CN116942839A - Nk纳米药物制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物技术领域，公开了NK纳米药物制剂及其制备方法和应用。该NK纳米药物制剂，包括NK细胞和接枝在所述NK细胞表面的C17H15FO3。本发明的NK纳米药物制剂中将自然杀伤细胞和F‑DMC进行接枝，促进F‑DMC顺利通过血脑屏障，在脑内氧化应激损伤条件下，NK细胞和F‑DMC连接被切断，释放的NK细胞可以清除细胞外的α‑synuclein，而被多巴胺神经元摄取的F‑DMC，可以通过促进自噬，清除细胞内的α‑synuclein。在双重作用下，完成对病理性α‑synuclein的清除和降解，从而改善PD模型的行为障碍和脑内病理损伤。

Description

NK纳米药物制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物技术领域，特别涉及NK纳米药物制剂及其制备方法和应用。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种中老年常见的神经退行性疾病，临床症状主要表现为静止性震颤、运动迟缓、肌张力增高和姿势平衡障碍。随着人口老龄化的到来，PD的发病率逐年递增。流行病学资料显示，65岁以上该病的患病率为1.67％。PD的主要病理变化表现为中脑黑质多巴胺能(Dopamine，DA)神经元进行性变性和死亡，残存神经元内出现由α-synuclein聚集形成的嗜酸性蛋白包涵体。PD病因目前尚不完全清楚，大多数学者认为PD是遗传和环境因素等多因素引发的疾病。迄今已发现多种基因的异常表达与PD有关，其中PARK1/SNCA编码的α-突触核蛋白(α-synuclein)是与PD关系最为密切的蛋白之一(参考文献：(1)Shahmoradian SH,Lewis AJ,Genoud C,Hench J,Moors TE,Navarro PP,etal.Lewy pathology in Parkinson's disease consists of crowded organelles andlipid membranes.Nature neuroscience.2019；22:1099-109.(2)Kalia LV,LangAE.Parkinson's disease.Lancet.2015；386:896-912.(3)Shahnawaz M,Mukherjee A,Pritzkow S,Mendez N,Rabadia P,Liu X,et al.Discriminating alpha-synucleinstrains in Parkinson's disease and multiple system atrophy.Nature.2020；578:273-7.(4)Fusco G,Chen SW,Williamson PTF,Cascella R,Perni M,Jarvis JA,etal.Structural basis of membrane disruption and cellular toxicity by alpha-synuclein oligomers.Science.2017；358:1440-3)。自噬功能障碍和氧化应激损伤等是PD发病的重要机制。近年来，多种促自噬和抗氧化应激小分子药物，比如针对NLRP3和RIPK的抑制剂，被证实可以保护PD中DA神经元损伤(参见文献：(1)Xu D,Zhao H,Jin M,Zhu H,Shan B,Geng J,et al.Modulating TRADD to restore cellular homeostasis andinhibit apoptosis.Nature.2020；587:133-8.(2)Han X,Sun S,Sun Y,Song Q,Zhu J,Song N,et al.Small molecule-driven NLRP3 inflammation inhibition viainterplay between ubiquitination and autophagy:implications for Parkinsondisease.Autophagy.2019；15:1860-81.(3)Cheng J,Liao Y,Dong Y,Hu H,Yang N,KongX,et al.Microglial autophagy defect causes parkinson disease-like symptoms byaccelerating inflammasome activation in mice.Autophagy.2020；16:2193-205.)。然而这些药物对α-synuclein病理的改善尚不清楚，且此类药物应用于治疗PD的安全性和有效性尚待商榷。诸多天然药物，比如芒果苷、角鲨胺、茶多酚等也被报道可以减轻α-synuclein造成的氧化应激损伤、线粒体功能障碍和免疫炎症反应，来保护多巴胺神经元，进而在PD中发挥神经保护效应(参见文献：(1)Feng ST,Wang ZZ,Yuan YH,Sun HM,ChenNH,Zhang Y.Mangiferin:A multipotent natural product preventingneurodegeneration in Alzheimer's and Parkinson's diseasemodels.Pharmacological research.2019；146:104336.(2)Perni M,Galvagnion C,Maltsev A,Meisl G,Muller MB,Challa PK,et al.Anatural product inhibits theinitiation of alpha-synuclein aggregation and suppresses its toxicity.ProcNatl Acad Sci U S A.2017；114:E1009-E17.(3)Zhou ZD,Xie SP,Saw WT,Ho PGH,WangH,Lei Z,et al.The Therapeutic Implications of Tea Polyphenols AgainstDopamine(DA)Neuron Degeneration in Parkinson's Disease(PD).Cells.2019；8.)。2019年Madeo Frank团队率先报道了一种来源于明日叶的黄酮类天然药物-4,4'-二甲氧基查耳酮(DMC)可以不依赖于mTORC1信号通路，激活GATA转录因子，促进酵母、线虫、果蝇、小鼠和灵长类等不同物种的自噬水平，进而发挥保护效应(参见文献：Carmona-Gutierrez D,Zimmermann A,Kainz K,Pietrocola F,Chen G,Maglioni S,et al.The flavonoid 4,4'-dimethoxychalcone promotes autophagy-dependent longevity acrossspecies.Nature communications.2019；10:651.)。明日叶盛产于日本，在明朝李时珍的《本草纲目》和日本《大和本草》中都有详细记载其功效主治。现代药理学研究发现，明日叶含有类黄酮、胆碱、香豆素等多种活性成分，其中最主要的是查尔酮类化合物。查尔酮是黄酮类化合物的一种，具有显著的抗氧化作用。DMC促进自噬效果显著，且安全性较好，然而其生物利用度较低，靶向性不强，且其对PD中α-synuclein病理作用不显著。
因此，亟需提供一种新的药物，提高其透过血脑屏障的效率，提高生物利用度，清除细胞内、外的α-synuclein，改善帕金森病模型的行为障碍和脑内病理损伤。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出NK纳米药物制剂及其制备方法和应用。本发明所述NK纳米药物制剂的制备方法操作简单、快速，且制备出来的NK纳米药物制剂性质稳定、安全性高，改善了DMC(4,4'-二甲氧基查耳酮)血脑屏障低通透性、靶向性差、对PD中α-synuclein病理作用不显著等问题。本发明NK纳米药物制剂性在抗帕金森病的应用中，通过血脑屏障后，在脑内氧化应激损伤环境下，NK纳米药物制剂中的NK细胞和靶向小分子药物分别释放，通过清除细胞内外的α-synuclein改善帕金森病小鼠的运动行为障碍，可作为新型的神经保护药物用于抗神经退行性疾病的治疗中。
本发明的发明构思为：本发明的NK纳米药物制剂中含噬效果显著、清除α-synuclein效果好，且无显著毒性的先导化合物(化合物名为2-Propen-1-one,2-fluoro-1,3-bis(4-methoxyphenyl)-,(E)-，C17H15FO3，分子量为286.30，命名为F-DMC)。通过对F-DMC药理学活性研究，证实了其抗PD的显著效果。结合细胞治疗，将自然杀伤细胞(naturalkiller cell，NK cell)和该F-DMC进行接枝，促进F-DMC顺利通过血脑屏障，在脑内氧化应激损伤条件下，NK细胞和F-DMC连接被切断，释放的NK细胞可以清除细胞外的α-synuclein，而被多巴胺神经元摄取的F-DMC，可以通过促进自噬，清除细胞内的α-synuclein。在双重作用下，完成对病理性α-synuclein的清除和降解，从而改善PD模型的行为障碍和脑内病理损伤。这种治疗模式有望为神经退行性疾病治疗提供新的借鉴。
本发明的第一方面提供NK纳米药物制剂。
具体的，NK纳米药物制剂，包括NK细胞和接枝在所述NK细胞表面的C17H15FO3。
所述C17H15FO3的结构式为
优选的，所述NK纳米药物制剂还包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物和/或活性氧响应性磷脂。所述C17H15FO3通过聚乳酸-羟基乙酸共聚物和/或活性氧响应性磷脂包覆后，然后与NK细胞进行接枝。
优选的，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重均分子量为30k-60k，优选45-55k，更优选48-50k。
优选的，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中，聚乳酸结构与羟基乙酸结构的摩尔比为1：(0.8-1.2)，优选1：1。
优选的，所述活性氧响应性磷脂(简称ROS响应性磷脂)为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇。
优选的，所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇中的聚乙二醇为聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000中的至少一种，优选聚乙二醇2000。所述硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇为活性氧响应性磷脂。
本发明的第二方面提供NK纳米药物制剂的制备方法。
具体的，NK纳米药物制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)取C17H15FO3、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、活性氧响应性磷脂与有机溶剂混合，超声分散，加水，透析，制得NPs@F-DMC；
(2)将靶向肽RVG29与所述NPs@F-DMC混合，制得RVG-NPs@F-DMC；
(3)将NK细胞加入含有三(2-羧乙基)-膦盐酸盐的磷酸缓冲盐溶液中，孵育，洗涤，得到经过三(2-羧乙基)-膦盐酸盐处理过的NK细胞，然后将所述RVG-NPs@F-DMC与过三(2-羧乙基)-膦盐酸盐处理过的NK细胞混合，孵育，制得NK纳米药物制剂(记为NK cell-NPs@F-DMC)。
优选的，步骤(1)中，所述C17H15FO3、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、活性氧响应性磷脂的质量比为1：(0.8-3)：(0.8-3)，优选1：(1-2)：(1-2)。
优选的，步骤(1)中，所述有机溶剂包括乙醇和/或二甲基亚砜。当有机溶剂为乙醇和二甲基亚砜的混合物时，乙醇与二甲基亚砜的体积比为1：(7-10)，优选1：9。
优选的，步骤(1)中，所述C17H15FO3与有机溶剂的质量体积比为1mg：(0.1-1)mL，优选1mg：(0.1-0.5)mL。
优选的，步骤(1)中，所述超声的功率为20-50W，优选30-35W。
优选的，步骤(1)中，所述水为超纯水。
优选的，步骤(1)中，加入水是在超声分散的时候滴加。
优选的，步骤(1)中，所述水的体积为1-20mL，优选2-10mL。
优选的，步骤(1)中，所述透析是采用透析袋进行，且采用超纯水透析40-48小时。
进一步优选的，所述透析袋的截留分子量为3000-3500Da。透析的作用在于除去C17H15FO3与有机溶剂。
优选的，步骤(2)中，取1-5μg靶向肽RVG29与步骤(1)制备的NPs@F-DMC混合0.5-4小时，超滤，去除游离的靶向肽RVG29，制得所述RVG-NPs@F-DMC，4℃以下保持备用。
优选的，步骤(3)中，所述含有三(2-羧乙基)-膦盐酸盐的磷酸缓冲盐溶液中，三(2-羧乙基)-膦盐酸盐的浓度为0.1-1mg/mL，优选0.1-0.5mg/mL。
优选的，步骤(3)中，所述含有三(2-羧乙基)-膦盐酸盐的磷酸缓冲盐溶液中，磷酸缓冲盐溶液的体积为1-15mL，优选1-10mL。
优选的，步骤(3)中，将数量为(1-10)×106个的NK细胞加入到含有三(2-羧乙基)-膦盐酸盐的磷酸缓冲盐溶液中。
优选的，步骤(3)中，所述孵育的温度为35-37℃，孵育的时间为5-50分钟，优选孵育的温度为37℃，孵育的时间为10-45分钟。孵育完后用磷酸缓冲盐溶液洗涤2-10次。
优选的，步骤(3)中，将1mL的RVG-NPs@F-DMC与经过三(2-羧乙基)-膦盐酸盐处理过的NK细胞混合。混合后，RVG-NPs@F-DMC的浓度为10-50μg/mL，优选5-60μg/mL。
优选的，步骤(3)中，制得NK纳米药物制剂前，还用磷酸缓冲盐溶液进行洗涤2-10次。
优选的，步骤(3)中，孵育后，离心2-10次，并用磷酸缓冲盐溶液分散，除去游离RVG29、三(2-羧乙基)-膦盐酸盐等杂质，制得NK纳米药物制剂。
优选的，NK纳米药物制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)取C17H15FO3、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、活性氧响应性磷脂与有机溶剂混合，超声分散，加水，透析，制得NPs@F-DMC，C17H15FO3、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、活性氧响应性磷脂的质量比为1：(0.8-3)：(0.8-3)，C17H15FO3与有机溶剂的质量体积比为1mg：(0.1-1)mL，透析是采用透析袋进行，且采用超纯水透析40-48小时，所述透析袋的截留分子量为3500Da，超声的功率为20-50W；
(2)取1-5μg靶向肽RVG29与步骤(1)制备的NPs@F-DMC混合0.5-4小时，超滤，制得RVG-NPs@F-DMC；
(3)将数量为(1-10)×106个的NK细胞加入含有三(2-羧乙基)-膦盐酸盐的磷酸缓冲盐溶液中，孵育，孵育的温度为35-37℃，孵育的时间为5-50分钟，磷酸缓冲盐溶液进行洗涤2-10次，得到经过三(2-羧乙基)-膦盐酸盐处理过的NK细胞，然后将1mL的RVG-NPs@F-DMC与过三(2-羧乙基)-膦盐酸盐处理过的NK细胞混合，孵育，孵育的温度为35-37℃，孵育的时间为5-50分钟，离心，磷酸缓冲盐溶液进行洗涤2-10次，制得NK纳米药物制剂(记为NKcell-NPs@F-DMC)，含有三(2-羧乙基)-膦盐酸盐的磷酸缓冲盐溶液中，三(2-羧乙基)-膦盐酸盐的浓度为0.1-1mg/mL，磷酸缓冲盐溶液的体积为1-15mL。
本发明的第三方面提供NK纳米药物制剂的应用。
上述NK纳米药物制剂在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。
优选的，所述神经退行性疾病包括帕金森病。
一种治疗帕金森病的药物，包括上述NK纳米药物制剂。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明的NK纳米药物制剂中将自然杀伤细胞(natural killer cell，NK cell)和F-DMC进行接枝，促进F-DMC顺利通过血脑屏障，在脑内氧化应激损伤条件下，NK细胞和F-DMC连接被切断，释放的NK细胞可以清除细胞外的α-synuclein，而被多巴胺神经元摄取的F-DMC，可以通过促进自噬，清除细胞内的α-synuclein。在双重作用下，完成对病理性α-synuclein的清除和降解，从而改善PD模型的行为障碍和脑内病理损伤。这种治疗模式有望为神经退行性疾病治疗提供新的借鉴。
附图说明
图1为F-DMC与DMC的结构图；
图2为F-DMC显著促进多巴胺能神经元MN9D细胞的自噬水平图；
图3为F-DMC显著促进多巴胺能神经元MN9D细胞对于病理性α-synuclein的清除效果图；
图4为实施例1制备的NPs@F-DMC和RVG-NPs@F-DMC的粒径检测结果；
图5为NK细胞和实施例1制备的NK纳米药物制剂的扫描电镜图；
图6为标记的NK纳米药物制剂(NK cell-NPs@ICG)ROS响应释药性能检测结果；
图7为实施例1的NK纳米药物制剂治疗改善了AAV-A53Tα-Syn模型小鼠的运动行为障碍结果；
图8为实施例1的NK纳米药物制剂治疗改善了AAV-A53Tα-Syn模型小鼠的多巴胺神经元损伤结果；
图9为实施例1的NK纳米药物制剂治疗降低了AAV-A53Tα-Syn模型小鼠的病理性α-synuclein表达。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1：NK纳米药物制剂的制备
NK纳米药物制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)取5mg C17H15FO3(F-DMC，购买自美国ChemDiv公司)、10mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物(聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重均分子量为50k，聚乳酸-羟基乙酸共聚物中，聚乳酸结构与羟基乙酸结构的摩尔比为1：1)、10mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇中的聚乙二醇为聚乙二醇2000)与1mL有机溶剂(有机溶剂为乙醇和二甲基亚砜的混合物，乙醇与二甲基亚砜的体积比为1：9)混合，在功率为30W的超声条件下滴加5mL超纯水分散，然后透析(透析是采用透析袋进行，且采用超纯水透析48小时，透析袋的截留分子量为3500Da)，制得NPs@F-DMC；
(2)取2μg靶向肽RVG29与步骤(1)制备的NPs@F-DMC混合2小时，超滤游离的靶向肽RVG29，制得RVG-NPs@F-DMC；
(3)将数量为5×106个的NK细胞加入含有三(2-羧乙基)-膦盐酸盐的磷酸缓冲盐溶液(三(2-羧乙基)-膦盐酸盐的浓度为0.3mg/mL，磷酸缓冲盐溶液的体积为5mL，磷酸缓冲盐溶液简称PBS)中，37℃下孵育20分钟，用磷酸缓冲盐溶液进行洗涤3次，得到经过三(2-羧乙基)-膦盐酸盐处理过的NK细胞，然后将1mL的RVG-NPs@F-DMC(浓度为20μg/mL)与1×105个过三(2-羧乙基)-膦盐酸盐处理过的NK细胞混合，37℃下孵育30分钟，磷酸缓冲盐溶液进行洗涤3次，制得NK纳米药物制剂(记为NK cell-NPs@F-DMC)。
实施例2：NK纳米药物制剂的制备
NK纳米药物制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)取5mg C17H15FO3(F-DMC)、5mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物(聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重均分子量为50k，聚乳酸-羟基乙酸共聚物中，聚乳酸结构与羟基乙酸结构的摩尔比为1：1)、5mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇中的聚乙二醇为聚乙二醇2000)与1mL有机溶剂(有机溶剂为乙醇和二甲基亚砜的混合物，乙醇与二甲基亚砜的体积比为1：9)混合，在功率为30W的超声条件下滴加10mL超纯水分散，然后透析(透析是采用透析袋进行，且采用超纯水透析48小时，透析袋的截留分子量为3500Da)，制得NPs@F-DMC；
(2)取2μg靶向肽RVG29与步骤(1)制备的NPs@F-DMC混合1小时，超滤游离的靶向肽RVG29，制得RVG-NPs@F-DMC；
(3)将数量为2×106个的NK细胞加入含有三(2-羧乙基)-膦盐酸盐的磷酸缓冲盐溶液(三(2-羧乙基)-膦盐酸盐的浓度为0.1mg/mL，磷酸缓冲盐溶液的体积为3mL)中，37℃下孵育45分钟，用磷酸缓冲盐溶液进行洗涤3次，得到经过三(2-羧乙基)-膦盐酸盐处理过的NK细胞，然后将1mL的RVG-NPs@F-DMC(浓度为20μg/mL)与1×105个过三(2-羧乙基)-膦盐酸盐处理过的NK细胞混合，37℃下孵育30分钟，磷酸缓冲盐溶液进行洗涤3次，制得NK纳米药物制剂(记为NK cell-NPs@F-DMC)。
产品效果测试方法如下：
1.NK纳米药物制剂ROS响应释药实验
用质量比为2％的近红外荧光染料ICG代替F-DMC，制得标记纳米药物制剂(记为RVG-NPs@ICG)，进一步制得标记的NK纳米药物制剂(记为NK cell-NPs@ICG)。将标记的NK纳米药物制剂(NK cell-NPs@ICG)与含ROS的培养基(400mM的H2O2和3.2μM的氯化铜)、以及不含ROS的培养基在37℃共孵育。在不同的时间点进行低速离心(300g，3分钟)，取一定体积的上清液测量其荧光强度，并向共孵育培养皿中补入相同体积的培养基，通过如下公式计算不同时间点的NPs@ICG释放量，结果如图6所示。
NPs@ICG累计释放率
式中:Ve为置换体积，Vo为释放液的体积，Fi:为第i次置换取样时释放液中荧光强度。
2.细胞活力实验
(1)96孔板加入100μL细胞悬液，每孔5000个细胞。
(2)细胞培养箱培养24h后对细胞进行实验处理。
(3)到达时间后，弃上清，将CCK-8检测试剂与完全培养基按1:9的比例配置工作液，完全移除旧培养基，每孔加入100μL工作液，放细胞培养箱温育。
(4)温育1h后，用450nm波长测试吸光度。
3.电镜检测
透射电镜检测实验步骤如下：
(1)2.5％戊二醛的0.1M PBS固定液常温固定1小时，0.1M PBS漂洗3次。
(2)使用1％四氧化锇染色30分钟，蒸馏水冲洗三次，每次15分钟。
(3)依次用50％、70％、90％和100％的酒精4℃脱水，每个梯度15-20分钟。
(4)丙酮/包埋剂(1:1)，室温1小时，丙酮/包埋剂(1:3)，4℃过夜，纯包埋剂，4℃过夜。
(5)树脂渗透样本在65℃烘箱内固化24小时。
(6)超微切片机切片，厚度50-100nm。
(7)3％醋酸铀-枸橼酸铅双染色。
(8)透射电镜观察、拍照。
4.PD模型制备及药物治疗
PD模型应用大脑定位注射AAV-A53Tα-Syn病毒。大脑定位注射步骤如下：C57BL/6J小鼠吸入异氟烷麻醉后，俯卧位将小鼠固定在小鼠脑立体定位仪上，门齿低于耳杆2.3mm，保证前后囟在同一水平面上。剪去头部毛发，用碘伏消毒头部皮肤，依次剪开头皮，剥离骨膜。黑质坐标为前囟后3.0mm，中线旁开1.3mm，骨膜下4.7mm。注射对照病毒或者AAV-A53Tα-Syn病毒0.5μL。注射完毕，停针10min，缓慢拔针，缝一针，保暖。肌肉注射青霉素。清醒后置笼喂养。病毒注射完1个月后，尾静脉给予PBS、NK细胞(NK Cell)、纳米包载F-DMC(NPs@F-DMC)，NK细胞连接F-DMC(NK Cell-NPs@F-DMC)，隔天一次，一共治疗8次。最后一次治疗结束后，进行行为学等检测。
5.行为学实验
(1)旷场实验：旷场箱为长50cm、宽50cm、高40cm且内壁涂黑的正方形敞箱，且敞箱顶部人工给予光照，敞箱被分为中心区域(长25cm、宽25cm)和外周区域。实验开始时将小鼠放置于敞箱正中央，且保持每只小鼠位置和方向一致，让小鼠在敞箱中自由活动15min。使用Smart 3.0视频跟踪软件记录小鼠运动的运动速度等。
(2)滚轴实验：滚轴实验需要动物在滚轴上保持平衡并连续运动，是广泛采用的检测运动协调性的实验，滚轴直径6cm，转速20r/min，小鼠适应5次后，每次检测间隔1min，连续测5次取平均值。
(3)爬杆实验：将一直径为2cm的泡沫塑料小球固定于一根长50cm、直径1cm的木杆顶端，木杆上缠2层纱布以防打滑。持小鼠尾部将其头向下置于杆顶(以小鼠双后肢置于球上为准)，让其自然爬下，小鼠自站于杆顶至双前肢接触杆底平台为爬完全长。在造模后各组分别取一定数量小鼠进行爬杆实验，观察小鼠行为学改变，记录爬杆时间。
(4)悬挂实验：自制有机玻璃试验箱，水平放置的金属杆直径1.5mm，距地面30cm，金属杆上方1cm加盖，以避免小鼠翻坐于金属杆上，实验中小鼠悬挂于金属杆上，使其前爪握住金属杆，保持10s。悬挂得分计算如下：小鼠两只后爪握住杆得3分；小鼠一只后爪握住杆得2分；小鼠未能用双后爪握住杆得1分；跌落小鼠得分为0。
6.免疫印迹杂交实验
提取细胞的蛋白样品，运用BCA试剂盒测定蛋白浓度，按一定比例加入上样缓冲液，100℃沸水浴5min。电泳后将蛋白转移至PVDF(聚偏二氟乙烯)膜。室温下，PVDF膜用TBST缓冲液(即Tris盐缓冲液)漂洗5min，5％牛血清白蛋白封闭液封闭2h，TBST缓冲液漂洗3次，每次5min。一抗4℃孵育过夜。TBST缓冲液漂洗膜3次，每次5min，再将膜与二抗室温下孵育1h，TBST缓冲液漂洗。将化学发光试剂A液与B液等量混合，孵育PVDF膜1min，在曝光仪上进行曝光。
7.免疫组织化学染色
小鼠吸入异氟烷麻醉后，应用预冷生理盐水和4％多聚甲醛进行灌注。取小鼠大脑置于4％多聚甲醛4℃固定约6h，依次移入20％、30％蔗糖溶液于4℃冰箱中梯度脱水，OCT包埋剂包埋组织，恒冷冰冻切片机连续冠状切片。切片置于0.01M枸橼酸盐缓冲液染色缸中，98℃水浴10～15min，自然冷却至室温，PBS冲洗3次，每次5min。0.3％ Triton和5％ BSA破膜封闭30min，PBS冲洗3次，每次5min。滴加一抗，4℃湿盒内过夜，第二天，从冰箱拿出后室温复温45min，切片滴加二抗，37℃孵育60min，PBS洗涤3次，每次5min。滴加DAB显色液于切片，室温，镜下检测反应时间，自来水流水冲洗。苏木素复染2min，盐酸酒精分色1次，自来水流水冲洗。梯度酒精脱水后，树胶封片，镜检。
8.免疫荧光染色
切片经过PBS漂洗后，用含0.3％ Triton和5％ BSA的PBS液在37℃下破膜封闭1h，一抗4℃孵育过夜。PBS洗涤3次后二抗孵育l h，阴干，甘油封片。在激光共聚焦显微镜下扫描，计算机数据采集，数字成像。
产品效果测试结果如下：
1.F-DMC促进自噬的细胞实验验证
培养多巴胺神经元细胞系MN9D，加入不同浓度的F-DMC(0、5、10、50和100μM)，将雷帕霉素(10μM)作为阳性对照。培养24小时后，通过免疫印迹杂交和电镜等实验进行观察，结果如图2(图2中的“Ctrl”表示雷帕霉素阳性对照，LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62、GAPDH表示蛋白质)所示。
图1为F-DMC与DMC的结构图；图1中的A图表示DMC的二维结构，B表示F-DMC的二维结构。
图2为F-DMC显著促进多巴胺能神经元MN9D细胞的自噬水平图。从图2可以看出F-DMC可以呈现浓度依赖性地促进MN9D细胞自噬的产生，具体表现为LC3Ⅱ/Ⅰ比例的增加(参见图2中的A图)。并且，在同等浓度(100μM)下，F-DMC较DMC显著促进自噬产生(参见图2中的B图)。应用透射电镜观察，F-DMC显著促进了自噬溶酶体的生成，具体表现为溶酶体数目的增加(参见图2中的C图)。细胞活力实验，显示不同浓度的F-DMC未显示有细胞毒性，证实了该药物的安全性(参见图2中的D图)。
2.F-DMC显著促进病理性α-synuclein的清除和降解
应用人源性α-synuclein纤维体(hα-Syn)处理MN9D细胞，加入F-DMC和DMC(100μM)，培养24小时，结果如图3所示。
图3(图3中的“Ctrl”表示雷帕霉素阳性对照)为F-DMC显著促进多巴胺能神经元MN9D细胞对于病理性α-synuclein的清除效果图；从图3可以看出，与DMC相比，F-DMC可以显著清除α-synuclein纤维体(表现为降低磷酸化α-synuclein表达)(参见图3中的A图)。并且50和100μM的F-DMC可显著清除磷酸化α-synuclein和降低内源性α-synuclein表达，显示了较好的降解α-synuclein作用(参见图3中的B图)。
3.NK纳米药物制剂中间物的表征
实施例1制备的NPs@F-DMC和RVG-NPs@F-DMC，利用Zetasizer Nano ZS仪器检测粒径，结果如图4所示。
图4为实施例1制备的NPs@F-DMC和RVG-NPs@F-DMC的粒径检测结果。从图4(图4中的“Size”表示尺寸，“PDI”表示多分散系数)可以看出，NPs@F-DMC和RVG-NPs@F-DMC的粒径分布在80-300nm之间(参见图4中的A图)，其中平均粒径在160.0±6.9nm和167.3±6.5nm(参见图4中的B图)。PDI多分散系数分别是0.445和0.403(参见图4中的C图)。
4.NK纳米药物制剂扫描电镜表征结果
图5为NK细胞和实施例1制备的NK纳米药物制剂的扫描电镜图；图5中的“NK cell”表示NK细胞，“NK cell-NPs@F-DMC”表示实施例1制备的NK纳米药物制剂，在NK细胞表面接枝包载的药物如图5箭头所示。
5.NK纳米药物制剂ROS响应释药实验
用质量比为2％的近红外荧光染料ICG代替F-DMC，参照实施例1的方法，制得荧光标记的纳米药物制剂(记为RVG-NPs@ICG)，进一步制得荧光标记的NK纳米药物制剂(记为NKcell-NPs@ICG)。将荧光标记的NK纳米药物制剂(NK cell-NPs@ICG)与含ROS的培养基(400mM的H2O2和3.2μM的氯化铜)、以及不含ROS的培养基在37℃共孵育。在不同的时间点进行低速离心(300g，3分钟)，取一定体积的上清液测量其荧光强度，并向共孵育培养皿中补入相同体积的培养基，通过如下公式计算不同时间点的NPs@ICG累计释放率，结果如图6所示。
NPs@ICG累计释放率
式中:Ve为置换体积，Vo为释放液的体积，Fi:为第i次置换取样时释放液中荧光强度。
图6为荧光标记的NK纳米药物制剂(NK cell-NPs@ICG)ROS响应释药性能检测结果；从图6中可以看出，与无ROS(即-ROS)的PBS处理组相比，在ROS(即+ROS)存在的条件下，纳米药物制剂从细胞表面脱落的12小时，脱落效率超出80％，证明该体系具有良好的ROS响应释放能力。
6.NK Cell-RVG-NPs@F-DMC显著改善了AAV-A53Tα-Syn模型小鼠的运动行为障碍和多巴胺神经元损伤
应用AAV-A53Tα-Syn制备PD小鼠模型，尾静脉注射药物进行治疗。实验分为5组，分别是对照组给予PBS(野生型，wildtype，简称WT)，一个模型组给予PBS(AAV-A53Tα-Syn)，一个模型组给予NK细胞(AAV-A53Tα-Syn+NK Cell)，一个模型组给予实施例1制备的NPs@F-DMC(AAV-A53Tα-Syn+NPs@F-DMC)，一个模型组给予实施例1制备的NK纳米药物制剂(AAV-A53Tα-Syn+NK Cell-RVG-NPs@F-DMC)，然后进行了旷场实验、爬杆实验、滚轴实验、悬挂实验，结果如图7所示。
图7和图8为实施例1的NK纳米药物制剂治疗改善了AAV-A53Tα-Syn模型小鼠的运动行为障碍和多巴胺神经元损伤结果；从图7可以看出，NK Cell-RVG-NPs@F-DMC实验组显著增加了小鼠在旷场实验中的运动速度(参见图7中A图)。
此外，治疗后小鼠的爬杆时间显著降低(参见图7中B图)，在滚轴运动时间和悬挂时间显著延长(参见图7中C、D图)。这些行为学实验证实，PD模型小鼠的运动行为障碍显著得到缓解。通过免疫组化染色检测其对多巴胺神经元的影响，结果表明，和其他组相比，NKCell-RVG-NPs@F-DMC治疗后多巴胺神经元数目明显增加，说明F-DMC可以显著改善PD模型中神经元活性(参见图8)。
7.NK Cell-RVG-NPs@F-DMC显著改善了AAV-A53Tα-Syn模型小鼠的病理性α-synuclein表达
应用免疫印迹杂交实验进一步证实，结果如图9所示。
图9为实施例1的NK纳米药物制剂治疗降低了AAV-A53Tα-Syn模型小鼠的病理性α-synuclein表达。
从图9可以看出，较模型组(AAV-A53Tα-Syn组)，NK Cell-RVG-NPs@F-DMC治疗可显著增加TH表达，减少磷酸化α-synuclein表达，显示NK Cell-RVG-NPs@F-DMC给药体系对多巴胺神经元的保护效应(参见图9中A图)。通过免疫荧光发现，NK Cell-RVG-NPs@F-DMC治疗后可以显著降低病理性α-synuclein的表达(参见图9中B图，箭头指示为磷酸化α-synuclein)。从而证实，该NK Cell-RVG-NPs@F-DMC给药体系可以显著清除病理性α-synuclein，从而对PD模型发挥神经保护作用。

Claims (10)

1.NK纳米药物制剂，其特征在于，包括NK细胞和接枝在所述NK细胞表面的C17H15FO3。
2.根据权利要求1所述的NK纳米药物制剂，其特征在于，所述NK纳米药物制剂还包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物和/或活性氧响应性磷脂，所述C17H15FO3通过聚乳酸-羟基乙酸共聚物和/或活性氧响应性磷脂包覆后，然后与所述NK细胞进行接枝。
3.根据权利要求1所述的NK纳米药物制剂，其特征在于，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重均分子量为30k-60k。
4.根据权利要求1所述的NK纳米药物制剂，其特征在于，所述活性氧响应性磷脂为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇。
5.权利要求1-4任一项所述的NK纳米药物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取C17H15FO3、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、活性氧响应性磷脂与有机溶剂混合，超声分散，加水，透析，制得NPs@F-DMC；
(2)将靶向肽RVG29与步骤(1)制备的NPs@F-DMC混合，制得RVG-NPs@F-DMC；
(3)将NK细胞加入含有三(2-羧乙基)-膦盐酸盐的磷酸缓冲盐溶液中，孵育，洗涤，得到经过三(2-羧乙基)-膦盐酸盐处理过的NK细胞，然后将所述RVG-NPs@F-DMC与过三(2-羧乙基)-膦盐酸盐处理过的NK细胞混合，孵育，制得NK纳米药物制剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述C17H15FO3、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、活性氧响应性磷脂的质量比为1：(0.8-3)：(0.8-3)。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，取1-5μg靶向肽RVG29与步骤(1)制备的NPs@F-DMC混合0.5-4小时，超滤，去除游离的靶向肽RVG29，制得所述RVG-NPs@F-DMC。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述含有三(2-羧乙基)-膦盐酸盐的磷酸缓冲盐溶液中，三(2-羧乙基)-膦盐酸盐的浓度为0.1-1mg/mL，磷酸缓冲盐溶液的体积为1-15mL。
9.权利要求1-4任一项所述的NK纳米药物制剂在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。
10.一种治疗帕金森病的药物，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的NK纳米药物制剂。
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