CN116930043A - 白细胞分类溶血剂、试剂盒和白细胞分类方法 - Google Patents

白细胞分类溶血剂、试剂盒和白细胞分类方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及白细胞分类溶血剂、试剂盒和白细胞分类方法。其中所述白细胞分类溶血剂，包括阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、以及芳香族有机酸和/或其盐，其中，所述芳香族有机酸和/或其盐的浓度为大于等于5mM到小于20mM，所述溶血剂的pH值为5.0～8.0，或者所述芳香族有机酸和/或其盐的浓度为大于50mM到小于等于80mM，所述溶血剂的pH值为5.0～7.5。该溶血剂能够提高淋巴细胞和单核细胞的分离效果。

Description

白细胞分类溶血剂、试剂盒和白细胞分类方法
技术领域
本公开涉及样本中白细胞检测领域，具体涉及用于白细胞分类的试剂和方法。
背景技术
常规的白细胞分类中，可将白细胞分为五类，即淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞和嗜碱性细胞。五类细胞的比例在正常人群的血液中一般是固定在一定范围内，一旦某类或某几类白细胞所占的比例发生变化，甚至出现一些异常的白细胞，如原始细胞、异常淋巴细胞、未成熟的粒细胞等，就预示着疾病的发生。通过检测白细胞计数及分类，对诊断疾病，追踪监测疾病的发生发展及消亡，具有十分重要的临床意义。
目前，利用血液细胞分析仪对末梢血样本中白细胞的分类和计数通常需要使用溶血剂和核酸染料对样本进行预处理。溶血剂用于使样本中大量存在的红细胞破裂成碎片，而白细胞保持细胞的完整性。核酸染料可通过白细胞的细胞膜进入细胞内部，与胞内的核酸物质结合后可发出荧光。由于白细胞中各亚群细胞的细胞大小、胞内结构有所差异，胞内核酸与荧光染料结合后发出的荧光强度也有所不同，因而能够通过检测各个细胞的散射光和荧光信号，将不同亚群的白细胞通过利用例如二维检测信息的散点图区分开，从而能够进行分类计数。
基于这样的检测原理，散点图中各个亚群的白细胞粒子之间相距越远，则分类越明确，计数越准确，特别是对于患病人群的异常血液样本来说，明确的分类是准确计数的前提。
因此，用于白细胞检测的反应试剂仍需进一步改进。
发明内容
本公开提供了一种能够提高淋巴细胞和单核细胞的分离效果的溶血剂，包含该溶血剂的白细胞分类试剂盒以及利用该溶血剂对样本中的白细胞进行检测的方法。
第一方面，本公开提供一种白细胞分类溶血剂，包括阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、以及芳香族有机酸和/或其盐，其中，所述芳香族有机酸和 /或其盐的浓度为大于等于5mM到小于20mM，所述溶血剂的pH值为5.0～8.0，或者所述芳香族有机酸和/或其盐的浓度为大于50mM到小于等于80mM，所述溶血剂的pH值为5.0～7.5。
根据一些实施方式，所述芳香族有机酸和/或其盐的浓度为大于等于10mM 到小于20mM，所述溶血剂的pH值为5.5～7.5，或者为大于50mM到小于等于 70mM，优选为大于50mM到小于等于58mM，所述溶血剂的pH值为5.8～7.0。
根据较优的实施方式，所述芳香族有机酸和/或其盐的浓度为大于等于 15mM到小于20mM，所述溶血剂的pH值为5.5～7.5，或者为大于50mM到小于等于58mM，所述溶血剂的pH值为5.8～7.0。
根据一些实施方式，所述芳香族有机酸选自由芳香族羧酸和芳香族磺酸所组成的组中的一种或多种。
根据一些实施方式，所述芳香族有机酸选自由对苯二甲酸、邻苯二甲酸、羟基苯甲酸、乙酰水杨酸、对氨基苯甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸和羟基苯磺酸所组成的组中的一种或多种。
根据一些实施方式，所述阳离子表面活性剂选自季铵盐和吡啶鎓盐中的至少一种。
根据一些实施方式，所述非离子表面活性剂选自聚氧乙烯类表面活性剂、斯潘和吐温中的至少一种。
根据一些实施方式，所述非离子表面活性剂的浓度为1.0～6.0g/L，所述阳离子表面活性剂的浓度与所述非离子表面活性剂的浓度比为0.045～0.9；或者，其中所述阳离子表面活性剂的浓度为0.09～1.8g/L，所述非离子表面活性剂的浓度与所述阳离子表面活性剂的浓度比为1.8～9.0。
第二方面，本公开提供一种白细胞分类试剂盒，包括第一试剂，所述第一试剂为上述白细胞分类溶血剂。
根据一些实施方式，所述白细胞分类试剂盒进一步包括第二试剂，所述第二试剂包括核酸荧光染料。
根据一些实施方式，所述第二试剂中所述荧光染料的浓度为0.1～1000mg/L。
第三方面，本公开提供一种样本分析方法，包括用第一试剂处理所述样本得到待测试样；使所述样本中的粒子逐个通过检测器通过光学检测装置的检测区，并且利用所述光学检测装置的光源对所述待测试样中的粒子进行照射，以测得所述粒子的光学信号；和根据所述粒子的光学信息获得白细胞分类，其中，所述第一试剂为上述白细胞分类溶血剂。
根据一些实施方式，所述光学信息包括侧向光散射强度信号和前向光散射强度信号。
根据一些实施方式，所述待测试样的获得还包括用第二试剂处理所述样本，其中所述第二试剂包括核酸荧光染料。
根据一些实施方式，所述光学信号包括光散射强度信号和荧光强度信号。
根据一些实施方式，所述白细胞分类包括淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
本公开提供的白细胞分类溶血剂能够改善散点图中淋巴细胞和单核细胞的分离效果，更具体地说是使淋巴细胞和单核细胞在散点图中的分布分别向各自的中心靠拢，从而提高白细胞分类计数的准确性。此外，该溶血剂对核酸染料没有影响，可适用于任何常规用于不同激发波长的核酸染料。
附图说明
图1是实施例1中检测的血样的散点图，其中A对应溶血剂A1，B对应溶血剂A2，C对应溶血剂A2。
图2是实施例4中利用实施例1中溶血剂A2在不使用荧光染料的情况下，根据前向和侧向光散射强度获得的白细胞散点图。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例，对本公开的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的具体实施方式仅仅是一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于这些实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
在文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的方法或者产品不仅包括所明确记载的要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者还包括为实施所述方法或者产品所固有的要素。
除非另有说明，否则如在本文中所使用的单数形式“一个/种”和“该/所述”包括所指名词的复数。
中国专利申请CN103460041A中公开了一种白细胞分类计数方法以及相应的试剂盒。根据该专利申请公开的方法可分类计数正常白细胞，并且能区别检测母细胞和非典型淋巴细胞的白细胞的分类计数，其中通过使芳香族有机酸的浓度和试剂的pH成为指定的组合，能提高异常白细胞的检测精度，区别检测母细胞和非典型淋巴细胞。
具体地，芳香族的有机酸的浓度是20mM以上、不足30mM时，试剂的pH 是5.5以上6.4以下，芳香族的有机酸的浓度是30mM以上50mM以下时，试剂的pH是5.5以上7.0以下。
然而，本发明人发现，在CN103460041A中所建议使用的芳香族的有机酸的浓度在20～50mM之外时，配合相应的pH范围，出乎意料地获得了比 CN103460041A公开的最佳实施例更好的白细胞各亚群的分离效果，特别是在二维散点图中相距较近的淋巴细胞和单核细胞的粒子群，获得了更好的分离效果。
因此，本公开提供一种能够提高淋巴细胞和单核细胞分离效果的白细胞分类溶血剂。根据本公开的一些实施方式，所述白细胞分类溶血剂包括阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和芳香族有机酸，其中，所述芳香族有机酸的浓度为大于等于5mM到小于20mM，所述溶血剂的pH值为5.0～8.0，或者所述芳香族有机酸的浓度为大于50mM到小于等于80mM，所述溶血剂的pH值为 5.0～7.5。
本发明人发现，利用血细胞分析仪进行血液样本分析时，在常规溶血剂中加入特定浓度的芳香族有机酸和/或其盐，在一定的pH条件下所测得的二维散点图中可以获得淋巴细胞和单核细胞的粒子群更好的分离效果。这种更好的分离效果是指淋巴细胞和单核细胞的粒子群向各自的中心靠拢而呈现的淋巴细胞和单核细胞在侧向光散射强度坐标方向的距离拉开的效果。换句话说，本公开提供的溶血剂能够使淋巴细胞和单核细胞各自的光学特性更为聚集和一致。与 CN103460041A中提及的两个粒子群的重心距离增加相比，这样的效果可以获得两个细胞群更清晰的边界，因而具有更好的分离效果。
根据较优的实施方式，所述芳香族有机酸和/或其盐的浓度为大于等于 10mM到小于20mM，优选为大于等于15mM到小于20mM，所述溶血剂的pH 值为5.5～7.5；或者为大于50mM到小于等于70mM，优选为大于50mM到小于等于58mM，所述溶血剂的pH值为5.8～7.0。
在更为优选的实施方式中，所述芳香族有机酸和/或其盐的浓度为大于等于 15mM到小于20mM；或者为大于50mM到小于等于55mM。在该浓度范围内，所述溶血剂的pH值为约6.0。最优选地，所述芳香族有机酸和/或其盐的浓度为 18mM或者52mM，组合物的pH为约6.0。
根据一些实施方式，芳香族有机酸和/或其盐是取代有至少一个选自羧基和磺酸基的芳烃或它们的盐。所述芳烃可具有6～10个碳原子。所述芳香族有机酸在所述芳烃上还可取代有其他基团，如选自羟基、氨基、C1-C5烷基、卤素、硝基和C1-C5烷基酰基中的至少一种。芳香族有机酸的实例为：对苯二甲酸、邻苯二甲酸、羟基苯甲酸、苯磺酸、羟基苯磺酸、对甲苯磺酸、对氨基苯甲酸、乙酰水杨酸等，但不限于此。芳香族有机酸盐可以是所述芳香族有机酸的碱金属盐、碱土金属盐或铵盐，只要在使用浓度下能溶于水即可。优选碱金属盐，如钠盐、钾盐。
正如以下实施例所证实的，芳香族有机酸使用浓度不合适或者在不适宜的 pH环境下，溶血剂不能达到淋巴细胞和单核细胞分离的效果，甚至不能使白细胞分群，而其芳香族有机酸的使用浓度和溶血剂的pH值的合适组合则对所述分离效果有明显影响。因此，所述溶血剂中的芳香族有机酸和/或其盐的浓度范围和对应的pH值范围如以上所定义时，可获得改进的淋巴细胞和单核细胞检测结果的分离效果。
根据一些实施方式，白细胞分类溶血剂中的阳离子表面活性剂为季铵盐和吡啶鎓盐中的一种或多种。季铵盐可以是C6-18烷基三(C1-4)卤化铵，优选为C8-14烷基三甲基卤化铵、C8-14烷基三乙基卤化铵，其中卤离子优选为氯离子和溴离子。季铵盐的实例包括十二烷基三甲基氯化铵、辛基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵、溴化辛基三甲基铵、溴化葵基三甲基铵，十二烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵，但不限于此。吡啶鎓盐可以是N-C6-18烷基吡啶氢卤酸盐，优选为N-C8-14烷基吡啶氢卤酸盐，更优选盐酸盐和溴化氢盐。吡啶鎓盐的实例包括氯化十六烷基吡啶鎓。
根据一些实施方式，白细胞分类溶血剂中的非离子表面活性剂可以是聚氧乙烯类、斯潘和吐温中的一种或多种。根据具体的实施方式，聚氧乙烯类非离子表面活性剂可以是C8-25脂肪醇聚氧乙烯醚、C8-25烷基酚聚氧乙烯醚、C8-25脂肪酸聚氧乙烯、C8-25脂肪胺聚氧乙烯，其中聚氧乙烯的聚合度为10～50，优选为 20～40。根据更优选的实施方式，聚氧乙烯类非离子表面活性剂可以是C12-22烷醇聚氧乙烯醚、C12-22烷基酚聚氧乙烯醚、C12-22烷基羧酸聚氧乙烯、C12-22烷基胺聚氧乙烯，其中较佳的为C12-22烷醇聚氧乙烯醚。聚氧乙烯类非离子表面活性剂的实例如十八烷醇聚氧乙烯醚(30)(鲸蜡醇聚氧乙烯醚(30))、十二烷醇聚氧乙烯醚(Brij35)、壬基酚聚氧乙烯醚(15)、十六烷基氧乙烯醚。斯潘系列非离子表面活性剂可以是斯潘20-80。吐温系列非离子表面活性剂可以是吐温20-80。
根据一些实施方式，白细胞分类溶血剂中非离子表面活性剂和阳离子表面活性剂需组合使用，而且当非离子表面活性剂的浓度在1.0～6.0g/L范围内时，阳离子和非离子表面活性剂的浓度之比为0.045～0.9；或者，当阳离子表面活性剂的浓度在0.09～1.8g/L范围内时，非离子和阳离子表面活性剂的浓度之比为1.8～9.0。根据较优的实施方式，非离子表面活性剂的浓度在2.0～4.0g/L范围内，阳离子和非离子表面活性剂的浓度之比为0.1～0.4；阳离子表面活性剂的浓度在 0.3～1.1g/L范围内，非离子和阳离子表面活性剂的浓度之比为4～7。
上述白细胞分类溶血剂还包括缓冲剂以获得最佳pH值。缓冲剂的pH值调节范围为4～9，优选5～8。本公开对缓冲剂的种类没有特别限制，常用于白细胞检测的缓冲剂均可使用。可以例举的缓冲剂例如：磷酸盐缓冲对、MES(2-(N- 吗啡啉)乙磺酸)缓冲对、MOPS(3-(N-吗啡基)丙磺酸)缓冲对、Hepes缓冲对、 Tris-HCl、柠檬酸盐缓冲对等，但不限于此
本公开的白细胞分类溶血剂也可以加入渗透压调节剂。渗透压范围可为 30～380mOsm/kg，优选为50～100mOsm/kg,。
此外，白细胞分类溶血剂还可以加入适量抑菌防腐剂。
本公开进一步提供一种白细胞分类试剂盒。
根据一些实施方式，所述试剂盒包括上述白细胞分类溶血剂作为第一试剂。在该实施方式中，采用以下详述的样本分析方法，样本，如末梢血，用该第一试剂处理获得待测试样，然后通过光学检测装置，获得待测试样中各粒子的光散射信息，具体地为侧向光散射强度和前向光散射强度信息，并据此获得样本中白细胞的分类。
根据另一些实施方式，所述试剂盒包括上述白细胞分类溶血剂作为第一试剂外，还包括第二试剂，所述第二试剂包括核酸荧光染料。在该实施方式中，采用以下详述的样本分析方法进行分析时，样本用第一和第二试剂处理获得待测试样，然后通过光学检测装置，获得待测试样中各粒子的散射光信息和荧光信息，具体地为侧向光散射强度和荧光强度信息，并据此获得样本中白细胞的分类。
可以用于上述试剂盒中第二试剂的核酸荧光染料在本公开中并没有特别限制。即，常规用于利用血细胞分析仪中测定白细胞分类计数的核酸荧光染料均可使用。例如，所述核酸荧光染料可以是能够被不同激发波段激发的染料，如红光激发波段的染料、蓝光激发波段的染料或者绿光激发波段的染料。换句话说，本公开提供的白细胞分类溶血剂可适用于配备各种的激光器和配套染料的分析平台。在这些实施方式中，所述试剂盒中的第二试剂可以是所使用的检测仪器所配套的核酸荧光染料试剂。
核酸荧光染料在本公开中没有特别限制，常规用于检测白细胞的核酸荧光染料均可使用，如，中国专利申请CN103460041A(该专利文献全文通过引用合并于本文)中公开的那些。具体示例，如：罗丹明B、碘化丙啶、溴化乙锭、乙啶-吖啶异源二聚体、乙啶二叠氮基、乙啶同源二聚体-1、乙啶同源二聚体-2、乙啶单叠氮基、三亚甲基双[[3-[[4-[[(3-甲基苯并噻唑-3-鎓)-2-基]亚甲基]-1,4-二氢喹啉]-1-基]丙基]二甲基铵]·四碘化物(TOTO-1)、4-[(3-甲基苯并噻唑-2(3H)- 亚基)甲基]-1-[3-(三甲基铵)丙基]喹啉鎓·二碘化物(TO-PRO-1)、N,N,N’,N’- 四甲基-N,N′-双[3-[4-[3-[(3-甲基苯并噻唑-3-鎓)-2-基]-2-亚丙烯基]-1,4-二氢喹啉-1-基]丙基]-1,3-丙烷二铵四碘化物(TOTO-3)、2-[3-[[1-[3-(三甲基铵)丙基]-1,4-二氢喹啉]-4-亚基]-1-丙烯基]-3-甲基苯并噻唑-3-鎓·二碘化物(TO-PRO-3)等，但不限于此。
核酸荧光染料的浓度根据染料种类的不同可在0.1～1000mg/L的范围内变化，本公开对此没有特别限制，本领域技术人员能够根据具体情况进行确定。
第二试剂还包括有机溶剂，用于溶解所述染料。有机溶剂的实例，如甲醇、乙醇、乙二醇等，但不限于此。有机溶剂在本公开中没有特别限制，本领域技术人员能够根据具体情况确定。
基于上述白细胞分类溶血剂，本公开提供一种样本分析方法，包括：用第一试剂处理所述样本得到待测试样；使所述样本中的粒子逐个通过检测器通过光学检测装置的检测区，并且利用所述光学检测装置的光源对所述待测试样中的粒子进行照射，以测得所述粒子的光学信息；和根据所述粒子的光学信息获得白细胞分类，其中，所述第一试剂为上述白细胞分类溶血剂。
根据一种实施方式，即，样本用第一和第二试剂处理，此时测得的光学信息包括侧向光散射强度信息和荧光强度信息。其中，样本的处理可以是第一试剂与第二试剂预先混合后再对样本进行处理，也可以是第一试剂和第二试剂中的任一试剂先处理样本，再用剩下的一种试剂进行处理。在该实施方式中，通过对白细胞的胞内核酸进行染色，同时获得白细胞的散射光的强度信息(具体地为侧向散射光强度信息)和荧光强度信息从而获得改进的白细胞分类，特别是改进的淋巴细胞和单核细胞的分类。所述白细胞分类包括淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。该实施方式中利用核酸特异性荧光染料，能够获得分离效果更好的四分类结果。
根据另一种实施方式，即，样本只需用第一试剂处理，此时测得的光学信息仅为散射光信息，具体包括侧向光散射强度信息和前向光散射强度信息。在该实施方式中，仅通过散射光的强度信息就能够获得白细胞分类。所述白细胞分类包括淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。在该实施方式中，不需对白细胞进行核酸染色，可节省试剂，降低检测成本。
所述样本通常为血液样本，如外周血、静脉血等，也可以是其他体液样本，如胸腔液、脑脊液等。
利用诸如血细胞分析仪进行的上述分析方法是本领域技术人员所掌握的。示例性地，所述方法可包括用含有核酸荧光染料的第二试剂预先与含上述溶血剂的第一试剂混合(也可以没有该步骤，而将第一和第二试剂直接与样本混合；此外，如果仅使用第一试剂时则不需这一步骤)；将试剂与样本，如末梢血混合获得待测试样，其中第一试剂和第二试剂混合体积比为20:1到500:1，优选20:1 到200:1，更优选40:1到50:1；两试剂混合均匀后，将试剂混合溶液与血样再进行混合孵育，混合比例为20:1到100:1，优选比例为40:1到50:1，然后将待测试样进行孵育，反应时间为10～60秒，反应温度为25℃～50℃，反应时间为20～40s。
以下通过实施例进一步说明本公开的各种实施方式和优点。
实施例1
按以下配方制备第二试剂(核酸荧光染料)：
荧光染料A(mg) 35
乙二醇(mL) 950
甲醇(mL) 50
其中荧光染料A的结构式为：
按以下配方制备第一试剂(溶血剂A1～A9)：
用水溶血剂作为溶液基质。
第一试剂1ml与第二试剂20微升先混合，再在混合溶液中加入经抗凝处理的血样20微升，在40℃下孵育30秒，形成待测试样，用带蓝光激光器(波长为450nm)的迈瑞BC-6000plus进行检测，通过测定前向低角度散射光强、侧向高角度散射光强及荧光强度，得到白细胞散点图，如图1所示。
根据散点图计算淋巴细胞和单核细胞在侧散方向上的分离度，以此评价试剂对淋巴和单核细胞的分离效果(分离度越大说明分离效果越好)。其中，分离度指两粒子团在侧向散射光方向上的间距，其中一种计算方式是使用淋巴细胞和单核细胞的距离除以淋巴粒子团的重心得到。测定结果如表1所示。
表1：溶血剂A1～A9对淋巴细胞和单核细胞在SS方向上的分离结果
试剂名称 淋巴细胞和单核细胞在SS方向上的分离度
溶血剂A1 2.73
溶血剂A2 3.10
溶血剂A4 2.75
溶血剂A5 2.78
溶血剂A3 3.18
溶血剂A6 2.90
溶血剂A7 2.89
溶血剂A8 2.83
溶血剂A9 2.76
从表1中可以看出，本方案中的芳香酸浓度含量5-20mM及50-80mM的新配方，其淋巴细胞和单核细胞分离效果较好。相比专利CN103460041B中的优选配方溶血剂A1，新配方试剂可以提高淋巴细胞和单核细胞在SS方向上的分离度。
实施例2
按以下配方制备第二试剂(核酸荧光染料)：
荧光染料B 50mg
乙二醇 950ml
甲醇 50ml
其中荧光染料B的结构式为：
按以下配方制备第一试剂(溶血剂B1～B3)：
组分 溶血剂B1 溶血剂B2 溶血剂B3
十四烷基三甲基氯化铵 0.9g 0.9g 0.9g
邻苯二甲酸氢钾 52mM 52mM 52mM
ETDA-2Na 0.15g 0.15g 0.15g
Brij 35 3.0g 3.0g 3.0g
MES 2.0g 2.0g 2.0g
水 1L 1L 1L
pH值 4.5 6.0 8.3
按以下配方制备第一试剂(溶血剂C1～C7)：
第一试剂1ml与第二试剂20微升先混合，再在混合溶液中加入经抗凝处理的血样20微升，在40℃很温下孵育30秒，形成待测试样，用带蓝光激光器(波长为460nm)的迈瑞BC-6000plus进行检测，通过测定前向低角度散射光强、侧向高角度散射光强及荧光强度，得到白细胞散点图，如图2所示。根据散点图计算淋巴细胞和单核细胞在侧散方向上的分离度和在侧散方向上两粒子团的边界距离，以此评价试剂对淋巴和单核细胞的分离效果，测定结果如表2所示。
表2：溶血剂B1～B3和C1～C7对淋巴细胞和单核细胞在SS方向上的分离结果
试剂名称 淋巴细胞和单核细胞在SS方向上的分离度
溶血剂B1 无法计算
溶血剂B2 2.84
溶血剂B3 因粒子团太近或重叠在一起导致无法计算
溶血剂C1 因粒子团太近或重叠在一起导致无法计算
溶血剂C2 3.18
溶血剂C3 1.99
溶血剂C4 2.82
溶血剂C5 2.83
溶血剂C6 2.83
溶血剂C7 2.92
实施例3
按以下配方制备第二试剂(核酸荧光染料)：
罗丹明B(mg) 65
乙二醇(mL) 950
甲醇(mL) 50
罗丹明B具有以下结构式C：
按以下配方制备第一试剂(溶血剂D1～D5)：
按以下配方制备第一试剂(溶血剂E1～E5)：
第一试剂1ml与第二试剂25微升先混合，再在混合溶液中加入经抗凝处理的血样20微升，在40℃很温下孵育30秒，形成测定用试剂，用带红光激光器(波长为625nm)的迈瑞BC-6000plus进行检测，通过测定前向低角度散射光强、侧向高角度散射光强及荧光强度，得到白细胞散点图。
根据散点图计算淋巴细胞和单核细胞在侧散方向上的分离度，以此评价试剂对淋巴和单核细胞的分离效果。其白细胞和红细胞相关参数如下表3所示。
表3：溶血剂D1～D5和E1～E5对淋巴细胞和单核细胞在SS方向上的分离结果
从表中可以看出，当阳离子表活浓度0.6g/L时，非离子与阳离子表活质量比在0.18-9.0之外的配方淋巴单核的分离度弱于在范围内的配方性能。当非离子表活浓度为2g/L时，阳离子与非离子表活质量比在0.045-0.9范围内的配方分离度要强于在范围外的配方分离度。
实施例4
用乙二醇代替第一试剂。第二试剂的配方与实施例1中溶血剂A2相同。
在1mL的第二试剂中加入经抗凝处理的血样20微升(此实施例中，染色液中无染料，仅为溶剂乙二醇)，在40℃下孵育30秒，形成测定用试剂，用迈瑞 BC-6000plus进行检测，进行检测，通过测定前向低角度散射光强、侧向高角度散射光强，得到白细胞散点图。
该配方溶血剂，不用染色液，紧靠表面活性剂的作用，就可以对白细胞进行差异化处理，进而利用前向和侧向光散射强度的二维数据，对白细胞进行分类。
以上所述仅为本发明的部分实施方式的实例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (16)

1.一种白细胞分类溶血剂，包括阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、以及芳香族有机酸和/或其盐，其中，
所述芳香族有机酸和/或其盐的浓度为大于等于5mM到小于20mM，所述溶血剂的pH值为5.0～8.0，或者所述芳香族有机酸和/或其盐的浓度为大于50mM到小于等于80mM，所述溶血剂的pH值为5.0～7.5。
2.根据权利要求1所述的白细胞分类溶血剂，其中所述芳香族有机酸和/或其盐的浓度为大于等于10mM到小于20mM，所述溶血剂的pH值为5.5～7.5，或者为大于50mM到小于等于70mM，优选为大于50mM到小于等于58mM，所述溶血剂的pH值为5.8～7.0。
3.根据权利要求2所述的白细胞分类溶血剂，其中所述芳香族有机酸和/或其盐的浓度为大于等于15mM到小于20mM，所述溶血剂的pH值为5.5～7.5，或者为大于50mM到小于等于58mM，所述溶血剂的pH值为5.8～7.0。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的白细胞分类溶血剂，其中所述芳香族有机酸选自由芳香族羧酸和芳香族磺酸所组成的组中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的白细胞分类溶血剂，其中所述芳香族有机酸选自由对苯二甲酸、邻苯二甲酸、羟基苯甲酸、乙酰水杨酸、对氨基苯甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸和羟基苯磺酸所组成的组中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的白细胞分类溶血剂，其中所述阳离子表面活性剂选自季铵盐和吡啶鎓盐中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的白细胞分类溶血剂，其中所述非离子表面活性剂选自聚氧乙烯类表面活性剂、斯潘和吐温中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的白细胞分类溶血剂，其中所述非离子表面活性剂的浓度为1.0～6.0g/L，所述阳离子表面活性剂的浓度与所述非离子表面活性剂的浓度比为0.045～0.9；或者，其中所述阳离子表面活性剂的浓度为0.09～1.8g/L，所述非离子表面活性剂的浓度与所述阳离子表面活性剂的浓度比为1.8～9.0。
9.一种白细胞分类试剂盒，包括第一试剂，所述第一试剂为根据权利要求1～8中任一项所述的白细胞分类溶血剂。
10.根据权利要求9所述的白细胞分类试剂盒，进一步包括第二试剂，所述第二试剂包括核酸荧光染料。
11.根据权利要求10所述的白细胞分类试剂盒，其中所述第二试剂中所述荧光染料的浓度为0.1～1000mg/L。
12.一种样本分析方法，包括：
用第一试剂处理所述样本得到待测试样；
使所述样本中的粒子逐个通过检测器通过光学检测装置的检测区，并且利用所述光学检测装置的光源对所述待测试样中的粒子进行照射，以测得所述粒子的光学信号；和
根据所述粒子的光学信息获得白细胞分类，
其中，所述第一试剂为根据权利要求1～8中任一项所述的白细胞分类溶血剂。
13.根据权利要求12所述的样本分析方法，其中所述光学信息包括侧向光散射强度信号和前向光散射强度信号。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述待测试样的获得还包括用第二试剂处理所述样本，其中所述第二试剂包括核酸荧光染料。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述光学信号包括光散射强度信号和荧光强度信号。
16.根据权利要求12～15中任一项所述的方法，其中所述白细胞分类包括淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
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