端的光片倾斜角扩展模块采用了非平凡反射元件208。照明光片在非平凡反射元件上的入射角和出射角一般不相等，因此会改变扫描光片的切向位移，即光片的切向扫描位移放缩比例系数σt的绝对值不一定等于1。对于需要主动扫描斜光片实施三维体积成像的应用场景，照明中继光学系统和探测中继光学系统的放大率应满足广义去扫描条件，即公式(1)：以实现正确的去扫描探测；且需要注意的是，非平凡反射器件也可能反转光片的扫描方向(即使得σt＜0)，在这种情况下，/>和/>应该具有相反的符号。
在本实施例中，非平凡反射元件208可以选用反射式光栅、反射式棱栅(grism)、反射式超表面(meta-surface)或超透镜、数字微镜器件(digital micromirror devices,DMD)等，或相关领域技术人员清楚的任一其他设计。
替代实施例中，光片倾斜角扩展模块可以包含一个或多个非平凡反射器件，或是组合使用平凡与非平凡反射元件等；在需要主动扫描斜光片实施三维体积成像时，需要相应调整照明中继光学系统和探测中继光学系统的放大率(包括大小和符号)以保证去扫描条件。
实施例9
图9b展示了基于分立中继光路设计策略的第三种实施例。此处仅展示了从主物镜后焦面到成像样品的部分光路；整体光路的其余部分与图8所示的实施例相同，不再重复。
在本实施例中，特殊透射式元件优先采用了三棱镜203，利用照明光片经过三棱镜203时的折射改变照明光片的方向。通过优化三棱镜的顶角、材料(折射率)、位置、朝向等设计参数，可以实现光片倾斜角的提升。
对于需要主动扫描斜光片实施三维体积成像的应用场景，需要注意扫描光片经三棱镜折射后的切向位移量一般会改变(即光片的切向扫描位移放缩系数σt的绝对值一般不等于1)。为满足去扫描条件，此时照明中继光学系统和探测中继光学系统的放大率应满足广义去扫描条件
在替代实施例中，三棱镜203也可以替换为其他特殊透射式光片偏转元件，包括(但不限于)楔形棱镜、透射式衍射光栅、透射式棱栅(grism)、透射式超表面或超透镜(meta-lens)等折射或衍射光学元件，或相关领域技术人员清楚的任一其他设计。
本实施例的光片倾斜角扩展模块仅包含单个特殊透射式元件203。在替代实施例中，光片倾斜角扩展模块也可以包含两个或更多透射式光片偏转元件，或者采用平凡反射元件、非平凡反射元件和透射式光片偏转元件的任意组合。对于需要主动扫描斜光片实施三维体积成像的应用场景，需要根据光片倾斜角扩展模块综合的切向扫描位移放缩系数σt，相应调整照明和探测中继光学系统的放大率(包括大小和符号)以保证去扫描条件。
实施例10
图10展示了基于分立中继光路设计策略发展而来的另一种实施例，其中主扫描器件采用了多面转镜(亦称多边形扫描棱镜)，照明光路与探测光路可以分别使用该多面转镜的不同反射面，从而使得斜光片成像系统整体的光路设计更为灵活。
在本实施例中，从光片生成模块出射的光片首先入射到多面转镜27的一个反射面上，反射后进入由透镜271、反射镜275、透镜272、透镜273、透镜274构成的照明中继光学系统，并被中继到主物镜21后端；从主物镜前端出射的照明光片经平凡反射元件207反射后以更大的倾斜角入射到成像样本中。照明光片在样本中激发的背向信号光(荧光或散射光)由主物镜21直接接收，然后通过由透镜212和透镜211构成的探测中继光学系统返回到多面转镜27的另一个反射面上；经该反射面后进入的第二物镜模块和图像采集模块的工作原理与前述实施例相同，此处不再赘述。
本实施例所采用的多面转镜27有6个反射面。在替代实施例中，该多面转镜可以具有任意多个反射面；尤其需要指出的是，只有2个反射面的多面转镜在功能和实现形式上等同于正反两面反射的检流计扫描振镜。
在本实施例中，照明光路与探测光路使用了多面转镜上相邻的两个反射面。在替代实施例中，照明光路与探测光路可以使用多面转镜的任意两个反射面。尤其需要指出的是，为实现周期性重复扫描，多面转镜可以单向转动，也可以往返转动(或摆动)。
实施例11
鉴于前一实施例中的多面转镜在任一时刻实际用到的只有两个反射面，上述实施例可以进一步推广至采用分立同步扫描器的实施例。在如图11所示的实施例中，照明光路和探测光路仅共用了主物镜，其余部分都是独立的，尤其是分别使用了独立的扫描器。
具体而言，从光片生成模块出射的光片首先入射到照明光路扫描器241上，反射后进入由透镜271、反射镜275、透镜272、透镜273、透镜274构成的照明中继光学系统，并被中继到主物镜21后端；从主物镜前端出射的照明光片经平凡反射元件207反射后以更大的倾斜角入射到成像样本中。照明光片在样本中激发的背向信号光(荧光或散射光)被主物镜21直接接收，然后通过由透镜212和透镜211构成的探测中继光学系统返回到与照明扫描器241相独立的探测光路扫描器242上；经该扫描器242后进入的第二物镜模块和图像采集模块的工作原理与前述实施例相同，此处不再赘述。
当需要主动扫描斜光片以实施三维体积成像时，照明光路扫描器241与探测光路扫描器242需要以相同周期精确同步扫描，但扫描角速度可以不同。记照明光路扫描器241和探测光路扫描器242导致的光束转动角速度分别为ω1和ω2，则去扫描条件要求
其中为从照明光路扫描器241至主物镜21后端的照明中继光学系统的放大率，/>为从主物镜21后端至探测扫描振镜242的探测中继光学系统的放大率，β1为光片从主物镜出射时的初始倾斜角，β2为经过光片倾斜角扩展模块后的光片倾斜角，σt则代表了光片倾斜角扩展模块引发的切向扫描位移放缩比例。值得注意的是，公式(2)中角速度的符号代表了光片的转动方向，即两台扫描器可以沿相同或相反的方向转动，为整体成像光路的设计和去扫描条件的实现提供了更高的自由度。
在图11所示的本实施例中，扫描器241和242都优先采用了检流计扫描振镜，且转动方向相同。在替代实施例中，这两台扫描振镜都可以选用微机电系统(MEMS)扫描器、旋转楔形棱镜、多面转镜等，或者相关领域技术人员清楚的任一其他设计；且根据照明和探测中继光学系统以及光片扩展模块的设计，可以自由设定这两台扫描器各自的扫描角速度大小和方向，以保证去扫描条件的成立。
需要整体说明的是：
1)在图8、图9、图11所示的实施例中，扫描器件24、照明光路扫描器241和探测光路扫描器242优先选用了检流计扫描振镜。在对应的替代实施例中，这些扫描器都可以选用微机电系统(MEMS)扫描器、旋转楔形棱镜、多面转镜，或者相关领域技术人员清楚的任一其他设计。
2)在图8-图11所示的实施例中，光片倾斜角扩展模块由单个平凡反射、非平凡反射或透射元件构成。在替代实施例中，光片倾斜角扩展模块亦可选用前述任何一种包含单个或多个平凡反射元件、非平凡反射元件、衍射元件或透射式光片偏转元件，以及这些元件的任意合理组合的照明光片倾斜角扩展方案，或采用相关领域技术人员清楚的任一其他设计。
3)在图8-图11所示的所有实施例中，照明中继光学系统由两组4f系统级联构成且包含一次平凡反射；探测中继光学系统则由一组4f系统构成。在替代实施例中，照明中继光学系统和探测中继光学系统都可以由任意多组4f系统构成，且所涉及的4f系统可以由凸透镜、凹透镜、柱形透镜或离轴抛物面反射镜等组成，或采用相关领域技术人员清楚的任一其他设计。
进一步的，在本发明的前述所有实施例中，倾斜角扩展后的照明光片在扫描过程中其光腰一般无法保持在同一个垂轴面(比如主物镜21的焦平面)内，影响最终所得三维体积图像的整体分辨率水平和均匀性。
鉴于此，对于前述任一实施例，都可以在光片产生模块中引入动态调焦装置，以便在扫描过程中同步动态地调节其光腰的位置，使得光腰始终保持在某个垂轴面(如主物镜的焦平面)内或者该平面附近。可选的动态调焦装置包括(但不限于)电动可调焦透镜(electrically tunable lens,ETL)、可变形反射镜(deformable mirror)、可调声学梯度透镜(tunable acoustic gradient index of refraction lens,TAG lens)、基于电动线性位移台或音圈电机的机械变焦装置，以及相关领域技术人员清楚的任一其他设计。
在本发明已经展示的所有实施例中，图像采集模块利用由第三物镜23和镜筒透镜232组成的图像采集中继光路将中间图像映射到图像传感器25上，其中第二物镜和第三物镜的孔径角的重合部分决定了系统整体的等效数值孔径和探测灵敏度。
在本发明的前述实施例中，第三物镜23和匹配的镜筒透镜232通常是同轴放置的；需要指出的是，图像采集中继光路也可以将中间图像缩小，或者呈现非对称的放大倍率以更好地匹配图像传感器的像素尺寸，以及优化提升成像速度等。在替代实施例中，图像放大光路可以包含光纤面板(fiber-optic faceplate)、纤维光锥(fiber-optic taper)或光纤传像束(fiber bundle)等光纤传像器件。通过将所选光纤传像器件的入射端面与中间图像重合放置，可以有效采集中间图像并传输至出射端面，再经放大光路映射到图像传感器上。
在上述用于斜光片自主扫描和去扫描探测的实施例中，可能存在去扫描不完全的情况，导致第二物镜重建的中间图像231无法保持完全静止，而是存在沿平行于第三物镜光轴方向的小幅度抖动。在本发明的一些实施例中，可以在图像采集模块中引入基于光瞳函数工程(pupil engineering)的景深扩展方法，以有效免疫中间图像的微小抖动，规避反复重新对焦对体积成像速度的影响；可选的光瞳函数调制装置包括(但不限于)三次相位板、锥透镜、可变形反射镜、空间光调制器，或其他相关领域技术人员了清楚的任一其他设计。
在本发明的一些实施例中，图像采集模块还可以包含谱分图像分束器，用于将中间图像按波长拆分成两个或多个副本，最终映射到不同的图像传感器或同一图像传感器的不同位置上，实现多光谱并行成像。
注意，上述仅为本发明的较佳实施例及所运用技术原理。本领域技术人员应当理解，本发明不限于这里所述的特定实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。

Claims (10)

1.一种斜光片成像系统，其特征在于，包括：
光源模块，用于提供光源；
光片产生模块，设置在光源的出射光路上，用于将光源模块发射的光转换为光片的形式；
主物镜模块，包括直接面向成像样本的主物镜、将主扫描器件的扫描运动传送到主物镜后端的照明中继光学系统，以及将主物镜收集的背向信号光传送回主扫描器件的探测光路中继系统；
第二物镜模块，包括第二物镜和与之配套的中继光学系统，所述中继光学系统用于将从主物镜模块返回的信号光中继传输到第二物镜的后端，然后经由第二物镜并在第二物镜的焦点区重建形成静止的中间图像；
图像采集模块，用于采集和探测所述静止的中间图像；
光片倾斜角扩展模块，包括具备反射、折射或者衍射功能的光学元件，设置在所述主物镜前端，用于扩展从主物镜出射的照明光片的倾斜角。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述照明中继光学系统和所述探测中继光学系统为同一套光路，所述光学倾斜角扩展模块为至少一个平凡反射元件，或者至少一个非平凡反射元件；
所述平凡反射元件为基于镜面反射工作原理且出射角等于入射角的反射元件；所述非平凡反射元件为包括反射光栅、反射棱栅、数字微镜器件、反射式超平面在内的、出射角由入射角和元件微观结构共同决定的反射元件；
当斜光片进行自主扫描时，所述系统还包括主扫描器件，所述光学倾斜角扩展模块还包括线性位移装置；
所述主扫描器件用于驱动和控制斜照明光片在成像样本中的位置并进行扫描运动；
所述线性位移装置用于驱动至少一个平凡反射元件或者至少一个非平凡反射元件与主扫描器件同步移动，以满足去扫描条件。
3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述照明中继光学系统和所述探测中继光学系统为同一套光路，所述光学倾斜角扩展模块为至少一个平凡反射元件和至少一个非平凡反射元件的组合；
所述平凡反射元件为基于镜面反射工作原理且出射角等于入射角的反射元件；所述非平凡反射元件为包括反射光栅、反射棱栅、数字微镜器件、反射式超平面在内的、出射角由入射角和元件微观结构共同决定的反射元件；
当斜光片进行自主扫描时，所述系统还包括主扫描器件，所述主扫描器件用于驱动和控制斜照明光片在成像样本中的位置并进行扫描运动；
通过控制光学倾斜角扩展模块中平凡与非平凡反射元件的结构和位置参数，以满足去扫描条件；
或者在所述光学倾斜角扩展模块中设置线性位移装置，用于驱动至少一个平凡反射元件和/或至少一个非平凡反射元件与主扫描器件同步移动，以满足去扫描条件。
4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述照明中继光学系统和所述探测中继光学系统为同一套光路，所述光学倾斜角扩展模块为至少一个衍射元件；
当斜光片进行自主扫描时，所述系统还包括主扫描器件，所述光学倾斜角扩展模块还包括线性位移装置；
所述主扫描器件用于驱动和控制斜照明光片在成像样本中的位置并进行扫描运动；
所述线性位移装置用于驱动至少一个衍射元件与主扫描器件同步移动，以满足去扫描条件。
5.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述照明中继光学系统和所述探测中继光学系统为同一套光路，所述光学倾斜角扩展模块为至少一个折射元件，所述折射元件具备至少一次折射功能；
当斜光片进行自主扫描时，所述系统还包括主扫描器件，所述光学倾斜角扩展模块还包括线性位移装置；
所述主扫描器件用于驱动和控制斜照明光片在成像样本中的位置并进行扫描运动；
所述线性位移装置用于驱动至少一个折射元件与主扫描器件同步移动，以满足去扫描条件。
6.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述照明中继光学系统和所述探测中继光学系统为同一套光路，所述光学倾斜角扩展模块包括能够发生多次反射和/或多次折射和/或多次衍射的特殊棱镜；
当斜光片进行自主扫描时，所述系统还包括主扫描器件，所述光学倾斜角扩展模块还包括线性位移装置；
所述主扫描器件用于驱动和控制斜照明光片在成像样本中的位置并进行扫描运动；
所述线性位移装置用于驱动所述特殊棱镜与主扫描器件同步移动，以满足去扫描条件。
7.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述照明中继光学系统和所述探测中继光学系统为分立的光路，所述光学倾斜角扩展模块包括：一个或者多个平凡反射元件和/或一个或者多个非平凡反射元件和/或一个或者多个衍射元件和/或一个或者多个透射式光片偏转元件；
所述平凡反射元件为基于镜面反射工作原理且出射角等于入射角的反射元件；所述非平凡反射元件为包括反射光栅、反射棱栅、数字微镜器件、反射式超平面在内的、出射角由入射角和元件微观结构共同决定的反射元件；
当斜光片进行自主扫描时，所述系统还包括主扫描器件，所述主扫描器件用于驱动和控制斜照明光片在成像样本中的位置并进行扫描运动；
通过分别控制照明中继光学系统和探测中继光学系统的放大率，以满足去扫描条件；
或者在所述光学倾斜角扩展模块中设置线性位移装置，通过所述线性位移装置驱动所述光学倾斜角扩展模块中的光学元件与主扫描器件同步移动，以满足去扫描条件。
8.根据权利要求7所述的系统，其特征在于，所述主扫描器件为多边形扫描棱镜，所述照明中继光学系统中的照明光路与所述探测光路中继系统中的探测光路分别使用所述多边形扫描棱镜的不同反射面。
9.根据权利要求7所述的系统，其特征在于，所述系统包括两个分立的扫描器，所述照明中继光学系统中的照明光路和所述探测光路中继系统中的探测光路分别使用独立的扫描器；两个扫描器采用相同或者不同的扫描速度同步工作。
10.根据权利要求2-9任一项所述的系统，其特征在于，所述光片产生模块还包括动态调焦装置。
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