CN116917479A - Rna分子、嵌合体型na分子、双链rna分子及双链嵌合体型na分子 - Google Patents
Rna分子、嵌合体型na分子、双链rna分子及双链嵌合体型na分子 Download PDFInfo
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Abstract
本发明的目的在于提供一种新型的RNA分子。该RNA分子为用于以具有点突变的突变型等位基因为靶基因的RNA干涉法的RNA分子，其中，(1)具有与突变型等位基因的编码区互补的碱基序列；(2)从与突变型等位基因互补的碱基序列的最靠近5’侧的碱基开始计数，(2‑1)第5个或第6个碱基与突变型等位基因的碱基不匹配；(2‑2)第10位或第11位对应于点突变的位置；及(2‑3)在第6‑8位或第7‑8位中，五碳糖的2’位被OCH3等修饰。在该RNA分子中，核糖核苷酸可以被脱氧核糖核苷酸等取代，可与互补链一起形成双链RNA。
Description
技术领域
本发明涉及用于RNA干涉法的RNA分子、嵌合体型NA分子、双链RNA分子及双链嵌合体型NA分子。
背景技术
RNA干涉法为一种用于在细胞内特异性抑制特定靶基因的表达的简便且有效的方法。
然而，已知该方法会超出预计而对原本并非靶标的基因(脱靶(off-target))也抑制其基因表达(Jackson,A.L.et al.,(2003)Nature Biotechnology vol.21,p.635-7)。
特别是，已知若siRNA对靶基因的亲和力变强，则脱靶效应也会变大(Ui-Tei,K.etal.,(2008)Nucleic Acids Res.vol.36,p.7100-7109.)。
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明的目的在于提供新型的RNA分子、新型的嵌合体型NA分子、新型的双链RNA分子及新型的双链嵌合体型NA分子。
解决技术问题的技术手段
本申请的发明人为了确定脱靶效应低的RNA序列而进行了深入研究，结果发现通过使第5个或第6个碱基不匹配，并在第6-8个或第7-8个核糖核苷酸中修饰五碳糖的2’位，对于第10个或第11个碱基，尤其脱靶效应会降低。据此，通过在将相对于某个基因的野生型等位基因具有一个碱基的点突变的突变型等位基因作为靶基因的RNA干涉法中，以使第10个或第11个碱基对应于点突变的位置并为突变型等位基因所具有的碱基的方式设计RNA分子，并将以该RNA分子为引导链的双链RNA分子用于RNA干涉法，从而成功地主要抑制了突变型等位基因的表达且事实上不抑制野生型等位基因的表达，进而完成了本发明。
本发明的一个实施方案为一种RNA分子，其用于以相对于基因的野生型等位基因具有一个碱基的点突变的突变型等位基因为靶基因的RNA干涉法，其中，所述RNA分子满足以下的要件：
(1)具有除下述(2-1)中规定的碱基以外与所述突变型等位基因的编码区互补的碱基序列；
(2)从与所述突变型等位基因互补的碱基序列的最靠近5’侧的碱基开始计数，
(2-1)第5个或第6个碱基与所述突变型等位基因的碱基不匹配；
(2-2)第10位或第11位对应于所述点突变的位置，第10个或第11个碱基对应于所述突变型等位基因所具有的碱基；及
(2-3)在第6-8个或第7-8个核糖核苷酸中，五碳糖的2’位被OCH3、卤素或LNA修饰，
所述基因选自由HTT基因、ATXN3基因、ZMYM3基因、CTNNB1基因、SMARCA4基因、SMO基因、AR基因、DNM2基因、KRT14基因、IL4R基因、MAPT基因、MS4A2基因、PABPN1基因、RHO基因、SCNIA基因、APOB基因、F12基因、CLCN7基因、SCN8A基因、PCSK9基因及KRT6A基因组成的组中。
所述卤素可为F。当上述(1)中规定的碱基序列的5’末端的碱基并非腺嘌呤或尿嘧啶时，该碱基可被腺嘌呤或尿嘧啶取代。当上述(1)中规定的碱基序列的3’末端的碱基并非胞嘧啶或鸟嘌呤时，该碱基可被胞嘧啶或鸟嘌呤取代。上述任一RNA分子均可由13～28个核苷酸构成。上述任一RNA分子均可为一个或多个核糖核苷酸被脱氧核糖核苷酸、人工核酸或核酸类似物取代而成的嵌合体型NA分子。
本发明的另一个实施方案为一种双链RNA分子，其中，上述任一RNA分子为引导链(guide strand)，具有与所述RNA分子互补的序列的RNA分子为过客链(passengerstrand)。在引导链的3’末端和/或过客链的3’末端可以具有单链突出端(overhang)部分，所述单链突出端部分可由1～3个核苷酸构成。上述任一双链RNA分子均可为一个或多个核糖核苷酸被脱氧核糖核苷酸、人工核酸或核酸类似物取代而成的双链嵌合体型NA分子。
本发明的另一个实施方案为一种在RNA干涉法中用作引导链的RNA分子的制备方法，其包括制备上述任一RNA分子的工序。RNA分子可以为一个或多个核糖核苷酸被脱氧核糖核苷酸、人工核酸或核酸类似物取代而成的嵌合体型NA分子。
本发明的另一个实施方案为一种RNA干涉法，其为在具备基因的野生型等位基因与具有一个碱基的点突变的所述基因的突变型等位基因的细胞中，以所述突变型等位基因为靶基因的RNA干涉法，其包括：将上述任一RNA分子、嵌合体型NA分子、双链RNA分子或上述任一双链嵌合体型NA分子导入所述细胞的工序。
本发明的另一个实施方案为一种治疗药物，其为用于患有具备致病基因的野生型等位基因与具有一个碱基的点突变的所述致病基因的突变型等位基因，且所述突变型等位基因为原因的疾病的患者的治疗药物或用于所述疾病的携带者的预防药物，其以上述任一RNA分子、嵌合体型NA分子、双链RNA分子或上述任一双链嵌合体型NA分子为有效成分。所述疾病可以为表1所记载的疾病。
[表1]
本发明的又一个实施方案为一种RNA分子、嵌合体型NA分子、双链RNA分子或双链嵌合体型NA分子的筛选方法，其为筛选在用于抑制靶基因的RNA干涉法中使用的RNA分子、嵌合体型NA分子、双链RNA分子或双链嵌合体型NA分子的方法，其包括：分别使用多个上述任一RNA分子、嵌合体型NA分子、双链RNA分子或上述任一双链嵌合体型NA分子在体外(invitro)进行上述RNA干涉法，由此考察所述多个RNA分子、嵌合体型NA分子、双链RNA分子或双链嵌合体型NA分子对所述靶基因的特异性抑制基因表达的能力的工序；及筛选所述特异性抑制基因表达的能力为规定水平以上的RNA分子、嵌合体型NA分子、双链RNA分子或双链嵌合体型NA分子的工序。
＝＝与相关文献的交叉引用＝＝
本申请基于2021年1月15日提出申请的日本专利申请特愿2021-005335主张优先权，并通过引用该基础申请而将其涵盖于本说明书中。
附图说明
图1为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以K-ras基因为靶标的siRNA的第9～11位对应于点突变的位置时的siRNA。
图2为示出在本发明的一个实施例中使用如下siRNA时的siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以K-ras基因为靶标的siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由鸟嘌呤取代为尿嘧啶，将过客链的5’末端的碱基由尿嘧啶取代为鸟嘌呤的siRNA。
图3为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以K-ras基因为靶标的siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由鸟嘌呤取代为尿嘧啶，将过客链的5’末端的碱基由尿嘧啶取代为鸟嘌呤，在siRNA的引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3时的siRNA。
图4为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以K-ras基因为靶标的siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由鸟嘌呤取代为尿嘧啶，将过客链的5’末端的碱基由尿嘧啶取代为鸟嘌呤，使siRNA的引导链的第3～7个碱基与A突变型等位基因的碱基不匹配时的siRNA。
图5为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以K-ras基因为靶标的siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由鸟嘌呤取代为尿嘧啶，将过客链的5’末端的碱基由尿嘧啶取代为鸟嘌呤，在siRNA的引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，使siRNA的引导链的第3～7个碱基与A突变型等位基因的碱基不匹配时的siRNA。
图6为示出本发明的一个实施例中的对K-ras基因的A突变型等位基因表现出特异性的siRNA对野生型等位基因、T突变型K-ras(c.35G＞T)等位基因及C突变型K-ras(c.35G＞C)等位基因的表达抑制能力的考察结果的图表。
图7为示出本发明的一个实施例中的对K-ras基因的T突变型等位基因表现出特异性的siRNA对野生型等位基因、A突变型等位基因及C突变型等位基因的表达抑制能力的考察结果的图表。
图8为示出本发明的一个实施例中的对K-ras基因的C突变型等位基因表现出特异性的siRNA对野生型等位基因、A突变型等位基因及T突变型等位基因的表达抑制能力的考察结果的图表。
图9为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：以N-ras基因的cDNA第35个核苷酸中的点突变为对象，并使siRNA的第11位对应于A突变型N-ras(c.35G＞A)等位基因(以下称作A突变型N35等位基因)的点突变的位置，将siRNA的引导链的5’末端的碱基由胞嘧啶取代为尿嘧啶，将过客链的5’末端的碱基由腺嘌呤取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，且使siRNA的引导链的第5个碱基与A突变型N35等位基因的碱基不匹配时的siRNA。
图10为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：以N-ras基因的cDNA第182个核苷酸中的点突变为对象，并使siRNA的第11位对应于A突变型N-ras(c.182A＞G)等位基因(以下称作G突变型N182等位基因)的点突变的位置，将siRNA的引导链的5’末端的碱基由鸟嘌呤取代为尿嘧啶，将过客链的5’末端的碱基由腺嘌呤取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，且使siRNA的引导链的第5个碱基与G突变型N182等位基因的碱基不匹配时的siRNA。
图11为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以HTT基因为靶标的第一siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的过客链的5’末端的碱基由胞嘧啶取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由尿嘧啶改为腺嘌呤而使其不匹配时的siRNA。
图12为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以HTT基因为靶标的第二siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由鸟嘌呤取代为尿嘧啶，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由腺嘌呤改为尿嘧啶而使其不匹配时的siRNA。
图13为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以HTT基因为靶标的第三siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的过客链的5’末端的碱基由胞嘧啶取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中，将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由腺嘌呤改为尿嘧啶而使其不匹配时的siRNA。
图14为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以ATXN3基因为靶标的siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由鸟嘌呤取代为尿嘧啶，将过客链的5’末端的碱基由腺嘌呤取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由鸟嘌呤改为胞嘧啶而使其不匹配时的siRNA。
图15为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以ZMYM3基因为靶标的siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由腺嘌呤取代为尿嘧啶，将过客链的5’末端的碱基由尿嘧啶取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由胞嘧啶改为鸟嘌呤而使其不匹配时的siRNA。
图16为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以CTNNB1基因为靶标的siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由鸟嘌呤取代为尿嘧啶，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由尿嘧啶改为腺嘌呤而使其不匹配时的siRNA。
图17为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以SMARCA4基因为靶标的siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由胞嘧啶取代为尿嘧啶，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由尿嘧啶改为腺嘌呤而使其不匹配时的siRNA。
图18为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以SMO基因为靶标的siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由胞嘧啶取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由鸟嘌呤改为胞嘧啶而使其不匹配时的siRNA。
图19为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以AR基因为靶标的siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由鸟嘌呤取代为尿嘧啶，将过客链的5’末端的碱基由尿嘧啶取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由腺嘌呤改为尿嘧啶而使其不匹配时的siRNA。
图20为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以DNM2基因为靶标的siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由鸟嘌呤取代为尿嘧啶，将过客链的5’末端的碱基由尿嘧啶取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由胞嘧啶改为鸟嘌呤而使其不匹配时的siRNA。
图21为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以KRT14基因为靶标的siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由鸟嘌呤取代为尿嘧啶，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由鸟嘌呤改为胞嘧啶而使其不匹配时的siRNA。
图22为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以IL4R基因为靶标的第一siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的过客链的5’末端的碱基由腺嘌呤取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由腺嘌呤改为尿嘧啶而使其不匹配时的siRNA。
图23为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以IL4R基因为靶标的第二siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的过客链的5’末端的碱基由尿嘧啶取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由胞嘧啶改为鸟嘌呤而使其不匹配时的siRNA。
图24为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以MAPT基因为靶标的siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由鸟嘌呤取代为尿嘧啶，将过客链的5’末端的碱基由腺嘌呤取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由胞嘧啶改为鸟嘌呤而使其不匹配时的siRNA。
图25为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以MS4A2基因为靶标的siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由腺嘌呤取代为尿嘧啶，将过客链的5’末端的碱基由胞嘧啶取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由腺嘌呤改为尿嘧啶而使其不匹配时的siRNA。
图26为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以PABPN1基因为靶标的siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由鸟嘌呤取代为尿嘧啶，将过客链的5’末端的碱基由腺嘌呤取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由胞嘧啶改为鸟嘌呤而使其不匹配时的siRNA。
图27为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以RHO基因为靶标的第一siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由鸟嘌呤取代为尿嘧啶，将过客链的5’末端的碱基由腺嘌呤取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由胞嘧啶改为鸟嘌呤而使其不匹配时的siRNA。
图28为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以RHO基因为靶标的第二siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的过客链的5’末端的碱基由腺嘌呤取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由胞嘧啶改为鸟嘌呤而使其不匹配时的siRNA。
图29为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以SCNIA基因为靶标的siRNA的第11位对应于点突变的位置，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由尿嘧啶改为腺嘌呤而使其不匹配时的siRNA。
图30为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以APOB基因为靶标的siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由胞嘧啶取代为尿嘧啶，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由腺嘌呤改为尿嘧啶而使其不匹配时的siRNA。
图31为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以F12基因为靶标的siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由鸟嘌呤取代为尿嘧啶，将过客链的5’末端的碱基由尿嘧啶取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由鸟嘌呤改为胞嘧啶而使其不匹配时的siRNA。
图32为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以CLCN7基因为靶标的siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由腺嘌呤取代为尿嘧啶，将过客链的5’末端的碱基由尿嘧啶取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由鸟嘌呤改为胞嘧啶而使其不匹配时的siRNA。
图33为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以SCN8A基因为靶标的siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由胞嘧啶取代为尿嘧啶，将过客链的5’末端的碱基由尿嘧啶取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由胞嘧啶改为鸟嘌呤而使其不匹配时的siRNA。
图34为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以PCSK9基因为靶标的siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由鸟嘌呤取代为尿嘧啶，将过客链的5’末端的碱基由胞嘧啶取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由鸟嘌呤改为胞嘧啶而使其不匹配时的siRNA。
图35为示出本发明的一个实施例中的如下siRNA的表达抑制能力的考察结果的图表：使以KRT6A基因为靶标的siRNA的第11位对应于点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由腺嘌呤取代为尿嘧啶，将过客链的5’末端的碱基由腺嘌呤取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，将引导链的第6个碱基由鸟嘌呤改为胞嘧啶而使其不匹配时的siRNA。
具体实施方式
根据本说明书的记载，本发明的目的、特征、优点及其构思对本领域技术人员而言是显而易见的，只要是本领域技术人员，则能够根据本说明书的记载容易地再现本发明。以下记载的发明的实施方式及具体的实施例等用于示出本发明的优选实施方案，其仅用于例示或说明，本发明并不受限于此。能够在本说明书中公开的本发明的意图以及范围内基于本说明书的记载进行各种改变以及修饰这一点，对于本领域技术人员而言是显而易见的。
另外，在本说明书记载的碱基序列中，当没有特别明示时，以左侧为5’末端、右侧为3’末端的方式进行记载。
＝＝RNA分子＝＝
本发明的一个实施方案为一种RNA分子，其用于以相对于基因的野生型等位基因具有一个碱基的点突变的突变型等位基因为靶基因的RNA干涉法。靶基因只要能够设计本发明公开的RNA分子，则没有特别限定，但优选靶基因为因点突变而导致正常细胞发生癌化的癌基因；因点突变而导致发病的遗传性疾病的致病基因；或具有在编码区上与作为疾病的原因的突变连锁的SNP的疾病的致病基因。此处，在基因库中，作为疾病的原因的突变与SNP连锁的比例优选为50％以上，更优选为60％以上、70％以上、80％以上或90％以上，进一步优选为95％以上、99％以上或99.5％以上。
例如，作为癌基因，可列举出ZMYM3基因、CTNNB1基因、SMARCA4基因、SMO基因、AR基因等；作为遗传性疾病的致病基因，可列举出DNM2基因、KRT14基因、IL4R基因、MAPT基因、MS4A2基因、PABPN1基因、SCNIA基因、APOB基因、F12基因、CLCN7基因、SCN8A基因、PCSK9基因、KRT6A基因、RHO基因等；作为具有SNP的疾病的致病基因，可列举出ATXN3基因、HTT基因等。将由这些基因的突变引起的疾病分别示于表1。
构成RNA分子的核苷酸的个数没有特别限定，可以为13个以上且100个以下，可以为13个以上且50个以下，可以为13个以上且28个以下，可以为15个以上且25个以下，可以为17个以上且21个以下，进一步优选为19个以上且21个以下。此外，一个或多个核糖核苷酸可被脱氧核糖核苷酸、人工核酸或肌酐、吗啉等核酸类似物取代。在本说明书中，将这样的RNA分子称作嵌合体型NA分子，但在本发明公开中，对于RNA分子，以包括嵌合体型NA分子的形式进行说明。
对于该RNA分子，从与突变型等位基因互补的碱基序列的最靠近5’侧的碱基开始计数，第5个或第6个碱基与突变型等位基因的碱基不匹配，但在除此以外的部分具有与突变型等位基因的编码区互补的碱基序列。该RNA分子也可以具有除与突变型等位基因的编码区互补的碱基序列以外的序列，例如可以具有与该互补的碱基序列互补的序列，由此可以进行自退火(self-annealing)，并作为siRNA发挥作用。作为这样的单链RNA，可例示出Bonac核酸。或者，可以在3’末端键合有1～3个核苷酸，其碱基序列没有特别限定。当互补的碱基序列的最靠近5’侧的碱基并非腺嘌呤或尿嘧啶时，该碱基可以被腺嘌呤或尿嘧啶或胸腺嘧啶取代。此外，当互补的碱基序列的最靠近3’侧的碱基并非胞嘧啶或鸟嘌呤时，该碱基可以被胞嘧啶或鸟嘌呤取代。通过这些操作，当该RNA分子作为siRNA的引导链发挥作用时，能够提高抑制基因表达的功能。此外，该RNA分子可以具有除核酸以外的化学物质以进行传递、提高膜通透性或提高血中滞留性。例如，RNA分子可与GalNAc或PEG缀合(conjugate)。此外，RNA分子也可以由除了第5个或第6个碱基以外与突变型等位基因的编码区互补的碱基序列之外的序列构成。另外，RNA分子虽然具有除了第5个或第6个碱基以外与突变型等位基因互补的碱基序列，但优选具有90％以上的互补性，更优选具有95％以上的互补性，进一步优选具有98％以上的互补性，最优选具有100％的互补性。第5个或第6个碱基只要与突变型等位基因不匹配则没有特别限定，只要为该位置的突变型等位基因的碱基以外的碱基，则A、U、C、G、T、I或除此以外的人工核酸·核酸类似物均可。
此外，在该RNA分子中，从与突变型等位基因互补的碱基序列的最靠近5’侧的碱基开始计数，第10位或第11位对应于点突变的位置，其碱基为对应于突变型等位基因所具有的碱基的碱基。即，当突变型等位基因所具有的发生了突变的碱基为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶时，RNA分子的第10位或第11位分别为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶(或胸腺嘧啶)。
此外，在该RNA分子中，从与突变型等位基因互补的碱基序列的最靠近5’侧的碱基开始计数，第6-8个或第7-8个核苷酸所具有的五碳糖的2’位被OCH3、卤素或LNA修饰(即，取代)。例如，五碳糖的2’位被-OCH3取代的RNA(以下称作2’-O-甲基RNA)具有下述通式的结构。
[化学式1]
卤素的种类没有特别限定，但从分子的大小较小的角度出发，优选氟。关于这些位置以外的核苷酸，可以一部分或全部被修饰，但优选所有的核苷酸均未被修饰。核苷酸的修饰没有特别限定，可例示出其所具有的五碳糖的2’位被选自由H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2、CN、COOR及LNA(式中，R为C1-C6烷基、烯基、炔基或芳基；卤素为F、Cl、Br或I)组成的组中的基团取代。
RNA分子对靶基因的IC50优选为1nM以下，更优选为500pM以下，进一步优选为200pM以下。
将该RNA分子以单链直接使用于RNA干涉法时，优选其5’末端被磷酸化或者可在原位(in situ)或体内(in vivo)被磷酸化。
该RNA分子的设计方法包括以下工序。
首先，进行使突变型等位基因所具有的发生了突变的碱基成为从最靠近5’侧的碱基开始计数时的第10位或第11位，选定具有与突变型等位基因的碱基序列互补的序列的规定长度的碱基序列的工序。接着，进行使从最靠近5’侧的碱基开始计数时的第5个或第6个碱基成为不匹配的碱基的工序。然后，使从最靠近5’侧的碱基开始计数时的第6-8个或第7-8个核苷酸所具有的五碳糖的2’位被OCH3、卤素或LNA修饰。此处，当互补的碱基序列的最靠近5’侧的碱基并非腺嘌呤或尿嘧啶时，也可以进行用腺嘌呤或尿嘧啶或胸腺嘧啶进行取代的工序。此外，当互补的碱基序列的最靠近3’侧的碱基并非胞嘧啶或鸟嘌呤时，也可以进行用胞嘧啶或鸟嘌呤进行取代的工序。最后，可以进行在3’侧加成1～3个碱基的工序。能够如此设计碱基序列。可以制作用于使该设计方法在计算机中运行的程序，也可以将该程序存储于计算机可读的记录介质上。具有如此设计的碱基序列的核苷酸可按照常规方法进行化学合成。
＝＝双链RNA分子＝＝
本发明的一个实施方案为一种双链RNA分子，其中，上述RNA分子(以下称作第一RNA分子)为引导链，具有与第一RNA分子互补的序列的第二RNA分子为过客链。第二RNA分子具有与第一RNA分子互补的序列，并在生理条件下与第一RNA分子形成双链，优选具有90％以上的互补性，更优选具有95％以上的互补性，进一步优选具有98％以上的互补性，最优选具有100％的互补性。
过客链的链长没有特别限定，可以远比第一RNA分子短，例如可以为第一RNA分子的一半以下，但优选为相同的长度。当过客链比第一RNA分子短时，第一RNA分子中会产生单链部分，该部分可以为单链的状态，也可以键合有与第一RNA分子互补的第三RNA分子。第二RNA分子与第三RNA分子键合于第一RNA分子整体时，成为与一条过客链上存在切口(nick)而分成两条链的情况相同的状态。
双链RNA分子的两端可以为平滑末端，也可以在作为引导链的第一RNA分子的3’末端和/或作为过客链的第二RNA分子的3’末端具有单链突出端。单链突出端的核苷酸数没有特别限定，优选为1～3个。
双链RNA分子也可以为引导链及过客链中的任一核苷酸链中的1～3个、4～6个、7～9个、10个～12个、13个～15个、16个～18个、19个～21个、22个～24个或25个以上、或者所有的核糖核苷酸被脱氧核糖核苷酸、吗啉等人工核酸或甘油核酸等核酸类似物取代的双链嵌合体型NA分子。
取代部位没有特别限定。
构成过客链的核苷酸可以被修饰，但优选未被修饰。核苷酸的修饰没有特别限定，能够例示出其所具有的五碳糖的2’位被选自由H、OR、R、卤素、SH、SR1、NH2、NHR、NR2、CN、COOR及LNA(式中，R为C1-C6烷基、烯基、炔基或芳基；卤素为F、Cl、Br或I)组成的组中的基团取代。
过客链也能够根据公知技术容易地设计、容易地制备。另外，引导链与过客链可以通过接头(linker)键合。接头的构成材料没有特别限定，可以为肽或PEG等。
＝＝RNA干涉法＝＝
本发明的一个实施方案为一种RNA干涉法，其中，在具备目标基因的野生型等位基因与具有一个碱基的点突变的基因的突变型等位基因的细胞中，将突变型等位基因作为靶基因。该RNA干涉法包括将包含嵌合体型NA分子的第一RNA分子、或包含双链嵌合体型NA分子的上述双链RNA分子导入具有野生型等位基因与突变型等位基因的细胞的工序。
RNA干涉法能够按照公知技术容易地进行。例如，通过对表达靶基因的培养细胞、或者人或除了人以外的生物个体导入第一RNA分子或双链RNA分子，能够下调靶基因的表达。
通过在进行RNA干涉法时使用上述的第一RNA分子或双链RNA分子，能够主要抑制来自突变型等位基因的表达而事实上不抑制目标基因的野生型等位基因的表达。此处，对于野生型等位基因的表达，只要达到野生型等位基因发挥作用并带来正常的表现型的程度，则即使被抑制也无妨。对于突变型等位基因的表达，只要被抑制至突变型等位基因不发挥作用且不会带来异常的表现型的程度即可。由此，例如当突变型等位基因具有显性突变时，能够使突变产生的表现型不表达而使细胞正常发挥作用。
＝＝药物＝＝
本发明的一个实施方案为一种治疗药物或预防药物，其为用于具备致病基因的野生型等位基因与具有一个碱基的点突变的致病基因的突变型等位基因，且致病基因的突变型等位基因为原因的疾病的患者的治疗药物或携带者的预防药物，其以上述的包含嵌合体型NA分子的RNA分子或包含双链嵌合体型NA分子的双链RNA分子为有效成分。携带者是指，虽然具有致病基因的突变型等位基因，但未发病、将来有发病可能的人。此外，用于携带者的预防药物是指，由于携带者具有致病基因的突变型等位基因，因此用于预防该疾病发病的药物。
此处，疾病的原因不限于该点突变，原因也可以为其他突变且规定比例的患者或携带者具有该点突变。当为后者时，优选作为疾病的原因的突变与点突变连锁，规定比例没有特别限定，但优选为50％以上，更优选为60％以上、70％以上、80％以上或90％以上，进一步优选为95％以上、99％以上或99.5％以上。当规定比例为较低值时，在将该药物给药之前，可以调查该患者或携带者是否具有该点突变。另外，此时，优选除了患者或携带者以外的健康个体不具有该点突变。
作为前者的实例，能够例示出以一个碱基的突变为发病原因的遗传性疾病或肿瘤。遗传性疾病只要为以一个碱基的突变为发病原因的遗传性疾病，则没有特别限定，能够例示出表1中记载的疾病。肿瘤也同样，只要为以肿瘤基因的一个碱基的突变为发病原因的肿瘤，则没有特别限定，能够例示出表1中记载的疾病。
作为后者的实例，可列举出三联体重复序列疾病(triplet repeat disease)。已知三联体重复序列疾病会因在健康个体中重复5～40次的CAG等重复序列在患者中重复36～3000次而发病。例如在作为马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease，MJD)的致病基因的ATXN3突变基因中，具有紧接着CAG重复序列的G突变成C的SNP，能够将该突变作为本发明公开的siRNA的靶标。对三联体重复序列疾病并无特别限定，能够例示出表1中记载的疾病。
本说明书所公开的药物的给药方法没有特别限定，优选为注射，更优选为静脉注射。此时，除有效成分以外，还可以在治疗药物中添加pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、等渗剂、局部麻醉剂等。
用量没有特别限定，可根据所含有的成分的有效性、给药形式、给药途径、疾病的种类、对象的性质(体重、年龄、病状及是否使用其他药物等)及主治医师的判断等而适当选择。
＝＝筛选方法＝＝
本发明的一个实施方案为一种筛选在用于抑制靶基因的RNA干涉法中使用的RNA分子、嵌合体型NA分子、双链RNA分子或双链嵌合体型NA分子的方法，其包括：使用多个上述的RNA分子、嵌合体型NA分子、双链RNA分子或双链嵌合体型NA分子在体外进行RNA干涉法，由此考察特异性抑制基因表达的能力的工序；及筛选特异性抑制基因表达的能力为规定水平以上的RNA分子、嵌合体型NA分子、双链RNA分子或双链嵌合体型NA分子的工序。
在体外进行RNA干涉法时，使用基因的野生型等位基因与具有一个碱基的点突变的突变型等位基因作为对象基因，选择不以规定水平以上的水平抑制野生型等位基因的表达但以规定水平以上的水平抑制突变型等位基因的表达的分子。由此，能够得到抑制突变型等位基因的表达而不抑制野生型等位基因的表达的分子。此处，规定水平的数值没有特别限定，优选为50％，更优选为70％，进一步优选为90％。
在体外利用RNA干涉的检测方法为技术常识，并且基因的选择、细胞的选择、向细胞内导入RNA分子等对于本领域技术人员而言是显而易见的。
实施例
(方法)
将在含10％FBS的DMEM中培养的HeLa细胞以1×105个/mL的密度接种于24孔板，并将100ng的各报告基因及100ng的内标用质粒(pGL3)及双链siRNA与2μL的脂质体2000(lipofectamine2000)一起共转染。双链siRNA的浓度如各图所示。另外，作为对照的siRNA，导入siGY441。在24小时之后回收细胞，使用双荧光素酶报告基因检测系统(dual-luciferase reporter assay system)(Promega Corporation)，测定萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)及海肾荧光素酶(Renilla luciferase)的活性，使用萤火虫荧光素酶的测定值，对海肾荧光素酶的测定值进行标准化。此外，将siGY441所得到的测定值设为100％，将此时的双链siRNA所得到的测定值示于图表。
实施例1
在本实施例中，作为表达被抑制的靶基因，使用K-ras基因。
(实施例1-1)
本实施例中示出：通过使siRNA的第10位或第11位对应于A突变型K-ras(c.35G＞A)等位基因(以下称作A突变型等位基因)的点突变的位置，相较于野生型K-ras等位基因(以下称作野生型等位基因)，RNA分子对A突变型K-ras(c.35G＞A)等位基因的表达抑制能力的特异性升高。
首先，作为用于考察基因表达抑制效果的报告基因，化学合成具有与野生型K-ras(wt)等位基因及A突变型K-ras(c.35G＞A)等位基因相同的碱基序列的DNA，并插入到表达载体(psiCHECK)的荧光素酶基因的3’-UTR，制作野生型K报告基因及A突变型K报告基因。将导入载体中的部分的序列分别示于以下。
野生型K报告基因序列：
A突变型K报告基因序列：
接着，作为siRNA，化学合成具有下述序列的双链RNA。作为siRNA的K(35)9A、K(35)10A及K(35)11A的第9位、第10位及第11位分别对应于A突变型K-ras(c.35G＞A)等位基因的点突变的位置。另外，下述序列中，用□包围对应于点突变的位置的碱基对。
K(35)9A：
K(35)10A：
K(35)11A：
图1中示出各siRNA的基因表达抑制效果。
K(35)9A对A突变型等位基因、野生型等位基因均具有较强的表达抑制效果。K(35)10A及K(35)11A的表达抑制效果虽稍微减弱，但相较于野生型等位基因，更强烈地抑制A突变型等位基因的表达。
(实施例1-2)
本实施例中示出：通过使用在使siRNA的第11位对应于A突变型等位基因的点突变的位置的基础上，且将siRNA的引导链的5’末端的碱基由鸟嘌呤取代为尿嘧啶，并将过客链的5’末端的碱基由尿嘧啶取代为鸟嘌呤的siRNA，RNA分子对A突变型等位基因的表达抑制能力增强，其特异性进一步升高。
作为用于考察基因表达抑制效果的报告基因，使用野生型K报告基因及A突变型K报告基因，作为siRNA，化学合成具有下述序列的双链RNA，作为对照，使用K(35)11A。另外，下述序列中，用□包围对应于点突变的位置的碱基对与引导链及过客链的5’末端的被取代的碱基对。
K(35)11Arev：
图2中示出各siRNA的基因表达抑制效果。
相较于野生型等位基因，K(35)11A更强烈地抑制A突变型等位基因的表达，而K(35)11Arev对上述两种等位基因的表达抑制效果均变强，且相较于野生型等位基因，进一步强烈地抑制A突变型等位基因的表达。
(实施例1-3)
本实施例中示出：通过在使siRNA的第11位对应于A突变型等位基因的点突变的位置，且将siRNA的引导链的5’末端的碱基由鸟嘌呤取代为尿嘧啶，并将过客链的5’末端的碱基由尿嘧啶取代为鸟嘌呤的基础上，在siRNA的引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，RNA分子对A突变型等位基因的表达抑制能力增强，其特异性进一步升高。
作为用于考察基因表达抑制效果的报告基因，使用野生型K报告基因及A突变型K报告基因，作为siRNA，化学合成具有下述序列的双链RNA，作为对照，使用K(35)11Arev。另外，下述序列中，用□包围对应于点突变的位置的碱基对与引导链及过客链的5’末端的被取代的碱基对，用阴影标记五碳糖的2’位被取代为OCH3的核苷酸。
K(35)11ArevOM(2-5)：
K(35)11ArevOM(6-8)：
图3中示出各siRNA的基因表达抑制效果。
相较于野生型等位基因，K(35)11Arev更强烈地抑制A突变型等位基因的表达，而K(35)11ArevOM(6-8)对上述两种等位基因的表达抑制效果均增强，且相较于野生型等位基因，更强烈地抑制A突变型等位基因的表达。作为另一个对照的K(35)11ArevOM(2-5)(引导链的第2个至第5个核糖核苷酸中，五碳糖的2’位被OCH3取代)对上述两种等位基因的表达抑制效果均相当弱。
(实施例1-4)
本实施例中示出：若在使siRNA的第11位对应于A突变型等位基因的点突变的位置，且将siRNA的引导链的5’末端的碱基由鸟嘌呤取代为尿嘧啶，并将过客链的5’末端的碱基由尿嘧啶取代为鸟嘌呤的基础上，使siRNA的引导链的第5个或第6个碱基与A突变型等位基因的碱基不匹配，则RNA分子对野生型等位基因的表达抑制能力减弱，其结果，对A突变型等位基因的特异性进一步升高。
作为用于考察基因表达抑制效果的报告基因，使用野生型K报告基因及A突变型K报告基因，作为siRNA，以K(35)11Arev为基础，化学合成使第3～7个碱基不匹配的下述序列的双链RNA，作为对照，使用K(35)11Arev。另外，下述序列中，用□包围对应于点突变的位置的碱基对、引导链及过客链的5’末端的被取代的碱基对以及不匹配的碱基对。
K(35)11ArevM3：
K(35)11ArevM4：
K(35)11ArevM5：
K(35)11ArevM6：
K(35)11ArevM7：
图4中示出各siRNA的基因表达抑制效果。
相较于野生型等位基因，K(35)11Arev更强烈地抑制A突变型等位基因的表达，而关于K(35)11ArevM5及K(35)11ArevM6，RNA分子对野生型等位基因的表达抑制能力非常弱，其结果，对A突变型等位基因的特异性进一步升高。
(实施例1-5)
本实施例中示出：若在使siRNA的第11位对应于A突变型等位基因的点突变的位置，且将siRNA的引导链的5’末端的碱基由鸟嘌呤取代为尿嘧啶，并将过客链的5’末端的碱基由尿嘧啶取代为鸟嘌呤的基础上，在siRNA的引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3、在siRNA的引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3、且使siRNA的引导链的第5个或第6个碱基与A突变型等位基因的碱基不匹配，则对A突变型等位基因的特异性进一步升高。
作为用于考察基因表达抑制效果的报告基因，使用野生型K报告基因及A突变型K报告基因，作为siRNA，以K(35)11Arev为基础，化学合成使第3～7个碱基不匹配的下述序列的双链RNA，作为对照，使用K(35)11Arev。另外，下述序列中，用□包围对应于点突变的位置的碱基对、引导链及过客链的5’末端的被取代的碱基对以及不匹配的碱基对，用阴影标记五碳糖的2’位被取代为OCH3的核苷酸。
K(35)11ArevOM(6-8)M3：
K(35)11ArevOM(6-8)M4：
K(35)11ArevOM(6-8)M5：
K(35)11ArevOM(6-8)M6：
K(35)11ArevOM(6-8)M7：
图5中示出各siRNA的基因表达抑制效果。
关于K(35)11ArevOM(6-8)M5及K(35)11ArevOM(6-8)M6，RNA分子对野生型等位基因的表达抑制能力非常弱，其结果，对A突变型等位基因的特异性进一步升高。
(实施例1-6)
本实施例中示出：对A突变型等位基因表现出特异性的siRNA不仅对野生型等位基因的表达抑制能力低，对T突变型K-ras(c.35G＞T)等位基因及C突变型K-ras(c.35G＞C)等位基因的表达抑制能力也低。
作为用于考察基因表达抑制效果的报告基因，使用下述的为K-ras报告基因的野生型K报告基因、A突变型K报告基因、T突变型K-ras(c.35G＞T)报告基因(以下称作T突变型K报告基因)、C突变型K-ras(c.35G＞C)报告基因(以下称作C突变型K报告基因)，作为siRNA，使用K(35)11ArevOM(6-8)M5及K(35)11ArevOM(6-8)M6，作为对照，使用K(35)11Arev。另外，下述序列中，用□包围对应于点突变的位置的碱基对。
T突变型K报告基因：
C突变型K报告基因：
图6中示出对各报告基因的基因表达抑制效果。
任一siRNA对A突变型K报告基因的表达抑制效果均最强，但尤其是K(35)11ArevOM(6-8)M5及K(35)11ArevOM(6-8)M6对T突变型K报告基因及C突变型K报告基因的表达抑制效果较弱。
(实施例1-7)
本实施例中示出：对T突变型等位基因表现出特异性的siRNA不仅对野生型等位基因的表达抑制能力低，对A突变型等位基因及C突变型等位基因的表达抑制能力也低。
作为用于考察基因表达抑制效果的报告基因，使用为K-ras报告基因的野生型K报告基因、A突变型K报告基因、T突变型T突变型K报告基因、C突变型K报告基因，作为siRNA，使用K(35)11TrevOM(6-8)M5及K(35)11TrevOM(6-8)M6，作为对照，使用K(35)11Trev。另外，下述序列中，用□包围对应于点突变的位置的碱基对、引导链及过客链的5’末端的被取代的碱基对以及不匹配的碱基对，用阴影标记五碳糖的2’位被取代为OCH3的核苷酸。
K(35)11Trev：
K(35)11TrevOM(6-8)M5：
K(35)11TrevOM(6-8)M6：
图7中示出对各报告基因的基因表达抑制效果。
任一siRNA对T突变型K报告基因的表达抑制效果均最强，但尤其是K(35)11TrevOM(6-8)M5及K(35)11TrevOM(6-8)M6对T突变型K报告基因及C突变型K报告基因的表达抑制效果较弱。
(实施例1-8)
本实施例中示出：对C突变型等位基因表现出特异性的siRNA不仅对野生型等位基因的表达抑制能力低，对A突变型等位基因及T突变型等位基因的表达抑制能力也低。
作为用于考察基因表达抑制效果的报告基因，使用下述的为K-ras报告基因的野生型K报告基因、A突变型K报告基因、T突变型T突变型K报告基因、C突变型K报告基因，作为siRNA，使用K(35)11CrevOM(6-8)M5及K(35)11CrevOM(6-8)M6，作为对照，使用K(35)11Crev。另外，下述序列中，用□包围对应于点突变的位置的碱基对、引导链及过客链的5’末端的被取代的碱基对以及不匹配的碱基对，用阴影标记五碳糖的2’位被取代为OCH3的核苷酸。
K(35)11Crev：
K(35)11CrcvOM(6-8)M5：
K(35)11CrevOM(6-8)M6：
图8示出对各报告基因的基因表达抑制效果。
任一siRNA对C突变型K报告基因的表达抑制效果均最强，但尤其是K(35)11CrevOM(6-8)M5及K(35)11CrevOM(6-8)M6对A突变型K报告基因及T突变型K报告基因的表达抑制效果弱。
实施例2
在本实施例中，作为表达被抑制的靶基因，使用N-ras基因。
(实施例2-1)
本实施例中示出：若以N-ras基因的cDNA第35个核苷酸中的点突变为对象，并使siRNA的第11位对应于A突变型N-ras(c.35G＞A)等位基因(以下称作A突变型N35等位基因)的点突变的位置，将siRNA的引导链的5’末端的碱基由胞嘧啶取代为尿嘧啶，将过客链的5’末端的碱基由腺嘌呤取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，且使siRNA的引导链的第5个碱基与A突变型N35等位基因的碱基不匹配，则相较于野生型N-ras(wt)等位基因(以下称作野生型N等位基因)的表达，更特异性地抑制A突变型N35等位基因的表达。
作为用于考察基因表达抑制效果的报告基因，将具有与野生型N等位基因及A突变型N35等位基因相同的碱基序列的DNA插入到表达载体(psiCHECK)的荧光素酶基因的3’-UTR，制作野生型N35报告基因及A突变型N报告基因。将进行化学合成、导入载体的序列示于以下。另外，下述序列中，用□包围对应于点突变的位置的碱基对。
野生型N35报告基因：
A突变型N35报告基因：
作为siRNA，化学合成具有下述序列的双链RNA。N(35)11G具有与野生型N等位基因互补的序列。N(35)11A为使第11个核苷酸对应于A突变型N35等位基因的点突变的位置的siRNA。N(35)11ArevOM(6-8)M5为使第11个核苷酸对应于A突变型N35等位基因的点突变的位置，并将引导链的5’末端的碱基由胞嘧啶取代为尿嘧啶，将过客链的5’末端的碱基由尿嘧啶取代为胞嘧啶，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，且使siRNA的引导链的第5个碱基与A突变型N35等位基因的碱基不匹配的siRNA。另外，下述序列中，用□包围对应于点突变的位置的碱基对、引导链及过客链的5’末端的被取代的碱基对以及不匹配的碱基对，用阴影标记五碳糖的2’位被取代为OCH3的核苷酸。
N(35)11G：
N(35)11A：
N(35)11ArevOM(6-8)M5：
图9中示出各siRNA的基因表达抑制效果。
相较于A突变型N35等位基因的表达，N(35)11G更有效地抑制野生型N等位基因的表达，与之相反，相较于野生型N等位基因的表达，N(35)11A更有效地抑制A突变型N35等位基因的表达。N(35)11ArevOM(6-8)M5对野生型等位基因的表达抑制能力非常弱，而对A突变型N35等位基因的表达抑制能力增强，其结果，对A突变型N35等位基因的特异性升高。
(实施例2-2)
本实施例中示出：若以N-ras基因的cDNA第182个核苷酸中的点突变为对象，使siRNA的第11位对应于A突变型N-ras(c.182A＞G)等位基因(以下称作G突变型N182等位基因)的点突变的位置，并将siRNA的引导链的5’末端的碱基由鸟嘌呤取代为尿嘧啶，将过客链的5’末端的碱基由腺嘌呤取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，且使siRNA的引导链的第5个碱基与G突变型N182等位基因的碱基不匹配，则相较于野生型N-ras(wt)等位基因(以下称作野生型N等位基因)的表达，更特异性地抑制G突变型N182等位基因的表达。
作为用于考察基因表达抑制效果的报告基因，将具有与G突变型N182等位基因相同的碱基序列的DNA插入到表达载体(psiCHECK)的荧光素酶基因的3’-UTR，制作G突变型N182报告基因。将进行化学合成、导入载体中的序列示于以下。
野生型N182报告基因：
G突变型N182报告基因：
作为siRNA，化学合成具有下述序列的双链RNA。N(182)11A具有与野生型N等位基因互补的序列。N(182)11G为使第11个核苷酸对应于G突变型N182等位基因的点突变的位置的siRNA。N(182)11GrevOM(6-8)M5为使第11个核苷酸对应于A182突变型N等位基因的点突变的位置，并将引导链的5’末端的碱基由鸟嘌呤取代为尿嘧啶，将过客链的5’末端的碱基由腺嘌呤取代为鸟嘌呤，在引导链的第6个至第8个核糖核苷酸中将五碳糖的2’位取代为OCH3，且siRNA的引导链的第5个碱基与G突变型182N等位基因的碱基不匹配的siRNA。另外，下述序列中，用□包围对应于点突变的位置的碱基对、引导链及过客链的5’末端的被取代的碱基对以及不匹配的碱基对，用阴影标记五碳糖的2’位被取代为OCH3的核苷酸。
N(182)11A：
N(182)11G:
N(182)11GrevOM(6-8)M5：
图10中示出各siRNA的基因表达抑制效果。
相较于G突变型N182等位基因的表达，N(182)11A更有效地抑制野生型N182等位基因的表达，与之相反，相较于野生型N182等位基因的表达，N(182)11G更有效地抑制A突变型N182等位基因的表达。N(182)11ArevOM(6-8)M5对野生型等位基因的表达抑制能力消失，对G突变型N182等位基因的表达抑制能力稍微减弱，其结果，对G突变型182等位基因的特异性升高。
实施例3
本实施例中示出：将表2所示的各种基因用作表达被抑制的靶基因，通过本发明公开的方法设计的siRNA抑制来自突变型等位基因的表达，而不会抑制来自野生型等位基因的表达。
首先，作为用于考察基因表达抑制效果的报告基因，化学合成具有与各野生型基因(wt)等位基因及各突变型基因等位基因相同的碱基序列的DNA，并插入到表达载体(psiCHECK)的荧光素酶基因的3’-UTR，制作野生型报告基因及突变型报告基因。将导入到载体中的部分的序列分别示于表2。
表中，在碱基序列中，小写字母为用于键合于载体的序列，大写字母为来自基因的序列。此外，K-ras基因的括号表示突变型的种类，HTT基因的括号表示基因组上的位置，其他基因的括号表示从翻译起始位置(即，起始密码子ATG的A)开始计数的顺位。另外，P表示过客链，G表示引导链。
[表2]
/>
关于siRNA，使各基因的第11个碱基对应于各突变型等位基因的点突变的位置，在siRNA的引导链的第6～8个核糖核苷酸中，将五碳糖的2’位取代为OCH3，且使siRNA的引导链的第6个碱基与突变型等位基因的碱基不匹配。此外，如表3所示地取代siRNA的引导链的5’末端及过客链的5’末端。
[表3]
关于各基因，使用表2中记载的报告基因，并使用表4及5中记载的siRNA，使用上述方法进行报告基因检测。
[表4]
[表5]
/>
将其结果示于图11～35，对于任一基因，各siRNA虽然均几乎未抑制来自野生型等位基因的表达，但以浓度依赖的方式抑制了来自突变型等位基因的表达。
工业实用性
通过本发明，能够提供新型的RNA分子、新型的嵌合体型NA分子、新型的双链RNA分子及新型的双链嵌合体型NA分子。
序列表
<110> 国立大学法人东京大学
<120> RNA分子、嵌合体型NA分子、双链RNA分子及双链嵌合体型NA分子
<130> 4252PCT
<160> 239
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 1
gggagcugau ggccuaggaa a 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> (6)...(8) 2'-O-甲基修饰
<400> 2
uccuaggcca ucagcuccca c 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> (6) 和 (8) 2'-O-甲基修饰
<400> 3
uccuaggcca ucagcuccca c 21
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因正链
<400> 4
tggtagttgg agctggtggc gtaggcaaga gtg 33
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因负链
<400> 5
cactcttgcc tacgccacca gctccaacta cca 33
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因正链
<400> 6
tggtagttgg agctgatggc gtaggcaaga gtg 33
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因负链
<400> 7
cactcttgcc tacgccatca gctccaacta cca 33
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 8
guuggagcug auggcguagt t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
<400> 9
cuacgccauc agcuccaact t 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 10
uuggagcuga uggcguaggc a 21
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
<400> 11
ccuacgccau cagcuccaac u 21
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 12
uggagcugau ggcguaggca a 21
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
<400> 13
gccuacgcca ucagcuccaa c 21
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 14
gggagcugau ggcguaggaa a 21
<210> 15
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
<400> 15
uccuacgcca ucagcuccca c 21
<210> 16
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 16
gggagcugau ggcguaggaa a 21
<210> 17
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
(2)...(5) 2'-O-甲基修饰
<400> 17
uccuacgcca ucagcuccca c 21
<210> 18
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 18
gggagcugau ggcguaggaa a 21
<210> 19
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
(6)...(8) 2'-O-甲基修饰
<400> 19
uccuacgcca ucagcuccca c 21
<210> 20
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 20
gggagcugau ggcguacgaa a 21
<210> 21
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
<400> 21
ucguacgcca ucagcuccca c 21
<210> 22
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 22
gggagcugau ggcguuggaa a 21
<210> 23
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
<400> 23
uccaacgcca ucagcuccca c 21
<210> 24
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 24
gggagcugau ggcgaaggaa a 21
<210> 25
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
<400> 25
uccuucgcca ucagcuccca c 21
<210> 26
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 26
gggagcugau ggccuaggaa a 21
<210> 27
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
<400> 27
uccuaggcca ucagcuccca c 21
<210> 28
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 28
gggagcugau gggguaggaa a 21
<210> 29
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
<400> 29
uccuacccca ucagcuccca c 21
<210> 30
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 30
gggagcugau ggcguacgaa a 21
<210> 31
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
(6)...(8) 2'-O-甲基修饰
<400> 31
ucguacgcca ucagcuccca c 21
<210> 32
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 32
gggagcugau ggcguuggaa a 21
<210> 33
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
(6)...(8) 2'-O-甲基修饰
<400> 33
uccaacgcca ucagcuccca c 21
<210> 34
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 34
gggagcugau ggcgaaggaa a 21
<210> 35
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
(6)...(8) 2'-O-甲基修饰
<400> 35
uccuucgcca ucagcuccca c 21
<210> 36
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 36
gggagcugau ggccuaggaa a 21
<210> 37
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
(6)...(8) 2'-O-甲基修饰
<400> 37
uccuaggcca ucagcuccca c 21
<210> 38
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 38
gggagcugau gggguaggaa a 21
<210> 39
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
(6)...(8) 2'-O-甲基修饰
<400> 39
uccuacccca ucagcuccca c 21
<210> 40
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因正链
<400> 40
tggtagttgg agctgttggc gtaggcaaga gtg 33
<210> 41
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因负链
<400> 41
cactcttgcc tacgccaaca gctccaacta cca 33
<210> 42
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因正链
<400> 42
tggtagttgg agctgctggc gtaggcaaga gtg 33
<210> 43
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因负链
<400> 43
cactcttgcc tacgccagca gctccaacta cca 33
<210> 44
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 44
gggagcuguu ggcguaggaa a 21
<210> 45
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
<400> 45
uccuacgcca acagcuccca c 21
<210> 46
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 46
gggagcuguu ggcgaaggaa a 21
<210> 47
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
(6)...(8) 2'-O-甲基修饰
<400> 47
uccuucgcca acagcuccca c 21
<210> 48
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 48
gggagcuguu ggccuaggaa a 21
<210> 49
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
(6)...(8) 2'-O-甲基修饰
<400> 49
uccuaggcca acagcuccca c 21
<210> 50
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 50
gggagcugcu ggcguaggaa a 21
<210> 51
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
<400> 51
uccuacgcca gcagcuccca c 21
<210> 52
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 52
gggagcugcu ggcgaaggaa a 21
<210> 53
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
(6)...(8) 2'-O-甲基修饰
<400> 53
uccuucgcca gcagcuccca c 21
<210> 54
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 54
gggagcugcu ggccuaggaa a 21
<210> 55
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
(6)...(8) 2'-O-甲基修饰
<400> 55
uccuaggcca gcagcuccca c 21
<210> 56
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因正链
<400> 56
actggtggtg gttggagcag gtggtgttgg gaaaagcgca 40
<210> 57
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因负链
<400> 57
tgcgcttttc ccaacaccac cagctccaac caccaccagt 40
<210> 58
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因正链
<400> 58
actggtggtg gttggagcag atggtgttgg gaaaagcgca 40
<210> 59
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因负链
<400> 59
tgcgcttttc ccaacaccat cagctccaac caccaccagt 40
<210> 60
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 60
uggagcaggu gguguuggga a 21
<210> 61
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
<400> 61
cccaacacca ccugcuccaa c 21
<210> 62
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 62
uggagcagau gguguuggga a 21
<210> 63
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
<400> 63
cccaacacca ucugcuccaa c 21
<210> 64
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 64
cggagcagau ggugauggaa a 21
<210> 65
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
(6)...(8) 2'-O-甲基修饰
<400> 65
uccaucacca ucugcuccga c 21
<210> 66
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因正链
<400> 66
catactggat acagctggac aagaagagta cagtgcca 38
<210> 67
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因负链
<400> 67
tggcactgta ctcttcttgt ccagctgtat ccagtatg 38
<210> 68
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因正链
<400> 68
catactggat acagctggac gagaagagta cagtgcca 38
<210> 69
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因负链
<400> 69
tggcactgta ctcttctcgt ccagctgtat ccagtatg 38
<210> 70
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 70
agcuggacaa gaagaguaca g 21
<210> 71
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
<400> 71
guacucuucu uguccagcug u 21
<210> 72
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 72
agcuggacga gaagaguaca g 21
<210> 73
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
<400> 73
guacucuucu cguccagcug u 21
<210> 74
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA正链
<400> 74
ggcuggacga gaaguguaaa g 21
<210> 75
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA负链
(6)...(8) 2'-O-甲基修饰
<400> 75
uuacacuucu cguccagccg u 21
<210> 76
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 76
tcgaggttaa gagatcccca cagtacttca acgctagaag aacacag 47
<210> 77
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
<400> 77
aattctgtgt tcttctagcg ttgaagtact gtggggatct cttaacc 47
<210> 78
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 78
tcgaggttaa gagatcccca cagtaattca acgctagaag aacacag 47
<210> 79
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
<400> 79
aattctgtgt tcttctagcg ttgaattact gtggggatct cttaacc 47
<210> 80
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 80
tcgagccgga gcctttggaa gtctgcgccc ttgtgccctg cctccag 47
<210> 81
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
<400> 81
aattctggag gcagggcaca agggcgcaga cttccaaagg ctccggc 47
<210> 82
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 82
tcgagccgga gcctttggaa gtctgtgccc ttgtgccctg cctccag 47
<210> 83
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
<400> 83
aattctggag gcagggcaca agggcacaga cttccaaagg ctccggc 47
<210> 84
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 84
tcgagcccac gcctgctccc tcatctactg tgtgcacttc atcctgg 47
<210> 85
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
<400> 85
aattccagga tgaagtgcac acagtagatg agggagcagg cgtgggc 47
<210> 86
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 86
tcgagcccac gcctgctccc tcatccactg tgtgcacttc atcctgg 47
<210> 87
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
<400> 87
aattccagga tgaagtgcac acagtggatg agggagcagg cgtgggc 47
<210> 88
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 88
tcgagagcag cagcagcagc agcaggggga cctatcagga cagagtg 47
<210> 89
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
<400> 89
aattcactct gtcctgatag gtccccctgc tgctgctgct gctgctc 47
<210> 90
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 90
tcgagagcag cagcagcagc agcagcggga cctatcagga cagagtg 47
<210> 91
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
<400> 91
aattcactct gtcctgatag gtcccgctgc tgctgctgct gctgctc 47
<210> 92
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 92
tcgagtgctg gagaccatcc actggcgtgg gcagatccgt catttcg 47
<210> 93
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
<400> 93
aattcgaaat gacggatctg cccacgccag tggatggtct ccagcac 47
<210> 94
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 94
tcgagtgctg gagaccatcc actggtgtgg gcagatccgt catttcg 47
<210> 95
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
<400> 95
aattcgaaat gacggatctg cccacagcag tggatggtct ccagcac 47
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 96
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
<400> 97
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<400> 98
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<223> 报告基因反义链
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aattcgaagt agcctcccac gatgaacacc aggccgattg gggccac 47
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<223> 报告基因反义链
<400> 109
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<220>
<223> 报告基因有义链
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 114
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<220>
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<220>
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<400> 118
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<212> DNA
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<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 124
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<220>
<223> 报告基因反义链
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<223> 报告基因反义链
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<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 128
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
<400> 129
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 130
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
<400> 131
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 132
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
<400> 133
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 134
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 136
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<220>
<223> 报告基因反义链
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<220>
<223> 报告基因有义链
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<220>
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<220>
<223> 报告基因有义链
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
<400> 141
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 142
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 144
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<212> DNA
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<220>
<223> 报告基因反义链
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 146
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
<400> 147
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 148
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<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
<400> 149
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 150
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 152
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
<400> 153
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 154
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
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<212> DNA
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<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 156
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
<400> 157
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<212> DNA
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<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 158
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<220>
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<400> 159
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<212> DNA
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<223> 报告基因有义链
<400> 160
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 162
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 164
tcgagtcccc tccatcatga atgtggtgct ggtgtgtctc atcttcg 47
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<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
<400> 165
aattcgaaga tgagacacac cagcaccaca ttcatgatgg aggggac 47
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 166
tcgagacatc attggtgcct ccagcgactg cagcacctgc tttgtgg 47
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<212> DNA
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<220>
<223> 报告基因反义链
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<212> DNA
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<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 168
tcgagacatc attggtgcct ccagctactg cagcacctgc tttgtgg 47
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<212> DNA
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<220>
<223> 报告基因反义链
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<223> 报告基因反义链
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<212> DNA
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<220>
<223> 报告基因有义链
<400> 172
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<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告基因反义链
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aattccttgt cgatgaagga ggcaaccttg ttgttgaggg tcttgac 47
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> siRNA
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<210> 175
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 175
uagcguugaa guacuguggg g 21
<210> 176
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 176
gaagucugcg cccuugugcc c 21
<210> 177
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 177
gcacaagggc gcagacuucc a 21
<210> 178
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 178
cccucaucua cugugugcac u 21
<210> 179
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 179
ugcacacagu agaugaggga g 21
<210> 180
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 180
agcagcaggg ggaccuauca g 21
<210> 181
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 181
agcagcaggg ggaccuauca g 21
<210> 182
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 182
uccacuggcg ugggcagauc c 21
<210> 183
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 183
aucugcccac gccaguggau g 21
<210> 184
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 184
gugccacuac cacagcuccu u 21
<210> 185
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 185
ggagcugugg uaguggcacc a 21
<210> 186
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 186
gcugcugacg ggcacaccgc u 21
<210> 187
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 187
cggugugccc gucagcagca g 21
<210> 188
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 188
gccuggugcu caucguggga g 21
<210> 189
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 189
cccacgauga gcaccaggcc g 21
<210> 190
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 190
gcacaguaau ucaucgcuag a 21
<210> 191
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 191
uagcgaugaa uuacugugcg g 21
<210> 192
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 192
gaagucugug cccaugugac c 21
<210> 193
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 193
ucacaugggc acagacuucc a 21
<210> 194
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 194
gccucaucca cugagugcac u 21
<210> 195
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 195
ugcacucagu ggaugaggca g 21
<210> 196
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 196
ggcagcagcg ggagcuauaa g 21
<210> 197
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 197
uauagcuccc gcugcugccg c 21
<210> 198
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 198
gccacuggug uggccagaac c 21
<210> 199
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 199
uucuggccac accaguggcu g 21
<210> 200
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 200
gugccacugc cacugcucau u 21
<210> 201
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 201
ugagcagugg caguggcacc a 21
<210> 202
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 202
gcugcugaug ggcucaccac u 21
<210> 203
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 203
uggugagccc aucagcagca g 21
<210> 204
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 204
gccugguguu caugguggaa g 21
<210> 205
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 205
gccaccauga acaccaggcc g 21
<210> 206
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 206
gggcuuccuc aacauacaag u 21
<210> 207
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 207
uuguauguug aggaagcccg g 21
<210> 208
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 208
gcuuccacaa gcgcuuccaa u 21
<210> 209
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 209
uggaagcgcu uguggaagcu g 21
<210> 210
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 210
ggagcagccg gccgagcuac g 21
<210> 211
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 211
uagcucggcc ggcugcuccu c 21
<210> 212
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 212
gcacgugugu cccagagaac a 21
<210> 213
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 213
uucucuggga cacacgugcg g 21
<210> 214
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 214
gcagcaaccc ccucagccag u 21
<210> 215
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 215
uggcugaggg gguugcugca g 21
<210> 216
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 216
gcacguccug ggacgcggaa g 21
<210> 217
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 217
uccgcguccc aggacgugcu u 21
<210> 218
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 218
gccaggggga augacuccac c 21
<210> 219
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 219
uggagucauu cccccuggcu c 21
<210> 220
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 220
ggcagcggcg gcuccgggag g 21
<210> 221
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 221
ucccggagcc gccgcugccg c 21
<210> 222
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 222
gcgcagccac uuccaguaac c 21
<210> 223
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 223
uuacuggaag uggcugcgca c 21
<210> 224
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 224
ggguggccuc ggcguaagac c 21
<210> 225
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 225
ucuuacgccg aggccacccg g 21
<210> 226
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 226
gaguucucug agcuuugaag a 21
<210> 227
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 227
uucaaagcuc agagaacucu g 21
<210> 228
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 228
gagcacacag ucuacaguaa a 21
<210> 229
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 229
uacuguagac ugugugcucu u 21
<210> 230
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 230
gcagcccagg accgggacac c 21
<210> 231
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 231
ugucccgguc cugggcugcg g 21
<210> 232
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 232
ggacccggac gccguggacc a 21
<210> 233
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 233
uccagcugcc acaggccccg g 21
<210> 234
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 234
ggaauguggu gcucguguau c 21
<210> 235
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 235
uacacgagca ccacauuccu g 21
<210> 236
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 236
gcuccagcua cuggagcaac u 21
<210> 237
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 237
uugcuccagu agcuggagcc a 21
<210> 238
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 238
gcaacaaggu ugcguccuac a 21
<210> 239
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 239
uaggacgcaa ccuuguugcu g 21
Claims (17)
1.一种RNA分子，其用于以相对于基因的野生型等位基因具有一个碱基的点突变的突变型等位基因为靶基因的RNA干涉法，
所述RNA分子满足以下的要件：
(1)具有除下述(2-1)中规定的碱基以外与所述突变型等位基因的编码区互补的碱基序列；
(2)从与所述突变型等位基因互补的碱基序列的最靠近5’侧的碱基开始计数，
(2-1)第5个或第6个碱基与所述突变型等位基因的碱基不匹配；
(2-2)第10位或第11位对应于所述点突变的位置，第10个或第11个碱基对应于所述突变型等位基因所具有的碱基；及
(2-3)在第6-8个或第7-8个核糖核苷酸中，五碳糖的2’位被OCH3、卤素或LNA修饰，
所述基因选自由HTT基因、ATXN3基因、ZMYM3基因、CTNNB1基因、SMARCA4基因、SMO基因、AR基因、DNM2基因、KRT14基因、IL4R基因、MAPT基因、MS4A2基因、PABPN1基因、RHO基因、SCNIA基因、APOB基因、F12基因、CLCN7基因、SCN8A基因、PCSK9基因及KRT6A基因组成的组中。
2.根据权利要求1所述的RNA分子，其中，所述卤素为F。
3.根据权利要求1或2所述的RNA分子，其中，当权利要求1的(1)中规定的碱基序列的5’末端的碱基为胞嘧啶或鸟嘌呤时，该碱基被腺嘌呤或尿嘧啶取代。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的RNA分子，其中，当权利要求1的(1)中规定的碱基序列的3’末端的碱基为腺嘌呤或尿嘧啶时，该碱基被胞嘧啶或鸟嘌呤取代。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的RNA分子，其由13～28个核苷酸构成。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的RNA分子，其在权利要求1的(1)中规定的碱基序列的3’末端进一步具有1～3个核苷酸。
7.一种嵌合体型NA分子，其通过将权利要求1～6中任一项所述的RNA分子中的一个或多个核糖核苷酸取代为脱氧核糖核苷酸、人工核酸或核酸类似物而成。
8.一种双链RNA分子，其中，权利要求1～5中任一项所述的RNA分子为引导链，具有与所述RNA分子互补的序列的RNA分子为过客链。
9.根据权利要求8所述的双链RNA分子，其中，在引导链的3’末端和/或过客链的3’末端具有单链突出端部分。
10.根据权利要求9所述的双链RNA分子，其中，所述单链突出端部分由1～3个核苷酸构成。
11.一种双链嵌合体型NA分子，其通过将权利要求8～10中任一项所述的双链RNA分子中的一个或多个核糖核苷酸取代为脱氧核糖核苷酸、人工核酸或核酸类似物而成。
12.一种在RNA干涉法中用作引导链的RNA分子的制备方法，其包括制备权利要求1～6中任一项所述的RNA分子的工序。
13.一种在RNA干涉法中用作引导链的嵌合体型NA分子的制备方法，其包括制备权利要求7所述的嵌合体型NA分子的工序。
14.一种RNA干涉法，其为在具备基因的野生型等位基因与具有一个碱基的点突变的所述基因的突变型等位基因的细胞中，以所述突变型等位基因为靶基因的RNA干涉法，其包括：
将权利要求1～6中任一项所述的RNA分子、权利要求7所述的嵌合体型NA分子、权利要求8～10中任一项所述的双链RNA分子或权利要求11所述的双链嵌合体型NA分子导入所述细胞的工序。
15.一种治疗药物或预防药物，其为用于具备致病基因的野生型等位基因与具有一个碱基的点突变的所述致病基因的突变型等位基因，且所述致病基因的突变型等位基因为原因的疾病的患者的治疗药物或携带者的预防药物，其中，
所述治疗药物或预防药物以权利要求1～6中任一项所述的RNA分子、权利要求7所述的嵌合体型NA分子、权利要求8～10中任一项所述的双链RNA分子或权利要求11所述的双链嵌合体型NA分子为有效成分。
16.根据权利要求15所述的治疗药物，其中，所述疾病为三联体重复序列疾病、遗传性疾病或肿瘤。
17.一种RNA分子、嵌合体型NA分子、双链RNA分子或双链嵌合体型NA分子的筛选方法，其为筛选在用于抑制靶基因的RNA干涉法中使用的RNA分子、嵌合体型NA分子、双链RNA分子或双链嵌合体型NA分子的方法，其包括：
分别使用多个权利要求1～6中任一项所述的RNA分子、权利要求7所述的嵌合体型NA分子、权利要求8～10中任一项所述的双链RNA分子或权利要求11所述的双链嵌合体型NA分子在体外进行权利要求11的RNA干涉法，由此考察所述多个RNA分子、嵌合体型NA分子、双链RNA分子或双链嵌合体型NA分子对所述靶基因的特异性抑制基因表达的能力的工序；及
筛选所述特异性抑制基因表达的能力为规定水平以上的RNA分子、嵌合体型NA分子、双链RNA分子或双链嵌合体型NA分子的工序。
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