CN116949174A - 一种lncRNA及其下游级联物质在芳香化酶抑制剂耐药ER阳性乳腺癌中的用途 - Google Patents

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Abstract

一种lncRNA及其下游级联物质在芳香化酶抑制剂(AI)耐药ER阳性乳腺癌中的用途。该长链非编码RNA是雌激素非依赖性乳腺癌细胞生长、增殖的关键调控因素，基于该长链非编码RNA展开的研究路线，本发明人发现其能作为ER阳性乳腺癌AI耐药、ER阳性乳腺癌AI治疗预后的诊断标志物，有望利用该长链非编码RNA实现相应的诊断，从而尽早为对应患者调整治疗策略，以提高相应治疗效果。敲低DIO3OS、PTBP1能有效抑制雌激素非依赖性AI耐药乳腺癌细胞的生长、增殖，起到一定的杀伤治疗作用。有望应用于临床中以提高AI耐药ER阳性乳腺癌治疗效果，延长患者生存期，减少或避免患者的复发，提高生存率。

Description

一种lncRNA及其下游级联物质在芳香化酶抑制剂耐药ER阳性 乳腺癌中的用途
技术领域
本发明涉及肿瘤分子生物学领域，更具体地，涉及一种lncRNA及其下游级联物质在芳香化酶抑制剂耐药ER阳性乳腺癌中的用途。
背景技术
乳腺癌中约有75％的类型表达雌激素受体(Estrogen receptor，ER)，称之为ER阳性乳腺癌，其发生、发展主要依赖雌激素的刺激。因此，剥夺雌激素信号成为ER阳性乳腺癌激素疗法的主要内容。第三代芳香化酶抑制剂(Aromatase inhibitor，AI)是当今临床上绝经后 ER阳性乳腺癌患者的标准一线用药，其疗效相对于他莫昔芬更具优势。该优势尤其体现于绝经后女性，其发生卵巢萎缩，由于外周组织中的芳香化酶催化肾上腺分泌的雄激素前体，是雌激素的最主要来源，在治疗初期，AI通过特异性引起芳香化酶失活以抑制内源性雌激素产生，从而影响乳腺癌细胞的失控增殖。然而在临床上AI治疗的有效率仅为25％～45％，多数患者在治疗后期出现明显的耐药现象，引起疾病进展、复发。因此，AI继发性耐药的发生极大地限制了其治疗的有效性。尽管目前已经有不少针对AI耐药的研究，但AI耐药的分子机制还尚不明确，仍然无法给出相应有效的治疗靶点、技术方案。现有技术亟需对乳腺癌AI 耐药的发生机制进行深入研究，以获取有望诊断AI耐药、逆转AI耐药、增强AI治疗疗效的产品或治疗方案等，提高ER阳性乳腺癌的治疗敏感性，改善患者预后。
发明内容
本发明旨在克服上述现有技术的至少一种不足，提供一种长链非编码RNA(lncRNA)及其下游级联物质在诊断、治疗AI耐药ER阳性乳腺癌中的用途，该长链非编码RNA能作为一种标志物，以诊断ER阳性乳腺癌对AI的耐药性及对应患者的预后，同时，该长链非编码 RNA促进下游的PTBP1与LDHA 3’UTR结合反应使相应ER阳性乳腺癌细胞进行不依赖雌激素的增殖，基于该内容，提供相应的长链非编码RNA及其下游结合反应的抑制剂能实现相应的杀伤、治疗效果，提高该类AI耐药乳腺癌的AI治疗疗效。
本发明的一个目的在于提供上述长链非编码RNA在制备诊断ER阳性乳腺癌AI耐药、预后评估ER阳性乳腺癌AI治疗、治疗AI耐药ER阳性乳腺癌的产品中的用途，所述长链非编码RNA为DIO3OS。在本发明的一个实施例中，长链非编码RNA DIO3OS在长期雌激素剥夺(LTED)ER阳性乳腺癌细胞、AI耐药ER阳性乳腺癌组织中特异性上调，且其与患者不良预后显著相关，通过该长链非编码RNA能够实现相应的诊断用途。更进一步地，通过敲低长链非编码RNA DIO3OS，还能起到抑制包括LTED细胞不依赖雌激素生长和增殖的作用，实现相应的治疗效果。同样的，对于实际的AI耐药ER阳性乳腺癌细胞，其同样不依赖于雌激素，该长链非编码RNA的敲除也有利于实现对应的治疗。
本发明的再一个目的在于提供一种ER阳性乳腺癌AI耐药诊断标志物，包括lncRNADIO3OS。
本发明的再一个目的在于提供一种长链非编码RNA的检测试剂在制备诊断ER阳性乳腺癌AI耐药的产品中的用途，所述长链非编码RNA为DIO3OS。
进一步地，所述诊断ER阳性乳腺癌AI耐药的产品包括实时荧光定量PCR检测试剂。
在本发明的一个实施例中，通过针对DIO3OS的检测试剂，包括荧光定量PCR检测试剂，能够对DIO3OS的表达量进行检测，结合前述的该长链非编码RNA标志物作用，该检测试剂能用于制备诊断ER阳性乳腺癌AI耐药的产品。
进一步地，所述诊断ER阳性乳腺癌AI耐药的产品含有基于长链非编码RNA DIO3OS核苷酸序列设计的用于检测所述长链非编码RNADIO3OS的特异性引物。在本发明的一个以上实施例中，通过采用长非编码RNA对应特异性引物的实时荧光定量PCR能够成功进行DIO3OS的检测。
进一步地，所述特异性引物包括如下所述引物：
DIO3OS_Forward：5’-AAGCCCAGCCCAATAGGAA-3’(序列如SEQIDNO.1所示)；DIO3OS_Reverse：5’-GGCCCAAGAAACAGCAACA-3’(序列如SEQIDNO.2所示)。
本发明的再一个目的在于提供DIO3OS抑制剂在制备抑制AI耐药ER阳性乳腺癌有氧糖酵解、治疗AI耐药ER阳性乳腺癌、增强ER阳性乳腺癌对AI治疗敏感性和/或降低LDHARNA稳定性的产品中的用途。在本发明的一个实施例中，通过沉默DIO3OS的表达，能够抑制相应的LTED细胞有氧糖酵解，抑制不依赖于雌激素的LTED乳腺癌细胞的生长和增殖，同样的，其有利于增强ER阳性乳腺癌对AI治疗的敏感性。
进一步地，DIO3OS抑制剂包括基于DIO3OS：Entrez GeneID:64150所含序列设计的抑制剂。进一步地，DIO3OS：Entrez GeneID:64150对应为Ensembl ID：ENST00000554735.1。
进一步地，DIO3OS抑制剂包括沉默DIO3OS表达的LNA、siRNA和/或shRNA。
进一步地，DIO3OS抑制剂包括基于DIO3OS：Entrez GeneID:64150所含序列设计的沉默DIO3OS表达的LNA、siRNA、shRNA；
进一步地，DIO3OS抑制剂包括沉默DIO3OS表达的LNA、siRNA、shRNA。在本发明的一个实施例中，通过LNA诱导RNase-H介导的降解，以有效沉默DIO3OS的表达。通过 shRNA也能有效沉默DIO3OS的表达。
进一步地，LNA包括：
LNA-1：5’-AGAAAGAGTGTGGATC-3’(序列如SEQIDNO.3所示)；和/或，LNA-2： 5’-GACAAACGGCCAGTGG-3’(序列如SEQIDNO.4所示)；和/或，LNA-3： 5’-GGTTAGTCACTGTAGA-3’(序列如SEQIDNO.5所示)；和/或，LNA-4： 5’-CCATTCACCAGCACTC-3’(序列如SEQIDNO.6所示)；和/或，LNA-5： 5’-CCGAGGTGTGGAGTGT-3’(序列如SEQIDNO.7所示)；
和/或，
shRNA包括：shRNA-1，序列为5’-CAGTGACTAACCCAAACCA-3’(序列如SEQIDNO.8 所示)；和/或，shRNA-2，序列为5’-CCTCGGGACTCCATAATAT-3’(序列如SEQIDNO.9 所示)；和/或，shRNA-3，序列为5’-GCACCTGATCCACACTCTT-3’(序列如SEQIDNO.10 所示)。
本发明的再一个目的在于提供一种表达载体，含有lncRNADIO3OS基因片段。
进一步地，为携带T7启动子且含有lncRNA DIO3OS的pcDNA3.1载体。
本发明的再一个目的在于提供一种慢病毒载体，含有靶向lncRNA DIO3OS的shRNA；进一步地，靶向lncRNADIO3OS的shRNA包括：shRNA-1，序列为5’ -CAGTGACTAACCCAAACCA-3’(序列如SEQIDNO.8所示)；和/或，shRNA-2，序列为 5’-CCTCGGGACTCCATAATAT-3’(序列如SEQIDNO.9所示)；和/或，shRNA-3，序列为 5’-GCACCTGATCCACACTCTT-3’(序列如SEQIDNO.10所示)。
本发明的再一个目的在于提供PTBP1抑制剂在制备抑制AI耐药ER阳性乳腺癌有氧糖酵解代谢、治疗AI耐药ER阳性乳腺癌、增强AI耐药ER阳性乳腺癌对AI治疗敏感性和/ 或降低LDHA RNA稳定性的药剂中的用途。在本发明的一个实施例中，本发明人发现长链非编码RNADIO3OS主要是促进PTBP1与LDHA 3’UTR结合而促进LDHAmRNA稳定性，从而促进糖酵解过程，以保障不依赖于雌激素的乳腺癌细胞的生长和增殖。本发明人通过抑制PTBP1基因的表达，能够有效地抑制雌激素非依赖性乳腺癌细胞的有氧糖酵解代谢过程，也能起到抑制相应乳腺癌细胞生长、增殖的作用，起到有效的治疗效果。同样的，对于AI 耐药ER阳性乳腺癌细胞这一雌激素非依赖性乳腺癌细胞，也能起到相应的治疗、增强AI 敏感性效果。
进一步地，PTBP1抑制剂包括基于PTBP1：Entrez GeneID：5725所含序列设计的抑制剂。
进一步地，PTBP1抑制剂包括沉默PTBP1表达的siRNA；进一步地，PTBP1抑制剂包括基于PTBP1：Entrez GeneID：5725所含序列设计的沉默PTBP1表达的siRNA。
进一步地，沉默PTBP1表达的siRNA包括：
si-PTBP1-1：5’-GCACAGUGUUGAAGAUCAUTT-3’(序列如SEQIDNO.11所示)；
和/或，si-PTBP1-2：5’-CCCAAAGCCUCUUUAUUCUTT-3’(序列如SEQIDNO.12所示)；和/或，si-PTBP1-3：5’-GCCUCAACGUCAAGUACAATT-3’(序列如SEQIDNO.13所示)；和/或，si-PTBP1-4：5’-CCCUCAUUGACCUGCACAATT-3’(序列如SEQIDNO.14所示)。
本发明的再一个目的在于提供一种药物组合物，含有DIO3OS抑制剂和/或PTBP1抑制剂；进一步地，及药学上可接受的载体。
本发明的再一个目的在于提供一种药物组合物，含有LDHARNA稳定性破坏剂。LDHARNA稳定性破坏剂包括DIO3OS抑制剂和/或PTBP1抑制剂。.
进一步地，药物组合物为ER阳性乳腺癌治疗药物；进一步地，所述ER阳性乳腺癌为AI耐药ER阳性乳腺癌。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：提供了一种雌激素非依赖性ER阳性乳腺癌细胞生长、增殖的关键调控因素，长链非编码RNA DIO3OS，并研究了其作用机制，发现了与其结合的PTBP1以及该蛋白对LDHAmRNA的关键作用。基于该主要研究路线，本发明人发现其能作为ER阳性乳腺癌AI耐药以及ER阳性乳腺癌AI治疗预后的预测标志物，有望利用该长链非编码RNA实现相应的诊断，从而尽早为对应患者调整治疗策略，以提高相应的治疗效果。同时，本申请发明人还通过敲低DIO3OS、PTBP1以进一步研究该长链非编码 RNA及PTBP1在促进雌激素非依赖性ER阳性乳腺癌细胞生长、增殖中的作用，发现通过敲低DIO3OS、PTBP1能有效抑制雌激素非依赖性乳腺癌细胞(如LTED细胞)的生长、增殖，起到一定的杀伤治疗作用。本申请还具体阐明了DIO3OS、PTBP1与LDHA之间的关系，基于本发明研究内容，有望进一步基于该关键长非编码RNA提供有效地增强ER阳性乳腺癌的AI治疗敏感性的治疗策略。有望应用于临床中以提高AI耐药ER阳性乳腺癌的治疗效果，延长患者生存期，减少或避免患者的复发，提高生存率。
附图说明
图1显示AI耐药ER阳性乳腺癌表现出增强的有氧糖酵解和lncRNA DIO3OS上调；其中，a，从AI治疗敏感、耐药患者中获得的ER阳性乳腺癌组织表达谱测序热图；b，AI耐药和AI敏感ER阳性乳腺癌之间差异基因表达谱的GSEA结果；c，与经历一周雌激素剥夺的亲代细胞相比，MCF-7/T47D LTED细胞的葡萄糖摄取量；d，与经历一周雌激素剥夺的亲代细胞相比，MCF-7/T47D LTED细胞的乳酸产量；e、f，与其经历一周雌激素剥夺的亲本对应物相比，MCF-7LTED(e)和T47D LTED(f)细胞的ECAR值和计算的糖酵解能力；g， MCF-7LTED细胞与经历了三天雌激素剥夺的亲本MCF-7细胞的LC-MS分析；h，来自对 AI治疗敏感、耐药患者ER阳性乳腺癌组织的lncRNA测序数据火山图；i，MCF-7/T47D LTED细胞中前十个候选lncRNA的qRT-PCR及与其亲本对应物的比较；j，AI治疗敏感、耐药的ER阳性乳腺癌患者肿瘤组织中lncRNADIO3OS的qRT-PCR；k，在石蜡包埋ER 阳性乳腺癌组织中的DIO3OS代表性ISH图像(n＝257)(左)以及DIO3OS水平与AI治疗反应之间的相关性分析(右)；从AI治疗敏感(n＝133)、耐药(n＝124)ER阳性乳腺癌患者中获得的肿瘤组织，比例尺：50 μm；l，队列中不同DIO3OS表达状态下AI耐药、 AI敏感ER阳性乳腺肿瘤组织的统计分析；m，具有高(n＝112)或低(n＝145)DIO3OS表达水平的AI治疗ER阳性乳腺癌患者的无复发生存期(左)、总生存期(右)的Kaplan-Meier 生存曲线组织；HR，风险比；n，不同临床特征(肿瘤大小、Ki67指数和转移状态)与DIO3OS 高表达、DIO3OS低表达AI治疗ER阳性乳腺肿瘤的关联热图。
图2显示DIO3OS调节LTED细胞的增殖和有氧糖酵解；a，显示在MCF-7/T47D LTED细胞中DIO3OS敲低功效的Northern印迹，其中通过LNAs(左)敲低DIO3OS；显示在亲本MCF-7/T47D细胞中DIO3OS过表达功效(右)的Northern印迹，其中ACTB用作上样对照RNA；b，c，转染对照或DIO3OS LNAs的MCF-7/T47D LTED细胞(b)和转染对照或DIO3OS过表达质粒的亲本MCF-7/T47D细胞(c)的生长曲线；d，e，转染了对照组或DIO3OS LNAs的含eduMCF-7LTED细胞(d)以及转染了DIO3OS过表达质粒或对照质粒的亲本MCF-7 细胞(e)的代表性免疫荧光图像和定量，标尺:50μm；f，g，转染DIO3OS LNAs或对照LNA 的MCF-7/T47D LTED细胞(f)和转染对照或DIO3OS过表达质粒的亲本MCF-7/T47D细胞(g) 的平板克隆形成代表性图像和定量；h，i，转染对照组或DIO3OS LNAs的MCF-7/T47D LTED 细胞的ECAR值；j，k，转染对照组或DIO3OS过表达质粒的亲本MCF-7/T47D细胞的ECAR 值；l，m，转染对照或DIO3OS LNAs的MCF-7/T47D LTED细胞(l)和转染对照或DIO3OS 过表达质粒的亲本MCF-7/T47D细胞(m)的乳酸产量。
图3显示DIO3OS与细胞核中的PTBP1相互作用；a，使用全长DIO3OS转录物(正义)和反义RNA进行生物素-RNA pull-down测定，然后进行银染色；红框表示差分频段； b，DIO3OS结合蛋白PTBP1的高得分质谱谱图；c，生物素-RNA pull-down测定，随后是蛋白质印迹，证明了DIO3OS和PTBP1的相互作用；d，用抗PTBP1抗体进行的RNA免疫沉淀测定，表明DIO3OS和PTBP1在MCF-7/T47D LTED细胞中的相互作用；e，在 MCF-7/T47D LTED细胞中DIO3OS和PTBP1亚细胞共定位的荧光评估结果；其中，通过RNA FISH(绿色)和免疫荧光(红色)染色分别检测DIO3OS和PTBP1；比例尺：10μm；f，g，对照或PTBP1 siRNA转染的MCF-7LTED细胞的细胞数计数(f)和MTT测定(g)；h，i，用对照或PTBP1 siRNA转染的MCF-7LTED细胞(h)和T47DLTED细胞(i)的ECAR 值；j，用对照或PTBP1 siRNA瞬时转染的MCF-7/T47D LTED细胞的葡萄糖摄取；k，用对照或PTBP1 siRNA瞬时转染的MCF-7/T47D LTED细胞的乳酸产生。
图4显示DIO3OS通过PTBP1调节LTED细胞增殖和糖酵解；a，对照LNA/DIO3OS 靶向LNA与对照载体/PTBP1过表达质粒共转染MCF-7/T47D LTED细胞的乳酸产生；b， c，MCF-7LTED(b)和T47D LTED(c)细胞的ECAR值；d，用对照构建体转染或用DIO3OS 表达质粒与PTBP1 siRNA/对照siRNA共转染的亲本MCF-7/T47D细胞的乳酸产生；e，f，亲本MCF-7(e)和T47D(f)细胞的ECAR值；g，h，MCF-7/T47D LTED细胞的计数(g)和亲本 MCF-7/T47D细胞的计数(h)；i，Edu结合MCF-7LTED细胞代表性免疫荧光图像(左)和定量分析(右)；比例尺:50μm；j，MCF-7LTED细胞的平板克隆形成代表性图像(左)和定量(右)。
图5显示DIO3OS与PTBP1相互作用以上调LDHA mRNA稳定性；a，用对照 LNA/siRNA与DIO3OS LNA或PTBP1 siRNA转染的MCF-7LTED细胞中的差异剪接事件维恩图；b，DIO3OS或PTBP1敲低的MCF-7LTED细胞中差异剪接mRNA的KEGG通路分析；c，MCF-7LTED细胞中的乳酸产生LC-MS分析；d，MCF-7LTED细胞中LDHA mRNA5'/3'UTR的PCR、琼脂糖凝胶；e，MCF-7LTED细胞中LDHA mRNA的qRT-PCR；f，MCF-7LTED细胞中的LDHA表达免疫印迹；g，通过在指定时间点使用10μg/mL放线菌素D以确定MCF-7LTED细胞中LDHA mRNA在指定处理下的半衰期；h，用抗 PTBP1抗体进行的RNA免疫沉淀测定，揭示PTBP1和携带3'UTR的LDHA变体在亲本 (左)和LTED(右)MCF-7细胞中的相互作用；i，两种不同LDHA变体表达质粒的全长示意图，荧光素酶报告质粒融合了不同的LDHA-5'utr和3'UTR区域；指示了LDHA-5'UTR 和3'UTR的核苷酸位置；j，生物素-RNA pull-down，然后是蛋白质印迹，证明了PTBP1和不同LDHA变体(有或没有完整的3'UTR)的相互作用；k，用抗PTBP1抗体进行的RNA 免疫沉淀测定揭示了，在用不同LDHA UTR融合的萤光素酶报告质粒转染的MCF-7LTED细胞中的PTBP1和LDHA 5'/3'UTR的相互作用；l，在MCF-7LTED中进行荧光素酶报告基因检测。
图6显示功能性LDHA-203在LTED细胞和抗AI的乳腺癌细胞中上调；a，亲本 MCF-7/T47D细胞及其LTED衍生物中LDHA mRNA5'/3'UTR的PCR和琼脂糖凝胶；b，通过在指定时间点使用10μg/mL放线菌素D测定亲本MCF-7/T47D细胞及其LTED衍生物中 LDHA mRNA的半衰期；c，亲本MCF-7/T47D细胞及其LTED衍生物中LDHA蛋白表达的免疫印迹；d，AI敏感或AI耐药ER阳性乳腺癌组织中LDHA mRNA5'/3'UTR的qRT-PCR； n＝18次重复；e，AI敏感或AI耐药ER阳性乳腺癌组织中LDHA mRNA5'/3'UTR的PCR和琼脂糖凝胶；n＝8次重复；f，g，用不同LDHA变体表达质粒或对照载体瞬时转染的亲本 MCF-7/T47D细胞的细胞数计数(f)和乳酸产生(g)；h，i，亲本MCF-7/T47D细胞的ECAR 值；j，DIO3OS/PTBP1/LDHA糖酵解级联反应的图示，通过稳定LDHA mRNA作为调节ER 阳性乳腺癌适应LTED中葡萄糖代谢的开关。
图7显示DIO3OS在体内促进ER阳性乳腺肿瘤进展；a，携带过表达DIO3OS的质粒或对照质粒稳定转染的MCF-7细胞的裸鼠中，肿瘤异种移植物的生长曲线；用低剂量或高剂量的雌激素片剂预处理小鼠；b，c，原位注射含对照或过表达DIO3OS的质粒MCF-7细胞的小鼠中的肿瘤生长(b)或肿瘤重量(c)；d，肿瘤异种移植物中葡萄糖积累的代表性PET-CT 扫描图像，来自在低剂量或高剂量雌激素处理下用过表达DIO3OS的质粒或对照质粒稳定转染的亲本MCF-7细胞；其中，小鼠的PET-CT扫描在肿瘤植入后8周完成；彩色圆圈表示具有指定治疗的肿瘤异种移植物；e，f，原位注射含有DIO3OS过表达质粒或不含雌激素的对照载体的MCF-7细胞的小鼠中的肿瘤生长(e)或肿瘤体积(f)；g，肿瘤异种移植物中葡萄糖积累的代表性PET-CT扫描图像，来自用过表达DIO3OS的质粒或未经雌激素处理的对照质粒稳定转染的亲本MCF-7细胞；彩色圆圈表示具有DIO3OS过表达的肿瘤异种移植物；h，i，在低剂量或高剂量雌激素作用下，稳定转染过表达DIO3OS质粒或对照质粒的亲本MCF-7细胞的肿瘤移植瘤中，DIO3OS代表性ISH染色和LDHA/Ki67表达IHC染色(h)、定量分析(i)；标尺：50μm；j，原位注射转导lenti-shDIO3OS或lenti-control的MCF-7LTED 细胞的小鼠中肿瘤异种移植物的生长曲线；用低剂量的雌激素片剂预处理小鼠；k，l，原位注射转导lenti-shDIO3OS或lenti-control的MCF-7LTED细胞的小鼠中的肿瘤生长(k)和肿瘤重量(l)；m，肿瘤异种移植物中葡萄糖积累的代表性PET-CT扫描图像，来自转导 lenti-shDIO3OS或lenti-control的MCF-7LTED细胞；彩色圆圈表示具有指定处理的异种移植物；n，o，转导lenti-shDIO3OS或lenti-对照的MCF-7LTED细胞中DIO3OS代表性ISH染色和异种移植物中LDHA/Ki67表达IHC染色(n)、定量分析(O)；比例尺，50μm；每个点代表一只老鼠(c，f，i，l，o)。
图8显示AI耐药ER阳性乳腺癌表现出增强的有氧糖酵解和lncRNA DIO3OS上调；a，MCF-7/T47D LTED细胞、亲代MCF-7/T47D细胞的生长曲线；b，MCF-7/T47D LTED细胞的细胞数计数；c，细胞与其亲代细胞的比较；d，DIO3OS的3'-RACE(左)和5'-RACE (右)；e，qRT-PCR检测亲本和LTED MCF-7细胞的核和细胞质中DIO3OS的表达； MALAT-1作为核基因表达的阳性对照，而GAPDH RNA作为细胞质基因表达的阳性对照； f，DIO3OS在MCF-7/T47D LTED细胞中的核定位代表性FISH图像；比例尺，10μm；g，将全长DIO3OS克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，在三种表达模式下具有N端密码子 ATG；GFP作为阳性对照。
图9显示DIO3OS调节LTED细胞的增殖和有氧糖酵解；a，显示指定LNAs在 MCF-7/T47D LTED细胞中的DIO3OS敲除效率的qRT-PCR；b，亲本MCF-7/T47D细胞中 DIO3OS过表达的qRT-PCR；c，用指定LNA转染的MCF-7/T47D LTED细胞的MTT测定；d、e，EdU结合T47D LTED细胞(d)、亲代T47D细胞(e)的代表性免疫荧光图像和定量，并进行了指定的处理；比例尺，50μm；f，MCF-7/T47D LTED细胞(经指定的LNA 转染)的ki67染色代表性免疫荧光图像和定量；比例尺:50μm；g，h，MCF-7/T47D LTED细胞的葡萄糖摄取(g)和乳酸产生(h)；i，j，亲本MCF-7细胞的细胞数计数(i)和MTT 测定(j)；k，亲本MCF-7细胞平板克隆形成的代表性图像和定量；l，掺入EdU的亲本MCF-7 细胞的代表性免疫荧光图像(左)和量化(右)；比例尺，50μm。
图10显示DIO3OS与细胞核中的PTBP1相互作用；A，显示在MCF-7/T47D LTED细胞中PTBP1敲低效率的qRT-PCR；b，显示PTBP1在MCF-7/T47D LTED细胞中的敲低效率的免疫印迹；c，用对照或PTBP1 siRNA转染后EdU结合MCF-7LTED细胞的代表性免疫荧光图像(左)和测定的定量(右)；比例尺，50μm。
图11显示DIO3OS通过PTBP1调节LTED细胞增殖和糖酵解；A，显示PTBP1过表达效率的Western印迹检测；b，T47D LTED细胞平板克隆形成的代表性图像(左)和定量(右)； c，d，Edu结合的亲本MCF-7(c)/T47D(d)细胞的代表性免疫荧光图像和定量；比例尺:50μ m；e，亲本MCF-7/T47D细胞平板克隆形成的代表性图像和定量。
图12显示DIO3OS和PTBP1几乎不影响其他与糖酵解相关候选基因的表达。a,通过LC-MS分析MCF-7LTED细胞糖酵解中间产物的产生；b，图7d中通过凝胶提取纯化的 PCR产物及其Sanger测序；c，MCF-7LTED细胞中，其他糖酵解相关候选基因的 qRT-PCR；d，MCF-7LTED细胞中PTBP1表达的免疫印迹。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本发明，但不构成对本发明的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容(如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到)。
实施例1
材料与方法
1、实验试剂
包含：EdU增殖试剂盒(广州锐博生物公司)、ER抗体(8644)(美国CST公司)、 G-418(Geneticin)(美国Thermo公司)、LDHA抗体(3582)(美国CST公司)、LNA Oligo (丹麦Clontech公司)、pcDNATM3.1(+)质粒(美国Thermo公司)、PTBP1抗体(57246) (美国CST公司)、阿那曲唑(美国Sigma公司)、雌激素片(美国IRA公司)、地高辛标记的lncRNA DIO3OS探针(美国LGC公司)、来曲唑(美国Sigma公司)、磷酸化(Ser118) ER抗体(2511)(美国CST公司)、磷酸化(Ser167)ER抗体(64508)(美国CST公司)、驴抗兔IgG-Alexa Fluor 555(英国Abcam公司)、驴抗小鼠IgG-Alexa Fluor 488(英国Abcam 公司)、慢病毒(苏州吉玛公司)。
2、细胞培养和处理
亲代MCF-7和T47D人类乳腺癌细胞系购自美国模式培养物集存库(ATCC)，并根据标准方案进行培养。为了建立AI耐药细胞系，将MCF-7和T47D细胞置于含有10％葡聚糖炭剥离(DCC)胎牛血清(Hyclone)的去类固醇、去酚红RPMI 1640培养基(GibcoTM)中生长至少10个月，以获得AI抵抗力，获得的细胞称为LTED细胞。对于功能实验，细胞在DCC 培养基中培养3～7天。为了评估AI药物敏感性，每两天用新鲜培养基补充10-8～10-4mol/L 来曲唑(Sigma)、阿那曲唑(Sigma)以培养LTED细胞，并在第8天使用自动细胞计数器 (CountstarIC1000)计数。
3、患者组织标本
肿瘤样本(n＝257)来自于中山大学孙逸仙纪念医院2011～2018年期间接受手术切除后 AI治疗并签署知情同意书、被诊断为ER阳性乳腺癌的女性患者。本实施例相关实验均在中山大学孙逸仙纪念医院内部审查与伦理委员会的批准指导下进行。具体地，本实施例中乳腺癌获得性内分泌耐药包括：乳腺癌术后接受内分泌治疗2年以上后复发转移、辅助内分泌治疗结束后1年内复发转移或接受一线内分泌治疗6个月以上后转移性乳腺癌存在疾病进展。
4、Seahorse分析
按照制造商的说明，通过Seahorse XF24细胞外通量分析仪(SeahorseBioscience)分析体外细胞代谢改变。
5、葡萄糖摄取、乳酸生产和乙酰辅酶A水平检测
根据葡萄糖摄取检测试剂盒Glucose Uptake Assay Kit(ab136955，Abcam)的说明书进行操作，以检测葡萄糖摄取；根据乳酸生成检测试剂盒Lactate ColorimetricAssay Kit II (K627-100，Biovision)的说明进行操作，以检测乳酸生成；根据试剂盒PicoProbeTM Acetyl CoA Assay Kit(#K317-100,BioVision)说明进行乙酰辅酶A水平检测。
6、5’和3’cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)
按照制造商的指导使用SMARTer RACE 5'/3'试剂盒(#634860，Clontech)进行DIO3OS RNA的5'/3'RACE实验。主要包括过程：从MCF-7LTED细胞中提取了DIO3OS的RNA模板，并根据UCSC Genome Browser(http://genome.ucsc.edu/)的序列信息设计并合成所有基因特异性引物。
本研究中lncRNA DIO3OS 3’RACE和5’RACE所需引物包括：3’GSP_F1:5’-CGTCAAGCCCAGCCCAATAGGAAGCACCTG-3’(序列如SEQIDNO.15所示)；3’GSP_F2: 5’-ACAGAATACACTCCACACCTCGGGACTCCA-3’(序列如SEQIDNO.16所示)；3’GSP_F3: 5’-TGGAGGAGAGTGCTGGTGAATGGCAGGTGT-3’(序列如SEQIDNO.17所示)；3’GSP_F4: 5’-AGGTGTGTGCCTCAGTGTCCTTGCTGCCA-3’(序列如SEQIDNO.18所示)；5’GSP_R1: 5’-GGTCCCTGCCTGGTGCTGGTTTGGGTTAGT-3’(序列如SEQIDNO.19所示)；5’GSP_R2: 5’-ACACCTGCCATTCACCAGCACTCTCCTCCA-3’(序列如SEQIDNO.20所示)；5’GSP_R3: 5’-TGTAAGAGGGCAGGCAGAAAGGGAGGTGGG-3’(序列如SEQIDNO.21所示)； 5’GSP_R4:5’-CCCTCCTGACCACTGGGATGGGACAAGACA-3’(序列如SEQIDNO.22所示)；Full Length_F:5’-CTCTCGCCGCTTGCCTCG-3’(序列如SEQIDNO.23所示)；Full Length_R:5’-CCTGGTGCTGGTTTGGGTTAGTC-3’(序列如SEQIDNO.24所示)。
7、Northern印迹。
将与RNA上样缓冲液预混合的总RNA上样到2％甲醛-MOPS琼脂糖凝胶上，电泳分离，然后转移到尼龙膜(GE Healthcare)上，放置超过6小时。随后，52℃下，印迹膜与DIGEasy Hyb缓冲液(#11796895001,Roche)预杂交30分钟；与地高辛(DIG)标记的DIO3OS LNA寡核苷酸(5DiGN/CCCAGAACAGATGACAGCCCT/3DiG_N；ACTB， 5DiGN/CTCATTGTAGAAGGTGTGGTGCCA/3DiG_N；Qiagen)进一步孵育过夜。通过DIG 发光检测试剂盒(#11363514910,Roche)检测探针-靶标杂交体。
8、RNA衰变测定。
将经处理的细胞接种到6孔板中，在培养基中用10μg/mL放线菌素D(APExBio)抑制mRNA转录以估计mRNA衰减率；等体积的DMSO用于阴性对照。每个样品中剩余的特定 mRNA相对量与mRNA降解相关，所有在指特定时间点提取RNA用于进一步的qRT-PCR 分析，以便进一步获取检测结果。将结果标准化为每个样品中内参基因GAPDH的表达水平。
9、体外翻译测定。
为了产生推定的DIO3OS-GFP融合蛋白，通过逆转录PCR扩增DIO3OS的全长序列，然后将其克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1(其羧基末端融合了一个GFP)；通过sanger 测序验证后，将融合质粒用于细胞转染。
10、肿瘤细胞的转染和转导。
将DIO3OS和DIO3OS-GFP融合蛋白、PTBP1、LDHA变体、PCDNA3.1质粒中的荧光素酶-LDHA 5'/3'UTR嵌合RNA以及pGL3荧光素酶报告质粒用于细胞系中的异位表达。
按照制造商的建议，通过Lipofectamine 3000(L3000008，Invitrogen)使指定的LNA、siRNA或质粒转染细胞。为了筛选稳定的DIO3OS过表达细胞，每两天更换一次补充有1mg/ml G418的新鲜培养基，持续至少两周。对于肿瘤细胞的转导，将细胞接种到六孔板中至约40％融合并在估计感染复数(MOI)为5时，结合8μg/mL聚凝胺(Sigma)，用慢病毒颗粒转导。为了选择稳定的DIO3OS敲低细胞，转染后72小时使用5μg/mL嘌呤霉素 (Gibco)处理。
11、荧光素酶报告基因测定
将携带雌激素受体元件(ERE)序列的pGL3荧光素酶报告质粒或与荧光素酶 -LDHA-5'/3'UTR嵌合RNA 融合的pcDNA3.1质粒与pRL-TK Renilla对照构建物 (Promega)共转染到MCF-7中细胞。萤光素酶活性由双萤光素酶报告分析系统(#E1910, Promega)测定，并标准化为Renilla萤光素酶活性。
12、RNA干扰
本研究中干扰lncRNA DIO3OS的锁核苷酸修饰序列(LNATM GapmeR)购自Exiqon公司，干扰PTBP1的siRNA购自吉玛公司。干扰序列信息如下所示。具体步骤：转染前24小时，按后续实验需要的细胞量将细胞种植于孔板中，细胞融合度30-60％左右；按照说明书用去核酸酶的水溶解LNA或siRNA，选择合适的混合比例与Lipofectamine 3000(Invitrogen) 混合形成复合物，静置5min后加入不含血清Opti-MEM培养基中，充分混匀，室温下静置10min。更换细胞培养基，将上述混合液加进细胞中，小心摇匀，置于37℃恒温、含5％CO2的细胞培养箱中培养。6～8小时后将培养基弃去，换成用10％FBS配制的完全培养基，再继续培养24～96小时；转染后24～48小时可收细胞提取RNA，检测基因干扰情况；转染后48～72小时可收细胞提取蛋白，对蛋白的干扰效率进行检测。LNA与siRNA干扰序列(5’-3’)： CtrlLNA：5’-AACACGTCTATACGC-3’(序列如SEQIDNO.25所示)；LNA-1： 5’-AGAAAGAGTGTGGATC-3’(序列如SEQIDNO.3所示)；LNA-2： 5’-GACAAACGGCCAGTGG-3’(序列如SEQIDNO.4所示)；si-NC：5’-GGGUUGUAGAGUGCAUAAATT-3’(序列如SEQIDNO.26所示)；si-PTBP1-1： 5’-GCACAGUGUUGAAGAUCAUTT-3’(序列如SEQIDNO.11所示)；si-PTBP1-2： 5’-CCCAAAGCCUCUUUAUUCUTT-3’(序列如SEQIDNO.12所示)。此外，还涉及到对于 DIO3OS的shRNA，包括对照Sh-Ctrl：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’(序列如 SEQIDNO.27所示)。沉默DIO3OS的Sh-DIO3OS，包括：shRNA-1： 5’-CAGTGACTAACCCAAACCA-3’(序列如SEQIDNO.8所示)；shRNA-2： 5’-CCTCGGGACTCCATAATAT-3’(序列如SEQIDNO.9所示)。具体地，本实施例中针对 DIO3OS的LNA、shRNA序列是基于DIO3OS：EntrezGeneID：64150基因设计的，针对PTBP1的siRNA序列是基于PTBP1：Entrez GeneID：5725基因设计的；除了前述的干扰序列外，本发明人还进一步采用针对DIO3OS的LNA-3：5’-GGTTAGTCACTGTAGA-3’(序列如 SEQIDNO.5所示)；LNA-4：5’-CCATTCACCAGCACTC-3’(序列如SEQIDNO.6所示)； LNA-5:5’-CCGAGGTGTGGAGTGT-3’(序列如SEQIDNO.7所示)；shRNA-3，序列为 5’-GCACCTGATCCACACTCTT-3’(序列如SEQIDNO.10所示)确认了通过LNA或shRNA 沉默表达的有效性，且沉默后的平行试验与前述序列沉默后试验结果表现类似；同样的，也采用针对PTBP1的si-PTBP1-3：5’-GCCUCAACGUCAAGUACAATT-3’(序列如SEQIDNO.13 所示)；si-PTBP1-4：5’-CCCUCAUUGACCUGCACAATT-3’(序列如SEQIDNO.14所示)确认了通过siRNA沉默表达的有效性，且沉默后的平行试验与前述序列沉默后试验结果表现类似。
13、逆转录合成cDNA
RNA反转录采用逆转录试剂盒PrimeScriptTM RT Master Mix(RR036A，TAKARA)进行。实验所需枪头盒PCR管均为无酶。逆转录所得的cDNA样品可置于-20℃保存。
14、实时荧光定量PCR技术(Real-Time Quantitative PCR，RT-qPCR)
荧光定量PCR采用SYBR Premix Ex TaqTM(RR420L，TAKARA)。将逆转录合成的cDNA样品用超纯水稀释后备用。本研究中qPCR实验所用基因引物使用Primer Premier 6软件进行设计，订购自上海捷瑞生物公司。内参基因：ACTB、GAPDH或HSP90，计算方法选用2-ΔΔCt计算。RT-qPCR基因引物序列如下：
ACTB_Forward:5’-GATGCGTTGTTACAGGAAGTCC-3’(序列如SEQIDNO.28所示)；ACTB_Reverse：5’-GGCACGAAGGCTCATCATTCA-3’(序列如SEQIDNO.29所示)； DIO3OS_Forward:5’-AGGCCCAGCCCAATAGGAA-3’(序列如SEQIDNO.1所示)；DIO3OS_Reverse:5’-GGCCCAAGAAACAGCAACA-3’(序列如SEQIDNO.2所示)； GAPDH_Forward:5’-ATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3’(序列如SEQIDNO.30所示)； GAPDH_Reverse:5’-CCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’(序列如SEQIDNO.31所示)； HSP90_Forward:5’-CCAGTTTGGTGTCGGTTTCTAT-3’(序列如SEQIDNO.32所示)； HSP90_Reverse:5’-CTGGGTATCGTTGTTGTGTTTTG-3’(序列如SEQIDNO.33所示)； LDHA_Forward:5’-TTGACCTACGTGGCTTGGAAG-3’(序列如SEQIDNO.34所示)； LDHA_Reverse:5’-GGTAACGGAATCGGGCTGAAT-3’(序列如SEQIDNO.35所示)； LDHA-203 3'UTR_Forward:5’-AGGTGGAGGTTGTGCATGTTG-3’(序列如SEQIDNO.36所示)；LDHA-203 3'UTR_Reverse:5’-GCAGTACGTACAGCATTGGCA-3’(序列如 SEQIDNO.37所示)；LDHA-220 5'UTR_Forward:
5’-AGTGGCAAATACCCCCAAAGGA-3’(序列如SEQIDNO.38所示)；LDHA-220 5'UTR_Reverse:5’-ATTCTGGGGGGTCTGTTCTTCC-3’(序列如SEQIDNO.39所示)； Luciferase_Forward:5’-GATTGACAAGGATGGATGGC-3’(序列如SEQIDNO.40所示)； Luciferase_Reverse:5’-CGTCATCGTCGGGAAGACCT-3’(序列如SEQIDNO.41所示)； MALAT-1_Forward:5’-GTCATAACCAGCCTGGCAGT-3’(序列如SEQIDNO.42所示)； MALAT-1_Reverse:5’-CGAAACATTGGCACACAGCA-3’(序列如SEQIDNO.43所示)； PTBP1_Forward:5’-AGCGCGTGAAGATCCTGTTC-3’(序列如SEQIDNO.44所示)； PTBP1_Reverse:5’-CAGGGGTGAGTTGCCGTAG-3’(序列如SEQIDNO.45所示)。
15、核质分离提RNA、银染及蛋白质质谱分析、RNA免疫共沉淀(RNAimmunoprecipitation,RIP)、免疫组化、快速扩增cDNA 末端(RACE)、EdU掺入试验
核质分离提RNA：本研究采用PARISTM Kit(AM1921，Thermo Fisher Scientific)提取细胞浆和细胞核内的RNA。银染及蛋白质质谱分析：采用银染试剂盒Pierce SilverStain for Mass Spectrometry(24600，Thermo)进行银染实验。将PAGE胶被银染上色的特异性条带割胶回收，通过Q-TOF质谱仪对条带中的蛋白质信息进行分析。RNA免疫共沉淀：本实验采用Magna RIPTM试剂盒(17-700，Millipore)，所用的枪头、EP管、溶液和容器等均经过无酶处理。免疫组化：本过程采用的抗体包括：LDHA抗体(兔抗人，#3582，CST)，Ki67 抗体(小鼠抗人，ZM-0166，中杉金桥)。快速扩增cDNA末端(RACE)：DIO3OS RNA的 5'/3'RACE是按照SMARTer RACE 5'/3'试剂盒(#634860，Clontech)指导进行。EdU掺入试验：使用Cell-Light EdU Apollo567体外成像试剂盒(#C10310-1；广州瑞博生物有限公司)进行。
16、过表达载体构建
①根据RACE实验获得的DIO3OS全长序列，从Pubmed和UCSC基因数据库中检索针对PTBP1的CDS序列、LDHA不同转录本的全长序列及其5’UTR、3’UTR序列，以及荧光素酶报告基因的序列。②利用DNAMAN软件一一分析上述序列的限制性酶切位点。在克隆载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点中排除目的基因(片段)含有的酶切位点，选择两个限制性内切酶酶切位点。③直接在上述基因(片段)序列起始和末端设计引物，然后在引物的5’端加上相应的酶切位点。④用细胞cDNA作为模板进行PCR扩增得到目的基因片段，产物经过电泳，割胶回收目的片段。⑤用上述两个限制性内切酶酶切处理片段并纯化回收。⑥以相同的酶切位点处理pcDNA3.1(+)载体使其线性化，胶回收载体后与已纯化的片段进行连接。⑦产物用于感受态细胞转化，随后涂菌、挑出单克隆、摇菌、提质粒，通过PCR鉴定阳性克隆并测序。
17、RNA沉降(pull down)
按照制造商的指导，使用MEGAscriptTM T7转录试剂盒(#AM1333，Thermo FisherScientific)体外转录Biotin-16-UTP标记的DIO3OS RNA。
18、RNA免疫沉淀。
使用Magna RIPTM RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒(#17-700，Millipore)按照制造商的方案进行RNA免疫沉淀测定。
19、慢病毒感染
感染前一天在6cm3培养皿中种植适当密度的肿瘤细胞。感染前弃培养基，加入新鲜的含有8μg/mL凝聚胺polybrene(sigma)的培养基和包装了靶向DIO3OS的shRNA慢病毒颗粒(感染复数MOI：100)。培养6～8小时后将培养基进行更换，24小时后可再次转染以提高病毒感染的效率。72小时后更换新鲜培养基(含5μg/mL嘌呤霉素)，每2天换液，至少培养14天，直到筛选出DIO3OS稳定敲降的细胞株。最后按上述方法提取RNA或蛋白验证敲低效率以及用于相关实验检测。
20、多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)
PCR采用Premix TaqTM Version 2.0(R004A，TAKARA)。将逆转录合成的cDNA样品用超纯水适当稀释后备用。研究中PCR实验所用基因引物均通过Primer Premier 6软件设计，订购自上海捷瑞生物工程有限公司。内参基因：ACTB。
PCR所需基因引物序列如下：LDHA-220 5’UTR_Forward:5’-Cctgtcattaggcctttcaact-3’ (序列如SEQIDNO.46所示)；LDHA-220 5’UTR_Reverse: 5’-TGCCATATTGGACTTGGAACC-3’(序列如SEQIDNO.47所示)；LDHA-203 3'UTR_Forward:5’-GGCTACAACAGGATTCTAGGTG-3’(序列如SEQIDNO.48所示)； LDHA-203 3'UTR_Reverse:5’-CACACGGTAAACATCCACCT-3’(序列如SEQIDNO.49所示)；ACTB_Forward:5’-GATGCGTTGTTACAGGAAGTCC-3’(序列如SEQIDNO.28所示)；ACTB_Reverse:5’-GGCACGAAGGCTCATCATTCA-3’(序列如SEQIDNO.29所示)。
21、细胞RNA荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)与组织RNA原位杂交(In situ hybridization,ISH)、
本实验所用的枪头、EP管、溶液和容器等均经过无酶处理。DIO3OS探针购自Qiagen公司；DIO3OS探针序列：5DiGN/CCCAGAACAGATGACAGCCCT/3DiG_N；ACTB探针序列：5DiGN/CTCATTGTAGAAGGTGTGGTGCCA/3DiG_N。
为了对di3os和PTBP1进行共定位分析，将经过固定、渗透和预杂交的细胞用dig标记的LNA di3os探针(杂交溶液的终浓度为25nm；Qiagen)于52℃下孵育过夜，随后用抗DIG-fluorescein(绿色，#11207741910，Roche)和抗PTBP1(#57246，CST)抗体在4℃下过夜。Alexa Fluor 555偶联二抗(红色，#A-21428，Thermo Fisher Scientific)用于信号可视化。用Hochest33342(#H21492，Thermo Fisher Scientific)对细胞核进行复染，在共聚焦激光扫描显微镜(LSM780/800，Zeiss)上以63倍放大率获得高分辨率荧光图像。
对于RNA ISH，按照标准方案对石蜡包埋的组织样品切片进行脱蜡和再水化。用5％胰蛋白酶消化30分钟后，将肿瘤切片在室温下用4％多聚甲醛(PFA)固定，并在52℃下用杂交溶液预杂交2小时。之后，在52℃的加湿室内，使用25nM DIG标记的靶向DIO3OS 探针进行杂交。细胞核用核固红溶液复染后，ISH信号呈蓝紫色染色。DIO3OS的染色指数 (SI)染色指数(SI)计算为至少10个随机视野(目标值×20)计数阳性染色细胞的比例和强度评分的乘积。具体而言，DIO3OS阳性染色的肿瘤细胞比例分为五个级别(0，无阳性细胞；1， <25％DIO3OS阳性细胞；2，25％-50％DIO3OS阳性细胞；3，50％-75％DIO3OS阳性细胞； 4，>75％DIO3OS阳性细胞)。染色强度按四分制评分(0，无DIO3OS染色；1，弱DIO3OS 染色；2，中等DIO3OS染色；3，强DIO3OS染色)。根据SI，从0到12记录DIO3OS 的表达，最佳截止值<3(低)与≥3(高)。
22、免疫荧光和免疫组织化学染色。
将石蜡包埋的肿瘤样品切片脱蜡，然后进行抗原修复。对于免疫荧光染色，细胞在室温下用4％PFA固定15分钟，然后在冰上用0.1％Triton X-100于PBS中渗透5分钟。细胞粘附的载玻片或组织切片在室温下用PBS中的5％BSA封闭15分钟，然后在4℃下与一抗孵育过夜。在与Alexa Fluor或HRP偶联的二抗再孵育1小时后(在室温下)，样品由 Hoechst 33342复染。在共聚焦激光扫描显微镜(LSM780/800，Zeiss)上获得高分辨率荧光图像。
对于免疫组织化学染色，按照制造商的说明用DAB进行免疫检测。在Olympus BX51显微镜(Olympus，Tokyo，Japan)下观察免疫染色。使用ImageJ软件评估量化Ki67阳性细胞，每个切片至少5×200放大图像。如前所述，根据它们在10个随机视野(目标×20) 中的比例和强度计算LDHA阳性细胞的染色评分。
23、动物实验
购自Vital River Laboratories(北京)的6周龄雌性无胸腺BALB/c裸鼠，在中山大学实验动物资源中心的无特定病原体(SPF)动物设施标准条件下饲养。所有动物实验均按照中山大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)指南进行。在皮下雌激素片剂植入前，小鼠最初被切除卵巢并让其适应7天的时间。又一周后，将含有1x107个细胞(在Matrigel(BDBiosciences)中DIO3OS表达改变或不改变的细胞)的0.1mL无菌细胞悬液原位注射到裸鼠的第四对乳腺脂肪垫中。根据公式宽2×长/2，每周根据公式宽度2×长度/2监测肿瘤体积(mm3)。异种移植物生长至直径约10mm，八周后处死小鼠。
24、正电子发射断层扫描/计算机断层扫描成像。
使用Inveon micro PET/CT扫描仪(Siemens)检测携带乳腺肿瘤异种移植物的裸鼠的葡萄糖积累。在micro-PET扫描之前，所有小鼠都禁食至少8小时，然后进行麻醉，然后通过尾静脉注射负载于盐水(100μL)中的5μCig-1[18F]氟脱氧葡萄糖(18F-FDG)。四十分钟后，进行静态15分钟PET扫描以进行静态采集。收集的图像进一步校正衰减、散射、归一化和相机死区时间，然后在制造商的说明下使用Inveon Research Workplace软件与微CT 图像进行共同配准。根据标准化摄取值(SUV)确定在三维感兴趣区域(ROI)中测量的 18F-FDG肿瘤摄取量。
25、统计数据
本研究中的所有统计分析均由Microsoft Excel 2016、GraphPad Prism 8.0、SPSS版本 20.0、R(v.4.0.3)和RStudio(v.1.3.1093)进行。确切的n数字、具有相似结果的独立实验数量、统计检验和p值在图和图例中进行了说明。通常图中的误差线表示s.d。或s.e.m.，所有实验至少独立进行3次。使用双尾Student t检验或Mann-Whitney检验(用于ISH染色的量化)分析两组之间的统计差异，同时使用双尾单向方差分析和Dunnett或Sidak的多重比较检验进行两组以上的比较。从病历中回顾性收集所有临床和病理数据并进行分析。肿瘤组织样本的免疫荧光或免疫组织化学染色由研究人员在不了解临床数据和实验设计的情况下进行量化。通过X-tile软件(版本3.6.1，耶鲁大学)，根据AI处理的乳腺癌组织DIO3OS 染色评分，确定临床样本分组的截止值。将生存数据绘制为Kaplan-Meier曲线并用对数秩检验进行分析。卡方(χ2)检验用于比较组间频率差异。P值<0.05被认为具有统计学意义。
一、AI耐药ER阳性乳腺癌表现出增强的有氧糖酵解活性
为了探索AI耐药ER阳性乳腺癌的分子特征，进行了高通量RNA测序，以检测来源于AI辅助治疗患者的ER阳性乳腺癌组织的转录谱(如图1a所示)。基因集富集分析(GSEA) 显示，与AI敏感组相比，糖酵解途径在AI耐药组织中呈正富集(图1b)，表明AI治疗后发生糖代谢重编程。
长期雌激素剥夺(LTED)已被广泛用于模拟ER阳性乳腺癌细胞的临床AI耐药。为了研究AI耐药ER阳性乳腺癌细胞中是否发生代谢变化，本发明人在AI不敏感的两种细胞模型MCF-7LTED和T47D LTED中检测了葡萄糖的摄取和细胞外乳酸的产生(糖酵解的关键代谢物)，其中MCF-7LTED和T47DLTED细胞对雌激素剥夺、AI药物(如，来曲唑、阿那曲唑)处理不敏感，如图8a，8b所示。
与在雌激素剥夺培养基中短时间(7天)培养的亲本对照细胞相比，在雌激素剥夺培养基中培养较长时间(至少十个月)的LTED细胞中葡萄糖摄取和乳酸产生均显著上调(图1c， d)。此外，通过细胞外酸化率(ECAR)测量的糖酵解通量表明，与剥夺雌激素7天的亲本MCF-7和T47D细胞相比，LTED细胞中的总糖酵解通量和糖酵解能力增强(图1e，f)。
为了进一步鉴定MCF-7亲本和LTED细胞之间的代谢谱差异，使用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)进行检测并筛选了糖酵解代谢物。如图1g所示，与亲代MCF-7细胞相比，磷酸烯醇式丙酮酸和乳酸在LTED细胞中显着上调。总体上，数据表明ER阳性乳腺癌细胞经过长期雌激素剥夺LTED后有氧糖酵解增强。
二、LncRNA DIO3OS在AI耐药ER阳性乳腺癌中表达上调，临床上与AI治疗耐药相关。
为了确定驱动所述AI耐药诱导糖酵解变化这一过程的潜在调节因子，本发明人首先分析了mRNA表达谱，发现上调或下调的蛋白质编码基因都没有聚集到与葡萄糖代谢相关的途径中。然后，本发明人关注于差异表达的lncRNA(图1h)，其中大部分具有未知的生物学功能。在AI敏感与AI耐药肿瘤组织之间，共鉴定出60个差异表达的lncRNA基因，在 AI耐药组中有33个lncRNA上调超过两倍，27个lncRNA下调。为了缩小筛选潜在调节因子的范围，通过qRT-PCR以检查MCF-7LTED和T47D LTED细胞中前十个上调的 lncRNA 的表达水平。
发现DIO3OS(记录于Ensembl数据库中，基因ID为ENST00000554735.1)是两个LTED细胞中唯一一致上调的lncRNA，与其亲本细胞相比，该lncRNA表达水平上调了约三倍 (图1i)。此外，在细胞模型里具有统计学意义的四种差异表达lncRNA中，与没有临床复发的组织相比，AI耐药乳腺癌组织中只有DIO3OS显著增加(图1j)。此外，Northern印迹证实了：与亲本细胞相比，LTED细胞中DIO3OS呈现更高表达(图8c)。
为了进一步评估DIO3OS的临床和病理学意义，从接受术后AI治疗的ER阳性乳腺癌患者中收集了257个石蜡包埋的肿瘤组织样本。原位杂交(ISH)测定显示，在产生AI耐药性的患者的肿瘤组织中，DIO3OS的表达显着高于没有临床复发的患者(图1k和1l)。更重要的是，高DIO3OS水平与这些患者较差的无复发生存期(HR＝2.62,95％CI:1.85-3.71, P<0.0001)和总生存期(HR＝2.445,95％CI:1.42-4.21,P＝0.0008)相关(图1m)。此外，DIO3OS表达与肿瘤大小、Ki67指数呈正相关，但与淋巴结或远处转移无关(图1n)。总的来说，这些数据表明DIO3OS在AI耐药的乳腺癌组织中高表达，并且在临床上与乳腺癌 AI治疗耐药相关。
三、DIO3OS调节LTED细胞的增殖和有氧糖酵解
LncRNADIO3OS位于人类的第14号染色体上，并且从DIO3基因位点开始以相反方向转录。本发明人通过5'-、3'-cDNA末端快速扩增(RACE)和Sanger测序，将DIO3OS鉴定为具有3128个核苷酸的无内含子转录物(图8d)。为了阐明该DIO3OS转录本是否具有蛋白编码潜能，对绿色荧光蛋白(GFP)融合的假定蛋白进行表位标记分析，并证实 DIO3OS-GFP融合不编码任何蛋白产物(图8g)。为了检测DIO3OS的亚细胞定位，本发明人提取了亲本、LTEDMCF-7细胞中的核和细胞质RNA部分；随后的qRT-PCR证明DIO3OS 主要位于细胞核中，而细胞质中也有少量表达(图8e)。通过DIO3OS的荧光原位杂交(FISH) 进一步验证了这一发现(图8f)，意味着DIO3OS可能在细胞核中发挥其生物学功能。
为了研究DIO3OS在AI耐药中的功能作用，我们进行了功能丧失/功能增强分析。由于DIO3OS的核定位，使用锁核苷酸(LNA)来沉默其表达。在五个LNA中，选择了两个最有效的LNA进行进一步的敲除实验(敲除效果如图2a左图和图9a所示)。
正如细胞计数和MTT分析结果所示，沉默DIO3OS显著抑制了MCF-7LTED和 T47DLTED细胞的生长(图2b和图9c)。更具体地说，LTED细胞的DIO3OS敲低，降低了增殖细胞的比例，正如EdU增殖实验(图2d和图9d)以及Ki67染色(图9f)结果所示。
同时，在平板克隆试验中，当DIO3OS沉默后，LTED细胞的克隆形成能力降低(图2f，g)。值得注意的是，通过细胞计数、MTT、克隆形成和EdU增殖实验(图9i-l)发现，DIO3OS 敲除几乎不影响亲代MCF-7细胞的生长和增殖。DIO3OS在亲代T47D细胞中的表达极低，同样的，下调DIO3OS不会影响T47D细胞的生物学行为。
鉴于AI耐药乳腺癌中有氧糖酵解增强，本发明人接下来评估了沉默DIO3OS对这些细胞糖酵解代谢的影响。事实上，与对照细胞相比，敲除DIO3OS可显著降低MCF-7LTED和T47D LTED细胞的ECAR水平和糖酵解能力(图2h，i)。此外，葡萄糖摄取试验和乳酸生成试验一致表明，LTED细胞中的DIO3OS沉默显著损害了其葡萄糖摄取能力(图9g)和乳酸生成水平(图2l)。
在功能获得性分析中，本发明人将表达DIO3OS的pcDNA3.1质粒转染到亲本MCF-7和T47D细胞中，然后通过G418药物筛选，以建立稳定的DIO3OS过表达细胞(图2a，右，图9b)。在雌激素缺乏条件下，过表达DIO3OS的MCF-7和T47D细胞比转染空载体的细胞生长更快(图2c)。EdU增殖试验进一步证明，DIO3OS过表达促进亲代MCF-7和T47D 细胞的非雌激素依赖性增殖(图2e和图9e)。此外，过表达DIO3OS的MCF-7和T47D细胞在雌激素缺乏的情况下具有增强的克隆形成能力(图2g)
此外，在亲代MCF-7和T47D细胞中过表达DIO3OS可促进其葡萄糖代谢，表现为更高的ECAR水平(图2j，k)、葡萄糖摄取(图9h)和乳酸生成(图2m)。总体上，数据表明，DIO3OS促进ER阳性乳腺癌细胞不依赖雌激素的增殖和有氧糖酵解。
四、DIO3OS与细胞核中的PTBP1相互作用
为了剖析DIO3OS在癌症代谢中的分子机制，结合RNA pulldown和体外转录生物素标记的DIO3OS RNA来筛选DIO3OS相互作用蛋白。获得分子量在55～70kDa之间的特定条带(非反义对照RNA)，进行质谱(MS)分析(图3A)。在所有RNA沉淀蛋白中，多嘧啶区结合蛋白1(PTBP1，一种选择性剪接调节因子)的含量最高，蛋白序列覆盖范围最高(图3b)。Westernblotting进一步证实PTBP1特异性结合DIO3OS(图3c)。此外，使用抗PTBP1 抗体进行RNA免疫沉淀(RNA-IP)检测，结果显示，与在LTED细胞中使用IgG的对照IP反应相比，抗PTBP1免疫沉淀中的DIO3OS富集约为其15倍(图3d)。
根据DIO3OS的核定位，通过FISH共聚焦显微镜和免疫荧光染色进一步证明了DIO3OS和PTBP1在MCF-7LTED和T47D LTED细胞的细胞核中存在较好的共定位 (图3e)。这些数据表明DIO3OS与LTED乳腺癌细胞核中的PTBP1特异性结合。
PTBP1在某些情况下调节许多基因的可变剪接，从而产生具有不同功能的多样的RNA 转录物。据报道，PTBP1参与了癌症进展的各种过程，包括细胞增殖和代谢重编程。为了研究PTBP1在LTED细胞中的作用，用两种siRNA敲低了PTBP1(图10A和10B)，发现LTED细胞生长被显著抑制(图3f，g)。且EdU增殖实验进一步证实PTBP1敲低抑制了LTED细胞增殖(图10C)。
然后，本发明人还检测了沉默PTBP1是否影响LTED细胞中的有氧糖酵解。与DIO3OS在LTED细胞中的功能一致，敲除PTBP1降低了MCF-7LTED和T47D LTED细胞中的 ECAR水平和糖酵解能力(图3H和3I)；在PTBP1敲低的LETD细胞中，葡萄糖摄取和乳酸生成也受损(图3J和3K)。
即DIO3OS与PTBP1特异性相互作用，PTBP1是一种促进LTED乳腺癌细胞生长和有氧糖酵解的剪接调节剂。
五、DIO3OS通过PTBP1调节LTED细胞增殖和糖酵解
为了验证DIO3OS是通过PTBP1而发挥其功能的，本发明人进行了一系列挽救(rescue) 实验。首先，用对照LNA或DIO3OS LNA以及空载体或PTBP1表达质粒转染MCF-7/T47D LTED细胞，然后测量其乳酸产量、ECAR水平。与对照LNA/空载体转染的MCF-7/T47DLETD细胞相比，DIO3OS LNA和PTBP1表达质粒的共转染挽救了DIO3OS下调，且没有 PTBP1过表达细胞中的乳酸产出受损现象(图4A)。从糖酵解seahorse测定中也获得了类似的结果(图4B和4C)。
另一方面，与对照siRNAs相比，PTBP1 siRNA抑制了过表达DIO3OS亲代MCF-7细胞中增加的乳酸生成和ECAR水平(图4d左侧和4e)。同样的结果也在T47D细胞中检测到(图4d，右，和4f)。
在细胞生长实验中，与对照组相比，DIO3OS LNA转染导致MCF-7LTED和T47D LTED细胞中的细胞数量减少，而同时PTBP1过表达几乎使细胞生长恢复到对照水平(图4G)。使用siRNA沉默PTBP1可以消除亲本MCF-7和T47D细胞中稳定DIO3OS过表达所增强的细胞生长(图4H)。从EdU增殖试验中获得了类似的细胞增殖结果(图4I和11C、 11D)。
此外，PTBP1上调挽救了DIO3OS敲除LTED细胞的集落形成能力(图4j和图11b)，反之亦然(图11e)。总之，DIO3OS通过PTBP1调节LTED乳腺癌细胞的有氧糖酵解和增殖。
六、DIO3OS与PTBP1相互作用上调LDHA mRNA稳定性
为了探索DIO3OS如何通过与PTBP1相互作用发挥作用，采用两组高通量测序来比较DIO3OS敲低、PTBP1敲低MCF-7LTED细胞与对照细胞的转录谱。考虑到PTBP1是一种剪接调节剂，本发明人主要关注于DIO3OS敲低和PTBP1敲低细胞中一致发生的可变剪接事件。通过对差异可变剪接事件取交集，确定了在DIO3OS和PTBP1敲低细胞中出现，而在对照细胞中未出现的：共657个基因中发生的1458个可变剪接事件(图5A)。进一步的KEGG分析表明，许多可变剪接事件发生在代谢基因中，包括糖酵解/糖异生途径中的 PFKP、ENO和LDHA(图5B)。该结果表明DIO3OS和PTBP1可能调节某些关键糖酵解相关基因的可变剪接。
为了缩小候选基因的范围，进行了LC-MS以筛选受DIO3OS和PTBP1影响的糖酵解代谢物。发现D-葡萄糖6-磷酸(G6P)和乳酸在DIO3OS和PTBP1敲低后均显著降低 (图5C和12A)。己糖激酶2(HK2)和乳酸脱氢酶A(LDHA)是分别催化G6P和乳酸产生的两种关键代谢酶。回溯DIO3OS和PTBP1敲低细胞中的可变剪接基因，除了 LDHA，ALDH3A1、ALDOC、PFKP和ENO3也影响乳酸的产生。因此，使用RT-PCR来检查这些基因在DIO3OS和PTBP1敲低后的剪接事件，发现选择性剪接事件仅发生在 LDHA 的mRNA 中(图5d)，而不发生在其他糖酵解酶中(数据未显示)。
LDHA是催化丙酮酸转化为乳酸的关键酶，丙酮酸转化为乳酸是糖酵解的关键过程。根据ISOexpresso数据库信息，乳腺癌细胞中最常见的LDHA 转录物是LDHA-203，其具有一个357-nt 5'UTR(UTR，非翻译区)和567-nt 3'UTR。由该转录本编码的LDHA亚型也被选为典型序列，如UniProtKB数据库所示。
除了LDHA-203外，在DIO3OS/PTBP1敲低细胞中还存在一种特殊的LDHA转录物(LDHA-220)，其5'UTR较短，更重要的是，缺少3'UTR(图5D和12B)。为了验证LDHA mRNA的5'UTR或3'UTR中的剪接事件，使用特定的引物进行RT-PCR，并在琼脂糖凝胶中观察产物。如图5d所示，在DIO3OS或PTBP1基因下调的LTED细胞中，LDHA-203的3'UTR 显著降低，而LDHA-220的5'UTR上调，表明在DIO3OS或PTBP1基因下调后，具有3'UTR 缺失特征的LDHA-220转录本有所增加。
为了进一步证明可变剪接对RNA和蛋白质表达的影响，进行了qRT-PCR，结果表明只有LDHA在DIO3OS和PTBP1敲低的LTED细胞中表现出降低的mRNA水平，而 PFKP、ALDOC、ENO3或HK2没有(图5E和12c)。进一步地，还通过蛋白质印迹证实，DIO3OS或PTBP1敲低后，LDHA 的蛋白质水平持续降低(图5F)。据此，本发明人在下述过程中将对LDHA进行进一步研究。
5'UTR和3'UTR含有重要的mRNA加工调控元件。据报道，5'UTR可调节转录起始，而3'UTR更可能参与mRNA 转运和稳定。为了测试DIO3OS和PTBP1是否起到稳定 LDHA mRNA的作用，使用放线菌素D来抑制mRNA转录。在DIO3OS或PTBP1敲低的MCF-7LTED细胞中，检测到LDHA mRNA的稳定性显著降低(图5G)。
为了进一步剖析PTBP1和LDHA mRNA之间的相互作用，以及DIO3OS在其中的作用，本发明首先检测DIO3OS是否调节PTBP1的表达，发现在DIO3OS敲低后PTBP1 蛋白水平没有改变(图12d)。然后进行了RNA-IP分析，以检测PTBP1是否与LDHA mRNA相互作用，以及DIO3OS是否影响相互作用。在用对照载体转染的亲代MCF-7细胞中，与IgG免疫沉淀物相比，具有3'UTR的LDHA mRNA在抗PTBP1免疫沉淀物中富集了约5倍，而在DIO3OS过表达的MCF-7细胞中，通过抗PTBP1抗体回收的含 3'UTRLDHA mRNA显著增加至约15倍(图5H，左)。同样的，这些RNA-蛋白(RNP)复合物在MCF-7LTED细胞中也被检测到；与DIO3OS敲除细胞相比，抗PTBP1免疫沉淀在 sh-Ctrl细胞中获得了更多带有3'UTR的LDHA mRNA(图5h，右)。这些数据表明，DIO3OS 促进PTBP1和携带3'UTR的LDHA mRNA之间的相互作用。
为了测试PTBP1是否直接与LDHA mRNA的3'UTR结合，构建了两个LDHA转录本LDHA-220、LDHA-203的质粒(图5I)；正如RNA pulldown分析和蛋白质印迹中所揭示的那样，在总蛋白裂解物检测结果中，含有3'UTR的全长LDHA-203相比于LDHA-220 和反义物对照具有明显更强的PTBP1条带(图5J)。
据报道，PTBP1通过四个短的单链嘧啶基序与RNA结合：UCUU、UCUUC、UUCUCU、CUCUCU。因此，本发明在LDHA-203的3'UTR中搜索了这些基序，在3'UTR序列中鉴定出6个UCUU序列。然后，通过用AGAA替换TCTT来生成LDHA-203 3'UTR突变体。
RNA pulldown后的Western印迹显示，与完整的LDHA-203不同，具有3'UTR突变的LDHA-203未能富集PTBP1，这与3'UTR缺失的LDHA-203类似(图5j)，3'UTR中的UCUU 序列说明了LDHA-203与PTBP1的结合。为了重现PTBP1与LDHA 3'UTR或5'UTR在体内的相互作用，用表达荧光素酶的嵌合报告基因构建物转染LTED细胞，该基因表达物融合了 LDHA-203 3'UTR或LDHA-220 5'UTR(阴性对照)。RNP复合物通过抗PTBP1抗体免疫沉淀，qRT-PCR显示含3'UTR的荧光素酶嵌合转录物比5'UTR-荧光素酶报告基因更富集，证实PTBP1优先结合LTED细胞LDHA mRNA 3'UTR，而不是5'UTR(图5K)。
为了进一步验证DIO3OS通过PTBP1与LDHA 3'UTR结合来调节LDHA表达，转染了含有荧光素酶基因与LDHA-220 5'UTR、LDHA-203 5'UTR或LDHA-203 3'UTR(图5I) 的报告质粒进入DIO3OS未敲低、DIO3OS敲低或PTBP1过表达的MCF-7 LTED细胞中。荧光素酶报告基因分析表明，LNA对DIO3OS的部分沉默仅导致表达luc-3'UTR(LDHA-203) 的细胞的荧光素酶活性降低，而在PTBP1过表达质粒的存在下，luc-3'UTR(LDHA-203)构建体中的荧光素酶活性显著恢复(图5L)。然而，类似的现象并没有发生在含有5'UTR的构造中(图5l)。
总的来说，该部分研究结果表明，DIO3OS促进PTBP1与LDHA 3'UTR的结合，保护LDHA mRNA免受选择性剪接并促进LDHA稳定和乳酸产生。
七、功能性LDHA-203在LTED细胞和AI耐药乳腺癌细胞中上调
接下来，本发明人检查了LDHAmRNA的这些可变剪接事件是否发生在亲本MCF-7和T47D细胞及其LTED衍生物中。使用针对LDHA-203 3'UTR和LDHA-220 5'UTR的特异性引物进行的RT-PCR，结果显示，含有特殊5'UTR的LDHA-220主要存在于亲代MCF-7和 T47D细胞中，而含有3'UTR的LDHA-203在LTED细胞中显著增加(图6a)，表明LTED 处理后亲代细胞中的LDHA-220被LDHA-203取代。为了确定这种选择性剪接是否影响亲代和LTED细胞中LDHAmRNA的稳定性，本发明人通过放线菌素D处理抑制了mRNA转录。随后的qRT–PCR显示，LTED细胞中LDHA mRNA的半衰期超过10小时，而亲代MCF-7 或T47D细胞中LDHA mRNA的稳定性显著缩短(图6b)。同时，与亲代细胞相比，LTED 细胞表现出更高的LDHA蛋白水平(图6c)。
此外，本发明人使用qRT–PCR检测了AI敏感和AI耐药患者乳腺肿瘤组织中LDHAmRNA的选择性剪接事件。与细胞系的结果一致，AI耐药乳腺癌样本的LDHA-203(具有3’UTR)表达普遍高于AI敏感组，而后者的LDHA-220(具有独特的5’UTR)表达更上调(图6d，e)。
为了进一步证明这两种LDHA转录物在ER阳性乳腺癌细胞中的功能，在亲代MCF-7和T47D细胞中过度表达了它们。与对照组相比，LDHA-203(而非LDHA-220)的过度表达显著促进了亲代MCF-7和T47D细胞的生长(图6f)。通过乳酸生成和ECAR测量以确定两种转录物对乳酸生成和糖酵解的影响(图6g-i)，结果显示，表达LDHA-203的细胞显示出乳酸生成增强(图6g)以及较高的ECAR水平(图6h,i)，相反，LDHA-220转染没有增强亲代MCF-7和T47D细胞的糖酵解(图6g-i)。即：LDHA-203在AI耐药乳腺癌细胞中上调，可以增加糖酵解过程中的乳酸生成。
总的来说，lncRNA DIO3OS直接与细胞核中的PTBP1蛋白相互作用，并通过阻止其3'UTR中的选择性剪接来稳定LDHA的mRNA，从而上调LDHA的表达并激活LTED、AI 耐药乳腺癌细胞中的糖酵解代谢(图6j)。
八、DIO3OS促进ER阳性乳腺癌在动物体内的进展
为了进一步探索DIO3OS是否在体内调节ER阳性乳腺癌的发展，在卵巢切除的裸鼠体内原位注射了DIO3OS过表达或未过表达的亲代MCF-7细胞。这些小鼠先前使用不同剂量的雌激素片剂治疗，由此分为剂量不同的三组。与对照组相比，低剂量(0.18mg)雌激素治疗组中，过度表达DIO3OS的MCF-7异种移植物的肿瘤生长得到显著促进(图7a-c)。且在高剂量(0.72mg)雌激素条件下，DIO3OS过表达也加速了肿瘤的生长(图7a-c)。
此外，与对照组(2/10)相比，在通过卵巢切除术完全剥夺雌激素且没有雌激素片治疗的情况下，DIO3OS的过度表达显著增强了裸鼠(6/10)的致瘤性(图7e，f)。
通过正电子发射断层扫描和计算机断层扫描(PET–CT)扫描(图7d，g)评估发现，无论是否服用雌激素，在DIO3OS过表达小鼠的肿瘤异种移植物中观察到增强的18F-氟脱氧葡萄糖(18FDG)积累(图7d，g)。
进一步地，与对照组相比，DIO3OS表达上调的异种移植瘤表现出更明显的Ki67染色状态，证实了DIO3OS在体内的促肿瘤作用(图7h,i)。同时，免疫组化检测到，在DIO3OS 过表达的异种移植瘤中观察到更高的LDHA表达(图7h,i)，该结果与过表达DIO3OS后糖酵解水平提高的结果一致。这些结果表明，DIO3OS在体内促进ER阳性乳腺肿瘤的雌激素非依赖性生长。
相反，DIO3OS的敲除抑制了MCF-7 LTED异种移植瘤的生长(图7j-l)，减少了18FDG的积累(图7m)，并降低了低剂量雌激素治疗组去卵巢裸鼠异种移植瘤中LDHA和Ki67的表达(图7n,o)。表明体内DIO3OS正向调控雌激素非依赖性乳腺癌细胞增殖和糖代谢。
总体上，本实施例中，发现lncRNA DIO3OS在经过长期雌激素剥夺的ER阳性乳腺癌细胞中表达上升，并且通过与细胞核内的剪接调控因子PTBP1相互作用以保护LDHA mRNA的3’UTR不发生选择性剪接，从而保证其完整性，帮助LDHA的RNA维持稳定，表达更多的LDHA蛋白以催化乳酸的生成，导致肿瘤细胞的有氧糖酵解活性上调，最终促进ER阳性乳腺癌细胞不依赖雌激素的生长和增殖。通过干预DIO3OS/PTBP1的表达，可以有效调控 ER阳性乳腺癌LTED细胞的有氧糖酵解和生长增殖情况，有望逆转乳腺癌细胞对AI药物的耐受。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学孙逸仙纪念医院
<120> 一种lncRNA及其下游级联物质在芳香化酶抑制剂耐药ER阳性乳腺癌中的用途
<130>
<160> 49
<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
<213> 未知
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<213> 未知
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<212> DNA
<213> 未知
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<213> 未知
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<213> 未知
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<213> 未知
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<213> 未知
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<400> 49
cacacggtaa acatccacct 20

Claims (16)

1.一种lncRNA在制备诊断ER阳性乳腺癌AI耐药、预后评估ER阳性乳腺癌AI治疗、治疗AI耐药ER阳性乳腺癌的产品中的用途，所述lncRNA为DIO3OS。
2.一种ER阳性乳腺癌AI耐药诊断标志物，其特征在于，包括lncRNA DIO3OS。
3.一种lncRNA的检测试剂在制备诊断ER阳性乳腺癌AI耐药的产品中的用途，所述lncRNA为DIO3OS。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述诊断ER阳性乳腺癌AI耐药的产品包括实时荧光定量PCR检测试剂。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述诊断ER阳性乳腺癌AI耐药诊断的产品含有基于lncRNA DIO3OS核苷酸序列设计的用于检测所述lncRNA DIO3OS的特异性引物；优选地，所述特异性引物包括如下所述引物：DIO3OS_Forward：5’-AAGCCCAGCCCAATAGGAA-3’；DIO3OS_Reverse：5’-GGCCCAAGAAACAGCAACA-3’。
6.DIO3OS抑制剂在制备抑制AI耐药ER阳性乳腺癌有氧糖酵解、治疗AI耐药ER阳性乳腺癌、增强AI耐药ER阳性乳腺癌对AI治疗敏感性和/或降低LDHA RNA稳定性的产品中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，DIO3OS抑制剂包括基于DIO3OS：EntrezGeneID:64150所含序列设计的抑制剂。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，DIO3OS抑制剂包括沉默DIO3OS表达的LNA、siRNA和/或shRNA；
优选地，DIO3OS抑制剂包括基于DIO3OS：Entrez GeneID:64150所含序列设计的沉默DIO3OS表达的LNA、siRNA、shRNA；
优选地，LNA包括：LNA-1：5’-AGAAAGAGTGTGGATC-3’；和/或，LNA-2：5’-GACAAACGGCCAGTGG-3’；和/或，LNA-3：5’-GGTTAGTCACTGTAGA-3’；和/或，LNA-4：5’-CCATTCACCAGCACTC-3’；和/或，LNA-5：5’-CCGAGGTGTGGAGTGT-3’；
和/或，shRNA包括：shRNA-1，序列为5’-CAGTGACTAACCCAAACCA-3’；和/或，shRNA-2，序列为5’-CCTCGGGACTCCATAATAT-3’；和/或，shRNA-3，序列为5’-GCACCTGATCCACACTCTT-3’。
9.一种表达载体，其特征在于，含有lncRNA DIO3OS基因片段；优选地，为携带T7启动子且含有权利要求1所述lncRNA DIO3OS的pcDNA3.1载体。
10.一种慢病毒载体，其特征在于，含有靶向lncRNA DIO3OS的shRNA；优选地，shRNA包括：shRNA-1，序列为5’-CAGTGACTAACCCAAACCA-3’；和/或，shRNA-2，序列为5’-CCTCGGGACTCCATAATAT-3’；和/或，shRNA-3，序列为5’-GCACCTGATCCACACTCTT-3’。
11.PTBP1抑制剂在制备抑制AI耐药ER阳性乳腺癌有氧糖酵解代谢、治疗AI耐药ER阳性乳腺癌、增强AI耐药ER阳性乳腺癌对AI治疗敏感性和/或降低LDHA RNA稳定性的药剂中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，PTBP1抑制剂包括基于PTBP1：EntrezGeneID：5725所含序列设计的抑制剂。
13.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，PTBP1抑制剂包括沉默PTBP1表达的siRNA；优选地，PTBP1抑制剂包括基于PTBP1：Entrez GeneID：5725所含序列设计的沉默PTBP1表达的siRNA。
14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述siRNA包括：
si-PTBP1-1：5’-GCACAGUGUUGAAGAUCAUTT-3’；
和/或，si-PTBP1-2：5’-CCCAAAGCCUCUUUAUUCUTT-3’；
和/或，si-PTBP1-3：5’-GCCUCAACGUCAAGUACAATT-3’；
和/或，si-PTBP1-4：5’-CCCUCAUUGACCUGCACAATT-3’。
15.一种药物组合物，其特征在于，含有DIO3OS抑制剂和/或PTBP1抑制剂。
16.一种药物组合物，其特征在于，含有LDHA RNA稳定性破坏剂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118267400A (zh) * 2024-05-31 2024-07-02 山东德升生物工程有限公司 一种运载紫杉醇的自然杀伤细胞外囊泡的制备方法与应用

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