CN116917491A - 抗体递送 - Google Patents

抗体递送 Download PDF

Info

Publication number
CN116917491A
CN116917491A CN202180084599.XA CN202180084599A CN116917491A CN 116917491 A CN116917491 A CN 116917491A CN 202180084599 A CN202180084599 A CN 202180084599A CN 116917491 A CN116917491 A CN 116917491A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
vector
antibody fragment
aav
promoter
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180084599.XA
Other languages
English (en)
Inventor
格雷戈里奥·德尔瓦尔
达米安·内沃特里斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AC Immune SA
Original Assignee
AC Immune SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by AC Immune SA filed Critical AC Immune SA
Publication of CN116917491A publication Critical patent/CN116917491A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14145—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/20—Vector systems having a special element relevant for transcription transcription of more than one cistron
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

载体包含编码抗体或抗体片段的多核苷酸，所述抗体或抗体片段用于在对象中治疗中枢神经系统(CNS)的疾病或病症的方法，其中所述载体转导或转染血脑屏障(BBB)之细胞并且经转导或经转染的BBB细胞表达所述抗体或抗体片段，导致将所述抗体或抗体片段递送到CNS中，优选递送到脑实质中。可用于这样的载体的表达盒可从5’至3’包含：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因和编码所述抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子，并且还包含在编码所述抗体或抗体片段的轻链的第一基因之后且在编码所述抗体或抗体片段的重链的第二基因之前的IRES，或者与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因可操作地连接的第一启动子和与编码所述抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的第二启动子。由此产生的抗体和抗体片段可具有更高的品质，展示出更低水平的聚集和不希望的免疫原性。

Description

抗体递送
技术领域
本发明涉及这样的方式和方法，其用于通过载体(例如病毒载体等)将编码抗体或抗体片段的基因有效递送至来自血脑屏障(blood-brainbarrier，BBB)或中枢神经系统(central nervous system，CNS)的细胞(例如脑内皮细胞)，以在细胞中产生释放至CNS(优选释放到脑实质中)的抗体分子。通过将抗体基因递送到BBB或CNS中，特别是脑内皮细胞中，本发明还涉及提高中枢神经系统(CNS)中抗体浓度的方法。通过这种方法递送治疗性抗体可用于治疗多种起源于CNS的疾病或病症，例如神经退行性疾病或病症、运动疾病或病症、脑相关肿瘤、精神病和CNS神经炎症等。在一个方面中，本发明来源于意想不到的发现，该发现即通过载体(例如腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体)在体外转导脑内皮细胞导致高品质抗体大量分泌到基底外侧空间中。本发明还描述了通过改变链位置、使用不同的分泌肽以及定制上游、内部和下游调节元件而获得的出乎意料的高抗体表达产量和改善的蛋白质品质。本发明绕过了与通过需要以足够的治疗剂量穿过血脑屏障将治疗性抗体递送至脑相关的困难。本发明适用于任何哺乳动物，尤其是人对象，并且旨在改善治疗性抗体向脑的递送。因此，本发明可用于治疗与患有CNS疾病或病症的患者相关的疾病、障碍或病症，其包括但不限于：淀粉样蛋白β蛋白相关疾病、TDP-43-蛋白质病、α-突触核蛋白病、Tau蛋白病、三核苷酸重复疾病(包括多聚谷氨酰胺疾病例如亨廷顿病)、脑相关癌症和肿瘤、癫痫、精神疾病(psychiatric disease)、神经炎性疾病、神经肌肉疾病、病毒诱发的脑炎和以小胶质细胞功能障碍为特征的疾病。
背景技术
血脑屏障(BBB)是结构性和功能性屏障，其保护脑免受血液携带的病原体和毒素的侵害，而且维持用于适当的神经元在中枢神经系统(CNS)中发挥作用所需的严格调节的微环境[1,2]。BBB由三种细胞类型构成：形成血流与脑之间的物理屏障的内皮细胞(endothelial cell，EC)，以及位于EC层的非内腔表面的两种壁细胞，即周细胞和星形胶质细胞[3]。尽管脑内皮细胞有助于BBB的主要功能，但这三种细胞类型构成了大多数脊椎动物的整个血脑屏障。它们的相互作用和交流对于维持严格调节的CNS稳态是至关重要的。
与内皮细胞相比，脑内皮细胞具有独特的特性；它们通过紧密连接(tightjunction，TJ)连接在一起，紧密连接是限制化合物通过细胞旁空间扩散的多蛋白连接网络。虽然小分子(例如水、氧和小脂溶性物质)可容易地从血液穿过进入脑中，但紧密连接阻止了大分子扩散进入脑，包括抗体。[4]
这种严格调节进入脑是针对开发生物制剂、针对涉及中枢神经系统(CNS)的疾病的主要挑战之一。实际上，已报道了在外周施用之后，约0.1％至0.3％的经注射的抗体到达脑[5][6]。即使使用高注射剂量，在脑中获得足够浓度的抗体以引发治疗性应答通常仍是挑战。该缺点已被描述为临床试验期间被动免疫治疗失败的可能原因之一。([7])
在过去的数十年期间，已开发了替代的非侵入性方法例如受体介导的转胞吞作用([8])、纳米颗粒递送[9][10]鼻内递送[11,12]或基于细胞的技术([13,14])以提高大分子在脑中的渗透。然而，报道了主要与制造挑战[15]、体内靶点介导的药物处置[16][17]或经修饰的蛋白质的疑似抗原性[18]相关的有限的效力。
在最近的研究[14]中，作者报道了由离体转染的能够归巢至BBB并表达治疗性抗体的自体内皮前体细胞(endothelial precursor cell，EPC)组成的细胞靶向递送系统。然而，即使观察到成功的离体转染，但预期在静脉内移植之后经改造的EPC的归巢有限[19]，这降低了这样的方法的治疗潜力。动脉内注射可以是合适的替代，但仍然具有挑战性，因为必须仔细评价和优化细胞剂量、输注速度和细胞类型。[20]
根据使用病毒载体的基因治疗，基于使用经修饰以在其基因组中包含目的转基因的病毒将治疗性基因引入到特定器官、组织或细胞类型中，可将目的基因直接递送到CNS中。已用于基因递送治疗的病毒载体基于但不限于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒。
腺相关病毒(adeno-associated viruse，AAV)为基因递送提供了有效且临床安全的平台，如由最近的以下批准所证明的：(voretigeneneparvovec-rzyl)，其是首个批准的为患有由于RPE65基因的两种拷贝均突变的遗传性视网膜疾病的患者提供RPE65基因的功能性拷贝的基于AAV2的治疗，以及/>(onasemnogeneabeparvovec-xioi)，其是将SMN1基因的功能性拷贝递送至脊髓性肌萎缩症(spinalmuscular atrophy，SMA)患者中运动神经元的AAV9载体。
AAV还被用作用于将基因转移至神经系统使得能够进行基因表达、敲低和基因编辑的载剂[21]。然而，这些应用中的大部分依赖于AAV载体的侵入性、局部注射(室内(intraventricular)施用、鞘内施用或脑池内施用)，以便1)绕过血脑屏障和2)在时间和空间上限制转基因表达。
不同的野生型血清型，包括AAV2，可转导BBB但不能穿过BBB，因此需要进行侵入性手术用于将其递送到脑[22,23]。相比之下，静脉内施用AAV9血清型可克服BBB并进入CNS，导致基因转移至脑和脊髓[24,25]。
最近报道的经改造的衣壳载体例如但不限于基于AAV9的AAV-S、AAV-F[26]或AAV-PHP.eB([27-29])提供了良好的脑转导，其中穿过成年小鼠许多区域的神经元和星形胶质细胞的大部分是使用静脉内施用途径来转导的。类似地，报道了基于AAV2的AAV-BR1(本文中可互换地称为AAV2-BR1)衣壳[30]或更近期的AAV9-PHP.V1[31]在持久的转基因表达的情况下选择性转导脑内皮细胞，其具有治疗神经血管疾病的潜力。
AAV介导的完整的免疫球蛋白(IgG)或不含Fc结构域的抗体片段的表达表明在CNS内用于多种适应证[32-44]，但也报道了两种形式的固有局限性[[32,45,46]]。实际上，AAV表达盒的包装尺寸对完整的IgG基因施加了设计限制，其中包含重链和轻链基因二者的所有转录和翻译所需的元件均需要低于4.7kb。迄今为止，大部分构建体由单个启动子组成并且因此需要在抗体重链基因(HC)与轻链(LC)之间使用自加工序列，例如弗林蛋白酶2A(F2A)[47-49]。由于高表达效价、小F2A序列尺寸(仅60至80个碱基对)和抗体链表达中的等摩尔性(equimolarity)，研究人员对这种构建体具有明显偏好。然而，并且在大部分情况下，F2A肽仍然与重链或轻链连接，这可能引发所表达蛋白质或抗体表达细胞的不希望的免疫原性[45]。用于双顺反子抗体表达的内部核糖体进入位点(internal ribosomal entrysite，IRES)已被描述为自切割序列的替代物，但由于重链和轻链表达上的不平衡，通常获得较低的蛋白质表达。虽然抗体片段例如scFv或单结构域抗体由于单顺反子表达而与完整的IgG分子相比存在一些优势，例如更高的蛋白质效价，但所述片段缺乏Fc效应子功能并且不具有FcRn结合能力，导致体内半衰期较短。缺乏Fc结构域的片段随后无法募集效应细胞以清除脑实质中的病理复合物，并存在通过反向转胞吞作用降低结合抗原从脑至血液的流出[32,50至52]。由于这样的分子的单价结合能力，观察到比IgG对应物更低的亲和力。因此，与片段相比，分泌的靶向和清除胞外蛋白病的完整的IgG可以是优选的选择，但需要开发规避当前局限性的方法，以允许高品质表达以提高抗体暴露、募集效应细胞并降低原位产生的IgG的不希望的免疫原性的风险。
发明内容
在此，首次描述了递送方法，该方法通过使用载体(例如病毒载体)或者另一种载体(例如脂质体或纳米颗粒)将编码抗体或抗体片段的基因递送至来自血脑屏障(BBB)的细胞，例如但不限于脑内皮细胞，以局部地使得治疗性抗体分子进入CNS，优选进入脑实质中。通过这种新方法产生的抗体可用于治疗CNS相关病症。在这样的情况下，BBB的细胞(脑内皮细胞和/或周细胞和/或星形胶质细胞)提供进入CNS，特别是脑实质中的高品质抗体的长期表达。
这种新策略绕过了需要穿过血脑屏障以使达到足够治疗剂量的抗体进入CNS，优选进入脑实质中的传统被动免疫策略的障碍。
本发明还涉及用于产生抗体和抗体片段的改善的表达盒，其通过改变链位置、使用不同的分泌肽和定制内部和下游调节元件来产生意想不到的相对于现有技术中先前报道的策略更高的抗体表达产量和改善的蛋白质品质。
本发明部分基于以下发现：载体可用于将编码抗体或抗体片段的多核苷酸递送至血脑屏障(BBB)的细胞。由BBB的细胞表达的编码抗体或抗体片段的多核苷酸导致将该抗体或抗体片段递送到CNS(优选递送到脑实质)中。该发现提出了绕过传统策略的局限性的新策略，传统策略依赖于治疗性抗体穿过BBB以便实现足够治疗剂量的抗体进入CNS，优选进入脑实质中，以治疗CNS的疾病或病症。
因此，在一个方面中，本发明提供了包含编码抗体或抗体片段的多核苷酸的载体，该抗体或抗体片段用于在对象中治疗中枢神经系统(CNS)的疾病或病症的方法，其中载体转导或转染血脑屏障(BBB)的细胞，并且经转导或经转染的BBB细胞表达该抗体或抗体片段，导致将该抗体或抗体片段递送到CNS中。
与依赖于将抗体或抗体片段直接递送至对象的常规抗体治疗相比，通过将本文中所述的包含编码抗体或抗体片段的多核苷酸的载体靶向至BBB，被递送至CNS(优选递送到脑实质中)的抗体或抗体片段的量提高。如别处所述，已报道了在外周施用之后，仅约0.1％至0.3％的经注射的抗体到达脑。相比之下，发明人发现使用AAV载体将编码抗体(MAB1)的多核苷酸引入到脑内皮细胞系导致MAB1的非极化分泌。这意味着该技术可用于将抗体或抗体片段表达到CNS中，优选地表达到脑实质中。
CNS由两种主要组分，即脑和脊髓组成。感觉冲动传递到CNS并且运动冲动从CNS传递过来。CNS还协调整个神经系统的活动。在一个实施方案中，根据本发明应用的载体转导或转染血脑屏障(BBB)的细胞并且经转导或经转染的BBB细胞表达该抗体或抗体片段，导致将该抗体或抗体片段递送到CNS中。CNS包含多种细胞类型，并且在一个实施方案中，抗体或抗体片段被递送到CNS中的至少一种(多至所有)细胞类型中。在一个实施方案中，抗体或抗体片段可递送至：脑内皮细胞、神经元、周细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和室管膜细胞。因此，可递送至CNS的神经元和非神经元(胶质)细胞。在一个实施方案中，抗体或抗体片段从BBB细胞分泌到CNS中。例如，BBB细胞中至少20％的表达的抗体或抗体片段被递送到CNS中。在一个实施方案中，BBB细胞中至少30％的表达的抗体或抗体片段被递送到CNS中。在一个实施方案中，BBB细胞中至少40％的表达的抗体或抗体片段被递送到CNS中。在一个实施方案中，BBB细胞中至少50％的表达的抗体或抗体片段被递送到CNS中。在一个实施方案中，BBB细胞中至少60％的表达的抗体或抗体片段被递送到CNS中。在一个实施方案中，BBB细胞中至少70％的表达的抗体或抗体片段被递送到CNS中。在一个实施方案中，BBB细胞中至少80％的表达的抗体或抗体片段被递送到CNS中。在一个实施方案中，BBB细胞中至少90％的表达的抗体或抗体片段被递送到CNS中。
在一个优选的实施方案中，将抗体或抗体片段递送到脑实质中。本文中使用的“脑实质”是指由神经元和胶质细胞构成的脑功能性组织。根据本发明应用的载体转导或转染血脑屏障(BBB)之细胞，并且经转导或经转染的BBB细胞表达抗体或抗体片段，导致将该抗体或抗体片段递送到脑实质中。在一个实施方案中，抗体或抗体片段从BBB细胞分泌到脑实质中。例如，BBB细胞中至少20％的表达的抗体或抗体片段被递送到脑实质中。在一个实施方案中，BBB细胞中至少30％的表达的抗体或抗体片段被递送到脑实质中。在一个实施方案中，BBB细胞中至少40％的表达的抗体或抗体片段被递送到脑实质中。在一个实施方案中，BBB细胞中至少50％的表达的抗体或抗体片段被递送到脑实质中。在一个实施方案中，BBB细胞中至少60％的表达的抗体或抗体片段被递送到脑实质中。在一个实施方案中，BBB细胞中至少70％的表达的抗体或抗体片段被递送到脑实质中。在一个实施方案中，BBB细胞中至少80％的表达的抗体或抗体片段被递送到脑实质中。在一个实施方案中，BBB细胞中至少90％的表达的抗体或抗体片段被递送到脑实质中。
如别处已描述的，BBB是结构性和功能性屏障，其保护脑免受血液携带的病原体和毒素的侵害。BBB由三种细胞类型构成：内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞。虽然发明人的发现主要涉及BBB的内皮细胞，但发明人的观察结果可同样适用于BBB的其他细胞。因此，在一个实施方案中，载体将编码抗体或抗体片段的多核苷酸转导或转染至选自以下的细胞类型：内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞。载体可转导或转染BBB的一种特定细胞类型。例如，载体可转导或转染BBB的周细胞。在另一个实例中，载体可转导或转染BBB的星形胶质细胞。如上所述，在转导或转染之后，抗体或抗体片段被表达。
在一个优选的实施方案中，载体转染或转导BBB的内皮细胞。用本文中所述的多核苷酸转染或转导BBB内皮细胞是优选的，因为BBB内皮细胞具有慢的更新速率，这可证明对于进入CNS中优选进入脑实质中的抗体或抗体片段在体内的长期表达是最佳的。
或者，载体可转导或转染BBB的多种细胞类型。例如，载体可转导或转染BBB的内皮细胞和星形胶质细胞。或者，载体可转导或转染BBB的内皮细胞和周细胞。作为另一个替代方案，载体可转导或转染BBB的星形胶质细胞和周细胞。在另一个替代方案中，载体可转导或转染BBB的内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞。如上所述，在转导或转染之后，抗体或抗体片段被表达。
在一些实施方案中，包含编码抗体或抗体片段的多核苷酸的载体可选择性地靶向BBB的细胞。例如，可通过使用亲神经载体实现靶向BBB的特定细胞。亲神经载体可以是病毒载体，该术语包括经改造的形式。病毒载体通常不能复制。可将多核苷酸并入到BBB的细胞的基因组中。亲神经载体的一个实例是单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)。本文中使用的“亲神经载体”是指分别与非BBB和/或非CNS细胞相比，优先转导或转染BBB之细胞和/或CNS之细胞的载体。因此，在一个实施方案中，载体包括亲神经载体。在另一个实施方案中，载体包括经修饰的HSV。
选择性靶向BBB之细胞的替代途径是利用在载体表面上表达或包含(特别是在表面，例如在病毒衣壳中)将载体靶向BBB之细胞的肽、小分子(SME)、抗体或其抗体片段、蛋白质、纳米颗粒、脂质、寡核苷酸、适配体或阳离子分子。
在一个实施方案中，载体在载体表面表达将载体靶向BBB之细胞的肽。换言之，在载体表面上表达或包含的肽、小分子、抗体或其抗体片段、蛋白质、纳米颗粒、脂质、寡核苷酸、适配体或阳离子分子赋予了靶向BBB的细胞的特异性。在另一个实施方案中，在载体表面上表达或包含的肽或其他列出的分子将载体靶向BBB的特定细胞类型。合适的肽以及包括噬菌体展示法在内的用于产生和测试这样的肽的方法的一些实例是本领域已知的。例如，肽可包含参与细胞转胞吞作用的配体或受体靶向肽。这样的肽允许使用受体介导的转胞吞作用将载体摄取到BBB的细胞中。在一个实施方案中，肽靶向选自以下的受体：转铁蛋白受体、胰岛素受体和低密度脂蛋白受体。在另一个实施方案中，肽包括转铁蛋白肽。一个示例性BBB靶向肽是包含在AAV2毒株中的NRGTEWD(SEQ ID NO:15)肽，在一些实施方案中，AAV-BR1肽例如这些可并入非病毒载体中。
因此，载体可携带突变，例如载体表面蛋白质(例如病毒衣壳蛋白)中的插入、缺失或替换，这导致将载体靶向至BBB的细胞。在一个特定的实施方案中，载体可包含将载体靶向至BBB之细胞的突变。
作为替代或补充，包含编码抗体或抗体片段的多核苷酸的亲神经病毒载体可用于选择性靶向BBB的细胞。
术语“载体”是本领域公知的，并且在本发明的上下文中适合用于将多核苷酸转运(通过转导或转染)到宿主细胞中。该定义包括非病毒载体和病毒载体二者。病毒载体或非病毒载体可靶向来自BBB或CNS的细胞，例如但不限于脑内皮细胞，以局部地使得治疗性抗体分子进入CNS，优选进入脑实质中。通过这种新方法产生的抗体，特别是治疗性抗体可用于治疗CNS相关疾病。在这样的情况下，脑内皮细胞和/或周细胞和/或星形胶质细胞充当储库，以提供进入CNS，优选进入脑实质的抗体的高品质和长期表达。
非病毒载体包括但不限于有机纳米材料例如脂质体、外排体、树枝状聚合物和胶束，或无机纳米材料例如金纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒和碳纳米管。在一个实施方案中，非病毒载体在载体表面表达将载体靶向至BBB的细胞的肽、小分子(SME)、抗体或其抗体片段、蛋白质、纳米颗粒、脂质、寡核苷酸、适配体或阳离子分子。
病毒载体包括但不限于野生型病毒和经改造的(例如经修饰的)病毒。病毒载体的一些实例包括但不限于腺相关病毒(AAV)、腺病毒、逆转录病毒、鼻病毒、慢病毒、肝炎、HSV和任何病毒样颗粒。如本领域已知的，病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)是模拟真实天然病毒的组织和构象但缺乏病毒基因组的多蛋白结构。本发明来源于意想不到的发现，即通过AAV载体转导脑内皮细胞导致由脑内皮细胞分泌高品质和大量的抗体。因此，在一个实施方案中，病毒载体是AAV。AAV可以是任何合适的血清型，其一些实例包括但不限于AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型3(AAV3)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AAV6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)、AAV血清型10(AAV10)、AAV血清型11(AAV11)或AAV血清型12(AAV12)，或者任何其他野生型血清型或经改造的AAV。更特别地，AAV可选自：AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)和AAV血清型10(AAV10)。在另一个实施方案中，病毒载体选自：AAV2、AAV8、AAV9和AAVrh.10(AAV恒河猴分离株10)。
在另一个实施方案中，病毒载体是经改造的AAV。经改造的AAV可以是经改造的AAV2、经改造的AAV9、经改造的AAV1或经改造的AAV10。在一个优选的实施方案中，经改造的AAV2是AAV-BR1。在另一个优选的实施方案中，经改造的AAV9是AAV-S、AAV-F、AAV-PHP.eB或AAV9-PHP-V。在另一个优选的实施方案中，经改造的AAV1是AAV1RX、AAV1R6或AAV1R7。经改造的AAV1的更多细节在通过引用并入本文的Albright BH et al.[53,54]中提供。在一个最优选的实施方案中，载体是对BBB内皮细胞具有特异性的AAV-BR1或AAV9-PHP-V1。
在另一个实施方案中，载体包含病毒元件和非病毒元件。病毒体是包含病毒元件和非病毒元件二者的载体的一个实例。另一个实例是与阳离子脂质混合的病毒载体。
本文中描述的所有载体均包含编码抗体或抗体片段的多核苷酸。多核苷酸可包含DNA或RNA。例如，多核苷酸可包含另外的组分以帮助编码抗体或抗体片段的序列在BBB的细胞中表达(例如翻译)。例如，编码抗体或抗体片段的多核苷酸包含在表达盒内。在一个实施方案中，表达盒包含选自以下的核苷酸序列、基本上由选自以下的核苷酸序列组成或者由选自以下的核苷酸序列组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。
在另一个实施方案中，表达盒包含与选自以下的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。在另一个实施方案中，表达盒包含与选自以下的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。在另一个实施方案中，表达盒包含与选自以下的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQID NO:10。在另一个实施方案中，表达盒包含与选自以下的核苷酸序列具有至少91％同一性的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。在另一个实施方案中，表达盒包含与选自以下的核苷酸序列具有至少92％同一性的核苷酸序列：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9或SEQ ID NO:10。在另一个实施方案中，表达盒包含与选自以下的核苷酸序列具有至少93％同一性的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。在另一个实施方案中，表达盒包含与选自以下的核苷酸序列具有至少94％同一性的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:10。在另一个实施方案中，表达盒包含与选自以下的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列：SEQ IDNO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。在另一个实施方案中，表达盒包含与选自以下的核苷酸序列具有至少96％同一性的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。在另一个实施方案中，表达盒包含与选自以下的核苷酸序列具有至少97％同一性的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。在另一个实施方案中，表达盒包含与选自以下的核苷酸序列具有至少98％同一性的核苷酸序列：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。在另一个实施方案中，表达盒包含与选自以下的核苷酸序列具有至少99％同一性的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。
本文中使用的“％同一性”用于描述两个序列(例如核苷酸序列和氨基酸序列)之间的序列相似性。这可通过比较以最佳方式比对的两个序列来确定，并且其中待比较的核苷酸序列可相对于参照序列包含添加或缺失以用于这两个序列之间的最佳比对。通过以下计算同一性百分比：确定两个序列之间残基相同的相同位置的数目，将该相同位置的数目除以比较窗口中的位置总数并将得到的结果乘以100以获得这两个序列之间的同一性百分比。例如，可使用BLAST程序“BLAST 2序列”(Tatusova et al,“Blast 2sequences-a newtool for comparing protein and nucleotidesequences”,FEMS Microbiol Lett.174:247-250)，其可在网站https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上获得，使用的参数是默认给出的那些(特别是参数“开放空位罚分”：5，和“延伸空位罚分”：2；所选矩阵是例如程序提出的矩阵“BLOSUM 62”)，待比较的两个序列之间的同一性百分比由程序直接计算。
表达盒可包含提供或编码以下的序列：与编码抗体或抗体片段的多核苷酸可操作地连接的启动子、核糖体结合位点、起始密码子、终止密码子和转录终止序列中的一种或更多种，并且优选全部。适当地，表达盒还可包含编码转录后调节元件的核酸。适当地，表达盒可另外包含编码polyA(多腺苷酸化)元件的核酸。
本文中使用的短语“启动子”是指通常位于待转录多核苷酸序列(例如编码抗体或抗体片段的多核苷酸序列)上游的DNA区域，其是转录发生所需要的，例如其启动转录。在一些实施方案中，启动子选自：巨细胞病毒(CMV)启动子；EF1A(人真核翻译延伸因子1α1)；CAG(与经修饰的鸡β-肌动蛋白启动子融合的CMV早期增强子)；CBh(与经修饰的鸡β-肌动蛋白启动子融合的CMV早期增强子)；SV40(猿猴病毒40增强子/早期启动子)；GFAP(人胶质原纤维酸性蛋白启动子)；ATP1A2_1(Na、K ATP酶α2)；CLDN_5(密封蛋白5)；ADRB2_1(肾上腺素受体β2)；TNFRSF6B_1(TNF受体超家族成员6b)；PDYN_1(强啡肽原)；GH1_1(人生长激素)；OPALIN_1(Opalin)；SYN1_1(突触蛋白1)；CAMK2A_1(钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα)；NEFH_1(神经丝重多肽(neurofilament heavy polypeptide))；NEUROD6_1(神经元分化因子6)；或OLIG2_1(少突胶质细胞转录因子2)。在一个优选的实施方案中，启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子；CBh；与GFAP、ATP1A2_1、CLDN_5、ADRB2_1、TNFRSF6B_1、PDYN_1、GH1_1.OPALIN_1、SYN1_1、CAMK2A_1、NEFH_1、NEUROD6_1或OLIG2_1启动子融合的CMV早期增强子。在一个更优选的实施方案中，启动子是CBh、CMV或与GFAP或OLIG2融合的CMV早期增强子。在一个甚至更优选的实施方案中，启动子是CMV启动子或CBh启动子。
术语启动子包括合成启动子。本文中使用的术语“合成启动子”涉及自然界中不存在的启动子。例如，可根据本发明使用天然存在的启动子的功能变体。在本发明的上下文中，启动子的“功能变体”是参照启动子的变体，其保留以与参照启动子相同的方式发挥作用的能力。在一些另外的实施方案中，使用了天然存在的启动子的截短形式。在一些优选的实施方案中，启动子与增强子例如CMV早期增强子可操作地连接。经截短或经修饰的天然存在的启动子可用于促进将相对大的抗体编码序列插入到载体，特别是病毒载体中。
如在别处详细描述的，载体可特异性靶向BBB(和/或CNS)的细胞。然而，在另一些情况下，载体未特异性靶向BBB(和/或CNS)。例如，许多野生型病毒载体靶向任何组织或细胞类型。在这样的情况下，BBB特异性或CNS特异性启动子可用于驱动编码抗体或抗体片段的多核苷酸在BBB或CNS的细胞中以与其他组织相比优先或占优势的方式表达。
在一个实施方案中，多核苷酸包含与编码抗体或抗体片段的多核苷酸可操作地连接的GFAP(人胶质原纤维酸性蛋白)启动子。在另一个实施方案中，GFAP启动子与CMV早期增强子可操作地连接。在这种情况下，抗体或抗体片段在星形胶质细胞中优先或占优势地表达。
在一个实施方案中，多核苷酸包含与编码抗体或抗体片段的多核苷酸可操作地连接的选自以下的启动子：ATP1A2_1(Na、K ATP酶α2)、CLDN_5(密封蛋白5)、ADRB2_1(肾上腺素受体β2)和TNFRSF6B_1(TNF受体超家族成员6b)。在另一个实施方案中，启动子与CMV早期增强子可操作地连接。在这种情况下，抗体或抗体片段在BBB的内皮细胞中优先或占优势地表达。
在一个实施方案中，多核苷酸包含与编码抗体或抗体片段的多核苷酸可操作地连接的选自以下的启动子：PDYN_1(强啡肽原)、GH1_1(人生长激素)和OPALIN_1(Opalin)。在另一个实施方案中，启动子与CMV早期增强子可操作地连接。在这种情况下，抗体或抗体片段在脑细胞中优先或占优势地表达。
在一个实施方案中，多核苷酸包含与编码抗体或抗体片段的多核苷酸可操作地连接的选自以下的启动子：SYN1_1(突触蛋白1)、CAMK2A_1(钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα)、NEFH_1(神经丝重多肽)和NEUROD6_1(神经元分化因子6)。在另一个实施方案中，启动子与CMV早期增强子可操作地连接。在这种情况下，抗体或抗体片段在神经元中优先或占优势地表达。
在一个实施方案中，多核苷酸包含与编码抗体或抗体片段的多核苷酸可操作地连接的OLIG2_1(少突胶质细胞转录因子2)启动子。在另一个实施方案中，OLIG2_1启动子与CMV早期增强子可操作地连接。在这种情况下，抗体或抗体片段在少突胶质细胞中优先或占优势地表达。
本文中使用的术语“可操作地连接”是指多种多核苷酸元件相对于彼此的排列，使得该元件在功能上联系并且能够以预期的方式彼此相互作用。这样的元件可包括但不限于启动子、增强子和/或调节元件、多腺苷酸化序列、一个或更多个内含子和/或外显子，以及待表达的目的基因的编码序列。多核苷酸元件在正确定向或可操作地连接时一起发挥作用以调节彼此的活性，并最终可影响产物(例如，抗体或抗体片段)的表达水平。调节意指提高、降低或维持特定元件的活性水平。如本领域普通技术人员所理解的，可操作地连接意味着功能活性，并且不一定与天然的位置联系有关。
如上所述，表达盒可包含提供或编码核糖体结合位点(ribosomalbinding site，RBS)的序列。在一个优选的实施方案中，RBS是内部核糖体进入位点(IRES)。在一个实施方案中，IRES来源于脑心肌炎病毒。在另一个实施方案中，IRES包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:8。因为IRES在包含多于一种编码抗体或抗体片段的基因的表达盒中特别有利。例如，其中表达盒包含编码抗体或抗体片段的轻链的基因和编码该抗体或抗体片段的重链的基因。
根据本发明的所有方面，表达盒可另外包含在构建体的3’末端提供或编码土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(Woodchuck Hepatitis VirusPosttranscriptionalRegulatory Element，WPRE)的序列，如图1的最顶部构建体中图示地表示的。WPRE序列通常用于提高由病毒载体递送的基因的表达。不希望受理论束缚，将序列包含在表达盒中可提高mRNA稳定性并因此提高蛋白质产量。
在替代方案中，表达盒可包含编码自切割肽的序列。所述自切割肽可用于包含多于一种编码抗体或抗体片段的基因的表达盒中。例如，其中表达盒包含与编码抗体或抗体片段的轻链的基因和编码该抗体或抗体片段的重链的基因可操作地连接的单个启动子。在这样的情况下，编码自切割肽的序列位于第一基因(例如，编码抗体或抗体片段的轻链的基因)之后和第二基因(例如，编码抗体或抗体片段的重链的基因)之前。这样的体系可允许肽的自切割通过核糖体跳跃(例如，这导致来自单个mRNA转录物的抗体或抗体片段的单独的重链和轻链多肽)共翻译地发生。一类特定的自切割肽是2A肽家族(包括来源于口蹄疫病毒的F2A肽)，其共用DxExNPGP(SEQ ID NO:16)的核心序列基序。因此，在一个实施方案中，表达盒包含编码来自2A家族的自切割肽的序列。在另一个实施方案中，表达盒还包含编码自切割位点上游的弗林蛋白酶切割位点的序列。换言之，表达盒包含与编码抗体或抗体片段的轻链的基因和编码该抗体或抗体片段的重链的基因可操作地连接的单个启动子，其中编码弗林蛋白酶切割肽和自切割肽的序列位于第一基因之后和第二基因之前。可添加弗林蛋白酶切割位点以消除自切割肽的另外的氨基酸，否则另外的氨基酸在自切割之后与上游蛋白质(例如，抗体或抗体片段的轻链)保持连接。然而，值得注意的是，即使在自切割肽上游有弗林蛋白酶切割位点，但另外的氨基酸可保留在一些上游蛋白质(例如，抗体或抗体片段的轻链)中，并且这可导致对上游蛋白质的免疫应答(例如免疫原性)。此外，发明人出乎意料地观察到包含弗林蛋白酶和2A以允许自切割的构建体的聚集提高。因此，在一个优选的实施方案中，表达盒不包含在第一基因之后和第二基因之前编码自切割肽的序列。
表达盒还可包含在编码抗体或抗体片段的多核苷酸的5’端的分泌肽。在本发明的上下文中，分泌肽帮助将抗体或抗体片段递送到CNS中，优选递送到脑实质中。在存在多种编码抗体或抗体片段的基因的情况下，所有基因还可包含编码分泌肽的序列。
本发明不限于编码特定抗体或抗体片段的特定多核苷酸。然而，通常抗体或抗体片段是治疗性抗体或抗体片段。治疗性抗体或抗体片段是在CNS中，特别是在脑中有效发挥其活性的抗体或抗体片段。因此，治疗性抗体或抗体片段可与CNS中表达的靶抗原，特别是脑或脊髓中表达的靶抗原结合。
一般而言，术语“抗体”在本文中以最广义使用，并且涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、全人抗体和抗体片段，只要它们表现出所期望的抗原结合活性即可。抗体还可以是嵌合抗体(特别是与人恒定结构域融合的小鼠VH和VL区)、重组抗体、重组抗体的抗原结合片段、人源化抗体。
抗体的“抗体片段”是指不同于完整抗体的包含完整抗体的一部分并且结合与完整抗体结合的抗原的分子。在一个实施方案中，抗体片段是Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv并优选scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。该术语还涵盖单结构域抗体(例如VHH、VNAR或人单结构域抗体)。根据本发明的一种优选抗体片段是scFv-Fc，其中scFv(与短接头肽连接的VH和VL结构域的融合蛋白，通常约10至25个氨基酸)与可结晶片段(fragmentcrystallizable，Fc)区域结合。scFv-Fc缺乏CH1和CL结构域。
本文中使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体的群体获得的抗体，即除可少量存在的可能天然发生的突变外，构成群体的各抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原位点。经修饰的“单克隆”指示该抗体在基本上同质的抗体群体中的特征，并且不应解释为要求该抗体通过任何特定方法来产生。根据本发明使用的单克隆抗体可通过由Kohler,Nature 256(1975),495描述的杂交瘤方法来制备。
因此，在本发明的上下文中，术语“抗体”涉及完整的免疫球蛋白分子以及这样的免疫球蛋白分子的一部分(即，“抗体片段”)。此外，如上所讨论，该术语涉及经修饰和/或经改变的抗体分子。该术语还涉及重组或合成地产生/合成的抗体。该术语还涉及完整的抗体及其抗体片段，例如分离的轻链和重链、Fab、Fv、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2。术语“抗体”还包括但不限于全人抗体、嵌合抗体、人源化抗体、CDR接枝的抗体和抗体构建体，例如单链Fv(scFv)、scFv-Fc或抗体融合蛋白。
人源化抗体是经修饰的抗体，也称为经重塑的人抗体。人源化抗体是通过将来源于免疫动物的抗体的CDR转移到人抗体的互补决定区来构建的。用于这样的目的的常规遗传重组技术是已知的(参见欧洲专利申请公开No.EP 239400；国际公开No.WO 96/02576；Sato K.et al.,CancerResearch 1993,53:851-856；国际公开No.WO 99/51743)。
本文中使用的术语“CDR”涉及本领域公知的“互补决定区”。CDR是免疫球蛋白的一部分，其决定所述分子的特异性并且与特定配体接触。CDR是所述分子的最可变的部分，并且有助于这些分子的多样性。每个V结构域中均存在三个CDR区：CDR1、CDR2和CDR3。VH-CDR或CDR-H示出了可变重链的CDR区，并且VL-CDR或CDR-L涉及可变轻链的CDR区。VH意指可变重链，VL意指可变轻链。Ig来源区域的CDR区可如Kabat“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”,第5版.NIH出版物no.91-3242U.S.Department of Health andHuman Services(1991)；Chothia J.,Mol.Biol.196(1987),901-917或Chothia,Nature342(1989),877-883中所述确定。
“Fc”区包含两个含有抗体的CH2和CH3结构域的重链片段。两个重链片段通过两个或更多个二硫键以及通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
“Fab’片段”包含一条轻链，以及一条重链的一部分，所述一条重链的一部分包含VH结构域和CH1结构域以及还具有在CH1与CH2结构域之间的区域，使得可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”包含两条轻链和两条重链，所述重链包含在CH1与CH2结构域之间的恒定区的一部分，使得在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab’)2片段由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段构成。
“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
“scFv-Fc”包含来自重链和轻链二者的“Fv”可变区，其与包含两个包含抗体的CH2和CH3结构域的重链片段的“Fc”区融合。两个重链片段通过两个或更多个二硫键以及通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
因此，在本发明的上下文中，提供了抗体分子或其抗体片段，其是人源化的并且可成功地用于药物组合物中，包含至少两种抗体分子或其抗体片段的混合物。
“与蛋白质限定区域中表位结合的抗体”是要求该区域中存在一个或更多个氨基酸以与蛋白质结合的抗体。
在某些实施方案中，“与蛋白质限定区域中表位结合的抗体”通过突变分析来鉴定，在突变分析中对该蛋白质的氨基酸进行突变，并且该抗体与所得经改变蛋白质(例如，包含该表位的经改变蛋白质)的结合确定为与未经改变蛋白质的结合的至少20％。在一些实施方案中，“与蛋白质限定区域中表位结合的抗体”通过突变分析来鉴定，在突变分析中对该蛋白质的氨基酸进行突变，并且该抗体与所得经改变蛋白质(例如，包含该表位的经改变蛋白质)的结合确定为与未经改变蛋白质的结合的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在某些实施方案中，抗体的结合通过FACS、WB或通过合适的结合测定例如ELISA来确定。
根据本发明应用的抗体或抗体片段优选地是与CNS中的表位结合的抗体或抗体片段。更特别地，抗体或抗体片段与CNS中与CNS的疾病或病症相关的表位结合。在一个优选的实施方案中，抗体或抗体片段选自：抗ErbB2、抗TDP-43(NI-205)、抗Aβ(例如巴品珠单抗(bapineuzumab)、索拉珠单抗(solanezumab)、lecanemab、阿杜卡尼单抗(aducanumab)、多奈单抗(donanemab)、更汀芦单抗(gantenerumab)或克瑞组单抗(crenezumab))、抗ApoE4(载脂蛋白E4)和抗DDX3X(ATP依赖性RNA解旋酶)、抗Tau(替拉奈单抗(tilavonemab)、gosuranemab、泽格特奈单抗(zagotenemab)、西瑞奈单抗(semorinemab)、bepranemab、BIIB076、JNJ-63733657、Lu AF87908、PNT001、E-2814)、抗LINGO-1(例如奥匹努单抗(opicinumab))、抗α-突触核蛋白(辛帕奈单抗(cinpanemab)、prasinezumab、MEDI-1341、LuAF82422、BAN0805)、抗ASC(IC-100)、抗NLRP3、抗C5(ravulizumab、依库珠单抗(eculizumab))、抗C1q(ANX-005)、抗C3、抗亨廷顿蛋白(C-617、NI-302)、抗朊病毒、抗CD20(例如奥法木单抗(ofatumumab)、奥美珠单抗(ocrelizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、BCD-132、乌妥昔单抗(ublituximab)、BAT-4406F、AL-014)、抗PD-1(IBC-Ab002)或抗VEGF-A(贝伐单抗(bevacizumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、布洛赛珠单抗(brolucizumab)、faricimab、伐努赛珠单抗(vanucizumab))。
如本文中实验部分所述，人脑内皮细胞系hCMEC/D3由AAV2、AAV8、AAV9和AAVrh.10(AAV恒河猴分离株10)转导，其递送编码以下之一的基因：抗TDP-43抗体MAB1(嵌合人IgG1)、抗ErbB2抗体(赫赛汀(Herceptin))MAB2或eGFP(增强型绿色荧光蛋白)。这导致了抗体的高品质和随时间的长期表达。发明人还确定了其在小鼠细胞系和人原代脑内皮细胞中的观察结果。递送体系导致以一系列不同的抗体形式(包括全长抗体和抗体片段)产生正确折叠的抗体。至关重要的是，在这些实验中，在顶端和基底外侧二者中均检测到了分泌的抗体，确定了递送至该模型中BBB的脑实质侧。因此，在实例中包含的数据表明本文中所述的方法和载体可用于将正确折叠的抗体或抗体片段(例如治疗性抗体)递送至CNS。
本发明的一个目的是首次提供通过将编码抗体或抗体片段的多核苷酸递送至CNS和/或BBB中的细胞来提高CNS中抗体浓度以便治疗CNS相关疾病或病症的方法。这种新方法可用于治疗起源于CNS的多种疾病或病症。
为了避免疑问，本文中使用的术语“治疗”包括治疗性治疗，以及对症治疗和病症的预防。术语“治疗”(及其语法变体)的使用意指对象病症的严重程度降低、至少部分改善、或改善，和/或者实现至少一种临床症状的一些减轻、缓解或降低，和/或者疾病或病症的进展延迟。
本文中使用的术语“对象”是指患有CNS内存在的特定病症、障碍或病症或者处于患有CNS内存在的特定病症、障碍或病症的风险之中的个体(例如哺乳动物，例如人)。对象可以是需要根据本发明进行治疗的对象。对象可能已接受了针对所述病症、障碍或病症的治疗。或者，对象在根据本发明进行治疗之前未进行治疗。
本发明涉及可用于任何哺乳动物，包括人对象并且用于治疗患有CNS的疾病或病症的对象中相关的疾病或病症的创新策略。通过将治疗性抗体基因递送到脑内皮细胞中，其充当储库以提供进入CNS的抗体的高品质和长期表达。
在一个实施方案中，疾病或病症是神经退行性疾病。
在另一个实施方案中，疾病或病症与CNS相关，包括但不限于：淀粉样蛋白β蛋白相关疾病、TDP-43-蛋白质病、α-突触核蛋白病、Tau蛋白病、三核苷酸重复疾病(包括多聚谷氨酰胺疾病例如亨廷顿病)、脑相关癌症和肿瘤、癫痫、精神疾病、神经炎性疾病、神经肌肉疾病、病毒诱发的脑炎和以小胶质细胞功能障碍为特征的疾病。
在另一个实施方案中，患者相关的疾病或障碍或病症是：淀粉样蛋白β蛋白相关疾病、TDP-43-蛋白质病、α-突触核蛋白病、Tau蛋白病、三核苷酸重复疾病(包括多聚谷氨酰胺疾病例如亨廷顿病)、脑相关癌症和肿瘤、癫痫、精神疾病、神经炎性疾病、神经肌肉疾病、病毒诱发的脑炎和以小胶质细胞功能障碍为特征的疾病。
在一些实施方案中，根据本发明的淀粉样蛋白β相关疾病、障碍或病症包括轻度认知损伤(mild cognitive impairment，MCI)、唐氏综合征(Downsyndrome，DS)、唐氏综合征相关阿尔茨海默病、脑淀粉样血管病(cerebralamyloid angiopathy，CAA)、多发性硬化、帕金森病(Parkinson's disease，PD)、帕金森病痴呆(Parkinson’s Disease withDementia，PDD)、路易体痴呆、ALS(肌萎缩侧索硬化)。这些病症中的许多以认知记忆能力丧失为特征或与其相关。因此，根据本发明以认知记忆能力丧失为特征或与其相关的病症包括AD、轻度认知损伤(MCI)、唐氏综合征(DS)、唐氏综合征相关阿尔茨海默病、脑淀粉样血管病(CAA)、多发性硬化、帕金森病、帕金森病痴呆(PDD)、路易体痴呆、ALS(肌萎缩侧索硬化)。
特别地，淀粉样蛋白β相关疾病、障碍或病症可选自阿尔茨海默病(Alzheimer’sDisease，AD)、唐氏综合征(DS)、唐氏综合征相关阿尔茨海默病、脑淀粉样血管病(CAA)或路易体痴呆。
在一些实施方案中，TDP-43-蛋白质病包括额颞痴呆(Frontotemporaldementia)(FTD，例如散发性或家族性、伴有或不伴有运动神经元病(motor-neuron disease，MND)、伴颗粒蛋白前体(GRN)突变、伴C9orf72突变、伴TARDBP突变、伴含缬酪肽蛋白(valosine-containing protein，VCP)突变、与9p染色体连锁、皮质基底节变性、伴泛素阳性TDP-43包涵体的额颞叶变性(frontotemporal lobar degeneration，FTLD)(FTLD-TDP)、嗜银颗粒病、皮克病、语义变异型原发性进行性失语(svPPA)、行为变异型FTD(bvFTD)、非流畅性变异型原发性进行性失语症(nfvPPA)，等)、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateralsclerosis)(ALS，例如散发性ALS、伴TARDBP突变、伴血管生成蛋白(ANG)突变)、亚历山大病(AxD)、边缘主导年龄相关性TDP-43脑病(LATE)、慢性创伤性脑病(Chronic TraumaticEncephalopathy，CTE)、佩里综合征、阿尔茨海默病(AD，包括散发性和家族性形式的AD)、唐氏综合征、家族性英国型痴呆、多聚谷氨酰胺疾病(亨廷顿病和脊髓小脑共济失调3型(SCA3；也称为马-约病))、海马硬化性痴呆和肌病(散发性包涵体肌炎、包涵体肌病，伴含缬酪肽蛋白(VCP)突变(以及佩吉特骨病和额颞痴呆))、创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(DLB)或帕金森病(PD)。
特别地，TDP-43-蛋白质病疾病、障碍或病症可选自：额颞痴呆(FTD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、慢性创伤性脑病(CTE)、边缘主导年龄相关性TDP-43脑病(LATE)和多发性硬化(multiple sclerosis，MS)。
在一些实施方案中，突触核蛋白病是帕金森病(散发性、家族性伴α-突触核蛋白突变、家族性伴有除α-突触核蛋白以外的突变、纯自主神经衰竭和路易体吞咽困难)、路易体痴呆(Lewy Body dementia)(LBD；包括路易体痴呆(dementia with Lewy bodies，DLB)(“纯”路易体痴呆)、帕金森病痴呆(PDD))、或弥漫性路易体病、散发性阿尔茨海默病、家族性阿尔茨海默病伴APP突变、家族性阿尔茨海默病伴PS-1、PS-2或其他突变、家族性英国型痴呆、阿尔茨海默病路易体变体、多系统萎缩(夏-德综合征、纹状体黑质变性和橄榄体脑桥小脑萎缩)、创伤性脑损伤、慢性创伤性脑病、拳击性痴呆、tau蛋白病(皮克病、额颞痴呆、进行性核上麻痹、皮质基底节变性、17号染色体连锁额颞痴呆伴帕金森综合征、和尼曼-皮克C1型病(Niemann-Pick type C1 disease))、唐氏综合征、克-雅病、亨廷顿病、运动神经元病、肌萎缩侧索硬化(散发性、家族性和关岛型ALS痴呆复合体)、神经轴索营养不良、神经退行性变伴脑铁沉积1型(哈勒沃登-施帕茨综合征(Hallervorden-Spatz syndrome))、朊病毒病、格斯特曼-施特劳斯勒-沙因克病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、共济失调毛细血管扩张、Meige综合征、亚急性硬化性全脑炎、戈谢病(Gaucher disease)、克拉伯病(Krabbe disease)以及其他溶酶体贮积症(包括Kufor-Rakeb综合征和Sanfilippo综合征)，或快速眼动(rapid eyemovement，REM)睡眠行为障碍。
特别地，突触核蛋白病可选自帕金森病、多系统萎缩、路易体痴呆(LBD；包括路易体痴呆(DLB)(“纯”路易体痴呆)、帕金森病痴呆(PDD))，或弥漫性路易体病。
在一些实施方案中，tau蛋白病选自阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化、帕金森病、克-雅病、拳击性痴呆、唐氏综合征、格斯特曼-施特劳斯勒-沙因克病、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、创伤性脑损伤、肌萎缩侧索硬化/关岛型帕金森痴呆复合体、非关岛型运动神经元病伴神经原纤维缠结、嗜银颗粒痴呆、皮质基底节变性、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、额颞痴呆、17号染色体连锁额颞痴呆伴帕金森综合征、哈勒沃登-施帕茨病、多系统萎缩、尼曼-皮克病C型、Pallido-ponto-黑质变性、皮克病、进行性皮质下神经胶质增生、进行性核上麻痹、亚急性硬化性全脑炎、仅缠结性痴呆、脑炎后帕金森综合征和肌强直性营养不良。
特别地，tau蛋白病可选自阿尔茨海默病或进行性核上麻痹。
在一些实施方案中，神经炎性疾病、病症或异常选自：阿尔茨海默病；帕金森病；额颞痴呆；边缘主导年龄相关性TDP-43脑病；肌萎缩侧索硬化；运动神经元病；三核苷酸重复疾病，包括多聚谷氨酰胺疾病例如亨廷顿病；多发性硬化；脱髓鞘；病毒性脑炎；癫痫；缺血性和出血性卒中；创伤性脑损伤；慢性创伤性脑病；冷吡啉相关周期性综合征(cryopyrin-associated periodic syndrome，CAPS)；穆-韦综合征(Muckle-Wells syndrome，MWS)；家族性寒冷性自身炎性综合征(familialcold autoinflammatory syndrome，FCAS)；新生儿发作多系统炎性疾病(neonatal-onset multisystem inflammatory disease，NOMID)；周期性发热综合征(HIDS)；铁粒幼细胞性贫血伴B细胞免疫缺陷；周期性发热；发育迟缓(SIFD)；贝赫切特病(disease)；干燥综合征；脑型疟；来自肺炎球菌脑膜炎、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)、罗斯河病毒(Ross River virus)、流感、HIV、冠状病毒、登革热、寨卡病毒、蠕虫感染、细菌感染、抑郁、心理压力的脑损伤；HIV相关的神经认知障碍、冠状病毒相关的炎性病理状况。
在一些实施方案中，神经炎性疾病、病症或异常优选地选自：阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、额颞痴呆、多发性硬化、脱髓鞘、病毒性脑炎、癫痫、卒中、冷吡啉相关周期性综合征(CAPS)、抗中性粒细胞胞浆抗体相关血管炎、狼疮、银屑病关节炎和遗传性复发性发热(Hereditary Recurrent Fever，HRF)。
在一些实施方案中，神经炎性疾病、病症或异常更优选地选自：阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、额颞痴呆、多发性硬化、脱髓鞘、病毒性脑炎、卒中、冷吡啉相关周期性综合征(CAPS)。
在一些实施方案中，神经肌肉疾病可包括：脑血管意外、帕金森病、多发性硬化、亨廷顿病和克罗伊茨费尔特-雅各布病、脊髓性肌萎缩和肌萎缩侧索硬化。在另一实施方案中，CNS疾病或病症是神经退行性病症。
在一个优选实施方案中，CNS的疾病或病症选自：额颞痴呆(FTD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、慢性创伤性脑病(CTE)和边缘主导年龄相关性TDP-43脑病(LATE)和多发性硬化(MS)。
也可根据本发明治疗的脑和CNS癌症和肿瘤包括：星形胶质细胞瘤(包括小脑和大脑)、脑干胶质瘤、脑肿瘤、恶性胶质瘤、室管膜瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚叶肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、室管膜瘤、脑干胶质瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤、颅外生殖细胞肿瘤、髓母细胞瘤、骨髓增生异常综合征、少突神经胶质瘤、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、髓细胞性白血病(myelogenousleukemia)、骨髓性白血病(myeloid leukemia)、多发性骨髓瘤、骨髓增生性病症、神经母细胞瘤、浆细胞赘生物/多发性骨髓瘤、中枢神经系统淋巴瘤、内在脑肿瘤、星形胶质细胞脑肿瘤、胶质瘤和中枢神经系统中的转移性肿瘤细胞侵袭。
如本文中所述的载体可通过任何常规途径(包括注射或通过随时间逐渐输注)施用于对象。可通过胃肠外施用来施用。例如，可通过输注或通过鞘内、脑池内、脑室内、实质内(intraparenchymal)、鼻内、玻璃体内、皮下或肌内途径施用。在一个实施方案中，通过静脉内注射或静脉内输注施用载体。作为另外的实例，用于胃肠外注射(包括皮下、肌内、血管内或输注)的合适形式包括无菌溶液剂、混悬剂或乳剂。优选静脉内注射。
本发明组合物的合适剂量的鉴定完全在本领域普通技术人员的常规能力范围内。例如，将通过考虑已知改变根据本发明使用的载体的作用的多种因素来确定用于给定对象的合适剂量。例如，CNS疾病或病症的严重程度和类型、体重、性别、饮食、施用时间和途径、其他药物和其他相关临床因素。剂量和方案可根据对象的具体状况、病症或症状总体状况而变化。也可能是这样的情况，即没有用于给定疾病的治疗的单一接受剂量，但认为一系列剂量是合适的。有效剂量可通过体外或体内方法确定。
本文中还提供了用于在对象中治疗CNS疾病或病症的方法。该方法包括向对象施用包含编码抗体或抗体片段的多核苷酸的载体。所述方法导致BBB细胞的转导或转染，并且有利地，经转导或经转染的细胞产生(例如表达)抗体或抗体片段，并且所述抗体或抗体片段被递送到CNS中，优选被递送到脑实质中。
在另一个方面中，本发明提供了用于将抗体或抗体片段递送至对象中BBB的方法，该方法包括向对象施用包含编码抗体或抗体片段的多核苷酸的载体，其中，所述方法导致BBB细胞的转导或转染，并且经转导或经转染的细胞表达抗体或抗体片段。
在另一个方面中，本发明提供了用于将抗体或抗体片段递送至对象中CNS的方法，该方法包括向对象施用包含编码抗体或抗体片段的多核苷酸的载体，其中，所述方法导致BBB细胞的转导或转染，并且经转导或经转染的细胞表达抗体或抗体片段，导致抗体或抗体片段被递送到CNS中。
在再一个方面中，本发明提供了用于在对象中治疗CNS疾病或病症的方法，该方法包括向对象施用包含编码抗体或抗体片段的多核苷酸的载体，其中，所述方法导致BBB细胞的转导或转染，并且经转导或经转染的细胞表达抗体或抗体片段，导致抗体或抗体片段被递送到CNS中。
在另一个方面中，本发明提供了包含编码抗体或抗体片段的多核苷酸的载体用于制造用于在对象中治疗CNS疾病或病症的药物的用途，其中，所述载体转导或转染血脑屏障(BBB)细胞，并且经转导或经转染的细胞表达抗体或抗体片段，导致抗体或抗体片段被递送到CNS中。
在另一个方面中，本发明提供了包含编码抗体或抗体片段的多核苷酸的载体用于将所述编码抗体或抗体片段的多核苷酸递送至对象的BBB的用途，其中该载体转导或转染血脑屏障(BBB)细胞，并且经转导或经转染的细胞表达抗体或抗体片段，导致抗体或抗体片段被递送到CNS中。
本文中描述的涉及根据本发明的前述方面应用的载体的所有实施方案同样适用于本发明的这些另外的方面。
发明人发现，特定的表达盒构建体改善所产生的抗体的品质。当在体内递送抗体时这很重要。因此，使用本发明的表达盒(如本文中本发明的多个方面和实施方案中详述的)提供抗体和抗体片段向CNS的有利递送，其可通过直接的递送至CNS或通过经由BBB细胞的递送(根据如本文中和所限定的本发明)。因此，以下方面可以在体内进行，其中细胞是BBB细胞，尤其是脑内皮细胞或更通常是CNS细胞。因此，抗体或抗体片段通常是治疗性抗体或抗体片段，如本文中所述。在一些实施方案中，以下方面还可以离体或体外进行，以用于抗体产生。在那些实施方案中，可以利用任何合适的细胞类型。在此，再次，抗体或抗体片段通常是治疗性抗体或抗体片段。
因此，本发明提供了包含表达盒的载体，所述表达盒从5’至3’包含：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因和编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子，所述抗体或抗体片段用于在对象中治疗中枢神经系统(CNS)的疾病或病症的方法中，其中所述载体转导或转染血脑屏障(BBB)或CNS的细胞，并且经转导或经转染的细胞表达抗体或抗体片段，导致抗体或抗体片段被递送到CNS中，优选地被递送到脑实质中。发明人发现，在这样的构建体中，将轻链排序在重链之前是显著有利的。优选地，IRES位于第一和第二基因之间。
在另一个方面中，本发明提供了包含表达盒的载体，所述表达盒从5’至3’包含：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因可操作地连接的第一启动子和与编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的第二启动子，所述抗体或抗体片段用于在对象中治疗中枢神经系统(CNS)的疾病或病症的方法中，其中所述载体转导或转染血脑屏障(BBB)或CNS的细胞，并且经转导或经转染的细胞表达抗体或抗体片段，导致抗体或抗体片段被递送到CNS中，优选地被递送到脑实质中。在这样的构建体中，不需要IRES。
与BBB一样，CNS包含多种细胞类型，并且在一个实施方案中，载体将编码抗体或抗体片段的多核苷酸转导或转染到CNS中的至少一种(多至所有)细胞类型中。例如，载体可转导或转染选自以下的CNS细胞：脑内皮细胞、神经元、周细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和室管膜细胞。因此，载体可转导或转染CNS的神经元和非神经元(胶质)细胞。或者，载体可转导或转染CNS的一种特定细胞类型。例如，载体可转导或转染CNS的脑内皮细胞。在另一实例中，载体可转导或转染CNS的神经元。在另一实例中，载体可转导或转染CNS的星形胶质细胞。在又一实例中，载体可转导或转染少突胶质细胞。在又一实例中，载体可转导或转染CNS的小胶质细胞。或者，载体可转导或转染CNS的室管膜细胞。
在另一实施方案中，载体转导或转染来自BBB和CNS的多种细胞类型。
如上所述，包含编码抗体或抗体片段的多核苷酸的载体可转导或转染特别是BBB和/或CNS的细胞。与针对其他地方描述的靶向BBB而描述的那些技术相同的技术同样适用于直接靶向CNS的载体。在一个实施方案中，载体在载体表面上表达将载体靶向BBB或CNS的细胞的肽。换句话说，在载体表面上表达的肽赋予靶向BBB和/或CNS的特异性。在另一实施方案中，在载体表面上表达的肽将载体靶向BBB和/或CNS的特定细胞类型。合适的肽以及用于产生和测试这样的肽的方法(包括噬菌体展示方法)的一些实例是本领域中已知的。
作为替代或补充，包含编码抗体或抗体片段的多核苷酸的亲神经载体可用于转导或转染特别是BBB和/或CNS的细胞，例如HSV。因此，在一个实施方案中，载体包括亲神经载体。在另一个实施方案中，载体包括经修饰的HSV。
本文中描述的涉及根据本发明的前述方面应用的载体的所有实施方案同样适用于本发明的这些另外的方面。
在一个实施方案中，表达盒从5’至3’包含：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因和编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子。表达盒可还包括在编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因之后并且在编码抗体的重链的第二基因之前的内部核糖体进入位点(IRES)。换句话说，表达盒从5’到3’包含：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因可操作地连接的至少一个启动子、IRES和编码抗体或抗体片段的重链的第二基因。在另一个实施方案中，表达盒从5’到3’包含：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因可操作地连接的第一启动子和与编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的第二启动子。表达盒内每个元件的位置是相对于其他元件的，并且按照惯例在此按在5’端处开始并朝向3’端移动的顺序表示。
本发明还涉及通过改变链位置、使用不同的分泌肽和定制内部和下游调节元件来产生意想不到的相对于现有技术中先前报道的策略更高的抗体表达产量和改善的蛋白质品质。
因此，本发明提供了降低抗体或抗体片段聚集的方法，其中该方法包括：
(i)用从5’至3’包含以下的表达盒转化细胞：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因和编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子，并且其中表达盒还包含在编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因之后并且在编码抗体或抗体片段的重链的第二基因之前的内部核糖体进入位点(IRES)；或者用从5’至3’包含以下的表达盒转化细胞：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因可操作地连接的第一启动子和与编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的第二启动子；以及
(ii)在适合于抗体或抗体片段产生的条件下维持经转化的细胞。
与其中采用其他构建体的方法相比，相同的构建体还导致抗体品质的改善(如本文中所讨论的，特别是在盒中重链在轻链之前和/或并入了自切割肽例如弗林蛋白酶/2A肽的那些)。本发明因此还提供了改善抗体或抗体片段成熟和/或品质的方法，其中该方法包括：
(i)用从5’至3’包含以下的表达盒转化细胞：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因和编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子，并且其中表达盒还包含在编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因之后并且在编码抗体或抗体片段的重链的第二基因之前的内部核糖体进入位点(IRES)；或者用从5’至3’包含以下的表达盒转化细胞：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因可操作地连接的第一启动子和与编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的第二启动子；以及
(ii)在适合于抗体或抗体片段产生的条件下维持经转化的细胞。
换言之，根据本发明的一种方法导致具有与抗体或抗体片段的天然构型相同的三维结构的抗体或抗体片段的比例增加。这可以例如使用电泳例如SDS-PAGE测量。样品也可以被还原(例如使用DTT)，然后在凝胶上运行以确定准确的二硫键形成以及轻链和重链二者都以预期的分子量迁移。
发明人令人惊讶地观察到，编码抗体或抗体片段的轻链的基因相对于编码抗体或抗体片段的重链的基因的定位影响所观察到的聚集的比例。实际上，当编码轻链的基因是表达盒中的第一基因、随后是编码重链的基因时，与相反的取向(例如，当编码重链的基因是表达盒中的第一基因、随后是编码轻链的基因时)相比，所表达的抗体的聚集降低。
在一个实施方案中，用从5’至3’包含以下的表达盒转化细胞：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因和编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子，并且其中表达盒还包含在编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因之后并且在编码抗体或抗体片段的重链的第二基因之前的内部核糖体进入位点(IRES)，并且与用从5’至3’包含以下的表达盒转化的细胞相比，抗体聚集降低：与编码抗体或抗体片段的重链的第一基因和编码抗体或抗体片段的轻链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子，并且其中表达盒还包含在编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因之后并且在编码抗体或抗体片段的重链的第二基因之前的内部核糖体进入位点(IRES)。如本文中其他地方进一步详细描述的，表达盒可任选地包含在构建体的3'端处提供或编码WPRE的序列，如图1的最顶部构建体中图解所示的。因此，在一个实施方案中，表达盒在编码抗体或抗体片段的重链的第二基因之后包含提供或编码WPRE的序列。注意这适用于本发明的所有相关构建体和方法。
在另一个实施方案中，用从5’至3’包含以下的表达盒转化细胞：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因可操作地连接的第一启动子和与编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的第二启动子，并且与用从5’至3’包含以下的表达盒转化的细胞相比，抗体或抗体片段的聚集降低：与编码抗体或抗体片段的重链的第一基因可操作地连接的第一启动子和与编码抗体或抗体片段的轻链的第二基因可操作地连接的第二启动子。
例如，存在抗体或抗体片段聚集的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的降低。
发明人还令人惊讶地观察到，含有弗林蛋白酶和2A(例如来源于口蹄疫病毒的2A肽，F2A)以允许自切割的的构建体的聚集增加，以允许自裂解自切割。因此，表达盒优选不包含自切割肽，特别是不包含弗林蛋白酶/2A。
发明人还观察到编码抗体或抗体片段的轻链的基因相对于编码抗体或抗体片段的重链的基因的定位影响抗体效价。实际上，当编码轻链的基因是表达盒中的第一基因、随后是编码重链的基因时，与相反的取向(例如，当编码重链的基因是表达盒中的第一基因、随后是编码轻链的基因时)相比，所表达的抗体或抗体片段的效价提高。
在另一个方面中，本发明提供了提高抗体或抗体片段效价的方法，其中该方法包括：
(i)用从5’至3’包含以下的表达盒转化细胞：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因和编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子，并且其中表达盒还包含在编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因之后并且在编码抗体或抗体片段的重链的第二基因之前的内部核糖体进入位点(IRES)或自切割位点(例如弗林蛋白酶-2A切割位点)；或者用从5’至3’包含以下的表达盒转化细胞：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因可操作地连接的第一启动子和与编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的第二启动子；以及
(ii)在适合于抗体或抗体片段产生的条件下维持经转化的细胞。
尽管该观察结果适用于含有自切割位点，特别是含有弗林蛋白酶-2A的构建体，但由于如本文中所讨论的聚集和免疫原性问题，优选不包含它们。
在一个实施方案中，用从5’至3’包含以下的表达盒转化细胞：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因和编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子，并且其中表达盒还包含在编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因之后并且在编码抗体或抗体片段的重链的第二基因之前的内部核糖体进入位点(IRES)。因此，与用从5’至3’包含以下的表达盒转化的细胞相比，抗体效价提高：与编码抗体或抗体片段的重链的第一基因和编码抗体或抗体片段的轻链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子，并且其中表达盒还包含在编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因之后并且在编码抗体或抗体片段的重链的第二基因之前的内部核糖体进入位点(IRES)。如本文中其他地方进一步详细描述的，表达盒可任选地包含在构建体的3'端处提供或编码WPRE的序列，如图1的最顶部构建体中图解所示的。因此，在一个实施方案中，表达盒在编码抗体或抗体片段的重链的第二基因之后包含提供或编码WPRE的序列。
在另一个(较不优选的)实施方案中，用从5’至3’包含以下的表达盒转化细胞：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因和编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子，并且其中表达盒还包含在编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因之后并且在编码抗体或抗体片段的重链的第二基因之前的自切割位点(例如弗林蛋白酶-2A切割位点)，并且与用从5’至3’包含以下的表达盒转化的细胞相比，抗体效价提高：与编码抗体或抗体片段的重链的第一基因和编码抗体或抗体片段的轻链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子，并且其中表达盒还包含在编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因之后并且在编码抗体或抗体片段的重链的第二基因之前的自切割位点(例如弗林蛋白酶-2A切割位点)。如本文中其他地方进一步详细描述的，表达盒可任选地包含在构建体的3'端处提供或编码WPRE的序列，如图1的最顶部构建体中图解所示的。因此，在一个实施方案中，表达盒在编码抗体或抗体片段的重链的第二基因之后包含提供或编码WPRE的序列。
在另一个实施方案中，用从5’至3’包含以下的表达盒转化细胞：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因可操作地连接的第一启动子和与编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的第二启动子，并且与用从5’至3’包含以下的表达盒转化的细胞相比，抗体效价提高：与编码抗体或抗体片段的重链的第一基因可操作地连接的第一启动子和与编码抗体或抗体片段的轻链的第二基因可操作地连接的第二启动子。
例如，存在抗体或抗体片段效价的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的提高。
不希望受理论束缚，发明人还认为，使用不利用自切割位点(例如弗林蛋白酶-2A)的表达盒产生的抗体与使用利用自切割位点(例如弗林蛋白酶-2A)的表达盒产生的抗体相比具有降低的免疫原性。这是因为抗体缺乏自切割位点的任何残余部分(remnant)，所述自切割位点例如已知促进针对抗体的中和抗体响应和/或细胞免疫的弗林蛋白酶-2A肽。因此，认为使用不利用自切割位点(例如弗林蛋白酶2A)的表达盒产生的抗体导致降低不希望的免疫原性。如本文所用，术语“不希望的免疫原性”用于指动物(例如人)针对抗体(特别是针对包括在表达盒中的自切割肽的肽残余部分)产生的导致中和抗体和/或细胞免疫(其在体内减弱治疗性抗体的活性)的产生的免疫应答。此外，所述不希望的免疫原性可能是与体内抗体或抗体片段治疗相关的不良事件的原因。
因此，在另一个方面中，本发明提供了降低不希望的抗体或抗体片段免疫原性的方法，其中该方法包括：
(i)用从5’至3’包含以下的表达盒转化细胞：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因和编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子，并且其中表达盒还包含在编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因之后并且在编码抗体或抗体片段的重链的第二基因之前的内部核糖体进入位点(IRES)：或者用从5’至3’包含以下的表达盒转化细胞：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因可操作地连接的第一启动子和与编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的第二启动子；以及
(ii)在适合于抗体或抗体片段产生的条件下维持经转化的细胞。
本发明的另个一方面提供了降低与抗体或抗体片段治疗相关的不良事件的方法，其中该方法包括：
(i)用从5’至3’包含以下的表达盒转化细胞：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因和编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子，并且其中表达盒还包含在编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因之后并且在编码抗体或抗体片段的重链的第二基因之前的内部核糖体进入位点(IRES)：或者用从5’至3’包含以下的表达盒转化细胞：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因可操作地连接的第一启动子和与编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的第二启动子；以及
(ii)在适合于抗体或抗体片段产生的条件下维持经转化的细胞。
在根据这些方面的一个实施方案中，用从5’至3’包含以下的表达盒转化或转导细胞：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因和编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子，并且其中表达盒还包含在编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因之后并且在编码抗体或抗体片段的重链的第二基因之前的内部核糖体进入位点(IRES)，并且与用从5’至3’包含以下的表达盒转化的细胞相比，不希望的免疫原性降低：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因和编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子，并且其中表达盒还包含在编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因之后并且在编码抗体或抗体片段的重链的第二基因之前的弗林蛋白酶-2A切割位点。
例如，存在抗体或抗体片段免疫原性的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的降低和/或与抗体或抗体片段治疗相关的不良事件的相应降低。
在比较项的上下文中，技术人员将理解将采用相同的细胞和相同的条件。
在另一实施方案中，抗体或抗体片段不含自切割元件。在另一实施方案中，抗体或抗体片段不含弗林蛋白酶-2A肽或其片段。
在另一个方面中，本发明提供了通过根据本发明的方法获得的抗体或抗体片段。与通过使用包含在编码抗体或抗体片段的重链和轻链的基因之间的自切割位点的表达盒的方法产生的抗体或抗体片段相比，通过根据本发明的方法获得的抗体或抗体片段可用于在对象中降低不希望的免疫原性(其可包括炎症)。在另一实施方案中，由本发明的方法产生的抗体或抗体片段还可降低与通过使用包含在编码抗体或抗体片段的重链和轻链的基因之间的自切割位点的表达盒的方法产生的抗体相关的任何毒性。
本发明还提供了可在这样的方法中采用的相应表达盒。因此，提供了从5’至3’包含以下的表达盒：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因和编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子；其中表达盒还包含在编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因之后并且在编码抗体或抗体片段的重链的第二基因之前的IRES。将所述表达盒引入到细胞中相比于当将从5’至3’包含以下的表达盒引入到相同细胞中时产生的抗体效价，产生了更高的抗体效价：与编码抗体或抗体片段的重链的第一基因和编码抗体或抗体片段的轻链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子，以及在编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因之后并且在编码抗体或抗体片段的重链的第二基因之前的IRES。如本文中其他地方进一步详细描述的，表达盒可任选地包含在构建体的3'端处提供或编码WPRE的序列，如图1的最顶部构建体中图解所示的。因此，在一个实施方案中，表达盒在编码抗体或抗体片段的重链的第二基因之后包含提供或编码WPRE的序列。
类似地，本发明提供了从5′到3’包含以下表达盒：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因可操作地连接的第一启动子和与编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的第二启动子。将表达盒引入到细胞中相比于当将从5’至3’包含以下的表达盒引入到相同细胞中时产生的抗体效价，产生了更高的抗体效价：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因可操作地连接的第一启动子和与编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的第二启动子。
这些表达盒优选不包含自切割位点，例如弗林蛋白酶/2A切割位点，因为这样的构建体导致所表达抗体的较高聚集(即较低品质)，并且还提高了免疫原性。
本发明还涉及转导或转染血脑屏障(BBB)或CNS的细胞的载体，其包含如本文中所述的本发明的表达盒。这样的载体可用于在抗体或抗体片段产生的方法中，该方法包括：用载体转化细胞，并在适合于抗体或抗体片段产生的条件下维持经转化的细胞。
本文中所述的表达盒的设计考虑了通过病毒载体的递送。在这样的载体中，可被包装的遗传物质的量是有限的。因此，本发明提供了包含本发明表达盒的病毒载体，特别是亲神经病毒载体或可转导或转染BBB或CNS细胞的病毒载体。病毒载体可包括：经改造的AAV2载体，优选AAV-BR1；或者经改造的AAV9载体，例如AAV-S、AAV-F、AAV-PHP.eB或AAV9-PHP-V1；或者经改造的AAV1载体，例如AAV1RX、AAV1R6或AAV1R7。病毒载体可包含从5’至3’包含以下的表达盒：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因和编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子，并且还包含在编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因之后并且在编码抗体或抗体片段的重链的第二基因之前的IRES。病毒载体可包含从5’至3’包含以下的表达盒：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因可操作地连接的第一启动子和与编码抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的第二启动子。
这些载体和表达盒可用于根据本发明的任何方法中。
附图简述
图1.为产生pAAV来源的抗体、连接的衍生物和其他蛋白质而研究的不同构建体的表示。曲线箭头表示表达盒中轻链和重链位置的改变。SP：分泌肽，IRES：内部核糖体进入位点，FSG2A：弗林蛋白酶/2A可自切割肽，WPRE：土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件，pA：poly A。重链或轻链可以是任何抗体序列。启动子可优选为CMV(人巨细胞病毒)或其他启动子，例如但不限于EF1A(人真核翻译延伸因子1α1)、CAG(与鸡β-肌动蛋白启动子融合的CMV早期增强子)、CBh(与经修饰的鸡β-肌动蛋白启动子融合的CMV早期增强子)、SV40(猿猴病毒40增强子/早期启动子)、GFAP(人胶质原纤维酸性蛋白启动子)*：3’调节元件不包括在内。
图2A.pAAV转染之后MAB1 IgG和scFv-Fc的CHO细胞上清液效价。BLI Octet系统，蛋白质A包被的生物传感器。箭头表示：当在构建体中重链基因位于轻链之前(HC/LC)时，相比于它们相应的LC/HC对应物，表达明显降低。克隆构建体是根据图1中的选项的，如图中所详述。
图2B.pAAV转染之后MAB1 Fab的CHO细胞上清液效价。BLI Octet系统，抗His包被的生物传感器。箭头再次表示：当在构建体中重链基因位于轻链之前(HC/LC)时，相比于它们相应的LC/HC对应物，明显降低的表达。
图3.用考马斯蓝染色进行的经纯化的MAB1 IgG的SDS-PAGE分离。当指示(DTT)时，样品在5mM二硫苏糖醇存在下还原。箭头表示向更大分子量的转移。
图4.用考马斯蓝染色进行的经纯化的MAB1 scFv-Fc的SDS-PAGE分离。当指示(DTT)时，样品在5mM二硫苏糖醇存在下还原。
图5.MAB1 IgG与TP-62肽结合。Octet-动力学从100nM结合蛋白候选物开始，然后是2倍连续稀释。上部的图涵盖具有不同启动子的2个启动子的MAB1 IgG和弗林蛋白酶HC/LC IgG构建体。下部的图涵盖弗林蛋白酶HC/LC和LC/HC MAB1 IgG构建体、IRES LC/HC和HC/LC IgG构建体以及scFv-Fc IgG构建体。各个构建体的细节见于图中。每个图用使用500nM TP-62肽的生物传感器上样开始。
图6.使用Superdex 200Increase 10/300GL柱对相关经纯化的pAAV来源的IgG进行的尺寸排阻色谱法分析。在PBS缓冲液中在4℃下进行分离。各个构建体的细节见于图中。
图7.相关经纯化的pAAV来源的IgG的尺寸排阻色谱图叠加。与图6中描述的条件相同。
图8.对弗林蛋白酶MAB2 IgG构建体的C端部分的分析，该分析确定了剩余的弗林蛋白酶/F2A肽以及因此的构建体上第一抗体链质量的增加。凝胶中进行胰蛋白酶消化，随后是LC/MS。
图9.来自AAV2、8、9和10CHO转导的每mL培养物的经纯化的MAB1 IgG和scFv-Fc，并与转染进行比较。经纯化的蛋白质的量/mL通过OD 280nm使用其相应的消光系数进行定量。各个构建体的细节见于图中。
图10.用考马斯蓝染色进行的经纯化的MAB1 IgG的SDS-PAGE分离。当指示(DTT)时，样品在5mM二硫苏糖醇存在下还原。
图11.用AAV2、8、9和10载体化的抗体构建体转导CHO、分化的神经元和BBB细胞之后的IgG效价比较。左图，CHO转导；中间的图，分化的人神经母细胞瘤细胞系转导；右图，分化的血脑屏障(BBB)细胞转导。各个构建体的细节见于图中。
图12.用AAV2、8、9和10载体化的MAB1 IgG和scFv-Fc构建体转导大鼠脑原代细胞之后的IgG效价比较。各个构建体的细节见于图中。
图13.在通过不同的WT AAV血清型转导之后3天，对hCMEC/D3细胞分泌到Organo3D BBB模型的顶端上清液中的MAB1(人IgG1亚型)的检测。MAB1的表达由CMV启动子驱动。IRES元件在LC和HC之间使用以实现双顺反子抗体的产生。总之，受试构建体具有以下排列：5'-CMV启动子-具有编码分泌肽的序列的轻链编码基因-IRES-具有编码分泌肽的序列的重链编码基因-3'。通过与hTDP-43全长(FL)蛋白结合的ELISA测量的抗体存在表示为O.D.(光密度)。对于对照AAV2-eGFP转导，未观察到结合。如所预期的，对于2个对照，mIgGMAB1和hIgGMAB2，没有检测到抗体结合，因为使用抗人二抗进行检测，而MAB2不能结合hTDP-43FL蛋白。
图14.在通过AAV2构建体转导之后3天，对hCMEC/D3细胞分泌到Organo3DBBB模型的顶端和基底外侧区室二者中的MAB1(人IgG1同种型)的检测。使用LC和HC之间的IRES元件实现了由CMV启动子驱动的MAB1的双顺反子表达。总之，受试构建体具有以下排列：5'-CMV启动子-具有编码分泌肽的序列的轻链编码基因-IRES-具有编码分泌肽的序列的重链编码基因-3'。通过与TDP-43全长蛋白结合的ELISA测量抗体的存在。对于对照AAV2-eGFP转导，未观察到结合。数据表示为O.D.。
图15.在通过AAV2构建体转导之后3天，在不同MOI(感染复数)下，对hCMEC/D3细胞分泌到24孔培养板的上清液中的MAB1(人IgG1同种型)的检测。使用LC和HC之间的IRES元件实现了由CMV启动子驱动的MAB1的双顺反子表达。总之，受试构建体具有以下排列：5'-CMV启动子-具有编码分泌肽的序列的轻链编码基因-IRES-具有编码分泌肽的序列的重链编码基因-3'。通过与TDP-43全长蛋白结合的ELISA测量抗体的存在。数据以由标准曲线计算的浓度表示。
图16.在通过AAV2构建体转导之后3天，对hCMEC/D3细胞分泌到Transwell BBB模型的顶端和基底外侧区室二者中的MAB1(人IgG1同种型)的检测。使用LC和HC之间的IRES元件实现了由CMV启动子驱动的MAB1的双顺反子表达。总之，受试构建体具有以下排列：5'-CMV启动子-具有编码分泌肽的序列的轻链编码基因-IRES-具有编码分泌肽的序列的重链编码基因-3'。通过与hTDP-43全长蛋白结合的ELISA测量抗体的存在。对于对照AAV2-eGFP转导，未观察到结合(数据未显示)。数据以抗体存在的相对百分比表示。
图17.在(A)b.End3和b.End5小鼠脑内皮瘤细胞系和(B)hCMEC/D3细胞中，在由AAV2、AAV-BR1和AAVrh10构建体以100’000的MOI转导之后6天，对细胞上清液中的MAB1hIgG1和scFv-Fc的检测。使用LC和HC之间的IRES元件实现了由CMV启动子驱动的MAB1的双顺反子表达。总之，受试构建体从5'至3'具有以下排列：CMV启动子-分泌肽-轻链-IRES-分泌肽-重链-WPRE-polyA。使用抗hFc试剂盒(PerkinElmer，Cisbio)通过HTRF(均相时间分辨荧光)测量抗体存在。数据以从标准曲线内插的浓度表示，并从单个实验内的3至6个生物学重复产生，并绘制了平均值±SD。
图18.对由来自可商购的3D人体外BBB模型(Neuromics)的原代人脑微脉管系统内皮细胞分泌的MAB1 hIgG1或mIgG2a的检测。在由AAV2和AAV-BR1载体以100’000的MOI转导之后7天，在顶端和基底外侧区室二者中进行检测。使用LC和HC之间的IRES元件实现了由CMV或CBh启动子驱动的MAB1的双顺反子表达。总之，受试构建体从5'至3'具有以下排列：CMV或CBh启动子-分泌肽-轻链-IRES-分泌肽-重链-WPRE-polyA。使用抗hFc试剂盒(PerkinElmer，Cisbio)通过HTRF测量抗体存在。数据以从相应的顶端和基底外侧区室中的标准曲线内插的(A)浓度或(B)数量表示。为了允许在所评价条件之间进行直接比较，在单个实验内进行了2至3个生物学重复，并绘制了平均值±SD。
在以下实施例中进一步描述本发明。这些实施例仅用于举例说明本发明，并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：载体化的抗体构建体：
1.选择用于载体化的最佳克隆
1.1介绍
在AAV衣壳中使用单链DNA(ssDNA)载体化进行的主要挑战之一是容量。表达盒尺寸包含a)启动子，b)开放阅读框(编码抗体或抗体片段，通常包括重链和轻链)以及c)下游调节元件。一旦DNA被转化为单链并在AAV衣壳中载体化，建议的尺寸不大于4.7kb，包括5’ITR和3’ITR。较大尺寸的构建体会难以进入AAV病毒衣壳复合物，从而降低产量。自互补构建体在5’ITR和3’ITR内的容量甚至更小，即不大于2.3kb。
常用的抗体质粒AAV(pAAV)设计用尺寸较小并适合于由单个启动子驱动的表达盒的抗体片段制备，该抗体片段例如：a)抗体单链可变片段(scFv)[44,55]，b)与IgG Fc结构域融合的scFv(scFv-Fc)[56,57]，或c)单结构域抗体，例如鲨鱼和/或骆驼科抗体[58-62]。
在全抗体的情况下，由于表达盒的上述尺寸限制，因此很难适合轻链和重链基因二者。迄今为止，大多数学术和工业研究者依赖于pAAV构建体，该构建体由在自加工蛋白质融合体中翻译的开放阅读框组成。在大多数情况下，相应的编码顺序由以下组成：1)抗体重链，2)弗林蛋白酶蛋白酶识别位点，也称为PACE(成对碱性氨基酸切割酶)[63]，3)促进弗林蛋白酶切割[47-49]并预期促进清洁过程的自切割2A肽，即E2A、F2A、P2A或T2A，以及4)抗体轻链。由于获得了高表达效价和等摩尔数的抗体链表达，研究者对该构建体有显著的偏好。然而，并在大多数情况下，蛋白质未适当地成熟，弗林蛋白酶和2A融合肽的残余部分被包含在所表达的蛋白质中[64]，从而可能利用所表达蛋白质的不希望的免疫原性[45]。不同的2A肽具有不同的自切割效率，T2A和P2A的自切割效率最高，F2A的自切割效率最低[65]。因此，高达50％的F2A连接蛋白可留在细胞中作为融合蛋白，这可导致一些不可预测的结果，包括功能的获得[66]。2A位点导致核糖体在大约60％的时间从多核苷酸上脱离。连同P2A和T2A的约10％的核糖体通读，这导致下游肽链的表达降低了约70％[47]。此外，值得注意的是，2A肽来源于病毒，即F2A来源于口蹄疫病毒18；E2A来源于马鼻炎(equine rhinitis)A病毒；P2A来源于猪捷申病毒-1 2A；T2A来源于明脉扁刺蛾(thosea asigna)病毒2A。因此，哺乳动物和人免疫系统可认为重链或轻链上剩余的2A肽残基是非自身的。
用于抗体表达的弗林蛋白酶/2A融合体的较不常见pAAV构建体替代方案是：1)使用两个启动子，每个启动子驱动抗体重链和轻链；或者2)使用一个启动子，并在两个抗体基因链之间定位内部核糖体进入位点(IRES，源自脑心肌炎病毒的DNA序列)。第一种由于启动子的常见的大尺寸提高了pAAV设计中的限制，从而需要使用小启动子来控制重链和轻链抗体基因，并去除可大大提高蛋白质效价的3’ITR调节元件。第二种，IRES构建体，迄今为止被认为是差的蛋白质表达体[56,67-69]，因此被许多pAAV构建体忽视(其中IRES构建体表达的效价比2A或弗林蛋白酶2A构建体低得多)。
1.2选择方法
我们筛选了多于55种的pAAV构建体，这些构建体是根据开放阅读框组件位置、启动子强度、分泌肽和融合肽而产生和研究其表达的。不同类型的构建体在图1中示出。据我们所知，文献中报道的使用AAV载体的完整IgG表达具有重链位于轻链之前的弗林蛋白酶/2A构建体(参见图1，第2构建体)。我们的方法还研究了这种类型的构建体的其他轻链和重链位置，以及双顺反子构建体的不同启动子强度(图1，第4构建体)。此外，我们通过改变链位置、使用不同的分泌肽和定制内部和下游调节元件来挑战IRES双顺反子构建体的所报道的低表达(图1，第3构建体)。最后，我们测试了两个完整的抗体克隆和相应的抗体片段(图1，第1构建体)，例如scFv-Fc、Fab和scFv，即MAB1(抗TDP-43抗体)和MAB2(抗ErbB2抗体)。此外，我们还包括了表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的克隆。在我们的研究中，我们定义了用于鉴定最佳pAAV构建体的选择标准如下：1)高蛋白效价、2)低聚集体水平、3)正确的成熟和折叠以及4)与靶标结合。
1.3.中国仓鼠卵巢(CHO)细胞转染及上清液效价
简言之，将CHO细胞(ExpiCHO-STM(ThermoFisher，目录号：A29127))按照制造商的建议用1μg/mL质粒/构建体转染，一式三份。使细胞在具有优化的合成培养基的24深孔微板中在37℃下生长24小时，然后将温度转变到32℃，然后使其在最终体积为约3.5mL的培养基中生长11天。然后使用生物膜层干涉法(Bio-Layer Interferometry，BLI)用Octet系统以及包被有以下的生物传感器尖端对每份上清液的效价一式三份地进行估计：a)蛋白质A(全长抗体和scFv-Fc的情况下)或b)结合经His标记的蛋白质的单克隆抗体(此处为Fab、scFv和EGFP)。对于所有测量，使用相应的和先前纯化的蛋白质进行标准曲线。图2A中显示了抗体和scFv-Fc的结果，图2B中显示了Fab的结果。
观察结果。在MAB1 IgG的情况下，每个2个启动子的构建体产生范围为约30至100μg/mL的显著效价。令人惊讶的是，用弗林蛋白酶和IRES构建体获得范围为150至350μg/mL的约2至10倍高的效价，但与2个启动子的IgG构建体相比，仅当构建体中轻链基因位于重链基因之前(LC/HC)时明显。IRES IgG构建体LC/HC中的高蛋白质水平与弗林蛋白酶IgG构建体相当。这是预料不到的，并且据我们所知，这是第一次报道，因为现有技术提到了相反的情况[56,67-69]。对图2B中的MAB1 Fab构建体进行了类似的观察，表明了与弗林蛋白酶和2个启动子的构建体相似的效价。此外，在IRES Fab构建体中轻链位于重链之前(LC/HC)相比于它们的HC/LC构建体对应物具有显著更高的表达效价。所收集的数据表明，在使用弗林蛋白酶和IRES的IgG或Fab构建体中，轻链位于重链之前提高了效价。该效价显著高于HC/LC对应物。最后，当中等强度的启动子SV40作为两个启动子之一包含在两个启动子的IgG构建体中时，表达似乎降低。
1.4.SDS-PAGE上的蛋白质纯化及分析
在该实验之后，收获细胞并且将每个克隆的上清液一式三份地分离并合并。在全长抗体和scFv-Fc克隆的情况下，使用可商购的蛋白质A树脂捕获蛋白质，并用补充有100mMNaCl的100mM甘氨酸pH 2.8缓冲液对其进行洗脱。然后，通过分光光度法OD 280nm使用其相应的消光系数对蛋白质进行定量。在Fab和scFv构建体的情况下，我们采用了可商购的亲和柱用于经His标记的蛋白质。
然后通过SDS-PAGE 12-4％分离蛋白质，并用考马斯蓝染色。独立于蛋白质浓度，每个凝胶孔上样13μL/样品，以：a)对纯化的效价进行第二次估计，以及b)查看任何可能的降解产物。此外，在不存在二硫苏糖醇(DTT)的情况下，在150kDa下进行了链间二硫键形成和适当复合物的验证，以及在二硫苏糖醇存在的情况下进行了轻链和重链的释放的验证。经纯化的MAB1 IgG pAAV克隆的所得凝胶在图3中呈现。
观察结果。所有样品都具有正确的二硫键构型，并且抗体在150kDa的相应分子量下迁移。当还原时，两个构建体，2个启动子的和IRES IgG，在分别为约25和约50kDa的预期轻链和重链分子量下分离。然而，注意到弗林蛋白酶/2AIgG构建体的第一链即HC/LC构建体构型中的重链和LC/HC构型中的轻链的分子量较大。通过LC/MS进一步研究了每个弗林蛋白酶/2AIgG链构建体的尺寸，用于肽的准确性。这证实了在LC/HC构建体的轻链或HC/LC构建体的重链的C端添加了完整或一些部分的弗林蛋白酶/2A肽(参见图3、7和8)。相比之下，第二抗体构建体链被适当加工，并通过LC/MS在N端处未观察到肽残留部分。总的来说，所有克隆在所应用的细胞培养条件下都表现出低水平的降解。2个启动子和IRES蛋白似乎具有最准确的成熟品质。最后，对克隆MAB2(一种不同的IgG抗体)进行了相同的观察。同样，弗林蛋白酶/2A构建体的第一构建体链具有较大的分子量，并且通过LC/MS确认了弗林蛋白酶/2A肽的添加，而2个启动子和IRES IgG具有最准确的成熟。经纯化的MAB1 scFv-Fc样品也在相同的SDS-PAGE条件下分离。结果在图4中呈现。
观察结果。按照经纯化的MAB1样品，scFv-Fc具有正确的链间二硫键形成，并且蛋白质在其约100kDa的预期分子量下迁移。当用5mM DTT还原样品时，单链被释放，并以50kDa的预期分子量迁移。总的来说，所有克隆在所使用的细胞培养条件下都表现出低水平的降解。
1.5.通过BLI对转染来源的蛋白质的结合亲和力的分析
为了证明pAAV系统产生的蛋白质是功能性的，我们使用Octet系统通过BLI测量了它们与TARDNA结合蛋白43(TDP-43)C端肽的结合亲和力。简言之，链霉亲和素生物传感器尖端包被有500nM TDP-43C端肽(称为TP-62)。然后使用反应缓冲液进行测量，该缓冲液由补充有0.1％牛血清白蛋白和0.02％吐温的PBS组成。反应在30℃下进行。然后用从100nM浓度开始的两倍连续稀释对样品进行分析。使用其在OD 280nm下相应的消光系数计算蛋白质摩尔浓度。在反应缓冲液中使样品与TP-62肽缔合900秒，然后在相同缓冲液中解离600秒。将生物传感器在pH 2.0的10mM甘氨酸中再生，并在每次样品测量之前在反应缓冲液中中和。针对相关经纯化的样品，所收集的数据在图5中呈现。
观察结果。总的来说，所有MAB1克隆都是功能性的，并结合TDP-43C端肽，具有约1至6nM的相当的KD。2个启动子和IRES构建体具有约2.5至3nm的相似的Rmax。重要的是，2个启动子的构建体的KD亲和力相应地作为启动子或分泌肽的函数而没有变化(CMV/CMV、CMV/SV40或SV40/CMV启动子构建体以及Igk或GH1分泌肽)。相比之下，弗林蛋白酶IgG HC/LC构建体产生的蛋白质的Rmax是2个启动子和IRES构建体的大约两倍，二者分别为约5至6nm和约2.5至3nm。此外，弗林蛋白酶IgG LC/HC构建体的Rmax相比于其2个启动子和IRES的对应物的Rmax，较不明显但也更大，二者分别为约3.5nm和约2.5至3nm。根据BLI系统，数据表明，弗林蛋白酶/2A构建体在等摩尔浓度下相比于其2个启动子和IRES的对应物，蛋白质分子量更大，例如在测定条件下的弗林蛋白酶IgG HC/LC蛋白质。在使用尺寸排阻色谱法分离(参见1.6)的下一个分析步骤中，证实了该观察结果。最后，数据表明可用pAAV表达系统获得功能性IgG和scFv蛋白。下文描述了进一步的Octet分析(参见1.6)。
1.6.通过尺寸排阻色谱法和LC/MS进行的蛋白质分析
然后通过尺寸排阻色谱法分离以监测降解、聚集的存在和正确的蛋白质折叠的经纯化的蛋白质以150kDa的分子量作为单体分离。对此，我们在来自G&E Healthcare的Superdex 200Increase 10/300GL柱上在4℃下使用PBS缓冲液分离了100μL经纯化样品。产生的分离在图6中呈现。
观察结果。对于所有构建体，IgG单体如所预期的以约11.7mL的洗脱体积分离。相比之下，弗林蛋白酶IgG构建体具有大的聚集体水平；对于LC/HC构建体为26％，对于HC/LC构建体为38％。此外，弗林蛋白酶构建体的单体峰未与IRES和2个启动子的IgG构建体对齐(参见叠加的图7)，并且在较早洗脱的分离物中具有稍大的分子量。显然，较早洗脱的0.25mL弗林蛋白酶IgG LC/HC构建体就是这种情况。弗林蛋白酶/2A构建体中较大的聚集体水平(图6、7和8)可反映这种类型的蛋白质的所报道的预料不到的结果和毒性[66]。这些数据证实了以上BLI测量，表明了较大分子量的弗林蛋白酶/2A来源的IgG。相反，IRES IgG构建体蛋白展示出非常低的2％的聚集体水平和98％的丰富的单体蛋白，因此证明了更高的品质。2个启动子的IgG蛋白也具有13％的低聚集体水平(尽管高于IRES构建体)。这些结果鉴定了IgG IRES LC/HC和2个启动子的LC/HC是具有更好的品质、表达产量、稳定性和潜在较少的不希望的免疫原性和/或毒性的构建体。
2.MAB1和MAB2前导候选物的载体化
2.1.用于细胞转导的AAV衣壳选择
如上所讨论的，选择了提供最高品质蛋白质的MAB1和MAB2最佳构建体用于载体化，即a)MAB1 IgG IRES LC/HC和2个启动子IgG LC/HC构建体，b)MAB2 2个启动子IgG LC/HC以及c)MAB1 scFv-Fc。选择一组不同的目标细胞用于转导的基因递送，即中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、在神经元中分化的人神经母细胞瘤细胞系和脑内皮细胞系(hCMEC/D3)。对此，以上最佳pAAV构建体在AAV2、AAV8、AAV9和AAV10衣壳中被载体化。所产生的具有低内毒素的经超纯化的衣壳被用于转导细胞。
2.2.CHO细胞转导、蛋白质纯化和与经转染的相同克隆的效价比较
简言之，使用载体化的前导构建体以100K gc(基因组拷贝)/CHO细胞转染CHO细胞培养物，一式三份，然后使其在如上的经优化的合成培养基中在37℃下在24深孔微板中生长24小时，随后将温度转变至32℃，然后使其以3.5mL/孔的最终体积生长11天。细胞生长不受AAV存在的影响。在此之后，收获细胞并且将每个克隆的上清液一式三份地分离并合并。使用蛋白质A树脂如上捕获全长抗体和scFv-Fc克隆，并用补充有100mM NaCl的100mM甘氨酸pH 2.8缓冲液对其进行洗脱。然后，通过分光光度法OD 280nm使用其相应的消光系数对蛋白质进行定量。所得的效价在图9中示出。
观察结果。所有经转导的前导基因构建体均使用每种受试AAV衣壳表达。表达水平作为用于载体化的衣壳的函数而变化，但总体上与用经纯化质粒转染的相同构建体相似。
2.3.使用MAB1抗原ELISA的大鼠原代脑细胞转导和抗体效价
简言之，大鼠原代细胞是通过从大鼠幼崽脑中解剖获得的，并在96孔微板中在补充有B27TM(ThermoFisher，目录号：17504044)的100μL神经基础培养基中在37℃下生长，每孔含有50K原代细胞。使用载体化的前导构建体以100K gc/大鼠原代细胞一式三份地转导大鼠原代脑细胞，然后在补充有B27的神经基础培养基中在37℃下生长7天。显微形态学评价表明细胞不受AAV存在的影响。然后收集一式三份的转导细胞上清液以通过ELISA量化针对hTDP-43全长蛋白的抗体效价。简言之，将96孔微板在4℃下在PBS缓冲液中用1μg/ml人全长TDP-43包被过夜。然后将板用补充有0.05％吐温的PBS洗涤3次，然后在37℃下用补充有1％牛血清白蛋白的PBS、0.05％吐温封闭1小时。将收集的含有抗体的上清液在封闭缓冲液中稀释20、40和80倍，然后将50μL样品添加至微板，并在37℃下孵育1小时。然后如上洗涤板并将其与在封闭缓冲液中以1/10000稀释度稀释的山羊抗人IgG Fc-HRP(abcam，#ab98624)一起在37℃下孵育1小时。如上洗涤板，并用100μLTMB底物补充孔，在室温下孵育几分钟。之后，用50μL的H2SO4 0.16M封闭HRP反应。最后，所得溶液在微板读取器(BioTek)情况下在450nm处为红色。相应的抗体效价在图12中示出。数据表明在AAV2中载体化的MAB1 IgG和scFv-Fc克隆具有显著较低的表达效价，范围在5至50ng/mL细胞上清液之间。相比之下，其他AAV8、9和10载体化的候选物具有大得多的IgG和scFv-Fc效价，范围在约500和2000ng/mL细胞上清液之间，与表达驱动系统(IRES或2个启动子)无关，在AAV9中载体化的MAB1除外，其在2个CMV启动子下表达，效价为约180ng/mL。
观察结果。所有经转导的前导基因构建体均使用每种受试AAV衣壳表达。如上，表达水平作为用于载体化的衣壳的函数而变化，但总体上与用经纯化质粒转染的相同构建体相似。
2.4.通过SDS-PAGE的分析以验证蛋白质成熟
通过SDS-PAGE 12-4％分离经纯化的前导蛋白，并用考马斯蓝染色。如上，在没有协调上样量的情况下，等体积(13μL/样品)地上样蛋白质样品，以通过OD 280nm验证所测得的量。图10呈现了MAB1 pAAV克隆的所产生的分离。
观察结果。所有样品都具有正确的二硫键构型，并且抗体在150kDa的相应分子量下迁移，如图10中所展示的。当还原时，两个构建体，2个启动子的和IRES IgG，在分别为约25和约50kDa的预期轻链和重链分子量下分离。scFv-Fc具有正确的链间二硫键形成，并且蛋白质在约100kDa的其预期分子量下迁移。当用5mM DTT还原样品时，单链被释放，并以50kDa的预期分子量迁移。总的来说，如由先前筛选实验所预期的，所有克隆在所采取的细胞培养条件下都表现出低水平的降解。
2.5.通过BLI对转染来源、转导来源的蛋白质的结合亲和力的分析
为了证明使用pAAV系统产生的蛋白质是功能性的，我们在如上所述的相同条件下通过BLI使用Octet系统测量了它们与TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)C端肽的结合亲和力。简言之，链霉亲和素生物传感器尖端包被有500nM TDP-43C端肽(称为TP-62)。然后使用反应缓冲液进行测量，该缓冲液由补充有0.1％牛血清白蛋白和0.02％吐温的PBS组成。反应在30℃下进行。然后用从100nM浓度开始的两倍连续稀释对样品进行分析。所收集的数据在下表1中呈现：
表1.
观察结果。数据表明，来自IRES或2个启动子的pAAV构建体的IgG克隆具有与所用的标准品相当的KD(表1)。此外，KD在转染或载体化的构建体类型之间是相当的，范围在约4至6nM之间，因此证明了载体化产生了高品质蛋白质，其针对被靶向的TDP-43抗原具有预期的结合亲和力。对于scFv-Fc蛋白也可以这样说，但可能略有变化。
2.6.人神经母细胞瘤细胞系和BBB细胞转导以及细胞上清液中的蛋白效价
下一步是验证AAV2、8、9和10载体化的MAB1 IgG和scFv-Fc构建体以及阴性对照MAB2 IgG 2启动子LC/HC是否可有效转导CHO以外的其他细胞类型。对此，我们使用补充有10μM视黄酸和2％胎牛血清的浓缩合成培养基在37℃、5％CO2下转导分化为神经元的人神经母细胞瘤细胞。一式三份地转导约200K细胞，并在每孔含500μL培养基的24孔微板中孵育。通过添加约100K基因组拷贝/细胞进行转导。通过ELISA确定载体化的MAB1 IgG和scFv-FC二者的效价。对血脑屏障微血管中分化的hCMEC/D3细胞进行了类似的实验(参见以下实施例中的程序)。在此，使血脑屏障细胞在50K或100K/孔、37℃、5％CO2下生长，并通过AAV载体化的MAB1 IgG IRES LC/HC构建体的50K基因组拷贝(gc)/细胞进行转导。在两种细胞类型情况下，均每3天更换培养基。简言之，用全长TDP-43蛋白包被96孔微板，然后用补充有1％血清牛白蛋白和0.05％吐温的PBS缓冲液饱和。然后将样品添加到微板孔中，并在37℃下孵育1小时。同时，从2μg/mL浓度开始然后使用与样品相同的缓冲液(补充有1％血清牛白蛋白和0.05％吐温的PBS缓冲液)以2倍连续的方式稀释，添加相应的样品标准品。用补充有0.05％吐温的PBS缓冲液洗涤板。在此之后，将用辣根过氧化物酶标记的抗人IgG Fc抗体添加到板中的补充有1％血清牛白蛋白和0.05％吐温的PBS缓冲液中，并在37℃下孵育1小时。如上洗涤板，并将辣根过氧化物酶底物(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺，称为TMB)添加到孔中，在室温下孵育约5至10分钟，并使用0.5M H2SO4停止反应。然后在微板读取器中在OD 450nm下独立地读取样品。所收集的数据在图11中呈现，并与以上在用MAB1前导构建体进行的相同载体化CHO转导的情况下获得的经纯化的效价进行了比较。
观察结果。两种经转导的可商购细胞类型(从人神经母细胞瘤细胞系和脑内皮细胞系(hCMECD/3)分化的神经元)产生了能够结合全长TDP-43蛋白的功能性MAB1 IgG和scFv-Fc(图11)。总的来说，抗体和衍生物随时间大量产生(参见中间的图，第18天，分化的人神经母细胞瘤细胞系)。它们代表约0.2至1pg抗体/细胞/天的平均值，这是稳健的细胞表达，类似于针对在较高细胞密度(约1000万/mL)下生长的CHO细胞所报道的，其表达约0.5至4pg/细胞/天。在这些实验中，对于AAV2载体化的MAB1 IgG和scFv-Fc，所获得的效价较高。此外，与载体化的IgG对应物相比，每种AAV8、9和10载体化中的scFv-Fc效价更高。作为用于载体化的衣壳的函数，IRES构建体的分化的人神经母细胞瘤细胞系效价高于2个启动子的构建体对应物。最后，由于其结合除TDP-43以外的另一特异性抗原的特性，未检测到载体化的MAB2 IgG 2个启动子LC/HC(参见中间的图)。总之，所收集的数据证实了较早的观察结果，该观察结果表明IgG IRES构建体相比于使用LC/HC构型的2个启动子达到更高的表达效价。
表2：载体化的抗体构建体中使用的核酸序列：
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
实施例2.细胞培养
在37℃下在含5％CO2的湿润气氛中将人脑微血管内皮hCMEC/D3细胞维持在预包被有100μg/mL鼠尾I型胶原(08-115，Merck)的75cm2的烧瓶中的补充有试剂盒中包含的所有因子和1ng/mL bFGF(Merck，GF003)的EndoGRO-MV生长培养基(Merck，SCME004)中。
B.End3和b.End5小鼠脑内皮瘤细胞系在补充有Pen/strep和10％FBS的DMEM培养基(生长培养基)中培养。将细胞在经TC处理的75cm2烧瓶中培养，并用胰蛋白酶-EDTA溶液脱离，以用于以1:10的比例传代进行继代培养。将细胞在37℃下在含有5％CO2的湿润气氛中孵育。
实施例3.Organo3通道体外BBB模型
用于3D体外BBB建模的Organo3通道系统包含嵌入标准384孔微量滴定板格式的40个微流控细胞培养结构。每个组织芯片由三个通道构成，这些通道与微量滴定板的相应孔相连，其起入口和出口的作用，以进入微流控培养。首先，通过混合1M HEPES、37g/L NaHCO3和5mg/mL胶原-I来制备4mg/mL胶原-I(大鼠尾，Merck)的胞外基质(ECM)凝胶，并将其引入到中心通道中。相位导向器(phase guide)用于通过弯月形钉在中心通道中选择性地形成ECM凝胶的图案。ECM胶凝(在37℃、5％CO2下过夜或过周末)之后，在顶部通道中以40000个细胞/芯片的密度将hCMEC/D3细胞接种在补充有1ng/mLbFGF的EndoGRO-MV生长培养基中。一旦细胞贴壁，就将板水平放置在通过储器之间的相互调平诱导流动的间隔摇杆上，并在37℃、5％CO2下孵育至少3天以允许小管形成。约每3天进行培养基更换，以维持最佳屏障完整性，其在每次转导或胞吞转运实验之前通过通透性测定进行控制。通过灌注在培养基中的0.5mg/mLFITC-右旋糖酐(Sigma 46946，平均150kDa；FD20S，平均20kDa，和Sigma FD10S，平均10kDa)通过管腔，然后确定基础凝胶区的荧光水平(相对于腔中的荧光归一化)来评估屏障功能。使用Incucyte活细胞读取器在1小时期间每5分钟进行荧光测量。
实施例4.Transwell体外BBB模型
对于基于Transwell的体外BBB模型，首先在湿润的培养箱中用大鼠尾胶原-I(Merck)包被含有孔径为0.4μm的Corning Transwell膜(0.33cm2培养面积，Sigma)的24孔板的顶端1小时。然后将hCMEC/D3细胞以100000个细胞/cm2的密度接种在补充有1ng/mLbFGF的EndoGRO-MV生长培养基中。约每2至3天进行培养基更换，总是维持100μL的顶端体积，并且在基底外侧为600μL。从内皮细胞接种之后4天进行通透性和跨内皮电阻(TEER)测量，并且发现细胞单层直到接种之后第15天仍保持合适的屏障特性。对于通透性测量，在基底外侧区室中用600μL新鲜培养基替换内皮细胞培养基。然后将培养基中的100μL 0.25mg/mL FITC(Sigma 46946，平均150kDa；FD20S，平均20kDa和Sigma FD10S，平均10kDa)添加到上部区室中，并将细胞在湿润培养箱中孵育1小时。然后从基底外侧区室收集100μL级分，并将其转移到Greiner black 96孔板中，用于使用Tecan Spark微板读取器进行荧光测量。根据公式Papp＝(ΔQ/Δt)×(1/AC0)计算表观通透性，其中Papp是表观通透性系数(cm/分钟)，ΔQ/Δt是右旋糖酐穿过内皮细胞层的通透速率(μg/分钟)，A是细胞层的表面积(cm2)，以及C0是施加到顶端细胞表面的初始右旋糖酐浓度(μg/ml)。对于TEER测量，在下部区室中用1050μL新鲜培养基替换内皮细胞培养基，并且在上部区室中用325μL替换。使用EVOM-3上皮伏特欧姆计(WPI)测量TEER。
实施例5.hBMEC的AAV转导/通过靶向结合检测hBMEC和抗体-通过使用OrganoBBB模型的hCMEC/D3细胞的抗体分泌
建立的OrganohCMEC/D3体外BBB模型用于评价hCMEC是否可有效分泌AVVWT衣壳中的载体化抗体。将MAB1(人IgG1同种型)抗体载体化到AAV2、AAV8、AAV9和AAVrh10衣壳中，并在以50’000的MOI接种到Organo/>3-通道中之后24小时转导到hCMEC/D3单层中。在转导之后3天收集来自顶部通道(顶端)和底部通道(基底外侧)两处的上清液，并使用间接ELISA通过与人全长(FL)TDP-43的结合确定顶端和基底外侧区室中的抗体浓度。简言之，用1μg/ml人FL TDP-43在4℃下在碳酸盐缓冲液中对ELISA板进行包被过夜。用0.05％吐温-20/PBS洗涤板，然后用0.05％吐温-20/PBS中的1％牛血清白蛋白(BSA)在37℃下封闭1小时。然后将所收集的含有抗体的上清液添加到板中，并在37℃下孵育2小时然后洗涤板。添加以1/1000的稀释度在0.05％吐温-20/PBS中稀释的AP缀合的抗小鼠IgG二抗(Jackson，115-055-206)，在37℃下持续1小时。在最终洗涤之后，将板与pNPP溶液一起孵育，并在1小时之后使用读板器(BioTek)在405nm下读取。如图13所示，在通过被评价的所有WT AAV衣壳转导的hCMEC/D3单层的顶端上清液中均检测到MAB1(人IgG1同种型)，并且其保留与TDP-43的结合。对于AAV2，顶端区室中的MAB1效价被估计为约40ng/mL，对于AAV8、AAV9和AAVrh10血清型，为约4ng/mL。相关阴性对照(AAV2-eGFP)在TDP-43ELISA测定中未诱导任何信号。由AAV2转导的MAB1(人IgG1同种型)也在基底外侧区室中被检测到，其水平是顶端的20倍低(图14)，这与在Organo/>中致密ECM层中观察到的有限扩散一致(数据未显示)。如图15所示，MAB1(人IgG1同种型)AAV2构建体当以5’000至160’000的MOI在hCMEC/D3细胞中转导时，以剂量依赖性方式产生抗体效价。Transwell体外BBB模型也用于进一步验证载体化抗体的递送。在接种到24孔Transwell插入物中之后24小时使用MAB1 AAV2构建体转导hCMEC/D3单层。如先前所述，在转导之后3天收集来自顶端和基底外侧两处的上清液，并使用间接ELISA通过与人FL TDP-43的结合来确定顶端和基底外侧区室中的抗体浓度。该初步评估表明了抗体向顶端和基底外侧的相对均匀的分泌，以及因此的载体化的MAB1抗体的非极化分泌，如图16所示。
实施例6.小鼠和人脑微脉管系统内皮细胞系的抗体分泌
永生化的hCMEC/D3、b.End3和b.End5细胞系用于评价脑内皮细胞是否能够产生高品质抗体。评价了不同AAV载体(例如AAV2、AAV-BR1和AAVrh10)将MAB1抗体转基因递送到人和小鼠细胞系中的能力。所有抗体(例如hIgG1和scFv-Fc)的表达均由CMV启动子驱动；在编码hIgG1的LC和HC的基因之间使用IRES元件以实现双顺反子抗体的产生。将细胞以100’000个细胞/cm2平板接种到96孔培养板中。然后在生长培养基中以100’000的MOI平板接种之后4小时至16小时转导内皮细胞系。将细胞在37℃、5％CO2下孵育过夜，第二天更换培养基以去除AAV颗粒。转导之后7天收集细胞培养上清液，并使用hFc试剂盒(PerkinElmer，Cisbio，62HFCPEH)根据制造商的说明通过均相时间分辨荧光(HTRF)确定所分泌的抗体效价。这种定量方法允许检测所分泌的和正确折叠的抗体。经纯化的重组MAB1 hIgG1用作培养基中抗体定量的标准品。使用Tecan微板读取器读取荧光信号(Em：317nm；Ex：620nm和665nm；75次闪光；400μs积分时间；100μs滞后时间)。内插的所分泌抗体效价在图17中描绘。由AAV2递送的MAB1 hIgG1在(A)b.End3和b.End5小鼠内皮瘤细胞系上清液中以20ng/mL以及在(B)hCMEC/D3细胞上清液中以200ng/mL定量。对于b.End3/b.End5和hCMEC/D3，MAB1scFv-Fc构建体在上清液中产生，并且分别以50/100ng/mL和2500ng/mL定量。在所有三种细胞系中，在AAVrh10和AAV-BR1血清型的情况下获得的MAB1 hIgG1少于10ng/mL。所获得的抗体水平显示，脑内皮细胞产生正确折叠的抗体，与所用的AAV衣壳或抗体的形式无关。表达效价取决于所评价的条件，并且与两种小鼠细胞系相比，对于人hCMEC/D3细胞系观察到更高的效价(图17A和B)。此外，对于MAB1 scFv-Fc，与整个MAB1 IgG1对应物相比，当每个都由AAV2递送时，总是观察到更高的抗体效价。在该实验中，与AAV-BR1相比，AAV2在递送转基因方面更强效。
实施例7.3D人BBB模型中人原代脑微脉管系统内皮细胞的抗体分泌
使用可商购的基于Transwell的模型评价BBB细胞的抗体产生，该模型由人原代脑内皮微脉管系统细胞、星形胶质细胞和周细胞构成，购自Neuromics(3D45002)。按照制造商的说明培养该模型。简言之，将24孔板在第0天时解冻，并将冷冻培养基替换为温热的生长培养基(培养基1)。在湿润的培养箱中孵育3小时之后，去除培养基1并用第二维持培养基(培养基2)代替。没有进行进一步的培养基更换，将细胞保持在培养基中直到解冻之后第11天。评价AAV2和AAV-BR1载体以递送MAB1抗体转基因的人形式(hIgG1)和小鼠形式(mIgG2a)。抗体的表达由CMV或CBh启动子驱动；在LC和HC之间使用IRES元件来实现双顺反子抗体的产生。如先前针对AAV构建体所述的，在解冻之后第4天以100’000的MOI在生长培养基中转导存在于细胞培养插入物中的内皮细胞。转导之后的7天之后收集来自顶端和基底外侧区室两处的上清液，并使用人Fc和小鼠Fc试剂盒(PerkinElmer Cisbio，62HFCPEH和6FMIGPEH)按照制造商的说明通过HTRF确定所分泌的抗体效价。作为hIgG1或mIgG2a形式的经纯化的重组MAB相应地用作抗体定量的标准品，并在用于维持模型的相同培养基中滴定。使用Tecan微板读取器读取荧光信号(Em：317nm；Ex：620nm和665nm；75次闪光；400μs积分时间；100μs滞后时间)。内插的分泌抗体效价在图18中描绘。对于AAV2和AAV-BR1血清型获得了类似的MAB1 hIgG1效价，其在顶端区室(细胞培养插入物)中为约50ng/mL，在基底外侧为10至20ng/mL。与hIgG1对应物相比，在CMV或CBh启动子下表达的MAB1 mIgG2a同种型的AAV-BR1递送展示出2至3倍低的效价。当与来自原代人脑微脉管系统内皮细胞的数据相比时(图18A和B)，在hCMEC/D3细胞系中在AAV-BR1情况下观察到向性(tropism)差异(图17A，无可检测的MAB1 hIgG1表达)。虽然体外细胞系数据可预测体内效应，但原代细胞数据是体内AAV向性的优选预测因子。图18B描绘了在每个AAV载体的顶端(200μL)和基底外侧(500μL)区室中确定的抗体的相对数量。抗体重新分配表明来自内皮细胞层的双侧分泌抗体。
总之，所获得的抗体效价显示，原代脑内皮细胞产生正确折叠的抗体，与所使用的AAV衣壳无关，也与抗体的形式无关。作为重要的注意事项，在顶端和基底外侧两处都检测到抗体，后者的观察结果模拟了脑实质。所产生的数据验证了本文中所述的创新方法，并证实了用这种新的递送策略实现了高品质的IgG效价。
在本说明书的描述和权利要求书通篇，词语"包括"和"包含"及其变化形式意指"包括但不限于"，并且它们不旨在(并且不)排除其他部分、添加物、组件、整数或步骤。
在本说明书的描述和权利要求书通篇，除非上下文另有要求，否则单数形式涵盖复数形式。特别地，在使用没有数量词修饰的名词的情况下，除非上下文另有要求，否则本说明书应理解为涵盖一个/种或更多个/种。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。出于与本发明有关的所有目的，本文中具体提及的所有出版物和专利均通过引用整体并入。
本发明的范围不限于本文中描述的一些具体实施方案。实际上，通过前面的描述和附图，除了本文中所述的那些之外的本发明的多种修改对于本领域技术人员来说将变得明显。这样的修改旨在落入所附权利要求书的范围内。此外，本文中描述的本发明的所有方面和实施方案被认为是广泛适用的并且可与任何和所有其他一致的实施方案组合，包括适当地从本发明的其他方面获得的那些(包括单独的(in isolation))。
参考文献：
1.Villabona-Rueda,A.,et al.,The Evolving Concept of the Blood BrainBarrier(BBB):From a Single Static Barrier to a Heterogeneous and DynamicRelay Center.Front Cell Neurosci,2019.13:p.405.
2.Daneman,R.and A.Prat,The blood-brain barrier.Cold Spring HarbPerspect Biol,2015.7(1):p.a020412.
3.Pachter,J.S.,H.E.de Vries,and Z.Fabry,The blood-brain barrier andits role in immune privilege in the central nervous system.J Neuropathol ExpNeurol,2003.62(6):p.593-604.
4.Sweeney,M.D.,et al.,The role of brain vasculature inneurodegenerative disorders.Nat Neurosci,2018.21(10):p.1318-1331.
5.St-Amour,I.,et al.,Brain bioavailability of human intravenousimmunoglobulin and its transport through the murine blood-brain barrier.JCereb Blood Flow Metab,2013.33(12):p.1983-92.
6.Pardridge,W.M.,Blood-Brain Barrier and Delivery of Protein and GeneTherapeutics to Brain.Front Aging Neurosci,2019.11:p.373.
7.Thom,G.,et al.,Isolation of blood-brain barrier-crossing antibodiesfrom a phage display library by competitive elution and their ability topenetrate the central nervous system.MAbs,2018.10(2):p.304-314.
8.Zhang,W.,et al.,Differential expression of receptors mediatingreceptor-mediated transcytosis(RMT)in brain microvessels,brain parenchyma andperipheral tissues of the mouse and the human.Fluids Barriers CNS,2020.17(1):p.47.
9.Gao,H.,Progress and perspectives on targeting nanoparticles forbrain drug delivery.Acta Pharm Sin B,2016.6(4):p.268-86.
10.Teleanu,D.M.,et al.,Blood-Brain Delivery Methods UsingNanotechnology.Pharmaceutics,2018.10(4).
11.Chen,H.,et al.,Focused ultrasound-enhanced intranasal braindelivery of brain-derived neurotrophic factor.Sci Rep,2016.6:p.28599.
12.Ahmad,E.,et al.,Evidence of nose-to-brain delivery ofnanoemulsions:cargoes but not vehicles.Nanoscale,2017.9(3):p.1174-1183.
13.Henchcliffe,C.and M.Parmar,Repairing the Brain:Cell ReplacementUsing Stem Cell-Based Technologies.J Parkinsons Dis,2018.8(s1):p.S131-S137.
14.Heller,L.,et al.,Secretion of proteins and antibody fragments fromtransiently transfected endothelial progenitor cells.Journal of cellular andmolecular medicine,2020.24(15):p.8772-8778.
15.Desai,N.,Challenges in development of nanoparticle-basedtherapeutics.AAPS J,2012.14(2):p.282-95.
16.Kariolis,M.S.,et al.,Brain delivery of therapeutic proteins usingan Fc fragment blood-brain barrier transport vehicle in mice and monkeys.SciTransl Med,2020.12(545).
17.Ullman,J.C.,et al.,Brain delivery and activity of a lysosomalenzyme using a blood-brain barrier transport vehicle in mice.Sci Transl Med,2020.12(545).
18.Pothin,E.,D.Lesuisse,and P.Lafaye,Brain Delivery of Single-DomainAntibodies:A Focus on VHH and VNAR.Pharmaceutics,2020.12(10).
19.Guo,X.-b.,X.Deng,and Y.Wei,Homing of Cultured EndothelialProgenitor Cells and Their Effect on Traumatic Brain Injury in RatModel.Scientific Reports,2017.7(1):p.4164.
20.Guzman,R.,M.Janowski,and P.Walczak,Intra-Arterial Delivery of CellTherapies for Stroke.Stroke,2018.49(5):p.1075-1082.
21.Tervo,D.G.,et al.,A Designer AAV Variant Permits EfficientRetrograde Access to Projection Neurons.Neuron,2016.92(2):p.372-382.
22.Olanow,C.W.,et al.,Trophic factors for Parkinson's disease:To liveor let die.Mov Disord,2015.30(13):p.1715-24.
23.Tuszynski,M.H.,et al.,Nerve Growth Factor Gene Therapy:Activationof Neuronal Responses in Alzheimer Disease.JAMANeurol,2015.72(10):p.1139-47.
24.Merkel,S.F.,et al.,Trafficking of adeno-associated virus vectorsacross a model of the blood-brain barrier；a comparative study of transcytosisand transduction using primary human brain endothelial cells.J Neurochem,2017.140(2):p.216-230.
25.Foust,K.D.,et al.,Intravascular AAV9 preferentially targetsneonatal neurons and adult astrocytes.Nat Biotechnol,2009.27(1):p.59-65.26.Hanlon,K.S.,et al.,Selection of an Efficient AAV Vector for Robust CNSTransgene Expression.Mol Ther Methods Clin Dev,2019.15:p.320-332.
27.Mathiesen,S.N.,et al.,CNS Transduction Benefits of AAV-PHP.eB overAAV9 Are Dependent on Administration Route and Mouse Strain.Mol Ther MethodsClin Dev,2020.19:p.447-458.
28.Huang,Q.,et al.,Delivering genes across the blood-brain barrier:LY6A,a novel cellular receptor for AAV-PHP.B capsids.PLoS One,2019.14(11):p.e0225206.
29.Chan,K.Y.,et al.,Engineered AAVs for efficient noninvasive genedelivery to the central and peripheral nervous systems.Nat Neurosci,2017.20(8):p.1172-1179.
30.Korbelin,J.,et al.,A brain microvasculature endothelial cell-specific viral vector with the potential to treat neurovascular andneurological diseases.EMBO Mol Med,2016.8(6):p.609-25.
31.Ravindra Kumar,S.,et al.,Multiplexed Cre-dependent selectionyields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types.Nat Methods,2020.17(5):p.541-550.
32.Elmer,B.M.,et al.,Gene delivery of a modified antibody to Aβreduces progression of murine Alzheimer's disease.PLoS One,2019.14(12):p.e0226245.
33.Sudol,K.L.,et al.,Generating differentially targeted amyloid-betaspecific intrabodies as a passive vaccination strategy for Alzheimer'sdisease.Mol Ther,2009.17(12):p.2031-40.
34.Ryan,D.A.,et al.,Abeta-directed single-chain antibody delivery viaa serotype-1 AAV vector improves learning behavior and pathology inAlzheimer's disease mice.Mol Ther,2010.18(8):p.1471-81.
35.Levites,Y.,et al.,Intracranial adeno-associated virus-mediateddelivery of anti-pan amyloid beta,amyloid beta40,and amyloid beta42 single-chain variable fragments attenuates plaque pathology in amyloid precursorprotein mice.J Neurosci,2006.26(46):p.11923-8.
36.Kou,J.,et al.,Anti-Amyloid-βSingle-Chain Antibody Brain DeliveryVia AAV Reduces Amyloid Load But May Increase Cerebral Hemorrhages in anAlzheimer's Disease Mouse Model.J Alzheimers Dis,2011.27(1):p.23-38.
37.Liu,W.,et al.,Vectored Intracerebral Immunization with the Anti-Tau Monoclonal Antibody PHF1 Markedly Reduces Tau Pathology in Mutant TauTransgenic Mice.J Neurosci,2016.36(49):p.12425-12435.
38.Vitale,F.,et al.,Intramuscular injection of vectorized-scFvMC1reduces pathological tau in two different tau transgenic models.ActaNeuropathol Commun,2020.8(1):p.126.
39.Vitale,F.,et al.,Anti-tau conformational scFv MC1 antibodyefficiently reduces pathological tau species in adult JNPL3 mice.ActaNeuropathol Commun,2018.6(1):p.82.
40.Bell,R.D.and M.D.Ehlers,Breaching the blood-brain barrier for drugdelivery.Neuron,2014.81(1):p.1-3.
41.Sacramento,C.B.,et al.,Anti-Phospho-Tau Gene Therapy for ChronicTraumatic Encephalopathy.Hum Gene Ther,2020.31(1-2):p.57-69.
42.Goodwin,M.S.,et al.,Utilizing minimally purified secreted rAAV forrapid and cost-effective manipulation of gene expression in the CNS.MolNeurodegener,2020.15(1):p.15.
43.Goodwin,M.S.,et al.,Anti-tau scFvs Targeted to the Cytoplasm orSecretory Pathway Variably Modify Pathology and NeurodegenerativePhenotypes.Mol Ther,2020.
44.Pozzi,S.,et al.,Virus-mediated delivery of antibody targeting TARDNA-binding protein-43 mitigates associated neuropathology.J Clin Invest,2019.129(4):p.1581-1595.
45.Saunders,K.O.,et al.,Broadly Neutralizing Human ImmunodeficiencyVirus Type 1 Antibody Gene Transfer Protects Nonhuman Primates from MucosalSimian-Human Immunodeficiency Virus Infection.J Virol,2015.89(16):p.8334-45.
46.Ho,S.C.,et al.,IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancinggeneration of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines.JBiotechnol,2012.157(1):p.130-9.
47.Liu,Z.,et al.,Systematic comparison of 2A peptides for cloningmulti-genes in a polycistronic vector.Sci Rep,2017.7(1):p.2193.
48.Yang,S.,et al.,Development of optimal bicistronic lentiviralvectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cellrecognition.Gene Ther,2008.15(21):p.1411-23.
49.Sharma,P.,et al.,2A peptides provide distinct solutions to drivingstop-carry on translational recoding.Nucleic Acids Res,2012.40(7):p.3143-51.
50.Zhang,Y.and W.M.Pardridge,Mediated efflux of IgG molecules frombrain to blood across the blood-brain barrier.J Neuroimmunol,2001.114(1-2):p.168-72.
51.Boado,R.J.,et al.,Fusion antibody for Alzheimer's disease withbidirectional transport across the blood-brain barrier and abeta fibrildisaggregation.Bioconjug Chem,2007.18(2):p.447-55.
52.Deane,R.,et al.,IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer's amyloid beta peptide by the blood-brain barrier neonatal Fc receptor.JNeurosci,2005.25(50):p.11495-503.
53.Albright,B.H.,et al.,Mapping the Structural Determinants Requiredfor AAVrh.10 Transport across the Blood-Brain Barrier.Mol Ther,2018.26(2):p.510-523.
54.Albright,B.H.,et al.,Modulation of Sialic Acid DependenceInfluences the Central Nervous System Transduction Profile of Adeno-associated Viruses.J Virol,2019.93(11).
55.Fukuchi,K.,et al.,Anti-Abeta single-chain antibody delivery viaadeno-associated virus for treatment of Alzheimer's disease.Neurobiol Dis,2006.23(3):p.502-11.
56.Elmer,B.M.,et al.,Gene delivery of a modified antibody to Abetareduces progression of murine Alzheimer's disease.PLoS One,2019.14(12):p.e0226245.
57.Hay,C.E.,et al.,2019.
58.Johnson,P.R.,et al.,Vector-mediated gene transfer engenders long-lived neutralizing activity and protection against SIV infection inmonkeys.Nat Med,2009.15(8):p.901-6.
59.Fuchs,S.P.and R.C.Desrosiers,Promise and problems associated withthe use of recombinant AAV for the delivery of anti-HIV antibodies.Mol TherMethods Clin Dev,2016.3:p.16068.
60.Fuchs,S.P.,et al.,AAV-Delivered Antibody Mediates SignificantProtective Effects against SIVmac239 Challenge in the Absence of NeutralizingActivity.PLoS Pathog,2015.11(8):p.e1005090.
61.Martinez-Navio,J.M.,et al.,Long-Term Delivery of an Anti-SIVMonoclonal Antibody With AAV.Front Immunol,2020.11:p.449.
62.Martinez-Navio,J.M.,et al.,Adeno-Associated Virus Delivery ofAnti-HIV Monoclonal Antibodies Can Drive Long-Term VirologicSuppression.Immunity,2019.50(3):p.567-575 e5.
63.Thomas,G.,Furin at the cutting edge:from protein traffic toembryogenesis and disease.Nat Rev Mol Cell Biol,2002.3(10):p.753-66.
64.Chng,J.,et al.,Cleavage efficient 2A peptides for high levelmonoclonal antibody expression in CHO cells.MAbs,2015.7(2):p.403-12.
65.Kim,J.H.,et al.,High cleavage efficiency of a 2A peptide derivedfrom porcine teschovirus-1 in human cell lines,zebrafish and mice.PLoS One,2011.6(4):p.e18556.
66.Velychko,S.,et al.,Fusion of Reprogramming Factors Alters theTrajectory of Somatic Lineage Conversion.Cell Rep,2019.27(1):p.30-39 e4.
67.Fang,J.,et al.,Stable antibody expression at therapeutic levelsusing the 2A peptide.Nat Biotechnol,2005.23(5):p.584-90.
68.Mizuguchi,H.,et al.,IRES-dependent second gene expressionissignificantly lower than cap-dependent first gene expression inabicistronic vector.Mol Ther,2000.1(4):p.376-82.
69.Fuchs,S.P.,et al.,Recombinant AAV Vectors for Enhanced ExpressionofAuthentic IgG.PLoS One,2016.11(6):p.e0158009.
序列表
<110> AC Immune SA
<120> 抗体递送
<130> P218778WO00
<150> EP 20215823.4
<151> 2020-12-18
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 588
<212> DNA
<213> 脑心肌炎病毒
<400> 1
gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60
gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 120
ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 180
gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 240
aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 300
tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 360
acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 420
aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480
gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 540
gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg ccacaacc 588
<210> 2
<211> 4528
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠MAB2，启动子-LC-IRES-HC-WPRE
<400> 2
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc ttctagacaa ctttgtatag aaaagttgta gttattaata 180
gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact 240
tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat 300
gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta 360
tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc 420
tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg 480
ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg 540
gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct 600
ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa 660
atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt 720
ctatataagc agagctggtt tagtgaaccg tcagatccaa gtttgtacaa aaaagcaggc 780
tgccaccatg gagacagata cactgctgct gtgggtgctg ctcctctggg tgccaggatc 840
tacaggcgac atcgtgatga cccagagcca caagttcatg agcaccagcg tgggcgacag 900
agtgtccatc acatgcaagg ccagccagga cgtgaacaca gccgtggctt ggtatcagca 960
gaagcccggc cattctccta agctgctgat ctacagcgcc agcttcagat acaccggcgt 1020
gcccgataga ttcaccggca acagaagcgg caccgacttc accttcacca tcagctctgt 1080
gcaggccgag gatctggccg tgtactactg tcagcagcac tacaccacac ctccaacctt 1140
cggcggaggc accaaggtgg aaatcaagag agctgacgcc gctcctaccg tgtctatctt 1200
cccacctagc agcgagcagc tgacatctgg cggagcctct gtcgtgtgct tcctgaacaa 1260
cttctacccc aaggacatca acgtgaagtg gaagatcgac ggcagcgaga gacagaacgg 1320
cgtgctgaac tcttggaccg accaggacag caaggactcc acctacagca tgagcagcac 1380
cctgacactg accaaggacg agtacgagag acacaacagc tacacatgcg aggctaccca 1440
caagaccagc acaagcccca tcgtgaagtc cttcaacaga aacgagtgct gaacccagct 1500
ttcttgtaca aagtgggccc ctctccctcc ccccccccta acgttactgg ccgaagccgc 1560
ttggaataag gccggtgtgc gtttgtctat atgttatttt ccaccatatt gccgtctttt 1620
ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct gtcttcttga cgagcattcc taggggtctt 1680
tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg tgaaggaagc agttcctctg 1740
gaagcttctt gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt gcaggcagcg gaacccccca 1800
cctggcgaca ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat aagatacacc tgcaaaggcg 1860
gcacaacccc agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg aaagagtcaa atggctctcc 1920
tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg taccccattg tatgggatct 1980
gatctggggc ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt cgaggttaaa aaaacgtcta 2040
ggccccccga accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata atatggccac 2100
aaccatggag acagatacac tgctgctgtg ggtgctgctc ctctgggtgc caggatctac 2160
aggccaggtt cagctgcagc agtctggacc tgagctggtt aagcctggcg cctctctgaa 2220
gctgagctgt accgcttccg gcttcaacat caaggacacc tacatccact gggtcaagca 2280
gaggcctgag cagggactcg agtggatcgg cagaatctac cccaccaacg gctacaccag 2340
atacgacccc aagttccagg acaaggccac catcacagcc gacaccagca gcaacacagc 2400
ctatctccag gtgtccaggc tgaccagcga ggacacagcc gtgtactact gctctagatg 2460
gggaggcgac ggcttctacg ccatggatta ttggggacag ggcgccagcg tgacagtgtc 2520
tagtgccaag acaacagccc ctagcgtgta ccctctggct cctgtgtgtg gcgacacaac 2580
aggcagctct gtgacactgg gctgtctggt caagggctac ttccccgaac cagtgacact 2640
gacctggaac agcggctctc tgtctagcgg cgtgcacaca tttccagccg tgctgcagag 2700
cgacctgtac acactgtcct ctagcgtgac cgtgaccagc tctacatggc ccagccagag 2760
catcacctgt aacgtggccc atcctgccag cagcaccaag gtggacaaga agatcgagcc 2820
tagaggccct accatcaagc cctgtcctcc atgcaagtgc cccgctccta atctgctcgg 2880
aggcccaagc gtgttcatct tcccacctaa gatcaaggac gtgctgatga tctctctgag 2940
ccccatcgtg acctgcgtgg tggtggatgt gtctgaggac gaccctgacg tgcagatcag 3000
ttggttcgtg aacaacgtgg aagtgcacac agcccagaca cagacccaca gagaggacta 3060
caacagcacc ctgagagtgg tgtctgccct gcctatccag caccaggatt ggatgagcgg 3120
caaagaattc aagtgcaaag tgaacaacaa ggacctgcct gctcctatcg agagaaccat 3180
cagcaagccc aagggctctg tcagggctcc tcaggtgtac gttctgccac ctcctgagga 3240
agagatgacc aagaaacaag tgaccctcac ctgtatggtc accgacttca tgcccgagga 3300
catctacgtg gaatggacca acaacggcaa gaccgagctg aactacaaga acaccgagcc 3360
tgtgctggac agcgacggca gctacttcat gtacagcaag ctgcgcgtcg agaagaagaa 3420
ctgggtcgag agaaacagct acagctgctc cgtggtgcac gagggactgc acaaccacca 3480
caccaccaag agcttcagca gaacccctgg caagtgacaa ctttattata catagttgga 3540
attccgataa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact 3600
atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg 3660
cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg 3720
aggagttgtg gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa 3780
cccccactgg ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc 3840
ccctccctat tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg 3900
ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaagctgacg tcctttccat 3960
ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt 4020
cggccctcaa tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc 4080
cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgcatc 4140
gggaattcct agagctcgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt 4200
tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc 4260
ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg 4320
tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagag aatagcaggc atgctgggga 4380
gggccgcagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc 4440
actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg 4500
agcgagcgag cgcgcagctg cctgcagg 4528
<210> 3
<211> 4153
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠MAB2 - 2个启动子的IgG，由启动子1
(CMV)-LC-polyA-启动子2 (CMV)-HC-WPRE-poly A组成
<400> 3
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc ttctagacaa ctttgtatag aaaagttgta gttattaata 180
gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact 240
tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat 300
gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta 360
tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc 420
tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg 480
ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg 540
gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct 600
ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa 660
atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt 720
ctatataagc agagctggtt tagtgaaccg tcagatccaa gtttgtacaa aaaagcaggc 780
tgccaccatg gagacagata cactgctgct gtgggtgctg ctcctctggg tgccaggatc 840
tacaggcgac atcgtgatga cccagagcca caagttcatg agcaccagcg tgggcgacag 900
agtgtccatc acatgcaagg ccagccagga cgtgaacaca gccgtggctt ggtatcagca 960
gaagcccggc cattctccta agctgctgat ctacagcgcc agcttcagat acaccggcgt 1020
gcccgataga ttcaccggca acagaagcgg caccgacttc accttcacca tcagctctgt 1080
gcaggccgag gatctggccg tgtactactg tcagcagcac tacaccacac ctccaacctt 1140
cggcggaggc accaaggtgg aaatcaagag agctgacgcc gctcctaccg tgtctatctt 1200
cccacctagc agcgagcagc tgacatctgg cggagcctct gtcgtgtgct tcctgaacaa 1260
cttctacccc aaggacatca acgtgaagtg gaagatcgac ggcagcgaga gacagaacgg 1320
cgtgctgaac tcttggaccg accaggacag caaggactcc acctacagca tgagcagcac 1380
cctgacactg accaaggacg agtacgagag acacaacagc tacacatgcg aggctaccca 1440
caagaccagc acaagcccca tcgtgaagtc cttcaacaga aacgagtgct gacagacatg 1500
ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt 1560
atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa 1620
gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggaggt gtgggaggtt 1680
ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtatagtta ttaatagtaa tcaattacgg 1740
ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc 1800
cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca 1860
tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg 1920
cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg 1980
acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt 2040
ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca 2100
tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg 2160
tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact 2220
ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag 2280
ctggtttagt gaaccgtcag atcacccagc tttcttgtac aaagtgggcc accatggaga 2340
cagatacact gctgctgtgg gtgctgctcc tctgggtgcc aggatctaca ggccaggttc 2400
agctgcagca gtctggacct gagctggtta agcctggcgc ctctctgaag ctgagctgta 2460
ccgcttccgg cttcaacatc aaggacacct acatccactg ggtcaagcag aggcctgagc 2520
agggactcga gtggatcggc agaatctacc ccaccaacgg ctacaccaga tacgacccca 2580
agttccagga caaggccacc atcacagccg acaccagcag caacacagcc tatctccagg 2640
tgtccaggct gaccagcgag gacacagccg tgtactactg ctctagatgg ggaggcgacg 2700
gcttctacgc catggattat tggggacagg gcgccagcgt gacagtgtct agtgccaaga 2760
caacagcccc tagcgtgtac cctctggctc ctgtgtgtgg cgacacaaca ggcagctctg 2820
tgacactggg ctgtctggtc aagggctact tccccgaacc agtgacactg acctggaaca 2880
gcggctctct gtctagcggc gtgcacacat ttccagccgt gctgcagagc gacctgtaca 2940
cactgtcctc tagcgtgacc gtgaccagct ctacatggcc cagccagagc atcacctgta 3000
acgtggccca tcctgccagc agcaccaagg tggacaagaa gatcgagcct agaggcccta 3060
ccatcaagcc ctgtcctcca tgcaagtgcc ccgctcctaa tctgctcgga ggcccaagcg 3120
tgttcatctt cccacctaag atcaaggacg tgctgatgat ctctctgagc cccatcgtga 3180
cctgcgtggt ggtggatgtg tctgaggacg accctgacgt gcagatcagt tggttcgtga 3240
acaacgtgga agtgcacaca gcccagacac agacccacag agaggactac aacagcaccc 3300
tgagagtggt gtctgccctg cctatccagc accaggattg gatgagcggc aaagaattca 3360
agtgcaaagt gaacaacaag gacctgcctg ctcctatcga gagaaccatc agcaagccca 3420
agggctctgt cagggctcct caggtgtacg ttctgccacc tcctgaggaa gagatgacca 3480
agaaacaagt gaccctcacc tgtatggtca ccgacttcat gcccgaggac atctacgtgg 3540
aatggaccaa caacggcaag accgagctga actacaagaa caccgagcct gtgctggaca 3600
gcgacggcag ctacttcatg tacagcaagc tgcgcgtcga gaagaagaac tgggtcgaga 3660
gaaacagcta cagctgctcc gtggtgcacg agggactgca caaccaccac accaccaaga 3720
gcttcagcag aacccctggc aagtgacaac tttattatac atagttggaa ttcctagagc 3780
tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc 3840
cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga 3900
aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga 3960
cagcaagggg gaggattggg aagagaatag caggcatgct ggggagggcc gcaggaaccc 4020
ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga 4080
ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 4140
agctgcctgc agg 4153
<210> 4
<211> 4483
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠MAB1，启动子-LC-较短的IRES-HC-WPRE
<400> 4
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc ttctagacaa ctttgtatag aaaagttgta gttattaata 180
gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact 240
tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat 300
gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta 360
tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc 420
tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg 480
ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg 540
gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct 600
ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa 660
atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt 720
ctatataagc agagctggtt tagtgaaccg tcagatccaa gtttgtacaa aaaagcaggc 780
tgccaccatg gagacagata cactgctgct gtgggtgctg ctcctctggg tgccaggatc 840
tacaggcgac gtggtcatga cacagacccc tctgacactg agcgtgacca tcggacagcc 900
tgccagcatc agctgcaaga gcagtcagag cctgctgcac agcgacggca agacctacct 960
gaactggctg ctgcaaagac ccggccagtc tcctaagagg ctgatctacc tggtgtccaa 1020
gctggacagc agaatccccg acagattcac aggcagcggc tctggcacag acttcaccct 1080
gaagatcagc agagtggaag ccgaggacct gggcgtgtac tactgttggc agggcacaca 1140
cttccctcac acattcggcg ctggcacaaa gctggaactg aagagagctg acgccgctcc 1200
taccgtgtct atcttcccac ctagcagcga gcagctgaca tctggcggag cctctgtcgt 1260
gtgcttcctg aacaacttct accccaagga catcaacgtg aagtggaaga tcgacggcag 1320
cgagagacag aacggcgtgc tgaactcttg gaccgaccag gacagcaagg actccaccta 1380
cagcatgagc agcaccctga cactgaccaa ggacgagtac gagagacaca acagctacac 1440
atgcgaggct acccacaaga ccagcacaag ccccatcgtg aagtccttca acagaaacga 1500
gtgctgagcc cctctccctc ccccccccct aacgttactg gccgaagccg cttggaataa 1560
ggccggtgtg cgtttgtcta tatgttattt tccaccatat tgccgtcttt tggcaatgtg 1620
agggcccgga aacctggccc tgtcttcttg acgagcattc ctaggggtct ttcccctctc 1680
gccaaaggaa tgcaaggtct gttgaatgtc gtgaaggaag cagttcctct ggaagcttct 1740
tgaagacaaa caacgtctgt agcgaccctt tgcaggcagc ggaacccccc acctggcgac 1800
aggtgcctct gcggccaaaa gccacgtgta taagatacac ctgcaaaggc ggcacaaccc 1860
cagtgccacg ttgtgagttg gatagttgtg gaaagagtca aatggctctc ctcaagcgta 1920
ttcaacaagg ggctgaagga tgcccagaag gtaccccatt gtatgggatc tgatctgggg 1980
cctcggtgca catgctttac atgtgtttag tcgaggttaa aaaaacgtct aggccccccg 2040
aaccacgggg acgtggtttt cctttgaaaa acacgatgat aatatggaga cagatacact 2100
gctgctgtgg gtgctgctcc tctgggtgcc aggatctaca ggcgaggttc agctgcagca 2160
gtctggacct gagctggtta agcctggcgc ctccgtgaag atcagctgca agacaagcgg 2220
cttcaccttc accgagtaca gcatgcactg ggtcaagcag agccacggca agagcctgga 2280
atggatcggc ggcatcaacc ctaacaacgg cggcaccagc tacaaccaga agttcaaggg 2340
caaagccaca ctgaccgtgg acaagagcag cagcaccgcc tacatggaac tgagaagcct 2400
gaccagcgag gacagcgccg tgtactactg tgccagagag tcttggggcc agggcacaac 2460
cctgacagtc tcttctgcca agacaacagc ccctagcgtg taccctctgg ctcctgtgtg 2520
tggcgacaca acaggcagct ctgtgacact gggctgtctg gtcaagggct acttccccga 2580
accagtgaca ctgacctgga acagcggctc tctgtctagc ggcgtgcaca catttccagc 2640
cgtgctgcag agcgacctgt acacactgtc ctctagcgtg accgtgacca gctctacatg 2700
gcccagccag agcatcacct gtaacgtggc ccatcctgcc agcagcacca aggtggacaa 2760
gaagatcgag cctagaggcc ctaccatcaa gccctgtcct ccatgcaagt gccccgctcc 2820
taatctgctc ggaggcccaa gcgtgttcat cttcccacct aagatcaagg acgtgctgat 2880
gatctctctg agccccatcg tgacctgcgt ggtggtggat gtgtctgagg acgaccctga 2940
cgtgcagatc agttggttcg tgaacaacgt ggaagtgcac acagcccaga cacagaccca 3000
cagagaggac tacaacagca ccctgagagt ggtgtctgcc ctgcctatcc agcaccagga 3060
ttggatgagc ggcaaagaat tcaagtgcaa agtgaacaac aaggacctgc ctgctcctat 3120
cgagagaacc atcagcaagc ccaagggctc tgtcagggct cctcaggtgt acgttctgcc 3180
acctcctgag gaagagatga ccaagaaaca agtgaccctc acctgtatgg tcaccgactt 3240
catgcccgag gacatctacg tggaatggac caacaacggc aagaccgagc tgaactacaa 3300
gaacaccgag cctgtgctgg acagcgacgg cagctacttc atgtacagca agctgcgcgt 3360
cgagaagaag aactgggtcg agagaaacag ctacagctgc tccgtggtgc acgagggact 3420
gcacaaccac cacaccacca agagcttcag cagaacccct ggcaagtgaa cccagctttc 3480
ttgtacaaag tgggaattcc gataatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga 3540
ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt 3600
tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt 3660
tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg 3720
tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg 3780
ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc 3840
gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaagc 3900
tgacgtcctt tccatggctg ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct 3960
tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg 4020
ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc tccctttggg 4080
ccgcctcccc gcatcgggaa ttcctagagc tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag 4140
ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac 4200
tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca 4260
ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagagaatag 4320
caggcatgct ggggagggcc gcaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg 4380
cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc 4440
cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc agg 4483
<210> 5
<211> 4516
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MAB1启动子-LC-IRES-HC-WPRE-PolyA
<400> 5
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc ttctagacaa ctttgtatag aaaagttgta gttattaata 180
gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact 240
tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat 300
gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta 360
tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc 420
tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg 480
ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg 540
gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct 600
ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa 660
atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt 720
ctatataagc agagctggtt tagtgaaccg tcagatccaa gtttgtacaa aaaagcaggc 780
tgccaccatg gagacagata cactgctgct gtgggtgctg ctcctctggg tgccaggatc 840
tacaggcgac gtggtcatga cacagacccc tctgacactg tccgtgacca tcggacagcc 900
tgcctccatc tcctgcaagt cctctcagtc cctgctgcac tctgacggca agacctacct 960
gaactggctg ctgcagaggc ctggccagag tcctaagaga ctgatctacc tggtgtccaa 1020
gctggactct cggatccctg acagattcac cggctctggc tctggcaccg acttcaccct 1080
gaagatctcc agagtggaag ccgaggacct gggcgtgtac tactgttggc agggcaccca 1140
ctttccacac acctttggcg ctggcacaaa gctggaactg aagcggacag tggccgctcc 1200
ttccgtgttc atcttcccac cttccgacga gcagctgaag tccggcacag cttctgtcgt 1260
gtgcctgctg aacaacttct accctcggga agccaaggtg cagtggaagg tggacaatgc 1320
cctgcagtcc ggcaactccc aagagtctgt gaccgagcag gactccaagg acagcaccta 1380
cagcctgtcc tccacactga ccctgtccaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc 1440
ctgcgaagtg acccatcagg gcctgtctag ccctgtgacc aagtctttca accggggcga 1500
gtgttgaacc cagctttctt gtacaaagtg ggcccctctc cctccccccc ccctaacgtt 1560
actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc 1620
atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc 1680
attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag 1740
gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg 1800
cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat 1860
acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga 1920
gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc 1980
cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg 2040
ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga 2100
tgataatatg gccacaacca tggagacaga tacactgctg ctgtgggtgc tgctcctctg 2160
ggtgccagga tctacaggcg aggttcagct gcagcagtct ggacctgagc tggttaagcc 2220
tggcgcctcc gtgaagatct cctgcaagac ctctggcttc accttcaccg agtactccat 2280
gcactgggtc aagcagtccc acggcaagtc cctggaatgg atcggcggca tcaaccctaa 2340
caacggcggc acctcctaca accagaagtt caagggcaaa gctaccctga ccgtggacaa 2400
gtcctcctcc accgcctaca tggaactgcg gtccctgacc tctgaggact ccgccgtgta 2460
ctactgcgct agagagtctt ggggccaggg caccacactg acagtctctt ctgcttctac 2520
caagggaccc agcgtgttcc ctctggctcc ttccagcaag tctacctctg gcggaacagc 2580
tgctctgggc tgcctggtca aggactactt tcctgagcct gtgaccgtgt cttggaactc 2640
tggcgctctg acatccggcg tgcacacctt tccagctgtg ctgcaatcca gcggcctgta 2700
ctctctgtcc tccgtcgtga ccgtgccttc tagctctctg ggcacacaga cctacatctg 2760
caatgtgaac cacaagcctt ccaacaccaa ggtggacaag aaggtggaac ccaagtcctg 2820
cgacaagacc cacacctgtc ctccatgtcc tgctccagaa ctgctcggcg gaccttccgt 2880
gttcctgttt cctccaaagc ctaaggacac cctgatgatc tctcggaccc ctgaagtgac 2940
ctgcgtggtg gtggatgtgt ctcacgagga tcccgaagtg aagttcaatt ggtacgtgga 3000
cggcgtggaa gtgcacaacg ccaagaccaa gcctagagag gaacagtaca actccaccta 3060
cagagtggtg tccgtgctga ccgtgctgca ccaggattgg ctgaacggca aagagtacaa 3120
gtgcaaggtg tccaacaagg ccctgcctgc tcctatcgaa aagaccatct ccaaggccaa 3180
gggccagcct agggaacccc aggtttacac cttgcctcca tctcgggaag agatgaccaa 3240
gaaccaggtg tccctgacct gtctcgtgaa gggcttctac ccctccgata tcgccgtgga 3300
atgggagtct aatggccagc ctgagaacaa ctacaagaca acccctcctg tgctggactc 3360
cgacggctca ttcttcctgt actccaagct gacagtggac aagtccagat ggcagcaggg 3420
caacgtgttc tcctgctccg tgatgcacga ggccctgcac aatcactaca cccagaagtc 3480
cctgtctctg agccccggca agtagcaact ttattataca tagttggaat tccgataatc 3540
aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat gttgctcctt 3600
ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg 3660
ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag gagttgtggc 3720
ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc cccactggtt 3780
ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc ctccctattg 3840
ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct cggctgttgg 3900
gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga agctgacgtc ctttccatgg ctgctcgcct 3960
gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg gccctcaatc 4020
cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg cgtcttcgcc 4080
ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgcatcgg gaattcctag 4140
agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc 4200
ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga 4260
ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca 4320
ggacagcaag ggggaggatt gggaagagaa tagcaggcat gctggggagg gccgcaggaa 4380
cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg 4440
cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg 4500
cgcagctgcc tgcagg 4516
<210> 6
<211> 4141
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MAB1 - 2个启动子的IgG，由启动子1
(CMV)-LC-polyA-启动子2(CMV)-HC-WPRE-poly A组成
<400> 6
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc ttctagacaa ctttgtatag aaaagttgta gttattaata 180
gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact 240
tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat 300
gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta 360
tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc 420
tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg 480
ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg 540
gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct 600
ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa 660
atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt 720
ctatataagc agagctggtt tagtgaaccg tcagatccaa gtttgtacaa aaaagcaggc 780
tgccaccatg gagacagata cactgctgct gtgggtgctg ctcctctggg tgccaggatc 840
tacaggcgac gtggtcatga cacagacccc tctgacactg tccgtgacca tcggacagcc 900
tgcctccatc tcctgcaagt cctctcagtc cctgctgcac tctgacggca agacctacct 960
gaactggctg ctgcagaggc ctggccagag tcctaagaga ctgatctacc tggtgtccaa 1020
gctggactct cggatccctg acagattcac cggctctggc tctggcaccg acttcaccct 1080
gaagatctcc agagtggaag ccgaggacct gggcgtgtac tactgttggc agggcaccca 1140
ctttccacac acctttggcg ctggcacaaa gctggaactg aagcggacag tggccgctcc 1200
ttccgtgttc atcttcccac cttccgacga gcagctgaag tccggcacag cttctgtcgt 1260
gtgcctgctg aacaacttct accctcggga agccaaggtg cagtggaagg tggacaatgc 1320
cctgcagtcc ggcaactccc aagagtctgt gaccgagcag gactccaagg acagcaccta 1380
cagcctgtcc tccacactga ccctgtccaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc 1440
ctgcgaagtg acccatcagg gcctgtctag ccctgtgacc aagtctttca accggggcga 1500
gtgttgacag acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag 1560
tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt aaccattata 1620
agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg 1680
gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtat agttattaat 1740
agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 1800
ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 1860
tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 1920
atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 1980
ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 2040
gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 2100
ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc 2160
tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa 2220
aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg 2280
tctatataag cagagctggt ttagtgaacc gtcagatcac ccagctttct tgtacaaagt 2340
gggccaccat ggagacagat acactgctgc tgtgggtgct gctcctctgg gtgccaggat 2400
ctacaggcga ggttcagctg cagcagtctg gacctgagct ggttaagcct ggcgcctccg 2460
tgaagatctc ctgcaagacc tctggcttca ccttcaccga gtactccatg cactgggtca 2520
agcagtccca cggcaagtcc ctggaatgga tcggcggcat caaccctaac aacggcggca 2580
cctcctacaa ccagaagttc aagggcaaag ctaccctgac cgtggacaag tcctcctcca 2640
ccgcctacat ggaactgcgg tccctgacct ctgaggactc cgccgtgtac tactgcgcta 2700
gagagtcttg gggccagggc accacactga cagtctcttc tgcttctacc aagggaccca 2760
gcgtgttccc tctggctcct tccagcaagt ctacctctgg cggaacagct gctctgggct 2820
gcctggtcaa ggactacttt cctgagcctg tgaccgtgtc ttggaactct ggcgctctga 2880
catccggcgt gcacaccttt ccagctgtgc tgcaatccag cggcctgtac tctctgtcct 2940
ccgtcgtgac cgtgccttct agctctctgg gcacacagac ctacatctgc aatgtgaacc 3000
acaagccttc caacaccaag gtggacaaga aggtggaacc caagtcctgc gacaagaccc 3060
acacctgtcc tccatgtcct gctccagaac tgctcggcgg accttccgtg ttcctgtttc 3120
ctccaaagcc taaggacacc ctgatgatct ctcggacccc tgaagtgacc tgcgtggtgg 3180
tggatgtgtc tcacgaggat cccgaagtga agttcaattg gtacgtggac ggcgtggaag 3240
tgcacaacgc caagaccaag cctagagagg aacagtacaa ctccacctac agagtggtgt 3300
ccgtgctgac cgtgctgcac caggattggc tgaacggcaa agagtacaag tgcaaggtgt 3360
ccaacaaggc cctgcctgct cctatcgaaa agaccatctc caaggccaag ggccagccta 3420
gggaacccca ggtttacacc ttgcctccat ctcgggaaga gatgaccaag aaccaggtgt 3480
ccctgacctg tctcgtgaag ggcttctacc cctccgatat cgccgtggaa tgggagtcta 3540
atggccagcc tgagaacaac tacaagacaa cccctcctgt gctggactcc gacggctcat 3600
tcttcctgta ctccaagctg acagtggaca agtccagatg gcagcagggc aacgtgttct 3660
cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca atcactacac ccagaagtcc ctgtctctga 3720
gccccggcaa gtagcaactt tattatacat agttggaatt cctagagctc gctgatcagc 3780
ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 3840
gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 3900
ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 3960
ggattgggaa gagaatagca ggcatgctgg ggagggccgc aggaacccct agtgatggag 4020
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 4080
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ctgcctgcag 4140
g 4141
<210> 7
<211> 3274
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MAB1，启动子-scFv-Fc-WPRE
<400> 7
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc ttctagacaa ctttgtatag aaaagttgta gttattaata 180
gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact 240
tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat 300
gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta 360
tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc 420
tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg 480
ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg 540
gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct 600
ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa 660
atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt 720
ctatataagc agagctggtt tagtgaaccg tcagatccaa gtttgtacaa aaaagcaggc 780
tgccaccatg gagacagata cactgctgct gtgggtgctg ctcctctggg tgccaggatc 840
tacaggcgag gttcagctgc agcagtctgg acctgagctg gttaagcctg gcgcctccgt 900
gaagatctcc tgcaagacct ctggcttcac cttcaccgag tactccatgc actgggtcaa 960
gcagtcccac ggcaagtccc tggaatggat cggcggcatc aaccctaaca acggcggcac 1020
ctcctacaac cagaagttca agggcaaagc taccctgacc gtggacaagt cctcctccac 1080
cgcctacatg gaactgcggt ccctgacctc tgaggactcc gccgtgtact actgcgctag 1140
agagtcttgg ggccagggca ccacactgac agtctcttct ggaggcggag gatctggcgg 1200
aggtggaagt ggcggaggcg gatctgacgt ggtcatgaca cagacccctc tgacactgtc 1260
cgtgaccatc ggacagcctg cctccatctc ctgcaagtcc tctcagtccc tgctgcactc 1320
tgacggcaag acctacctga actggctgct gcagaggcct ggccagagtc ctaagagact 1380
gatctacctg gtgtccaagc tggactctcg gatccctgac agattcaccg gctctggctc 1440
tggcaccgac ttcaccctga agatctccag agtggaagcc gaggacctgg gcgtgtacta 1500
ctgttggcag ggcacccact ttccacacac ctttggcgct ggcacaaagc tggaactgaa 1560
gggaggcgga ggatctgaca agacccacac ctgtcctcca tgtcctgctc cagaactgct 1620
cggcggacct tccgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag gacaccctga tgatctctcg 1680
gacccctgaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcac gaggatcccg aagtgaagtt 1740
caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccta gagaggaaca 1800
gtacaactcc acctacagag tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg attggctgaa 1860
cggcaaagag tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg cctgctccta tcgaaaagac 1920
catctccaag gccaagggcc agcctaggga accccaggtt tacaccttgc ctccatctcg 1980
ggaagagatg accaagaacc aggtgtccct gacctgtctc gtgaagggct tctacccctc 2040
cgatatcgcc gtggaatggg agtctaatgg ccagcctgag aacaactaca agacaacccc 2100
tcctgtgctg gactccgacg gctcattctt cctgtactcc aagctgacag tggacaagtc 2160
cagatggcag cagggcaacg tgttctcctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaatca 2220
ctacacccag aagtccctgt ctctgagccc cggcaagtag acccagcttt cttgtacaaa 2280
gtgggaattc cgataatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc 2340
ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg 2400
ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc 2460
tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg 2520
acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg 2580
ctttccccct ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga 2640
caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaag ctgacgtcct 2700
ttccatggct gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg 2760
tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc 2820
ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc 2880
cgcatcggga attcctagag ctcgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc 2940
atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt 3000
cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct 3060
ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagagaata gcaggcatgc 3120
tggggagggc cgcaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc 3180
tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc 3240
tcagtgagcg agcgagcgcg cagctgcctg cagg 3274
<210> 8
<211> 576
<212> DNA
<213> 脑心肌炎病毒
<400> 8
gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60
gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 120
ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 180
gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 240
aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 300
tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 360
acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 420
aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480
gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 540
gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataat 576
<210> 9
<211> 3859
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MAB1 FAB启动子-LC-IRES-HC-WPRE-PolyA
<400> 9
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc ttctagacaa ctttgtatag aaaagttgta gttattaata 180
gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact 240
tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat 300
gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta 360
tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc 420
tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg 480
ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg 540
gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct 600
ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa 660
atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt 720
ctatataagc agagctggtt tagtgaaccg tcagatccaa gtttgtacaa aaaagcaggc 780
tgccaccatg gagacagata cactgctgct gtgggtgctg ctcctctggg tgccaggatc 840
tacaggcgac gtggtcatga cacagacccc tctgacactg tccgtgacca tcggacagcc 900
tgcctccatc tcctgcaagt cctctcagtc cctgctgcac tctgacggca agacctacct 960
gaactggctg ctgcagaggc ctggccagag tcctaagaga ctgatctacc tggtgtccaa 1020
gctggactct cggatccctg acagattcac cggctctggc tctggcaccg acttcaccct 1080
gaagatctcc agagtggaag ccgaggacct gggcgtgtac tactgttggc agggcaccca 1140
ctttccacac acctttggcg ctggcacaaa gctggaactg aagcggacag tggccgctcc 1200
ttccgtgttc atcttcccac cttccgacga gcagctgaag tccggcacag cttctgtcgt 1260
gtgcctgctg aacaacttct accctcggga agccaaggtg cagtggaagg tggacaatgc 1320
cctgcagtcc ggcaactccc aagagtctgt gaccgagcag gactccaagg acagcaccta 1380
cagcctgtcc tccacactga ccctgtccaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc 1440
ctgcgaagtg acccatcagg gcctgtctag ccctgtgacc aagtctttca accggggcga 1500
gtgttgaacc cagctttctt gtacaaagtg ggcccctctc cctccccccc ccctaacgtt 1560
actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc 1620
atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc 1680
attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag 1740
gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg 1800
cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat 1860
acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga 1920
gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc 1980
cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg 2040
ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga 2100
tgataatatg gccacaacca tggagacaga tacactgctg ctgtgggtgc tgctcctctg 2160
ggtgccagga tctacaggcg aggttcagct gcagcagtct ggacctgagc tggttaagcc 2220
tggcgcctcc gtgaagatct cctgcaagac ctctggcttc accttcaccg agtactccat 2280
gcactgggtc aagcagtccc acggcaagtc cctggaatgg atcggcggca tcaaccctaa 2340
caacggcggc acctcctaca accagaagtt caagggcaaa gctaccctga ccgtggacaa 2400
gtcctcctcc accgcctaca tggaactgcg gtccctgacc tctgaggact ccgccgtgta 2460
ctactgcgct agagagtctt ggggccaggg caccacactg acagtctctt ctgcttctac 2520
caagggaccc agcgtgttcc ctctggctcc ttccagcaag tctacctctg gcggaacagc 2580
tgctctgggc tgcctggtca aggactactt tcctgagcct gtgaccgtgt cttggaactc 2640
tggcgctctg acatccggcg tgcacacctt tccagctgtg ctgcaatcca gcggcctgta 2700
ctctctgtcc tccgtcgtga ccgtgccttc tagctctctg ggcacacaga cctacatctg 2760
caatgtgaac cacaagcctt ccaacaccaa ggtggacaag aaggtggaac ccaagtcctg 2820
cggctcccac caccatcacc atcattagca actttattat acatagttgg aattccgata 2880
atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc 2940
cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta 3000
tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt 3060
ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg 3120
gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta 3180
ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt 3240
tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaagctgac gtcctttcca tggctgctcg 3300
cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca 3360
atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc 3420
gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgcat cgggaattcc 3480
tagagctcgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc 3540
ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa 3600
tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg 3660
gcaggacagc aagggggagg attgggaaga gaatagcagg catgctgggg agggccgcag 3720
gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc 3780
gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga 3840
gcgcgcagct gcctgcagg 3859
<210> 10
<211> 4088
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MAB1 Fab - 2个启动子的IgG，由启动子1
(CMV)-HC-polyA-启动子2(CMV)-LC-WPRE-poly A组成
<400> 10
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc ttctagacaa ctttgtatag aaaagttgta gttattaata 180
gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact 240
tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat 300
gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta 360
tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc 420
tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg 480
ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg 540
gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct 600
ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa 660
atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt 720
ctatataagc agagctggtt tagtgaaccg tcagatccaa gtttgtacaa aaaagcaggc 780
tgccaccatg gagacagata cactgctgct gtgggtgctg ctcctctggg tgccaggatc 840
tacaggcgag gttcagctgc agcagtctgg acctgagctg gttaagcctg gcgcctccgt 900
gaagatctcc tgcaagacct ctggcttcac cttcaccgag tactccatgc actgggtcaa 960
gcagtcccac ggcaagtccc tggaatggat cggcggcatc aaccctaaca acggcggcac 1020
ctcctacaac cagaagttca agggcaaagc taccctgacc gtggacaagt cctcctccac 1080
cgcctacatg gaactgcggt ccctgacctc tgaggactcc gccgtgtact actgcgctag 1140
agagtcttgg ggccagggca ccacactgac agtctcttct gcttctacca agggacccag 1200
cgtgttccct ctggctcctt ccagcaagtc tacctctggc ggaacagctg ctctgggctg 1260
cctggtcaag gactactttc ctgagcctgt gaccgtgtct tggaactctg gcgctctgac 1320
atccggcgtg cacacctttc cagctgtgct gcaatccagc ggcctgtact ctctgtcctc 1380
cgtcgtgacc gtgccttcta gctctctggg cacacagacc tacatctgca atgtgaacca 1440
caagccttcc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc aagtcctgcg gctcccacca 1500
ccatcaccat cattagcaga catgataaga tacattgatg agtttggaca aaccacaact 1560
agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta 1620
accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag 1680
gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa agcaagtaaa acctctacaa atgtggtata 1740
gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg 1800
ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga 1860
cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat 1920
gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa 1980
gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca 2040
tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca 2100
tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat 2160
ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg 2220
actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac 2280
ggtgggaggt ctatataagc agagctggtt tagtgaaccg tcagatcacc cagctttctt 2340
gtacaaagtg ggccaccatg gagacagata cactgctgct gtgggtgctg ctcctctggg 2400
tgccaggatc tacaggcgac gtggtcatga cacagacccc tctgacactg tccgtgacca 2460
tcggacagcc tgcctccatc tcctgcaagt cctctcagtc cctgctgcac tctgacggca 2520
agacctacct gaactggctg ctgcagaggc ctggccagag tcctaagaga ctgatctacc 2580
tggtgtccaa gctggactct cggatccctg acagattcac cggctctggc tctggcaccg 2640
acttcaccct gaagatctcc agagtggaag ccgaggacct gggcgtgtac tactgttggc 2700
agggcaccca ctttccacac acctttggcg ctggcacaaa gctggaactg aagcggacag 2760
tggccgctcc ttccgtgttc atcttcccac cttccgacga gcagctgaag tccggcacag 2820
cttctgtcgt gtgcctgctg aacaacttct accctcggga agccaaggtg cagtggaagg 2880
tggacaatgc cctgcagtcc ggcaactccc aagagtctgt gaccgagcag gactccaagg 2940
acagcaccta cagcctgtcc tccacactga ccctgtccaa ggccgactac gagaagcaca 3000
aggtgtacgc ctgcgaagtg acccatcagg gcctgtctag ccctgtgacc aagtctttca 3060
accggggcga gtgttgacaa ctttattata catagttgga attccgataa tcaacctctg 3120
gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta 3180
tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt 3240
ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc 3300
aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt 3360
gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg 3420
gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac 3480
aattccgtgg tgttgtcggg gaagctgacg tcctttccat ggctgctcgc ctgtgttgcc 3540
acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac 3600
cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct 3660
cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgcatc gggaattcct agagctcgct 3720
gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc 3780
cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg 3840
catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca 3900
agggggagga ttgggaagag aatagcaggc atgctgggga gggccgcagg aacccctagt 3960
gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa 4020
ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagctg 4080
cctgcagg 4088
<210> 11
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 预期的LC C端序列
<400> 11
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
1 5 10 15
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
20
<210> 12
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分析的LC C端序列
<400> 12
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
1 5 10 15
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly
20 25 30
Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
35 40 45
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu
50 55 60
<210> 13
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 预期的HC C端序列
<400> 13
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
1 5 10 15
Ser Pro Gly Lys
20
<210> 14
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分析的HC C端序列
<400> 14
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
1 5 10 15
Ser Pro Gly Lys Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Ala Pro Val Lys
20 25 30
Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
35 40 45
Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu
50 55
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BBB靶向肽
<400> 15
Asn Arg Gly Thr Glu Trp Asp
1 5
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 自切割肽的核心序列基序是2A肽家族
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 16
Asp Xaa Glu Xaa Asn Pro Gly Pro
1 5

Claims (62)

1.包含编码抗体或抗体片段的多核苷酸的载体，所述抗体或抗体片段用于在对象中治疗中枢神经系统(CNS)的疾病或病症的方法，其中所述载体转导或转染血脑屏障(BBB)之细胞并且经转导或经转染的BBB细胞表达所述抗体或抗体片段，导致将所述抗体或抗体片段递送到CNS中。
2.根据权利要求1所述应用的载体，其中所述抗体或抗体片段被递送到脑实质中，任选地其中所述抗体或抗体片段被分泌到脑实质中。
3.根据权利要求1或权利要求2所述应用的载体，其中所述载体转导或转染BBB之内皮细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项所述应用的载体，其中所述载体转导或转染BBB之周细胞或星形胶质细胞。
5.根据前述权利要求中任一项所述应用的载体，其中所述载体包括野生型病毒载体或经改造的病毒载体。
6.根据前述权利要求中任一项所述应用的载体，其中所述载体包括亲神经载体。
7.根据前述权利要求中任一项所述应用的载体，其中所述载体在所述载体表面上表达将所述载体靶向至BBB之细胞的肽、小分子、抗体或其抗体片段、蛋白质、纳米颗粒、脂质、寡核苷酸、适配体或阳离子分子。
8.根据前述权利要求中任一项所述应用的载体，其中所述载体包含所述载体表面上的将所述载体靶向至BBB之细胞的修饰。
9.根据前述权利要求中任一项所述应用的载体，其中所述载体包含有机纳米材料、无机纳米材料，所述有机纳米材料例如脂质体、外排体、树枝状聚合物、胶束，所述无机纳米材料例如金纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒或碳纳米管。
10.根据前述权利要求中任一项所述应用的载体，其中所述载体选自：腺相关病毒(AAV)、腺病毒、逆转录病毒、鼻病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒(HSV)或任何病毒样颗粒。
11.根据前述权利要求中任一项所述应用的载体，其中所述载体是选自以下的AAV：AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)和AAV血清型10(AAV10)。
12.根据前述权利要求中任一项所述应用的载体，其中所述载体是经改造的AAV载体，其中任选地
(i)所述经改造的AAV载体是经改造的AAV2载体，优选AAV-BR1；或者
(ii)所述经改造的AAV载体是经改造的AAV9载体，例如AAV-S、AAV-F、AAV-PHP.eB、AAV9-PHP-V1；或者
(iii)所述经改造的AAV载体是经改造的AAV1载体，例如AAV1RX、AAV1R6或AAV1R7，或者
(iv)所述经改造的AAV载体是经改造的AAV10载体。
13.根据前述权利要求中任一项所述应用的载体，其中所述载体是AAV-BR1或AAV9-PHP-V1。
14.根据前述权利要求中任一项所述应用的载体，其中所述CNS的疾病或病症选自：淀粉样蛋白β蛋白相关疾病、TDP-43-蛋白质病、α-突触核蛋白病、Tau蛋白病、包括多聚谷氨酰胺疾病例如亨廷顿病的三核苷酸重复疾病、脑相关癌症和肿瘤、癫痫、精神疾病、神经炎性疾病、神经肌肉疾病、病毒诱发的脑炎和以小胶质细胞功能障碍为特征的疾病。
15.根据前述权利要求中任一项所述应用的载体，其中所述CNS的疾病或病症选自：额颞痴呆(FTD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、慢性创伤性脑病(CTE)、边缘主导年龄相关性TDP-43脑病(LATE)和多发性硬化。
16.根据前述权利要求中任一项所述应用的载体，其中所述抗体或抗体片段选自：抗ErbB2、抗TDP-43(NI-205)、抗Aβ(例如巴品珠单抗、索拉珠单抗、lecanemab、阿杜卡尼单抗、多奈单抗、更汀芦单抗或克瑞组单抗)、抗ApoE4(载脂蛋白E4)和抗DDX3X(ATP依赖性RNA解旋酶)、抗Tau(替拉奈单抗、gosuranemab、泽格特奈单抗、西瑞奈单抗、bepranemab、BIIB076、JNJ-63733657、Lu AF87908、PNT001、E-2814)、抗LINGO-1(例如奥匹努单抗)、抗α-突触核蛋白(辛帕奈单抗、prasinezumab、MEDI-1341、Lu AF82422、BAN0805)、抗ASC(IC-100)、抗NLRP3、抗C5(ravulizumab、依库珠单抗)、抗C1q(ANX-005)、抗C3、抗亨廷顿蛋白(C-617、NI-302)、抗朊病毒、抗CD20(例如奥法木单抗、奥美珠单抗、利妥昔单抗、BCD-132、乌妥昔单抗、BAT-4406F、AL-014)、抗PD-1(IBC-Ab002)或抗VEGF-A(贝伐单抗、雷珠单抗、布洛赛珠单抗、faricimab、伐努赛珠单抗)的抗体或抗体片段。
17.根据前述权利要求中任一项所述应用的载体，其中所述载体肠胃外施用于所述对象。
18.根据权利要求17所述应用的载体，其中所述载体通过静脉内注射或静脉内输注施用于所述对象。
19.根据前述权利要求中任一项所述应用的载体，其中所述多核苷酸包含选自以下的至少一个启动子：巨细胞病毒(CMV)启动子；EF1A(人真核翻译延伸因子1α1)；CAG(与经修饰的鸡β-肌动蛋白启动子融合的CMV早期增强子)；CBh(与经修饰的鸡β-肌动蛋白启动子融合的CMV早期增强子)；SV40(猿猴病毒40增强子/早期启动子)；GFAP(人胶质原纤维酸性蛋白启动子)；ATP1A2_1(Na、K ATP酶α2)；CLDN_5(密封蛋白5)；ADRB2_1(肾上腺素受体β2)；TNFRSF6B_1(TNF受体超家族成员6b)；PDYN_1(强啡肽原)；GH1_1(人生长激素)；OPALIN_1(Opalin)；SYN1_1(突触蛋白1)；CAMK2A_1(钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα)；NEFH_1(神经丝重多肽)；NEUROD6_1(神经元分化因子6)；或OLIG2_1(少突胶质细胞转录因子2)；与GFAP、ATP1A2_1、CLDN_5、ADRB2_1、TNFRSF6B_1、PDYN_1、GH1_1.OPALIN_1、SYN1_1、CAMK2A_1、NEFH_1、NEUROD6_1或OLIG2_1启动子融合的CMV早期增强子；所述至少一个启动子优选巨细胞病毒(CMV)启动子或CBh启动子，并且其中所述至少一个启动子与编码抗体或抗体片段的序列可操作地连接。
20.根据权利要求19所述应用的载体，其中所述至少一个启动子选自：ATP1A2_1(Na、KATP酶α2)、CLDN_5(密封蛋白5)、ADRB2_1(肾上腺素受体β2)和TNFRSF6B_1(TNF受体超家族成员6b)，任选地其中所述至少一个启动子与增强子可操作地连接，所述增强子例如CMV早期增强子。
21.用于将抗体或抗体片段递送至对象中的BBB的方法，所述方法包括向所述对象施用包含编码所述抗体或抗体片段的多核苷酸的载体，其中所述方法导致转导或转染BBB之细胞并且经转导或经转染的细胞表达所述抗体或抗体片段。
22.用于将抗体或抗体片段递送至对象中的CNS的方法，所述方法包括向所述对象施用包含编码所述抗体或抗体片段的多核苷酸的载体，其中所述方法导致转导或转染BBB之细胞并且经转导或经转染的细胞表达所述抗体或抗体片段，导致将所述抗体或抗体片段递送到CNS中。
23.用于在对象中治疗CNS的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述对象施用包含编码抗体或抗体片段的多核苷酸的载体，其中所述方法导致转导或转染BBB之细胞并且经转导或经转染的细胞表达所述抗体或抗体片段，导致将所述抗体或抗体片段递送到CNS中。
24.包含编码抗体或抗体片段的多核苷酸的载体用于制造用于在对象中治疗CNS的疾病或病症的药物的用途，其中所述载体转导或转染血脑屏障(BBB)之细胞并且经转导或经转染的细胞表达所述抗体或抗体片段，导致将所述抗体或抗体片段递送到CNS中。
25.包含编码抗体或抗体片段的多核苷酸的载体用于将编码所述抗体或抗体片段的多核苷酸递送至对象的BBB的用途，其中所述载体转导或转染血脑屏障(BBB)之细胞并且经转导或经转染的细胞表达所述抗体或抗体片段，导致将所述抗体或抗体片段递送到CNS中。
26.根据权利要求21至25中任一项所述的方法或用途，其还根据权利要求2至20中任一项所述的特征来限定。
27.包含表达盒的载体，所述表达盒从5’到3’包含：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因和编码所述抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子，所述抗体或抗体片段用于在对象中治疗中枢神经系统(CNS)的疾病或病症的方法，其中所述载体转导或转染血脑屏障(BBB)之细胞或CNS之细胞并且经转导或经转染的细胞表达所述抗体或抗体片段，导致将所述抗体或抗体片段递送到CNS中。
28.包含表达盒的载体，所述表达盒从5’到3’包含：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因可操作地连接的第一启动子和与编码所述抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的第二启动子，所述抗体或抗体片段用于在对象中治疗中枢神经系统(CNS)的疾病或病症的方法，其中所述载体转导或转染血脑屏障(BBB)之细胞或CNS之细胞并且经转导或经转染的细胞表达所述抗体或抗体片段，导致将所述抗体或抗体片段递送到CNS中。
29.根据权利要求27或权利要求28所述应用的载体，其中所述抗体或抗体片段被递送到脑实质中，任选地其中所述抗体或抗体片段被分泌到脑实质中。
30.根据权利要求27至29中任一项所述应用的载体，其中所述载体转导或转染CNS之细胞并且所述细胞选自：脑内皮细胞、神经元、周细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和室管膜细胞。
31.根据权利要求27至30中任一项所述应用的载体，其中所述载体转导或转染BBB之内皮细胞。
32.根据权利要求27至31中任一项所述应用的载体，其中所述载体转导或转染BBB之周细胞或星形胶质细胞。
33.根据权利要求27至32中任一项所述应用的载体，其中所述抗体或抗体片段被分泌到CNS中，优选被分泌到脑实质中。
34.根据权利要求27至33中任一项所述应用的载体，其中所述载体包含所述载体表面上的将所述载体靶向至BBB之细胞的修饰。
35.根据权利要求27至34中任一项所述应用的载体，其中所述载体在所述载体表面上表达将所述载体靶向至BBB之细胞或CNS之细胞的肽、小分子、抗体或其抗体片段、蛋白质、纳米颗粒、脂质、寡核苷酸、适配体或阳离子分子。
36.根据权利要求27至35中任一项所述应用的载体，其中所述载体包括亲神经载体。
37.根据权利要求27至36中任一项所述应用的载体，其中所述载体包含有机纳米材料或无机纳米材料，所述有机纳米材料例如脂质体、外排体、树枝状聚合物和胶束，所述无机纳米材料例如金纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒和碳纳米管。
38.根据权利要求27至37中任一项所述应用的载体，其中所述载体包括野生型病毒载体或经改造的病毒载体。
39.根据权利要求27至38中任一项所述应用的载体，其中所述载体选自：腺相关病毒(AAV)、腺病毒、逆转录病毒、鼻病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒(HSV)或病毒样颗粒。
40.根据权利要求27至39中任一项所述应用的载体，其中所述载体是选自以下的AAV：AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)和AAV血清型10(AAV10)。
41.根据权利要求27至40中任一项所述应用的载体，其中所述载体是经改造的AAV载体，其中任选地
(i)所述经改造的AAV载体是经改造的AAV2载体，优选AAV-BR1；或者
(ii)所述经改造的AAV载体是经改造的AAV9载体，例如AAV-S、AAV-F、AAV-PHP.eB、AAV9-PHP-V1；或者
(iii)所述经改造的AAV载体是经改造的AAV1载体，例如AAV1RX、AAV1R6或AAV1R7，或者
(iv)所述经改造的AAV载体是经改造的AAV10载体。
42.根据权利要求27至41中任一项所述应用的载体，其中所述CNS的疾病或病症选自淀粉样蛋白β蛋白相关疾病、TDP-43-蛋白质病、α-突触核蛋白病、Tau蛋白病、包括多聚谷氨酰胺疾病例如亨廷顿病的三核苷酸重复疾病、脑相关癌症和肿瘤、癫痫、精神疾病、神经炎性疾病、神经肌肉疾病、病毒诱发的脑炎和以小胶质细胞功能障碍为特征的疾病。
43.根据权利要求27至42中任一项所述应用的载体，其中所述CNS的疾病或病症选自：额颞痴呆(FTD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、慢性创伤性脑病(CTE)、边缘主导年龄相关性TDP-43脑病(LATE)和多发性硬化。
44.根据权利要求27至43中任一项所述应用的载体，其中所述抗体或抗体片段选自：抗ErbB2、抗TDP-43(NI-205)、抗Aβ(例如巴品珠单抗、索拉珠单抗、lecanemab、阿杜卡尼单抗、多奈单抗、更汀芦单抗或克瑞组单抗)、抗ApoE4(载脂蛋白E4)和抗DDX3X(ATP依赖性RNA解旋酶)、抗Tau(替拉奈单抗、gosuranemab、泽格特奈单抗、西瑞奈单抗、bepranemab、BIIB076、JNJ-63733657、Lu AF87908、PNT001、E-2814)、抗LINGO-1(例如奥匹努单抗)、抗α-突触核蛋白(辛帕奈单抗、prasinezumab、MEDI-1341、Lu AF82422、BAN0805)、抗ASC(IC-100)、抗NLRP3、抗C5(ravulizumab、依库珠单抗)、抗C1q(ANX-005)、抗C3、抗亨廷顿蛋白(C-617、NI-302)、抗朊病毒、抗CD20(例如奥法木单抗、奥美珠单抗、利妥昔单抗、BCD-132、乌妥昔单抗、BAT-4406F、AL-014)、抗PD-1(IBC-Ab002)或抗VEGF-A(贝伐单抗、雷珠单抗、布洛赛珠单抗、faricimab、伐努赛珠单抗)。
45.根据权利要求27至44中任一项所述应用的载体，其中所述载体肠胃外施用于所述对象。
46.根据权利要求45所述应用的载体，其中所述载体通过静脉内注射或静脉内输注施用于所述对象。
47.根据权利要求27至46所述应用的载体，其中所述表达盒还包含在编码所述抗体或抗体片段的轻链的第一基因之后并且在编码所述抗体或抗体片段的重链的第二基因之前的内部核糖体进入位点(IRES)或弗林蛋白酶2A切割位点。
48.根据权利要求47所述应用的载体，其中所述IRES来源于脑心肌炎病毒，并且任选地包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:8。
49.根据权利要求27至48中任一项所述应用的载体，其中编码所述抗体或抗体片段的轻链的第一基因还包含分泌肽，和/或编码所述抗体或抗体片段的重链的第二基因还包含分泌肽。
50.根据权利要求27至49中任一项所述应用的载体，其中所述至少一个启动子和/或所述第一启动子和/或所述第二启动子选自：巨细胞病毒(CMV)启动子；EF1A(人真核翻译延伸因子1α1)；CAG(与经修饰的鸡β-肌动蛋白启动子融合的CMV早期增强子)；CBh(与经修饰的鸡β-肌动蛋白启动子融合的CMV早期增强子)；SV40(猿猴病毒40增强子/早期启动子)；GFAP(人胶质原纤维酸性蛋白启动子)；ATP1A2_1(Na、K ATP酶α2)；CLDN_5(密封蛋白5)；ADRB2_1(肾上腺素受体β2)；TNFRSF6B_1(TNF受体超家族成员6b)；PDYN_1(强啡肽原)；GH1_1(人生长激素)；OPALIN_1(Opalin)；SYN1_1(突触蛋白1)；CAMK2A_1(钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα)；NEFH_1(神经丝重多肽)；NEUROD6_1(神经元分化因子6)；或OLIG2_1(少突胶质细胞转录因子2)；CBh；与GFAP、ATP1A2_1、CLDN_5、ADRB2_1、TNFRSF6B_1、PDYN_1、GH1_1.OPALIN_1、SYN1_1、CAMK2A_1、NEFH_1、NEUROD6_1或OLIG2_1启动子融合的CMV早期增强子；所述至少一个启动子优选巨细胞病毒(CMV)启动子或CBh启动子，并且其中所述至少一个启动子与编码抗体或抗体片段的序列可操作地连接。
51.根据权利要求50所述应用的载体，其中所述至少一个启动子和/或所述第一启动子和/或所述第二启动子选自：ATP1A2_1(Na、K ATP酶α2)、CLDN_5(密封蛋白5)、ADRB2_1(肾上腺素受体β2)和TNFRSF6B_1(TNF受体超家族成员6b)，任选地其中所述至少一个启动子和/或所述第一启动子和/或所述第二启动子与增强子可操作地连接，所述增强子例如CMV早期增强子。
52.根据权利要求27至51中任一项所述应用的载体，其中所述表达盒包含选自以下的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10，或者与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性的序列。
53.降低抗体或抗体片段聚集、改善抗体或抗体片段成熟和/或品质的方法，其中所述方法包括：
(i)用从5’至3’包含以下的表达盒转化细胞：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因和编码所述抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子，并且其中所述表达盒还包含在编码所述抗体或抗体片段的轻链的第一基因之后并在编码所述抗体或抗体片段的重链的第二基因之前的内部核糖体进入位点(IRES)；或者用从5’到3’包含以下的表达盒转化细胞：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因可操作地连接的第一启动子和与编码所述抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的第二启动子；以及
(ii)在适合于抗体或抗体片段产生的条件下维持经转化的细胞。
54.提高抗体或抗体片段效价的方法，其中所述方法包括：
(i)用从5’至3’包含以下的表达盒转化细胞：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因和编码所述抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子，并且其中所述表达盒还包含在编码所述抗体或抗体片段的轻链的第一基因之后并在编码所述抗体或抗体片段的重链的第二基因之前的内部核糖体进入位点(IRES)或自切割位点(例如弗林蛋白酶-2A切割位点)；或者用从5’到3’包含以下的表达盒转化细胞：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因可操作地连接的第一启动子和与编码所述抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的第二启动子；以及
(ii)在适合于抗体或抗体片段产生的条件下维持经转化的细胞。
55.降低不希望的抗体或抗体片段免疫原性和/或者与抗体或抗体片段治疗相关的不良作用的方法，其中所述方法包括：
(i)用从5’至3’包含以下的表达盒转化细胞：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因和编码所述抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子，并且其中所述表达盒还包含在编码所述抗体或抗体片段的轻链的第一基因之后并在编码所述抗体或抗体片段的重链的第二基因之前的内部核糖体进入位点(IRES)；或者用从5’到3’包含以下的表达盒转化细胞：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因可操作地连接的第一启动子和与编码所述抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的第二启动子；以及
(ii)在适合于抗体或抗体片段产生的条件下维持经转化的细胞。
56.根据权利要求53至55中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗体片段不含自切割元件。
57.根据权利要求53至56中任一项所述的方法，其中所述表达盒包含在载体中，并且所述方法还根据权利要求29至52中任一项所述的特征来限定。
58.抗体或抗体片段，其通过根据权利要求53至57中任一项所述的方法来获得。
59.病毒载体，其包含经改造的AAV2载体，优选AAV-BR1；或者经改造的AAV9载体，例如AAV-S、AAV-F、AAV-PHP.eB或AAV9-PHP-V1；或者经改造的AAV1载体，例如AAV1RX、AAV1R6、AAV1R7；或者经改造的AAV10载体；并且其中经改造的病毒载体包含从5’到3’包含以下的表达盒：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因和编码所述抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的至少一个启动子，并且还包含在编码所述抗体或抗体片段的轻链的第一基因之后并在编码所述抗体或抗体片段的重链的第二基因之前的IRES。
60.病毒载体，其包含经改造的AAV2载体，优选AAV-BR1；或者经改造的AAV9载体，例如AAV-S、AAV-F、AAV-PHP.eB或AAV9-PHP-V1；或者经改造的AAV1载体，例如AAV1RX、AAV1R6或AAV1R7；或者经改造的AAV10载体；并且其中经改造的病毒载体包含从5’到3’包含以下的表达盒：与编码抗体或抗体片段的轻链的第一基因可操作地连接的第一启动子和与编码所述抗体或抗体片段的重链的第二基因可操作地连接的第二启动子。
61.根据权利要求59或60所述的经改造的病毒载体，其中所述经改造的病毒载体是AAV-BR1或AAV9-PHP-V1。
62.根据权利要求59至61中任一项所述的病毒载体，其还根据权利要求29至52中任一项来限定。
CN202180084599.XA 2020-12-18 2021-12-17 抗体递送 Pending CN116917491A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20215823 2020-12-18
EP20215823.4 2020-12-18
PCT/EP2021/086645 WO2022129609A2 (en) 2020-12-18 2021-12-17 Antibody delivery

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116917491A true CN116917491A (zh) 2023-10-20

Family

ID=74183005

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180084599.XA Pending CN116917491A (zh) 2020-12-18 2021-12-17 抗体递送

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20240100187A1 (zh)
EP (1) EP4263573A2 (zh)
JP (1) JP2024500115A (zh)
KR (1) KR20230121096A (zh)
CN (1) CN116917491A (zh)
AR (1) AR124410A1 (zh)
AU (1) AU2021399147A1 (zh)
CA (1) CA3200807A1 (zh)
IL (1) IL303758A (zh)
MX (1) MX2023006973A (zh)
TW (1) TW202242118A (zh)
WO (1) WO2022129609A2 (zh)

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
WO1996002576A1 (fr) 1994-07-13 1996-02-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anticorps humain reconstitue contre l'interleukine-8 humaine
US6677436B1 (en) 1998-04-03 2004-01-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Humanized antibody against human tissue factor (TF) and process of production of the humanized antibody
US9790488B2 (en) * 2013-08-02 2017-10-17 Agency For Science, Technology And Research Mutated internal ribosomal entry site (IRES) for controlled gene expression
CA2874083C (en) * 2014-12-05 2024-01-02 Universite Laval Tdp-43-binding polypeptides useful for the treatment of neurodegenerative diseases
SG10202008378UA (en) * 2016-04-15 2020-10-29 Regenxbio Inc Treatment of ocular diseases with fully-human post-translationally modified anti-vegf fab
WO2017189963A1 (en) * 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
JP7221275B2 (ja) * 2017-08-03 2023-02-13 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド Ａａｖを送達するための組成物および方法
WO2020210655A1 (en) * 2019-04-11 2020-10-15 California Institute Of Technology Virus compositions with enhanced specificity in the brain

Also Published As

Publication number Publication date
AR124410A1 (es) 2023-03-22
WO2022129609A2 (en) 2022-06-23
CA3200807A1 (en) 2022-06-23
WO2022129609A3 (en) 2022-09-15
EP4263573A2 (en) 2023-10-25
MX2023006973A (es) 2023-06-23
KR20230121096A (ko) 2023-08-17
IL303758A (en) 2023-08-01
AU2021399147A1 (en) 2023-07-27
US20240100187A1 (en) 2024-03-28
JP2024500115A (ja) 2024-01-04
TW202242118A (zh) 2022-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200254113A1 (en) Fusion proteins for delivery of gdnf to the cns
US8142781B2 (en) Fusion proteins for blood-brain barrier delivery
US8124095B2 (en) Fusion proteins for delivery of erythropoietin to the CNS
CA2661042C (en) Agents for blood-brain barrier delivery
US20100077498A1 (en) Compositions and methods for blood-brain barrier delivery in the mouse
US20150210771A1 (en) Treatment of brain cancers using central nervous system mediated gene transfer of monoclonal antibodies
CN112074605A (zh) 抗fam19a5抗体的腺相关病毒（aav）递送
CN116917491A (zh) 抗体递送
US20220041697A1 (en) Monoclonal antibodies targeting c-terminal region of phosphorylated tau
WO2024088384A1 (zh) 用于疾病治疗的基因编辑器和抗纤维化抑制剂的核酸药物组合物
AU2011205186B2 (en) Fusion proteins for blood-brain barrier delivery
CA3230492A1 (en) Gene sequence construct for gene therapy for hiv infection

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination