CN116942680A - 一种治疗耐药的非小细胞肺癌的药物组合物 - Google Patents

一种治疗耐药的非小细胞肺癌的药物组合物 Download PDF

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CN116942680A CN202311162517.6A CN202311162517A CN116942680A CN 116942680 A CN116942680 A CN 116942680A CN 202311162517 A CN202311162517 A CN 202311162517A CN 116942680 A CN116942680 A CN 116942680A
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Abstract

本发明公开了一种治疗耐药的非小细胞肺癌(Non‑small cell lung can cer,NSCLC)的药物组合物，该药物组合物包括路路通酸和吉非替尼，且吉非替尼与路路通酸的摩尔比为1:2、1:1或2:1，路路通酸和吉非替尼联合对NSCLC细胞的抑制率显著高于单独用药，吉非替尼与路路通酸联合使用，可增加对细胞的杀伤作用以及对细胞增殖和迁移的抑制作用，同时促进细胞凋亡，本发明的实验结果为路路通酸和吉非替尼的临床联合用药及治疗NSCLC的有效方案提供了理论依据，在医药学领域有广阔的应用前景。

Description

一种治疗耐药的非小细胞肺癌的药物组合物
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种治疗耐药的非小细胞肺癌的药物组合物。
背景技术
肺癌是全世界发生率及死亡率均排首位的恶性肿瘤。根据组织病理学特点将肺癌分为小细胞肺癌(small cell lung can cer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small celllung can cer,NSCLC)，NSCLC占所有肺癌的85％。
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)与细胞增殖、转移、凋亡等多种信号传导通路有关，其含有一个细胞膜外与配体结合的结构域、一个跨膜区域、一个近膜核定位信号和一个细胞质酪氨酸激酶结构域，使酪氨酸激酶结构域激活的EGFR基因突变的发现使NSCLC进入小分子酪氨酸激酶抑制剂靶向治疗时代。
表皮生长因子受体被EGF、TGFα、双向调节蛋白、肝素结合型EGF等激活后发生构象改变形成二聚体，二聚化会激活酪氨酸激酶活性，使其下游调节细胞增殖、生长和凋亡的Ras通路、PI3K/AKT通路、STAT3通路激活，从而促进NSCLC的发生和发展。
表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)分为三代，其代表药物分别是吉非替尼、阿法替尼和奥希替尼，它们通过与EGFR的酪氨酸激酶域的ATP结合位点结合阻断EGFR磷酸化，从而阻止下游通路的激活，达到抑制细胞生长和增殖的效果。
通过EGFR-TKI治疗获益的患者在治疗一段时间后都会不可避免的对EGFR-TKI产生耐药，因此患者无法通过EGFR-TKI的治疗达到肿瘤完全缓解。EGFR的下游通路信号传导及转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription3,STAT3)的旁路途径激活是EGFR-TKI治疗耐药的重要原因。STAT3被各种途径磷酸化激活后可形成二聚体进入细胞核与特定的调控元件结合诱导靶基因转录。磷酸化的STAT3(p-STAT3)的高表达是NSCLC预后不良的信号，在临床病例中发现p-STAT3的含量与磷酸化的EGFR(p-EGFR)的含量有强烈的相关性，EGFR突变型NSCLC细胞p-STAT3的表达明显高于EGFR野生型。STAT3的激活受到表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、IL-6、IL-8、IL-10、JAKs和Src酪氨酸激酶等多种细胞因子、生长因子和细胞内部酪氨酸激酶的调控，具有强大的代偿激活途径。STAT3最常见的代偿激活原因是肿瘤微环境中IL-6的浓度增加。研究发现肺癌患者的血清中有更高水平的IL-6，发生EGFR突变的NSCLC细胞系也会分泌更多的IL-6，阿法替尼还可作用于成纤维细胞分泌IL-6。
由于各种原因导致的IL-6总量增加和肿瘤微环境中复杂的生长因子、细胞因子以及细胞内的其他酪氨酸激酶的激活，仅用单纯的EGFR-TKI治疗不能有效的抑制STAT3的激活，从而导致EGFR-TKI治疗耐药。由于STAT3激活具有强大的代偿途径，仅抑制某一个STAT3的上游途径不能有效抑制STAT3的激活，而抑制多个上游途径又难以实现，直接作用于STAT3的抑制剂是抑制STAT3激活的最佳选择。目前暂时没有用于临床的STAT3直接抑制剂，因此研究开发新的STAT3抑制剂对NSCLC的治疗是非常有意义的。
据《中国药典》记载路路通为金缕梅科植物枫香树干燥成熟果序，具有祛风活络、利水、通经的作用，路路通酸是路路通的主要成分。已有研究表明路路通酸可以增加紫杉醇抗乳腺癌的疗效，对胃癌、白血病、前列腺癌、肝癌等也有一定的治疗作用。但是至今为止，没有关于吉非替尼和路路通酸联合用于治疗NSCLC的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗耐药的非小细胞肺癌的药物组合物，该药物组合物首次提出吉非替尼和路路通酸联合用于治疗非小细胞肺癌，以解决治疗非小细胞肺癌中耐药性的问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
路路通酸和吉非替尼联合在治疗表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂耐药的非小细胞肺癌的药物中的应用。
本发明提供的路路通酸能够增强吉非替尼在治疗EGFR-TKI获得性耐药的NSCLC中的应用，两药联用增强吉非替尼的疗效，为老药新用提供依据。
所述表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂耐药的非小细胞肺癌为吉非替尼继发耐药的非小细胞肺癌。
进一步地，所述药物中吉非替尼与路路通酸的摩尔比为1:2、1:1或2:1。
本发明从临床实际出发，首次考察了吉非替尼与路路通酸联合用药对耐药NSCLC的治疗作用。在H1975细胞上进行的体外实验表明，吉非替尼与路路通酸联合使用，可增加对细胞的杀伤作用和对细胞增殖和迁移的抑制作用，同时促进细胞凋亡。
本发明首次探究了吉非替尼与路路通酸联合使用发挥协同作用的机制。通过WB实验发现，其发挥协同作用是由于吉非替尼对STAT3Tyr705磷酸化位点的磷酸化不具有抑制作用，而路路通酸可以弥补这一不足。
附图说明
图1为吉非替尼联合路路通酸增强H1975细胞毒性作用；A-C为不同比例的吉非替尼联合路路通酸对H1975细胞存活率影响，D为吉非替尼与路路通酸联合使用的联合指数。
图2为吉非替尼与路路通酸联合使用的时间依赖性。
图3为Edu细胞增殖实验显微镜镜下拍摄图片(200X)。
图4为Edu细胞增殖实验结果；A为药物处理24h；B为药物处理48h。
图5为细胞迁移实验；A为显微镜镜下拍摄图片(40X)；B为迁移细胞数统计分析结果(400X)。
图6为细胞凋亡实验；A为细胞凋亡流式分析图；B为整体细胞凋亡率；C为各期细胞数量百分比。
图7为H1975细胞内p-STAT3Tyr705含量；A为统计结果，B为蛋白条带示例图。
图8为H1975细胞内p-STAT3Ser727含量；A为统计结果，B为蛋白条带示例图。
图9为H1975细胞内tSTAT3含量；A为统计结果，B为蛋白条带示例图。
图10为肿瘤生长曲线。
具体实施方式
本实施例首次提出将吉非替尼与路路通酸联合用药对耐药NSCLC的治疗作用，并在H1975细胞上进行的体外实验。
本实施例研究吉非替尼与路路通酸联合使用是否存在协同抗耐药NSCLC的作用。以吉非替尼耐药的NSCLC细胞H1975细胞系为研究对象，首先通过MTT实验考察不同浓度的吉非替尼、路路通酸单独使用时对细胞存活率的影响，计算相应的IC50，同时筛选一个路路通酸的安全给药浓度。然后通过MTT实验考察不同浓度的吉非替尼联合一个安全浓度的路路通酸(细胞存活率＞80％)对细胞存活率的影响，与单独使用吉非替尼相比IC50是否下降。最后根据吉非替尼与路路通酸IC50的比值设定两药的联合摩尔比，根据Chou-Talalay法(中位药效法)原理，通过MTT实验考察吉非替尼联合路路通酸细胞抑制率的联合指数(Combinationindex，CI)，通过判断CI的大小评估两药是否具有协同作用。
(1)吉非替尼与路路通酸联合使用具有协同增强H1975细胞毒性作用。
材料：胎牛血清(FBS)购于美国ZetaLife，RPMI-1640培养基购于美国Gibco，二甲基亚砜(DMSO)购于美国Amresco，胰酶、青链霉素双抗、磷酸盐缓冲液(PBS)、EDTA购于美国索莱宝生物技术有限公司，噻唑蓝(MTT)购于大连美仑生物技术有限公司，路路通酸购于上海麦克林生化科技有限公司，吉非替尼购于上海阿拉丁生化科技有限公司。
方法：取对数生长期的H1975细胞，使用含EDTA的胰酶消化并收集细胞，使用细胞计数板对细胞进行计数，按1ⅹ104个/孔的细胞密度接种于96孔板，待细胞贴壁后弃去培养基，每孔加入100μL含吉非替尼和路路通酸的含药培养基，其中路路通酸与吉非替尼按一定的摩尔比联合，设置摩尔比的依据为吉非替尼与路路通酸单独处理H1975细胞时的IC50，另设空白培养基对照孔和不含细胞的空白培养基对照孔，每组设置6复孔。给药后继续培养24h后弃去培养液，每孔加入100μLMTT浓度为0.5mg/mL的PBS溶液，继续培养4h。培养完成后弃去MTT溶液，每孔加入100μLDMSO，置于37℃摇床以80rpm速度振荡10min。使用酶标仪于490nm波长处检测定各孔吸光度值，计算细胞存活率。
数据处理：采用MicrosoftExcel2019对数据进行整理，使用Graphadprism8.0软件对数据进行统计学分析和作图。根据Chou-Talalay的原理判断吉非替尼与路路通酸的协同作用，使用Compusyn软件计算吉非替尼与路路通酸的联合指数(Combinationindex，CI)，当CI＞1时表示拮抗作用，CI＝1表示作用相加，CI＜1表示协同/增敏作用，CI＜0.3表示强协同/增敏作用。
结果：单独使用吉非替尼或路路通酸时对H1975细胞有杀伤作用，但是达到一定浓度后(吉非替尼35μM、路路通酸20μM)这种杀伤作用趋于饱和，对H1975细胞的杀伤作用不再随浓度的增大而增大。
如图1所示，吉非替尼与路路通酸联合使用后，对H1975细胞的杀伤作用显著增加，在药物高浓度的情况下可完全杀灭细胞；其中，吉非替尼与路路通酸摩尔比为2:1和1:1时细胞毒性更强，如图1(B)和(C)所示，在吉非替尼浓度为40μM时几乎可完全杀灭细胞。
从图1(D)可知在细胞低抑制率时两药联合使用的CI＞1，为拮抗作用；而随着对H1975细胞杀伤作用增加，两药的CI＜1，即为协同作用，当对H1975细胞的抑制率大于0.8时，吉非替尼与路路通酸摩尔比为2:1联合呈强协同作用。其中吉非替尼与路路通酸摩尔比为2:1时，两药的协同作用最好，在细胞抑制率为0.3时即开始呈现出协同作用。
(2)吉非替尼与路路通酸联合使用对H1975的细胞毒性呈时间依赖性。
材料：胎牛血清(FBS)购于美国ZetaLife，RPMI-1640培养基购于美国Gibco，二甲基亚砜(DMSO)购于美国Amresco，胰酶、青链霉素双抗、磷酸盐缓冲液(PBS)、EDTA购于美国索莱宝生物技术有限公司，噻唑蓝(MTT)购于大连美仑生物技术有限公司，路路通酸购于上海麦克林生化科技有限公司，吉非替尼购于上海阿拉丁生化科技有限公司。
方法：取对数生长期的H1975细胞，使用含EDTA的胰酶消化并收集细胞，使用细胞计数板对细胞进行计数，按1ⅹ104个/孔的细胞密度接种于96孔板，待细胞贴壁后弃去培养基，每孔加入100μL含吉非替尼和路路通酸的含药培养基，其中吉非替尼与路路通酸的摩尔比为2:1，分别用药物处理24h、48h、72h。其中处理4h组于给药24h后更换新鲜的含药培养基，处理72h组于给药24h、48h后更换新鲜的含药培养基。另设空白培养基对照孔和不含细胞的空白培养基对照孔，每组设置6复孔。孵育至规定时间后弃去培养基，每孔加入100μLMTT浓度为0.5mg/mL的PBS溶液，继续培养4h。培养完成后弃去MTT溶液，每孔加入100μLDMSO，置于37℃摇床以80rpm速度振荡10min。使用酶标仪于490nm波长处检测定各孔吸光度值，计算细胞存活率。
数据处理：采用MicrosoftExcel2019对数据进行整理，使用Graphadprism8.0软件对数据进行统计学分析和作图。
结果：吉非替尼与路路通酸摩尔比为2:1，分别处理24h、48h和72h，观察对H1975细胞存活率的影响。如图2所示，随着处理时间的延长，两药联合使用对H1975细胞的杀伤作用越来越强，处理24h时完全杀灭细胞所需要的浓度(以吉非替尼浓度计)为35μM，处理48h和72h完全杀灭细胞所需的浓度仅为20μM，较24h所需浓度减少15μM。同在药物浓度为10μM时，处理48h时细胞存活率＞20％，而处理72h时细胞存活率＜20％，说明处理72h对H1975细胞的毒性大于处理48h。
实验结果表明，吉非替尼与路路通酸联合使用对H1975细胞的毒性具有时间依赖性，适合长期联合使用。
本实施例研究吉非替尼与路路通酸联合使用对细胞增殖、迁移、凋亡的影响。通过Edu细胞增殖实验考察吉非替尼与路路通酸联合使用是否可以协同抑制H1975细胞增殖；通过Transwell细胞迁移实验考察吉非替尼与路路通酸联合使用对H1975细胞迁移能力的影响；通过Annexin-VAbFluorTM488/PI双染色实验考察吉非替尼与路路通酸联合使用对H1975细胞凋亡的影响。
(3)Edu细胞增殖实验
材料：胎牛血清(FBS)购于美国ZetaLife，RPMI-1640培养基购于美国Gibco，二甲基亚砜(DMSO)购于美国Amresco，胰酶、青链霉素双抗、磷酸盐缓冲液(PBS)、EDTA购于美国索莱宝生物技术有限公司，路路通酸购于上海麦克林生化科技有限公司，吉非替尼购于上海阿拉丁生化科技有限公司，Edu试剂盒、4％多聚甲醛购于上海碧云天生物医药有限公司，TritonX-100购于Biofroxx。
方法：取对数生长期的H1975细胞，使用含EDTA的胰酶消化并收集细胞，以2.5ⅹ105个/孔的细胞密度接种于24孔板中，培养至细胞融合度达70％左右时弃去培养基，加入含药培养基，并同时设置空白对照组，每组设3复孔，继续培养24h、48h。
培养24h、48h后取出细胞板，吸出一半的培养基然后补进相同体积的2XEdu工作溶液(Edu浓度为20μM)，继续培养2h，使Edu标记正在进行DNA复制的细胞。Edu标记完成后，去除培养液，并使用预冷的PBS清洗3遍去除剩余的Edu试剂。然后加入0.4％的多聚甲醛溶液室温固定15min。固定完成后去除固定液并用预冷PBS清洗去除剩余的固定液，然后加入含0.3％TritonX-100的PBS溶液室温孵育15min，通透细胞。
通透细胞期间，按Edu试剂盒说明书配制Click反应液。通透细胞完成后去除通透液，用预冷的PBS清洗3遍去除剩余的通透液，然后加入100μLClick反应液，轻轻摇晃培养板使反应液均匀覆盖细胞，室温避光孵育30min。孵育完成后去除反应液，并用预冷PBS清洗剩余反应液，然后加入1XHoechst3342溶液，室温孵育10min。孵育完毕后，去除1XHoechst3342溶液，并用预冷PBS洗3遍，随后在倒置荧光显微镜下检测荧光并拍照。
Hoechst3342溶液是一种细胞核染料，可与所有细胞的细胞核结合，与细DNA结合后发射蓝色荧光。被Edu标记的增殖期细胞发射绿色荧光，细胞增殖率＝绿色荧光细胞数/蓝色荧光细胞数ⅹ100％。
数据处理：使用ImageJ软件对Edu实验进行细胞计数；采用MicrosoftExcel2019对数据进行整理；使用Graphadprism8.0软件对数据进行统计学分析和作图。
结果：设置7个对照组：空白对照组、吉非替尼10μM、吉非替尼20μM、路路通酸5μM、路路通酸10μM、吉非替尼10μM+路路通酸5μM、吉非替尼20μM+路路通酸10μM。6个对照组均处理24h和48h，观察Edu细胞增殖情况。
处理H1975细胞24h，结果如图3(A)和图4(A)所示，空白对照组细胞增殖率为20.92％。
吉非替尼浓度为10μM、20μM时细胞增殖率为4.00％和2.36％，较空白对照组吉非替尼浓度为10μM、20μM的细胞增殖降低了5.23倍和8.86倍。
路路通酸浓度为5μM和10μM时细胞增殖率为25.66％和22.72％，与空白组的细胞增殖率相似。
吉非替尼10μM+路路通酸5μM和吉非替尼20μM+路路通酸10μM组的细胞增殖率为4.09％和2.47％，与同浓度的吉非替尼相比，细胞增殖率没有太大变化，与同浓度的路路通酸相比，细胞增殖率降低了6.27倍和9.19倍，差异具有统计学意义。
处理H1975细胞48h，结果如图3(B)和图4(B)所示，空白对照组细胞增殖率8.74％。
吉非替尼浓度为10μM、20μM时细胞增殖率为1.57％和0.77％，较空白对照组细胞增殖率降低了5.57倍和11.35倍。
路路通酸浓度为5μM和10μM时细胞增殖率为4.76％和7.43％，较空白组降低了1.83和1.17倍。
吉非替尼10μM+路路通酸5μM和吉非替尼20μM+路路通酸10μM组的细胞增殖率为0.75％和0.67％，与同浓度的吉非替尼相比，细胞增殖率分别下降了2.09倍和1.15倍，与同浓度的路路通酸相比，细胞增值率显著下降，分别降低了6.34倍和11.09倍，差异具有统计学意义。
从以上实验结果可知，吉非替尼对H1975细胞的增殖有较好的抑制效果，且随着给药浓度的增加和处理时间的延长而增强；路路通酸对H1975细胞的增殖抑制效果弱于吉非替尼，路路通酸处理24h没有抑制细胞增殖的作用，但是对细胞的杀伤作用更强。如图3所示，路路通酸处理后，细胞的密度较其他组更低。随着处理时间的延长，路路通酸表现出对细胞增殖的抑制作用。处理48h时，由于路路通酸浓度为10μM时对细胞的杀伤作用更强，导致细胞总数下降，使细胞增殖率高于路路通酸浓度为5μM时。在处理24h时，两药联合使用对细胞增殖的抑制作用大于路路通酸单独使用，与吉非替尼单独使用的增殖抑制作用区别不大。处理48h时，两药联合使用的细胞增殖率低于吉非替尼、路路通酸单独使用，说明两者联合使用对细胞的增殖具有协同抑制作用。联合使用结合了吉非替尼对细胞增殖抑制作用强和路路通酸对细胞杀伤作用强的优点，增强了对肿瘤的抑制作用。
(4)细胞迁移实验
材料：胎牛血清(FBS)购于美国ZetaLife，RPMI-1640培养基购于美国Gibco，二甲基亚砜(DMSO)购于美国Amresco，胰酶、青链霉素双抗、磷酸盐缓冲液(PBS)、EDTA购于美国索莱宝生物技术有限公司，路路通酸购于上海麦克林生化科技有限公司，吉非替尼购于上海阿拉丁生化科技有限公司，4％多聚甲醛购于上海碧云天生物医药有限公司，结晶紫染色液购于北京索莱宝生物技术有限公司。
方法：本实验使用的是24孔Transwell小室，孔径为8μM。取对数生长期的H1975细胞，用不含血清的培养基重悬细胞，控制细胞密度5ⅹ105个/mL。细胞悬液与同积体的2倍浓度的含药培养基混合均匀。在上室加入200μL的含药细胞悬液，下室加入含10％血清的含药培养基800μL，培养24h。同时设置空白对照组，每组设3复孔。
培养24h后，去除培养基，用预冷的PBS清洗3遍去除残余的培养基，然后将小室置于4％的多聚甲醛溶液中15min室温固定细胞。细胞固定完成后去除固定液，用0.5％的结晶紫溶液染色30min。染色完成后用预冷的PBS清洗多余的结晶紫，用棉签轻柔的擦除小室内侧的细胞，置于显微镜下观察，在400倍镜下随机选取5个视野拍照并计数穿过小室的细胞。
数据处理：使用ImageJ软件对细胞迁移实验进行细胞计数；采用MicrosoftExcel2019对数据进行整理；使用Graphadprism8.0软件对数据进行统计学分析和作图。
结果：设置4个对照组：空白对照组，吉非替尼20μM组、路路通酸10μM组及吉非替尼20μM+路路通酸10μM联合给药组。
如图5A所示，吉非替尼组、路路通酸组及联合给药组的细胞密度明显低于空白对照组，其中联合给药组细胞密度最低。对400倍显微镜下拍摄的图片进行细胞计数，空白组每个视野穿过的细胞数量约为84个。吉非替尼组每个视野穿过的细胞数约为32个，较空白组降低了2.63倍；路路通酸组每个视野穿过的细胞数量约为60个，较空白对照组降低1.38倍；联合给药组每个视野穿过的细胞数量约为14个，较空白对照组降低了6倍。联合给药组每个视野穿过的细胞数较吉非替尼组和路路通酸组分别降低了2.29倍和4.29倍，差异具有统计学意义。
以上实验结果说明，吉非替尼和路路通酸均具有抑制H1975细胞的迁移的能力，当两药联合使用时对H1975细胞迁移的抑制作用均强于单独使用一种药物时，两药联合使用可协同增强对H1975细胞迁移的抑制作用。
(5)Annexin-VAbFluorTM488/PI双染色细胞凋亡实验
材料：胎牛血清(FBS)购于美国ZetaLife，RPMI-1640培养基购于美国Gibco，二甲基亚砜(DMSO)购于美国Amresco，胰酶、青链霉素双抗、磷酸盐缓冲液(PBS)、EDTA购于美国索莱宝生物技术有限公司，路路通酸购于上海麦克林生化科技有限公司，吉非替尼购于上海阿拉丁生化科技有限公司，Annexin-VAbFluorTM488/PI试剂盒购于Abbkine。
方法：取对数生长期的H1975细胞，按5ⅹ105个/孔的细胞密度接种于12孔板中。培养至细胞融合度达到80-90％时弃去培养液，加入不同的含药培养基，继续培养24h。另设置一个空白对照组，每组设置3复孔。
培养24h后弃去培养基，用不含EDTA的胰酶消化收集细胞，并用预冷的PBS洗涤2次。离心后用100μL的1xAnnexin-VBindingBuffer(由5xAnnexin-VBindingBuffer加入去离子水稀释得到)重悬细胞，每100μL的细胞悬液中加入5μL的Annexin-VAbFluorTM488和2μLPI，轻柔混匀。室温避光孵育15min。染色孵育结束后加入400μL1xAnnexin-VBindingBuffer，轻柔混匀后置于冰上。在30min内使用流式细胞分析仪进行上机检测。
数据处理：使用FlowJo对细胞凋亡的流式检测数据进行分析绘图；采用MicrosoftExcel2019对数据进行整理；使用Graphadprism8.0软件对数据进行统计学分析和作图。
结果：设置4个给药组：空白对照组，吉非替尼20μM组，路路通酸10μM组，吉非替尼20μM+路路通酸10μM联合给药组。细胞经过药物处理和Annexin-VAbFluorTM488/PI双染色后，采用流式细胞分析仪上机检测。
将细胞分为四期，Q4为活细胞，Q2为晚期凋亡细胞，Q3为早期凋亡细胞，Q1为机械性损伤细胞。凋亡细胞总量为早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的总和，因此细胞凋亡率为Q2％+Q3％。
如图6所示，吉非替尼组和路路通酸组的细胞凋亡率较空白对照组显著升高，吉非替尼组的细胞凋亡率为7.69％，较空白对照组的2.94％升高2.61倍，路路通酸的细胞凋亡率为13.43％，较空白对照组升高4.57倍。联合给药组的细胞凋亡率为51.47％，显著高于单独用药组，且差异具有统计学意义。
联合给药组细胞凋亡率较单独使用吉非替尼组和路路通酸组分别升高了6.69倍和3.83倍。如图6C所示，联合用药可以升高H1975细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率，其中对晚期凋亡率的影响较大。
本实施例初步探索路路通酸与吉非替尼联合用药具有协同作用的机制。通过蛋白免疫印迹实验(Westernblotting，WB)考察吉非替尼、路路通酸单独使用与联合使用对H1975细胞内STAT3蛋白的影响。
(6)蛋白免疫印迹实验
材料：BCA蛋白定量试剂盒购于北京天根生化科技有限公司，Anti-Phospho-STAT3(Tyr705)RecombinantRabbitMonoclonalAntibody、Anti-Phospho-STAT3(Ser727)RecombinantRabbitMonoclonalAntibody购于杭州华安生物科技有限公司，STAT3抗体(F-2)购于SantaCruzBiotechnology，ECL显色液购于上海碧云天生物技术有限公司，GAPDHRabbitpAb一抗、GoatAnti-RabbitIgG-HRP购于武汉爱博泰克生物技术有限公司，PMSF、TEMED购于美国Sigma-Aldrich，RIPA裂解液购于北京索莱宝生物技术有限公司，Trisbase购于广州赛国生物科技有限公司，甘氨酸购于北京百灵威科技有限公司，NaCl购于天津瑞金特化学品有限公司，吐温20购于天津科密欧化学试剂有限公司，丙烯酰胺购于上海麦克林生化科技有限公司，脱脂奶粉购于广州赛国生物科技有限公司，蛋白Marker购于上海翊圣生物科技有限公司，PVDF膜购于美国Bio-RadLaboratories，路路通酸购于上海麦克林生化科技有限公司，吉非替尼购于上海阿拉丁生化科技有限公司。
方法：(1)细胞铺板和处理：取对数生长期的H1975细胞，按1.5ⅹ106个/孔接种于无菌的6孔板，待细胞贴壁且生长至80％融时，弃去培养基，分别加入不同的含药培养基，继续培养24h。同时设置空白对照组，每个组设置3复孔。
(2)细胞蛋白提取：药物处理结束后取出6孔板，弃去培养基，用预冷的PBS洗涤2-3次。每孔加入含1mMPMSF和1倍磷酸酶抑制剂混合物的RIPA裂解液，于冰上间断涡旋30min使细胞充分裂解。将细胞裂解液转移至离心管中，以12000rpm的转速在4℃离心10min，取上清液。使用BCA试剂盒测定细胞裂解液的蛋白浓度。将提取的细胞裂解液与5ⅹloadingbuffer按4：1的比例混合均匀，然后用沸水煮10min，-20℃保存。
(3)免疫印迹实验：配置SDS-PAGE凝胶，加蛋白样品至上样孔内，保证每孔上样的蛋白量为20-40μg，每块胶另设孔加入Marker，80V恒压跑至蛋白压缩成一条直线时，将电压调至120V，恒压跑至蛋白完全分离开为止(通过观察Marker颜色分开的情况)。PVDF膜用甲醇活化后覆盖在胶上，在转膜液中恒流300A转膜120min。转膜完成后，用TBST溶液将PVDF膜洗涤3次，然后把PVDF膜置于含5％脱脂奶粉的TBST中封闭2小时。封闭完成后，PVDF膜用TBST溶液洗涤3次，然后放入一抗溶液中，在摇床中4℃孵育过夜。一抗孵育完成后，用TBST溶液洗涤PVDF膜3次，然后将PVDF膜放入二抗溶液中，在摇床中室温孵育1h。二抗孵育完成后，PVDF膜依次用TBST溶液洗涤3遍，TBS溶液洗2遍。使用ELC化学发光试剂盒显影、SageCapture软件观察并采集图像。
数据处理：使用ImageJ软件对蛋白免疫印迹实验所得到的蛋白条带进行灰度值分析，采用MicrosoftExcel2019对数据进行整理，使用Graphadprism8.0软件对数据进行统计学分析和作图。
结果：STAT3有两个磷酸化位点，分别是Tyr705位点和Ser727位点，它们被磷酸化后使STAT3激活，促进细胞的增殖和存活。检测吉非替尼10μM、20μM，路路通酸5μM、10μM，以及吉非替尼10μM+路路通酸5μM、吉非替尼20μM+路路通酸10μM处理H1975细胞24h后细胞内磷酸化的STAT3(p-STAT3Tyr705、p-STAT3Ser727)的含量，以及总STAT3(tSTAT3)含量的影响。
从图7可知吉非替尼10μM、20μM处理H1975细胞24h对细胞内p-STAT3Tyr705含量的影响不大，与空白组相比差异没有统计学意义。路路通酸5μM、10μM处理H1975细胞24h，细胞内的p-STAT3Tyr705含量与空白对照组相比分别下降至58％和49％，差异具有统计学意义。两个联合用药组的p-STAT3Tyr705含量较空白组相比分别下降至34％和14％；与单独使用吉非替尼相比，细胞内p-STAT3Tyr705含量显著下降，差异具有统计学意义，与单独使用路路通酸相比，p-STAT3Tyr705的含量具有下降趋势，浓度较大的联合用药组下降趋势更明显，差异具有统计学意义。
从图8可知，吉非替尼、路路通酸处理H1975细胞后，细胞内p-STAT3Ser727含量较空白对照组均显著降低，差异具有统计学意义。
由图9可知，吉非替尼、路路通酸单独处理H1975细胞，对细胞内tSTAT3的含量影响不大，高浓度的联合用药组显著降低了细胞内的tSTAT3含量。
以上实验结果表明，吉非替尼和路路通酸单独使用不影响细胞内tSTAT3含量，两者均能有效抑制STAT3Ser727磷酸化位点的磷酸化。吉非替尼对细胞内STAT3Tyr705磷酸化位点的磷酸化没有抑制作用可能是其耐药的原因。路路通酸可有效抑制STAT3Tyr705磷酸化位点磷酸化，正好弥补了吉非替尼的不足。当两者以较高浓度合用时，可降低细胞内tSTAT3的含量，进一步增强对STAT3活化导致的细胞增殖和存活的抑制作用。因此吉非替尼与路路通酸发挥协同抗NSCLC的作用可能是通过抑制STAT3Tyr705磷酸化位点的磷酸化达成的。
(7)本实施例考察路路通酸联用吉非替尼的体内药效。
材料：4周龄的雄性Balb/c-Nude小鼠购于成都达硕实验动物有限公司，路路通酸购于上海麦克林生化科技有限公司，吉非替尼购于上海阿拉丁生化科技有限公司。
方法：首先建立荷瘤小鼠模型，本研究使用的是4周龄的雄性Balb/c-Nude小鼠，体重约为18-20g。取对数生长期的H1975细胞，用胰酶消化收集细胞后用PBS重悬细胞，调整细胞浓度为2.5×107个/mL，于小鼠左侧腋下接种200μLH1975细胞悬液，隔天观察小鼠肿瘤生长情况。
当小鼠肿瘤生长至80mm3时随机分成4组，每组6只：①空白对照组(control)；②单给吉非替尼组(GEF)；③单给路路通酸组(BA)；④联合吉非替尼和路路通酸组(GEF+BA)。给药方式：poqd；给药周期14天；给药剂量为吉非替尼50mg/kg，路路通酸25mg/kg。治疗期间记录小鼠的生长情况和肿瘤的体积变化。通过瘤体积的变化情况和肿瘤组织的最终重量考察治疗的有效性。
数据处理：本实验采用MicrosoftExcel2019对数据进行整理，使用Graphadprism8.0软件对数据进行统计学分析和作图。
结果：在治疗期间通过监测肿瘤的体积变化判断不同给药组的治疗效果。如图10所示，四个组肿瘤生长速度按从快到慢的顺序排列依次是control组、BA组、GEF组、GEF+BA组，因此对肿瘤生长抑制效果从强到弱依次为GEF+BA组、GEF组、BA组。
上述实验结果为吉非替尼联合路路通酸的临床联合用药及治疗EGFR-TKI耐药的NSCLC的有效方案提供了理论依据，在医药学领域有广阔的应用前景。
上所述仅是本发明优选的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何基于本发明所提供的技术方案和发明构思进行的改造和替换都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.路路通酸和吉非替尼联合在治疗表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂耐药的非小细胞肺癌的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂耐药的非小细胞肺癌为吉非替尼继发耐药的非小细胞肺癌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物中吉非替尼与路路通酸的摩尔比为1:2、1:1或2:1。
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