CN116917505A - 胆汁盐细菌传感器及其在诊断和治疗目的中的用途 - Google Patents

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Abstract

胆汁盐是源自肝脏中的胆固醇中提取的类固醇酸，被释放到胃肠道以帮助消化并被常驻肠道的微生物群完全修饰。胆汁酸是具有多种内分泌功能的多功能信号分子，与多种疾病相关联。特别是，血清和尿胆汁盐相当于肝功能障碍早期诊断的生物标志物，然而目前的检测方法不实用且难以规模化。在此发明人利用VtrA作为连接到大肠杆菌CadC系统的传感结构域来工程化合成胆汁盐受体，该系统在二聚化时激活转录。该系统的性能可以通过启动子的多种选择进行分析，它们表明可以通过改变胆汁盐受体的表达水平来实现精细可调节的响应。通过对VtrA传感器进行多轮定向进化，发明人获得了具有较低检测限和较高灵敏度的变体的集合。最后，他们表明细菌传感器可以检测肝功能障碍患者样本中的病理性胆汁盐浓度。因此，本发明涉及胆汁盐细菌传感器及其诊断和治疗目的的用途。

Description

胆汁盐细菌传感器及其在诊断和治疗目的中的用途
技术领域
本公开涉及医学领域，具体地，涉及合成生物学和肝病学。
背景技术
肝脏是协调代谢、解毒和免疫过程的重要器官。包括肝炎、肝硬化、脂肪肝和癌症在内的肝脏疾病是主要的大众健康问题，并且需要大规模的筛查方法来进行预防、诊断和治疗监测。肝活检和基于超声的弹性成像是最常见的诊断和监测肝脏疾病进展的方法。然而，这些技术仍然受到精密的基础设施需求和训练有素的技术人员要求的限制。肝功能还可以通过量化血清酶活性和胆红素来监测，但这些标志物只有当损伤已经发展后才能被检测到，并且不完全具有特异性。由于缺乏特异性，肝功能通常通过同时量化多个酶活性来监测。血清和尿液中的胆汁盐是肝功能障碍早期诊断可选择的生物标志物，但目前的检测方法不实用且难以规模化。WO2018049362公开了胆汁盐传感器，特别地适用于多形拟杆菌(Bαcteroides thetaiotaomicron)中胆汁盐的转录传感器，使用了胆汁传感器蛋白，例如来自费氏弧菌的BreR和VFA0359。
发明内容
本发明由权利要求书限定。更具体地，本发明涉及胆汁盐细菌传感器及其在诊断和治疗目的中的用途。
发明的详细说明：
定义：
本发明中，所用术语“氨基酸残基”指的是包括任何天然或合成的氨基酸残基，主要是指包含在由20种天然存在的氨基酸组成的组中的氨基酸残基，即选自由丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、赖氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、蛋氨酸(Met或M)、天冬酰胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、谷氨酰胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、缬氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)残基组成的组。
本发明中，所用术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本发明中可互换使用，用于指代任意长度的氨基酸聚合物。所述术语还包括已被修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、磷酸化或与标记成分的结合。本发明在基因治疗背景下所讨论的多肽指的是各自的完整多肽，或其任何片段或基因工程衍生物，其保留了完整蛋白质所需的生化功能。
本发明中，所用术语“多核苷酸”指任意长度的核苷酸组成的聚合物，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。一个多核苷酸可能包含被修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物，并且可能被非核苷酸组分中断。如果存在，可以在聚合物的组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。本发明中所用术语多核苷酸，可互换地指双链和单链分子。除非另有说明或要求，本发明描述的任何多核苷酸的实施方式包含双链结构以及能够构成双链结构的已知或预测的两个互补的单链结构的任意一个。
本发明中，所用术语“同一性”指的是两个多核苷酸或多肽序列的精确核苷酸到核苷酸或氨基酸到氨基酸之间的对应关系。同一性百分比可以通过直接比较两个分子之间的序列信息来确定，将序列对齐，计算两个对齐序列之间的精确匹配数，除以较短序列的长度，然后将结果乘以100。根据本发明所述第一氨基酸序列与第二氨基酸序列具有至少90％的同一性，意味着第一序列与第二氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。序列同一性通常以同一性百分比(或相似性或同源性)来衡量；百分比越高，两个序列越相似。比较序列的对齐方法在本领域是众所周知的。各种程序和对齐算法被描述在：Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482,1981；Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443,1970；Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:2444,1988；Higgins and Sharp,Gene,73:237-244,1988；Higgins and Sharp,CABIOS,5:151-153,1989；Corpet et al.Nuc.Acids Res.,16:10881-10890,1988；Huang et al.,Comp.Appls Biosci.,8:155-165,1992；和Pearson etal.,Meth.Mol.Biol.,24:307-31,1994).Altschul et al.,Nat.Genet.,6:119-129,1994,公开了序列对齐方法和同源性计算的详细思路。举例来说，对齐工具ALIGN(Myers andMiller,CABIOS 4:11-17,1989)或LFASTA(Pearson and Lipman,1988)可以用于进行序列比较(Internet1996,W.R.Pearson and the University of Virginia,10fasta20u63 version 2.0u63,release date December 1996).(Internet />1996,W.R.Pearson and the University of Virginia,fasta20u63 version 2.0u63,release date December 1996)。ALIGN比较整个序列，而LFASTA比较局部相似性区域。这些对齐工具及其各自的教程可通过网络获得，例如在NCSA网站上。可选地，对于大于约30个氨基酸的氨基酸序列的比较，可以使用Blast 2序列函数，使用默认的BLOSUM62矩阵，该矩阵设置15个默认参数(间隙存在成本为11，每个残基间成本为1)。当对齐短肽(少于约30个氨基酸)时，应使用Blast 2序列函数进行比对，使用PAM30矩阵设置为默认参数(开放间隙为9，扩展间隙1惩罚间隙)。所述BLAST序列比较系统是可获得的，例如，从NCBI网站；另请参见Altschul et al.,J.Mol.Biol.,215:403-410,1990；20 Gish.&States,Nature Genet.,3:266-272,1993；Madden et al.Meth.Enzymol.,266:131-141,1996；Altschul et al.,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402,1997；和Zhang&Madden,GenomeRes.,7:649-656,1997。
本发明中，表述“源自”指的是一个过程，其中第一组分(例如第一多肽)，或来自该第一组分的信息用于分离、衍生或制备不同的第二组分(例如与第一组分不同的第二多肽)。
本发明中，术语“融合蛋白”指的是一个单个的多肽链具有至少两个不存在于单个的、天然多肽中的多肽结构域的单个多肽链。因此，在本发明中，天然存在的蛋白质不是“融合蛋白”。优选地，靶向多肽(例如VtrA)通过肽键与至少一个异源多肽(例如DNA结合域)融合，所述融合蛋白还可以包括来源于不同蛋白质的氨基酸部分之间的氨基酸连接区域。
本发明中，术语“异源多肽”指的是不来源于与所述异源多肽融合的相同蛋白的多肽。
本发明中，术语“连接肽”指的是将所述靶向多肽与融合蛋白中的所述异源多肽连接的至少一个氨基酸的序列。这样的连接肽可以有助于防止空间位阻。通常一个连接肽包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35；36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60；61、62、63、64、65、66、67、68、69或70个氨基酸。
本发明中，术语“VtrA”指的是来自副溶血弧菌(Vibrio pαrahαemolyticus)的膜结合型调节因子，其通过寡聚化激活。所述VtrA的C末端结构域也表现出可以与VtrC形成复合物，该复合物与胆汁盐结合。因此，提出了VtrA/VtrC复合物能够感知胆汁盐以激活VtrA的DNA结合域。一种典型的VtrA的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，一种典型的VtrC的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:1>tr|Q87GI4|Q87GI4_VIBPA Putative transcriptional regulatorToxR OS＝Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6(strain RIMD 2210633)OX＝223926 GN＝VPA1332 PE＝1 SV＝1.The transmembrane domain is indicated in bold,italic and underlined.The periplasmic sensing domain is indicated in bold anddouble underlined.
SEQ ID NO:2>VtrC sequence
MKLNIKRLHLSLTLMSVVMLLVIIYNNFFQPVHFYETSYKYQAADSTYMHDVAINVSIKGNHFTSDIIIRELVKSENKNYYNVIGHGDIIQKNTHQYYLNFDNIDVYTGTNKANMKPYKEPTSISSLINKSNNIRVVYLSEEYVVVEFFFYDGQIITLHRY
本发明中，术语“DNA结合域”指代但并不限制于可以结合特定DNA序列(例如基因组DNA序列)的基序。DNA结合域具有至少一个识别并结合单链或双链DNA的基序。DNA结合域可以以序列特异性或非序列特异性的方式与DNA相互作用。
本发明中，术语“CadC转录激活因子”具有其在本领域中的一般含义，指的是大肠杆菌的膜整合型转录调节因子CadC。CadC在低外部pH值时激活cadBA操纵子的表达，同时提供赖氨酸，从而适应轻度酸性胁迫。CadC是ToxR-样蛋白的代表，其在单个多肽中结合了感知、信号转导和DNA结合活性。具体地来说，CadC是由C末端的周质pH感应域、单个跨膜螺旋和N末端的细胞质翼状螺旋-转角-螺旋DNA结合域组成的(Buchner S,Schlundt A,LassakJ,Sattler M,Jung K.Structural and Functional Analysis of the Signal-Transducing Linker in the pH-Responsive One-Component System CadC ofEscherichia coli.J Mol Biol.2015 Jul 31；427(15):2548-61.)。CadC通过其C末端的周质pH感应域二聚。因此，“E.coliCadC转录激活因子DNA结合域”指的是CadC的细胞质的结构域，其能够通过CadC的C末端融合结构域的寡聚化来恢复其功能。
本发明中，术语“重组体”指的是两个不同的分离序列片段通过人工组合得到的的结合体，例如，通过化学合成或通过遗传工程技术对氨基酸或核酸的分离片段进行操作。
本发明中，术语“表达框”指的是一种核酸序列，能够在适当的环境中驱动编码靶向多肽的多核苷酸的表达，该多核苷酸被整合到所述表达框中。当将表达框引入到宿主细胞中时，表达框除其他外尤其能够引导细胞机制将编码靶向多肽的多核苷酸转录成RNA的机制，然后RNA通常会被进一步处理并最终转化为所述靶向多肽。所述表达框可以包含在表达载体中，将在下文详细描述。本发明所述的表达框的各个元件将在随后详细解释。
本发明中，术语“启动子”指的是促进靶向多核苷酸转录的核酸序列。所述启动子可操作地连接至靶向多核苷酸。所述启动子也可以是形成一个启动子/增强子元件的一部分。虽然元件“启动子”和“增强子”之间的物理边界并不总是清晰的，所述“启动子”通常指核酸分子上的一个位点，与RNA聚合酶和/或任何相关因子结合，并在该位点启动转录。增强子在时间和空间上增强启动子的活性。在本领域现有技术中已知许多启动子在很广泛范围的细胞类型中具有转录活性。
本发明中，术语“有效地连接”指的是两个多核苷酸之间的连接，特别是表达调控因子序列(例如启动子)与靶向多核苷酸之间的连接。
本发明中，术语“载体”指的是能够将核酸序列转移至靶细胞的一种介质(例如，非病毒载体、微粒载体和脂质体)。典型地，“载体构建”、“表达载体”和“基因转移载体”代表任何能够指导靶向核酸的表达并能够将核酸序列转移至靶细胞的任何核酸结构体。因此，该术语包括克隆和表达载体以及病毒载体。
本发明中，术语“宿主细胞”可以是在生成外源性多肽或蛋白中大量常规使用的细胞中的任何一种，包括原核宿主细胞。
本发明中，术语“益生菌”是指活的微生物，当其以足够的数量整合，对卫生、舒适和健康产生超越传统营养效应的积极影响。益生菌微生物已被定义为“当其以足够的数量给予宿主时，能够对宿主产生健康益处的活的微生物”(FAO/WHO，2001)。
本发明中，术语“转染”是指广泛使用的用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的各种技术，例如，电穿孔、钙磷共沉淀、DEAE-右旋糖酐转染等等。所述宿主细胞可以通过本领域技术人员所熟知的任何传统方法用本发明的载体进行“转染”。例如，转染可以是瞬时的转染。
本发明中，术语“胆汁盐”具有其在本领域中的一般含义，其是在肝脏中从胆固醇合成而来的，与甘氨酸或牛磺酸共轭结合，并与胆固醇和卵磷脂一起在胆汁中分泌。典型的胆汁盐包括二羟基胆酸盐，例如脱氧胆酸、甘氧脱氧胆酸、牛磺酸脱氧胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨胆酸和牛磺鹅去氧胆酸，以及三羟基胆酸，例如胆酸、甘氨胆酸和牛磺胆酸。碱性盐包括钠盐和钾盐。
本发明中，术语“输出分子”是指对特定信号作出响应而表达的一种多核苷酸或多肽，例如胆汁盐的存在。
本发明中，术语“治疗性多肽”是指任何一种在受试者中发挥治疗作用的蛋白质或多肽。术语“治疗性多核苷酸”是指任何一种在受试者中发挥治疗作用的多核苷酸。
本发明中，术语“受试者”在此是指任何哺乳动物。该术语包括但不限于人类、非人类灵长类动物如黑猩猩和其他类人猿和猴子物种；农牧动物如牛、羊、猪、山羊和马；家畜如狗和猫等；实验动物包括啮齿类动物如小鼠、大鼠和豚鼠，等等。该术语并不表示特定的年龄或性别。因此，成年人和新生儿受试者，胎儿无论男性或女性都包括在内。
本发明中，术语“样本”是指任何体积的液体或悬浮液，其中待测的胆汁盐可以存在于溶液中。
本发明中，术语“肝功能障碍”或“肝功能紊乱”是指肝脏的功能相对于正常状态下降低的状态。肝功能障碍是肝脏疾病的特征。
本发明中，术语“非酒精性脂肪性肝病”具有其在本领域中的一般含义，指代的范围是在没有过度饮酒史的个体中，因肝细胞内脂肪的积累引起的一系列疾病。在最温和的形式中，NAFLD指脂肪肝。术语NAFLD也旨在包括更严重和晚期的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝细胞癌和病毒诱发(例如HIV、肝炎)的脂肪性肝病。
本发明中，术语“药物诱发性肝病”或“毒性肝损伤”被用于举例说明那些由活性成分导致肝脏损伤的情况。
本发明中，术语“酒精性肝病”或“酒精性肝损伤”是指至少部分原因是由于酒精摄入造成的肝细胞脂肪积累引起的疾病。例子包括但不限于，例如纯酒精性脂肪肝、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化疾病等疾病。应该注意的是，酒精性脂肪性肝炎也称为酒精性脂肪肝，并包括酒精性肝纤维化。
本发明中，术语“风险”在本发明的上下文中，是指一个事件在特定时间段内发生的概率并可以表示受试者的“绝对”风险或“相对”风险。绝对风险可以通过或参考相关时间队列的实际观测后测量，或参考在相关时间段内跟踪统计的有效历史队列的指数值来测定。相对风险是指将受试者的绝对风险与低风险队列的绝对风险或平均人群风险比率，该比率可能因临床风险因素的评估方式而异。优势比，即给定测试结果中阳性事件相对于阴性事件的比重，也通常被用于无转变(根据公式p/(l-p)计算可能性，其中p是事件发生的概率而(1-p)是事件不发生的概率)。“风险评估”或“风险的评估”在本发明上下文中包含对一个事件或疾病状态可能发生的概率、机会或可能性、事件发生率或从一种疾病状态到另一种的转变的比率进行预测。风险评估还可以包括预测未来临床参数、传统实验室风险因素值或其他复发指数，无论是绝对还是相对的，都可以参考之前测量的人群。本发明的方法可以用于对转化风险进行连续或分类测量，从而诊断和定义一系列被定义为有转化风险受试者的风险范围。在分类场景中，本发明可用于区分正常和其他高风险受试者队列。在某些实施方式中，本发明可以用于将有风险的受试者与正常受试者区分开。
本发明中，术语“肝移植”具有在本领域中的一般含义，包括部分和整个肝脏的移植，其中供体的肝脏被部分或全部切除，并部分或全部移植到受体中。部分肝移植按操作方式分为原位部分肝移植、异位部分肝移植等，本发明可应用于任何一种方法。在部分肝移植中，通常来自供体的肝移植或部分肝移植(相当于受体正常肝体积的约30-50％)作为移植物移植到肝脏被完全切除的受体体内。
本发明中，术语“移植排斥反应”在此被定义为由于受体表达的主动免疫应答引起的器官功能性和结构的恶化，与器官功能障碍的非免疫学原因无关。所述移植排斥反应可以是急性的或慢性的。本发明所用术语“急性排斥反应”是指移植后5-60天内发生的移植器官排斥反应。它通常是细胞介导的免疫损伤的表现。人们认为，延迟型超敏反应和细胞毒性机制都参与其中。免疫损伤针对的是HLA和其他可能的由小管上皮和血管内皮表达的细胞特异性抗原。本发明所用术语“慢性排斥反应”是指移植器官在移植后30-120天内发生的排斥反应。术语“慢性排斥反应”还指结合免疫学损伤(如慢性排斥反应)和非免疫学损伤(如高血压肾病或免疫抑制剂如环孢霉素A的肾毒性)的后果，在移植数月或数年后发生，最终导致同种异体移植物纤维化和硬化，并伴随有肾功能的进行性丧失。
本发明中，术语“治疗”或“处理”指预防性或预防性治疗以及治疗性或疾病缓解治疗，包括对可能患病或疑似感染该疾病的患者进行治疗，以及对患病或被诊断为患有疾病或处于医疗状况下的患者进行治疗，并包括抑制临床复发。所述治疗可以施用于患有医学疾病或最终可能患病的患者，为了疾病的预防、治愈、延缓发生、减轻疾病的严重程度或改善一个或多个疾病的症状或疾病复发，或者为了延长患者的生存期使其超过没有施用这种治疗的情况下预期的生存期。通过“治疗方案”表示对于疾病的治疗模式，例如治疗期间使用的给药模式。治疗方案可能包括诱导方案和维持方案。术语“诱导方案”或“诱导期”指用于疾病初始治疗的治疗方案(或治疗方案的一部分)。诱导方案的总体目标是在治疗方案的初始阶段为患者提供高水平的药物。诱导方案可以(部分或全部)使用“负荷方案”，其中可能包括比医生在维持方案中使用的剂量更大的药物剂量，比医生在维持方案中给药更频繁的给药，或两者都有。术语“维持方案”或“维持期”是指在疾病治疗期间用于维持患者状态的治疗方案(或治疗方案的部分)，例如使患者长期(数月或数年)处于缓解期。维持方案可以采用连续治疗(例如按照规律间隔给药，例如每周、每月、每年等)或间歇治疗(例如中断治疗、间歇疗法、复发时治疗或在达到特定的预定标准[例如疼痛、疾病表现等]时进行的治疗)。
本发明中，术语“有效量”是指原核宿主细胞足以达到有益效果的量。
本发明中，术语“生物传感器装置”具有本技术领域中的一般含义，是指一种将传感器与识别分子之间的相互作用转化为信号(如电信号)以测量或检测靶标的装置。
本发明中，术语“内切酶”是指切割多核苷酸链内磷酸二酯键的酶。一些内切酶，如脱氧核糖核酸酶I，相对非特异性地切割DNA(不考虑序列)，而许多内切酶，通常被称为限制性内切酶或限制性酶，只在非常特定的核苷酸序列处切割。基于内切酶基因组失活机制通常需要第一步单链或双链DNA的断裂，其可以触发两种不同的DNA修复细胞机制，可用于DNA失活：易错非同源末端连接(NHEJ)和高保真度的同源性定向修复(HDR)。DNA靶向内切酶可以是天然存在的内切酶(例如细菌巨型核酸酶)或可以通过人工生成的(例如工程化巨型核酸酶、TALEN、ZFN等)。本发明所用术语“TALEN”具有其本领域中的一般含义，是指转录激活因子样效应器核酸酶，一种可用于编辑靶基因的人工核酸酶。本发明所用术语“ZFN”或“锌指核酸酶”具有其在本领域中的一般含义，指一种锌指核酸内切酶，可用于编辑靶基因的人工核酸内切酶。本发明所用术语“CRISPR-相关内切酶”具有其在本领域中的一般含义，是指聚类规则间隔短回文重复序列相关的原核DNA片段，是包含短重复碱基序列的原核生物DNA片段。
本发明中，术语“食品”是指液态(即饮料、固态或半固态饮食组合物，特别是不需要额外的营养摄入或食品补充剂组合物的总食物组合物(食物替代品)。本发明所用术语“食品成分”或“饲料成分”包括作为营养补充剂添加或可被添加到功能性食品或食品中的制剂。通过“营养食品”或“保健品”或“功能性”食品，表示包含对健康有益效果或能够提高生理功能的成分的食品。通过“食品补充剂”表示以补充正常饮食为目的的食品。
多肽：
本发明第一个目的涉及一种融合蛋白，其中，“VtrA”多肽与DNA结合域融合，所述“VtrA”多肽具有与如SEQ ID NO：1所示从第134位氨基酸残基到第253位氨基酸残基范围内的氨基酸序列具有90％的同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VtrA多肽直接或通过连接肽结合到DNA结合域。在某些实施方式中，所述DNA结合域的C端末端与所述VtrA多肽的N端末端融合。
在某些实施方式中，所述DNA结合域是E.coli CadC转录激活因子DNA结合域。在某些实施方式中，所述E.coli CadC转录激活因子DNA结合域包括与如SEQ ID NO:3所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3>E.Coli CadC transcription activator DNA binding domain
MQQPVVRVGEWLVTPSINQISRNGRQLTLEPRLIDLLVFFAQHSGEVLSRDELIDNVWKRSIVTNHVVT
QSISELRKSLKDNDEDSPVYIATVPKRGYKLMVPVIWY
在某些实施方式中，所述VtrA多肽通过连接肽与E.coli CadC转录激活因子的DNA结合域融合。在某些实施方式中，所述连接肽由如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成。
SEQ ID NO:4>Linker
SEEEGEEIMLSSPPPIPEAVPATDSPSHSLNIQNTATPPEQSPVKSKR
在某些实施方式中，本发明所述的融合蛋白由与如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列组成。
SEQ ID NO:5>CadC DNA binding domain–linker-transmembrane domain
-periplasmic sensing domain
MQQPVVRVGEWLVTPSINQISRNGRQLTLEPRLIDLLVFFAQHSGEVLSRDELIDNVWKRSIVTNHVVT
QSISELRKSLKDNDEDSPVYIATVPKRGYKLMVPVIWYSEEEGEEIMLSSPPPIPEAVPATDSPSHSLN
IQNTATPPEQSPVKSKRILLISILQLAFIYVAYSYTSIFVSSTAKDDYPSLSFQQDYVYIFSSDFQL
SEELGVALINALSAKEIVPERLYVMLNDKTISFSFISKNKKSKNRVLSTEKKLNYKHISEYIVNEIEY
本发明公开的多肽可以通过本领域中已知的任何技术来生产，例如，不限于任何化学、生物、遗传或酶技术，单独或结合使用。已知所需序列的氨基酸序列，本领域技术人员可以通过标准的多肽生产技术容易地生产所述多肽。例如，它们可以使用众所周知的固相法合成，优选使用商品化可获得的多肽合成装置(例如由Applied Biosystems,FosterCity,California制造的装置)并遵循制造商的说明书。可选地，本发明所述多肽和融合蛋白可以通过本领域众所周知的DNA重组技术合成。例如，在将编码所需(多)肽的DNA序列整合至表达载体中并将这些表达载体引入合适的真核或原核宿主细胞中之后，这些片段可以作为DNA表达产物被获取，随后可以通过公知技术将其从宿主中分离。
多核苷酸：
本发明的另一个目的涉及编码本发明所述融合蛋白的多核苷酸。
本发明的另一个目的涉及表达框，包括编码本发明所述融合蛋白的多核苷酸，并可操作性地与其控制序列连接使其在原核宿主细胞中表达。
合适的表达控制序列包括适用于目标宿主生物体的启动子。对于来自原核生物的不同宿主，上述启动子是本领域技术人员来说是众所周知的，并在文献中有描述。例如，所述启动子可以从天然存在的基因中分离出来或是合成或嵌合的启动子。同样，所述启动子可能已经存在于靶向基因组中，并且将通过本领域中已知的适当技术(例如同源重组)与多核苷酸连接起来。
在某些实施方式中，启动子选自由p14、p10或p9启动子组成的组，其分别具有如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核酸序列。
SEQ ID NO:6>P14
TTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGA
SEQ ID NO:7>P10
TTTCAATTTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGA
SEQ ID NO:8>p9
TTGCCTCTTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGA
根据本发明所述的表达框，特别指用于易于使用的插入靶向多核苷酸例如载体或基因组DNA中。为此，所述表达框优选地在其5'-和3'-末端两侧提供核苷酸序列，以便于将其移除并插入特定序列位置中，例如，限制性内切酶识别位点或同源重组的靶向序列，例如由重组酶催化。
载体和宿主细胞：
本发明的另一个目的涉及载体，特别是在基因工程中常规使用的质粒、粘性质粒、病毒和噬菌体，其包括本发明所述的多核苷酸或表达框。
在某些实施方式中，本发明所述的载体适用于原核宿主细胞的转化。本领域技术人员熟知的方法可用于构建重组载体。除了本发明所述的多核苷酸或表达框外，所述载体还可以包含更多的基因，例如标记基因，其使得可以在合适的宿主细胞和适当的条件下选择所述载体。通常地，所述载体还包含一个或多个复制起点。对于基因工程来说，例如，在原核宿主细胞中，本发明所述的多核苷酸或这些分子的部分都可以被导入质粒中。表达载体已经被广泛地描述在文献中。通常，它们不仅包含选择性标记基因和一个保证在所选择的宿主中复制的复制起位点，还包含细菌启动子和在大多数情况下用于转录的终止信号。在启动子和终止信号之间，通常存在至少一种限制性位点或多克隆位点，使其能够插入编码核苷酸序列。可以使用确保基因表达的组成型启动子和有意识地控制基因的表达的诱导型启动子。具有这些特性的细菌启动子序列在文献中有详细描述。微生物(例如E.coli)中表达的调控序列已经在文献中充分描述。诱导型启动子也是可能的。这些启动子通常导致比组成型启动子更高的蛋白质产量。
本发明的另一个目的涉及一种生产能够表达本发明所述融合蛋白的原核宿主细胞的方法，包括使用本发明上述的多核苷酸、表达框或载体对细胞进行基因工程。
本发明的另一个目的涉及使用上述多核苷酸、表达框或载体进行基因工程的原核宿主细胞，以及来源于这些转化细胞并包含本发明上述的多核苷酸、表达框或载体的细胞，以及通过上述生产方法获得的细胞。
在某些实施方式中，所述原核宿主细胞选择自革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。
在某些实施方式中，所述原核宿主细胞选自非致病菌。在某些实施方式中，所述原核宿主细胞选自源自正常内部生态系统(例如细菌菌群)的细菌。在某些实施方式中，所述原核宿主细胞选自源自胃肠道正常内部生态系统的非致病菌。作为胃肠道正常菌群的一部分的非限制性的非致病菌的例子，包括来自以下属的细菌：拟杆菌属、梭菌属、梭杆菌属、真杆菌属、瘤胃球菌属、消化球菌属、消化链球菌、双歧杆菌、埃希氏菌和乳酸菌菌属的细菌。
在某些实施方式中，所述原核宿主细胞选择自厌氧细菌细胞(例如，不需要氧气供给生长的细胞)。厌氧细菌细胞包括专性厌氧细胞，例如，拟杆菌属和梭菌种属。在人体中，例如，厌氧细菌细胞最常见于胃肠道。
在某些实施方式中，所述原核宿主细胞选择自食品级细菌。在某些实施方式中，所述原核宿主细胞是益生菌。
在某些实施方式中，所述原核宿主细胞是大肠杆菌。
在某些实施方式中，所述原核宿主细胞以如下方式进行基因工程改造，即包含稳定整合到基因组中的引入的多核苷酸。利用本发明所述的多核苷酸或载体转化原核宿主细胞可以通过标准方法实行。例如，氯化钙转染通常用于原核宿主细胞。所述原核宿主细胞在满足特定使用的原核宿主细胞要求的营养培养基中培养，特别是在pH值、温度、盐浓度、曝气、抗生素、维生素、微量元素等方面的要求。
在某些实施方式中，所述原核宿主细胞包括编码具有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的VtrC多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸可操作性地连接到具有如SEQ ID NO：9所示核酸序列的启动子p5。
SEQ ID NO:9>P5启动子
TTGACAATTAATCATCCGGCTCGTAATTTATGTGGA
在某些实施方式中，本发明所述原核宿主细胞包括至少一种编码输出分子的另一种多核苷酸，其表达受本发明所述融合蛋白的控制。
优选地，所述胆汁盐与融合蛋白的结合会触发其寡聚化，从而允许CadC转录激活因子DNA结合域的寡聚化，可以随后激活至少一种编码输出分子的多核苷酸的表达，该输出分子处于CadBA启动子的控制下。
因此，本发明所述原核宿主细胞还包括编码与CadBA启动子可操作地连接的输出分子的多核苷酸。CadBA启动子核酸的示例如SEQ ID NO:10所示。
SEQ ID NO:10>PCadBA
ATCCATTGTAAACATTAAATGTTTATCTTTTCATGATATCAACTTGCGATCCTGATGTGTTAATAAAAA
ACCTCAAGTTCTCACTTACAGAAACTTTTGTGTTATTTCACCTAATCTTTAGGATTAATCCTTTTTTCG
TGAGTAATCTTATCGCCAGTTTGG
在某些实施方式中，所述输出分子是一种多肽。
在某些实施方式中，所述输出分子是一种检测蛋白，可以通过生物或物理手段进行检测。
在某些实施方式中，所述检测蛋白是一种荧光蛋白。荧光蛋白的出现使非侵入性的细胞内标记成为可能，这些标记可以容易地通过光学方法检测。来自AequoreαVictoria的绿色荧光蛋白(GFP)是如今最广泛使用于许多生物体中的报告基团。具有不同光谱特性的多个变体已被开发。在某些实施方式中，所述原核宿主细胞包括不同组合的荧光蛋白，展现提供差异性的荧光的能量转移。在某些实施方式中，所述检测蛋白选自发光蛋白。某些细菌(例如，费氏弧菌)具有自诱导发光基因，表达荧光素酶，可导致荧光素的裂解和蓝光发射。细菌产生信号分子，N-酰基同型丝氨酸内酯(AELs)进入细菌细胞并诱导编码AHL合成酶的LuxI基因以及编码AHL-依赖型转录因子的LuxR基因的转录激活。细胞中足够高浓度的AHL会导致其与LuxR激活因子的结合以及荧光素基因的转录。
可选地，所述检测蛋白可以是融合蛋白(例如，绿色荧光蛋白-Fv)，具有可检测的特性，并且可以从细胞分泌出来。因此，分泌可以通过与本发明所述的融合蛋白结合的胆汁盐来触发。在这种情况下，检测蛋白的产量过剩而不是与胆汁盐的结合成比例。
在某些实施方式中，可以使用特异性结合荧光探针的RNA配位体进行检测。探针与配位体的结合增强其荧光并满足基因表达的检测。
在某些实施方式中，所述输出分子是诱导可检测分子或治疗分子表达的转录因子。在某些实施方式中，所述输出分子是抑制可检测分子或治疗分子表达的抑制因子。
在某些实施方式中，所述输出分子是内切酶。在某些实施方式中，所述靶向转基因产物是内切酶，提供基因功能的位点特异性的敲除，例如，内切酶敲除与遗传疾病相关的等位基因。例如，当显性等位基因编码基因的缺陷拷贝时，该基因为野生型时是一个结构蛋白和/或提供正常功能，位点特异性内切酶可以靶向缺陷等位基因，并敲除缺陷等位基因。除了敲除缺陷等位基因外，位点特异性核酸酶还可以用于激发供体DNA的同源重组，该供体DNA编码由缺陷等位基因编码的功能性拷贝。因此，例如，本发明所述的原核宿主细胞可以用于传递敲除缺陷等位基因的位点特异性内切酶，也可用于传递缺陷等位基因的功能性拷贝，从而修复缺陷等位基因，进而产生功能性蛋白。在某些实施方式中，本发明所述的DNA靶向内切酶是TALEN。在某些实施方式中，本发明所述的DNA靶向内切酶是ZFN。在某些实施方式中，本发明所述的DNA靶向内切酶是CRISPR相关内切酶。在细菌中，CRISPR/Cas基因座编码导向型RNA的适应性免疫系统，以对抗移动遗传元件(病毒，转座因子和共轭质粒)。已经确定了三种类型(I-VI)的CRISPR系统。CRISPR簇包含间隔区，所述间隔区序列与前面的可移动遗传元件互补。CRISPR簇转录并加工成成熟的CRISPR(Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats规律成簇并留有间隔的短回文重复序列)RNA(crRNA)。所述CRISPR相关内切酶Cas9和Cpf1属于II型和V型CRISPR/Cas系统，并具有切割靶向DNA的强内切酶活性。Cas9由包含约20个核苷酸的独特靶向序列(称为间隔区)的成熟crRNA，以及指导预CRNA核酸酶III-辅助过程的反式激活小RNA(tracrRNA)引导。所述crRNA:tracrRNA双链通过在crRNA上间隔区与靶向DNA上的互补序列(称为前间隔序列)之间的互补配对来指导Cas9切割靶向DNA。Cas9可识别三核苷酸(NGG)前间隔序列邻近基序(PAM)以指定切割位点(从PAM起第3个或第4个核苷酸)。所述crRNA和tracrRNA可以分别表达或通过合成茎环改造为人工融合小向导RNA(sgRNA)，以模拟天然的crRNA/tracrRNA双链。这样的sgRNA与shRNA一样，可以被合成或在体外转录以诱导RNA转染或从U6或H1启动的RNA表达载体的表达。在某些实施方式中，所述CRISPR相关内切酶是Cas9内切酶。所述Cas9内切酶可以具有与野生型产脓链球菌序列相同的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述CRISPR相关内切酶可以是来自其他物种的序列，例如其他链球菌种属，如嗜热链球菌；铜绿假单胞菌，大肠杆菌或其他已测序的细菌基因组和古菌，或其他原核微生物。可选地，所述野生型产脓链球菌Cas9序列可以被修饰。所述核酸序列可以被密码子优化以在哺乳动物细胞中高效表达，即“人源化”。在某些实施方式中，所述CRISPR相关内切酶是Cpf1内切酶。
在某些实施方式中，所述输出分子是一种治疗分子，特别是一种治疗性多肽或治疗性多核苷酸。
本发明意义上的治疗性多肽或者是天然存在的蛋白质，例如未经修饰的生长因子，或者是设计的治疗性蛋白质，例如天然存在蛋白质的单链可变片段或其变体。治疗性多肽通过不同的治疗机制发挥其生物活性。治疗性多肽不仅是生长因子，还可以是具有生物活性的其他蛋白质，例如但不限于蛋白酶抑制因子或免疫受体拮抗剂。在本发明中使用的治疗性多肽可以具有与自然存在的氨基酸序列和蛋白质二级和三级结构相同的形式，也可以经过修饰或设计以改进其作用。例如，可以通过融合不同的治疗性多肽形成嵌合蛋白。治疗性多肽也是自然界中不存在的生物活性的分子，例如单链可变片段、重组抗体、作为拮抗剂的肽、抗体(例如中和性抗体)、纳米抗体或可溶性受体。在某些实施方式中，所述治疗性多肽是一种结合肿瘤坏死因子(TNF)或TNF受体的蛋白，一种结合整合素或整合素受体的蛋白质，或成纤维细胞生长因子19(FGF19)。结合TNF或TNF受体的蛋白的例子包括阿达木单抗、赛妥珠单抗、戈利木单抗和英利昔单抗以及一种抗TNF纳米抗体。
在某些实施方式中，所述输出分子是一种多核苷酸，特别地治疗性分子。在某些实施方式中，所述输出分子是一种核糖核酸(RNA)。在某些实施方式中，所述输出分子是一种干扰性RNA(RNAi)。
其他种类的输出信号包括通过特定的操作子(如紫色杆菌素操作子，或通过黄酮单加氧酶的表达将色氨酸转化为靛蓝)产生色素，或通过酶的表达将外源提供的底物转化为比色产物，例如酶β-半乳糖苷酶及其底物X-gal。
可以利用细胞计算领域中开发的技术创建更高功能水平的更复杂的原核生物宿主细胞。在这些方法中，细胞作为一种生化计算机，通过使用内部逻辑门加工例如胆汁盐结合等输入信息来生成输出信息。已经设计出了对多个输入信号的复杂条件响应，例如，通过在大肠杆菌细胞中应用AND、NOT、OR、XOR和IMPLIES逻辑门。例如，可以使用DNA结合蛋白来应用这些逻辑门以调节重组载体的表达。也可以使用其他系统，例如但不限于，基于重组酶的逻辑门、基于核酸的逻辑门或基于蛋白的逻辑门。有关细胞计算的更多信息，请参见R.Weiss,“Cellular Computation and Communications using Engineered GeneticRegulatory Networks,”Ph.D.Thesis,MIT,2001；M.L.Simpson et al.,“Whole-cellbiocomputing,”Trends Biotechnol.19:317-323(2001)；Yaakov Benenson.,<<Biomolecular computing systems:principles,progress and potential>>.<<NatureReviews Genetics>>,13(7):455{468,2012.；Bonnet et al.,“Amplifying geneticlogic gates”Science,340(6132):599{603,2013.；Brophy JAN and Voigt CA.<<Principles of genetic circuit design>>.Nature methods,11(5):508{520,2014.,这些内容通过引用编入本发明。
诊断方法：
本发明中所述的原核生物宿主细胞构成了全细胞生物传感器(“bactosensor”)，可适用于检测和量化胆汁盐。
因此，本发明的另一个目的涉及一种检测样本中是否存在胆汁盐的方法，包括(1)至少提供一种本发明所述的原核宿主细胞；(2)将所述原核宿主细胞与疑似含有所述胆汁盐的样品接触足够长的时间，使融合蛋白的寡聚结合，然后表达检测蛋白；以及(3)检测所述检测蛋白的表达水平，其中，所述表达水平与所述样品中存在的胆汁盐的量相关。
在某些实施方式中，所述样本是体液样本。在某些实施方式中，所述样本选自由血液样本(包括血清或血浆样本)、尿液样本、脑脊液样本、泪液样本、唾液样本和滑液样本组成的组。
使用本发明所述的方法，可以在几个数量级的摩尔范围内测量所述样本中溶解的胆汁盐浓度。
所述检测蛋白被化验和检测以量化胆汁盐。通常，当所述检测蛋白为荧光蛋白时，可以使用本领域已知的方法如流式细胞术、激光扫描细胞术或成像显微镜来读取每个细胞上的荧光强度。通过这种方式，可以检测到每个单个细胞中所有期望波长范围内的荧光强度。然后可以使用标准方法测定样本中的胆汁盐的量或浓度。在某些实施方式中，当细胞与含有已知浓度的胆汁盐的样本结合时可以通过检测蛋白的表达(即其荧光)来构建标准曲线。只要可以构建可重现的曲线，响应就不必是线性的。然后可以通过标准曲线将在试验中测定的所述检测蛋白的荧光强度与样本中的胆汁盐浓度相关联。
本领域技术人员可以理解的是，本发明所述方法可用于检测、鉴定和量化生物和非生物样本中的胆汁盐，例如在医学或兽医科学中疾病的诊断。这些应用可以是商业性质(常规分析意义上)或纯科研目的的。由于本发明的方法可以使用几乎无限种类的形式进行应用，因此它可以使得成千上万种不同的胆汁盐的特异性检测成为可能。在全细胞传感器没有被破坏的情况下，它们是可重复使用的。特别地，本发明所述全细胞传感器在体外检测中可用于医学诊断和疾病管理。
特别地，本发明所述全细胞传感器尤其适用于肝功能障碍受试者的诊断。
因此，本发明的另一个目的涉及一种确定受试者是否患有肝功能障碍或具有肝功能障碍风险的方法，包括(1)提供至少一种本发明所述的原核宿主细胞；(2)将从受试者获得的样品与原核宿主细胞接触足够的时间，以允许所述融合蛋白的寡聚结合，然后表达检测蛋白；以及(3)检测所述检测蛋白的表达水平，其中，所述表达水平与所述样品中存在的胆汁盐含量相关，并且其中所述胆汁盐的含量表明受试者是否有肝功能障碍或有患肝功能障碍的风险。
许多急性或慢性的病理状况会导致肝功能障碍。这些症状包括但不限于肝脓肿、原发性或转移性肝癌、肝硬化，如饮酒引起的肝硬化或原发性胆汁性肝硬化、阿米巴肝脓肿、自身免疫性肝炎、胆道闭锁、播散性球孢子菌病、门静脉高压肝感染(如甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒)、血色病、肝细胞癌、化脓性肝脓肿、雷氏综合征、硬化性胆管炎、威尔逊氏病、药物诱发的肝毒性或暴发性或急性肝衰竭。
在某些实施方式中，所述肝病是非酒精性脂肪性肝病。在某些实施方式中，所述肝病是药物诱发的肝病。在某些实施方式中，所述肝病是酒精性肝病。
在某些实施方式中，所述肝功能障碍可能是病毒感染导致的。例如，肝内涉及由在肝脏内复制的亲肝病毒引起的感染，所述肝脏是其主要靶器官。这些亲肝病毒包括甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒。在所有这些感染中，肝炎和肝功能障碍的产生都是肝脏内对病毒的免疫反应和修复机制(例如纤维化)的结果。此外，肝脏作为主要针对其他组织的病毒感染的全身性宿主的一部分而受到影响，特别是上呼吸道病毒。这些病毒的例子包括疱疹病毒(Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒[CMV]和单纯疱疹病毒)、细小病毒、腺病毒和严重急性呼吸综合征(SARS)相关的冠状病毒(例如SARS-CoV-2)。
在某些实施方式中，本发明所述诊断方法适用于出现肝功能障碍症状但未进行常规筛查以排除导致肝功能障碍所有可能原因的受试者。本发明所述方法可以是对出现肝功能障碍症状的受试者进行的常规化验程序的一部分，这些症状例如黄疸、腹痛和肿胀、腿部和脚踝肿胀、皮肤瘙痒、尿液颜色深、大便颜色浅、大便颜色带血、大便焦油色、慢性疲劳、恶心或呕吐、食欲不振、易于淤血等。本发明所述方法可以添加其他诊断工具一起实施，包括超声评估(例如弹性成像)、活组织检查和/或至少一种其他生物标志物的定量，例如血液中AST、ALT、ALP、TTT、ZTT、总胆红素、总蛋白、白蛋白、乳酸脱氢酶、胆碱酯酶等的水平。
在某些实施方式中，所述受试者接受了肝移植。因此，本发明特别适用于确定肝移植受试者是否存在或有发生移植排斥反应的风险。
在某些实施方式中，本发明所述方法特别适用于确定患有肝疾病的受试者是否对治疗产生响应。所述方法因此特别适用于区分响应者和无响应者。本发明公开的响应者指明的是能够产生响应的受试者，即处于缓解状态的受试者，更具体地说是未患有肝功能障碍的受试者。无响应者包括在治疗后疾病没有减轻或改善的受试者(例如，肝功能障碍保持稳定或减少)。根据本发明，治疗包括任何适用于治疗肝功能障碍的方法或药物。某些肝脏问题可以通过改变生活方式来治疗，例如停止饮酒或减肥，通常包括在仔细监测肝功能在内的医疗项目的一部分。每种肝疾病都有其特定的治疗方案。例如，甲型肝炎需要支持性护理以维持水分平衡，同时身体的免疫系统对抗并解决感染。胆囊病患者可能需要手术切除胆囊。其他疾病可能需要长期医疗护理，以控制并最小化其疾病后果。在肝硬化和晚期肝病患者中，可能需要药物来控制饮食中吸收的蛋白量。其他例子包括治疗门静脉高压所需的手术。
本发明所述方法特别适用于监测治疗的效果。通常，结合能力的降低(例如，在不同时间间隔内进行的测量)表明受试者未能通过治疗产生响应。相反，结合能力的增加(例如，在不同时间间隔内进行的测量)表明受试者对治疗产生了反应。
本发明所述方法也特别适用于在临床前或临床阶段研究中评估正在开发的药物对肝损伤的影响。
生物传感器：
本发明所述全细胞传感器还可以转化为生物传感器设备，该设备可以利用本发明所述全细胞传感器形成并部署在微环境或微流控装置中，或在多芯片模块或分布式无线网络中收集这些设备。所述生物传感器设备可以对一个或多个特定的化学和/或物理输入信息(例如热量或电流)做出反应，产生检测蛋白质形式的输出信息，并通过测热的、电化学的或优选的荧光生物发光法与物理转换器进行通信。生物传感器1可能因此包括一个包含全传感器细胞的检测组件和用于将由检测组件产生的物理变化或化学变化转化为电信号的转换器组件。根据生物标志物检测机制，本发明可用作生物传感器的转换器有五种类型：光学(比色、荧光、发光和干涉)转换器、基于质量的(压电式和声波式)转换器、基于磁场的转换器、电化学(电流、电位和电导)转换器和量热转换器。在某些实施方式中，该设备可能包括用于测量其他靶标参数的附加测量设备。通常，所述系统包括适用于测量生理表型的附加设备。所述生理表型可能包括生理参数，例如体温、脉搏率、血压、呼吸率、水分状态等等。在某些实施方式中，所述系统包括输入/输出模块、分析模块和报告生成模块。所述输入/输出模块被配置用于可选地通过关联通信设备与其他参数结合地接收胆汁盐的量。所述分析模块被配置用于分析包括胆汁盐量在内的不同参数。所述报告生成模块被配置用于根据不同参数的分析生成的受试者的概况。在某些实施方式中，所述系统包括共享模块，用于基于生成的受试者概况的比较，与一个或多个利益相关者共享一个或多个预格式化信息。在某些实施方式中，所述系统包括向受试者提供建议，以警告受试者患有肝功能障碍的风险。在某些实施方式中，所述系统包括向外部操作者(例如医生)传输允许一个或多个消息，以警告该受试者患有或有风险患肝功能障碍。因此在某些实施方式中，所述设备包括一个通信设备。通信设备的例子包括但不限于手机、平板电脑、台式计算机等等。各种介质可用于连接，包括互联网、局域网、蓝牙、Wi-Fi等等。在某些实施方式中，所述通信设备与服务器相连。由测量设备测量的一个或多个参数的测量结果实际上可以通过无线传输方式传输到包括微处理器的手持设备上。所述手持设备可以是智能手机、平板设备、手机、移动互联网设备、上网本、笔记本电脑、个人数字助理、网络电话、全息设备、全息电话、有线网络设备、卫星网络设备、互联网电视、DSL网络设备和遥控器。
试剂盒：
本发明的另一个目的涉及用于实施上述公开方法的试剂盒。所述试剂盒包括一个或多个如上所述的全细胞传感器和测定检测蛋白表达水平的装置。本发明的试剂盒中还可以提供用于检测的特定类型试剂。在某些实施方式中，所述试剂盒包括如上所述的生物传感器设备。此外，所述试剂盒还包括各种稀释液和缓冲液、标记的共轭物或其他用于检测特异性免疫复合物的试剂。试剂盒的其他组分可以被本领域技术人员容易的确定。
治疗方法:
所述原核宿主细胞也特别适用于治疗目的。特别地，本发明所述工程化的原核宿主细胞适用于在肠道中发挥作用，并且在到达胆汁盐存在的肠道微环境时会被特异性激活。所述原核宿主细胞特别适用于在肠道中表达治疗性分子(多核苷酸或多肽)。在胆汁盐存在的情况下，可以触发输出治疗分子的表达。
因此，本发明的另一个目的涉及对有需要的受试者进行治疗的方法，其中，包括向受试者施用有效剂量的本发明所述原核宿主细胞，其包含编码治疗分子的多核苷酸。
本发明所述方法可以治疗的疾病的例子包括但不限于，肥胖症、炎症性肠道疾病、结直肠癌、肝脏疾病和肝胆疾病。在某些实施方式中，所述疾病或紊乱是消化性溃疡疾病、肝硬化、炎症性肠病、感染、癌症、血管紊乱、药物副作用或凝血障碍。在某些实施方式中，所述受试者患有或有患炎症性肠病的风险。炎症性肠病(IBD)是指小肠和结肠的一组炎症性疾病。在某些实施方式中，所述IBD是克罗恩病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、转流性结肠炎、贝赫切特病或不明原因的结肠炎。
在某些实施方式中，所述原核宿主细胞被施用于肠道中。
在某些实施方式中，本发明所述原核宿主细胞被包埋以保护其免受胃酸的侵蚀。因此，在某些实施方式中，本发明所述原核宿主细胞以包埋的形式制备成组合物，以显著提高其存活时间。在这种情况下，胶囊的存在尤其可以延迟或防止原核宿主细胞在胃肠道中被降解。可以理解本发明实施方式所述的组合物可以被包埋在肠溶包衣、定时释放的胶囊或片剂中。所述肠溶包衣使得胶囊/片剂在通过胃肠道时保持完好无损(即未溶解)，直到到达肠道。封装活菌细胞的方法在本领域中是众所周知的(参见，例如General Mills Inc.的美国专利，如美国专利号6,723,358)。例如，可以使用肠溶性包衣实现包埋，优选为，甲基丙烯酸-丙烯酸烷基酯共聚物，如聚合物。聚(甲基)丙烯酸已被证明是一种特别适合用作包衣的物质。
在某些实施方式中，本发明所述原核宿主细胞以食品组合物的形式施用于受试者。在某些实施方式中，所述食品组成选择自完全食物组合物、饮食补充剂、营养品组合物等等。本发明所述组合物可用作食品成分和/或饲料成分。所述食品成分可以采用溶液或固体的形式，具体取决于使用和/或应用的方式和/或给药的方式。食品和食品补充剂组合物例如发酵乳制品或乳制品，优选地，每天一次或多次给药或口服摄入。可以直接使用本发明所述菌株在生产过程中制作发酵乳制品，例如将其添加到食品基料中，采用已知的方法。在此方法中，除了通常使用的微生物外，还可以使用本发明所述菌株，和/或取代一种或多种或部分通常使用的微生物。发酵乳制品包括基于奶的产品，例如(但不限于)甜点、酸奶、酸奶饮料、凝乳、克非尔、发酵牛奶饮料、酪乳、奶酪、调味品、低脂肪酱、新鲜奶酪、大豆饮料、冰激凌等。另外，食品和/或食品补充剂组合物也可以是非乳制品或非发酵乳制品(例如，非发酵乳或其他食品媒介中的菌株或无细胞培养基)。非发酵乳制品可能包括冰激凌、营养棒和调味品等等。非乳制品可能包括粉末饮料和营养棒等等。
在某些实施方式中，包含本发明所述原核宿主细胞的食品组合物含有至少一种益生元，即旨在促进本发明所述原核宿主细胞在肠道中生长的食品材料。所述益生元可以选择自由低聚糖，和可选地包含果糖、半乳糖、甘露糖、大豆和/或菊糖组成的组；和/或膳食纤维。
在本发明的上下文中，施用于受试者的所述原核宿主细胞剂量将取决于个体的特征，例如一般健康状况、年龄、性别、体重等。熟练的技术人员能够根据这些和其他因素确定恰当的剂量。例如，所述原核宿主细胞应该能够产生菌落足以对受试者产生有益效果。如果所述原核宿主细胞被以食品的形式施用，通常每克干重的食品组成物中含有103到1012cfu的本发明所述原核宿主细胞。
筛选方法：
本发明所述原核宿主细胞还特别适用于筛选目的。特别地，本发明所述原核宿主细胞特别适用于药物的筛选，适用于例如抑制病原体信号通路的药物。在这种情况下，该系统是副溶血性弧菌毒力激活通路的重构版本。由于该系统是在非致病原核宿主细胞中重建，例如大肠杆菌中，且可以通过检测可检测的输出分子被轻松监测激活情况，该系统可作为高通量筛选化合物文库的平台，以识别可用于治疗的新的副溶血性弧菌毒力的抑制剂(或激活剂)。
因此，本发明公开的另一个目标涉及一种筛选多种测试物质的方法，包括：(1)在一定量的胆汁盐存在下，将本发明所述原核宿主细胞群体与所述多种测试物质接触，以及(2)选择能够调节输出分子表达的测试物质。
本发明所述测试物质可以选自先前合成的物质文库、或已在数据库中确定结构的物质文库，或重新合成的物质文库。所述测试物质可以选择自由(a)蛋白质或肽、(b)核酸以及(c)有机或化学物质组成的组。
在某些实施方式中，所述方法包括以下步骤：将输出分子(例如检测蛋白质)的表达水平与未加入测试物质时测定的表达水平进行比较，并趋向于选择提供输出分子表达水平降低或增加的测试物质。
本发明将通过以下图片和实施例进行进一步说明。但是，这些实施例和图片不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
附图说明
图1.VtrAC生物传感器的结构和机理。所述CadC DBD与VtrA的跨膜和周质结构域融合。CadC-VtrA和VtrC分别受P9和P5启动子的控制。胆汁盐结合VtrA/VtrC异二聚体的复合物促进CadC-VtrA的寡聚化并激活GFP报告基团下游的表达。
图2.VtrAC生物传感器的剂量响应曲线。VtrAC-EMeRALD受体对提高胆汁盐牛磺胆脱氧胆酸(TDCA)浓度的转移函数。实验是在不同的三天里进行的三次重复实验的平均值。误差带：+/-SD。RPU：参考启动子单位。
图3.CadC-VtrAC系统对不同类型的胆汁盐的响应。激活的细胞和未激活的细胞通过门控被进一步区分。用于分析的不同胆汁盐在Y轴左侧上标记。
图4.VtrAC-EMeRALD系统的胆汁盐特异性图谱。将过夜培养的细胞利用胆汁盐浓度为80uM的LB培养基以1：100稀释，然后在37℃下生长16小时后用流式细胞术分析。数值代表流式细胞术数据的几何平均数。所有实验是在不同的三天里进行的三次重复实验的平均值。误差带：+/-SD。RPU：参考启动子单位。
具体实施方式
材料和方法
质粒和菌株
所有构建都通过等温Gibson组装克隆到带有p15a复制起点和氯霉素抗性基因的J64100_p15A质粒中。所有实验都是使用E.coli菌株NEB10β(New England Biolabs)进行的。质粒和材料将通过Addgene提供。
具有sfGFP荧光输出的合成胆汁盐受体的功能表征
对于使用组成型启动子进行构建的实验，编码不同构建的质粒被转化入化学感受态E.coli NEB10β(New England Biolabs)细胞中，接种于添加了25μg/mL氯霉素的LB琼脂平板并在37℃下孵育过夜。对于每次测量，挑选三个新克隆的菌落接种到5mL的LB/氯霉素培养基中并在37℃下剧烈震荡生长16-18小时。第二天，将培养物在96深孔板(Greinerbio-one)中以1:100稀释到含有不同胆汁盐浓度的的1mL的LB/氯霉素培养基中，在37℃下再剧烈震荡培养4小时，并通过流式细胞术进行分析。所有实验在三个不同的日子至少进行三次，一式三份。用于胆汁盐特异性分布图的实验，每种胆汁盐以80μM的浓度进行实验。对于使用诱导型启动子构建的实验，将过夜培养物在96深孔板中以1:100稀释到含有不同IPTG浓度，1.5mM苯甲酸和不同胆汁盐浓度的1mL的LB/氯霉素培养基中。然后按照与组成型启动子相同的程序进行构建实验。本研究中使用的所有化学品均来自Sigma-Aldrich。
相对启动子单位(rpus)的计算
在不同实验中进行的荧光强度测定通过根据每个实验中平行生长的参考值构建的E.coli菌株NEB10β的荧光强度来标准化并转换为RPUs。我们使用组成型启动子J23101和RBS_B0032作为体内参照标准，并将超折叠的GFP作为报告基团放置在pSB4K5质粒中。我们量化了流式细胞术数据的荧光强度(MFI)的几何平均数，并根据以下公式计算RPUs：
RPU＝(MFIsample)/(MFIreferencepromoter)
流式细胞仪分析
使用配有高通量自动进样器(Thermo Fisher Scientific)的Attune NxT细胞计数仪和Attune NxTTMVersion 2.7软件进行流式细胞术试验。每个数据点共计采集了30,000个细胞。Attune NxT实验在96孔板中进行，设置如下：FSC：200V，SSC：380V，绿色强度BL1：440V(488nm激光和510/10nm的滤光片)。流式细胞术数据使用FlowJo 10.0.8r1(TreestarInc.，Ashland，USA)进行分析。
结果
肝脏是协调着代谢、解毒和免疫过程的重要器官。包括肝炎、肝硬化、脂肪肝和癌症在内的肝脏疾病是主要的公众健康问题并且需要大规模的筛查方法来进行预防、诊断和治疗监测。通常通过量化血清酶活性和胆红素来监测肝功能，但这些标志物只有当损伤已经发展后才能被检测到，并且不完全具有特异性。由于缺乏特异性，肝功能通常通过同时量化多个酶活性来监测。血清和尿液中的胆汁盐是肝功能障碍早期诊断可选择的生物标志物，但目前的检测方法不实用且难以规模化。在此，我们构建了一种基于非致病性大肠杆菌的细菌生物传感器，检测临床样本中的胆汁盐病理浓度。我们重构了来自副溶血弧菌中的细菌单组分VtrA胆汁盐感应结构域，该结构域在病原体进入肠道时控制毒力操纵子的激活。我们利用VtrA作为连接到大肠杆菌CadC系统的传感结构域来工程化合成胆汁盐受体，该系统在二聚化时激活转录(图1)。我们展示了我们的细菌传感器可以检测样本中的胆汁盐浓度(图2,3,4)，我们的工作为建立灵敏、可扩展且经济实惠的肝功能障碍筛查平台开辟了途径，该平台可部署于护理点或家庭环境中并使得肝相关疾病的大规模监测成为可能。这项工作还展示了合成生物学可以如何帮助应对全球医疗保健的挑战，并提供了破译和靶向基本细胞机制的工具，在此处是病原体信号传导。
参考文献：
在本申请中，各种参考文献描述了本发明所涉及技术领域的现状。这些参考文献的公开内容通过引用被纳入本申请的公开范围内。

Claims (21)

1.一种融合蛋白，其中“VtrA”多肽与DNA结合域融合，所述“VtrA”多肽具有与如SEQ IDNO：1所示从第134位氨基酸残基到第253位氨基酸残基范围内的氨基酸序列具有90％的同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述DNA结合域是E.coli CadC转录激活因子的DNA结合域，其包含与如SEQ ID NO：3所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述VtrA多肽直接或通过连接肽与所述DNA结合域融合。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中，所述VtrA多肽通过包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的连接肽与E.coli CadC转录激活因子的DNA结合域融合。
5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由与如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列组成。
6.编码权利要求1所述融合蛋白的多核苷酸。
7.一种表达框，包含权利要求6所述的多核苷酸和与其可操作连接的控制序列，允许在原核宿主细胞中表达。
8.根据权利要求7所述的表达框，其中，所述启动子选自由p14、p10或p9启动子组成的组，其分别具有如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核酸序列。
9.一种原核宿主细胞，通过基因工程改造权利要求6所述的多核苷酸或权利要求7所述的表达框获得。
10.根据权利要求9所述的原核宿主细胞，选自拟杆菌属、梭菌属、梭杆菌属、真杆菌属、瘤胃球菌属、消化球菌属、消化链球菌、双歧杆菌、埃希氏菌和乳酸菌菌属的细菌。
11.根据权利要求9所述的原核宿主细胞，所述原核宿主细胞为E.coli。
12.根据权利要求9所述的原核宿主细胞，其中，包括编码具有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的VtrC多肽的多核苷酸，其中，可选地，所述多核苷酸可操作性地连接到具有如SEQID NO：9所示核酸序列的启动子p5。
13.根据权利要求9的原核宿主细胞，其中，进一步地包括至少一种编码输出分子的多核苷酸，其表达受权利要求1所述的融合蛋白控制。
14.根据权利要求9所述的原核宿主细胞，其中，进一步地包括编码与SEQ ID NO：10所示的CadBA启动子可操作连接的输出分子的多核苷酸。
15.根据权利要求14的原核宿主细胞，其中，所述输出分子为检测蛋白，例如荧光蛋白。
16.根据权利要求14的原核宿主细胞，其中，所述输出分子为治疗性多肽。
17.一种检测样本中是否存在胆汁盐的方法，包括(1)至少提供权利要求15所述的原核宿主细胞；(2)将所述原核宿主细胞与疑似含有所述胆汁盐的样品接触足够长的时间，使融合蛋白的寡聚结合，然后表达检测蛋白；以及(3)检测所述检测蛋白的表达水平，其中，所述表达水平与所述样品中存在的胆汁盐的量相关。
18.一种确定受试者是否患有肝功能障碍或具有肝功能障碍风险的方法，包括(1)提供至少一种权利要求9所述的原核宿主细胞；(2)将从受试者获得的样品与原核宿主细胞接触足够的时间，以允许所述融合蛋白的寡聚结合，然后表达检测蛋白；以及(3)检测所述检测蛋白的表达水平，其中，所述表达水平与所述样品中存在的胆汁盐含量相关，并且其中所述胆汁盐的含量表明受试者是否患有肝功能障碍或具有患有肝功能障碍的风险。
19.一种治疗有需要的受试者的方法，包括向受试者施用有效剂量的权利要求16所述的原核宿主细胞。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，将所述方法用于治疗肥胖症、炎症性肠道疾病、结直肠癌、肝脏疾病和肝胆疾病。
21.一种筛选多种测试物质的方法，包括(1)在一定量的胆盐存在下，将权利要求15所述的原核宿主细胞群体与所述多种测试物质接触，以及(2)选择能够调节输出分子表达的测试物质。
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