CN116948017A - 一种抗爱德华氏菌卵黄抗体的制备方法与应用 - Google Patents

一种抗爱德华氏菌卵黄抗体的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种抗爱德华氏菌卵黄抗体，是以爱德华氏菌为抗原制备灭活疫苗对蛋鸡进行免疫，收集鸡蛋后进行分离提纯获得所述爱德华氏菌卵黄抗体，具有特异性好、效价高的优点，用于防治爱德华氏菌引起的疾病和免疫学检测具有良好的效果；且使用健康母鸡所产鸡蛋为载体，安全无毒，成本低，产量高，易于产业化。

Description

一种抗爱德华氏菌卵黄抗体的制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗爱德华氏菌卵黄抗体的制备方法与应用。
背景技术
随着我国水产养殖业的发展，爱德华氏菌属细菌作为水产养殖鱼类的一种重要病原，特别是对鲇形目鱼类危害重大，越来越引起人们的重视，而且爱德华氏菌属中的迟缓爱德华氏菌还是一种重要的人畜共患病的病原菌，对人类健康造成威胁，因此，对爱德华氏病病原进行深入的研究，寻求科学的诊断与防控方法，给人们提供高质量的水产品，具有重要的意义。但是，目前在爱德华氏菌病的诊断与防控方面，还存在以下不足：尽管国内外对爱德华氏菌进行了大量的研究，但其致病机理仍没有彻底搞清，而完全弄清病原菌的致病机理能使诊断更准确；在防治方面，由于使用抗生素类药物的弊端，积极发展非抗生素类药物势在必行。
卵黄抗体(Immunoglobulin of yolk,IgY)是一种免疫球蛋白，主要存在于禽类、两栖动物以及爬行动物的血清当中。卵黄抗体具有高产量、低成本、理化性质稳定等特点，目前已在人、畜牧、水产养殖的疾病防治中广泛应用。与传统的抗生素和化学药物相比，应用卵黄抗体具有以下几个优点：(1)特异性强，与广谱的抗生素不同，卵黄抗体只针对相应的致病菌，不会对其它菌群产生影响；(2)易获取，卵黄抗体可从免疫蛋鸡的鸡蛋中获取，无需宰杀大量动物且产生的抗体效价高，稳定性强，能够避免频繁注射；(3)于鸡类与哺乳动物间存在一定系统发育距离，少量抗原就可以引发有效的免疫应答；(4)无残留，由于卵黄抗体属于免疫球蛋白，发挥作用后会被机体作为营养物质消化吸收；(5)研制开发的周期短，成本低，可长期保存，便于运输和应用。近年来，利用IgY的被动免疫保护作用用于疾病的预防和治疗受到了国内外的广泛关注，并取得了良好的效果。
发明内容
本发明提供抗爱德华氏菌卵黄抗体的制备方法与应用，采用爱德华氏菌为抗原，免疫健康的产蛋母鸡，制备具有特异性的抗爱德华氏菌卵黄抗体，在爱德华氏菌的免疫学检测、抗原的纯化，以及爱德华氏菌感染的预防和治疗上具有重要的作用。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种抗爱德华氏菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)抗原的制备：用TSB培养基将活化后的爱德华氏菌培养至对数期后期，取菌液离心后，用无菌PBS缓冲液洗涤菌体三遍并重悬，最后用0.4％的甲醛灭活，得到灭活的爱德华氏菌抗原；
(2)将灭活的爱德华氏菌抗原与等量的弗式完全佐剂配合注射到生长状况良好的蛋鸡，进行初次免疫，若干次加强免疫时采用灭活的爱德华氏菌抗原与等量的弗式不完全佐剂配合进行注射，加强免疫后采集鸡蛋，用间接酶联免疫法ELISA测定卵黄抗体效价；
(3)提取卵黄抗体水溶性组分：收集第一次免疫后每一天产下的鸡蛋，分离卵黄，破碎去除杂蛋白，收集卵黄液，进一步去除脂蛋白与脂肪后，用去离子水稀释10倍，盐酸调pH至5.0，于-20℃中冷冻过夜，次日4℃缓慢解冻，至少进行冻融处理1次，再利用离心收集上清，即为卵黄抗体水溶性组分；
(4)纯化：利用硫酸铵二次沉淀法进行卵黄抗体水溶性组分进一步纯化，最终得到抗爱德华氏菌卵黄抗体。
进一步的，所述步骤(2)中蛋鸡的免疫过程采用胸肌和翅膀分点注射免疫，初次免疫时左右胸肌各注射0.1～0.2mL，翅膀皮下注射0.4～0.6mL；加强免疫中，左右胸肌和翅膀皮下各注射0.3mL；每隔两周进行一次加强免疫。
进一步的，所述步骤(2)中产蛋鸡筛选的方法为ELISA法检测高免鸡产的蛋含有抗爱德华氏菌的抗体，且效价均在1:10000以上。
进一步的，所述步骤(3)中杂蛋白去除方法为将卵黄溶液的pH值调至脂蛋白的等电点，沉淀静置取上清，底部浑浊部分放入离心取上清，合并上清后微孔过滤进一步去除脂蛋白和脂肪，取滤液，该滤液为卵黄液。
本发明提供根据上述制备方法制得的抗爱德华氏菌卵黄抗体。
本发明还提供根据上述方法制得的抗爱德华氏菌卵黄抗体在以爱德华氏菌为抗原的亲和纯化试剂或以爱德华氏菌为抗原的免疫检测试剂制备中的应用。
相较于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供抗爱德华氏菌卵黄抗体由爱德华氏菌免疫产蛋母鸡而得，具有特异性好、效价高的优点，用于防治爱德华氏菌引起的疾病和免疫学检测具有良好的效果；且使用健康母鸡所产鸡蛋为载体，安全无毒，成本低，产量高，易于产业化。
附图说明
图1为实施例2中ELISA法检测抗爱德华氏菌卵黄抗体的效价示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
一种抗爱德华氏菌卵黄抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)抗原的制备：用TSB培养基将活化后的爱德华氏菌培养至对数期后期，取菌液离心后，在4℃12000rpm的条件下离心15min，倒掉上清后用无菌PBS洗涤菌体三遍并重悬，用无菌PBS缓冲液洗涤菌体三遍并重悬，最后用0.4％的甲醛灭活，得到灭活的爱德华氏菌抗原；
(2)将灭活的爱德华氏菌抗原与等量的弗式完全佐剂配合注射到生长状况良好的蛋鸡，进行初次免疫，加强免疫时采用灭活的爱德华氏菌抗原与等量的弗式不完全佐剂配合进行注射，蛋鸡的免疫过程采用胸肌和翅膀分点注射免疫，初次免疫时左右胸肌各注射0.1～0.2mL，翅膀皮下注射0.4～0.6mL；加强免疫中，左右胸肌和翅膀皮下各注射0.3mL；每隔两周进行一次加强免疫；本实施例中进行4次加强免疫，加强免疫后采集血清，产蛋鸡筛选的方法为ELISA法检测高免鸡产的蛋含有抗爱德华氏菌的抗体，且效价均在1:10000以上；
(3)提取卵黄抗体水溶性组分：收集第一次免疫后每一天产下的鸡蛋，分离卵黄，破碎去除杂蛋白，收集卵黄液，进一步去除脂蛋白与脂肪后，用去离子水稀释10倍，盐酸调pH至5.0，于-20℃中冷冻过夜，次日4℃缓慢解冻，至少进行冻融处理1次，再利用离心收集上清，即为卵黄抗体水溶性组分；
其中，杂蛋白去除方法为：用盐酸和氢氧化钠溶液将卵黄溶液的PH值调至各种脂蛋白的等电点(pH5.2～6.0)，使卵黄溶液产生浑浊沉淀；将以上溶液静置4～8℃冰箱过夜，使卵黄溶液的杂蛋白沉淀；第二天用吸管吸取沉淀后的上清，底部浑浊部分放入3500～4000r/min离心机离心20～40分钟后取上清；将两种上清混合后经微孔过滤(孔径0.22μm)进一步去除脂蛋白和脂肪，取滤液；
(5)纯化：将卵黄抗体水溶性组分缓慢加入100％饱和硫酸铵溶液当中，至最终饱和度为55％，边缓慢加入边在冰上搅拌混匀，4℃10000rpm离心15min，将上清液倒掉并用少量的PBS溶液将沉淀重悬，再缓慢加入到100％硫酸铵溶液，至最终饱和度为33％，在冰上搅拌混匀后静置于4℃冰箱过夜，次日4℃10000rpm离心15min，去除上清液，加入少量的PBS溶液重悬，重悬液转移至10kDa透析袋中进行透析，将装有上述重悬液的透析袋放入提前预冷好的透析液(灭菌PBS溶液)中，充分透析，得到抗爱德华氏菌卵黄抗体。
实施例2
(1)抗爱德华氏菌卵黄抗体的效价检测
抗爱德华氏菌卵黄抗体的效价由酶联免疫吸附法进行测定，具体步骤如下：
抗原包被：将灭活的爱德华氏菌作为抗原，用包被液稀释800倍后，以每孔200μL的量加入酶标板中，4℃包被过夜；
封闭：次日，倒掉孔板中的包被液，用洗涤液荡洗3次，每次3min；再每孔加入200μL封闭液，37℃封闭1h；
加样：将待测卵黄抗体用稀释液进行倍比稀释，稀释梯度为1:1000至1:102400，非特异性卵黄抗体作为阴性对照，每孔加入100μL，设置三个重复孔，37℃孵育1h，甩干后用洗涤液荡洗3次，每次3min；
加酶标二抗：用稀释液将兔抗鸡IgY-HRP按1:10000稀释后，每孔加入100μL，37℃孵育1h，甩干后用洗涤液荡洗3次，每次3min；
显色：避光加入TMB显色液，每孔100μL，轻摇混匀后，37℃避光显色15～20min；
终止：每孔加入50μL的终止液，用酶标仪检测OD450nm。
结果：OD样品/OD阴性≥2.1时，最大稀释倍数为特异性卵黄抗体的效价。
取第五次免疫后产下的鸡蛋，进行提取纯化后将提取纯化好的卵黄抗体进行ELISA实验，测定鸡蛋中抗爱德华氏菌卵黄抗体的效价，由图1可知，当稀释倍数为32000时，OD450nm平均值为0.067，是对照组的2.5倍，大于2.1；当稀释倍数为64000时，OD450nm平均值为0.060，是对照组的0.7倍，小于2.1；由此可知提取纯化的抗爱德华氏菌卵黄抗体的效价为1:32000，如表1所示；
表1ELISA检测爱德华氏菌卵黄抗体的效价
稀释倍数 阳性 阴性 倍数
1:1000 1.041 0.133 7.8
1:2000 0.507 0.095 5.3
1:4000 0.319 0.053 6.1
1:8000 0.158 0.036 4.4
1:16000 0.102 0.040 2.5
1:32000 0.067 0.027 2.5
1:64000 0.060 0.082 0.7
1:128000 0.044 0.060 0.7
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种抗爱德华氏菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)抗原的制备：用TSB培养基将活化后的爱德华氏菌培养至对数期后期，取菌液离心后，用无菌PBS缓冲液洗涤菌体三遍并重悬，最后用0.4％的甲醛灭活，得到灭活的爱德华氏菌抗原；
(2)将灭活的爱德华氏菌抗原与等量的弗式完全佐剂配合注射到生长状况良好的蛋鸡，进行初次免疫，若干次加强免疫时采用灭活的爱德华氏菌抗原与等量的弗式不完全佐剂配合进行注射，加强免疫后采集血清，用间接酶联免疫法ELISA测定血清效价；
(3)提取卵黄抗体水溶性组分：收集第一次免疫后每一天产下的鸡蛋，分离卵黄，破碎去除杂蛋白，收集卵黄液，进一步去除脂蛋白与脂肪后，用去离子水稀释10倍，盐酸调pH至5.0，于-20℃中冷冻过夜，次日4℃缓慢解冻，至少进行冻融处理1次，再利用离心收集上清，即为卵黄抗体水溶性组分；
(4)纯化：利用硫酸铵二次沉淀法进行卵黄抗体水溶性组分进一步纯化，最终得到抗爱德华氏菌卵黄抗体。
2.根据权利要求1所述的抗爱德华氏菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中蛋鸡的免疫过程采用胸肌和翅膀分点注射免疫，初次免疫时左右胸肌各注射0.1～0.2mL，翅膀皮下注射0.4～0.6mL；加强免疫中，左右胸肌和翅膀皮下各注射0.3mL；每隔两周进行一次加强免疫。
3.根据权利要求2所述的抗爱德华氏菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中产蛋鸡筛选的方法为ELISA法检测高免鸡产的蛋含有抗爱德华氏菌的抗体，且效价均在1：10000以上。
4.根据权利要求1所述的抗爱德华氏菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中杂蛋白去除方法为将卵黄溶液的pH值调至脂蛋白的等电点，沉淀静置取上清，底部浑浊部分放入离心取上清，合并上清后微孔过滤进一步去除脂蛋白和脂肪，取滤液，该滤液为卵黄液。
5.根据权利要求1至4任一所述的抗爱德华氏菌卵黄抗体的制备方法获得的抗爱德华氏菌卵黄抗体。
6.根据权利要求5所述的抗爱德华氏菌卵黄抗体在以爱德华氏菌为抗原的亲和纯化试剂或以爱德华氏菌为抗原的免疫检测试剂制备中的应用。
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