CN116916908A - 用于保持治疗化合物完整性的edta和egta - Google Patents

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Abstract

本发明涉及保持肠道中肽的完整性的方法。特别地，本发明涉及某些化合物作为肠道蛋白酶抑制剂的用途。

Description

用于保持治疗化合物完整性的EDTA和EGTA
发明领域
本发明涉及保持肠道中治疗化合物的完整性的方法。特别地，本发明涉及某些化合物作为肠道蛋白酶抑制剂的用途。
背景技术
以下论述仅旨在促进对本发明的理解。所述论述并不认可或承认所提及的任何材料是或曾经是截至申请的优先权日的公知常识的一部分。
肽，并且特别是例如蛋白质的多肽日益被认为是治疗肠道(胃肠道)中出现的疾病的理想药剂。蛋白质疗法通常基于具有悠久药用历史的天然产物，它们比新合成并且对身体的影响在很大程度上未知的小分子具有更高的安全性。此外，蛋白质可表现出高度的特异性和选择性，同时可被设计成利用其大尺寸来显示多功能性，使它们能够同时与两个或更多个不同的靶标相互作用。
具有抗氧化活性的蛋白质，例如超氧化物歧化酶是此类治疗应用的实例。其它实例是单克隆抗体，其可通过与侵入肠道的感染性生物体上的位点结合来充当抗感染剂。或者，此类抗体可结合肠细胞上的受体位点并干扰感染性生物体的粘附过程和定殖。另外，这些抗体可与免疫系统的细胞相互作用，以刺激其对抗传染病的活性。其它类型的治疗肽包括肽激素，例如食欲抑制剂。
在肠中使用肽的一个重要缺点是它们对肠道蛋白酶极度敏感。这些蛋白酶可在胃(例如胃蛋白酶)和上肠中找到，并且已进化至使消化道能够通过蛋白水解将作为食物摄入的肽分解成氨基酸，所述氨基酸可通过受体介导的机制作为营养物质吸收。肠道蛋白酶的列表中包括丝氨酸蛋白酶。
如果治疗性或预防性肽的预期作用部位是小肠，则可通过将其放入以下各者来保护肽免于在胃中分解：肠溶胶囊、片剂或其它装置，其在胃中发现的低pH下抵抗溶解，但在较高pH下崩解，以将肽释放至小肠，例如十二指肠、空肠或回肠中。然而，小肠中发现的蛋白酶(特别是丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶)的作用是，一旦肽从此类装置中释放出来，它们就可以迅速分解和破坏肽。这显然限制了经口施用的治疗肽的功效，而防止其被胰蛋白酶降解的方法将显著增强其性能。
尽管本领域技术人员已知有许多充当蛋白酶抑制剂的试剂，但很少有试剂(如果有的话)适合此特定应用。大多数已知的抑制剂，例如抗痛素、亮肽素仅用于研究目的，并且不适合人类施用。一些抑制剂，例如氟磷酸二异丙酯或苯甲基磺酰氟具有很高的效力，但表现出非常广泛的特异性，因此，它们有在除肠道之外的不期望身体部位发挥作用的风险。另一方面，其它抑制剂，例如用于治疗HIV的新型蛋白酶抑制剂所抑制的蛋白酶的选择性非常高，因此对肠道中的丝氨酸蛋白酶没有影响。
已施用于人类的两种丝氨酸蛋白酶抑制剂是抑肽酶和大豆胰蛋白酶抑制剂。然而，这些抑制剂的合成相对昂贵，并且必须以使得最终产品的成本将阻碍日常使用药物的制造的高水平包含于药物中。
本发明寻求提供一种作为蛋白酶抑制剂的替代剂，其至少改善与现有技术的蛋白酶抑制剂相关的一个或多个问题。
发明内容
本发明人已发现迄今为止未知的普遍应用原理。令人惊讶的是，其已确定某些化合物可抑制肠道蛋白酶，而所述化合物与肠道蛋白酶的相互作用先前从未被认识到。此发现提供了使用这些化合物作为治疗化合物的保护剂的迄今为止未知的应用，所述治疗化合物例如来自蛋白水解(即，通过肠道蛋白酶，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、二肽基肽酶4(DPP4)和弹性蛋白酶降解)的肽。
本发明人已发现，EDTA或EGTA无论在存在或不存在钙或镁的情况下都表现出抑制胰蛋白酶的显著活性，胰蛋白酶是一种在哺乳动物肠中发现的众所周知的丝氨酸蛋白酶。本发明人还发现，单独的EDTA或EGTA或在钙或镁的存在下也表现出抑制其它丝氨酸蛋白酶，例如糜蛋白酶和弹性蛋白酶的显著活性。这种抑制活性预计还会抑制丝氨酸蛋白酶DPP4。此发现为抑制丝氨酸蛋白酶的活性提供了新的方法。
本文所述的试剂的活性与这些分子的螯合能力无关，因为(i)丝氨酸蛋白酶，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶和DPP4的功能不依赖于金属离子的存在，金属离子可通过螯合去除，(ii)与EDTA或EGTA具有相似螯合活性的试剂未表现出抑制作用，并且(iii)EDTA和EGTA在存在或不存在某些金属离子的情况下都起作用。
有人提议本文所述的发明可用于药物配制物中或与药物配制物一起使用，其中需要抑制胰蛋白酶样蛋白酶以用于有效治疗疾病，例如凝血级联疾病；用于减轻蛇咬伤或蜘蛛毒液的致病性后遗症；用于减少炎症的局部影响；用于对抗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的影响(例如在肺中)；用于避免因胰腺疾病引起的胰蛋白酶浓度增加的局部副作用；以及用于保护引入肠中的治疗化合物，包括治疗蛋白质免受蛋白酶的影响。
在第一方面，本发明提供用于抑制丝氨酸蛋白酶活性的包含EDTA和/或EGTA的组合物。在本发明的此方面的优选实施方案中，组合物抑制丝氨酸蛋白酶活性以保持肠道中一种或多种治疗化合物的完整性。
在第二方面，本发明提供包含EDTA和/或EGTA以及金属离子的组合物，其中金属离子与EDTA或EGTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:2、1:1、1:0.5、1:0.25。在另一优选实施方案中，金属离子为钙或镁。
在一个替代的优选实施方案中，本发明的此方面提供包含EDTA或EGTA或其药学上可接受的盐(优选钙盐)的组合物，其在患者的肠中产生浓度为0.1至10mg/ml的EDTA或EGTA，或其药学上可接受的盐(优选钙盐)。优选地，浓度为0.15至10mg/ml，更优选地，浓度为0.2至5mg/ml或0.2至1mg/ml，或甚至更优选地，浓度为0.2至0.3mg/ml。因此，例如，在含有大约100mg易于溶解在位于肠腔中的1ml或更少液体中的固体粉末赋形剂的胶囊中，可提供0.2至10mg的EDTA或EGTA。
在另一优选实施方案中，本发明的此方面提供包含鹅去氧胆酸盐和/或没食子酸丙酯、EDTA或EGTA或其药学上可接受的盐(优选钙盐)的组合物，其在患者的肠中产生浓度为0.1至10mg/ml的EDTA或EGTA，或其药学上可接受的盐(优选钙盐)。优选地，浓度为0.15至10mg/ml，更优选地，浓度为0.2至5mg/ml或0.2至1mg/ml，或甚至更优选地，浓度为0.2至0.3mg/ml。因此，例如，在含有大约100mg易于溶解在位于肠腔中的1ml或更少液体中的固体粉末赋形剂的胶囊中，可提供0.2至10mg的EDTA或EGTA。
在第三方面，本发明提供包含EDTA和/或EGTA以及金属离子的药物或治疗组合物，其中金属离子与EDTA或EGTA的摩尔比为至少1:1。优选地，金属离子与EDTA或EGTA的摩尔比范围为1:2至1:1、1:0.5、1:0.25。在另一优选实施方案中，金属离子为钙或镁。
在一个替代实施方案中，本发明提供一种药物或治疗组合物，其包含EDTA和/或EGTA和金属离子，其中金属离子与EDTA或EGTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:2至1:1、1:0.5、1:0.25，以及治疗有效量的鹅去氧胆酸盐和/或没食子酸丙酯。在高度优选的实施方案中，金属离子为钙或镁。
在第四方面，本发明提供包含EDTA和/或EGTA以及钙的组合物的用途，其中钙与EDTA或EGTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:2、1:1、1:0.5、1:0.25，所述组合物用于制造供治疗需要抑制胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶的病痛用的药物。例如，药物用于治疗凝血级联疾病；用于减轻蛇咬伤或蜘蛛毒液的致病性后遗症；用于减少炎症的局部影响；用于对抗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的影响(例如在肺中)；用于避免因胰腺疾病引起的胰蛋白酶浓度增加的局部副作用；以及用于保护引入肠中的治疗化合物，例如治疗蛋白质免受蛋白酶的影响。
在一个替代的优选方面，本发明提供包含EDTA和/或EGTA以及镁的组合物的用途，其中镁与EDTA或EGTA的摩尔比为至少1:1，所述组合物用于制造供治疗需要抑制胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶的病痛用的药物。例如，药物用于治疗凝血级联疾病；用于减轻蛇咬伤或蜘蛛毒液的致病性后遗症；用于减少炎症的局部影响；用于对抗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的影响(例如在肺中)；用于避免因胰腺疾病引起的胰蛋白酶浓度增加的局部副作用；以及用于保护引入肠中的治疗化合物，例如治疗蛋白质免受蛋白酶的影响。
在一个替代的优选方面，本发明提供包含治疗有效量的鹅脱氧胆酸盐和/或没食子酸丙酯、EDTA和/或EGTA、以及钙或镁的组合物的用途，其中钙或镁与EDTA或EGTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:2、1:1、1:0.5、1:0.25，所述组合物用于制备供治疗需要抑制胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶的病痛用的药物。例如，药物用于治疗凝血级联疾病；用于减轻蛇咬伤或蜘蛛毒液的致病性后遗症；用于减少炎症的局部影响；用于对抗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的影响(例如在肺中)；用于避免因胰腺疾病引起的胰蛋白酶浓度增加的局部副作用；以及用于保护引入肠中的治疗化合物，例如治疗蛋白质免受蛋白酶的影响。
在一个替代的优选形式中，本发明的此方面提供(i)治疗化合物；和(ii)EDTA或EGTA或其钙盐在药物制造中的用途，其中所述EDTA或EGTA以产生0.15至10mg/ml浓度的水平存在于组合物中并且配制所述组合物用于治疗需要抑制丝氨酸蛋白酶，包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶和DPP4的病痛。
在第五方面，本发明提供包含EDTA和/或EGTA以及钙的组合物的用途，其中钙与EDTA或EGTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:2、1:1、1:0.5、1:0.25，所述组合物用于制造供治疗病痛用的药物，其中所述药物包含治疗化合物并且所述组合物以保护所述治疗化合物免受肠中的蛋白酶影响的量存在。
在一个替代的优选实施方案中，本发明的此方面提供：(i)治疗化合物；和(ii)EDTA或EGTA或其钙盐在药物制造中的用途，其中所述EDTA或EGTA以产生0.15至10mg/ml的EDTA或EGTA浓度的水平存在于组合物中，并且组合物被配制用于在肠道中递送化合物。优选地，EDTA或EGTA浓度为0.15至10mg/ml，更优选为0.2至5mg/ml或0.2至1mg/ml，或甚至更优选为0.2至0.3mg/ml。
在一个替代的优选实施方案中，本发明的此方面提供：(i)治疗化合物；(ii)治疗有效量的鹅去氧胆酸盐和/或没食子酸丙酯，和(iii)EDTA或EGTA或其钙盐在药物制造中的用途，其中所述EDTA或EGTA以产生0.15至10mg/ml的EDTA或EGTA浓度的水平存在于组合物中，并且组合物被配制用于在肠道中递送化合物。优选地，EDTA或EGTA浓度为0.15至10mg/ml，更优选为0.2至5mg/ml或0.2至1mg/ml，或甚至更优选为0.2至0.3mg/ml。
在第六方面，本发明提供治疗罹患病痛的受试者的方法，其中所述受试者的治疗受到丝氨酸蛋白酶(包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶或DPP4)的抑制的影响，所述方法包括以下步骤：向受试者施用包含EDTA和/或EGTA以及钙或镁的组合物，其中钙或镁与EDTA或EGTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:2、1:1、1:0.5、1:0.25。优选地，以药学或治疗有效量提供组合物。
在一个替代的优选实施方案中，本发明的此方面提供治疗罹患病痛的受试者的方法，其中所述受试者的治疗受到丝氨酸蛋白酶(包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶或DPP4)的抑制的影响，所述方法包括以下步骤：向受试者施用EDTA或EGTA或其钙盐，其中所述EDTA或EGTA以产生0.15至10mg/ml的EDTA或EGTA浓度的水平存在于组合物中。
在第七方面，本发明提供治疗罹患病痛的受试者的方法，所述治疗包括向受试者施用治疗化合物以治疗所述病痛，并且基本上同时施用包含EDTA和/或EGTA以及钙或镁的治疗上或药学上可接受的组合物，其中钙或镁与EDTA或EGTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:2、1:1、1:0.5、1:0.2，其中所述组合物以保护所述治疗化合物免受肠中至少丝氨酸蛋白酶影响的量存在。
在一个替代的优选实施方案中，本发明的此方面提供治疗罹患病痛的受试者的方法，所述治疗包括向受试者施用治疗化合物以治疗病痛，并且基本上同时施用治疗上或药学上可接受的组合物，所述组合物包含EDTA或EGTA或其钙盐，其中所述EDTA或EGTA以产生0.15至10mg/ml的浓度的水平存在于组合物中，并且所述组合物被配制用于在肠道中递送所述化合物。
在一个替代的优选实施方案中，本发明的此方面提供治疗罹患病痛的受试者的方法，所述治疗包括向受试者施用治疗化合物以治疗病痛，并且基本上同时施用治疗上或药学上可接受的组合物，所述组合物包含EDTA或EGTA或其钙盐、治疗有效量的鹅去氧胆酸盐和/或没食子酸丙酯，其中所述EDTA或EGTA以产生0.15至10mg/ml的浓度的水平存在于组合物中，并且所述组合物被配制用于在肠道中递送所述化合物。
根据下面结合附图对示例性实施方案的描述，本发明的这些和/或其它方面将变得显而易见并且更容易理解。
附图说明
本公开将参考以下附图在以下优选实施方案的描述中提供细节，其中：
图1：在存在钙离子的情况下不同浓度的EDTA对胰蛋白酶活性的抑制。
图2：在存在和不存在钙离子的情况下不同浓度的EGTA对胰蛋白酶活性的抑制。
图3：在存在钙离子的情况下不同浓度的EGTA和菲咯啉对胰蛋白酶活性的影响。
图4：在存在钙离子的情况下不同浓度的EDTA对糜蛋白酶活性的抑制。
具体实施方式
本发明人已发现，单独的EDTA或EGTA或者当存在钙或镁时表现出显著的抑制丝氨酸蛋白酶的活性，所述丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶或DPP4，即在哺乳动物肠中发现的众所周知的丝氨酸蛋白酶。此发现为抑制丝氨酸蛋白酶的活性提供了新的方法。
本文所述的试剂的活性与这些分子的螯合能力无关，因为(i)丝氨酸蛋白酶(例如胰蛋白酶)的功能不依赖于金属离子的存在，金属离子可通过螯合去除，(ii)与EDTA或EGTA具有相似螯合活性的试剂未表现出抑制作用，并且(iii)EDTA和EGTA在存在或不存在某些金属离子的情况下都起作用。特别地，本发明人已了解到，在所要求的摩尔比下，EDTA不仅去除钙，而且降低丝氨酸蛋白酶(例如胰蛋白酶)活性，事实上，丝氨酸蛋白酶(例如胰蛋白酶)活性随着EDTA浓度增加超过所要求的摩尔比而增加。此外，柠檬酸盐也螯合钙，对胰蛋白酶活性或其它丝氨酸蛋白酶的活性没有影响。本发明人已用经钙预活化和未经预活化的胰蛋白酶对此进行了检查。本发明人相信，在自然界中，胰蛋白酶在肠道中以活性钙形式以及其它金属离子活化形式存在。还相信，其它丝氨酸蛋白酶，例如糜蛋白酶、弹性蛋白酶和DPP4在肠道中也以活性钙形式或其它金属离子活化形式存在。
有人提议本文所述的发明可用于药物配制物中或与药物配制物一起使用，其中需要抑制胰蛋白酶样蛋白酶以用于有效治疗疾病，例如凝血级联疾病；用于减轻蛇咬伤或蜘蛛毒液的致病性后遗症；用于减少炎症的局部影响；用于对抗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的影响(例如在肺中)；用于避免因胰腺疾病引起的胰蛋白酶浓度增加的局部副作用；以及用于保护引入肠中的治疗蛋白质免受蛋白酶的影响。
为了方便起见，以下部分概括地概述了本文所使用的术语的各种含义。在此论述之后，论述了关于本发明的组合物、药物的用途和方法的一般方面，随后是展示本发明的各种实施方案的特性以及如何使用它们的具体实施例。
定义
下面提供说明书、实施例和所附权利要求书中使用的某些术语和短语的含义。如果本领域术语的使用与其在本文提供的定义之间存在明显差异，则应以说明书中提供的定义为准。
本领域技术人员将理解，本文描述的本发明易于进行除了具体描述的那些之外的变化和修改。本发明包括所有此类变化和修改。本发明还包括说明书中单独或共同提及或指示的所有步骤、特征、配制物和化合物以及步骤或特征的任何和所有组合或其中的任何两者或更多者。
本文中引用的每个文件、参考文献、专利申请或专利均以引用的方式明确地整体并入本文中，这意味着读者应将其作为本文的一部分来阅读和考虑。本文中所引用的文件、参考文献、专利申请或专利在本文中不再重复仅仅是出于简洁的原因。然而，所引用的材料或所述材料中包含的信息均不应被理解为公知常识。
本文提及的任何产品或以引用的方式并入本文中的任何文件中的制造商说明书、描述、产品规格和产品表均特此以引用的方式并入本文中，并且可在本发明的实践中采用。
本发明的范围不限于本文所述的任何具体实施方案。这些实施方案仅旨在用于示例的目的。功能等同的产品、配制物和方法显然在本文所述的本发明的范围内。
除了在操作实施例中或另外指示的情况外，本文使用的表示成分的量或反应条件的所有数字应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。当与百分比结合使用时，术语“约”可意指±1％。
本文所述的本发明可包括一个或多个值范围(例如大小、浓度等)。值范围将被理解为包括所述范围内的所有值，包括限定所述范围的值以及导致与紧邻限定范围边界的所述值的值相同或基本相同的结果的与所述范围相邻的值。例如，本领域技术人员将理解，范围的上限或下限的10％的变化可为完全合适的并且被本发明涵盖。更具体地，范围的上限或下限的变化将为5％或如本领域中普遍认可的，以较大者为准。
在本申请中，除非另有确切说明，否则单数的使用包括复数。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用是指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其它形式如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。另外，除非另有确切说明，否则术语如“元件”或“组分”既涵盖包含一个单元的元件和组分，又涵盖包含多于一个子单元的元件和组分。另外，术语“部分”的使用可包括部分的一部分或整个部分。
除非上下文要求，否则在本说明书通篇中，词语“包含(comprise)”或变化形式如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解成意指包括所述的整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。
术语“减少(decrease/reduced/reduction/decrease)”或“抑制”在本文中均一般意指统计显著量的减少。然而，为了避免疑问，“减少(reduced/reduction/decrease)”或“抑制”意指与参考水平(例如在不存在试剂的情况下)相比减少至少10％，例如减少至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％。
本文使用的术语“增加(increased/increase)”或“增强”或“活化”通常意指静态显著量的增加；为了避免任何疑问，术语“增加(increased/increase)”或“增强”或“活化”意指与参考水平(例如在不存在试剂的情况下)相比增加至少10％，例如与参考水平相比增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍增加、或2倍与10倍之间或更大的任何增加。
如本文所用，术语“施用”是指通过使得组合物至少部分定位在期望部位处从而产生期望效果的方法或途径将组合物置入受试者体内。本文所述的化合物或组合物可通过本领域已知的任何适当途径施用，包括但不限于经口或肠胃外途径，包括静脉内、肌内、皮下、经皮、气道(气雾剂)、经肺、经鼻、经直肠和局部(包括口腔和舌下)施用。在某些实施方案中，化合物通过肠胃外施用或允许递送至靶位点的其它方法来施用。
如本文所用，术语“EDTA”或“EGTA”在本文中通常包括其药学上可接受的盐。
如本文所用，术语“EDTA:Ca的摩尔比”、“EDTA:Mg的摩尔比”、“EGTA:Ca的摩尔比”和“EGTA:Mg”的摩尔比不具有游离二价金属离子。由于EDTA和EGTA最多结合两个二价金属离子，因此比率范围包括1:2、1:1、1:0.5、1:0.25等。
如本文所用，术语丝氨酸蛋白酶可由催化三联体来定义。三联体位于酶的发生催化作用的活性位点，并且在所有丝氨酸蛋白酶家族中都被保留。三联体是由三个氨基酸组成的配位结构：His 57、Ser 195和Asp 102。这三个关键氨基酸各自在蛋白酶的裂解能力中发挥重要作用。三联体成员的特定几何形状对其特定功能是高度特征性的。丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶和二肽基肽酶4(DPP4)。
一般而言，本发明涉及人类的治疗，例如当提及“肠道”时，其典型地指人类肠道，尽管在一个方面，本发明涉及非人类动物的治疗。因此，举例来说，本发明可具体应用的对象包括：人类、哺乳动物、伴侣动物和鸟类。
本文所使用的所选术语的其它定义可在本发明的详细描述中找到并且贯穿全文。除非另有限定，否则本文中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。
现在将参考以下非限制性描述和实施例来论述本发明的特征。
实施方案
被鉴定为表现出这种活性的化合物是单独的EDTA或EGTA，或者是EDTA或EGTA与钙或镁的组合。已知螯合剂(这些是螯合剂的实例)能够通过其与金属离子结合的能力来抑制某些金属酶的活性，将它们从酶活性中心的金属结合位点中提取出来，以留下无活性的脱辅基酶。然而，对于胰蛋白酶以及其它丝氨酸蛋白酶，例如糜蛋白酶、弹性蛋白酶和DPP4，这些酶不是金属蛋白，因此不会预期螯合剂会抑制活性。事实上，普遍的共识是螯合剂可增强胰蛋白酶和其它丝氨酸蛋白酶的活性，并且在此基础上，当使用这种酶从培养物的塑料表面去除细胞时，建议将EDTA与胰蛋白酶或其它丝氨酸蛋白酶结合使用。
现已发现，EDTA和EGTA能够抑制胰蛋白酶的活性，但仅在钙离子或镁离子存在的情况下，抑制程度比单独的EDTA或EGTA更大。然而，还发现，在不存在钙离子或镁离子的情况下，EDTA和EGTA能够抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性，尽管其抑制量比存在钙离子或镁离子时要少。需要存在此类金属离子才能增强抑制作用，这一事实清楚地表明EGTA和EDTA不充当经典螯合剂，因为如果是这种情况，则添加金属离子会抵消这种作用。还需要注意的是，其它常用的螯合剂，例如柠檬酸(钠盐形式)或邻菲咯啉未显示这种抑制作用。所述抑制作用似乎还针对特定金属离子–显示出抑制作用的钙和镁，而锌则没有这种作用，并且甚至似乎可增强胰蛋白酶的活性。最后，值得注意的是，EDTA与钙或镁的最佳摩尔比似乎在1:1范围内，表明一种可能的作用机制可能涉及EDTA或EGTA与二价金属离子的复合物的特异性抑制，比率为一个钙或镁原子比一个EDTA或EGTA。优选地，对于EDTA:Ca、EDTA:Mg、EGTA:Ca或EGTA:Mg的摩尔比，重要的是不存在游离金属离子，因此由于EDTA或EGTA结合最多两个钙离子或两个镁离子，这意味着所述比率的范围可为1:2至1:1、1:0.5、1:0.25等。优选地，所述比率在1:1与1:0.25之间的范围内。
A.组合物
因此，本发明涉及用作丝氨酸蛋白酶抑制剂的化合物，所述丝氨酸蛋白酶选自包含胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶和DPP4的组，所述化合物是EDTA或EGTA或其药学上可接受的盐。优选地，所述化合物是钙盐。
在第一方面，本发明提供包含EDTA和/或EGTA以及钙或镁的组合物，其中钙或镁与EDTA或EGTA的摩尔比为至少1:1。
在一个实施方案中，本发明的第一方面提供包含EDTA和钙或镁的组合物，其中EDTA与钙或镁的摩尔比为约1:2。更优选地，EDTA与钙或镁的摩尔比为1:2。更优选地，EDTA与钙或镁的摩尔比在1:2、1:1、1:0.5、1:0.25范围内。
在一个替代的实施方案中，本发明的第一方面提供包含EGTA和钙或镁的组合物，其中EGTA与钙或镁的摩尔比为约1:2。更优选地，EGTA与钙或镁的摩尔比为1:2。更优选地，EDTA与钙或镁的摩尔比在1:2、1:1、1:0.5、1:0.25范围内。
在第二方面，本发明提供包含EDTA和/或EGTA以及钙或镁的药物或治疗组合物，其中钙或镁与EDTA或EGTA的摩尔比为至少1:1。更优选地，EDTA与钙或镁的摩尔比在1:2、1:1、1:0.5、1:0.25范围内。
在一个实施方案中，本发明的第二方面提供包含EDTA和钙或镁的药物或治疗组合物，其中EDTA与钙或镁的摩尔比为约1:2。更优选地，EDTA与钙或镁的摩尔比为1:2。更优选地，EDTA与钙或镁的摩尔比在1:2、1:1、1:0.5、1:0.25范围内。
在一个替代的实施方案中，本发明的第二方面提供包含EGTA和钙或镁的药物或治疗组合物，其中EGTA与钙或镁的摩尔比为约1:2。更优选地，EGTA与钙或镁的摩尔比为1:2。更优选地，EDTA与钙或镁的摩尔比在1:2、1:1、1:0.5、1:0.25范围内。
在本发明的第二方面的一个优选实施方案中，提供了一种产品或药物组合物，其含有：(a)EDTA或EGTA或任一化合物的钙盐，和(b)治疗化合物，其中(a)和(b)被制备用于同时、单独或依序递送至受试者以治疗影响受试者的疾病或疾患，或预防影响受试者的疾病或疾患。
根据本发明使用的治疗化合物可为任何被蛋白酶改变、降解或影响的化合物，所述蛋白酶在人或动物体内，包括在人或动物体内的一个或多个细胞内具有治疗作用。就此而言，并且通常在本文中，对根据本发明使用的治疗化合物的提及也旨在涵盖使用多于一种治疗化合物，例如2、3或更多种治疗化合物的可能性。根据本发明使用的治疗化合物是大分子。就此而言，治疗化合物优选具有约1000Da或更大，例如2000Da或更大、或3000Da或更大的分子量。
尽管不是必需的，单治疗化合物优选是肽，更优选是多肽，并且更优选是蛋白质。合适的治疗化合物的实例包括但不限于胰岛素；降钙素；人血清白蛋白；生长激素；生长激素释放因子；甘丙肽；甲状旁腺激素；肽YY；胃泌酸调节素；凝血蛋白，例如激肽原、凝血酶原、纤维蛋白原、因子VII、因子VIII或因子IX；促红细胞生成素和EPO模拟物；集落刺激因子，包括GCSF和GMCSF；血小板源性生长因子；表皮生长因子；成纤维细胞生长因子；转化生长因子；GLP-1、GLP-2；GLP-1类似物和融合蛋白、GIP、胰高血糖素；艾塞那肽；瘦素；GAG；细胞因子；胰岛素样生长因子；骨和软骨诱导因子；神经营养因子；白介素，包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；干扰素，包括干扰素γ、干扰素-1a、干扰素α；TNFα；TNFβ；TGF-β；霍乱毒素A和B片段；大肠杆菌肠毒素A和B片段；胰泌素；酶，包括组蛋白脱乙酰酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、腺苷脱氨酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、蛋白酶、脂肪酶、糖酶、核苷酸酶、聚合酶、激酶和磷酸酶；转运或结合蛋白，尤其是结合和/或转运维生素、金属离子、氨基酸或脂质或脂蛋白的那些，例如胆固醇酯转运蛋白、磷脂转运蛋白、HDL结合蛋白；结缔组织蛋白，例如胶原蛋白、弹性蛋白或纤连蛋白；肌肉蛋白，例如肌动蛋白、肌球蛋白、肌营养不良蛋白或微型肌营养不良蛋白；神经元、肝脏、心脏或脂肪细胞蛋白；细胞毒性蛋白；细胞色素；能够引起细胞复制、生长或分化的蛋白；信号传导分子，例如细胞内信号传导蛋白或细胞外信号传导蛋白(例如激素)；营养因子，例如BDNF、CNTF5NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、VEGF、NT3、T3和HARP；载脂蛋白；抗体分子、抗体片段、单域抗体；可溶形式的受体，例如T细胞受体和细胞因子、干扰素或趋化因子的受体；含有抗原表位和片段的蛋白质或肽；以及上述任一者的白蛋白融合蛋白、衍生物、缀合物和序列变体。这些和其它蛋白质可源自人类、植物、动物、细菌或真菌来源，并且从天然来源中提取，通过发酵或化学合成制备为重组体。在一个优选的方面，所述治疗化合物是选自以下的肽：胰岛素、降钙素、生长激素、生长激素释放因子、甘丙肽、甲状旁腺激素、肽YY、胃泌酸调节素、促红细胞生成素、集落刺激因子、血小板源性生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子、GLP-1、GLP-2、GIP、胰高血糖素、艾塞那肽、瘦素、神经营养因子、胰岛素样生长因子、软骨诱导因子、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、干扰素-γ、干扰素-la、干扰素α和上述任一者的缀合物、包括上述任一者的融合蛋白、以及上述任一者的组合。
优选地，所述产品或药物组合物被配制用于递送至受试者的肠道。
在体液中，在正常生理条件下，体内平衡机制可将钙水平维持在1mM的浓度。因此，为了使EDTA以与钙以1:2或更低的比率复合的形式发挥活性，其应以在肠道溶液中产生0.5mM EDTA浓度的水平存在。对于EDTA钠盐，这将相当于0.1mg/ml或以上的水平。如果使用较高浓度的EDTA，则调整钙水平，以使摩尔比继续为1:2或更低(EDTA:钙)。在适当的情况下，类似的调整也适用于镁的使用。
在本发明的一种形式中，产品或药物组合物以0.1至10mg/ml的浓度存在于肠中。优选地，EDTA浓度为0.15至10mg/ml，更优选为0.2至5mg/ml或0.2至1mg/ml，或甚至更优选为0.2至0.3mg/ml。例如，其浓度可在大约0.3至10mg/ml之间。替代地，浓度可为：0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0mg/ml。
尽管胰蛋白酶只是参与肠内肽分解的四种蛋白酶之一，但仅抑制这种单一的酶的能力就显得尤为重要，因为它负责活化其它蛋白酶，在非活性酶原从胰腺进入十二指肠后将其裂解。事实上，胰蛋白酶甚至会活化自身，从赖氨酸残基15之后的肽键N末端裂解一小段肽。因此，抑制十二指肠中存在的少量活性胰蛋白酶可对抑制放大级联产生深远的影响，放大级联通常将在新物质从胰腺分泌至上肠道时发生。同样，糜蛋白酶、弹性蛋白酶和羧肽酶的活化可被胰蛋白酶抑制剂抑制；因为糜蛋白酶原通过胰蛋白酶在精氨酸15与异亮氨酸16之间的位点处被胰蛋白酶裂解而活化，导致活性酶的形成。胰蛋白酶还会从原弹性蛋白酶的N末端裂解12个残基肽，从而引起活化。最后，胰腺羧肽酶原A和B通过胰蛋白酶裂解而被活化，并且抑制此过程可防止活化。因此，单独抑制胰蛋白酶活性可间接保护肠中容易在许多不同的裂解位点处受到攻击的蛋白质，而不仅仅是胰蛋白酶特异性的蛋白质。
还有另一种通过胰蛋白酶原裂解来活化胰蛋白酶的途径，即胰蛋白酶原与存在于肠粘膜表面上的肠肽酶相互作用的结果。肠肽酶是一种丝氨酸蛋白质。
因此，抑制上述扩增级联的有效方法包括将本文所述的胰蛋白酶特异性抑制剂与丝氨酸蛋白酶的一般抑制剂组合。
在一个实施方案中，本发明的第二方面提供一种药物或治疗组合物，其包含(i)EDTA或EGTA和钙，其中EDTA与钙的摩尔比为约1:2，和(ii)丝氨酸蛋白酶的一般抑制剂。优选地，EDTA与钙或镁的摩尔比范围为1:2、1:1、1:0.5、1:0.25。
优选地，丝氨酸蛋白酶抑制剂作用于肠肽酶并防止所述酶产生新鲜的胰蛋白酶，并且胰蛋白酶特异性的抑制剂将作用于已在肠中的活化酶，并防止其促进胰蛋白酶自溶链式反应。优选地，这些试剂均在任何裂解反应发生之前以在十二指肠中起作用的方式施用于禁食的胃中。
丝氨酸蛋白酶的一般抑制剂的一个实例是鹅脱氧胆酸盐，其对一系列丝氨酸蛋白酶(包括凝血酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶)的活性已在专利PCT/AU2009/001305中报道。因此，本发明的另一个特征是一种组合物，优选物质的药物组合物，其包含如上所述的优选比率的鹅去氧胆酸盐与单独的EDTA和/或EGTA或加上钙或镁的组合。此类组合物的一个实例包括胶囊，所述胶囊尤其含有Aerosil和SSG、70mg的鹅去氧胆酸盐和33mg的没食子酸丙酯，其中胶囊被包覆以抵抗在胃中的分解，但其中包衣易于在十二指肠的5.5与6.5之间的pH下溶解。
在本发明的替代形式中，丝氨酸蛋白酶的一般抑制剂包括：丝氨酸蛋白酶抑制剂，例如大豆胰蛋白酶抑制剂、抑肽酶、Bowman-Birk抑制剂、Ecotin、天然丝氨酸蛋白酶抑制剂、二甲双胍、鹅去氧胆酸盐、脱氧胆酸盐，以及其它更具体的抑制剂，例如糜蛋白酶抑素(用于糜蛋白酶)、弹性酶抑制素(elastatin)、抑弹性蛋白酶素(elasnin)、西维来司他(sivelestat)(用于弹性蛋白酶)以及MEROPS抑制剂家族成员2-MPPA、PMPA和ZJ43(用于羧肽酶)。
B.组合物在制备药物中的用途
在第三方面，本发明提供包含EDTA和/或EGTA以及钙的组合物的用途，其中钙与EDTA或EGTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:1、1:2、1:0.05、1:0.25，所述组合物用于制造供治疗需要抑制胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶的病痛用的药物。优选地，药物用于治疗疾病，其中需要抑制胰蛋白酶样蛋白酶以用于有效治疗疾病，例如凝血级联疾病；用于减轻蛇咬伤或蜘蛛毒液的致病性后遗症；用于减少炎症的局部影响；用于对抗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的影响(例如在肺中)；用于避免因胰腺疾病引起的胰蛋白酶浓度增加的局部副作用；以及用于保护引入肠中的治疗蛋白质免受蛋白酶的影响。
在一个实施方案中，本发明的第三方面提供包含EDTA和钙或镁的组合物的用途，其中钙或镁与EDTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:1、1:2、1:0.05、1:0.25，其用于制造供治疗需要抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶或DPP4的病痛用的药物。优选地，药物用于治疗疾病，其中需要抑制胰蛋白酶样蛋白酶以用于有效治疗疾病，例如凝血级联疾病；用于减轻蛇咬伤或蜘蛛毒液的致病性后遗症；用于减少炎症的局部影响；用于对抗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的影响(例如在肺中)；用于避免因胰腺疾病引起的胰蛋白酶浓度增加的局部副作用；以及用于保护引入肠中的治疗蛋白质免受蛋白酶的影响。
在一个替代的实施方案中，本发明的第三方面提供包含EGTA和钙或镁的组合物的用途，其中钙或镁与EGTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:1、1:2、1:0.05、1:0.25，其用于制造供治疗需要抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶或DPP4的病痛用的药物。优选地，药物用于治疗疾病，其中需要抑制胰蛋白酶样蛋白酶以用于有效治疗疾病，例如凝血级联疾病；用于减轻蛇咬伤或蜘蛛毒液的致病性后遗症；用于减少炎症的局部影响；用于对抗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的影响(例如在肺中)；用于避免因胰腺疾病引起的胰蛋白酶浓度增加的局部副作用；以及用于保护引入肠中的治疗蛋白质免受蛋白酶的影响。
在一个替代的优选实施方案中，本发明的此方面提供(i)治疗化合物；和(ii)EDTA或EGTA或其钙盐在药物制造中的用途，其中所述EDTA或EGTA以产生0.1至10mg/ml浓度的水平存在于组合物中并且配制所述组合物用于治疗需要抑制胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶或DPP4的病痛。
在另一个替代的优选实施方案中，本发明的此方面提供(i)治疗化合物；和(ii)EDTA或EGTA或其钙盐在药物制造中的用途，其中所述EDTA或EGTA以产生0.1至10mg/ml浓度的水平存在于组合物中并且配制所述组合物用于治疗需要抑制胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶或DPP4的病痛。优选地，EDTA或EGTA或其钙盐的浓度为0.15至10mg/ml，更优选为0.2至5mg/ml或0.2至1mg/ml，或甚至更优选为0.2至0.3mg/ml。例如，其浓度可在大约0.3至10mg/ml之间。替代地，浓度可为：0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0mg/ml。
在第四方面，本发明提供包含EDTA和/或EGTA以及钙或镁的组合物的用途，其中钙或镁与EDTA或EGTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:1、1:2、1:0.05、1:0.25，所述组合物用于制造供治疗病痛用的药物，其中所述药物包含治疗化合物并且所述组合物以保护所述化合物免受肠中的丝氨酸蛋白酶影响的量存在。
在一个实施方案中，本发明的第四方面提供包含EDTA以及钙或镁的组合物的用途，其中钙或镁与EDTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:1、1:2、1:0.05、1:0.25，所述组合物用于制造供治疗病痛用的药物，其中所述药物包含治疗化合物并且所述组合物以保护所述化合物免受肠中的丝氨酸蛋白酶影响的量存在。
在一个替代的实施方案中，本发明的第四方面提供包含EGTA以及钙或镁的组合物的用途，其中钙或镁与EGTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:1、1:2、1:0.05、1:0.25，所述组合物用于制造供治疗病痛用的药物，其中所述药物包含治疗化合物并且所述组合物以保护所述化合物免受肠中的丝氨酸蛋白酶影响的量存在。
在一个替代的优选实施方案中，本发明提供：(i)治疗化合物；和(ii)EDTA或EGTA或其钙盐在药物制造中的用途，其中所述EDTA或EGTA以产生0.15至10mg/ml的浓度的水平存在于组合物中，并且组合物被配制用于在肠道中递送化合物。
在另一个替代的优选实施方案中，本发明提供：(i)治疗化合物；和(ii)EDTA或EGTA或其钙盐在药物制造中的用途，其中所述EDTA或EGTA以产生0.1至10mg/ml的浓度的水平存在于组合物中，并且组合物被配制用于在肠道中递送化合物。优选地，EDTA或EGTA或其钙盐的浓度为0.15至10mg/ml，更优选为0.2至5mg/ml或0.2至1mg/ml，或甚至更优选为0.2至0.3mg/ml。例如，其浓度可在大约0.3至10mg/ml之间。替代地，浓度可为：0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0mg/ml。
C.用于治疗受试者的方法
在第五方面，本发明提供治疗罹患病痛的受试者的方法，其中所述受试者的治疗受到胰蛋白酶或其它丝氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶、弹性蛋白酶或DPP4)的抑制的影响，所述方法包括以下步骤：向受试者施用组合物，所述组合物仅包含EDTA和/或EGTA或包含其与钙或镁的组合，其中钙或镁与EDTA或EGTA的摩尔比为至少1:1。优选地，组合物以药学或治疗有效量提供。
在一个实施方案中，本发明的第五方面提供治疗罹患病痛的受试者的方法，其中所述受试者的治疗受到胰蛋白酶或丝氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶、弹性蛋白酶或DPP4)的抑制的影响，所述方法包括以下步骤：向受试者施用组合物，所述组合物仅包含EDTA或包含其与钙或镁的组合，其中钙或镁与EDTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:1、1:2、1:0.05、1:0.25。
在一个替代的实施方案中，本发明的第五方面提供治疗罹患病痛的受试者的方法，其中所述受试者的治疗受到胰蛋白酶或丝氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶、弹性蛋白酶或DPP4)的抑制的影响，所述方法包括以下步骤：向受试者施用组合物，所述组合物仅包含EGTA或包含其与钙或镁的组合，其中钙或镁与EGTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:1、1:2、1:0.05、1:0.25。
作为本发明的实例，上述方法用于治疗凝血级联疾病；用于减轻蛇咬伤或蜘蛛毒液的致病性后遗症；用于减少炎症的局部影响；用于对抗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的影响(例如在肺中)；用于避免因胰腺疾病引起的胰蛋白酶浓度增加的局部副作用；以及用于保护引入肠中的治疗蛋白质免受丝氨酸蛋白酶的影响。
在一个替代的优选实施方案中，本发明提供治疗罹患病痛的受试者的方法，其中所述受试者的治疗受到胰蛋白酶或其它丝氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶、弹性蛋白酶和DPP4)的抑制的影响，所述方法包括以下步骤：向受试者施用EDTA或EGTA或其钙盐，其中所述EDTA或EGTA以产生0.10至10mg/ml的EDTA或EGTA浓度的水平存在于组合物中。优选地，EDTA或EGTA或其钙盐的浓度为0.15至10mg/ml，更优选为0.2至5mg/ml或0.2至1mg/ml，或甚至更优选为0.2至0.3mg/ml。例如，其浓度可在大约0.3至10mg/ml之间。替代地，浓度可为：0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0mg/ml。
在另一个替代的优选实施方案中，本发明提供治疗罹患病痛的受试者的方法，其中所述受试者的治疗受到胰蛋白酶或其它丝氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶、弹性蛋白酶和DPP4)的抑制的影响，所述方法包括以下步骤：在药物制造中向受试者施用EDTA或EGTA或其钙盐，其中所述EDTA或EGTA以产生0.3至10mg/ml的EDTA或EGTA浓度的水平存在于组合物中。
在第六方面，本发明提供治疗罹患病痛的受试者的方法，所述治疗包括向受试者施用治疗化合物以治疗所述病痛，并且基本上同时施用包含EDTA和/或EGTA以及钙的治疗上或药学上可接受的组合物，其中钙与EDTA或EGTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:1、1:2、1:0.05、1:0.25，其中所述组合物以保护所述化合物免受肠中至少丝氨酸蛋白酶影响的量存在。
在一个替代的实施方案中，本发明的第六方面提供治疗罹患病痛的受试者的方法，所述治疗包括向受试者施用治疗化合物以治疗所述病痛，并且基本上同时施用包含EDTA和钙的治疗上或药学上可接受的组合物，其中钙与EDTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:1、1:2、1:0.05、1:0.25，其中所述组合物以保护所述化合物免受肠中至少蛋白酶影响的量存在。
在一个替代的实施方案中，本发明的第六方面提供治疗罹患病痛的受试者的方法，所述治疗包括向受试者施用治疗化合物以治疗所述病痛，并且基本上同时施用包含EGTA和钙的治疗上或药学上可接受的组合物，其中钙与EGTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:1、1:2、1:0.05、1:0.25，其中所述组合物以保护所述化合物免受肠中至少蛋白酶影响的量存在。
在一个替代的优选实施方案中，本发明提供治疗罹患病痛的受试者的方法，所述治疗包括向受试者施用治疗化合物以治疗病痛，并且基本上同时施用治疗上或药学上可接受的组合物，所述组合物包含EDTA或EGTA或其钙盐，其中所述EDTA或EGTA以产生0.15至10mg/ml的浓度的水平存在于组合物中，并且所述组合物被配制用于在肠道中递送所述化合物。
在一个替代的优选实施方案中，本发明提供治疗罹患病痛的受试者的方法，所述治疗包括向受试者施用治疗化合物以治疗病痛，并且基本上同时施用治疗上或药学上可接受的组合物，所述组合物包含EDTA或EGTA或其钙盐，其中所述EDTA或EGTA以产生0.3至10mg/ml的浓度的水平存在于组合物中，并且所述组合物被配制用于在肠道中递送所述化合物。
D.本发明药物组合物的施用
本文公开的本发明的药物组合物可治疗性或预防性施用。在治疗应用中，将组合物以足以治愈或至少部分抑制其症状和/或并发症的量施用于已罹患病痛的患者。所述组合物应提供一定量的活性化合物，所述化合物足以在单次剂量中或作为治疗方案的一部分有效治疗患者。
在预防性应用中，将本发明的组合物以足以至少部分阻止病痛的症状和/或并发症的量施用于有患病痛的风险的受试者。所述组合物应提供足以治疗患者的量的活性成分。
优选地，为了施用于受试者，治疗组合物或药物组合物作为药学上可接受的组合物提供。当处于这种形式时，组合物将与一种或多种药学上可接受的载剂(添加剂)和/或稀释剂一起药物配制。
如本文所用，术语“药学上可接受的”涉及在合理医学判断范围内适用于与受试者(例如，人)的组织接触使用而没有过量毒性、刺激性、过敏反应、或其它问题或并发症、与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
制备可施用组合物的方法是本领域技术人员显而易见的，并且更详细地描述于例如特此以引用的方式整体并入的Remington's Pharmaceutical Science,第15版,MackPublishing Company,Easton,Pa.中。
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指参与将主题化合物从一个器官或身体的一部分携带或运输至另一器官或身体的一部分的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂或溶剂封装材料。每种载剂在与配制物的其它成分相容并且不会对患者造成伤害的含义上必须是“可接受的”。可用作药学上可接受的载剂的材料的一些实例包括但不限于：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和乙酸纤维素；(4)黄蓍粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)填充剂，例如多肽和氨基酸；(23)血清组分，例如血清白蛋白、HDL和LDL；(22)C2-C12醇，例如乙醇；以及(23)药物配制物中采用的其它无毒相容物质。配制物中还可存在润湿剂、粘合剂、填充剂、润滑剂、粘液溶解剂、着色剂、崩解剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂、水、盐溶液、醇、抗氧化剂、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。诸如“赋形剂”、“载剂”、“药学上可接受的载剂”等术语在本文中可互换使用。
药学上可接受的载剂或稀释剂的实例是软化水或蒸馏水；盐水溶液；植物油，例如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油，例如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、落花生油或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，例如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；挥发性有机硅；矿物油，例如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物，例如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级链烷醇，例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，例如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡啶酮；琼脂；卡拉胶；黄蓍胶或阿拉伯树胶和凡士林。典型地，一种或多种载剂将占组合物重量的10％至99.9％。
本文所述的组合物可另外含有药物组合物中常规存在的其它辅助组分，其用量为本领域确立的使用水平。因此，例如，组合物可含有额外的相容的药学活性物质，例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂。然而，此类物质在添加时不应过度干扰本文所述的组合物的组分的生物活性。
如下文所详细描述，本文所述的药学上可接受的组合物可特别配制用于以固体、凝胶或液体形式施用，包括适于以下的那些：(1)经口施用，例如应用于舌部的灌服剂(水性或非水性溶液或悬浮液)、胶囊、丸剂、片剂、颗粒剂、糊剂；(2)肠胃外施用，例如通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射，例如作为无菌溶液或悬浮液、或缓释配制物；(3)直接注射至需要治疗的部位；(4)局部施用，例如作为乳膏、洗剂、凝胶、软膏或控释贴剂或喷雾剂应用于皮肤；(5)阴道内或直肠内，例如作为子宫托、乳膏、栓剂或泡沫剂；(6)舌下含服；(7)作为滴眼剂经眼；(8)透皮；(9)经粘膜；或(10)经鼻。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物例如与惰性稀释剂或可同化的食用载剂一起经口施用。对于经口治疗性施用，药物组合物可与赋形剂混合且以可摄取片剂、经颊片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、粉片等形式使用。
适用于经口使用的载剂、稀释剂、赋形剂和佐剂的一些实例包括花生油、液体石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、藻酸钠、阿拉伯树胶、黄蓍胶、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、明胶和卵磷脂。另外，这些经口配制物可含有合适的调味剂和着色剂。
当以胶囊形式使用时，胶囊可用延迟崩解的化合物，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯进行包衣。片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可含有以下各者：粘合剂，如黄蓍树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；额外崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；以及甜味剂，例如蔗糖、乳糖或糖精或调味剂，例如胡椒薄荷、冬青油或樱桃调味剂。
当剂量单位形式是胶囊时，除以上类型的物质之外，它也可含有液体载剂。各种其它材料可以包衣存在或以其它方式修改剂量单位的物理形式。例如，可用虫胶、糖或两者对片剂、丸剂或胶囊进行包衣。
用于经口施用的液体形式(例如糖浆或酏剂)除了上述试剂外还可含有液体载剂、甜味剂(例如蔗糖)、防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)、染料和调味剂，例如樱桃味或橙味。合适的液体载剂包括水、油如橄榄油、花生油、芝麻油、葵花籽油、红花油、落花生油、椰子油、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯或其混合物。
用于经口施用的悬浮液还可包含分散剂和/或悬浮剂。合适的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸钠或乙酰醇。合适的分散剂包括卵磷脂、脂肪酸的聚氧乙烯酯例如硬脂酸、聚氧乙烯山梨醇单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯等。用于经口施用的乳液还可包含一种或多种乳化剂。合适的乳化剂包括如上示例的分散剂或天然树胶，例如瓜尔胶、阿拉伯树胶或黄蓍胶。
另外，药学上可接受的组合物可掺入缓释制剂和配制物中。此类药物组合物还可包含合适的缓冲剂以最小化酸水解。合适的缓冲剂是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐和其混合物。
本文公开的药物组合物对于任何特定受试者的治疗有效量将取决于多种因素，包括：药物组合物的毒性和治疗功效；病痛的严重程度；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间；施用途径；组合物的固存率；治疗的持续时间；与治疗组合或同时使用的药物；以及医学上众所周知的其它相关因素。
毒性和治疗功效可通过标准制药程序在细胞培养物或实验动物中确定，例如，确定LD50(50％群体致死剂量)和ED50(50％群体有效治疗剂量)。毒性与治疗作用之间的剂量比为治疗指数并且其可表示为LD50/ED50比。表现出高治疗指数的组合物是优选的。
从本文所述的细胞培养测定中获得的数据可用于配制用于人类的一系列治疗有效剂量。所述化合物的剂量优选处于包括ED50同时具有极小毒性或无毒性的循环浓度的范围内。剂量可取决于所采用的剂型和所利用的施用途径在此范围内变化。
在本发明的某些实施方案中，有效量的组合物作为单次施用剂量给予。在某些实施方案中，重复给予剂量。也就是说，治疗方案将取决于疾病的严重程度和类型、患者的整体健康状况和年龄以及治疗医生要考虑的各种其它状况而变化。关于治疗的持续时间和频率，熟练的临床医生典型地监测受试者以确定治疗何时提供治疗益处，并确定增加或减少剂量、增加或减少施用频率、停止治疗、恢复治疗或对治疗方案进行其它改变。
本文所述的本发明的药学上可接受的组合物可以单次推注施用或多次剂量或治疗的形式提供，并且还可通过“连续”疗法来应用，其中在延长的时间段内连续提供少量的治疗组合物。
当在治疗(包括连续疗法)中使用多次给药时，药物组合物将按照可在每周一次至每天一次内变化的给药计划表来施用，这取决于若干临床因素，例如受试者对治疗或药物组合物的敏感性。在此类方案中施用的所需剂量可作为单次剂量一次递送或分成亚剂量，例如2-4个亚剂量并在一段时间内施用，例如在一天中以适当的间隔施用或其它适当的计划表。此类亚剂量可作为单位剂型施用。
在一些实施方案中，施用是长期的，例如在数周或数月的时间段内每天一次或多次剂量。给药计划表的实例是在1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月或更长时间的时间段内的每天、每天两次、每天三次或每天四次或更多次施用。
可使用连续输注或通过控释配制物递送来施用所需剂量。在那种情况下，每个亚剂量中包含的药物组合物必须相应地较小，以达到每日总剂量。
治疗优势可通过组合方案来实现。在本发明的某些实施方案中，方法还可包括以下步骤：与本发明的第二或第三方面中鉴定的治疗同时或伴随向受试者施用第二活性剂，所述第二活性剂在预防性递送时是对患者正在罹患或可能罹患的病痛的辅助治疗。
以下实施例用于说明本发明，但不应被解释为限制性的。
实施例
实施例1-EDTA和钙的组合对胰蛋白酶的抑制
制备浓度为0.3mM磷酸盐(pH7)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的稀溶液，并用于溶解浓度为0.3mg/ml的二水氯化钙或氯化镁。将来自猪胰腺的胰蛋白酶在存在或不存在钙的情况下以0.02mg/ml胰蛋白酶的浓度溶解于Ca/PBS缓冲液中。在含或不含钙或镁的PBS中制备5ml等份的EDTA二钠(二水合物)溶液，从8mg/ml向下加倍稀释，并将每种溶液的pH调节至7。胰蛋白酶底物(即Z-L-精氨酸-4-甲基-7-香豆素酰胺HCl)以0.125mg/ml的浓度溶解于DMSO中，接着在Ca/PBS缓冲液中稀释100倍。将EDTA溶液分配至黑色微孔板的孔中(每孔60μl)，接着添加10μl胰蛋白酶溶液，然后添加10μl底物。使反应进行30分钟，并在荧光微孔板读取器中通过测量反应产物(香豆素)在激发波长365nm、发射波长440nm下的荧光来确定反应程度。在图1中可以看出，单独或与钙(0.3mg/ml)或镁(0.5mg/ml)组合的EDTA对胰蛋白酶的活性具有显著抑制作用。
实施例2-EGTA对胰蛋白酶的抑制
制备浓度为0.3mM磷酸盐(pH7)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的稀溶液，并用于溶解浓度为0.3mg/ml的二水氯化钙。将来自猪胰腺的胰蛋白酶以0.02mg/ml胰蛋白酶的浓度溶解于Ca/PBS缓冲液中。在PBS中制备5ml等份的EGTA二钠(二水合物)溶液，从8mg/ml向下加倍稀释，并将每种溶液的pH调节至7。胰蛋白酶底物(即Z-L-精氨酸-4-甲基-7-香豆素酰胺HCl)以0.125mg/ml的浓度溶解于DMSO中，接着在Ca/PBS缓冲液中稀释100倍。将EGTA溶液分配至黑色微孔板的孔中(每孔60μl)，接着添加10μl胰蛋白酶溶液，然后添加10μl底物。使反应进行30分钟，并在荧光微孔板读取器中通过测量反应产物(香豆素)在激发波长365nm、发射波长440nm下的荧光来确定反应程度。
从图2中可以看出，EGTA对胰蛋白酶的活性有抑制作用。
实施例3-菲咯啉和钙的组合对胰蛋白酶活性的影响
制备浓度为0.3mM磷酸盐(pH7)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的稀溶液，并用于溶解浓度为0.3mg/ml的二水氯化钙。将来自猪胰腺的胰蛋白酶在存在或不存在钙的情况下以0.02mg/ml的浓度溶解于缓冲液中。在含或不含钙的PBS中制备5ml等份的EGTA二钠(二水合物)溶液和菲咯啉(仅使用低浓度的菲咯啉，因为其在水相中的溶解度有限)，从8mg/ml向下加倍稀释，并将每种溶液的pH调节至7。胰蛋白酶底物(即Z-L-精氨酸-4-甲基-7-香豆素酰胺HCl)以0.125mg/ml的浓度溶解于DMSO中，接着在Ca/PBS缓冲液中稀释100倍。将EGTA溶液和菲咯啉分配至黑色微孔板的孔中(每孔60μl)，接着添加10μl胰蛋白酶溶液，然后添加10μl底物。使反应进行30分钟，并在荧光微孔板读取器中通过测量反应产物(香豆素)在激发波长365nm、发射波长440nm下的荧光来确定反应程度。
从图3中可以看出，菲咯啉对胰蛋白酶活性没有抑制作用。类似的实验表明柠檬酸盐没有作用(结果未示出)。这些药剂都没有任何作用的事实进一步证明EDTA或EGTA的抑制性肌动蛋白不仅仅是由于螯合活性。
实施例4-在钙离子存在下EDTA对糜蛋白酶的抑制
重复实验1，不同之处在于使用糜蛋白酶代替胰蛋白酶，并且实验仅在钙离子存在下进行。从图4中可以看出，EDTA对糜蛋白酶的蛋白酶活性有抑制作用，其方式与胰蛋白酶类似。
实施例5-包含EDTA的药物组合物的制备
制备包含一定量的EDTA或其药学上可接受的盐(优选钙盐)的本发明的药物组合物用于治疗需要治疗的受试者。本发明的药物组合物可与治疗化合物组合使用，用于治疗受试者的病痛、疾病、病症或疾患。
在此实施例中，包含一定量的EDTA或其药学上可接受的盐(优选钙盐)的本发明的药物组合物是使用一定量的EDTA来制备的，所述EDTA能够在患者的肠中产生浓度为0.1至10mg/ml的EDTA或其药学上可接受的盐(优选钙盐)。优选地，EDTA或其药学上可接受的盐(优选钙盐)的浓度为0.15至10mg/ml，更优选地，浓度为0.2至5mg/ml或0.2至1mg/ml，或甚至更优选地，浓度为0.2至0.3mg/ml。
因此，例如，在含有大约100mg固体粉末赋形剂(其容易溶解于位于肠腔中的1ml或更少的液体中)的胶囊中，可提供0.2至10mg的EDTA或其药学上可接受的盐(优选钙盐)。
当所述组合物包含EDTA和钙或镁时，钙或镁与EDTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:1、1:2、1:0.05、1:0.25，其中所述组合物以保护治疗化合物免受肠中至少蛋白酶影响的量存在。
药物组合物还可包含治疗有效量的丝氨酸蛋白酶的一般抑制剂，例如鹅去氧胆酸盐和/或没食子酸丙酯。
例如，本发明的药物组合物包括胶囊，所述胶囊包含：0.2至10mg的EDTA；任选地钙或镁，钙与EDTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:1、1:2、1:0.05、1:0.25；70mg鹅去氧胆酸盐；以及任选地33mg没食子酸丙酯。胶囊可被包覆以抵抗在胃中的分解，但包衣在十二指肠的5.5与6.5之间的pH下容易溶解。
如上文所论述，本发明的药物组合物可用于治疗需要所述治疗的受试者的病痛，其中用治疗化合物来治疗受试者。
治疗化合物可选自以下中的任一者：胰岛素；降钙素；人血清白蛋白；生长激素；生长激素释放因子；甘丙肽；甲状旁腺激素；肽YY；胃泌酸调节素；凝血蛋白，例如激肽原、凝血酶原、纤维蛋白原、因子VII、因子VIII或因子IX；促红细胞生成素和EPO模拟物；集落刺激因子，包括GCSF和GMCSF；血小板源性生长因子；表皮生长因子；成纤维细胞生长因子；转化生长因子；GLP-1、GLP-2；GLP-1类似物和融合蛋白、GIP、胰高血糖素；艾塞那肽；瘦素；GAG；细胞因子；胰岛素样生长因子；骨和软骨诱导因子；神经营养因子；白介素，包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；干扰素，包括干扰素γ、干扰素-1a、干扰素α；TNFα；TNFβ；TGF-β；霍乱毒素A和B片段；大肠杆菌肠毒素A和B片段；胰泌素；酶，包括组蛋白脱乙酰酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、腺苷脱氨酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、蛋白酶、脂肪酶、糖酶、核苷酸酶、聚合酶、激酶和磷酸酶；转运或结合蛋白，尤其是结合和/或转运维生素、金属离子、氨基酸或脂质或脂蛋白的那些，例如胆固醇酯转运蛋白、磷脂转运蛋白、HDL结合蛋白；结缔组织蛋白，例如胶原蛋白、弹性蛋白或纤连蛋白；肌肉蛋白，例如肌动蛋白、肌球蛋白、肌营养不良蛋白或微型肌营养不良蛋白；神经元、肝脏、心脏或脂肪细胞蛋白；细胞毒性蛋白；细胞色素；能够引起细胞复制、生长或分化的蛋白；信号传导分子，例如细胞内信号传导蛋白或细胞外信号传导蛋白(例如激素)；营养因子，例如BDNF、CNTF5NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、VEGF、NT3、T3和HARP；载脂蛋白；抗体分子、抗体片段、单域抗体；可溶形式的受体，例如T细胞受体和细胞因子、干扰素或趋化因子的受体；含有抗原表位和片段的蛋白质或肽；以及上述任一者的白蛋白融合蛋白、衍生物、缀合物和序列变体。这些和其它蛋白质可源自人类、植物、动物、细菌或真菌来源，并且从天然来源中提取，通过发酵或化学合成制备为重组体。
所述药物组合物可被配制用于将治疗化合物递送至肠道，所述药物组合物包含(i)治疗化合物；和(ii)EDTA或其钙盐，其中EDTA以产生0.15mg/ml至10mg/ml的EDTA浓度的水平存在于组合物中，以及鹅去氧胆酸盐和/或没食子酸丙酯。当存在钙或镁时，钙或镁与EDTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:1、1:2、1:0.05、1:0.25。
实施例6-包含EGTA的药物组合物的制备
制备包含一定量的EGTA或其药学上可接受的盐(优选钙盐)的本发明的药物组合物用于治疗需要治疗的受试者。本发明的药物组合物可与治疗化合物组合使用，用于治疗病痛、疾病、病症或疾患。
在此实施例中，包含一定量的EGTA或其药学上可接受的盐(优选钙盐)的本发明的药物组合物是使用一定量的EGTA来制备的，所述EGTA能够在患者的肠中产生浓度为0.1至10mg/ml的EGTA或其药学上可接受的盐(优选钙盐)。优选地，EGTA或其药学上可接受的盐(优选钙盐)的浓度为0.15至10mg/ml，更优选地，浓度为0.2至5mg/ml或0.2至1mg/ml，或甚至更优选地，浓度为0.2至0.3mg/ml。
因此，例如，在含有大约100mg固体粉末赋形剂(其容易溶解于位于肠腔中的1ml或更少的液体中)的胶囊中，可提供0.2至10mg的EGTA或其药学上可接受的盐(优选钙盐)。
当所述组合物包含EGTA和钙或镁时，钙或镁与EGTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:1、1:2、1:0.05、1:0.25，其中所述组合物以保护治疗化合物免受肠中至少蛋白酶影响的量存在。
药物组合物还可包含治疗有效量的丝氨酸蛋白酶的一般抑制剂，例如鹅去氧胆酸盐和/或没食子酸丙酯。
例如，本发明的药物组合物包括胶囊，所述胶囊包含：0.2至10mg的EGTA；任选地钙或镁，钙与EGTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:1、1:2、1:0.05、1:0.25；70mg鹅去氧胆酸盐；以及任选地33mg没食子酸丙酯。胶囊可被包覆以抵抗在胃中的分解，但包衣在十二指肠的5.5与6.5之间的pH下容易溶解。
如上文所论述，本发明的药物组合物可用于治疗需要所述治疗的受试者的病痛，其中用治疗化合物来治疗受试者。
治疗化合物可选自以下中的任一者：胰岛素；降钙素；人血清白蛋白；生长激素；生长激素释放因子；甘丙肽；甲状旁腺激素；肽YY；胃泌酸调节素；凝血蛋白，例如激肽原、凝血酶原、纤维蛋白原、因子VII、因子VIII或因子IX；促红细胞生成素和EPO模拟物；集落刺激因子，包括GCSF和GMCSF；血小板源性生长因子；表皮生长因子；成纤维细胞生长因子；转化生长因子；GLP-1、GLP-2；GLP-1类似物和融合蛋白、GIP、胰高血糖素；艾塞那肽；瘦素；GAG；细胞因子；胰岛素样生长因子；骨和软骨诱导因子；神经营养因子；白介素，包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；干扰素，包括干扰素γ、干扰素-1a、干扰素α；TNFα；TNFβ；TGF-β；霍乱毒素A和B片段；大肠杆菌肠毒素A和B片段；胰泌素；酶，包括组蛋白脱乙酰酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、腺苷脱氨酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、蛋白酶、脂肪酶、糖酶、核苷酸酶、聚合酶、激酶和磷酸酶；转运或结合蛋白，尤其是结合和/或转运维生素、金属离子、氨基酸或脂质或脂蛋白的那些，例如胆固醇酯转运蛋白、磷脂转运蛋白、HDL结合蛋白；结缔组织蛋白，例如胶原蛋白、弹性蛋白或纤连蛋白；肌肉蛋白，例如肌动蛋白、肌球蛋白、肌营养不良蛋白或微型肌营养不良蛋白；神经元、肝脏、心脏或脂肪细胞蛋白；细胞毒性蛋白；细胞色素；能够引起细胞复制、生长或分化的蛋白；信号传导分子，例如细胞内信号传导蛋白或细胞外信号传导蛋白(例如激素)；营养因子，例如BDNF、CNTF5NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、VEGF、NT3、T3和HARP；载脂蛋白；抗体分子、抗体片段、单域抗体；可溶形式的受体，例如T细胞受体和细胞因子、干扰素或趋化因子的受体；含有抗原表位和片段的蛋白质或肽；以及上述任一者的白蛋白融合蛋白、衍生物、缀合物和序列变体。这些和其它蛋白质可源自人类、植物、动物、细菌或真菌来源，并且从天然来源中提取，通过发酵或化学合成制备为重组体。
所述药物组合物可被配制用于将治疗化合物递送至肠道，所述药物组合物包含(i)治疗化合物；和(ii)EGTA或其钙盐、鹅去氧胆酸盐和/或没食子酸丙酯，其中EGTA以产生0.15mg/ml至10mg/ml的EGTA浓度的水平存在于组合物中。当存在钙或镁时，钙或镁与EGTA的摩尔比为至少1:1，并且优选为1:1、1:2、1:0.05、1:0.25。

Claims (19)

1.一种用作丝氨酸蛋白酶抑制剂的化合物，所述丝氨酸蛋白酶选自包含胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶和二肽基肽酶4(DPP4)的组，所述化合物是EDTA或EGTA或其药学上可接受的盐。
2.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是钙盐或镁盐。
3.一种产品或药物组合物，所述产品或药物组合物包含(a)抑制选自包含胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶和二肽基肽酶(DPP4)的组的丝氨酸蛋白酶的化合物，其中所述化合物是EDTA或EGTA或其药用盐、鹅去氧胆酸盐和/或没食子酸丙酯；和(b)治疗化合物，其中(a)和(b)被制备用于同时、单独或依序递送至受试者以用于治疗影响所述受试者的疾病或疾患，或用于预防影响所述受试者的疾病或疾患。
4.如权利要求3所述的产品或药物组合物，其中所述化合物是钙盐或镁盐。
5.一种产品或药物组合物，所述产品或药物组合物包含：(a)根据权利要求1和2中任一项所述的化合物，和(b)治疗化合物，其中(a)和(b)被制备用于同时、单独或依序递送至受试者以用于治疗影响所述受试者的疾病或疾患，或用于预防影响所述受试者的疾病或疾患。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的产品，其中所述治疗化合物选自包含以下的组：胰岛素；降钙素；人血清白蛋白；生长激素；生长激素释放因子；甘丙肽；甲状旁腺激素；肽YY；胃泌酸调节素；凝血蛋白，例如激肽原、凝血酶原、纤维蛋白原、因子VII、因子VIII或因子IX；促红细胞生成素和EPO模拟物；集落刺激因子，包括GCSF和GMCSF；血小板源性生长因子；表皮生长因子；成纤维细胞生长因子；转化生长因子；GLP-1、GLP-2；GLP-1类似物和融合蛋白、GIP、胰高血糖素；艾塞那肽；瘦素；GAG；细胞因子；胰岛素样生长因子；骨和软骨诱导因子；神经营养因子；白介素，包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；干扰素，包括干扰素γ、干扰素-1a、干扰素α；TNFα；TNFβ；TGF-β；霍乱毒素A和B片段；大肠杆菌肠毒素A和B片段；胰泌素；酶，包括组蛋白脱乙酰酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、腺苷脱氨酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、蛋白酶、脂肪酶、糖酶、核苷酸酶、聚合酶、激酶和磷酸酶；转运或结合蛋白，尤其是结合和/或转运维生素、金属离子、氨基酸或脂质或脂蛋白的那些，例如胆固醇酯转运蛋白、磷脂转运蛋白、HDL结合蛋白；结缔组织蛋白，例如胶原蛋白、弹性蛋白或纤连蛋白；肌肉蛋白，例如肌动蛋白、肌球蛋白、肌营养不良蛋白或微型肌营养不良蛋白；神经元、肝脏、心脏或脂肪细胞蛋白；细胞毒性蛋白；细胞色素；能够引起细胞复制、生长或分化的蛋白；信号传导分子，例如细胞内信号传导蛋白或细胞外信号传导蛋白(例如激素)；营养因子，例如BDNF、CNTF5NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、VEGF、NT3、T3和HARP；载脂蛋白；抗体分子、抗体片段、单域抗体；可溶形式的受体，例如T细胞受体和细胞因子、干扰素或趋化因子的受体；含有抗原表位和片段的蛋白质或肽；以及上述任一者的白蛋白融合蛋白、衍生物、缀合物和序列变体。这些和其它蛋白质可源自人类、植物、动物、细菌或真菌来源，并且从天然来源中提取，通过发酵或化学合成制备为重组体。在一个优选的方面，所述治疗化合物是选自以下的肽：胰岛素、降钙素、生长激素、生长激素释放因子、甘丙肽、甲状旁腺激素、肽YY、胃泌酸调节素、促红细胞生成素、集落刺激因子、血小板源性生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子、GLP-1、GLP-2、GIP、胰高血糖素、艾塞那肽、瘦素、神经营养因子、胰岛素样生长因子、软骨诱导因子、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、干扰素-γ、干扰素-la、干扰素α和上述任一者的缀合物、包括上述任一者的融合蛋白、以及上述任一者的组合。
7.根据权利要求5所述的产品或药物组合物，所述产品或药物组合物还包含鹅去氧胆酸盐和/或没食子酸丙酯。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的产品或药物组合物，其中所述产品被递送至所述受试者的肠道。
9.根据权利要求8所述的产品或药物组合物，其中所述化合物以0.10至10mg/ml的浓度存在于肠中。
10.根据权利要求8所述的产品或药物组合物，其中所述化合物以0.2至10mg/ml的浓度存在于肠中。
11.根据权利要求8所述的产品或药物组合物，其中所述化合物以0.3至5mg/ml的浓度存在于肠中。
12.根据权利要求8所述的产品或药物组合物，其中所述化合物以0.2至1mg/ml的浓度存在于肠中。
13.一种抑制选自包含胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶和DPP4的组的丝氨酸蛋白酶的方法，所述方法包括以下步骤：向受试者施用权利要求1或2中任一项所述的化合物或根据权利要求3至12中任一项所述的产品或药物组合物。
14.(i)治疗化合物；和(ii)EDTA或EGTA或其钙盐在药物制造中的用途，其中所述EDTA或EGTA以产生0.10至10mg/ml的浓度的水平存在于所述组合物中，并且所述组合物被配制用于在肠道中递送所述化合物。
15.(i)治疗化合物；和(ii)EDTA或EGTA或其钙盐在药物制造中的用途，其中所述EDTA或EGTA以产生0.2至10mg/ml的浓度的水平存在于所述组合物中，并且所述组合物被配制用于在肠道中递送所述化合物。
16.(i)治疗化合物；和(ii)EDTA或EGTA或其钙或镁盐在药物制造中的用途，其中所述EDTA或EGTA以产生0.3至5mg/ml的浓度的水平存在于所述组合物中，并且所述组合物被配制用于在肠道中递送所述化合物。
17.(i)治疗化合物；和(ii)EDTA或EGTA或其钙或镁盐在药物制造中的用途，其中所述EDTA或EGTA以产生0.2至1mg/ml的浓度的水平存在于所述组合物中，并且所述组合物被配制用于在肠道中递送所述化合物。
18.如权利要求14-17中任一项所述的用途，其中所述治疗化合物选自包含以下的组：胰岛素；降钙素；人血清白蛋白；生长激素；生长激素释放因子；甘丙肽；甲状旁腺激素；肽YY；胃泌酸调节素；凝血蛋白，例如激肽原、凝血酶原、纤维蛋白原、因子VII、因子VIII或因子IX；促红细胞生成素和EPO模拟物；集落刺激因子，包括GCSF和GMCSF；血小板源性生长因子；表皮生长因子；成纤维细胞生长因子；转化生长因子；GLP-1、GLP-2；GLP-1类似物和融合蛋白、GIP、胰高血糖素；艾塞那肽；瘦素；GAG；细胞因子；胰岛素样生长因子；骨和软骨诱导因子；神经营养因子；白介素，包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；干扰素，包括干扰素γ、干扰素-1a、干扰素α；TNFα；TNFβ；TGF-β；霍乱毒素A和B片段；大肠杆菌肠毒素A和B片段；胰泌素；酶，包括组蛋白脱乙酰酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、腺苷脱氨酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、蛋白酶、脂肪酶、糖酶、核苷酸酶、聚合酶、激酶和磷酸酶；转运或结合蛋白，尤其是结合和/或转运维生素、金属离子、氨基酸或脂质或脂蛋白的那些，例如胆固醇酯转运蛋白、磷脂转运蛋白、HDL结合蛋白；结缔组织蛋白，例如胶原蛋白、弹性蛋白或纤连蛋白；肌肉蛋白，例如肌动蛋白、肌球蛋白、肌营养不良蛋白或微型肌营养不良蛋白；神经元、肝脏、心脏或脂肪细胞蛋白；细胞毒性蛋白；细胞色素；能够引起细胞复制、生长或分化的蛋白；信号传导分子，例如细胞内信号传导蛋白或细胞外信号传导蛋白(例如激素)；营养因子，例如BDNF、CNTF5NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、VEGF、NT3、T3和HARP；载脂蛋白；抗体分子、抗体片段、单域抗体；可溶形式的受体，例如T细胞受体和细胞因子、干扰素或趋化因子的受体；含有抗原表位和片段的蛋白质或肽；以及上述任一者的白蛋白融合蛋白、衍生物、缀合物和序列变体。
19.根据权利要求14-18中任一项所述的用途，所述用途还包含鹅去氧胆酸盐和/或没食子酸丙酯。
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