CN116948040A - 一种多模块嵌合蛋白、生物蛋白纤维及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种多模块嵌合蛋白、生物蛋白纤维及其制备方法和应用。所述多模块嵌合蛋白由双嵌段蛋白模块及蛛丝末端CTD结构域构成；双嵌段蛋白模块由不同聚合度和/或不同比例的Resilin‑ELP和Spider‑ELP组成，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1‑2所示，蛛丝末端CTD结构域为ADF3，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。根据本发明方法制备出了多种不同聚合度的多模块嵌合蛋白，并且进一步通过湿法纺丝工艺将其制备成适用于不同溶剂环境的高力学性能生物蛋白纤维，所述生物蛋白纤维具有良好的细胞相容性，并可用于组织缝合，具有广阔的医学应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物蛋白功能材料技术领域，尤其涉及一种多模块嵌合蛋白、生物蛋白纤维及其制备方法和应用。
背景技术
生物功能材料具有良好的生物相容性、生物降解性、以及可持续发展的优异特性。其中，以蛋白质为基础的蚕丝和蜘蛛丝的生物功能材料已被开发用于智能织物、生物传感器、组织工程等其他新型应用领域。蛛丝相对于蚕丝具有更高的机械性能。然而，天然蛛丝不同于蚕丝，难以通过规模性养殖而获得。通过分子生物学和基因工程技术制备的重组蛛丝蛋白，为开发可媲美于天然蛛丝的人造蜘蛛纤维提供了切实可行的解决策略。
自然界中进化出的具有不同化学、生物、物理学特性的优异的蛋白质材料，归溯于其明确结构的蛋白序列。蜘蛛的大壶状腺丝中MaSp1和MaSp2因优异的力学性能而受到广泛研究。其中，聚丙氨酸拉伸形成的β微晶主要贡献强度，GGX或GPGXX基序有助于其韧性。然而大部分重组蛋白因异源表达量低，水溶性差，且需在有机环境下纺丝，所制备的纤维无法复刻自然界中蛛丝性能，展现出较低的机械强度和韧性。此外，节肢弹性蛋白具有高延展性和优异的弹性，并展现出优异的温度、pH、光响应特性。但是可溶性的重组rec1-resilin多为无规卷曲结构，缺乏折叠态二级结构如α螺旋和β片层等，因此机械强度较低。类弹性蛋白VPGXG中，X的种类赋予其不同的活性作用位点，从而对性能达到精细控制，如温度响应、热响应、粘合性能、生物学功能等。然而，同样的无序结构限制了其机械性能，导致应用领域受限。因此，亟需开发一种有效的生物聚合策略，结合不同结构蛋白的特性，建立序列-结构-性能的调控体系，实现高机械性能生物蛋白材料的制备。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多模块嵌合蛋白、生物蛋白纤维及其制备方法和应用，从而解决现有技术中的生物功能材料普遍存在的机械强度较低、韧性不高的问题。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
根据本发明的第一方面，提供一种多模块嵌合蛋白，由双嵌段蛋白模块及蛛丝末端CTD结构域构成；所述双嵌段蛋白模块由不同聚合度和/或不同比例的Resilin-ELP和Spider-ELP组成；其中，所述Resilin-ELP的氨基酸序列为VGSGGRPSDSYGAPGGGNP(VP GKG)5VPG，如SEQ ID NO:1所示；所述Spider-ELP的氨基酸序列为GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGP(VPGKG)5TS，如SEQ ID NO:2所示；蛛丝末端CT D结构域为ADF3(来自Araneus diadematus)，氨基酸序列为GAASAAVSVGGYGPQSS SAPVASAAASRLSSPAASSRVSSAVSSLVSSGPTNQAALSNTISSVVSQVSASNPGLSGCD VLVQALLEVVSALVSILGSSSIGQINYGASAQYTQMVGQSVAQALAG，如SEQ ID NO:3所示。
所述ELP嵌段包含5个重复的五肽序列VPGKG，其中活性位点为赖氨酸K，该嵌段提供动态共价连接化学交联位点以及促进嵌合蛋白在大肠杆菌中高效表达。
根据本发明的一个优选方案，所述多模块嵌合蛋白的构成为[Resilin-ELP]m-[Spider-ELP]n-A，其中，m为4的整数倍或0，n为4的整数倍。A代表蛛丝末端CTD结构域ADF3。
在本发明中，应当理解的是，根据对m、n取值的不同选择，该多模块嵌合蛋白中Resilin-ELP和Spider-ELP可以具有不同的聚合度，也可以具有不同的比例。优选的，m为0、4、8、16，n为4、8、12、16，由此构成多种多模块嵌合蛋白，比如，R8C4-A、R4C8-A、R8C16-A，R16C8-A、C12-A等等。
根据本发明的优选实施例，还提供了多种多模块嵌合蛋白的氨基酸序列。其中，R8C4-A的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。R4C8-A的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。R8C16-A的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。R16C8-A的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。C12-A的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
根据本发明，所述多模块嵌合蛋白按照以下步骤进行制备：A1：首先，通过基因合成构建基因元件NdeI-PflMI-[Resilin-ELP]4-BglI-NheⅠ-[Spider-ELP]4-SpeⅠ-His6-EcoRI，通过PflMI、BglI双酶切获得片段[Resilin-ELP]4，或通过NheⅠ和SpeⅠ双酶切获得[Spider-ELP]4，在T4连接酶的作用下连接至单酶切处理的载体上，从而获得不同聚合度和/或不同比例的多模块嵌合蛋白载体[Resilin-ELP]m-[Spider-ELP]n-A，通过双酶切连接至表达载体获得多模块嵌合蛋白表达载体；A2：将所述多模块嵌合蛋白表达载体转化进E.coli BLR(DE3)感受态细胞中，在LB固体培养基中挑取阳性单克隆菌落，在TB培养基中诱导表达，离心收集菌体；A3：采用裂解缓冲液重悬菌体后加入溶菌酶、DNA酶、氯化镁，超声破碎，离心后收集上清液依次进行镍柱、离子交换柱、除盐柱纯化，获得多模块嵌合蛋白。
根据本发明的一个优选方案，步骤A2中，在LB培养基中生长至OD600为3～4时转入TB培养基，保证初始OD600<0.1，继续培养；对于整体聚合度低于等于12的多模块嵌合蛋白，当OD600为0.6～0.8时，加入终浓度0.1mM的IPTG并在28.5℃条件下进行诱导表达10～14小时；对于整体聚合度超过12的多模块嵌合蛋白，在OD600＞5时加入终浓度为1mM的IPTG并在37℃条件下诱导表达4～6小时。
应当理解的是，这里的整体聚合度指的是Resilin-ELP和Spider-ELP的聚合度之和，该整体聚合度的数值即为m与n的二者之和。
根据本发明的第二方面，提供一种采用所述多模块嵌合蛋白制备而成的生物蛋白纤维。所述多模块嵌合蛋白可在有机溶剂或有机溶剂/水或水体系环境下，经湿法纺丝工艺交联而成生物蛋白纤维。
根据本发明的第三方面，提供一种所述生物蛋白纤维的制备方法，包括以下步骤：B1：将所述多模块嵌合蛋白溶于甲酸或HFIP/水或水体系中，获得蛋白浓度为100～200mg/mL的蛋白溶液；B2：将所述蛋白溶液挤出至凝固浴中进行湿法纺丝，收集纤维，即可获得一种高力学性能的生物蛋白纤维。
优选地，所述凝固浴为化学交联剂的醇溶液，其中，所述化学交联剂为终浓度为0.5～1.5％的戊二醛，所述醇溶液为甲醇溶液或乙醇/水溶液。
优选地，所述蛋白溶液的挤出速度为8～30μL/min，收集速度为0.5～3m/min。
优选地，所述制备方法还包括：B3：将步骤B2收集到的纤维经水浸泡后进行后拉伸处理，获得一种力学性能进一步提升的生物蛋白纤维。优选地，后拉伸处理的拉伸程度为原纤维长度的0～200％。
根据本发明的研究发现，在同一湿法纺丝工艺条件下，制备出的高聚合度下的蛋白纤维力学性能要优于低聚合度下的蛋白纤维。
根据本发明的研究还发现，所述多模块嵌合蛋白可在有机溶剂或有机溶剂/水体系或水体系环境下，经湿法纺丝工艺交联而成生物蛋白纤维。在不同体系下(比如：甲酸体系或HFIP/水或水体系)制备的生物蛋白纤维，其力学性能也不同。本发明通过湿法纺丝工艺可制备出适用于不同溶剂环境下的高力学性生物蛋白纤维。
根据本发明提供的制备方法，所制备的生物蛋白纤维具有优异的力学性能以及良好的生物相容性。
根据本发明的第四方面，提供一种所述生物蛋白纤维在细胞培养以及组织缝合中的应用。
根据本发明的一个优选方案，研究发现所述生物蛋白纤维具有作为贴壁细胞支架培养的能力，所述细胞为293T\L929\HT22。
根据本发明的另一优选方案，将后拉伸的生物蛋白纤维进行加捻，还可用于皮肤缝合。
综上所述，本发明提供了一种多模块嵌合蛋白、生物蛋白纤维及其制备方法和应用。该多模块嵌合蛋白由不同聚合度和不同比例的双嵌段蛋白模块构成，其构成为[Resilin-ELP]m-[Spider-ELP]n-A(m为4的整数倍或0，n为4的整数倍)。本发明通过湿法纺丝工艺将该多模块嵌合蛋白制备成适用于不同溶剂环境下的高力学性能的生物蛋白纤维，纤维内部具有依赖于蛋白二级结构所形成的超分子作用网络以及依赖于动态亚胺键所形成的化学交联网络。此外，所述生物蛋白纤维具有良好的细胞相容性，并可用于组织缝合，具有良好的医学应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中多模块嵌合蛋白表达载体构建流程示意图；
图2为本发明实施例3中经后拉伸处理得到的纤维的SEM(A)和POM(B)图；
图3为本发明实施例3中经后拉伸处理得到的R8C4-A蛋白纤维的拉伸力学性能曲线图；
图4为本发明实施例3中经后拉伸处理得到的C12-A、R4C8-A蛋白纤维的拉伸力学性能曲线图；
图5为本发明实施例3中经后拉伸处理得到的R8C16-A、R16C8-A蛋白纤维的拉伸力学性能曲线图；
图6为本发明实施例3中在HFIP/水体系下制备经后拉伸处理得到的蛋白纤维的力学性能汇总；
图7为本发明实施例4中在水体系下制备经后拉伸处理得到的蛋白纤维的力学性能；
图8为本发明实施例5中在甲酸体系中制备经后拉伸处理得到的蛋白纤维的力学性能；
图9为本发明实施例6中单股纤维细胞培养情况；
图10为本发明实施例7中加捻纤维(A)及其皮肤缝合效果图(B)。
具体实施方式
下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作清楚、完整地描述。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
实施例1：多模块嵌合蛋白的构建
结合图1所示的构建流程示意图，该多模块嵌合蛋白的具体构建过程说明如下：
首先，通过基因公司合成基因元件
NdeI-PflMI-[Resilin-ELP]4-BglI-NheⅠ-[Spider-ELP]4-SpeⅠ-His6-EcoRI，并将其构建到载体pBluescript II KS(+)-M13(下称“m13”)上，获得基因元件-m13，以此为基础进行多种多模块嵌合蛋白[R]m-[C]n-A的构建。优选的，m为0、4、8、16，n为4、8、12、16。
然后，通过PflMI和BglI双酶切基因元件-m13获得R4元件，在T4连接酶(市售)的作用下，将R4连接至PflMI单酶切的基因元件-m13载体上，获得多模块蛋白R8C4-m13。同样的，通过NheⅠ和SpeⅠ双酶切基因元件-m13获得C4，在T4连接酶的作用下，连接至SpeⅠ单酶切的基因元件-m13载体上，获得多模块蛋白R4C8-m13。随后，SpeⅠ单酶切，从而连接上ADF3元件，获得R8C4-A、R4C8-A多模块蛋白载体，序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
应当理解的是，按照上述方式还可进一步获得多模块蛋白R8C16-A载体，序列如SEQ ID NO:6所示。将以上多模块蛋白载体再次通过NdeI、EcoRI双酶切连接至pET-25b表达载体上，即可构建得到pET-25b-多模块嵌合蛋白。
通过同源重组，将NheⅠ酶切位点移动到R16终止密码子之前。具体的，R16为实验室自主构建的工程菌，具体可参考文献Engineering high strength and super toughnessof unfolded structural proteins and their extraordinary anti-adhesionperformance for abdominal hernia repair,Adv.Mater.,2022,34(19),2200842。随后，通过NheⅠ和EcoRⅠ双酶切R4C8-A获得C8-A基因元件，在T4连接酶的作用下，连接至NheⅠ和EcoRⅠ双酶切的R16载体上，获得R16C8-A载体。R16C8-A序列如SEQ ID NO:7所示。
应当理解的是，此处仅作为举例而非限制，实际上本发明的技术方案并不仅限于R16载体，也可采用本领域其他常用载体。
实施例2：多模块嵌合蛋白的表达与纯化
将实施例1构建得到的多模块嵌合蛋白表达载体转化进E.coli BLR(DE3)感受态细胞中，在LB固体培养基中挑取阳性单克隆菌落，在LB培养基中生长至OD600为3～4时转入TB培养基。对于C12-A(序列如SEQ ID NO:8所示)、R8C4-A、R4C8-A，当OD600为0.6-0.8时，加入终浓度0.1mM的IPTG并在28.5℃条件下进行诱导表达12小时；对于R8C16-A、R16C8-A，在OD600＞5时加入高浓度(1mM)IPTG并在37℃条件下诱导表达5小时。离心收集菌体并保存于-80℃。
裂解缓冲液重悬菌体后加入溶菌酶、DNA酶、氯化镁，超声破碎，离心收集上清液后依次进行镍柱，阴离子交换柱，除盐柱纯化，获得目的蛋白，冻干并保存在-80℃冰箱中，制得多种不同聚合度的多模块嵌合蛋白。
实施例3：HFIP/水体系中多模块嵌合蛋白纤维的制备
将实施例2制备得到的多模块嵌合蛋白溶于HFIP/水体系中，HFIP/水优选为4/1(v/v)；蛋白浓度优选为100～200mg/mL，更优选为160mg/mL。蛋白溶液通过1mL注射器在注射泵的推动下挤入乙醇/水凝固浴中，进行湿法纺丝。所述挤出速度优选为8～15μL/min；收集速度优选为1.5～2m/min；化学交联剂戊二醛浓度优选为1wt％；乙醇/水的范围优选为70％～100％(v/v)，在本实施例中，更优选为95％(v/v)。
将收集到的生物蛋白纤维在室温平衡1～3h，随后浸泡在水中，进行后拉伸处理，获得直径均匀，结构取向良好的高性能纤维。R4C8-A蛋白纤维的扫描电子显微镜(SEM)检测和偏光显微镜(POM)检测图如图2所示。对后拉伸之后的R8C4-A蛋白纤维进行力学拉伸测试，典型的应力-应变曲线如图3所示。
相同条件下，制备并测试相同聚合度、相同化学交联位点下不同比例的模块蛋白纤维C12-A、R4C8-A；同时制备高聚合度下的R8C16-A以及R16C8-A蛋白纤维，其拉伸力学性能如图4、图5所示。图6是对HFIP/水体系下的多模块蛋白纤维的力学性能进行汇总，结果显示高聚合度下的蛋白纤维力学性能要优于低聚合度下的蛋白纤维，特别是R16C8-A蛋白纤维，其断裂强度可达～560MPa。
实施例4：水体系中多模块嵌合蛋白纤维的制备
按照实施例3中的方法制备得到水体系下的多模块蛋白纤维，不同的是，将实施例3中的HFIP/水体系替换为水。所述多模块蛋白优选为R8C4-A。力学性能测试如图7。结果表明HFIP使得模块蛋白R8C4-A展现出更优异的断裂强度和模量。
实施例5：甲酸体系中多模块嵌合蛋白纤维的制备
按照实施例3中的方法制备得甲酸体系下的多模块蛋白纤维，不同的是，将实施例3中的HFIP/水体系替换为甲酸，凝固浴相应的替换为1wt％戊二醛的甲醇溶液。所述多模块蛋白优选为R4C8-A。力学性能测试如图8，结果表明，甲酸条件下，多模块蛋白R4C8-A呈现更高的断裂强度和模量。
实施例6：生物蛋白纤维的生物相容性
在本具体实施例中，人胚肾细胞以105个/孔的密度接种到12孔板上；按照实施例3中的方法制备多模块嵌合蛋白纤维，UV消毒后，与人胚肾细胞共培养24小时。加入钙黄绿素AM和碘化丙啶PI染色液，在共聚焦显微镜下观察细胞在多模块嵌合蛋白纤维上的生长情况。如图9所示，该生物蛋白纤维展现出良好的生物相容性。
实施例7：多模块嵌合蛋白纤维的组织缝合能力
按照实施例3中的方法制备得单股多模块蛋白纤维，后拉伸处理后将纤维加捻处理，制备得生物蛋白缝合线，如图10中扫描电镜所示。优选的，单股纤维数目为15-30根。在老鼠背部构建线性皮肤破损模型，利用制备的生物蛋白缝合线缝合创口，实物图见图10右侧。由此可见，该生物蛋白纤维具有良好的医学应用潜力。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
Claims (10)
1.一种多模块嵌合蛋白，其特征在于，由双嵌段蛋白模块及蛛丝末端CTD结构域构成；所述双嵌段蛋白模块由不同聚合度和/或不同比例的Resilin-ELP和Spider-ELP组成；
所述Resilin-ELP的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述Spider-ELP的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述蛛丝末端CTD结构域为ADF3，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的多模块嵌合蛋白，其特征在于，所述多模块嵌合蛋白的构成为[Resilin-ELP]m-[Spider-ELP]n-A，其中，m为4的整数倍或0，n为4的整数倍。
3.根据权利要求1所述的多模块嵌合蛋白，其特征在于，所述多模块嵌合蛋白按照以下步骤进行制备：
A1：首先，通过基因合成构建基因元件
NdeI-PflMI-[Resilin-ELP]4-BglI-NheⅠ-[Spider-ELP]4-SpeⅠ-His6-EcoRI，通过PflMI、BglI双酶切获得片段[Resilin-ELP]4，或通过NheⅠ和SpeⅠ双酶切获得[Spider-ELP]4，在T4连接酶的作用下连接至单酶切处理的载体上，从而获得不同聚合度和/或不同比例的多模块嵌合蛋白载体[Resilin-ELP]m-[Spider-ELP]n-A，通过双酶切连接至表达载体获得多模块嵌合蛋白表达载体；
A2：将所述多模块嵌合蛋白表达载体转化进E.coliBLR(DE3)感受态细胞中，在LB固体培养基中挑取阳性单克隆菌落，在TB培养基中诱导表达，离心收集菌体；
A3：采用裂解缓冲液重悬菌体后加入溶菌酶、DNA酶、氯化镁，超声破碎，离心后收集上清液依次进行镍柱、离子交换柱、除盐柱纯化，获得多模块嵌合蛋白。
4.根据权利要求3所述的多模块嵌合蛋白，其特征在于，步骤A2中，在LB培养基中生长至OD600为3～4时转入TB培养基，保证初始OD600<0.1，继续培养；对于整体聚合度低于等于12的多模块嵌合蛋白，当OD600为0.6～0.8时，加入终浓度0.1mM的IPTG并在28.5℃条件下进行诱导表达10～14小时；对于整体聚合度超过12的多模块嵌合蛋白，在OD600＞5时加入终浓度为1mM的IPTG并在37℃条件下诱导表达4～6小时。
5.一种采用根据权利要求1～4中任意一项所述的多模块嵌合蛋白制备而成的生物蛋白纤维。
6.一种根据权利要求5所述的生物蛋白纤维的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
B1：将所述多模块嵌合蛋白溶于甲酸或HFIP/水或水体系中，获得蛋白浓度为100～200mg/mL的蛋白溶液；
B2：将所述蛋白溶液挤出至凝固浴中进行湿法纺丝，收集纤维，即可获得一种高力学性能的生物蛋白纤维。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述凝固浴为化学交联剂的醇溶液，其中，所述化学交联剂为终浓度为0.5～1.5％的戊二醛，所述醇溶液为甲醇溶液或乙醇/水溶液。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白溶液的挤出速度为8～30μL/min，收集速度为0.5～3m/min。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：B3：将步骤B2收集到的纤维经水浸泡后进行后拉伸处理，获得一种力学性能进一步提升的生物蛋白纤维。
10.一种根据权利要求5所述的生物蛋白纤维在细胞培养以及组织缝合中的应用。
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