CN116948976A - 一种提高中华仓鼠卵巢细胞中Fc融合蛋白SEC纯度的细胞培养工艺及其应用 - Google Patents
一种提高中华仓鼠卵巢细胞中Fc融合蛋白SEC纯度的细胞培养工艺及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种提高中华仓鼠卵巢细胞中Fc融合蛋白SEC纯度的细胞培养工艺及其应用，属于生物技术领域。本发明采用流加培养的细胞培养方法进行表达Fc融合蛋白细胞的培养，培养至第5天降温至更低的培养温度。本发明提供的方法实现了在维持一定水平的蛋白表达量的前提下，提高SEC纯度的目的，使得抗体的SEC纯度更加接近标准品，保证了抗体的药效，且无需要额外增加生产相关成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高中华仓鼠卵巢细胞中Fc融合蛋白SEC纯度的细胞培养工艺及其应用。
背景技术
在生物医药行业，治疗性抗体及其它重组治疗性蛋白质(包括融合蛋白)大多是由哺乳动物细胞(主要是仓鼠卵巢细胞，即CHO细胞)表达的重组糖蛋白。Fc融合蛋白通过DNA重组技术将免疫球蛋白(IgG、IgA等)的基因与目标蛋白基因(细胞因子、毒素、受体、酶、抗原肽等)重组后，得到的表达产物。Fc融合蛋白不仅可发挥所融合的目标蛋白的生物学活性，还具有一些抗体的性质，如可引起抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)、补体依赖的细胞毒作用(ComplementDependent Cytotoxicity，CDC)与抗体依赖细胞介导的吞噬作用(Antibody-DependentCellular Phagocytosis，ADCP)等。且与重组前的目标蛋白相比，Fc融合蛋白半衰期可被显著延长。
Fc融合蛋白作为生物大分子的重组抗体，同时具备聚体、降解、糖基化修饰、氧化、脱酰基化、异构体、二硫键错配等多种变异形式。纯度作为抗体最重要的质量属性对抗体的分子效应功能具有决定作用。由于Fc片段的引入，使得下游纯化工艺可以基于ProteinA、G等特异性强的亲和层析技术对目标蛋白进行纯化，但采用ProteinA、G类型的高特异性亲和层析技术所收获的Fc融合蛋白易于形成聚集体。目前，下游纯化工艺主要通过牺牲抗体收率的方式获得高纯度抗体，显著增加了抗体的生产成本。而上游工艺提高抗体纯度的方法一般是通过缩短细胞培养周期，而缩短细胞培养周期会显著降低抗体产量，且其他的糖基化水平也会改变。因此，急需寻找一种降低抗体生产成本，有效提高抗体纯度且对抗体产量无显著影响的方法。
发明内容
本发明旨在提供一种调控蛋白纯度(SEC)的方法，所述方法通过调整细胞流加培养过程中的温度和调整温度的时间以降低聚集体的比例，使得SEC单体的比例达到96％，SEC具体的比例降低至3.5％。
本发明提供了一种调控融合蛋白纯度的方法，采用分批流加培养，其中，第一阶段控制培养温度为36～37℃，第二阶段控制培养温度为29～31℃。
在一种实施方式中，所述第一阶段为0～4天，第二阶段为第5天至培养终止；或所述第一阶段为0～6天，第二阶段为第6天至培养终止。
在一种实施方式中，所述分批流加培养具体为细胞接种密度为0.7～1.1×106cells/mL，转速为275～285rpm，空气底通为0～100mL/min，DO为20～60％，每隔一天进行补料。
在一种实施方式中，所述补料为补加初始培养体积4～6％的CFM-A1培养基和初始培养体积0.4～0.6％的CFM-B1培养基。
在一种实施方式中，初始培养体积为1.4～1.6kg。
在一种实施方式中，当葡萄糖浓度低于4.00g/L时，使用300g/kg葡萄糖母液，补加葡萄糖至终浓度6.00g/L。
在一种实施方式中，第5天补加初始培养体积1～3％的GUM。
在一种实施方式中，以CBM-1为基础培养基。
在一种实施方式中，pH设置为7.00±0.20。
在一种实施方式中，所述GUM包括115g/kg半乳糖，31.4g/kg尿嘧啶核苷和0.0504g/kg四水氯化锰。
本发明提供了一种提高融合蛋白SEC纯度的方法，采用分批流加培养，其中，第0～4天控制培养温度为36～37℃，第5天至培养终止控制培养温度为29℃。
在一种实施方式中，所述分批流加培养具体为细胞接种密度为0.7～1.1×106cells/mL，转速为275～285rpm，空气底通为0～100mL/min，DO为20～60％，每隔一天进行补料。
在一种实施方式中，所述补料为补加初始培养体积4～6％的CFM-A1培养基和初始培养体积0.4～0.6％的CFM-B1培养基。
在一种实施方式中，初始培养体积为1.4～1.6kg。
在一种实施方式中，当葡萄糖浓度低于4.00g/L时，使用300g/kg葡萄糖母液，补加葡萄糖至终浓度6.00g/L。
在一种实施方式中，第5天补加初始培养体积1～3％的GUM。
在一种实施方式中，以CBM-1为基础培养基。
在一种实施方式中，pH设置为7.00±0.20。
在一种实施方式中，所述GUM包括115g/kg半乳糖，31.4g/kg尿嘧啶核苷和0.0504g/kg四水氯化锰。
在一种实施方式中，所述细胞包括哺乳动物细胞。
在一种实施方式中，所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞、杂交瘤细胞或HEK293细胞。
在一种实施方式中，所述融合蛋白包括抗体融合蛋白。
在一种实施方式中，所述抗体融合蛋白包括Fab融合蛋白、Fc融合蛋白与单链抗体融合蛋白。
本发明还提供了上述方法在调控融合蛋白SEC纯度中的应用。
有益效果：
本发明使用CHO-K1的细胞培养方法，在流加培养至第5天降温至更低的培养温度(29℃)直至培养结束。本发明提供的方法实现了在维持一定水平的蛋白表达量的前提下，提高SEC纯度的目的，使得抗体的SEC纯度更加接近标准品，SEC-聚体比例逐渐由6.7％(30℃)降到3.5％(29℃)(图4)，SEC-单体比例逐渐由92.5％(30℃)升高至96.0％(29℃)，保证了抗体的药效，且无需要额外增加生产相关成本。
附图说明
图1是Fc融合蛋白流加培养实验的活细胞密度；
图2是Fc融合蛋白流加培养实验的细胞活率；
图3是Fc融合蛋白流加培养实验的抗体表达量图；
图4是Fc融合蛋白流加培养实验的抗体SEC纯度-聚体比例图；
图5是Fc融合蛋白流加培养实验的抗体SEC纯度-单体比例图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市售商品或者可以通过已知方法制备。
本发明实施例中的CHO K1细胞(中国仓鼠卵巢细胞)-Clone387表达产物为一种Fc融合蛋白，下面结合附图与具体实施方式对本发明做进一步详细的阐述。
本发明中所用的基础培养基为CBM-1，补料培养基分别为CFM-A1和CFM-B1，均购自上海倍锦生物科技有限公司。添加剂半乳糖，来自Spectrum(货号：G5924C)；尿嘧啶核苷，来自西格玛奥德里奇(无锡)生化科技有限公司(货号：V900421)；四水氯化锰，来自Sigma(货号：M5005)。
GUM：115g/kg半乳糖，31.4g/kg尿嘧啶核苷和0.0504g/kg四水氯化锰。
细胞活率和密度的测定：通过台盼蓝染色法用细胞活力分析仪Vi-cell XR进行测定。
Fc融合蛋白的浓度的测定：通过HPLC法测定，用0.05M磷酸缓冲液以1.0mL/min流速平衡HPLC系统30min至基线平稳，于系统程序中设置标准曲线法程序。进样50μL，以1.0mL/min流速洗脱，记录样品检测的峰面积，并带入标准曲线进行计算，得到蛋白浓度。
融合蛋白的SEC纯度测定：实验开始前，先进行柱平衡，用两通连接柱温箱管路，用超纯水以1.0mL/min的流速冲洗管路至少30min。冲洗完成后，将超纯水替换为流动相，完成后用流动相冲洗系统，使当次实验需使用的管路充满流动相。然后安装色谱柱，设置流速为0.05mL/min，运行5min，调整流速为0.10mL/min，运行5min，调整流速为0.15mL/min，运行5min，依此类推调整流速至0.50mL/min，调用仪器方法并核对设置参数是否正确，随后进行样品检测。平衡色谱柱至少2小时以上，直至柱压及基线稳定。
流动相：20mmol/L磷酸缓冲液，200mmol/L NaCl，5％异丙醇，pH 6.80±0.1。
HPLC检测条件：流速：0.50mL/min；采集时间：30min；进样量：100μg；柱温：25℃：检测波长：280nm。
实施例1表达Fc融合蛋白的细胞的培养方法
在细胞培养实验中，使用3L反应器，以CBM-1为基础培养基进行流加培养，培养过程中需控制搅拌转速，控制溶氧(DO)和pH，其中DO控制以关联氧气和恒通底通空气来维持，pH控制使用CO2和碳酸钠来控制。初始培养体积为1.4～1.6kg，细胞接种密度为0.7～1.1×106cells/mL，转速为275～285rpm，空气底通为15(0～100)mL/min，DO为40％(≥20％)，pH设置为7.00±0.20，温度为36.5±0.5℃。
培养过程中，每天监测细胞活力和密度及各种生化参数。在流加培养至第3/5/7/9/11/13天时分别补加初始培养体积5％(v/v)的CFM-A1和初始培养体积0.5％(v/v)的CFM-B1并取样检测活细胞密度，细胞活率以及生化值，且于第5天补加初始培养体积2.0％(v/v)的GUM。根据生化分析仪检测的结果，当葡萄糖浓度低于4.00g/L时，使用300g/kg葡萄糖母液，补加葡萄糖至终浓度6.00g/L(包含补料CFM-A1中的糖浓度)。流加培养至第5天和第6天时，分别降温至29.0℃、30.0℃和31.0℃(表1)。
表1不同实验组的降温时间和温度的设置
| 序号 | 降温时间 | 降温温度(℃) | 实验组别 |
| 1 | 第5天 | 29.0 | 实验组1 |
| 2 | 第5天 | 30.0 | 对照组 |
| 3 | 第5天 | 31.0 | 实验组2 |
| 4 | 第6天 | 30.0 | 实验组3 |
当细胞培养至第15天或者细胞活率低于70％时进行收获。
留样处理：细胞液经4000rpm，离心15min，上清液经0.2μm滤器过滤后，进行亲和层析处理以测定SEC纯度。
流加培养实验中的活细胞密度和细胞活率如图1和图2所示，培养15天的细胞活率均能维持在90％以上，在培养的第7天左右，细胞密度均能达到最大值2.7×107cells/mL以上。
由于降温温度的差异，各组实验组能达到的细胞密度最大值不同，与降温温度成正比，温度越低细胞密度最大值越小(图1)，但对细胞活率无显著影响。
如图3所示，Fc融合蛋白的表达量与降温温度成反比，但与降温时间成正比，同样的降温温度的情况下，第6天降温的表达量略高于第5天降温时的表达量。相对于对照组，实验组抗体的表达量都在86％以上。
随着降温温度的降低，SEC-聚体比例逐渐由6.7％(30℃)降到3.5％(29℃)(图4)，SEC-单体比例逐渐由92.5％(30℃)升高至96.0％(29℃)(图5)。而随着降温时间的延迟，SEC-聚体比例逐渐由6.7％(第5天，30℃)升高到8.0％(第6天，30℃)(图4)，SEC-单体比例逐渐由92.5％(第5天，30℃)降低至91.1％(第6天，30℃)(图5)。
由上可知，在第5天降温且降温至更低的温度(29℃)方法可有效的降低SEC聚体和提高SEC单体比例，使得抗体表达质量更加接近标准品水平。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种提高融合蛋白SEC纯度的方法，其特征在于，采用分批流加培养，其中，第0～4天控制培养温度为36～37℃，第5天至培养终止控制培养温度为29℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分批流加培养具体为细胞接种密度为0.7～1.1×106cells/mL，转速为275～285rpm，空气底通为0～100mL/min，DO为20～60％，每隔一天进行补料。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述补料为补加CFM-A1培养基和CFM-B1培养基；当葡萄糖浓度低于4.00g/L时，补加葡萄糖至终浓度6.00g/L；第5天补加GUM。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，补加初始培养体积4～6％的CFM-A1培养基和初始培养体积0.4～0.6％的CFM-B1培养基；第5天补加初始培养体积1～3％的GUM。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述GUM包括115g/kg半乳糖，31.4g/kg尿嘧啶核苷和0.0504g/kg四水氯化锰。
6.根据权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，以CBM-1为基础培养基。
7.根据权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，所述细胞包括哺乳动物细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞、杂交瘤细胞或HEK293细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白包括抗体融合蛋白。
10.权利要求1～9任一所述的方法在调控融合蛋白SEC纯度中的应用。
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