CN116916904A - 用于基因编辑的脂质制剂 - Google Patents

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CN116916904A
CN116916904A CN202180076945.XA CN202180076945A CN116916904A CN 116916904 A CN116916904 A CN 116916904A CN 202180076945 A CN202180076945 A CN 202180076945A CN 116916904 A CN116916904 A CN 116916904A
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卡兰特赫塔西尔·G·拉杰夫
索维克·比斯瓦斯
帕德玛·马尔亚拉
利萨·N·卡西维奇
亚伦·比奇
托马斯·V·科拉克
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Weihu Medical Co ltd
Original Assignee
Weihu Medical Co ltd
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Abstract

本公开涉及PEG‑脂质、阳离子脂质和/或可电离脂质以及包含它们的核酸‑脂质颗粒组合物。本公开还涉及制备、使用和递送所描述的脂质和含有脂质的颗粒的方法。

Description

用于基因编辑的脂质制剂
交叉引用
本申请要求2020年9月15日提交的美国临时申请第63/078,738号和2021年7月9日提交的美国临时申请第63/220,340号的权益，所述美国临时申请中的每一者通过引用以它的整体并入本文。
背景技术
含有脂质的颗粒已被用于包封治疗剂诸如核酸、小分子化合物和蛋白质，并且作为其进入细胞和其他细胞内区室中的运输载体。仍然持续需要开发新的脂质来包封治疗剂，并且改善此类基于纳米颗粒的运输载体的安全性、功效和特异性。
发明内容
本文描述了新型脂质和包含所述脂质的脂质纳米颗粒。在一个方面，描述了新型氨基脂质。在另一方面，描述了新型PEG-脂质。在另外方面，描述了包含一种或多种新型氨基脂质和/或新型PEG-脂质的新型脂质纳米颗粒。在一个方面，如本文所述的纳米颗粒包含以下中的一者或多者：氨基脂质、中性脂质、PEG-脂质、固醇或其衍生物以及任选的核酸分子实体、核酸稳定剂、表面活性剂和抗氧化剂中的一者或多者。本文还描述了使用和制备所述脂质和脂质纳米颗粒的方法。
在一个方面，本文公开了一种具有式(I)的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R1和R2中的每一者独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、C3-C30杂烷基、C3-C30杂烯基、C3-C30杂炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C2-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的；
X、Y和Z中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-、-S-或键；
每个L独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-N＝CR4-、-CR4＝N-O-、-O-、-S-、-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
R3是-C0-C10亚烷基-NR7R8、-C0-C10亚烷基-杂环烷基或-C0-C10亚烷基-杂环芳基，其中所述亚烷基、杂环烷基和杂环芳基独立地是被取代的或未被取代的；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
R5是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
每个R6独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基，其中所述烷基、所述烯基和炔基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；
R7和R8中的每一者独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基，或R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环基；并且
n、m和q中的每一者独立地是0、1、2、3、4或5。
在一个方面，本文公开了一种具有式(I*)的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R1是氢、C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、C3-C30杂烷基、C3-C30杂烯基、C3-C30杂炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C2-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的；
R2是氢、C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、C3-C30杂烷基、C3-C30杂烯基、C3-C30杂炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C2-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的；
X、Y和Z中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-R11C(＝O)N(R4)R9-、-NR7C(＝O)R9-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-R11C(＝O)OR9-、-R11OC(＝O)R9-、-R11OC(＝O)OR9-、-R11N(R4)C(＝O)OR9-、-R11OC(＝O)N(R4)R9-、-R11(NR4)C(＝O)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝NR4)R9-、-R11C(＝S)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝S)R9-、-R11C(＝S)OR9-、-R11OC(＝S)R9-、-R11OC(＝S)OR9-、-R11N(R4)C(＝S)OR9-、-R11OC(＝S)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝S)N(R4)R9-、-R11C(＝O)SR9-、-R11SC(＝O)R9-、-R11OC(＝O)SR9-、-R11N(R4)C(＝O)SR9-、-R11SC(＝O)N(R4)R9-、-R11C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)R9-、-R11SC(＝S)OR9-、-R11N(R4)C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)N(R4)R9-、-R11C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)R9-、-R11SC(＝O)SR9-、-R11SC(＝S)SR9-、-R11N(R4)C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)N(R4)R9-、-R11OR9-、-R11SR9-、-O-、-S-或键；
每个L独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-N＝CR4-、-CR4＝N-O-、-O-、-S-、-R11C(＝O)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝O)R9-、-R11C(＝O)OR9-、-R11OC(＝O)R9-、-R11OC(＝O)OR9-、-R11N(R4)C(＝O)OR9-、-R11OC(＝O)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝O)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝NR4)N(R4)R9-、-R11C(＝S)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝S)R9-、-R11C(＝S)OR9-、-R11OC(＝S)R9-、-R11OC(＝S)OR9-、-R11N(R4)C(＝S)OR9-、-R11OC(＝S)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝S)N(R4)R9-、-R11C(＝O)SR9-、-R11SC(＝O)R9-、-R11OC(＝O)SR9-、-R11N(R4)C(＝O)SR9-、-R11SC(＝O)N(R4)R9-、-R11C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)R9-、-R11SC(＝S)OR9-、-R11N(R4)C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)N(R4)R9-、-R11C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)R9-、-R11SC(＝O)SR9-、-R11SC(＝S)SR9-、-R11N(R4)C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)N(R4)R9-、-R11O-N＝CR9-、-R11C(R10)＝N-OR9-、-R11OR9-、-R11SR9-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-、-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
R3是-C0-C10亚烷基-NR7R8、-C0-C10亚烷基-杂环烷基或-C0-C10亚烷基-杂环芳基，其中所述亚烷基、杂环烷基和杂环芳基独立地是被取代的或未被取代的；
每个R4独立地是氢、被取代的或未被取代的C1-C16烷基或被取代的或未被取代的C1-C16杂烷基；
R5是氢、被取代的或未被取代的-C0-C10亚烷基-L-R4；
每个R6独立地是氢、C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基，其中所述烷基、所述烯基和炔基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；
R7和R8中的每一者独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C16烷基、被取代的或未被取代的C1-C16杂烷基，或R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环基；并且
每个R9独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C16亚烷基或未被取代的C1-C16亚杂烷基；
每个R10独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C16亚烷基或未被取代的C1-C16亚杂烷基；并且每个R11独立地是被取代的或未被取代的C1-C16亚烷基或未被取代的C1-C16亚杂烷基。
n、m和q中的每一者独立地是0、1、2、3、4或5。
在一些实施方案中，式(I)或(I*)的氨基脂质具有式(Ia)的结构，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R1和R2中的每一者独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、C3-C30杂烷基、C3-C30杂烯基、C3-C30杂炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C2-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的；
X、Y和Z中的每一者独立地是C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-、-S-、-C1-C10亚烷基-O-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
每个L独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-N＝CR4-、-CR4＝N-O-、-O-、-S-、-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
R3是-C0-C10亚烷基-NR7R8或-C0-C10亚烷基-杂环烷基，其中所述亚烷基和杂环烷基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
每个R6独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基，其中所述烷基、所述烯基和炔基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；并且
R7和R8中的每一者独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基，或R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环基。
在另一方面，本文公开了一种具有式(Ib)的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐，
其中
X和Y中的每一者是相同的，并且选自：-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-SC(＝S)O-、-O-、-C1-C10亚烷基-O-和键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
R1和R2是相同的，并且选自：氢、C1-C30烷基、C1-C30杂烷基和Cy-C3-30烷基，其中所述烷基和杂烷基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
每个Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；并且
R7和R8中的每一者独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基，或R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环基；
A是-O-、-CH2-、-S-或-NR12-；
R12是氢、C1-C10烷基或C1-C10杂烷基，其中所述烷基和杂烷基各自独立地是被取代的或未被取代的；并且
Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基或被取代的或未被取代的杂芳基；
p是1、2、3、4、5或6。
在一些实施方案中，R6独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基，其中所述烷基、所述烯基和炔基各自独立地是被取代的或未被取代的。
在一个方面，本文公开了一种具有式(II)的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R1和R2中的每一者独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、C3-C30杂烷基、C3-C30杂烯基、C3-C30杂炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C1-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的；
X、Y和Z中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-、-S-或键；
每个L独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-N＝CR4-、-CR4＝N-O-、-O-、-S-、-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
R3是-C0-C10亚烷基-NR7R8、-C0-C10亚烷基-杂环烷基或-C0-C10亚烷基-杂环芳基，其中所述亚烷基、杂环烷基和杂环芳基独立地是被取代的或未被取代的；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
每个R6独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基，其中所述烷基、所述烯基和炔基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；
R7和R8中的每一者独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基，或R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环基；
a和b中的每一者独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；并且
m是0、1、2、3、4或5。
在一个方面，本文公开了一种具有式(II*)的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R1和R2中的每一者独立地是氢、C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、C3-C30杂烷基、C3-C30杂烯基、C3-C30杂炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C1-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的；
X、Y和Z中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-C(＝O)-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-、-S-或键；
每个L独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-N＝CR4-、-CR4＝N-O-、-O-、-S-、-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
R3是氢、-C1-C6烷基、-C0-C10亚烷基-NR7R8、-C0-C10亚烷基-杂环烷基或-C0-C10亚烷基-杂环芳基，其中所述烷基、亚烷基、杂环烷基和杂环芳基独立地是被取代的或未被取代的；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
每个R6独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基，其中所述烷基、所述烯基和炔基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；
R7和R8中的每一者独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基，或R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环基；
a和b中的每一者独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；并且
m是0、1、2、3、4或5。
在一个方面，本文公开了一种包含本文所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物的纳米颗粒组合物。在一个方面，本文公开了一种具有选自表1A的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在一个方面，本文公开了一种包含具有选自表1A的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物的纳米颗粒组合物。在一些实施方案中，所述氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的20mol％至80mol％。在一些实施方案中，所述氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的40mol％至60mol％。在一些实施方案中，所述氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的50mol％至60mol％。在一些实施方案中，所述氨基脂质或其盐或溶剂化物包含一个或多个可电离氮原子。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含一个或多个来自一种或多种氨基脂质的可电离氮原子。在一些实施方案中，所述纳米颗粒组合物仅包含一种氨基脂质或其盐或溶剂化物。在一些实施方案中，所述纳米颗粒组合物包含一种或多种核酸分子实体。在一些实施方案中，所述可电离氮原子与存在于所述核酸分子实体中的磷酸根基团的摩尔比(N与P或N/P比率)是约2至约20。在一些实施方案中，所述N/P比率是约2至约15、约2至约10、约2至约8、约2至约6、约3至约15、约3至约10、约3至约8、约3至约6、约4至约15、约4至约10、约4至约8或约4至约6。在一些实施方案中，所述N/P比率是约3.5至约10。在一些实施方案中，所述纳米颗粒组合物包含中性脂质。在一些实施方案中，所述中性脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约1mol％至约20mol％。在一些实施方案中，所述中性脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约2mol％至约25mol％。在一些实施方案中，所述中性脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约5mol％至约10mol％。在一些实施方案中，所述中性脂质选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、2-油酰基-1-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和神经鞘磷脂。在一些实施方案中，所述中性脂质是DSPC。在一些实施方案中，所述纳米颗粒组合物包含结构脂质。在一些实施方案中，所述结构脂质是固醇或其衍生物。在一些实施方案中，所述固醇或所述其衍生物是胆固醇或胆固醇衍生物。在一些实施方案中，所述结构脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约15mol％至约65mol％。在一些实施方案中，所述结构脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约30mol％至约60mol％。在一些实施方案中，所述结构脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约30mol％至约40mol％。在一些实施方案中，所述纳米颗粒组合物包含PEG-脂质。在一些实施方案中，所述PEG-脂质是表2的PEG-脂质。在一些实施方案中，所述PEG-脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约0.1mol％至约6mol％。在一些实施方案中，所述PEG-脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约2.0mol％至约2.5mol％。在一些实施方案中，所述PEG-脂质的数量平均分子量是约200Da至约5000Da。在一些实施方案中，所述一种或多种核酸分子实体包括靶向目标致病基因的指导RNA(gRNA)。在一些实施方案中，指导RNA是单指导RNA(sgRNA)。在一些实施方案中，目标致病基因在肝细胞中产生。在一些实施方案中，所述一种或多种核酸分子实体包括编码SpCas9、CBE和/或ABE蛋白的mRNA。在一些实施方案中，组合物包含核酸稳定剂。
在一个方面，本文公开了一种纳米颗粒组合物，所述纳米颗粒组合物包含：(a)一种或多种核酸分子实体；(b)本文所述的氨基脂质或其盐或溶剂化物，其中所述氨基脂质或其盐占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的20mol％至80mol％，其中所述氨基脂质或其盐包含一个或多个可电离氮原子，并且其中所述可电离氮原子与存在于所述核酸分子实体中的磷酸根基团的摩尔比是2至12；(c)中性脂质，所述中性脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的所述总脂质含量的2mol％至25mol％；(d)结构脂质，所述结构脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的所述总脂质含量的30mol％至60mol％；和(e)PEG-脂质，所述PEG-脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的所述总脂质含量的0.1mol％至6mol％。在一些实施方案中，组合物还包含核酸稳定剂。在一些实施方案中，核酸稳定剂包括聚乙二醇、西曲溴铵或壳聚糖。在一些实施方案中，核酸稳定剂包括具有约120至约2000Da的数量平均分子量的聚乙二醇。
在一个方面，本文公开了一种纳米颗粒组合物，所述纳米颗粒组合物包含：(a)一种或多种核酸分子实体；(b)氨基脂质或其盐，其中所述氨基脂质或其盐占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的20mol％至80mol％，其中所述氨基脂质或其盐包含一个或多个可电离氮原子，并且其中所述可电离氮原子与存在于所述核酸分子实体中的磷酸根基团的摩尔比是2至12；(c)中性脂质，所述中性脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的所述总脂质含量的2mol％至25mol％；(d)结构脂质，所述结构脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的所述总脂质含量的30mol％至60mol％；(e)PEG-脂质，所述PEG-脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的所述总脂质含量的0.1mol％至6mol％；和(f)核酸稳定剂，其中所述核酸稳定剂包括壳聚糖、西曲溴铵、具有约120至约2000Da的数量平均分子量的聚乙二醇或它们的组合。在一些实施方案中，核酸稳定剂包括PEG 200、PEG 400或PEG 600。在一些实施方案中，核酸稳定剂是PEG 400。在一些实施方案中，核酸稳定剂以按总重量计约0.01％至约20％的量存在于纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，核酸稳定剂以按总重量计约0.5％至约5％的量存在于纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，所述一种或多种核酸分子实体包括PCSK9 gRNA。在一些实施方案中，所述一种或多种核酸分子实体包括编码Cas核酸酶的mRNA。在一些实施方案中，所述一种或多种核酸分子实体包括mRNA、gRNA、siRNA、反义寡核苷酸、微RNA、抗微RNA剂、RNA激活剂、适体或它们的组合。在一些实施方案中，所述纳米颗粒组合物包含抗氧化剂。在一些实施方案中，所述抗氧化剂包括EDTA。在一些实施方案中，组合物包含表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂是脂肪酸或脂肪醇。在一些实施方案中，表面活性剂是C12-C24脂肪醇。在一些实施方案中，C12-C24脂肪醇是月桂醇、十三醇、肉豆蔻醇、十五醇、鲸蜡醇、棕榈油醇、十七醇、硬脂醇、油醇、十九醇、花生醇或它们的组合。在一些实施方案中，C12-C24脂肪醇是油醇、硬脂醇或它们的混合物。在一些实施方案中，表面活性剂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约1.0mol％至约10mol％。在一些实施方案中，纳米颗粒的中值直径是约50nm至约150nm。在一些实施方案中，纳米颗粒的多分散性指数是0至0.15。在一些实施方案中，纳米颗粒的多分散性指数是0至0.05。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的核酸包埋效率是至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
在一个方面，本文公开了一种具有式(III)的结构的PEG-脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R21和R22中的每一者独立地是被取代的或未被取代的C3-C30烷基
、被取代的或未被取代的C3-C30烯基或被取代的或未被取代的C3-C30炔基；
R26、R27和R28中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、
-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、
-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、
-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、
-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、
-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-
、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、
-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、
-SC(＝S)NR4-、-O(CH2)2C(O)O-、-O(CH2)2C(O)NH-、
-OC(O)(CH2)2O-、-OC(O)(CH2)2NH-、-O(CH2)2C(O)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)O-、-O(CH2)2C(NAc)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(O)O-、-NH(CH2)2C(O)NH-、NH(CH2)2C(O)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)O-、-NH(CH2)2C(NAc)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)--OC(O)(CH2)2N(CH3)-、-OC(NH)(CH2)2O-、-OC(NMe)(CH2)2NH-、-O2C(NH)(CH2)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O-、-S-或键；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
R23是-C0-C10亚烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24或-C1-C10亚杂烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24，其中所述亚烷基和亚杂烷基各自独立地是被取代的或未被取代的；
R24独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C3烷基；
R25是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
k1、k2和k3中的每一者独立地是0、1、2、3、4或5；并且
k4是选自1至100的整数。
在一个方面，本文公开了一种具有式(III*)的结构的PEG-脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R21是氢、被取代的或未被取代的C1-C30烷基、被取代的或未被取代的C3-C30烯基或被取代的或未被取代的C3-C30炔基；
R22是氢、被取代的或未被取代的C1-C30烷基、被取代的或未被取代的C3-C30烯基或被取代的或未被取代的C3-C30炔基；
R26、R27和R28中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-N(Ac)-、-OC(O)OCH2C(O)O-、-OC(O)OCH2C(O)NH--OC(O)NHCH2C(O)O-、-OC(O)NHCH2C(O)NH-、-OC(O)O(CH2)2C(O)O-、-OC(O)O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)NH(CH2)2C(O)O-、-OC(O)NH(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)O(CH2)3C(O)O-、-OC(O)O(CH2)3C(O)NH-、-OC(O)NH(CH2)3C(O)O-、-OC(O)NH(CH2)3C(O)NH-、-C(O)OCH2C(O)NH--C(O)NHCH2C(O)O-、-C(O)NHCH2C(O)NH-、-C(O)O(CH2)2C(O)O-、-C(O)O(CH2)2C(O)NH-、-C(O)NH(CH2)2C(O)O-、-C(O)NH(CH2)2C(O)NH-、-C(O)O(CH2)3C(O)O-、-C(O)O(CH2)3C(O)NH-、-C(O)NH(CH2)3C(O)O-、-C(O)NH(CH2)3C(O)NH-、-OC(＝O)NR4(CH2)1-3C(＝O)NH-、-OC(＝O)NR4(CH2)1-3C(＝O)O-、-C(＝O)NR4(CH2)1-3C(＝O)NH-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O(CH2)2C(O)O-、-O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)(CH2)2O-、-OC(O)(CH2)2NH-、-O(CH2)2C(O)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)O-、-O(CH2)2C(NAc)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(O)O-、-NH(CH2)2C(O)NH-、NH(CH2)2C(O)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)O-、-NH(CH2)2C(NAc)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)--OC(O)(CH2)2N(CH3)-、-OC(NH)(CH2)2O-、-OC(NMe)(CH2)2NH-、-O2C(NH)(CH2)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O-、-S-或键；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
R23是-C0-C10亚烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24、-C1-C10亚杂烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24、-C0-C10亚烷基-(O-CH2-CH2)k4-R24或-C1-C10亚杂烷基-(O-CH2-CH2)k4-R24，其中所述亚烷基和亚杂烷基各自独立地是被取代的或未被取代的；
R24独立地是氢、被取代的或未被取代的C1-C3烷基、-O-R4、-C(＝O)OH或-C(＝O)R4；
R25是氢或被取代的或未被取代的C1-C22烷基；
k1、k2和k3中的每一者独立地是0、1、2、3、4或5；并且
k4是选自1至100的整数。
在一些实施方案中，式(III)或(III*)的PEG-脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中
R21是被取代的或未被取代的C3-C30烷基、被取代的或未被取代的C3-C30烯基或被取代的或未被取代的C3-C30炔基；
R22是氢、被取代的或未被取代的C3-C30烷基、被取代的或未被取代的C3-C30烯基或被取代的或未被取代的C3-C30炔基；
R26、R27和R28中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-OC(＝O)NR4(CH2)1-3C(＝O)NH-、-OC(＝O)NR4(CH2)1-3C(＝O)O-、-C(＝O)NR4(CH2)1-3C(＝O)NH-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O(CH2)2C(O)O-、-O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)(CH2)2O-、-OC(O)(CH2)2NH-、-O(CH2)2C(O)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)O-、-O(CH2)2C(NAc)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(O)O-、-NH(CH2)2C(O)NH-、NH(CH2)2C(O)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)O-、-NH(CH2)2C(NAc)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)--OC(O)(CH2)2N(CH3)-、-OC(NH)(CH2)2O-、-OC(NMe)(CH2)2NH-、-O2C(NH)(CH2)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O-、-S-或键；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
R23是-C0-C10亚烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24或-C1-C10亚杂烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24，其中所述亚烷基和亚杂烷基各自独立地是被取代的或未被取代的；
R24独立地是氢、被取代的或未被取代的C1-C3烷基、-O-R4、-C(＝O)OR4或-C(＝O)R4；
R25是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
k1、k2和k3中的每一者独立地是0、1、2、3、4或5；并且
k4是选自1至100的整数。
在一个方面，本文公开了一种具有选自表2的结构的PEG-脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在一个方面，本文公开了一种包含所描述的纳米颗粒组合物和赋形剂或载体的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物包含编码基因编辑器核酸酶的mRNA。在一些实施方案中，所述药物组合物包含一种或多种指导RNA分子。在一些实施方案中，所述药物组合物包含PCSK9指导RNA。在一些实施方案中，所述药物组合物包含两种或更多种指导RNA分子。在一些实施方案中，所述两种或更多种指导RNA分子靶向两个或更多个目标基因。在一些实施方案中，所述mRNA编码Cas9核酸酶。在一些实施方案中，所述mRNA编码碱基编辑器核酸酶。在一些实施方案中，所述mRNA和所述一种或多种指导RNA分子存在于同一纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，所述mRNA和所述一种或多种指导RNA分子存在于不同纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，所述药物组合物中所述gRNA分子与所述mRNA的比率按重量计或按摩尔量计是约0.01至约100。在一些实施方案中，所述药物组合物中所述gRNA分子与所述mRNA的比率按重量计或按摩尔量计是约50:1、约40:1、约30:1、约20:1、约18:1、约16:1、约14:1、约12:1、约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9或约1:10。在一个方面，本文公开了一种药物组合物，所述药物组合物包含：如本文所述的第一纳米颗粒组合物和如本文所述的第二纳米颗粒组合物。在一些实施方案中，所述第一纳米颗粒组合物包含基因编辑器mRNA，并且所述第二纳米颗粒组合物包含一种或多种指导RNA分子。在一些实施方案中，所述药物组合物中指导RNA分子与mRNA的比率按重量计或按摩尔量计是约50:1、约40:1、约30:1、约20:1、约18:1、约16:1、约14:1、约12:1、约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9或约1:10。在一些实施方案中，所述药物组合物中指导RNA与mRNA的比率按重量计或按摩尔量计是约1:1。
在一个方面，本文公开了一种将核酸分子实体递送至细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与如本文所述的纳米颗粒组合物或药物组合物接触，借此将所述核酸分子实体递送至所述细胞。在一些实施方案中，所述细胞在体内、离体或在体外接触。在一个方面，本文公开了一种在细胞中产生目标多肽的方法，所述方法包括使所述细胞与本文所述的纳米颗粒组合物或药物组合物接触，其中所述纳米颗粒组合物或所述药物组合物包含核酸分子实体，并且其中所述核酸分子实体在所述细胞中翻译，由此产生所述多肽。在一个方面，本文公开了一种制备药物组合物的方法，所述方法包括将本文所述的第一纳米颗粒组合物和第二纳米颗粒组合物组合。在一个方面，本文公开了一种治疗哺乳动物的疾病或病况的方法，所述方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的本文所述的药物组合物。在一个方面，本文公开了一种编辑细胞中的PCSK9基因的方法，所述方法包括使所述细胞与本文所述的纳米颗粒组合物或药物组合物接触，其中所述纳米颗粒组合物或所述药物组合物包含PCSK9指导RNA。在一个方面，本文公开了一种产生本文所述的稳定化纳米颗粒组合物的方法，所述方法包括将核酸稳定剂与缺乏所述核酸稳定剂的纳米颗粒组合物组合。在一些实施方案中，在冷冻或储存之前将核酸稳定剂与纳米颗粒组合物组合。在一些实施方案中，在添加一种或多种核酸实体之前、与此并行或在此之后将核酸稳定剂与纳米颗粒组合物组合。在一些实施方案中，组合包括将核酸稳定剂与一种或多种核酸实体在水性缓冲液中混合。
在一个方面，本文公开了一种产生稳定化纳米颗粒组合物的方法，所述方法包括(a)将核酸稳定剂与一种或多种核酸分子实体组合，由此产生包含稳定化的一种或多种核酸分子实体的溶液；以及(b)将(a)的所述溶液与包含氨基脂质、中性脂质、结构脂质和PEG-脂质中的一者或多者的纳米颗粒组合物组合。在一些实施方案中，(a)中的组合包括将核酸稳定剂与一种或多种核酸实体在水性缓冲液中混合。在一些实施方案中，方法包括收集纳米颗粒组合物以及相对于具有约6.5至约8.0的pH的缓冲液透析纳米颗粒组合物。在一些实施方案中，核酸稳定剂是具有约120至约1000的数量平均分子量的聚乙二醇。
在一个方面，本文公开了一种制备包含脂质纳米颗粒的制剂的方法，其中所述纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)氨基脂质，和(iii)一种或多种选自结构脂质、中性脂质和PEG-脂质的脂质，所述方法包括(a)将所述氨基脂质的第一部分与所述一种或多种核酸分子实体在第一溶液中组合，其中所述第一部分占总氨基脂质的0.1mol％至99mol％；(b)将所述氨基脂质的剩余部分与所述一种或多种选自结构脂质、中性脂质和PEG-脂质的脂质在第二溶液中组合；(c)将所述第一溶液和所述第二溶液混合，由此产生所述脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，氨基脂质的第一部分被配置为中和一种或多种核酸分子实体中0.1-99％的磷酸根(基于N:P)。在一些实施方案中，氨基脂质的第一部分被配置为中和一种或多种核酸分子实体中0.5-90％的磷酸根(基于N:P)。在一些实施方案中，氨基脂质的第一部分被配置为中和一种或多种核酸分子实体中约10％、15％、25％、50％或75％的磷酸根(基于N:P)。在一些实施方案中，第一溶液是水性缓冲溶液。在一些实施方案中，第一溶液还包含核酸稳定剂。在一些实施方案中，将第一溶液和第二溶液于管线内混合器中混合。
本公开的额外方面和优势将根据以下详细描述而变得对本领域技术人员来说显而易见，在所述详细描述中，仅显示和描述本公开的说明性实施方案。如将认识到，本公开能够具有其他的和不同的实施方案，并且它的若干细节能够在各个明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本公开。因此，附图和描述在性质上应被视为是说明性的而非限制性的。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，所述引用的程度就好像已具体地和单独地指出将每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入一样。如果通过引用并入本文的出版物和专利或专利申请与说明书中含有的公开内容相抵触，那么说明书意图替代和/或优先于任何这种抵触材料。
附图说明
本公开的各个方面具体阐述于随附权利要求中。通过参考阐述其中利用本公开的原理的说明性实施方案的以下详细描述以及附图，将获得对本公开的特征和优势的更充分了解，在所述附图中：
图1说明除F1之外，LNP在0.5mg/kg总RNA剂量下在野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)中的PCSK9基因编辑。总RNA剂量F1：0.75mg/kg。LNP F1-F5通过使用SpCas9 mRNA和PCSK9gRNA构成。
图2A和2B说明来自用于测定PEG400(w/w)％的IP-RPLC-HPLC-ELSD方法的校正曲线和实例色谱图。校正曲线相对于三次拟合来拟合，因为ELSD检测具有非线性响应。
图3说明以从未冷冻的等分试样与三个冷冻/解冻循环后的等分试样两者将经GFPmRNA装载的LNP(在脂质组成和冷冻缓冲液方面相同，但在PEG400的存在性和位置方面不同)施加于HUH7人肝细胞系。72小时后测量GFP荧光。含有PEG400的制剂在三个冷冻/解冻循环之后未显示GFP表达和mRNA递送功效的降低，而没有PEG400的制剂经受递送功效的损失。
图4说明在表9和10中给出的剂量下并且在实施例14中描述的LNP F45-F51在野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)中在小鼠肝细胞中的PCSK9基因编辑。
图5说明在表9和10中给出的剂量下并且在实施例14中描述的LNP F52-F60在野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)中在小鼠肝细胞中的PCSK9基因编辑。剂量和运载物可见于这些表中。
图6说明在表9和10中给出的剂量下并且在实施例14中描述的LNP F32、F61、F62、F63在野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)中在小鼠肝细胞中的PCSK9基因编辑。剂量和运载物可见于这些表中。
图7说明在表9和10中给出的剂量下并且在实施例14中描述的LNP F64-F68在野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)中在小鼠肝细胞中的PCSK9基因编辑。剂量和运载物可见于这些表中。
图8说明在表9和10中给出的剂量下并且在实施例14中描述的LNP F69-F83在野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)中在小鼠肝细胞中的PCSK9基因编辑。剂量和运载物可见于这些表中。所有LNP都静脉内施用(RO)至野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)。
图9说明在表9和10中给出的剂量下并且在实施例14中描述的LNP F84-F91在野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)中在小鼠肝细胞中的PCSK9基因编辑。
图10说明在表9和10中给出的剂量下并且在实施例14中描述的F110、F123、F124和F143-F146在野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝3-5)中在小鼠肝细胞中的PCSK9基因编辑。
图11说明在表11和实施例15中给出的剂量下的LNP F92和F97-F100在野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)中在小鼠肝细胞中的PCSK9基因编辑。
图12说明在表12中给出的剂量下并且如实施例16中所述的LNP F93、F101-F103和F155在野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)中在小鼠肝细胞中的PCSK9基因编辑。所有LNP都静脉内施用(RO)至野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝3-5)。
图13说明如表15和16中所述的LNP F106-109在1mg/kg总RNA剂量下在野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)中在肝细胞处的PCSK9基因编辑。所有LNP都静脉内施用(RO)至野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)。
图14说明如表15和16中所述的LNP F111-118在0.5mg/kg总RNA剂量下在野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)中在小鼠肝细胞处的PCSK9基因编辑。所有LNP都静脉内施用(RO)至野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)。
图15说明如表9、15和16中所述的LNP F110、F111、119、120、121和122在0.5mg/kg总RNA剂量下在野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)中在小鼠肝细胞处的PCSK9基因编辑。所有LNP都静脉内施用(RO)至野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)。
图16说明对于分别如实施例17、18和23中所述的LNP F104和F105给出的PCSK9肝编辑％。F104和F105的制剂组成和表征数据分别在表13和14中给出。
图17说明LNP F94-F96和F147-F150的PCSK9编辑。这些在实施例14以及表9和10中被提及。
图18说明如表15和16中所述的LNP F128和F129在0.05mg/kg总RNA剂量下在野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)中在小鼠肝细胞处的PCSK9基因编辑。所有LNP都静脉内施用(RO)至野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)。
图19说明如实施例22和表17中所述的F151-F154的编辑％。
图20说明在以0.125mg/kg剂量来单次剂量施用如实施例24中所述的如表18中所示的处于6和8的N与P比率下的包含氨基脂质VL454、VL459和VL455的LNP F160-F165(n＝5)之后，在野生型C57BL/6雌性小鼠肝中实现的PCSK9基因编辑百分比。F151A是使用氨基脂质502构成的参考LNP。
图21说明在以0.1mg/kg总RNA剂量来单次剂量施用如实施例24，表19中所述的LNPF172-F177(n＝5)之后，野生型C57BL/6雌性小鼠肝中的PCSK9基因编辑百分比。施用的所有LNP都使用氨基脂质VL422构成。
图22(A)说明在以0.1mg/kg总RNA剂量来单次剂量施用LNP F151A、172和178-181(n＝5)(表20)之后，野生型C57BL/6雌性小鼠肝中的PCSK9基因编辑百分比。F151A是使用氨基脂质502构成的参考LNP。在LNP F178、F180和F181中，用PEG-脂质VP159替换可商购获得的PEG-脂质507。F179-F181包含氨基脂质VL422。图22(B)说明在以0.1mg/kg总RNA剂量来单次剂量施用LNP F151B、F193A-F193C(n＝5)(表20)之后，野生型C57BL/6雌性小鼠肝中的PCSK9基因编辑百分比。F151B是使用氨基脂质502构成的参考LNP。在LNP F19B和F193C中，用PEG-脂质VP177替换可商购获得的PEG-脂质507，并且用氨基脂质VL422配制。
图23(A)说明在单次剂量施用如实施例25，表23中所述的LNP F188、F190-F193之后，食蟹猴(n＝3)的肝中的ANGPTL3基因编辑百分比。F188和F192以1.5mg/kg总RNA剂量给药。F190、F191和F193以2mg/kg总RNA剂量给药。F188是包含氨基脂质502和PEG-脂质507的参考LNP。在F192中，用PEG-脂质VP159替换F188的PEG-脂质507。F190、190A、F191和F193包含氨基脂质VL422和PEG-脂质507。图23(B)说明在单次剂量施用如实施例25，表23中所述的LNP F190A和F190B之后，食蟹猴(n＝3)的肝中的ANGPTL3基因编辑百分比。F190A和F190B以2mg/kg总RNA剂量给药。在F190B中，用PEG-脂质VP159替换F190A的PEG-脂质507。
图24(A)说明在以0.25mg/kg总RNA剂量来单次剂量施用如实施例26，表24中所述的LNP F122A和F221-F226(n＝5)之后，野生型C57BL/6雌性小鼠肝中的PCSK9基因编辑百分比，并且图24(B)说明在单次剂量施用如实施例26，表24中所述的LNP F122A(以0.5和0.25mg/kg)和F226A-F226C(n＝5)(以0.25mg/kg总RNA剂量)之后，野生型C57BL/6雌性小鼠肝中的PCSK9基因编辑百分比。将脂肪醇掺入包含氨基脂质VL422的LNP使编辑改善。包含约6mol％的脂肪醇504的F223在0.25mg/kg总RNA下产生了等效于在0.5mg/kg下的不具有脂肪醇的相应LNP F122A的编辑。LNP组合物中10mol％的醇504进一步改善了编辑效率。评估的所有LNP都包含氨基脂质VL422。相较于在0.25mg/kg总RNA剂量下的不具有脂肪醇的相应LNP F122A，包含约6mol％和10％的脂肪醇513的制剂F226B和F226C在0.25mg/kg总RNA剂量下改善了编辑功效。评估的所有LNP都包含氨基脂质VL422。
图25说明在单次剂量施用如实施例40(表26)中所述的LNP F190A、F235-F237之后，食蟹猴(n＝3)的肝中的ANGPTL3基因编辑百分比。LNP F190A以2、1.5和1mg/kg总RNA给药。F236、F235和F237以2mg/kg总RNA给药。
图26说明在单次剂量施用LNP F190A、F235-F237(实施例40)之后，在第15天时食蟹猴(n＝3)的血清中ANGPTL3蛋白从基线敲低的百分比。F190A分别以2、1.5和1mg/kg RNA给药。F235、F236和F237以2mg/kg RNA给药。
图27说明在单次剂量施用如实施例42(表27)中所述的LNP F238和F239之后，食蟹猴(n＝3)的肝中的ANGPTL3基因编辑百分比。
图28说明在0、1、6和24小时时，氨基脂质502、VL422和VL454在人肝S9中的降解率。
图29说明在LNP施用之后来自食蟹猴的血浆中的氨基脂质VL422暴露概况。如实施例25和表23中所述的LNP F188以1.5mg/kg总RNA剂量给药，而F190、F191和F193以2mg/kg总RNA剂量给药。
具体实施方式
本公开涉及阳离子脂质和/或可电离脂质以及包含所述阳离子脂质和/或可电离脂质的含有脂质的颗粒。本公开还涉及将治疗剂(诸如核酸)递送至哺乳动物细胞的方法、在哺乳动物细胞中产生目标多肽的方法和治疗有需要的哺乳动物的疾病或病症的方法。举例来说，在细胞中产生目标多肽的方法可包括以下步骤：使本文所述的含有脂质的颗粒与所述细胞接触，由此将编码所述目标多肽的mRNA递送至所述细胞中，以及由此所述mRNA可被翻译以产生所述目标多肽。再举例来说，将治疗剂递送至哺乳动物细胞或器官的方法可涉及将本文所述的包含所述治疗剂的含有脂质的颗粒施用至对象，其中所述施用包括使所述细胞或器官与所述含有脂质的颗粒接触，借此将所述治疗剂递送至所述细胞或器官。
以下描述和实施例详细说明本公开的实施方案。应了解本公开不限于本文所述的特定实施方案，并且因此可变化。本领域技术人员将认识到存在本公开的众多变化和修改，所述众多变化和修改涵盖在本公开的范围内。
尽管本公开的各种特征可在单一实施方案的情形下描述，但特征还可单独地或以任何适合组合提供。相反地，尽管为明晰起见，本公开可在单独实施方案的情形下在本文中描述，但本公开还可以单一实施方案实施。
本文所用的章节标题仅出于组织目的，并且不应解释为限制所描述的主题。
所有术语都意图如它们将由本领域技术人员所理解的那样来理解。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与由本公开所属领域中的普通技术人员通常所理解相同的含义。
以下定义对本领域中的定义进行补充，并且针对本申请，而不应归于任何相关或无关的情况，例如归于任何共同拥有的专利或申请。尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料都可在实践中用于测试本公开，但本文描述了优选的材料和方法。因此，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不意图是限制性的。
I.定义
本文所用的术语仅出于描述特定情况的目的，并且不意图是限制性的。在本申请中，除非另外具体陈述，否则单数的使用包括复数。除非上下文另外明确指示，否则如本文所用，单数形式“一个(种)(a/an)”和“这个(种)(the)”也意图包括复数形式。
在本申请中，除非另外陈述，否则“或”的使用意指“和/或”。如本文所用的术语“和/或”和“它们的任何组合”以及它们的语法等效形式可互换使用。这些术语可表达任何组合都加以具体考虑。仅出于说明目的，以下短语“A、B和/或C”或“A、B、C或它们的任何组合”可意指“单独A；单独B；单独C；A和B；B和C；A和C；以及A、B和C”。除非上下文特指转折使用，否则术语“或”可以连接方式或以转折方式使用。
术语“约”或“近似”可意指在如由本领域普通技术人员测定的特定值的可接受误差范围内，所述可接受误差范围将部分地取决于如何测量或测定所述值，即测量系统的限制。举例来说，“约”可意指根据本领域中的实践在1个或大于1个标准偏差内。或者，“约”可意指给定值的至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。或者，特别是关于生物系统或过程，所述术语可意指在某一值的某一数量级内，在5倍内，或在2倍内。当在本申请和权利要求中描述特定值时，除非另外陈述，否则应假定术语“约”意指在特定值的可接受误差范围内。
如本说明书和一个或多个权利要求中所用，词语“包含(comprising)”(以及包含(comprising)的任何形式，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有”(以及具有(having)的任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括”(以及包括(including)的任何形式，诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及含有(containing)的任何形式，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括性的或开放式的，并且不排除额外的未叙述要素或方法步骤。可以预期的是，本说明书中讨论的任何实施方案都可关于本公开的任何方法或组合物来实施，并且反之亦然。此外，本公开的组合物可用于实现本公开的方法。
在说明书中提及“一些实施方案”、“一实施方案”、“一个实施方案”或“其他实施方案”意指与实施方案关联描述的特定特征、结构或特性包括在本公开的至少一些实施方案但未必所有实施方案中。为有助于理解本公开，以下定义了许多术语和短语。
如本文所用的术语“衍生物”指示在结构上与第二物质相关，并且可通过对所述第二物质的修饰而由所述第二物质衍生的化学或生物物质。特别地，如果第一化合物是第二化合物的衍生物，并且所述第二化合物与化学和/或生物活性相关，那么所述第一化合物就至少一个结构特征来说不同于所述第二化合物，同时保留(至少在某一程度上)所述第二化合物的所述化学和/或生物活性和与其相关的至少一个结构特征(例如序列、片段、官能团和其他结构特征)。以个案为基础以及在阅读本公开后，技术人员将能够确定第二化合物的必须在第一化合物中维持以保留第二化合物化学和/或生物活性的结构特征以及可用于证明所述化学和/或生物活性的保留的测定。示例性“衍生物”可包括前药、代谢物、对映体、非对映体、酯(例如酰基氧基烷基酯、烷氧基羰基氧基烷基酯、烷基酯、芳基酯、磷酸酯、磺酸酯、硫酸酯和含有二硫键的酯)、醚、酰胺、碳酸酯、硫代碳酸酯、N-酰基衍生物、N-酰基氧基烷基衍生物、叔胺的四级衍生物、N-曼尼希碱(N-Mannich base)、希夫碱(Schiff base)、氨基酸缀合物、磷酸酯、金属盐、磺酸酯等。在一些情况下，衍生物可包括对母体化合物的保留所述母体化合物的化学和/或生物活性的不重要的取代(即额外烷基/亚烷基)。
术语“药学上可接受”意指由联邦政府或州政府的监管机构核准或可由所述监管机构核准或列于美国药典或其他通常认可的药典中以在包括人类的动物中使用。
“药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂”是指可与剂一起施用至对象，并且不破坏所述剂的药理活性，并且当以足以递送所述剂的治疗量的剂量施用时无毒的赋形剂、载体或稀释剂。
“药学上可接受的盐”可为通常在本领域中被视为适用于与人类或动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏应答或其他问题或并发症的酸盐或碱盐。此类盐包括碱性残基诸如胺的矿物酸盐和有机酸盐，以及酸性残基诸如羧酸的碱金属盐或有机盐。具体药物盐包括但不限于诸如以下的酸的盐：盐酸、磷酸、氢溴酸、苹果酸、乙醇酸、反丁烯二酸、硫酸、氨基磺酸、磺胺酸、甲酸、甲苯磺酸、甲烷磺酸、苯磺酸、乙烷二磺酸、2-羟基乙基磺酸、硝酸、苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、硬脂酸、水杨酸、谷氨酸、抗坏血酸、帕莫酸(pamoic)、丁二酸、反丁烯二酸、顺丁烯二酸、丙酸、羟基顺丁烯二酸、氢碘酸、苯乙酸、链烷酸诸如乙酸、HOOC-(CH2)n-COOH(其中n是0-4)等。类似地，药学上可接受的阳离子包括但不限于钠、钾、钙、铝、锂和铵。本领域普通技术人员根据本公开以及本领域中的知识将认识到其他药学上可接受的盐包括由Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,MackPublishing Company,Easton,PA,第1418页(1985)列出的那些。一般来说，药学上可接受的酸盐或碱盐可通过任何常规化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。简要来说，此类盐可通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的适当碱或酸在适当溶剂中反应来制备。
如本文所用，术语“治疗有效量”意指待递送的剂(例如核酸、药物、有效载荷、组合物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的当施用至罹患或易患感染、疾病、病症和/或病况的对象时足以治疗所述感染、疾病、病症和/或病况，改善所述感染、疾病、病症和/或病况的症状，诊断、预防所述感染、疾病、病症和/或病况，以及/或者延迟所述感染、疾病、病症和/或病况的发作的量。
本文提供的范围应理解为是范围内所有值的简写形式。举例来说，1至50的范围应理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50组成的组的任何数字、数字组合或子范围，以及以上提及的整数之间的所有间插小数值，诸如像1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，特别考虑从范围的任一端点延伸的“嵌套子范围”。举例来说，示例性范围1至50的嵌套子范围可包括在一个方向上的1至10、1至20、1至30和1至40，或在另一方向上的50至40、50至30、50至20和50至10。
术语“对象”是指作为治疗、观察或实验对象的动物。仅举例来说，对象包括但不限于哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，诸如非人灵长类动物、牛科动物、马科动物、犬科动物、羊科动物或猫科动物。
术语“治疗(treat/treated/treating/treating)”等意指减轻或改善病症和/或与其相关的症状(例如瘤形成或肿瘤)。“治疗”可指在疾病或病况发作或怀疑发作之后将LNP组合物施用至对象。“治疗”包括“缓和”的概念，其是指减小与疾病或病况相关的任何症状或其他有害影响和/或与所述疾病或病况相关的副作用的发生或复发的频率，或严重性。术语“治疗”还涵盖“管理”的概念，其是指降低患者的特定疾病或病症的严重性，或延迟它的复发，例如延长已罹患所述疾病的患者的缓解时期。术语“治疗”还涵盖如先前陈述的“预防(prevent/preventing/prevention)”的概念。应了解，尽管不排除，但治疗病症或病状不要求所述病症、病状或与其相关的症状被完全消除。
除非另外指示，否则术语“被取代”是指给定结构中的一个或多个氢基团被包括但不限于以下的指定取代基的基团替换：卤基、烷基、烯基、炔基、芳基、杂环基、硫醇、烷基硫基、氧代基、硫氧基、芳基硫基、烷基硫基烷基、芳基硫基烷基、烷基磺酰基、烷基磺酰基烷基、芳基磺酰基烷基、烷氧基、芳基氧基、芳烷氧基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、卤代烷基、氨基、三氟甲基、氰基、硝基、烷基氨基、芳基氨基、烷基氨基烷基、芳基氨基烷基、氨基烷基氨基、羟基、烷氧基烷基、羧基烷基、烷氧基羰基烷基、氨基羰基烷基、酰基、芳烷氧基羰基、羧酸、磺酸、磺酰基、膦酸、芳基、杂芳基、杂环基团和脂族基团。应了解取代基可进一步被取代。示例性取代基包括氨基、烷基氨基等。
如本文所用，术语“取代基”意指在核心分子的原子上的位置变量，其在指定原子位置处取代，从而替换指定原子上的一个或多个氢，条件是不超过指定原子的正常化合价，并且取代产生稳定化合物。取代基和/或变量的组合只有当此类组合产生稳定化合物时才是可容许的。本领域普通技术人员应注意，如本文所述或所示的具有似乎未满足的化合价的任何碳以及杂原子被认为具有足够数目的氢原子来满足描述或显示的化合价。在某些情况下，可在本文中在取代基组内描述、显示或列出一种或多种具有双键作为连接点的取代基(例如“氧代基”或“＝O”)，其中结构可仅显示单键作为与式(I)、式(I*)、式(Ia)、式(II)、式(II*)、式(III)或式(III*)的核心结构的连接点。本领域普通技术人员将了解，尽管仅显示单键，但双键意图用于那些取代基。
术语“烷基”是指具有一个至二十个碳原子，并且通过单键连接于分子的其余部分的直链或支链烃链基团。包含至多10个碳原子的烷基被称为C1-C10烷基，同样地，举例来说，包含至多6个碳原子的烷基是C1-C6烷基。包含其他数目的碳原子的烷基(和本文定义的其他部分)以类似方式表示。烷基包括但不限于C1-C10烷基、C1-C9烷基、C1-C8烷基、C1-C7烷基、C1-C6烷基、C1-C5烷基、C1-C4烷基、C1-C3烷基、C1-C2烷基、C2-C8烷基、C3-C8烷基和C4-C8烷基。代表性烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基、1-乙基-丙基等。在一些实施方案中，烷基是甲基或乙基。在一些实施方案中，烷基是-CH(CH3)2或-C(CH3)3。除非在说明书中另外具体陈述，否则烷基可如下所述任选地被取代。“亚烷基”或“亚烷基链”是指将分子的其余部分连接于基团的直链或支链二价烃链。在一些实施方案中，亚烷基是-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，亚烷基是-CH2-。在一些实施方案中，亚烷基是-CH2CH2-。在一些实施方案中，亚烷基是-CH2CH2CH2-。
术语“芳基”是指由包含至少一个芳族环的烃环系统衍生的基团。在一些实施方案中，芳基包含氢和6至30个碳原子。芳基可为单环、双环、三环或四环环系统，其可包括稠合(当与环烷基或杂环烷基环稠合时，芳基通过芳族环原子键合)或桥接环系统。在一些实施方案中，芳基是6至10元芳基。在一些实施方案中，芳基是6元芳基。芳基包括但不限于由亚蒽基、亚萘基、亚菲基、蒽、薁、苯、荧蒽、芴、茚满、茚、萘、丙烯合萘、菲、七曜烯、芘和三亚苯的烃环系统衍生的芳基。在一些实施方案中，芳基是苯基。除非在说明书中另外具体陈述，否则芳基可任选地被取代，例如被卤素、氨基、烷基氨基、氨基烷基、腈、硝基、羟基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、杂烷基、烷氧基、芳基、环烷基、杂环烷基、杂芳基、-S(O)2NH-C1-C6烷基等取代。在一些实施方案中，芳基任选地被卤素、甲基、乙基、-CN、-CF3、-OH、-OMe、-NH2、-NO2、-S(O)2NH2、-S(O)2NHCH3、-S(O)2NHCH2CH3、-S(O)2NHCH(CH3)2、-S(O)2N(CH3)2或-S(O)2NHC(CH3)3取代。在一些实施方案中，芳基任选地被卤素、甲基、乙基、-CN、-CF3、-OH或-OMe取代。在一些实施方案中，芳基任选地被卤素取代。在一些实施方案中，芳基被烷基、烯基、炔基、卤代烷基或杂烷基取代，其中每个烷基、烯基、炔基、卤代烷基、杂烷基独立地未被取代或被卤素、甲基、乙基、-CN、-CF3、-OH、-OMe、-NH2或-NO2取代。
术语“烯基”是指一种类型的烷基，其中存在至少一个碳-碳双键。在一个实施方案中，烯基具有式-C(Ra)＝CRa 2，其中Ra是指所述烯基的剩余部分，其可为相同的或不同的。在一些实施方案中，Ra是H或烷基。在一些实施方案中，烯基选自乙烯基(ethenyl)(即乙烯基(vinyl))、丙烯基(即烯丙基)、丁烯基、戊烯基、戊二烯基等。烯基的非限制性实例包括-CH＝CH2、-C(CH3)＝CH2、-CH＝CHCH3、-C(CH3)＝CHCH3和-CH2CH＝CH2。术语“亚烯基”或“亚烯基链”是指其中存在至少一个碳-碳双键的亚烷基。在一些实施方案中，亚烯基是-CH＝CH-、-CH2CH2CH＝CH-或-CH＝CHCH2CH2-。在一些实施方案中，亚烯基是-CH＝CH-。在一些实施方案中，亚烯基是-CH2CH2CH＝CH-。在一些实施方案中，亚烯基是-CH＝CHCH2CH2-。
术语“炔基”是指一种类型的烷基，其中存在至少一个碳-碳三键。在一个实施方案中，炔基具有式-C≡CRa，其中Ra是指所述炔基的剩余部分。在一些实施方案中，Ra是H或烷基。在一些实施方案中，炔基选自乙炔基(ethynyl)(即乙炔基(acetylenyl))、丙炔基(即炔丙基)、丁炔基、戊炔基等。炔基的非限制性实例包括-C≡CH、-C≡CCH3和-CH2C≡CH。术语“亚炔基”或“亚炔基链”是指其中存在至少一个碳-碳三键的亚烷基。在一些实施方案中，亚炔基是-C≡C-、-CH2CH2C≡C-或-C≡CCH2CH2-。在一些实施方案中，亚炔基是-C≡C-。在一些实施方案中，亚炔基是-CH2CH2C≡C-。在一些实施方案中，亚炔基是-C≡CCH2CH2-。
术语“环烷基”是指单环或多环非芳族基团，其中形成环的每个原子(即骨架原子)是碳原子。在一些实施方案中，环烷基是饱和的或部分不饱和的。在一些实施方案中，环烷基是螺环或桥接化合物。在一些实施方案中，环烷基与芳族环稠合(在所述情况下，环烷基通过非芳族环碳原子键合)。环烷基包括具有3至10个环原子的基团。代表性环烷基包括但不限于具有三至十个碳原子、三至八个碳原子、三至六个碳原子、或三至五个碳原子的环烷基。单环环烷基包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。在一些实施方案中，单环环烷基是环丙基、环丁基、环戊基或环己基。在一些实施方案中，单环环烷基是环戊烯基或环己烯基。在一些实施方案中，单环环烷基是环戊烯基。多环基团包括例如金刚烷基、1,2-二氢萘基、1,4-二氢萘基、四氢萘基、十氢萘基、3,4-二氢萘基-1(2H)-酮、螺[2.2]戊基、降冰片基和双环[1.1.1]戊基。除非在说明书中另外具体陈述，否则环烷基可任选地被取代。视结构而定，环烷基可为单价的或二价的(即亚环烷基)。
术语“杂环”或“杂环族”是指包括至少一个选自氮、氧和硫的杂原子的杂芳族环(也被称为杂芳基)和杂环烷基环(也被称为杂脂环族基团)，其中每个杂环基团在它的环系统中具有3至12个原子，并且条件是任何环都不含有两个相邻的O或S原子。“杂环基”是通过从杂环化合物的任何环原子移除氢原子所形成的单价基团。在一些实施方案中，杂环是单环、双环、多环、螺环或桥接化合物。非芳族杂环基团(也被称为杂环烷基)包括在它的环系统中具有3至12个原子的环，并且芳族杂环基团包括在它的环系统中具有5至12个原子的环。杂环基团包括苯并稠环系统。非芳族杂环基团的实例是吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、噁唑烷酮基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢噻喃基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、噻噁烷基、哌嗪基、氮杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、高哌啶基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、氧氮杂基、二氮杂/>基、硫氮杂/>基、1,2,3,6-四氢吡啶基、吡咯啉-2-基、吡咯啉-3-基、吲哚啉基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二氧杂环己烷基、1,3-二氧杂环戊烷基、吡唑啉基、二硫杂环己烷基、二硫杂环戊烷基、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮杂双环[3.1.0]己烷基、3-氮杂双环[4.1.0]庚烷基、3h-吲哚基、吲哚啉-2-酮基、异吲哚啉-1-酮基、异吲哚啉-1,3-二酮基、3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮基、3,4-二氢喹啉-2(1H)-酮基、异吲哚啉-1,3-二硫酮基、苯并[d]噁唑-2(3H)-酮基、1H-苯并[d]咪唑-2(3H)-酮基、苯并[d]噻唑-2(3H)-酮基和喹嗪基。芳族杂环基团的实例是吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲哚嗪基、酞嗪基、哒嗪基、三嗪基、异吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、噻二唑基、呋咱基、苯并呋咱基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基和呋喃并吡啶基。当可能时，前述基团是C连接的(或C键联的)或N连接的。举例来说，由吡咯衍生的基团包括吡咯-1-基(N连接的)或吡咯-3-基(C连接的)两者。此外，由咪唑衍生的基团包括咪唑-1-基或咪唑-3-基(均是N连接的)或咪唑-2-基、咪唑-4-基或咪唑-5-基(全都是C连接的)。杂环基团包括苯并稠环系统。非芳族杂环任选地被一个或两个氧代基(＝O)部分取代，诸如吡咯烷-2-酮。在一些实施方案中，双环杂环的两个环中的至少一者是芳族。在一些实施方案中，双环杂环的两个环均是芳族。
术语“杂环烷基”是指包括至少一个选自氮、氧和硫的环杂原子的环烷基。除非在说明书中另外具体陈述，否则杂环烷基可为单环或双环环系统，其可包括稠合(当与芳基或杂芳基环稠合时，杂环烷基通过非芳族环原子键合)或桥接环系统。杂环基中的氮、碳或硫原子可任选地被氧化。氮原子可任选地被季铵化。杂环烷基是部分或完全饱和的。杂环烷基的实例包括但不限于二氧杂环戊烷基、噻吩基[1,3]二硫杂环己烷基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三硫杂环己烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉基、噻吗啉基、1-氧代-硫代吗啉基、1,1-二氧代-硫代吗啉基。术语杂环烷基还包括碳水化合物的所有环形式，所述碳水化合物包括但不限于单糖、二糖和寡糖。在一些实施方案中，杂环烷基在环中具有2至10个碳。在一些实施方案中，杂环烷基在环中具有2至10个碳以及1或2个N原子。在一些实施方案中，杂环烷基在环中具有2至10个碳以及3或4个N原子。在一些实施方案中，杂环烷基在环中具有2至12个碳、0-2个N原子、0-2个O原子、0-2个P原子和0-1个S原子。在一些实施方案中，杂环烷基在环中具有2至12个碳、1-3个N原子、0-1个O原子和0-1个S原子。应了解，当提及杂环烷基中碳原子的数目时，所述杂环烷基中碳原子的数目与构成所述杂环烷基的原子(包括杂原子)(即杂环烷基环的骨架原子)的总数不相同。除非在说明书中另外具体陈述，否则杂环烷基可任选地被取代。如本文所用，术语“亚杂环烷基”可指二价杂环烷基。
术语“杂芳基”是指包括一个或多个选自氮、氧和硫的环杂原子的芳基。杂芳基是单环的或双环的。单环杂芳基的说明性实例包括吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、哒嗪基、三嗪基、噁二唑基、噻二唑基、呋咱基、吲哚嗪、吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、吲唑、苯并咪唑、嘌呤、喹嗪、喹啉、异喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、1,8-萘啶和蝶啶。单环杂芳基的说明性实例包括吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、哒嗪基、三嗪基、噁二唑基、噻二唑基和呋咱基。双环杂芳基的说明性实例包括吲哚嗪、吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、吲唑、苯并咪唑、嘌呤、喹嗪、喹啉、异喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、1,8-萘啶和蝶啶。在一些实施方案中，杂芳基是吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基、噻吩基、噻二唑基或呋喃基。在一些实施方案中，杂芳基在环中含有0-6个N原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中含有1-4个N原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中含有4-6个N原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中含有0-4个N原子、0-1个O原子、0-1个P原子和0-1个S原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中含有1-4个N原子、0-1个O原子和0-1个S原子。在一些实施方案中，杂芳基是C1-C9杂芳基。在一些实施方案中，单环杂芳基是C1-C5杂芳基。在一些实施方案中，单环杂芳基是5元或6元杂芳基。在一些实施方案中，双环杂芳基是C6-C9杂芳基。在一些实施方案中，杂芳基被部分还原以形成本文定义的杂环烷基。在一些实施方案中，杂芳基被完全还原以形成本文定义的杂环烷基。
术语“杂烷基”是指其中烷基的一个或多个骨架原子选自除碳以外的原子例如氧、氮(例如-NH-、-N(烷基)-或-N(芳基)-)、硫(例如-S-、-S(＝O)-或-S(＝O)2-)或它们的组合的烷基。在一些实施方案中，杂烷基在所述杂烷基的碳原子处连接于分子的其余部分。在一些实施方案中，杂烷基在所述杂烷基的杂原子处连接于分子的其余部分。在一些实施方案中，杂烷基是C1-C6杂烷基。代表性杂烷基包括但不限于-OCH2OMe、-OCH2CH2OH、-OCH2CH2OMe或-OCH2CH2OCH2CH2NH2。“亚杂烷基”或“亚杂烷基链”是指将分子的其余部分连接于基团的直链或支链二价杂烷基链。除非在说明书中另外具体陈述，否则杂烷基或亚杂烷基可任选地被取代。代表性亚杂烷基包括但不限于-OCH2CH2O-、-OCH2CH2OCH2CH2O-或-OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2O-。
术语“杂烯基”是指其中烯基的一个或多个骨架原子选自除碳以外的原子例如氧、氮(例如-NH-、-N(烷基)-或-N(芳基)-)、硫(例如-S-、-S(＝O)-或-S(＝O)2-)或它们的组合的烯基。在一些实施方案中，杂烯基在所述杂烯基的碳原子处连接于分子的其余部分。在一些实施方案中，杂烯基在所述杂烯基的杂原子处连接于分子的其余部分。在一些实施方案中，杂烷基是C1-C6杂烯基。
术语“杂炔基”是指其中炔基的一个或多个骨架原子选自除碳以外的原子例如氧、氮(例如-NH-、-N(烷基)-或-N(芳基)-)、硫(例如-S-、-S(＝O)-或-S(＝O)2-)或它们的组合的炔基。在一些实施方案中，杂炔基在所述杂炔基的碳原子处连接于分子的其余部分。在一些实施方案中，杂炔基在所述杂炔基的杂原子处连接于分子的其余部分。在一些实施方案中，杂烷基是C1-C6杂炔基。
如本文所用，“N/P比率”是例如在包含脂质组分和RNA的纳米颗粒组合物中一种氨基脂质(或多种氨基脂质)中的可电离(例如在接近于脂质纳米颗粒的pKa的pH范围内)氮原子与一种核酸分子实体(或多种核酸分子实体)中的磷酸基团的摩尔比。可电离氮原子可包括例如可在约pH 1、约pH 2、约pH 3、约pH 4、约pH5、约pH 6、约pH 7、约pH 7.5或约pH 8或更高pH下质子化的氮原子。生理pH范围可包括例如不同细胞区室(诸如器官、组织和细胞)和体液(诸如血液、CSF、胃液、乳汁、胆汁、唾液、泪和尿)的pH范围。在某些具体实施方案中，生理pH范围是指哺乳动物的血液的pH范围，例如约7.35至约7.45。在一些实施方案中，可电离氮原子是指可在5至14的pH范围内电离的那些氮原子。
对于不含有磷酸基团的有效载荷，N/P比率可指脂质中的可电离氮原子与有效载荷中的总负电荷的摩尔比。举例来说，LNP组合物的N/P比率可指所述LNP组合物中的总可电离氮原子与存在于所述组合物中的有效载荷中的总负电荷的摩尔比。
如本文所用，氨基脂质可含有至少一个在pH范围4至14之间可质子化(或可电离)的伯胺、仲胺或叔胺部分。在一些实施方案中，一个或多个胺部分充当表1A和1B中所述的氨基脂质的亲水性头基。当核酸-脂质纳米颗粒制剂中一种氨基脂质(或多种氨基脂质)的大部分胺部分在生理pH下质子化时，那么纳米颗粒可被称为阳离子脂质纳米颗粒(cLNP)。当核酸-脂质纳米颗粒制剂中一种氨基脂质(或多种氨基脂质)的大部分胺部分在生理pH下不质子化，但可在酸性pH例如内体pH下质子化时，可被称为可电离脂质纳米颗粒(iLNP)。构成cLNP的氨基脂质可通常被称为阳离子氨基脂质(c脂质)。构成iLNP的氨基脂质可被称为可电离氨基脂质(i脂质)。在生理pH下，表1A和1B中所述的氨基脂质可为i脂质或c脂质。
如本文所用，“脂质纳米颗粒(LNP)组合物”或“纳米颗粒组合物”是包含一种或多种所描述的脂质的组合物。LNP组合物通常大小处于微米或更小的数量级，并且可包括脂质双层。纳米颗粒组合物涵盖脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体(例如脂质囊泡)和脂质复合物。举例来说，纳米颗粒组合物可为具有直径是500nm或更小的脂质双层的脂质体。本文所述的LNP可具有约1nm至约2500nm、约10nm至约1500nm、约20nm至约1000nm、约30nm至约150nm、约40nm至约150nm、约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm、约70nm至约100nm、约80nm至约100nm、约90nm至约100nm、约70至约90nm、约80nm至约90nm或约70nm至约80nm的平均直径。本文所述的LNP可具有约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、150nm或更大的平均直径。本文所述的LNP可为基本上无毒的。
如本文所用，“PEG-脂质”或“PEG-脂质”是指包含聚乙二醇组分的脂质。
如本文所用，“磷脂”可指包括磷酸部分和一个或多个碳链诸如不饱和脂肪酸链的脂质。磷脂可包括一个或多个多重(例如双重或三重)键。在一些实施方案中，磷脂可有助于与膜融合。举例来说，阳离子磷脂可与膜(例如细胞膜或细胞内膜)的一种或多种带负电荷的磷脂相互作用。磷脂与膜的融合可允许LNP的一种或多种元件穿过膜，也就是将所述一种或多种元件递送至细胞。
术语“治疗剂”可指当施用至对象时具有治疗、诊断和/或预防作用和/或引发所需生物和/或药理作用的任何剂。治疗剂还可被称为“活性物”或“活性剂”。此类剂包括但不限于细胞毒素、放射性离子、化学治疗剂、小分子药物、蛋白质和核酸。
术语“核酸分子实体”可与“核酸”互换使用。如本文所用的术语“核酸”通常是指一种或多种核碱基、核苷或核苷酸，并且所述术语包括多核碱基、多核苷和多核苷酸。核酸可包括多核苷酸、单核苷酸和寡核苷酸。核酸可包括DNA、RNA或它们的混合物，并且可为单链、双链或部分单链或双链，并且可形成二级结构。在一些实施方案中，核酸具有多个双链区段和单链区段。举例来说，核酸可包含在它内部具有多个双链区段的多核苷酸，例如mRNA。DNA可呈例如反义分子、质粒DNA、预凝聚DNA、PCR产物、载体、表达盒、嵌合序列、染色体DNA或这些组的衍生物和组合的形式。RNA可呈siRNA、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA(vRNA)、CRISPR RNA、碱基编辑器RNA以及它们的组合的形式。核酸包括含有已知核苷酸类似物或经修饰主链残基或键联的核酸，其是合成的，天然存在的，以及非天然存在的，与参考核酸具有类似结合性质。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯；氨基磷酸酯；甲基膦酸酯；手性甲基膦酸酯；2’、3’、4’和5’取代的核糖核苷酸；2’、3’、4’和5’取代的2’-核糖核苷酸；被取代的和未被取代的碳环核苷酸；被取代的和未被取代的无环核苷酸以及肽核酸(PNA)。核酸的实例还包括无环和碳环核苷酸，诸如二醇核酸。除非具体限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸与参考核酸具有类似结合性质。除非另外指示，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其经保守修饰变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指示的序列。具体来说，简并密码子取代可通过产生其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人,Nucleic Acid Res.,19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J Biol.Chem.,260:2605-2608(1985)；Rossolini等人,Mal.Cell.Probes,8:91-98(1994))。“核苷酸”含有被取代的和/或未被取代的糖脱氧核糖(DNA)，或被取代的和/或未被取代的糖核糖(RNA)，或被取代的和/或未被取代的碳环，或被取代的和/或未被取代的无环部分(例如二醇核酸)；碱基和磷酸基团。核苷酸通过磷酸基团连接在一起。“碱基”包括嘌呤和嘧啶，所述嘌呤和嘧啶进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，所述合成衍生物包括但不限于放置新的反应性基团诸如但不限于胺、醇、硫醇、羧酸酯和卤代烷的修饰。术语“基因”是指包含为产生多肽或前体多肽所必需的部分长度或整个长度编码序列的核酸(例如DNA或RNA)序列。
除非另外指示，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其经保守修饰变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指示的序列。具体来说，简并密码子取代可通过产生其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人,Nucleic Acid Res.,19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.,260:2605-2608(1985)；Rossolini等人,Mol.Cell.Probes,8:91-98(1994))。
本公开涵盖经分离或基本上纯化的核酸分子和含有这些分子的组合物。如本文所用，“经分离”或“纯化的”DNA分子或RNA分子是离开它的天然环境而存在的DNA分子或RNA分子。经分离DNA分子或RNA分子可以纯化形式存在，或可存在于非天然环境诸如像转基因宿主细胞中。举例来说，“经分离”或“纯化的”核酸分子或其生物活性部分当通过重组技术产生时基本上不含其他细胞材料或培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。在一个实施方案中，“经分离”核酸不含在所述核酸所源于的生物体的基因组DNA中天然地侧接于所述核酸的序列(即位于所述核酸的5’和3'末端的序列)。举例来说，在一些实施方案中，经分离核酸分子可含有小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在所述核酸所源于的细胞的基因组DNA中天然地侧接于所述核酸分子的核苷酸序列。
II.脂质纳米颗粒(LNP)组合物
氨基脂质
本文描述了包含氨基脂质、磷脂、PEG-脂质、胆固醇或其衍生物、有效载荷或它们的任何组合的LNP组合物。在一些实施方案中，LNP组合物包含氨基脂质。示例性氨基脂质包括但不限于表1A中的脂质。在一些实施方案中，LNP组合物包含具有式(I)、式(I*)、式(Ia)、式(II)、式(II*)的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在一些实施方案中，LNP组合物包含具有式(Ia)的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在一些实施方案中，LNP包含多种氨基脂质。举例来说，LNP组合物可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种氨基脂质。再举例来说，LNP组合物可包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少9、至少10或至少20种氨基脂质。再举例来说，LNP组合物可包含至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多9、至多10、至多20或至多30种氨基脂质。
在一些实施方案中，LNP组合物包含一种或多种氨基脂质。在一些实施方案中，一种或多种氨基脂质占存在于颗粒中的总脂质的约40mol％至约65mol％。在一些实施方案中，一种或多种氨基脂质占存在于颗粒中的总脂质的约40mol％、约41mol％、约42mol％、约43mol％、约44mol％、约45mol％、约46mol％、约47mol％、约48mol％、约49mol％、约50mol％、约51mol％、约52mol％、约53mol％、约54mol％、约55mol％、约56mol％、约57mol％、约58mol％、约59mol％、约60mol％、约61mol％、约62mol％、约63mol％、约64mol％或约65mol％。
在一些实施方案中，氨基脂质是可电离脂质。可电离脂质可包含一个或多个可电离氮原子。在一些实施方案中，一个或多个可电离氮原子中的至少一者带正电荷。在一些实施方案中，LNP组合物中至少10mol％、20mol％、30mol％、40mol％、50mol％、60mol％、70mol％、80mol％、90mol％、95mol％或99mol％的可电离氮原子带正电荷。在一些实施方案中，氨基脂质包含伯胺、仲胺、叔胺、亚胺、酰胺、胍部分、组氨酸残基、赖氨酸残基、精氨酸残基或它们的任何组合。在一些实施方案中，氨基脂质包含伯胺、仲胺、叔胺、胍部分或它们的任何组合。在一些实施方案中，氨基脂质包含叔胺。
在一些实施方案中，氨基脂质是阳离子脂质。在一些实施方案中，氨基脂质是可电离脂质。在一些实施方案中，氨基脂质包含一个或多个氮原子。在一些实施方案中，氨基脂质包含一个或多个可电离氮原子。示例性阳离子脂质和/或可电离脂质包括但不限于3-(二(十二烷基)氨基)-N1,N1,4-三(十二烷基)-1-哌嗪乙胺(KL10)、N1-[2-(二(十二烷基)氨基)乙基]-N1,N4,N4-三(十二烷基)-1,4-哌嗪二乙胺(KL22)、14,25-二(十三烷基)-15,18,21,24-四氮杂-三十八烷(KL25)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-DMA)、4-(二甲基氨基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2R))和(2S)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2S))。
在一些实施方案中，氨基脂质是对称的，此可导致较少的代谢物，并且使得分子无手性。在一些实施方案中，氨基脂质含有更多数目的可水解键，此导致包含脂质的纳米颗粒的较快代谢清除。在一些实施方案中，相比于非对称的氨基脂质，对称无手性氨基脂质有助于在LNP形成之后产生更紧密和/或更小的脂质纳米颗粒，其中相较于较大尺寸的LNP颗粒，小颗粒导致高效递送至哺乳动物对象的肝。
在一个方面，本文公开了一种具有式(I)的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R1和R2中的每一者独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、C3-C10环烷基、C3-C30杂烷基、C3-C30杂烯基、C3-C30杂炔基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C2-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的；
X、Y和Z中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-、-S-或键；
每个L独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-N＝CR4-、-CR4＝N-O-、-O-、-S-、-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
R3是-C0-C10亚烷基-NR7R8、-C0-C10亚烷基-杂环烷基或-C0-C10亚烷基-杂环芳基，其中所述亚烷基、杂环烷基和杂环芳基独立地是被取代的或未被取代的；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
R5是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
每个R6独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基，其中所述烷基、所述烯基和炔基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环
烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；R7和R8中的每一者独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基，或R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环基；并且
n、m和q中的每一者独立地是0、1、2、3、4或5。
在式(I)的一些实施方案中，
X、Y和Z中的每一者独立地是-R11C(＝O)N(R9)R4-、-NR7C(＝O)R4-、
-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-R11C(＝O)OR4-、-R11OC(＝O)R4-、
-R11OC(＝O)OR4-、-R11N(R9)C(＝O)OR4-、-R11OC(＝O)N(R9)R4-、
-R11(NR9)C(＝O)N(R9)R4-、-R11N(R9)C(＝NR9)R4-、-R11C(＝S)N(R9)R4-
、-R11N(R9)C(＝S)R4-、-R11C(＝S)OR4-、-R11OC(＝S)R4-、
-R11OC(＝S)OR4-、-R11N(R9)C(＝S)OR4-、-R11OC(＝S)N(R9)R4-、
-R11N(R9)C(＝S)N(R9)R4-、-R11C(＝O)SR4-、-R11SC(＝O)R4-、
-R11OC(＝O)SR4-、-R11N(R9)C(＝O)SR4-、-R11SC(＝O)N(R9)R4-、
-R11C(＝S)SR4-、-R11SC(＝S)R4-、-R11SC(＝S)OR4-、
-R11N(R9)C(＝S)SR4-、-R11SC(＝S)N(R9)R4-、-R11C(＝S)SR4-、
-R11SC(＝S)R4-、-R11SC(＝O)SR4-、-R11SC(＝S)SR4-、
-R11N(R9)C(＝S)SR4-、-R11SC(＝S)N(R9)R4-、-R11OR4-、-R11SR4-或键；每个L独立地是-R11C(＝O)N(R9)R4-、-R11N(R9)C(＝O)R4-、-R11C(＝O)OR4-
、-R11OC(＝O)R4-、-R11OC(＝O)OR4-、-R11N(R9)C(＝O)OR4-、
-R11OC(＝O)N(R9)R4-、-R11N(R9)C(＝O)N(R9)R4-、
-R11N(R9)C(＝NR9)N(R9)R4-、-R11C(＝S)N(R9)R4-、-R11N(R9)C(＝S)R4-、
-R11C(＝S)OR4-、-R11OC(＝S)R4-、-R11OC(＝S)OR4-、
-R11N(R9)C(＝S)OR4-、-R11OC(＝S)N(R9)R4-、-R11N(R9)C(＝S)N(R9)R4-
、-R11C(＝O)SR4-、-R11SC(＝O)R4-、-R11OC(＝O)SR4-、
-R11N(R9)C(＝O)SR4-、-R11SC(＝O)N(R9)R4-、-R11C(＝S)SR4-、
-R11SC(＝S)R4-、-R11SC(＝S)OR4-、-R11N(R9)C(＝S)SR4-、
-R11SC(＝S)N(R9)R4-、-R11C(＝S)SR4-、-R11SC(＝S)R4-、-R11SC(＝O)SR4-、-R11SC(＝S)SR4-、-R11N(R9)C(＝S)SR4-、-R11SC(＝S)N(R9)R4-、-R11O-N＝CR4-、-R11C(R10)＝N-OR4-、-R11OR4-、-R11SR4-、-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
每个R4独立地是被取代的或未被取代的C1-C16烷基或未被取代的C1-C16杂烷基，或不存在；
R5是氢或被取代的或未被取代的C1-C16烷基；
每个R6独立地是氢、C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基，其中所述烷基、所述烯基和炔基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个R7独立地是被取代的或未被取代的C1-C16烷基、被取代的或未被取代的C1-C16杂烷基，或不存在；
每个R9独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C16烷基或未被取代的C1-C16杂烷基；
每个R10独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C16烷基或未被取代的C1-C16杂烷基；并且
每个R11独立地是被取代的或未被取代的C1-C16烷基或未被取代的C1-C16杂烷基。
在一个方面，本文公开了一种具有式(I*)的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R1是氢、C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、C3-C30杂烷基、C3-C30杂烯基、C3-C30杂炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C2-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的；
R2是氢、C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、C3-C30杂烷基、C3-C30杂烯基、C3-C30杂炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C2-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的；
X、Y和Z中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-R11C(＝O)N(R4)R9-、-NR7C(＝O)R9-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-R11C(＝O)OR9-、-R11OC(＝O)R9-、-R11OC(＝O)OR9-、-R11N(R4)C(＝O)OR9-、-R11OC(＝O)N(R4)R9-、-R11(NR4)C(＝O)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝NR4)R9-、-R11C(＝S)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝S)R9-、-R11C(＝S)OR9-、-R11OC(＝S)R9-、-R11OC(＝S)OR9-、-R11N(R4)C(＝S)OR9-、-R11OC(＝S)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝S)N(R4)R9-、-R11C(＝O)SR9-、-R11SC(＝O)R9-、-R11OC(＝O)SR9-、-R11N(R4)C(＝O)SR9-、-R11SC(＝O)N(R4)R9-、-R11C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)R9-、-R11SC(＝S)OR9-、-R11N(R4)C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)N(R4)R9-、-R11C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)R9-、-R11SC(＝O)SR9-、-R11SC(＝S)SR9-、-R11N(R4)C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)N(R4)R9-、-R11OR9-、-R11SR9-、-O-、-S-或键；
每个L独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-N＝CR4-、-CR4＝N-O-、-O-、-S-、-R11C(＝O)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝O)R9-、-R11C(＝O)OR9-、-R11OC(＝O)R9-、-R11OC(＝O)OR9-、-R11N(R4)C(＝O)OR9-、-R11OC(＝O)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝O)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝NR4)N(R4)R9-、-R11C(＝S)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝S)R9-、-R11C(＝S)OR9-、-R11OC(＝S)R9-、-R11OC(＝S)OR9-、-R11N(R4)C(＝S)OR9-、-R11OC(＝S)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝S)N(R4)R9-、-R11C(＝O)SR9-、-R11SC(＝O)R9-、-R11OC(＝O)SR9-、-R11N(R4)C(＝O)SR9-、-R11SC(＝O)N(R4)R9-、-R11C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)R9-、-R11SC(＝S)OR9-、-R11N(R4)C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)N(R4)R9-、-R11C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)R9-、-R11SC(＝O)SR9-、-R11SC(＝S)SR9-、-R11N(R4)C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)N(R4)R9-、-R11O-N＝CR9-、-R11C(R10)＝N-OR9-、-R11OR9-、-R11SR9-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-、-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
R3是-C0-C10亚烷基-NR7R8、-C0-C10亚烷基-杂环烷基或-C0-C10亚烷基-杂环芳基，其中所述亚烷基、杂环烷基和杂环芳基独立地是被取代的或未被取代的；
每个R4独立地是氢、被取代的或未被取代的C1-C16烷基或被取代的或未被取代的C1-C16杂烷基；
R5是氢或被取代的或未被取代的-C0-C10亚烷基-L-R4；
每个R6独立地是氢、C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基，其中所述烷基、所述烯基和炔基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；
R7和R8中的每一者独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C16烷基、被取代的或未被取代的C1-C16杂烷基，或R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环基；并且
每个R9独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C16亚烷基或未被取代的C1-C16亚杂烷基；
每个R10独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C16亚烷基或未被取代的C1-C16亚杂烷基；并且每个R11独立地是被取代的或未被取代的C1-C16亚烷基或未被取代的C1-C16亚杂烷基。
n、m和q中的每一者独立地是0、1、2、3、4或5。
在一些实施方案中，式(I*)的R5是氢或被取代的或未被取代的C1-C16烷基。在一些实施方案中，式(I*)的R5是被取代的或未被取代的C1-C16烷基。
在式(I)或(I*)的一些实施方案中，如果结构携带超过一个不对称C原子，那么每个不对称C原子独立地表示外消旋、手性纯R和/或手性纯S异构体或它们的组合。
在一些实施方案中，式(I)或(I*)中的n、m和q中的每一者独立地是0、1、2或3。在一些实施方案中，式(I)或(I*)中的n和m中的每一者是1。在一些实施方案中，n是0。在一些实施方案中，n是1。在一些实施方案中，n是2。在一些实施方案中，n是3。在一些实施方案中，m是0。在一些实施方案中，m是1。在一些实施方案中，m是2。在一些实施方案中，m是3。在一些实施方案中，q是0。在一些实施方案中，q是1。在一些实施方案中，q是2。在一些实施方案中，q是3。
在一些实施方案中，式(I)或(I*)的化合物具有式(Ia)的结构，或其药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物：
其中
R1和R2中的每一者独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、C3-C10环烷基、C3-C30杂烷基、C3-C30杂烯基、C3-C30杂炔基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C2-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的；
X、Y和Z中的每一者独立地是C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-、-S-、-C1-C10亚烷基-O-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
每个L独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-N＝CR4-、-CR4＝N-O-、-O-、-S-、-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
R3是-C0-C10亚烷基-NR7R8或-C0-C10亚烷基-杂环烷基，其中所述亚烷基和杂环烷基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
每个R6独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基，其中所述烷基、所述烯基和炔基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；并且
R7和R8中的每一者独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基，或R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环基。
在式(Ia)的一些实施方案中，如果结构携带超过一个不对称C原子，那么每个不对称C原子独立地表示外消旋、手性纯R和/或手性纯S异构体或它们的组合。
在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)的化合物在R1和/或R2上包含非对称杂原子。
在一些实施方案中，式(I)、式(I*)或式(Ia)中的R1和R2各自独立地是C5-C30烷基、C5-C30烯基、C5-C30炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C2-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和R2各自独立地是C7-C28烷基、C7-C28烯基、C7-C28炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C2-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和R2各自独立地是C7-C25烷基、C7-C25烯基、C7-C25炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C2-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和R2各自独立地是C7-C22烷基、C7-C22烯基、C7-C22炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C2-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和R2各自独立地是C10-C20烷基、C10-C20烯基、-C4-C8亚烷基-L-R6或-C4-C8亚烷基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和R2各自是-C0-C10亚烷基-L-R6。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和R2各自是C7-C30烯基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和R2各自是C7-C28烯基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和R2各自是C7-C25烯基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和R2各自是C7-C22烯基。
在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和R2各自独立地是被取代的或未被取代的直链或支链C3-C30烷基或被取代的或未被取代的直链或支链C3-C30烯基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和R2各自独立地是被取代的或未被取代的直链或支链C3-C28烷基或被取代的或未被取代的直链或支链C3-C28烯基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和R2各自独立地是被取代的或未被取代的C3-C25烷基或被取代的或未被取代的C3-C25烯基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和R2各自独立地是被取代的或未被取代的C3-C25烷基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和R2各自独立地是C3烷基、C4烷基、C5烷基、C6烷基、C7烷基、C8烷基、C9烷基、C10烷基、C11烷基、C12烷基、C13烷基、C14烷基、C15烷基、C16烷基、C17烷基、C18烷基、C19烷基、C20烷基、C21烷基、C22烷基、C23烷基、C24烷基或C25烷基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和R2各自独立地是至少C3烷基、至少C4烷基、至少C5烷基、至少C6烷基、至少C7烷基、至少C8烷基、至少C9烷基、至少C10烷基、至少C11烷基、至少C12烷基、至少C13烷基、至少C14烷基、至少C15烷基、至少C16烷基、至少C17烷基、至少C18烷基、至少C19烷基、至少C20烷基、至少C21烷基、至少C22烷基、至少C23烷基、至少C24烷基或至少C25烷基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和R2各自独立地是至多C3烷基、至多C4烷基、至多C5烷基、至多C6烷基、至多C7烷基、至多C8烷基、至多C9烷基、至多C10烷基、至多C11烷基、至多C12烷基、至多C13烷基、至多C14烷基、至多C15烷基、至多C16烷基、至多C17烷基、至多C18烷基、至多C19烷基、至多C20烷基、至多C21烷基、至多C22烷基、至多C23烷基、至多C24烷基或至多C25烷基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和R2各自独立地是C8-C24烷基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和R2各自独立地是C12-C24烷基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和R2各自独立地是C6-C15烷基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和R2各自独立地是被取代的或未被取代的C3-C25烯基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和R2各自独立地是C3烯基、C4烯基、C5烯基、C6烯基、C7烯基、C8烯基、C9烯基、C10烯基、C11烯基、C12烯基、C13烯基、C14烯基、C15烯基、C16烯基、C17烯基、C18烯基、C19烯基、C20烯基、C21烯基、C22烯基、C23烯基、C24烯基或C25烯基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和R2各自独立地是至少C3烯基、至少C4烯基、至少C5烯基、至少C6烯基、至少C7烯基、至少C8烯基、至少C9烯基、至少C10烯基、至少C11烯基、至少C12烯基、至少C13烯基、至少C14烯基、至少C15烯基、至少C16烯基、至少C17烯基、至少C18烯基、至少C19烯基、至少C20烯基、至少C21烯基、至少C22烯基、至少C23烯基、至少C24烯基或至少C25烯基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和R2各自独立地是至多C3烯基、至多C4烯基、至多C5烯基、至多C6烯基、至多C7烯基、至多C8烯基、至多C9烯基、至多C10烯基、至多C11烯基、至多C12烯基、至多C13烯基、至多C14烯基、至多C15烯基、至多C16烯基、至多C17烯基、至多C18烯基、至多C19烯基、至多C20烯基、至多C21烯基、至多C22烯基、至多C23烯基、至多C24烯基或至多C25烯基。
在式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)的化合物的一些实施方案中，R1和R2各自是被取代的或未被取代的Cy-C3-30烷基。在一些实施方案中，Cy是双环。在一些实施方案中，Cy是单环。在一些实施方案中，Cy是具有0-2个氮和0-1个氧的双环杂芳基。在一些实施方案中，Cy是具有0-2个氮和0-1个氧的双环杂烷基。
在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和/或R2独立地是 在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和/或R2是在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和/或R2是在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和/或R2是在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和/或R2是/>在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和/或R2是在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和/或R2是/>在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和/或R2是在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R1和/或R2是
在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的L独立地是-O-、-S-、-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个L独立地是-O-、-S-、-C1-C3亚烷基-O-、-C1-C3亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C3亚烷基-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个L独立地是-O-、-S-、-C1-C3亚烷基-O-、-C1-C3亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C3亚烷基-OC(＝O)-或键，其中所述亚烷基是直链或支链未被取代的亚烷基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个L是-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个L是-C(＝O)O-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个L是-OC(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个L是-C(＝O)NR4-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个L是-C(＝O)NH-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个L是-C(＝O)N(CH3)-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个L是-NR4C(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个L是-NHC(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个L是-N(CH3)C(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个L是-O-N＝CR4-或-CR4＝N-O-。在一些实施方案中，R1和R2是相同的。在一些实施方案中，R1和R2是不同的。
在式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)的一些实施方案中，R1是-C0-C10亚烷基-L-R6。在式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)的一些实施方案中，R2是-C0-C10亚烷基-L-R6。在式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)的一些实施方案中，X是-C(＝O)O-。在式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)的一些实施方案中，X是-OC(＝O)-。在式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)的一些实施方案中，X是-OC(＝O)NR4-。在式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)的一些实施方案中，Y是-C(＝O)O-。在式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)的一些实施方案中，Y是-OC(＝O)-。在式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)的一些实施方案中，Y是-OC(＝O)NR4-。在式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)的一些实施方案中，L是-OC(＝O)-。在式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)的一些实施方案中，L是-C(＝O)-。在式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)的一些实施方案中，R1是-C4-C8亚烷基-L-R6。在式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)的一些实施方案中，R2是-C4-C8亚烷基-L-R6。
在式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)的一些实施方案中，R1任选地被氧代基取代。在式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)的一些实施方案中，R1或R2不含有任何可水解键。在式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)的一些实施方案中，R1或R2不含有任何C＝C键。在式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)的一些实施方案中，R1或R2不含有任何碳-碳三键。
在一些实施方案中，式(Ib)中的p是1至6。在一些实施方案中，式(Ib)中的p是1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、2至3、2至4、2至5、2至6、3至4、3至5、3至6、4至5、4至6或5至6。在一些实施方案中，式(Ib)中的p是1、2、3、4、5或6。在一些实施方案中，式(Ib)中的p是至少1、2、3、4或5。在一些实施方案中，式(Ib)中的p是至多2、3、4、5或6。在一些实施方案中，式(Ib)中的p是1-3。在一些实施方案中，式(Ib)中的p是1。在一些实施方案中，式(Ib)中的p是2。在一些实施方案中，式(Ib)中的p是3。在一些实施方案中，式(Ib)中的p是4。在一些实施方案中，式(Ib)中的p是5。在一些实施方案中，式(Ib)中的p是6。
在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R6独立地是被取代的或未被取代的直链或支链C3-C30烷基或被取代的或未被取代的直链或支链C3-C30烯基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R6独立地是被取代的或未被取代的直链或支链C3-C28烷基或被取代的或未被取代的直链或支链C3-C28烯基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R6独立地是被取代的或未被取代的C3-C25烷基或被取代的或未被取代的C3-C25烯基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R6独立地是被取代的或未被取代的C3-C25烷基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R6独立地是C3烷基、C4烷基、C5烷基、C6烷基、C7烷基、C8烷基、C9烷基、C10烷基、C11烷基、C12烷基、C13烷基、C14烷基、C15烷基、C16烷基、C17烷基、C18烷基、C19烷基、C20烷基、C21烷基、C22烷基、C23烷基、C24烷基或C25烷基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R6独立地是至少C3烷基、至少C4烷基、至少C5烷基、至少C6烷基、至少C7烷基、至少C8烷基、至少C9烷基、至少C10烷基、至少C11烷基、至少C12烷基、至少C13烷基、至少C14烷基、至少C15烷基、至少C16烷基、至少C17烷基、至少C18烷基、至少C19烷基、至少C20烷基、至少C21烷基、至少C22烷基、至少C23烷基、至少C24烷基或至少C25烷基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R6独立地是至多C3烷基、至多C4烷基、至多C5烷基、至多C6烷基、至多C7烷基、至多C8烷基、至多C9烷基、至多C10烷基、至多C11烷基、至多C12烷基、至多C13烷基、至多C14烷基、至多C15烷基、至多C16烷基、至多C17烷基、至多C18烷基、至多C19烷基、至多C20烷基、至多C21烷基、至多C22烷基、至多C23烷基、至多C24烷基或至多C25烷基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R6独立地是被取代的或未被取代的C3-C25烯基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R6独立地是C3烯基、C4烯基、C5烯基、C6烯基、C7烯基、C8烯基、C9烯基、C10烯基、C11烯基、C12烯基、C13烯基、C14烯基、C15烯基、C16烯基、C17烯基、C18烯基、C19烯基、C20烯基、C21烯基、C22烯基、C23烯基、C24烯基或C25烯基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R6独立地是至少C3烯基、至少C4烯基、至少C5烯基、至少C6烯基、至少C7烯基、至少C8烯基、至少C9烯基、至少C10烯基、至少C11烯基、至少C12烯基、至少C13烯基、至少C14烯基、至少C15烯基、至少C16烯基、至少C17烯基、至少C18烯基、至少C19烯基、至少C20烯基、至少C21烯基、至少C22烯基、至少C23烯基、至少C24烯基或至少C25烯基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R6独立地是至多C3烯基、至多C4烯基、至多C5烯基、至多C6烯基、至多C7烯基、至多C8烯基、至多C9烯基、至多C10烯基、至多C11烯基、至多C12烯基、至多C13烯基、至多C14烯基、至多C15烯基、至多C16烯基、至多C17烯基、至多C18烯基、至多C19烯基、至多C20烯基、至多C21烯基、至多C22烯基、至多C23烯基、至多C24烯基或至多C25烯基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R6独立地是被取代的或未被取代的C3-C30炔基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R6独立地是Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基，其中所述烷基、所述烯基和炔基各自独立地是被取代的或未被取代的。在一些实施方案中，R6是Cy-C3-30烷基，其中所述Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基。在一些实施方案中，Cy是双环。在一些实施方案中，Cy是单环。在一些实施方案中，Cy是具有0-2个氮和0-1个氧的双环杂芳基。在一些实施方案中，Cy是具有0-2个氮和0-1个氧的双环杂烷基。
在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R6独立地是 /> 在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R6是在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R6是在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R6是在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R6是/>在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R6是在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R6是/>
在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R4独立地是H或被取代的或未被取代的C1-C4烷基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R4独立地是被取代的或未被取代的直链或支链C1-C4烷基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R4是H。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R4独立地是H、-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3或-CH(CH3)2。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R4独立地是H或-CH3。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的至少一个R4是-CH3。
在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的W、X和Y独立地是-C(＝O)O-或-OC(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的W、X和Y中的至少一者是-C(＝O)O-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的W、X和Y中的至少一者是-OC(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的W、X和Y中的至少一者独立地是-C(＝O)NR4-或-NR4C(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的W、X和Y中的至少一者独立地是-C(＝O)N(CH3)-、-N(CH3)C(＝O)-、-C(＝O)NH-或-NHC(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的W、X和Y中的至少一者独立地是-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(CH3)-、-OC(＝O)-、-NHC(＝O)-、-N(CH3)C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)O-、-N(CH3)C(＝O)O-、-OC(＝O)NH-、-OC(＝O)N(CH3)-、-NHC(＝O)NH-、-N(CH3)C(＝O)NH-、-NHC(＝O)N(CH3)-、-N(CH3)C(＝O)N(CH3)-、NHC(＝NH)NH-、-N(CH3)C(＝NH)NH-、-NHC(＝NH)N(CH3)-、-N(CH3)C(＝NH)N(CH3)-、NHC(＝NMe)NH-、-N(CH3)C(＝NMe)NH-、-NHC(＝NMe)N(CH3)-或-N(CH3)C(＝NMe)N(CH3)-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的W、X和Y中的至少一者独立地是-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-或-NR4C(＝O)NR4-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的W、X和Y中的至少一者独立地是-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)O-、-OC(＝O)NH-、-NHC(＝O)NH-、-N(CH3)C(＝O)O-、-OC(＝O)N(CH3)-、-N(CH3)C(＝O)N(CH3)-或-N(CH3)C(＝O)NH-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的W、X和Y中的至少一者独立地是-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)O-、-OC(＝O)NH-或-NHC(＝O)NH-。
在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R3是-C0-C10亚烷基-NR7R8或-C0-C10亚烷基-杂环烷基，其中所述亚烷基和杂环烷基独立地是被取代的或未被取代的。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R3是-C0-C10亚烷基-NR7R8。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R3是-C1-C6亚烷基-NR7R8。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R3是-C1-C4亚烷基-NR7R8。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R3是-C1-亚烷基-NR7R8。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R3是-C2-亚烷基-NR7R8。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R3是-C3-亚烷基-NR7R8。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R3是-C4-亚烷基-NR7R8。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R3是-C5-亚烷基-NR7R8。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R3是-C0-C10亚烷基-杂环烷基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R3是-C1-C6亚烷基-杂环烷基，其中所述杂环烷基包含1至3个氮和0-2个氧。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R3是季铵化的。
在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R7和R8独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R7和R8独立地是被取代的或未被取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，R7和R8独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C3烷基。在一些实施方案中，R7和R8中的至少一者独立地是被取代的或未被取代的C1-C3烷基。在一些实施方案中，R7和R8中的至少一者独立地是-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3或-CH(CH3)2。在一些实施方案中，R7和R8中的至少一者是CH3。在一些实施方案中，R7和R8中的至少一者是-CH2CH3。
在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环基。在一些实施方案中，R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环烷基。在一些实施方案中，R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的3-7元杂环烷基。
在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R3是
在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R3是
在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R3是
在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R3是
在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R3是
在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R3是
在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R3是
在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的Z是-C(＝O)O-或-OC(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的Z是-C(＝O)O-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的Z是-OC(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的Z是-C(＝O)NR4-或-NR4C(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的Z是-C(＝O)NR4-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的Z是-NR4C(＝O)-。在一些实施方案中，Z中的R4是氢或C1-C4烷基。在一些实施方案中，Z中的R4是氢。在一些实施方案中，Z中的R4是C1-C4烷基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的Z是-C(＝O)N(CH3)-、-N(CH3)C(＝O)-、-C(＝O)NH-或-NHC(＝O)-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的Z是-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-或-NR4C(＝O)NR4-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的Z是-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)O-、-OC(＝O)NH-、-NHC(＝O)NH-、-N(CH3)C(＝O)O-、-OC(＝O)N(CH3)-、-N(CH3)C(＝O)N(CH3)-、-NHC(＝O)N(CH3)-或-N(CH3)C(＝O)NH-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的Z是-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)O-、-OC(＝O)NH-或-NHC(＝O)NH-。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的Z是键。
在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R5是氢或被取代的或未被取代的C1-C3烷基。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R5是H、-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3或-CH(CH3)2。在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)中的R5是H。在一些实施方案中，R5是被取代的或未被取代的-C0-C10亚烷基-L-R4。在一些实施方案中，R5是被取代的或未被取代的C1-C16烷基。
在另一方面，本文公开了一种具有式(Ib)的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐，
其中
X和Y中的每一者与式(I)、(I*)和(Ia)中相同，并且选自：-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-SC(＝S)O-、-O-、-C1-C10亚烷基-O-和键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
R1和R2与式(I)、(I*)和(Ia)中相同，并且选自：氢、C1-C30烷基、C1-C30杂烷基和Cy-C3-30烷基，其中所述烷基和杂烷基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
每个R6独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基，其中所述烷基、所述烯基和炔基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；并且
R7和R8中的每一者独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基，或R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环基；
A是-O-、-CH2-、-S-或-NR12-；
R12是氢、C1-C10烷基或C1-C10杂烷基，其中所述烷基和杂烷基各自独立地是被取代的或未被取代的；并且
Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基或被取代的或未被取代的杂芳基；
p是1、2、3、4、5或6
在一些实施方案中，式(I)、式(I*)、式(Ia)或式(Ib)的氨基脂质是
在另一方面，本文公开了一种具有式(II)的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R1和R2中的每一者独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C1-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的；
X、Y和Z中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-、-S-或键；
每个L独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-N＝CR4-、-CR4＝N-O-、-O-、-S-、-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
R3是-C0-C10亚烷基-NR7R8、-C0-C10亚烷基-杂环烷基或-C0-C10亚烷基-杂环芳基，其中所述亚烷基、杂环烷基和杂环芳基独立地是被取代的或未被取代的；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
每个R6独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基，其中所述烷基、所述烯基和炔基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；R7和R8中的每一者独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基，或R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环基；
a和b中的每一者独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；并且m是0、1、2、3、4或5。
在一个方面，本文公开了一种具有式(II*)的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R1和R2中的每一者独立地是氢、C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、C3-C30杂烷基、C3-C30杂烯基、C3-C30杂炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C1-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的；
X、Y和Z中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-C(＝O)-、
-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、
-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、
-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、
-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、
-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、
-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-
、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、
-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-、-S-或键；
每个L独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-N＝CR4-、-CR4＝N-O-、-O-、-S-、-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
R3是氢、-C1-C6烷基、-C0-C10亚烷基-NR7R8、-C0-C10亚烷基-杂环烷基或-C0-C10亚烷基-杂环芳基，其中所述烷基、亚烷基、杂环烷基和杂环芳基独立地是被取代的或未被取代的；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
每个R6独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基，其中所述烷基、所述烯基和炔基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；
R7和R8中的每一者独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基，或R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环基；
a和b中的每一者独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；并且
m是0、1、2、3、4或5。
在式(II)或(II*)的一些实施方案中，如果结构携带超过一个不对称C原子，那么每个不对称C原子独立地表示外消旋、手性纯R和/或手性纯S异构体或它们的组合。
在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的a和b中的每一者独立地是3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，a是1。在一些实施方案中，a是2。在一些实施方案中，a是3。在一些实施方案中，a是4。在一些实施方案中，a是5。在一些实施方案中，b是1。在一些实施方案中，b是2。在一些实施方案中，b是3。在一些实施方案中，b是4。在一些实施方案中，b是5。
在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的m是1、2、3、4或5。在一些实施方案中，m是1。在一些实施方案中，m是2。在一些实施方案中，m是3。在一些实施方案中，m是4。在一些实施方案中，m是5。
在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和R2各自独立地是C5-C28烷基、C5-C28烯基、C5-C28炔基、C3-C10环烷基、-C1-C10亚烷基-L-R6或-C1-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和R2各自独立地是C7-C25烷基、C7-C25烯基、C7-C25炔基、C3-C10环烷基、-C1-C10亚烷基-L-R6或-C1-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和R2各自独立地是C7-C22烷基、C7-C22烯基、C7-C22炔基、C3-C10环烷基、-C1-C10亚烷基-L-R6或-C1-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和R2各自独立地是C10-C20烷基、C10-C20烯基、-C4-C8亚烷基-L-R6或-C4-C8亚烷基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和R2各自是-C1-C10亚烷基-L-R6。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和R2各自是C7-C30烯基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和R2各自是C7-C28烯基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和R2各自是C7-C25烯基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和R2各自是C7-C22烯基。
在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和R2各自独立地是被取代的或未被取代的直链或支链C3-C30烷基或被取代的或未被取代的直链或支链C3-C30烯基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和R2各自独立地是被取代的或未被取代的直链或支链C3-C28烷基或被取代的或未被取代的直链或支链C3-C28烯基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和R2各自独立地是被取代的或未被取代的C3-C25烷基或被取代的或未被取代的C3-C25烯基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和R2各自独立地是被取代的或未被取代的C3-C22烷基或被取代的或未被取代的C3-C22烯基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和R2各自独立地是被取代的或未被取代的C3-C25烷基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和R2各自独立地是C3烷基、C4烷基、C5烷基、C6烷基、C7烷基、C8烷基、C9烷基、C10烷基、C11烷基、C12烷基、C13烷基、C14烷基、C15烷基、C16烷基、C17烷基、C18烷基、C19烷基、C20烷基、C21烷基、C22烷基、C23烷基、C24烷基或C25烷基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和R2各自独立地是至少C3烷基、至少C4烷基、至少C5烷基、至少C6烷基、至少C7烷基、至少C8烷基、至少C9烷基、至少C10烷基、至少C11烷基、至少C12烷基、至少C13烷基、至少C14烷基、至少C15烷基、至少C16烷基、至少C17烷基、至少C18烷基、至少C19烷基、至少C20烷基、至少C21烷基、至少C22烷基、至少C23烷基、至少C24烷基或至少C25烷基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和R2各自独立地是至多C3烷基、至多C4烷基、至多C5烷基、至多C6烷基、至多C7烷基、至多C8烷基、至多C9烷基、至多C10烷基、至多C11烷基、至多C12烷基、至多C13烷基、至多C14烷基、至多C15烷基、至多C16烷基、至多C17烷基、至多C18烷基、至多C19烷基、至多C20烷基、至多C21烷基、至多C22烷基、至多C23烷基、至多C24烷基或至多C25烷基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和R2各自独立地是被取代的或未被取代的C3-C25烯基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和R2各自独立地是C3烯基、C4烯基、C5烯基、C6烯基、C7烯基、C8烯基、C9烯基、C10烯基、C11烯基、C12烯基、C13烯基、C14烯基、C15烯基、C16烯基、C17烯基、C18烯基、C19烯基、C20烯基、C21烯基、C22烯基、C23烯基、C24烯基或C25烯基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和R2各自独立地是至少C3烯基、至少C4烯基、至少C5烯基、至少C6烯基、至少C7烯基、至少C8烯基、至少C9烯基、至少C10烯基、至少C11烯基、至少C12烯基、至少C13烯基、至少C14烯基、至少C15烯基、至少C16烯基、至少C17烯基、至少C18烯基、至少C19烯基、至少C20烯基、至少C21烯基、至少C22烯基、至少C23烯基、至少C24烯基或至少C25烯基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和R2各自独立地是至多C3烯基、至多C4烯基、至多C5烯基、至多C6烯基、至多C7烯基、至多C8烯基、至多C9烯基、至多C10烯基、至多C11烯基、至多C12烯基、至多C13烯基、至多C14烯基、至多C15烯基、至多C16烯基、至多C17烯基、至多C18烯基、至多C19烯基、至多C20烯基、至多C21烯基、至多C22烯基、至多C23烯基、至多C24烯基或至多C25烯基。
在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和/或R2独立地是 在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和/或R2是在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和/或R2是在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和/或R2是在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1和/或R2是/>在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1是/>在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R2是在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R1是/>在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R2是/>
在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的每个L独立地是-O-、-S-、-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个L独立地是-O-、-S-、-C1-C3亚烷基-O-、-C1-C3亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C3亚烷基-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个L独立地是-O-、-S-、-C1-C3亚烷基-O-、-C1-C3亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C3亚烷基-OC(＝O)-或键，其中所述亚烷基是直链或支链未被取代的亚烷基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个L是-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个L是-C(＝O)O-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个L是-OC(＝O)-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个L是-C(＝O)NR4-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个L是-C(＝O)NH-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个L是-C(＝O)N(CH3)-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个L是-NR4C(＝O)-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个L是-NHC(＝O)-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个L是-N(CH3)C(＝O)-。
在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个R6独立地是被取代的或未被取代的直链或支链C3-C30烷基或被取代的或未被取代的直链或支链C3-C30烯基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的每个R6独立地是被取代的或未被取代的直链或支链C3-C28烷基或被取代的或未被取代的直链或支链C3-C28烯基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的每个R6独立地是被取代的或未被取代的C3-C25烷基或被取代的或未被取代的C3-C25烯基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个R6独立地是被取代的或未被取代的C3-C25烷基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个R6独立地是C3烷基、C4烷基、C5烷基、C6烷基、C7烷基、C8烷基、C9烷基、C10烷基、C11烷基、C12烷基、C13烷基、C14烷基、C15烷基、C16烷基、C17烷基、C18烷基、C19烷基、C20烷基、C21烷基、C22烷基、C23烷基、C24烷基或C25烷基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个R6独立地是至少C3烷基、至少C4烷基、至少C5烷基、至少C6烷基、至少C7烷基、至少C8烷基、至少C9烷基、至少C10烷基、至少C11烷基、至少C12烷基、至少C13烷基、至少C14烷基、至少C15烷基、至少C16烷基、至少C17烷基、至少C18烷基、至少C19烷基、至少C20烷基、至少C21烷基、至少C22烷基、至少C23烷基、至少C24烷基或至少C25烷基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个R6独立地是至多C3烷基、至多C4烷基、至多C5烷基、至多C6烷基、至多C7烷基、至多C8烷基、至多C9烷基、至多C10烷基、至多C11烷基、至多C12烷基、至多C13烷基、至多C14烷基、至多C15烷基、至多C16烷基、至多C17烷基、至多C18烷基、至多C19烷基、至多C20烷基、至多C21烷基、至多C22烷基、至多C23烷基、至多C24烷基或至多C25烷基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个R6独立地是被取代的或未被取代的C3-C25烯基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个R6独立地是C3烯基、C4烯基、C5烯基、C6烯基、C7烯基、C8烯基、C9烯基、C10烯基、C11烯基、C12烯基、C13烯基、C14烯基、C15烯基、C16烯基、C17烯基、C18烯基、C19烯基、C20烯基、C21烯基、C22烯基、C23烯基、C24烯基或C25烯基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个R6独立地是至少C3烯基、至少C4烯基、至少C5烯基、至少C6烯基、至少C7烯基、至少C8烯基、至少C9烯基、至少C10烯基、至少C11烯基、至少C12烯基、至少C13烯基、至少C14烯基、至少C15烯基、至少C16烯基、至少C17烯基、至少C18烯基、至少C19烯基、至少C20烯基、至少C21烯基、至少C22烯基、至少C23烯基、至少C24烯基或至少C25烯基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个R6独立地是至多C3烯基、至多C4烯基、至多C5烯基、至多C6烯基、至多C7烯基、至多C8烯基、至多C9烯基、至多C10烯基、至多C11烯基、至多C12烯基、至多C13烯基、至多C14烯基、至多C15烯基、至多C16烯基、至多C17烯基、至多C18烯基、至多C19烯基、至多C20烯基、至多C21烯基、至多C22烯基、至多C23烯基、至多C24烯基或至多C25烯基。
在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的每个R6独立地是 在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的每个R6是在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的每个R6是在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的每个R6是
在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R4独立地是H或被取代的或未被取代的C1-C4烷基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个R4独立地是被取代的或未被取代的直链C1-C4烷基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个R4是H。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个R4独立地是H、-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3或-CH(CH3)2。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个R4独立地是H或-CH3。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的至少一个R4是-CH3。
在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的X和Y各自独立地是-C(＝O)O-或-OC(＝O)-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的X和Y各自是-C(＝O)O-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的X和Y各自是-OC(＝O)-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的Y是-C(＝O)O-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的Y是-OC(＝O)-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的X和Y各自独立地是-C(＝O)NR4-或-NR4C(＝O)-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的X是-C(＝O)NR4-或-NR4C(＝O)-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的X是-C(＝O)NR4-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的X是-NR4C(＝O)-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的X和Y各自独立地是-C(＝O)N(CH3)-、-N(CH3)C(＝O)-、-C(＝O)NH-或-NHC(＝O)-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的X和Y各自独立地是-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(CH3)-、-OC(＝O)-、-NHC(＝O)-、-N(CH3)C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)O-、-N(CH3)C(＝O)O-、-OC(＝O)NH-、-OC(＝O)N(CH3)-、-NHC(＝O)NH-、-N(CH3)C(＝O)NH-、-NHC(＝O)N(CH3)-、-N(CH3)C(＝O)N(CH3)-、NHC(＝NH)NH-、-N(CH3)C(＝NH)NH-、-NHC(＝NH)N(CH3)-、-N(CH3)C(＝NH)N(CH3)-、NHC(＝NMe)NH-、-N(CH3)C(＝NMe)NH-、-NHC(＝NMe)N(CH3)-或-N(CH3)C(＝NMe)N(CH3)-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的X和Y各自独立地是-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-或-NR4C(＝O)NR4-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的X和Y各自独立地是-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)O-、-OC(＝O)NH-、-NHC(＝O)NH-、-N(CH3)C(＝O)O-、-OC(＝O)N(CH3)-、-N(CH3)C(＝O)N(CH3)-或-N(CH3)C(＝O)NH-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的X和Y各自独立地是-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)O-、-OC(＝O)NH-或-NHC(＝O)NH-。
在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R3是-C0-C10亚烷基-NR7R8或-C0-C10亚烷基-杂环烷基，其中所述亚烷基和杂环烷基独立地是被取代的或未被取代的。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R3是-C0-C10亚烷基-NR7R8。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R3是-C1-C6亚烷基-NR7R8。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R3是-C1-C4亚烷基-NR7R8。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R3是-C1-亚烷基-NR7R8。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R3是-C2-亚烷基-NR7R8。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R3是-C3-亚烷基-NR7R8。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R3是-C4-亚烷基-NR7R8。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R3是-C5-亚烷基-NR7R8。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R3是-C0-C10亚烷基-杂环烷基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R3是-C1-C6亚烷基-杂环烷基，其中所述杂环烷基包含1至3个氮和0-2个氧。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R3是季铵化的。
在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R7和R8独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R7和R8中的至少一者独立地是被取代的或未被取代的C1-C6烷基。在一些实施方案中，R7和R8中的至少一者独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C3烷基。在一些实施方案中，R7和R8中的至少一者独立地是被取代的或未被取代的C1-C3烷基。在一些实施方案中，R7和R8中的至少一者独立地是-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3或-CH(CH3)2。在一些实施方案中，R7和R8中的至少一者是CH3。在一些实施方案中，R7和R8中的至少一者是-CH2CH3。
在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环基。在一些实施方案中，R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环烷基。在一些实施方案中，R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的3-7元杂环烷基。
在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R3是
在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R3是
在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R3是
在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R3是
在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R3是/>
在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R3是
在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的R3是
在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的Z是-C(＝O)O-或-OC(＝O)-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的Z是-C(＝O)O-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的Z是-OC(＝O)-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的Z是-C(＝O)NR4-或-NR4C(＝O)-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的Z是-C(＝O)NR4-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的Z是-NR4C(＝O)-。在一些实施方案中，Z中的R4是氢或C1-C4烷基。在一些实施方案中，Z中的R4是氢。在一些实施方案中，Z中的R4是C1-C4烷基。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的Z是-C(＝O)N(CH3)-、-N(CH3)C(＝O)-、-C(＝O)NH-或-NHC(＝O)-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的Z是-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-或-NR4C(＝O)NR4-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的Z是-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)O-、-OC(＝O)NH-、-NHC(＝O)NH-、-N(CH3)C(＝O)O-、-OC(＝O)N(CH3)-、-N(CH3)C(＝O)N(CH3)-、-NHC(＝O)N(CH3)-或-N(CH3)C(＝O)NH-。在一些实施方案中，式(II)或(II*)中的Z是-OC(＝O)O-、-NHC(＝O)O-、-OC(＝O)NH-或-NHC(＝O)NH-。
在一个方面，本文公开了一种表1A的氨基脂质或其盐或溶剂化物。
表1A.用于构成脂质纳米颗粒的氨基脂质。任何结构中的一个或多个手性碳原子指示外消旋和/或手性纯R和S立体异构体。
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在表1A的化合物的一些实施方案中，m是1-10。在一些实施方案中，m是1。在一些实施方案中，m是2。在一些实施方案中，m是3。在一些实施方案中，m是4。在一些实施方案中，m是5。在一些实施方案中，m是6。在一些实施方案中，m是7。在一些实施方案中，m是8。在一些实施方案中，m是9。在一些实施方案中，m是10。
在一些实施方案中，表1A中的不对称碳原子表示外消旋、手性纯R或手性S。在一些实施方案中，如果表1A的化合物含有两个或更多个手性中心，那么每个手性中心的立体化学的所有组合都由本公开涵盖。
在一些实施方案中，所公开的氨基脂质可被转化成N-氧化物。在一些实施方案中，N-氧化物通过用氧化剂(例如3-氯过氧苯甲酸和/或过氧化氢)处理来形成。因此，当化合价和结构允许时，本文公开了所描述的氨基脂质的N-氧化物化合物，其可指定为N→O或N+-O-。在一些实施方案中，本公开的化合物中的氮可被转化成N-羟基或N-烷氧基。举例来说，N-羟基化合物可通过用氧化剂诸如ra-CPBA使母体胺氧化来制备。还考虑所有显示和要求保护的含氮化合物。因此，本文还公开了所描述的氨基脂质的N-羟基和N-烷氧基(例如N-OR，其中R是被取代的或未被取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、3-14元碳环或3-14元杂环)衍生物。
在一些实施方案中，本文所述的氨基脂质可采用盐诸如药学上可接受的盐的形式。氨基脂质的所有药学上可接受的盐都由本公开涵盖。如本文所用，术语“氨基脂质”还包括它的药学上可接受的盐以及它的非对映体、对映体和差向异构体形式。
在一些实施方案中，本文所述的氨基脂质具有一个或多个立体中心，并且每个立体中心独立地以R构型或S构型存在。本文提供的脂质包括所有非对映体、对映体和差向异构体形式以及它们的适当混合物。本文提供的脂质包括所有顺式(cis)、反式(trans)、顺(syn)、反(anti)、反式(E)和顺式(Z)异构体以及它们的适当混合物。在某些实施方案中，本文所述的脂质通过以下方式制备成它们的单个立体异构体：使化合物的外消旋混合物与光学活性拆分剂反应以形成一对非对映异构化合物/盐，分离非对映体，以及回收光学纯对映体。在一些实施方案中，使用本文所述的化合物的共价非对映体衍生物进行对映体的拆分。在另一实施方案中，通过基于溶解性差异的分离/拆分技术分离非对映体。在其他实施方案中，通过色谱法或通过形成非对映体盐并通过重结晶或色谱法或它们的任何组合加以分离来进行立体异构体的分离。Jean Jacques,Andre Collet,Samuel H.Wilen,“Enantiomers,Racemates and Resolutions”,John Wiley And Sons,Inc.,1981。在一个方面，通过立体选择性合成获得立体异构体。
在一些实施方案中，脂质诸如氨基脂质基于本文公开的结构被取代。在一些实施方案中，氨基脂质是具有一个或多个取代基的表1A的脂质。在一些实施方案中，脂质诸如氨基脂质是未被取代的。在另一实施方案中，本文所述的脂质经同位素标记(例如用放射性同位素)或通过另外其他手段标记，包括但不限于使用发色团或荧光部分、生物发光标记或化学发光标记。
本文所述的脂质包括经同位素标记化合物，其与本文提供的各种式和结构中叙述的那些化合物相同，例外之处是一个或多个原子被原子质量或质量数不同于通常在自然界中发现的原子质量或质量数的原子替换。可掺入本发明脂质中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、硫、氟和氯的同位素，诸如像2H、3h、13C、14C、15N、18O、17O、35S、18F、3 6cl。在一个方面，本文所述的经同位素标记脂质，例如向其中掺入放射性同位素诸如3H和14C的那些，可用于药物和/或底物组织分布测定中。在一个方面，用同位素诸如氘进行取代会提供由较大代谢稳定性所致的某些治疗优势，诸如像体内半衰期增加或剂量需求降低。
在一些实施方案中，氨基脂质的不对称碳原子以对映体富集形式存在。在某些实施方案中，氨基脂质的不对称碳原子就(S)-构型或(R)-构型来说具有至少50％对映体过量、至少60对映体过量、至少70％对映体过量、至少80％对映体过量、至少90％对映体过量、至少95％对映体过量或至少99％对映体过量。
本文还公开了一种表1B的脂质或其盐或溶剂化物。
表1B.用于构成脂质纳米颗粒的氨基脂质和赋形剂
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在一些实施方案中，本文提供的氨基脂质(或其他脂质)可在本公开的不同部分中由超过一个化合物标识号指定。
PEG-脂质
在一些实施方案中，所描述的LNP组合物包含PEG-脂质。在一些实施方案中，所描述的LNP组合物包含两种或更多种PEG-脂质。示例性PEG-脂质包括但不限于表2中的脂质。示例性PEG-脂质还包括但不限于PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油以及它们的混合物。举例来说，一种或多种PEG-脂质可包括PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE脂质或它们的组合。在一些实施方案中，PEG部分是任选地被取代的乙二醇或氧化乙烯的线性或支化聚合物。在一些实施方案中，PEG部分例如被一个或多个烷基、烷氧基、酰基、羟基或芳基取代。在一些实施方案中，PEG部分包括PEG共聚物诸如PEG-聚氨酯或PEG-聚丙烯(参见例如j.Milton Harris,Poly(ethylene glycol)chemistry:biotechnical and biomedical applications(1992))。在一些实施方案中，PEG部分不包括PEG共聚物，例如它可为PEG单聚物。示例性PEG-脂质包括但不限于PEG-二月桂酰基甘油、PEG-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)、PEG-二棕榈酰基甘油、PEG-二硬脂酰基甘油(PEG-DSPE)、PEG-二棕榈酰基甘油、PEG-二甾基甘油、PEG-二月桂基咪唑二酰胺、PEG-二肉豆蔻基咪唑二酰胺、PEG-二棕榈酰基咪唑二酰胺、PEG-二甾基咪唑二酰胺、PEG-胆固醇和PEG-DMB(3,4-二(十四烷氧基)苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000])。
在一些实施方案中，PEG-脂质是PEG-脂质缀合物，例如偶联于二烷基氧基丙基的PEG(例如PEG-DAA缀合物)、偶联于二酰基甘油的PEG(例如PEG-DAG缀合物)、偶联于胆固醇的PEG、偶联于磷脂酰乙醇胺的PEG和缀合于神经酰胺的PEG(参见例如美国专利第5,885,613号)、阳离子PEG-脂质、聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物(例如POZ-DAA缀合物；参见例如WO2010/006282)、聚酰胺寡聚物(例如ATTA-脂质缀合物)以及它们的混合物。
在一个方面，本文公开了一种具有式(III)的结构的PEG-脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R21和R22中的每一者独立地是被取代的或未被取代的C3-C30烷基、被取
代的或未被取代的C3-C30烯基或被取代的或未被取代的C3-C30炔基；R26、R27和R28中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、
-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、
-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、
-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、
-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、
-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、
-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、
-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O(CH2)2C(O)O-、-O(CH2)2C(O)NH-、
-OC(O)(CH2)2O-、-OC(O)(CH2)2NH-、-O(CH2)2C(O)N(CH3)-、
-O(CH2)2C(NH)O-、-O(CH2)2C(NAc)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、
-O(CH2)2C(NH)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(O)O-、
-NH(CH2)2C(O)NH-、NH(CH2)2C(O)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)O-、-NH(CH2)2C(NAc)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)--OC(O)(CH2)2N(CH3)-、-O C(NH)(CH2)2O-、-OC(NMe)(CH2)2NH-、-O2C(NH)(CH2)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O-、-S-或键；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
R23是-C0-C10亚烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24或-C1-C10亚杂烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24，其中所述亚烷基和亚杂烷基各自独立地是被取代的或未被取代的；
R24独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C3烷基；
R25是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
k1、k2和k3中的每一者独立地是0、1、2、3、4或5；并且
k4是选自1至100的整数。
在一个方面，本文公开了一种具有式(III*)的结构的PEG-脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R21是氢、被取代的或未被取代的C1-C30烷基、被取代的或未被取代的C3-C30烯基或被取代的或未被取代的C3-C30炔基；
R22是氢、被取代的或未被取代的C1-C30烷基、被取代的或未被取代的C3-C30烯基或被取代的或未被取代的C3-C30炔基；
R26、R27和R28中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-N(Ac)-、-OC(O)OCH2C(O)O-、-OC(O)OCH2C(O)NH--OC(O)NHCH2C(O)O-、-OC(O)NHCH2C(O)NH-、-OC(O)O(CH2)2C(O)O-、-OC(O)O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)NH(CH2)2C(O)O-、-OC(O)NH(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)O(CH2)3C(O)O-、-OC(O)O(CH2)3C(O)NH-、-OC(O)NH(CH2)3C(O)O-、-OC(O)NH(CH2)3C(O)NH-、-C(O)OCH2C(O)NH--C(O)NHCH2C(O)O-、-C(O)NHCH2C(O)NH-、-C(O)O(CH2)2C(O)O-、-C(O)O(CH2)2C(O)NH-、-C(O)NH(CH2)2C(O)O-、-C(O)NH(CH2)2C(O)NH-、-C(O)O(CH2)3C(O)O-、-C(O)O(CH2)3C(O)NH-、-C(O)NH(CH2)3C(O)O-、-C(O)NH(CH2)3C(O)NH-、-OC(＝O)NR4(CH2)1-3C(＝O)NH-、-OC(＝O)NR4(CH2)1-3C(＝O)O-、-C(＝O)NR4(CH2)1-3C(＝O)NH-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O(CH2)2C(O)O-、-O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)(CH2)2O-、-OC(O)(CH2)2NH-、-O(CH2)2C(O)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)O-、-O(CH2)2C(NAc)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(O)O-、-NH(CH2)2C(O)NH-、NH(CH2)2C(O)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)O-、-NH(CH2)2C(NAc)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)--OC(O)(CH2)2N(CH3)-、-OC(NH)(CH2)2O-、-OC(NMe)(CH2)2NH-、-O2C(NH)(CH2)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O-、-S-或键；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
R23是-C0-C10亚烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24、-C1-C10亚杂烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24、-C0-C10亚烷基-(O-CH2-CH2)k4-R24或-C1-C10亚杂烷基-(O-CH2-CH2)k4-R24，其中所述亚烷基和亚杂烷基各自独立地是被取代的或未被取代的；
R24独立地是氢、被取代的或未被取代的C1-C3烷基、-O-R4、-C(＝O)OH或-C(＝O)R4；
R25是氢或被取代的或未被取代的C1-C22烷基；
k1、k2和k3中的每一者独立地是0、1、2、3、4或5；并且
k4是选自1至100的整数。
在一些实施方案中，式(III)或(III*)的PEG-脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中
R21是被取代的或未被取代的C3-C30烷基、被取代的或未被取代的C3-C30烯基或被取代的或未被取代的C3-C30炔基；
R22是氢、被取代的或未被取代的C3-C30烷基、被取代的或未被取代的C3-C30烯基或被取代的或未被取代的C3-C30炔基；
R26、R27和R28中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-OC(＝O)NR4C(＝O)NH-、-OC(＝O)NR4C(＝O)O-、-C(＝O)NR4C(＝O)NH-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O(CH2)2C(O)O-、-O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)(CH2)2O-、-OC(O)(CH2)2NH-、-O(CH2)2C(O)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)O-、-O(CH2)2C(NAc)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(O)O-、-NH(CH2)2C(O)NH-、NH(CH2)2C(O)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)O-、-NH(CH2)2C(NAc)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)--OC(O)(CH2)2N(CH3)-、-OC(NH)(CH2)2O-、-OC(NMe)(CH2)2NH-、-O2C(NH)(CH2)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O-、-S-或键；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
R23是-C0-C10亚烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24或-C1-C10亚杂烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24，其中所述亚烷基和亚杂烷基各自独立地是被取代的或未被取代的；
R24独立地是氢、被取代的或未被取代的C1-C3烷基、-O-R4、-C(＝O)OR4或-C(＝O)R4；
R25是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
k1、k2和k3中的每一者独立地是0、1、2、3、4或5；并且
k4是选自1至100的整数。
在式(III)或(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，R21和R22中的每一者独立地是未被取代的或被取代的直链或支链C12-C30烷基。在一些实施方案中，R21和R22中的每一者独立地是未被取代的直链C12-C25烷基。在式(III)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，R21和R22中的每一者独立地是未被取代的或被取代的直链或支链C12-C30烯基。在一些实施方案中，R21和R22中的每一者独立地是未被取代的直链C12-C25烯基。
在式(III)或(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，R26和R27中的每一者是-O-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-。在一些实施方案中，R26和R27中的每一者是-O-。在一些实施方案中，R26和R27中的每一者是键。
在式(III)或(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，R28是-O-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-或-OC(＝O)NR4。在式(III*)的化合物的一些实施方案中，R28是-OC(＝O)NR4。在式(III)或(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，R28是-C(＝O)O-或-OC(＝O)-。
在式(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，R26是-O(CH2)2C(O)O-、-O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)(CH2)2O-、-OC(O)(CH2)2NH-、-O(CH2)2C(O)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)O-、-O(CH2)2C(NAc)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(O)O-、-NH(CH2)2C(O)NH-、NH(CH2)2C(O)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)O-、-NH(CH2)2C(NAc)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)--OC(O)(CH2)2N(CH3)-、-O C(NH)(CH2)2O-、-OC(NMe)(CH2)2NH-、-O2C(NH)(CH2)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH、-N(Ac)-、-OC(O)O(CH2)C(O)O-、-OC(O)O(CH2)C(O)(NH)--OC(O)(NH)(CH2)C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)C(O)(NH)-、-OC(O)O(CH2)2C(O)O-、-OC(O)O(CH2)2C(O)(NH)-、-OC(O)(NH)(CH2)2C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)2C(O)(NH)-、-OC(O)O(CH2)3C(O)O-、-OC(O)O(CH2)3C(O)(NH)-、-OC(O)(NH)(CH2)3C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)3C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)C(O)(NH)--C(O)(NH)(CH2)C(O)O-、-C(O)(NH)(CH2)C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)2C(O)O-、-C(O)O(CH2)2C(O)(NH)-、-C(O)(NH)(CH2)2C(O)O-、-C(O)(NH)(CH2)2C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)3C(O)O-、-C(O)O(CH2)3C(O)(NH)-、-C(O)(NH)(CH2)3C(O)O-、-C(O)(NH)(CH2)3C(O)(NH)-或键。
在式(III)或(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，R26是-O(CH2)2C(O)O-、-O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)(CH2)2O-、-OC(O)(CH2)2NH-、-O(CH2)2C(O)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)O-、-O(CH2)2C(NAc)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(O)O-、-NH(CH2)2C(O)NH-、NH(CH2)2C(O)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)O-、-NH(CH2)2C(NAc)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)--OC(O)(CH2)2N(CH3)-、-C(O)NH(CH2)2O-、-C(O)N(Me)(CH2)2NH-、-O2C(NH)(CH2)N(CH3)-或-O(CH2)2C(NH)NH-。
在式(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，R27是-O(CH2)2C(O)O-、-O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)(CH2)2O-、-OC(O)(CH2)2NH-、-O(CH2)2C(O)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)O-、-O(CH2)2C(NAc)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(O)O-、-NH(CH2)2C(O)NH-、NH(CH2)2C(O)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)O-、-NH(CH2)2C(NAc)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)--OC(O)(CH2)2N(CH3)-、-O C(NH)(CH2)2O-、-OC(NMe)(CH2)2NH-、-O2C(NH)(CH2)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH、-N(Ac)-、-OC(O)O(CH2)C(O)O-、-OC(O)O(CH2)C(O)(NH)--OC(O)(NH)(CH2)C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)C(O)(NH)-、-OC(O)O(CH2)2C(O)O-、-OC(O)O(CH2)2C(O)(NH)-、-OC(O)(NH)(CH2)2C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)2C(O)(NH)-、-OC(O)O(CH2)3C(O)O-、-OC(O)O(CH2)3C(O)(NH)-、-OC(O)(NH)(CH2)3C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)3C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)C(O)(NH)--C(O)(NH)(CH2)C(O)O-、-C(O)(NH)(CH2)C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)2C(O)O-、-C(O)O(CH2)2C(O)(NH)-、-C(O)(NH)(CH2)2C(O)O-、-C(O)(NH)(CH2)2C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)3C(O)O-、-C(O)O(CH2)3C(O)(NH)-、-C(O)(NH)(CH2)3C(O)O-、-C(O)(NH)(CH2)3C(O)(NH)-或键。
在式(III)或(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，R27是-O(CH2)2C(O)O-、-O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)(CH2)2O-、-OC(O)(CH2)2NH-、-O(CH2)2C(O)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)O-、-O(CH2)2C(NAc)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(O)O-、-NH(CH2)2C(O)NH-、NH(CH2)2C(O)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)O-、-NH(CH2)2C(NAc)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)--OC(O)(CH2)2N(CH3)-、-O C(NH)(CH2)2O-、-OC(NMe)(CH2)2NH-、-O2C(NH)(CH2)N(CH3)-或-O(CH2)2C(NH)NH-。
在式(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，R28是-O(CH2)2C(O)O-、-O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)(CH2)2O-、-OC(O)(CH2)2NH-、-O(CH2)2C(O)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)O-、-O(CH2)2C(NAc)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(O)O-、-NH(CH2)2C(O)NH-、NH(CH2)2C(O)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)O-、-NH(CH2)2C(NAc)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)--OC(O)(CH2)2N(CH3)-、-O C(NH)(CH2)2O-、-OC(NMe)(CH2)2NH-、-O2C(NH)(CH2)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH、-N(Ac)-、-OC(O)O(CH2)C(O)O-、-OC(O)O(CH2)C(O)(NH)--OC(O)(NH)(CH2)C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)C(O)(NH)-、-OC(O)O(CH2)2C(O)O-、-OC(O)O(CH2)2C(O)(NH)-、-OC(O)(NH)(CH2)2C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)2C(O)(NH)-、-OC(O)O(CH2)3C(O)O-、-OC(O)O(CH2)3C(O)(NH)-、-OC(O)(NH)(CH2)3C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)3C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)C(O)(NH)--C(O)(NH)(CH2)C(O)O-、-C(O)(NH)(CH2)C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)2C(O)O-、-C(O)O(CH2)2C(O)(NH)-、-C(O)(NH)(CH2)2C(O)O-、-C(O)(NH)(CH2)2C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)3C(O)O-、-C(O)O(CH2)3C(O)(NH)-、-C(O)(NH)(CH2)3C(O)O-或-C(O)(NH)(CH2)3C(O)(NH)-。
在式(III)或(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，R28是-O(CH2)2C(O)O-、-O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)(CH2)2O-、-OC(O)(CH2)2NH-、-O(CH2)2C(O)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)O-、-O(CH2)2C(NAc)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(O)O-、-NH(CH2)2C(O)NH-、NH(CH2)2C(O)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)O-、-NH(CH2)2C(NAc)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)--OC(O)(CH2)2N(CH3)-、-O C(NH)(CH2)2O-、-OC(NMe)(CH2)2NH-、-O2C(NH)(CH2)N(CH3)-或-O(CH2)2C(NH)NH-。
在式(III)或(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，k1是0、1或2。在一些实施方案中，k1是0。在一些实施方案中，k1是1。在一些实施方案中，k1是2。
在式(III)或(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，k2是0、1或2。在一些实施方案中，k2是0。在一些实施方案中，k2是1。在一些实施方案中，k2是2。
在式(III)或(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，k3是0、1或2。在一些实施方案中，k3是0。在一些实施方案中，k3是1。在一些实施方案中，k3是2。
在式(III)或(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，R23是-C0-C3亚烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24，其中R24是H、乙基或甲基。在式(III)或(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，R23是-C1-C5亚杂烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24，其中R24是H或甲基。在式(III)或(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，R23是-C2亚烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24；其中R24是-O-CH3。在式(III)或(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，R23是-C3亚烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24；其中R24是-O-CH3。
在式(III)或(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，k4是1至75。在一些实施方案中，k4是1至50、1至30、1至25、1至20、1至15、1至10、1至5、20至50或5至50。在一些实施方案中，k4是30至50。在一些实施方案中，k4是35至45。在一些实施方案中，k4是40至50。在一些实施方案中，k4是36至48。
在式(III)或(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，R25是氢。
在式(III*)的化合物的一些实施方案中，R22是未被取代的C28烯基：
在式(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，R21是C12-22被取代的或未被取代的烷基；R22是C12-22被取代的或未被取代的烷基；R25是H；R26是-O-；R27是-O-；R28是-N(Ac)-、-OC(O)O(CH2)C(O)O-、-OC(O)O(CH2)C(O)(NH)--OC(O)(NH)(CH2)C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)C(O)(NH)-、-OC(O)O(CH2)2C(O)O-、-OC(O)O(CH2)2C(O)(NH)-、-OC(O)(NH)(CH2)2C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)2C(O)(NH)-、-OC(O)O(CH2)3C(O)O-、-OC(O)O(CH2)3C(O)(NH)-、-OC(O)(NH)(CH2)3C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)3C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)C(O)(NH)--C(O)(NH)(CH2)C(O)O-、-C(O)(NH)(CH2)C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)2C(O)O-、-C(O)O(CH2)2C(O)(NH)-、-C(O)(NH)(CH2)2C(O)O-、-C(O)(NH)(CH2)2C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)3C(O)O-、-C(O)O(CH2)3C(O)(NH)-、-C(O)(NH)(CH2)3C(O)O-或-C(O)(NH)(CH2)3C(O)(NH)-；k1是1，k2是0，并且k3是1。
在式(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，R25是C10-22被取代的或未被取代的烷基，R28是-O(CH2)2C(O)O-、-O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)(CH2)2O-、-OC(O)(CH2)2NH-、-O(CH2)2C(O)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)O-、-O(CH2)2C(NAc)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(O)O-、-NH(CH2)2C(O)NH-、NH(CH2)2C(O)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)O-、-NH(CH2)2C(NAc)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)--OC(O)(CH2)2N(CH3)-、-O C(NH)(CH2)2O-、-OC(NMe)(CH2)2NH-、-O2C(NH)(CH2)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH、-N(Ac)-、-OC(O)O(CH2)C(O)O-、-OC(O)O(CH2)C(O)(NH)--OC(O)(NH)(CH2)C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)C(O)(NH)-、-OC(O)O(CH2)2C(O)O-、-OC(O)O(CH2)2C(O)(NH)-、-OC(O)(NH)(CH2)2C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)2C(O)(NH)-、-OC(O)O(CH2)3C(O)O-、-OC(O)O(CH2)3C(O)(NH)-、-OC(O)(NH)(CH2)3C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)3C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)C(O)(NH)--C(O)(NH)(CH2)C(O)O-、-C(O)(NH)(CH2)C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)2C(O)O-、-C(O)O(CH2)2C(O)(NH)-、-C(O)(NH)(CH2)2C(O)O-、-C(O)(NH)(CH2)2C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)3C(O)O-、-C(O)O(CH2)3C(O)(NH)-、-C(O)(NH)(CH2)3C(O)O-或-C(O)(NH)(CH2)3C(O)(NH)-，并且k3是1，其中R21是氢，R22是氢，R26是键，R27是键，k1是0，并且k2是0。
在式(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，R25是C10-22烷基；R28是-O(CH2)2C(O)O-、-O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)(CH2)2O-、-OC(O)(CH2)2NH-、-O(CH2)2C(O)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)O-、-O(CH2)2C(NAc)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(O)O-、-NH(CH2)2C(O)NH-、NH(CH2)2C(O)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)O-、-NH(CH2)2C(NAc)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)--OC(O)(CH2)2N(CH3)-、-O C(NH)(CH2)2O-、-OC(NMe)(CH2)2NH-、-O2C(NH)(CH2)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH、-N(Ac)-、-OC(O)O(CH2)C(O)O-、-OC(O)O(CH2)C(O)(NH)--OC(O)(NH)(CH2)C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)C(O)(NH)-、-OC(O)O(CH2)2C(O)O-、-OC(O)O(CH2)2C(O)(NH)-、-OC(O)(NH)(CH2)2C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)2C(O)(NH)-、-OC(O)O(CH2)3C(O)O-、-OC(O)O(CH2)3C(O)(NH)-、-OC(O)(NH)(CH2)3C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)3C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)C(O)(NH)--C(O)(NH)(CH2)C(O)O-、-C(O)(NH)(CH2)C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)2C(O)O-、-C(O)O(CH2)2C(O)(NH)-、-C(O)(NH)(CH2)2C(O)O-、-C(O)(NH)(CH2)2C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)3C(O)O-、-C(O)O(CH2)3C(O)(NH)-、-C(O)(NH)(CH2)3C(O)O-或-C(O)(NH)(CH2)3C(O)(NH)-，并且k3是1；其中R21是氢，R22是氢，R26是键，R27是键，k1是0，并且k2是0。
在式(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，R21是C14-18被取代的或未被取代的烷基；R22是C14-18被取代的或未被取代的烷基；R25是H；R26是-O-；R27是-O-；R28是-O(CH2)2C(O)O-、-O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)(CH2)2O-、-OC(O)(CH2)2NH-、-O(CH2)2C(O)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)O-、-O(CH2)2C(NAc)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(O)O-、-NH(CH2)2C(O)NH-、NH(CH2)2C(O)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)O-、-NH(CH2)2C(NAc)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)--OC(O)(CH2)2N(CH3)-、-O C(NH)(CH2)2O-、-OC(NMe)(CH2)2NH-、-O2C(NH)(CH2)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH、-N(Ac)-、-OC(O)O(CH2)C(O)O-、-OC(O)O(CH2)C(O)(NH)--OC(O)(NH)(CH2)C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)C(O)(NH)-、-OC(O)O(CH2)2C(O)O-、-OC(O)O(CH2)2C(O)(NH)-、-OC(O)(NH)(CH2)2C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)2C(O)(NH)-、-OC(O)O(CH2)3C(O)O-、-OC(O)O(CH2)3C(O)(NH)-、-OC(O)(NH)(CH2)3C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)3C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)C(O)(NH)--C(O)(NH)(CH2)C(O)O-、-C(O)(NH)(CH2)C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)2C(O)O-、-C(O)O(CH2)2C(O)(NH)-、-C(O)(NH)(CH2)2C(O)O-、-C(O)(NH)(CH2)2C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)3C(O)O-、-C(O)O(CH2)3C(O)(NH)-、-C(O)(NH)(CH2)3C(O)O-或-C(O)(NH)(CH2)3C(O)(NH)-；k1是1，k2是0，并且k3是1。
在式(III*)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一些实施方案中，R21是C14被取代的或未被取代的烷基；R22是C14被取代的或未被取代的烷基；R25是H；R26是-O-；R27是-O-；R28是-O(CH2)2C(O)O-、-O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)(CH2)2O-、-OC(O)(CH2)2NH-、-O(CH2)2C(O)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)O-、-O(CH2)2C(NAc)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(O)O-、-NH(CH2)2C(O)NH-、NH(CH2)2C(O)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)O-、-NH(CH2)2C(NAc)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)--OC(O)(CH2)2N(CH3)-、-O C(NH)(CH2)2O-、-OC(NMe)(CH2)2NH-、-O2C(NH)(CH2)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH、-N(Ac)-、-OC(O)O(CH2)C(O)O-、-OC(O)O(CH2)C(O)(NH)--OC(O)(NH)(CH2)C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)C(O)(NH)-、-OC(O)O(CH2)2C(O)O-、-OC(O)O(CH2)2C(O)(NH)-、-OC(O)(NH)(CH2)2C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)2C(O)(NH)-、-OC(O)O(CH2)3C(O)O-、-OC(O)O(CH2)3C(O)(NH)-、-OC(O)(NH)(CH2)3C(O)O-、-OC(O)(NH)(CH2)3C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)C(O)(NH)--C(O)(NH)(CH2)C(O)O-、-C(O)(NH)(CH2)C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)2C(O)O-、-C(O)O(CH2)2C(O)(NH)-、-C(O)(NH)(CH2)2C(O)O-、-C(O)(NH)(CH2)2C(O)(NH)-、-C(O)O(CH2)3C(O)O-、-C(O)O(CH2)3C(O)(NH)-、-C(O)(NH)(CH2)3C(O)O-或-C(O)(NH)(CH2)3C(O)(NH)-；k1是1，k2是0，并且k3是1。
在一些实施方案中，本文公开了一种包含-O(CH2)2C(O)O-或-O(CH2)2C(O)NH-的结构的PEG-脂质。
在一个方面，本文公开了一种表2的PEG-脂质。
表2.用于构成LNP的示例性PEG-脂质
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在一些实施方案中，表2中的n是2至200、10至100、25至50或42至48的整数。在一些实施方案中，表2中的n是25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更大。
PEG-脂质可包含一个或多个乙二醇单元，例如至少1、至少2、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少120或至少150个乙二醇单元。在一些实施方案中，PEG-脂质的数量平均分子量是约200Da至约5000Da。在一些实施方案中，PEG-脂质的数量平均分子量是约500Da至约3000Da。在一些实施方案中，PEG-脂质的数量平均分子量是约750Da至约2500Da。在一些实施方案中，PEG-脂质的数量平均分子量是约750Da至约2500Da。在一些实施方案中，PEG-脂质的数量平均分子量是约500Da、约750Da、约1000Da、约1250Da、约1500Da、约1750Da或约2000Da。在一些实施方案中，一种或多种PEG-脂质的多分散性指数(PDI)小于2。在一些实施方案中，一种或多种PEG-脂质的PDI是至多1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0。在一些实施方案中，一种或多种PEG-脂质的PDI是至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0。
在一些实施方案中，PEG-脂质占存在于颗粒中的总脂质的约0.1mol％至约10mol％。在一些实施方案中，PEG-脂质占存在于颗粒中的总脂质的约0.1mol％至约6mol％。在一些实施方案中，PEG-脂质占存在于颗粒中的总脂质的约0.5mol％至约5mol％。在一些实施方案中，PEG-脂质占存在于颗粒中的总脂质的约1mol％至约3mol％。在一些实施方案中，PEG-脂质占存在于颗粒中的总脂质的约2.0mol％至约2.5mol％。在一些实施方案中，PEG-脂质占存在于颗粒中的总脂质的约1mol％、约1.1mol％、约1.2mol％、约1.3mol％、约1.4mol％、约1.5mol％、约1.6mol％、约1.7mol％、约1.8mol％、约1.9mol％、约2.0mol％、约2.1mol％、约2.2mol％、约2.3mol％、约2.4mol％、约2.5mol％、约2.6mol％、约2.7mol％、约2.8mol％、约2.9mol％或约3.0mol％。
在一些实施方案中，LNP组合物包含多种PEG-脂质，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同PEG-脂质。在一些实施方案中，多种PEG-脂质中的至少一者选自表2。
磷脂
在一些实施方案中，所描述的LNP组合物包含磷脂。在一些实施方案中，磷脂包括选自以下的脂质：磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺、甘油磷脂、鞘磷脂、Guriserohosuhono、鞘脂膦酰基脂质、天然卵磷脂和氢化磷脂。在一些实施方案中，磷脂包括磷脂酰胆碱。示例性磷脂酰胆碱包括但不限于大豆磷脂酰胆碱、蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)和二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)。在某些具体实施方案中，磷脂是DSPC。
在一些实施方案中，磷脂包括磷脂酰乙醇胺。在一些实施方案中，磷脂酰乙醇胺是二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、16-0-Monome Le PE、16-0-二甲基PE、18-1-反式PE、棕榈酰基油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)或1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)。在一些实施方案中，磷脂包括甘油磷脂。在一些实施方案中，甘油磷脂是缩醛磷脂、磷脂酸酯或磷脂酰胆碱。在一些实施方案中，甘油磷脂是磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、棕榈酰基油酰基磷脂酰甘油(POPG)或溶血磷脂酰胆碱。在一些实施方案中，磷脂包括鞘磷脂。在一些实施方案中，鞘磷脂(sphingophospholipid)是神经鞘磷脂(sphingomyelin)、神经酰胺磷酸乙醇胺、神经酰胺磷酸甘油或神经酰胺磷酸甘油磷酸。在一些实施方案中，磷脂包括天然卵磷脂。在一些实施方案中，天然卵磷脂是蛋黄卵磷脂或大豆卵磷脂。在一些实施方案中，磷脂包括氢化磷脂。在一些实施方案中，氢化磷脂是氢化大豆磷脂酰胆碱。在一些实施方案中，磷脂选自：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱和二亚油酰基磷脂酰胆碱。
在一些实施方案中，磷脂包括选自以下的脂质：1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二(十一酰基)-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半丁二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16溶血PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二(二十二碳六烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)和神经鞘磷脂。
磷脂可包含磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。磷脂部分可包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱或神经鞘磷脂。脂肪酸部分可包括月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、芥酸、植烷酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山嵛酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸。在一些具体实施方案中，磷脂可用一种或多种炔烃官能化或与一种或多种炔烃交联，所述一种或多种炔烃可在暴露于叠氮化物后经受铜催化的环加成。
在一些实施方案中，LNP组合物包含多种磷脂，例如至少2、3、4、5种或更多种不同磷脂。在一些实施方案中，磷脂占存在于颗粒中的总脂质的1mol％至20mol％。在一些实施方案中，磷脂占存在于颗粒中的总脂质的约5mol％至约15mol％。在一些实施方案中，磷脂占存在于颗粒中的总脂质的约8mol％至约12mol％。在一些实施方案中，磷脂占存在于颗粒中的总脂质的约9mol％、10mol％或11mol％。
胆固醇
在一些实施方案中，LNP组合物包含胆固醇或其衍生物。在一些实施方案中，LNP组合物包含结构脂质。结构脂质可选自类固醇、固醇、烷基间苯二酚、胆固醇或其衍生物、粪甾醇(fecosterol)、谷固醇(sitosterol)、麦角固醇(ergosterol)、菜油固醇(campesterol)、豆固醇(stigmasterol)、菜籽固醇(brassicasterol)、番茄碱(tomatidine)、番茄碱糖苷(tomatine)、熊果酸(ursolic acid)、α-生育酚以及它们的组合。在一些实施方案中，结构脂质是皮质类固醇诸如泼尼松龙、地塞米松、泼尼松和氢化可的松。在一些实施方案中，胆固醇或其衍生物是胆固醇、5-十七基间苯二酚或胆固醇半丁二酸酯。在一些实施方案中，胆固醇或其衍生物是胆固醇。
在一些实施方案中，胆固醇或其衍生物是胆固醇衍生物。在一些实施方案中，胆固醇衍生物是极性胆固醇类似物。在一些实施方案中，极性胆固醇类似物是5α-胆固烷醇、5β-粪醇(coprostanol)、胆固醇基-(2′-羟基)-乙基醚、胆固醇基-(4′-羟基)-丁基醚或6-酮基胆固烷醇。在一些实施方案中，极性胆固醇类似物是胆固醇基-(4′-羟基)-丁基醚。在一些实施方案中，胆固醇衍生物是非极性胆固醇类似物。在一些实施方案中，非极性胆固醇类似物是5α-胆固烷(5α-cholestane)、胆固烯酮(cholestenone)、5α-胆固烷酮(5α-cholestanone)、5β-胆固烷酮或癸酸胆固醇酯。
在一些实施方案中，胆固醇或其衍生物占存在于颗粒中的总脂质的20mol％至50mol％。在一些实施方案中，胆固醇或其衍生物占存在于颗粒中的总脂质的约20mol％、约21mol％、约22mol％、约23mol％、约24mol％、约25mol％、约26mol％、约27mol％、约28mol％、约29mol％、约30mol％、约31mol％、约32mol％、约33mol％、约34mol％、约35mol％、约36mol％、约37mol％、约38mol％、约39mol％、约40mol％、约41mol％、约42mol％、约43mol％、约44mol％、约45mol％、约46mol％、约47mol％、约48mol％或约50mol％。
抗氧化剂
在一些实施方案中，本文所述的LNP包含一种或多种抗氧化剂。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂起降低阳离子脂质、有效载荷或两者的降解的作用。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂包括亲水性抗氧化剂。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂是螯合剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)和柠檬酸盐。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂是EDTA。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂包括亲脂性抗氧化剂。在一些实施方案中，亲脂性抗氧化剂包括维生素E异构体或多酚。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂以至少1mM、至少10mM、至少20mM、至少50mM或至少100mM的浓度存在于LNP组合物中。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂以约20mM的浓度存在于颗粒中。
有效载荷
本文所述的LNP可被设计来递送有效载荷，诸如治疗剂或目标靶标。示例性治疗剂包括但不限于抗体(例如单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、纳米抗体以及它们的片段等)、胆固醇、激素、肽、蛋白质、化学治疗剂和其他类型的抗赘生剂、低分子量药物、维生素、辅因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、酶核酸、反义核酸、形成三链体的寡核苷酸、反义DNA或RNA组合物、嵌合DNA:RNA组合物、等位基因酶、适体、核酶、诱饵及其类似物、质粒和其他类型的表达载体、以及小核酸分子、RNAi剂、短干扰核酸(siRNA)、信使核糖核酸(信使RNA、mRNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子、肽核酸(PNA)、锁定核酸核糖核苷酸(LNA)、吗啉代核苷酸、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、siRNA(小内部区段化干扰RNA)、aiRNA(不对称干扰RNA)和在有义链与反义链之间具有1、2个或更多个错配的siRNA，它们用以到达诸如细胞培养物、对象或生物体中的相关细胞和/或组织。治疗剂可为纯化的或部分纯化的，并且可为天然存在的或合成的，或经化学修饰的。在一些实施方案中，治疗剂是RNAi剂、短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)分子。在一些实施方案中，治疗剂是mRNA。
在一些实施方案中，有效载荷包括一种或多种核酸(即一种或多种核酸分子实体)。在一些实施方案中，核酸是单链核酸。在一些实施方案中，单链核酸是DNA。在一些实施方案中，单链核酸是RNA。在一些实施方案中，核酸是双链核酸。在一些实施方案中，双链核酸是DNA。在一些实施方案中，双链核酸是RNA。在一些实施方案中，双链核酸是DNA-RNA杂合体。在一些实施方案中，核酸是信使RNA(mRNA)、微RNA、不对称干扰RNA(aiRNA)、小发夹RNA(shRNA)或Dicer底物dsRNA。
在一些实施方案中，有效载荷包括mRNA。在一些实施方案中，有效载荷包括编码Cas核酸酶的mRNA分子，即Cas核酸酶mRNA。在一些实施方案中，有效载荷包括一种或多种指导RNA或编码指导RNA的核酸。在一些实施方案中，有效载荷包括用于修复或重组的模板核酸。在一些实施方案中，有效载荷包括编码基因编辑器核酸酶的mRNA。在一些实施方案中，有效载荷包括编码碱基编辑器核酸酶的mRNA。在一些实施方案中，有效载荷包括编码限制酶的mRNA。在一些实施方案中，有效载荷包括锌指核酸酶或TALEN核酸酶。
在一些实施方案中，mRNA有效载荷诸如Cas核酸酶mRNA可被修饰以获得改善的稳定性和/或免疫原性性质。修饰可对mRNA内的一个或多个核苷进行。对mRNA核碱基的化学修饰的实例包括假尿苷、1-甲基-假尿苷和5-甲基-胞苷。还可进行用以改善稳定性、表达和免疫原性的额外修饰。编码Cas核酸酶的mRNA可针对在特定细胞类型中表达加以密码子优化，所述特定细胞类型诸如是真核细胞、哺乳动物细胞，或更特别是人细胞。在一些实施方案中，mRNA编码人密码子优化的Cas9核酸酶或人密码子优化的Cpf核酸酶作为Cas核酸酶。在一些实施方案中，mRNA编码基因编辑器(即基因组编辑器)核酸酶，并且被称为基因编辑器mRNA。在一些实施方案中，基因编辑器是Cas蛋白，诸如本文所述的Cas蛋白。在一些实施方案中，基因编辑器是经工程改造的核酸酶。在一些实施方案中，基因编辑器在目标基因中引入双链断裂。在一些实施方案中，基因编辑器在目标基因内的靶点处引入双链断裂。在一些实施方案中，基因编辑器在目标基因中引入单链断裂。在一些实施方案中，基因编辑器是碱基编辑器。在一些实施方案中，基因编辑器将核酸序列插入至目标基因中。在一些实施方案中，基因编辑器使所靶向的序列从目标基因缺失。在一些实施方案中，基因编辑器mRNA编码Cas9核酸酶。在一些实施方案中，基因编辑器mRNA编码碱基编辑器核酸酶。在一些实施方案中，基因编辑器mRNA编码限制酶。在一些实施方案中，基因编辑器mRNA编码锌指核酸酶。在一些实施方案中，基因编辑器mRNA编码基于转录激活因子样效应物的核酸酶(TALEN)。在一些实施方案中，基因编辑器mRNA编码兆碱基大范围核酸酶。在一些实施方案中，基因编辑器mRNA编码Argonaute蛋白。在一些实施方案中，mRNA是纯化的。在一些实施方案中，mRNA使用沉淀方法(例如LiCl沉淀、醇沉淀或等效方法，例如如本文所述)或基于色谱法的方法(例如基于HPLC的方法或等效方法)来纯化。
在一些实施方案中，Cas核酸酶mRNA包含3'或5'非翻译区(UTR)。在一些实施方案中，3'或5'UTR可源于人基因序列。示例性3'和5'UTR包括a-球蛋白和β-球蛋白、白蛋白、HSD17B4和真核延伸因子la。此外，还可使用病毒源性5'和3'UTR，并且包括正痘病毒和巨细胞病毒UTR序列。在某些实施方案中，mRNA包括5'帽，诸如m7G(5')ppp(5')N。在某些实施方案中，这个帽可为帽-0，其中核苷酸N不含有2'OMe；或帽-1，其中核苷酸N含有2'OMe；或帽-2，其中核苷酸N和N+l含有2'OMe。在一些实施方案中，5'帽可调节核输出；防止由核酸外切酶达成的降解；促进翻译；并且促进5'近端内含子切除。此外，帽还可含有充当真核翻译起始因子4E eIF4E的结合元件的非核酸实体。在某些实施方案中，mRNA包括多腺苷酸尾部。这个尾部在长度方面可为约40至约300个核苷酸。在一些实施方案中，尾部在长度方面是约40至约100个核苷酸。在一些实施方案中，尾部在长度方面是约100至约300个核苷酸。在一些实施方案中，尾部在长度方面是约100至约300个核苷酸。在一些实施方案中，尾部在长度方面是约50至约200个核苷酸。在一些实施方案中，尾部在长度方面是约50至约250个核苷酸。在某些实施方案中，尾部在长度方面是约100、150或200个核苷酸。多腺苷酸尾部可含有修饰以防止核酸外切酶降解，所述修饰包括硫代磷酸酯键联和对核碱基的修饰。在一些实施方案中，多腺苷酸尾部含有3'“帽”，其可包括经修饰或非天然的核碱基或其他合成部分。在一些实施方案中，mRNA包含至少一个能够改变RNA的细胞内半衰期的元件。RNA的半衰期可增加或降低。在一些实施方案中，元件能够增加或降低RNA的稳定性。在一些实施方案中，元件可促进RNA衰变。在一些实施方案中，元件可激活翻译。在一些实施方案中，元件可在RNA的3'UTR内。举例来说，元件可为mRNA衰变信号，或可包括多腺苷酸化信号(PA)。
在一些实施方案中，Cas核酸酶mRNA编码来自CRISPR/Cas系统的Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含至少一个与指导RNA(“gRNA”)相互作用的结构域。在一些实施方案中，Cas蛋白由指导RNA导向至靶标序列。指导RNA可与Cas蛋白以及靶标序列相互作用，因此它可指导与靶标序列的结合。在一些实施方案中，指导RNA为靶向裂解提供特异性，并且Cas蛋白可为通用的，并且与不同指导RNA配对以裂解不同靶标序列。在某些实施方案中，Cas蛋白可裂解单链或双链DNA。在某些实施方案中，Cas蛋白可裂解RNA。在某些实施方案中，Cas蛋白可切割RNA。在一些实施方案中，Cas蛋白包含至少一个DNA结合结构域和至少一个核酸酶结构域。在一些实施方案中，核酸酶结构域与DNA结合结构域可为异源性的。在某些实施方案中，Cas蛋白可被修饰以降低或消除核酸酶活性。Cas蛋白可用于结合至DNA序列，并且调节所述DNA序列的表达或活性。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统包括1类或2类系统组分，包括核糖核酸蛋白质复合物。2类Cas核酸酶家族的蛋白质是具有DNA核酸内切酶活性的酶，并且它们可通过设计适当指导RNA而被导向以裂解所需核酸靶标，如本文进一步所描述。2类CRISPR/Cas系统组分可来自IIA型、IIB型、IIC型、V型或VI型系统。2类Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpfl、C2cl、C2c2和C2c3蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白来自II型CRISPR/Cas系统(即来自CRISPR/Cas9系统的Cas9蛋白)或V型CRISPR/Cas系统(例如Cpfl蛋白)。在一些实施方案中，Cas蛋白来自2类CRISPR/Cas系统，即单蛋白Cas核酸酶诸如Cas9蛋白或Cpfl蛋白。
Cas9蛋白或其他组分可来自其的示例性物种包括但不限于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、链球菌属种(Streptococcus sp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、加氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)、新凶手弗朗西斯氏菌(Francisella novicida)、产琥珀酸沃林氏菌(Wolinella succinogenes)、华德萨特菌(Sutterella wadsworthensis)、γ变形菌(Gamma proteobacterium)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、多杀性巴斯德菌(Pasteurella multocida)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogene)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、玫瑰链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、还原硒酸盐芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、戴耳布吕克氏乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳酸杆菌(Lactobacillussalivarius)、布氏乳酸杆菌(Lactobacillus buchneri)、齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克氏菌目细菌(Burkholderialesbacterium)、食萘极地单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、极地单胞菌属种(Polaromonas sp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaera watsonii)、蓝丝菌属种(Cyanothecesp.)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、聚球藻属种(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobium arabaticum)、丹氏制氨菌(Ammonifex degensii)、毕氏热解纤维素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、Candidatus Desulforudis、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐喊厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、嗜热丙酸厌氧肠状菌(Pelotomaculum thermopropionium)、喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacilluscaldus)、氧化亚铁嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、酒色别样着色菌(Allochromatium vinosum)、海杆菌属种(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、沃特森亚硝化球菌(Nitrosococcus watsoni)、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、成簇细枝菌(Ktedonobacter racemifer)、调查甲烷盐菌(Methanohalobium evestigatum)、多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻属种(Nostoc sp.)、极大节旋藻(Arthrospiramaxima)、钝顶节旋藻(Arthrospiraplatensis)、节旋藻属种(Arthrospira sp.)、鞘丝藻属种(Lyngbya sp.)、喜泥微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻属种(Oscillatoriasp.)、运动石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)、灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea)、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheria)或Acaryochloris marina。在一些实施方案中，Cas9蛋白来自化脓性链球菌。在一些实施方案中，Cas9蛋白可来自嗜热链球菌。在一些实施方案中，Cas9蛋白来自金黄色葡萄球菌。
在一些实施方案中，有效载荷包括至少一种指导RNA。指导RNA可将2类Cas核酸酶引导至靶标核酸分子上的靶标序列，在此处，指导RNA与所述靶标序列杂交，并且Cas核酸酶裂解或调节所述靶标序列。在一些实施方案中，指导RNA与2类核酸酶结合，并且提供由所述2类核酸酶达成的裂解的特异性。在一些实施方案中，指导RNA和Cas蛋白可形成核糖核蛋白(RNP)，例如CRISPR/Cas复合物。在一些实施方案中，CRISPR复合物可为II型CRISPR/Cas9复合物。在一些实施方案中，CRISPR/Cas复合物可为V型CRISPR/Cas复合物，诸如Cpfl/指导RNA复合物。在一些实施方案中，Cas核酸酶可为单蛋白Cas核酸酶，例如Cas9蛋白或Cpf 1蛋白。在一些实施方案中，指导RNA靶向由Cas9蛋白达成的裂解。在一些实施方案中，有效载荷包括两种或更多种指导RNA分子。在一些实施方案中，两种或更多种指导RNA分子靶向同一致病基因。在一些实施方案中，两种或更多种指导RNA分子靶向不同基因。在一些具体实施方案中，两种指导RNA分子靶向两个单独的目标致病基因。
CRISPR/Cas9核酸酶系统的指导RNA包括CRISPR RNA(crRNA)和tracr RNA(tracr)。在一些实施方案中，crRNA可包含与靶标核酸分子上的靶标序列互补和杂交的靶向序列。crRNA还可包含与tracrRNA的一部分互补和杂交的旗杆(flagpole)。在一些实施方案中，crRNA可类似从细菌的CRISPR基因座转录的天然存在的crRNA的结构，其中靶向序列充当CRISPR/Cas9系统的间隔区，并且旗杆对应于CRISPR基因座上侧接于间隔区的重复序列的一部分。指导RNA可通过crRNA的靶向序列靶向任何目标序列。在一些实施方案中，指导RNA的靶向序列与靶标核酸分子上的靶标序列之间的互补性程度是至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，指导RNA的靶向序列和靶标核酸分子上的靶标序列可为100％互补的。在其他实施方案中，指导RNA的靶向序列和靶标核酸分子上的靶标序列可含有至少一个错配。举例来说，指导RNA的靶向序列和靶标核酸分子上的靶标序列可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个错配。在一些实施方案中，指导RNA的靶向序列和靶标核酸分子上的靶标序列可含有1-6个错配。
在一些实施方案中，靶向序列的长度取决于使用的CRISPR/Cas系统和组分。举例来说，来自不同细菌物种的不同Cas蛋白具有不同的最优靶向序列长度。因此，靶向序列在长度方面可包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50个或超过50个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列在长度方面包含18-24个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列在长度方面包含19-21个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列在长度方面包含20个核苷酸。
在一些实施方案中，指导RNA是“双指导RNA”或“dgRNA”。在一些实施方案中，dgRNA包括包含crRNA的第一RNA分子和包含tracr RNA的第二RNA分子。第一RNA分子和第二RNA分子可通过crRNA上的旗杆与tracr RNA之间的碱基配对形成RNA双链体。在一些实施方案中，指导RNA是“单指导RNA”或“sgRNA”。在一些实施方案中，sgRNA可包含共价连接于tracr RNA的crRNA。在一些实施方案中，crRNA和tracr RNA可通过接头共价连接。在一些实施方案中，单分子指导RNA可通过crRNA上的旗杆与tracr RNA之间的碱基配对来包含茎-环结构。在一些实施方案中，sgRNA是能够介导RNA引导的由Cas9蛋白达成的DNA裂解的“Cas9 sgRNA”。在某些实施方案中，指导RNA包括足以与Cas9蛋白形成活性复合物，并且介导RNA引导的DNA裂解的crRNA和tracr RNA。在一些实施方案中，有效载荷包括超过一种指导RNA；每种指导RNA含有不同靶向序列，以致CRISPR/Cas系统裂解超过一种靶标序列。在一些实施方案中，一种或多种指导RNA可具有相同或不同性质，诸如活性或在CRISPR/Cas复合物内的稳定性。当使用超过一种指导RNA时，每种指导RNA可在同一表达盒上或在不同表达盒上编码。用于驱动超过一种指导RNA的表达的启动子可为相同的或不同的。
在一些实施方案中，核酸有效载荷诸如RNA是经修饰的。经修饰核苷或核苷酸可存在于指导RNA或mRNA中。包含一个或多个经修饰核苷或核苷酸的指导RNA或Cas核酸酶编码mRNA被称为“经修饰”RNA以描述存在替代或外加于典型A、G、C和U残基来使用的一个或多个非天然和/或天然存在的组分或构型。在一些实施方案中，经修饰RNA用非典型核苷或核苷酸合成。经修饰核苷和核苷酸可包括以下中的一者或多者：(i)磷酸二酯主链键联中非连接性磷酸氧中的一者或两者和/或连接性磷酸氧中的一者或多者的改变，例如替换(示例性主链修饰)；(ii)核糖的成分例如核糖上2'羟基的改变，例如替换(示例性糖修饰)；(iii)用“脱磷酸”接头对磷酸部分的大规模替换(示例性主链修饰)；(iv)对天然存在的核碱基的修饰或替换，包括用非典型核碱基(示例性碱基修饰)；(v)对核糖-磷酸主链的替换或修饰(示例性主链修饰)；(vi)对寡核苷酸的3'末端或5'末端的修饰，例如对末端磷酸基团的移除、修饰或替换，或部分、帽或接头的缀合(此类3'或5'帽修饰可包括糖和/或主链修饰)；和(vii)对糖的修饰或替换(示例性糖修饰)。
在一些实施方案中，有效载荷可包括模板核酸。模板可用于在Cas核酸酶的靶标位点处或附近改变或插入核酸序列。在一些实施方案中，模板用于同源性重组中。在一些实施方案中，同源性重组可导致模板序列或模板序列的一部分整合至靶标核酸分子中。在一些实施方案中，提供单一模板。在其他实施方案中，提供两种或更多种模板以致同源性重组可在两个或更多个靶标位点处发生。
在一些实施方案中，有效载荷诸如一种或多种RNA完全包封在颗粒的脂质部分内，由此保护所述RNA免遭核酸酶降解。完全包封可指示在暴露于将显著降解游离DNA或RNA的血清或核酸酶测定之后，核酸-脂质颗粒中的RNA不显著降解。在一些实施方案中，核酸-脂质颗粒组合物包含完全包封在颗粒的脂质部分内的RNA分子，以致约30％至约100％、约40％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约90％至约100％、约30％至约95％、约40％至约95％、约50％至约95％、约60％至约95％、约70％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约30％至约90％、约40％至约90％、约50％至约90％、约60％至约90％、约70％至约90％、约80％至约90％或至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％(或其任何分数或在其中的任何范围)的颗粒具有包封在其中的RNA。
在一些实施方案中，有效载荷包括mRNA和一种或多种指导RNA。在一些实施方案中，mRNA编码基因编辑器核酸酶，并且被称为基因编辑器mRNA。在一些实施方案中，基因编辑器mRNA编码Cas9核酸酶。在一些实施方案中，mRNA编码碱基编辑器核酸酶。在一些实施方案中，基因编辑器mRNA编码锌指核酸酶。在一些实施方案中，基因编辑器mRNA编码TALEN核酸酶。
表面活性剂和其他组分
本文所述的纳米颗粒可包含一种或多种表面活性剂。在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂包括一种或多种阴离子表面活性剂。示例性阴离子表面活性剂包括但不限于2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸、月桂基硫酸铵、全氟壬酸铵、多库酯盐、椰油酰两性基二乙酸二钠、月桂醇聚醚硫酸酯镁、全氟丁烷磺酸、全氟壬酸、全氟辛烷磺酸、全氟辛酸、月桂基硫酸钾、烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、月硅酸钠、月桂醇聚醚硫酸酯钠、月桂酰肌氨酸钠、肉豆蔻醇聚醚硫酸酯钠、壬酰基氧基苯磺酸钠、链烷醇聚醚硫酸酯钠、硬脂酸钠和硫脂。在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂包括一种或多种阳离子表面活性剂。示例性阳离子表面活性剂包括但不限于山嵛基三甲基氯化铵(behentrimoniumchloride)、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苄索氯铵(benzethonium chloride)、十二烷基二甲基苄基溴化铵(benzododecinium bromide)、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷(bronidox)、[1-(乙氧基羰基)十五烷基]三甲基溴化铵(carbethopendecinium bromide)、西他氯铵(cetalkonium chloride)、西曲溴铵(cetrimonium bromide)、西曲氯铵(cetrimonium chloride)、西吡氯铵(cetylpyridinium chloride)、二癸基二甲基氯化铵、二甲基二(十八烷基)溴化铵、二甲基二(十八烷基)氯化铵、溴化度米芬(domiphenbromide)、月桂基甲基葡糖醇聚醚-10羟基丙基二甲基氯化铵(lauryl methyl gluceth-10hydroxypropyl dimonium chloride)、奥替尼啶二盐酸盐(octenidinedihydrochloride)、奥拉氟(olaflur)、N-油烯基-1,3-丙烷二胺、箱鲀毒素(pahutoxin)、司拉氯铵(stearalkonium chloride)、四甲基氢氧化铵和通佐溴铵(thonzonium bromide)。在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂包括一种或多种两性离子表面活性剂。示例性两性离子表面活性剂包括但不限于椰油酰胺基丙基甜菜碱、椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、蛋卵磷脂、羟基磺基甜菜碱、卵磷脂、肉豆蔻胺氧化物、肽洁剂和月桂酰两性基乙酸钠。
在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂包括一种或多种非离子表面活性剂。示例性非离子表面活性剂包括但不限于烷基聚糖苷、聚西托醇1000(cetomacrogol 1000)、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、椰油酰胺dea、椰油酰胺mea、癸基葡萄糖苷、癸基多聚葡萄糖、甘油单硬脂酸酯、igepal ca-630、异鲸蜡醇聚醚-20(isoceteth-20)、月桂基葡萄糖苷、麦芽糖苷、甘油单月桂酸酯、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、窄范围乙氧化物、诺纳德p-40(nonidetp-40)、壬苯聚醇-9、壬苯聚醇、np-40、八乙二醇单十二烷基醚、n-辛基β-d-硫代吡喃葡萄糖苷、辛基葡萄糖苷、油醇、peg-10向日葵油甘油酯、五乙二醇单十二烷基醚、聚多卡醇(polidocanol)、泊洛沙姆(poloxamer)(例如泊洛沙姆188和泊洛沙姆407)、聚乙氧基化牛脂胺、聚甘油聚蓖麻油酸酯、聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80)、脱水山梨糖醇、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、脱水山梨糖醇三硬脂酸酯、硬脂醇、表面活性素、曲通x-100(triton x-100)。
在一些实施方案中，本文所述的纳米颗粒包含一种或多种非离子表面活性剂。在一些实施方案中，一种或多种非离子表面活性剂包括脂肪醇、脂肪酸或两者。在一些实施方案中，脂肪醇是C12-C24脂肪醇。在一些实施方案中，脂肪醇是月桂醇、十三醇、肉豆蔻醇、十五醇、鲸蜡醇、棕榈油醇、十七醇、硬脂醇、油醇、十九醇、花生醇或它们的组合。在一些实施方案中，C12-C24脂肪醇是油醇、硬脂醇或它们的混合物。在一些实施方案中，纳米颗粒包含油醇。在一些实施方案中，纳米颗粒包含硬脂醇。
在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂(诸如脂肪醇)以存在于纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约0.5mol％至约20mol％或介于其之间的任何范围的量存在于本文所述的纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂(诸如脂肪醇)以存在于纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约1mol％至约10mol％的量存在于纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂(诸如脂肪醇)以存在于纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约3mol％至约8mol％的量存在于纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂(诸如脂肪醇)以存在于纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约3mol％、约4mol％、约5mol％、约6mol％、约7mol％、约8mol％、约9mol％或约10mol％存在于纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂(诸如脂肪醇)以存在于纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约0.5mol％、1mol％、1.5mol％、2mol％、2.5mol％、3mol％或3.5mol％至约4mol％、4.5mol％、5mol％、5.5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％或10mol％的范围存在于纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，一种或多种表面活性剂(诸如脂肪醇)以存在于纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约1mol％、2mol％、3mol％、4mol％、5mol％、6mol％或7mol％至约8mol％、9mol％、10mol％、11mol％、12mol％、13mol％、14mol％、15mol％或20mol％的范围存在于纳米颗粒组合物中。
本文所述的纳米颗粒组合物可包含一种或多种渗透性增强剂分子、碳水化合物、聚合物或其他组分。渗透性增强剂分子可为例如由美国专利申请公布第2005/0222064号所描述的分子。碳水化合物可为简单糖(例如葡萄糖)和多糖(例如糖原及其衍生物和类似物)。
在一些实施方案中，本文所述的纳米颗粒组合物包含聚合物。聚合物可为生物可降解的和/或生物可相容的。示例性聚合物包括但不限于聚胺、聚醚、聚酰胺、聚酯、聚氨基甲酸酯、聚脲、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚砜、聚氨酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚异氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈和聚芳酯。在一些实施方案中，本文所述的纳米颗粒组合物包含聚(己内酯)(PCL)、乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLLGA)、聚(D,L-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯-共-乙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PEO-共-D,L-丙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PPO-共-D,L-丙交酯)、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚氨酯、聚-L-赖氨酸(PLL)、甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)、聚乙二醇、聚-L-谷氨酸、聚(羟基酸)、聚酐、聚原酸酯、聚(酯酰胺)、聚酰胺、聚(酯醚)、聚碳酸酯、聚烯烃诸如聚乙烯和聚丙烯、聚亚烷基二醇诸如聚(乙二醇)(PEG)、聚氧化烯(PEO)、聚对苯二甲酸亚烷酯诸如聚(对苯二甲酸乙二酯)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯醚、聚乙烯酯诸如聚(乙酸乙烯酯)、聚卤乙烯诸如聚(氯乙烯)(PVC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚硅氧烷、聚苯乙烯(PS)、聚氨酯、衍生纤维素诸如烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酸的聚合物诸如聚((甲基)丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚((甲基)丙烯酸乙酯)、聚((甲基)丙烯酸丁酯)、聚((甲基)丙烯酸异丁酯)、聚((甲基)丙烯酸己酯)、聚((甲基)丙烯酸异癸酯)、聚((甲基)丙烯酸月桂酯)、聚((甲基)丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八酯)及其共聚物和混合物、聚二噁烷酮和它的共聚物、聚羟基链烷酸酯、聚反丁烯二酸丙二酯、聚甲醛、泊洛沙姆、泊洛沙胺(poloxamine)、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、碳酸1,3-丙二酯、聚(N-丙烯酰基吗啉)(PAcM)、聚(2-甲基-2-噁唑啉)(PMOX)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)(PEOZ)、聚甘油或它们的组合。
核酸稳定剂
在一些实施方案中，本文所述的纳米颗粒组合物包含使包封核酸有效载荷(例如核酸治疗剂)的脂质纳米颗粒稳定的赋形剂。举例来说，核酸治疗剂可为用以调节致病蛋白的mRNA；用以编辑目标治疗性基因的mRNA和指导RNA；RNA编辑核酸有效载荷；siRNA；反义寡核苷酸诸如用以引发RNA酶H介导的基因沉默的那些；微RNA和抗微RNA剂；RNA激活剂；适体等。
脂质纳米颗粒(LNP)代表一种用于核酸治疗剂的有效非病毒递送系统。LNP治疗的功效可由众多变量决定，包括包封的RNA运载物的稳定性和功能性。如果RNA运载物在长期储存或冷冻/解冻期间经受切割、降解或结构变化，那么可发生治疗效能的部分或完全丧失。因此，本文公开的纳米颗粒组合物在递送核酸有效载荷方面是有利的，这至少部分地归因于纳米颗粒组合物和/或包封的组合物(包括例如核酸治疗剂)的稳定性增强。在一些实施方案中，增强的稳定性可延长包含纳米颗粒的药物组合物的储存期限，并且改善其冷冻-解冻抗性。在一些实施方案中，增强的稳定性至少部分地通过选择用于溶解核酸有效载荷的缓冲液的类型、pH、体积摩尔渗透压浓度和反离子来实现。在一些实施方案中，增强的稳定性至少部分地通过添加核酸稳定剂来实现。核酸稳定剂可选自由FDA认定为公认安全(GRAS)的赋形剂。因此，在一个方面，本公开描述了通常使用的GRAS赋形剂用以改善RNA稳定性和通过LNP进行的递送的创新用途。
本文所述的纳米颗粒组合物可包含核酸稳定剂。在一些实施方案中，核酸稳定剂是聚乙二醇。在一些实施方案中，核酸稳定剂是阳离子表面活性剂诸如西曲溴铵和西曲氯铵。在一些实施方案中，核酸稳定剂是西曲溴铵(即十六烷基三甲基溴化铵或CTAB)。在一些实施方案中，核酸稳定剂是多糖或寡糖诸如低分子量壳聚糖。示例性低分子量壳聚糖可具有50,000至190,000Da或低于50,000Da的分子量。在一些实施方案中，核酸稳定剂是低温保护剂。示例性低温保护剂包括但不限于多元醇(例如二醇或三醇诸如丙二醇(即1,2-丙二醇)、1,3-丙二醇、甘油、2-甲基-2,4-戊二醇、1,6-己二醇、1,2-丁二醇、2,3-丁二醇、乙二醇或二乙二醇)、非洗涤剂磺基甜菜碱(例如NDSB-201(3-(1-吡啶子基)-1-丙烷磺酸盐)、渗透调节物质(例如L-脯氨酸或三甲胺N-氧化物二水合物)、水溶性聚合物(例如聚乙二醇、聚乙二醇一甲基醚(mPEG)(诸如mPEG 550、mPEG 600、mPEG 2000、mPEG 3350、mPEG 4000和mPEG5000)、聚乙烯吡咯烷酮、季戊四醇丙氧基化物以及聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段聚合物)、有机溶剂(例如二甲亚砜(DMSO)或乙醇)、糖(例如D-(+)-蔗糖、D-山梨糖醇、海藻糖、D-(+)-麦芽糖一水合物、内消旋赤藓糖醇、木糖醇、肌肉肌醇、D-(+)-棉子糖五水合物、D-(+)-海藻糖二水合物或D-(+)-葡萄糖一水合物)、盐(例如乙酸锂、氯化锂、甲酸锂、硝酸锂、硫酸锂、乙酸镁、氯化钠、甲酸钠、丙二酸钠、硝酸钠、硫酸钠或它们的任何水合物)或它们的任何组合。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含两种或更多种核酸稳定剂。
在一些实施方案中，核酸稳定剂是聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，聚乙二醇是PEG 200、PEG 400、PEG 600、PEG 1000、PEG 3350、PEG 4000、PEG 8000、PEG 10000、PEG20000或它们的组合。在一些实施方案中，聚乙二醇是PEG 200、PEG 400、PEG 600或它们的组合。在一些实施方案中，聚乙二醇具有约120至约5000Da或介于其之间的任何数目或范围的数量平均分子量(Mn)。在一些实施方案中，聚乙二醇具有约120至约200Da、约200至约800Da、约200至约600Da、约120至约1000Da或约40至约1200Da的Mn。在一些实施方案中，聚乙二醇具有约120、约160或约200至约300、约400、约500、约600、约700或约800Da的数量平均分子量。在一些实施方案中，核酸稳定剂包括PEG 400。在一些实施方案中，本文所述的纳米颗粒组合物包含聚乙二醇(诸如PEG400)和核酸有效载荷(诸如mRNA、指导RNA和/或siRNA)。
在一个方面，本文公开了一种制备包含核酸稳定剂的纳米颗粒组合物的方法。核酸稳定剂(例如聚乙二醇)可在添加核酸有效载荷之前、与此并行或在此之后添加至纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，将核酸稳定剂与核酸并行添加至纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，将核酸稳定剂与核酸有效载荷预混合。在一些实施方案中，将核酸稳定剂与核酸有效载荷在缓冲溶液中组合。在一些实施方案中，将核酸稳定剂(诸如PEG400)与核酸有效载荷(诸如mRNA、指导RNA和/或siRNA)在缓冲溶液中组合。在一些实施方案中，将核酸稳定剂(诸如PEG400)与核酸有效载荷在缓冲溶液中混合。在一些实施方案中，将核酸稳定剂(诸如PEG400)添加至包含核酸有效载荷的缓冲液中。在一些实施方案中，在脂质混合之前将核酸稳定剂诸如PEG-400连同RNA运载物一起添加至药物物质缓冲液中可允许它并入LNP的核心中，在所述核心中，预期它会赋予若干优势：1)通过对RNA核心提供缓冲来增加在2-8℃下以及在冷冻温度诸如-20、-40和-80℃下的长期稳定性，2)改善RNA包封(也以“包埋”而为本领域技术人员所知)率，并且3)保持RNA效能以及防止切割/降解。在一些实施方案中，在添加脂质和核酸有效载荷之后将核酸稳定剂(诸如PEG400)添加至纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，在配制之后并且在冷冻之前将核酸稳定剂(诸如PEG400)添加至纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，制备纳米颗粒组合物的方法包括收集LNP或将LNP的缓冲液更换成含有目标量的核酸稳定剂诸如PEG400的药物产品或冷冻缓冲溶液。在一些实施方案中，在冷冻缓冲溶液中以及在药物物质缓冲液中添加核酸稳定剂诸如PEG400可通过对RNA核心提供缓冲来增加在2-8℃下以及在冷冻温度诸如-20、-40和-80℃下的长期稳定性，并且保持RNA效能以及防止切割/降解。
在一些实施方案中，核酸稳定剂(诸如PEG400)以按总重量计约0.001％至约50％的量存在于所描述的纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，核酸稳定剂(诸如PEG400)以按总重量计约0.01％至约20％的量存在于纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，核酸稳定剂(诸如PEG400)以按总重量计约0.01％至约5％的量存在于纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，核酸稳定剂(诸如PEG400)以按总重量计至多约15％的量存在于纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，核酸稳定剂以按总重量计约0.01％、约0.05％、约0.1％、约0.15％或约0.2％至约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％或约2.0％存在于纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，核酸稳定剂以按总重量计约0.01％、0.25％、约0.5％、约0.75％、约1％或约5％至约7.5％、约10％、约15％或约20％的范围存在于纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，核酸稳定剂以按总重量计约0.01％至约0.5％、0.01％至约2％、0.01％至约3％、约0.2％至约0.8％、约0.4％至约0.6％、约0.6％至约0.8％、约0.5％至约1.0％、约0.5％至约2.0％、约1％至约2％、约1％至约5％、约5％至约10％、约10％至约15％、约15％至约20％、约2.5％至约7.5％、约7.5％至约12.5％、约12.5％至约17.5％或约15％至约25％的量存在于纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，核酸稳定剂以按总重量计至少0.1％、至少0.2％、至少0.25％、至少0.5％、至少0.75％、至少1％、至少2％、至少5％、至少10％或至少15％的量存在于纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，核酸稳定剂以按总重量计至多0.25％、至多0.5％、至多0.75％、至多1％、至多2％、至多5％、至多7.5％、至多10％、至多15％、至多20％、至多25％或至多30％的量存在于纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，核酸稳定剂以按总重量计约0.25％、约0.5％、约0.75％、约5％、约10％或约15％的量存在于纳米颗粒组合物中。
在一些实施方案中，在核酸有效载荷之前或在与核酸有效载荷共混合之前将核酸稳定剂(诸如PEG-400)添加至药物物质缓冲液中，不含有RNA的药物物质缓冲液中的w/w％高于最终含有RNA的药物物质缓冲液中的目标w/w％，以致用RNA进行的最终稀释将核酸稳定剂％稀释至目标w/w％。在一些实施方案中，核酸稳定剂(例如PEG-400)以与它在药物物质缓冲液中的重量百分比成比例的量被圈闭在颗粒的核心内。
其他脂质
在一些实施方案中，所公开的LNP组合物包含辅助脂质。在一些实施方案中，所公开的LNP组合物包含中性脂质。在一些实施方案中，所公开的LNP组合物包含隐形脂质。在一些实施方案中，所公开的LNP组合物包含额外脂质。
如本文所用，适用于本公开的脂质组合物中的“中性脂质”包括例如多种中性、不带电荷或两性离子脂质。适用于本公开中的中性磷脂的实例包括但不限于5-十七烷基苯-1,3-二酚(间苯二酚)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、磷酸胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酰胆碱(PLPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、蛋磷脂酰胆碱(EPC)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(PMPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱(PSPC)、1,2-二花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(SPPC)、l,2-二(二十碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、溶血磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二亚油酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺以及它们的组合。在一些实施方案中，中性磷脂可选自SPC和二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)。在一些实施方案中，中性磷脂是DSPC。中性脂质可起使LNP稳定，并且改善LNP的加工的作用。
“辅助脂质”可指增强转染(例如包括生物活性剂的纳米颗粒的转染)的脂质。辅助脂质增强转染的机制包括增强颗粒稳定性。在一些实施方案中，辅助脂质增强膜融合性。在一些实施方案中，辅助脂质是中性脂质。
“隐形脂质”可指改变纳米颗粒可在体内(例如在血液中)存在的时长的脂质。隐形脂质可通过例如降低颗粒聚集和控制粒度来有助于配制过程。本文所用的隐形脂质可调节LNP的药物代谢动力学性质。适用于本公开的脂质组合物中的隐形脂质可包括但不限于具有连接于脂质部分的亲水性头基的隐形脂质。适用于本公开的脂质组合物中的隐形脂质和关于此类脂质的生物化学的信息可见于Romberg等人,Pharmaceutical Research,第25卷,第1期,2008,第55-71页以及Hoekstra等人,Biochimica et Biophysica Acta 1660(2004)41-52中。额外的适合PEG-脂质公开于例如WO 2006/007712中。
在一些实施方案中，隐形脂质是PEG-脂质。在一个实施方案中，隐形脂质的亲水性头基包含聚合物部分，所述聚合物部分选自基于PEG(有时被称为聚(氧化乙烯))、聚(噁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚氨基酸和聚N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺]的聚合物。隐形脂质可包含脂质部分。在一些实施方案中，隐形脂质的脂质部分可衍生自二酰基甘油或二酰基咪唑二酰胺，包括包含二烷基甘油或二烷基咪唑二酰胺基团的那些，所述二烷基甘油或二烷基咪唑二酰胺基团具有独立地包含约C4至约C40饱和或不饱和碳原子的烷基链长度，其中链可包含一个或多个官能团诸如像酰胺或酯。二烷基甘油或二烷基咪唑二酰胺基团还可包含一个或多个被取代的烷基。
辅助脂质、中性脂质、隐形脂质和/或其他脂质的结构和性质进一步描述于WO2017173054A1、WO2019067999A1、US20180290965A1、US20180147298A1、US20160375134A1、US8236770、US8021686、US8236770B2、US7371404B2、US7780983B2、US7858117B2、US20180200186A1、US20070087045A1、WO2018119514A1和WO2019067992A1中，所述专利全都在此通过引用以它们的整体并入本文。
LNP制剂
本文所述的LNP可被设计用于一种或多种特定应用或靶标。纳米颗粒组合物的元件可基于特定应用或靶标，以及/或者基于功效、毒性、费用、易用性和可用性来选择。类似地，纳米颗粒组合物的特定制剂可针对特定应用或靶标来选择。示例性LNP制剂包括但不限于表4-6、8-15和17中所述的制剂。示例性LNP制剂还包括包含式(I)、(I*)、(Ia)(Ib)、(II)、(II*)的氨基脂质和式(III)和(III*)的PEG脂质的组合物。
所描述的LNP制剂可被设计用于一种或多种特定应用或靶标。举例来说，纳米颗粒组合物可被设计来将治疗剂诸如RNA递送至哺乳动物的身体中的特定细胞、组织、器官或系统或它们的组。可改变纳米颗粒组合物的生理化学性质以增加对特定身体靶标的选择性。举例来说，可基于不同器官的开窗尺寸调整粒度。包括在纳米颗粒组合物中的治疗剂还可基于一种或多种所需的递送靶标来选择。举例来说，治疗剂可针对特定适应症、病况、疾病或病症，以及/或者针对向特定细胞、组织、器官或系统或它们的组的递送(例如局部化或特异性递送)来选择。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物可包括编码目标多肽的mRNA，所述mRNA能够在细胞内被翻译以产生所述目标多肽。此种组合物可被设计来特异性递送至特定器官。
LNP组合物中的治疗剂的量可取决于纳米颗粒组合物的尺寸、组成、所需靶标和/或应用或其他性质。举例来说，包含在纳米颗粒组合物中的RNA的量可取决于RNA的尺寸、序列和其他特征。纳米颗粒组合物中的治疗剂和其他元件(例如脂质)的相对量也可变化。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物中脂质组分与治疗剂的wt/wt比率可为约5:1至约60:1，诸如约5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1和60:1。举例来说，脂质组分与治疗剂的wt/wt比率可为约10:1至约40:1。在某些实施方案中，wt/wt比率是约20:1。纳米颗粒组合物中的治疗剂的量可使用吸收光谱法(例如紫外-可见光谱法)测量。
在一些实施方案中，LNP组合物包含一种或多种核酸诸如RNA。在一些实施方案中，可选择一种或多种RNA、脂质以及它们的量以提供特定N/P比率。N/P比率可选自约1至约30。N/P比率可选自约2至约10。在一些实施方案中，N/P比率是约0.1至约50。在一些实施方案中，N/P比率是约2至约8。在一些实施方案中，N/P比率是约2至约15、约2至约10、约2至约8、约2至约6、约3至约15、约3至约10、约3至约8、约3至约6、约4至约15、约4至约10、约4至约8或约4至约6。在一些实施方案中，N/P比率是约2至约8。在一些实施方案中，N/P比率是约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6或约6.5。在一些实施方案中，N/P比率是约4至约6。在一些实施方案中，N/P比率是约4、约4.5、约5、约5.5或约6。
在一些实施方案中，LNP以在约50％至约70％、约70％至约90％或约90％至约100％的范围内的平均包封率形成。在一些实施方案中，LNP以在约75％至约95％的范围内的平均包封率形成。在一些实施方案中，本文所述的纳米颗粒的核酸(例如RNA)包埋效率是至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，本文所述的纳米颗粒的核酸包埋效率是约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约90％至约99％或约95％至约99％。在一些实施方案中，本文所述的纳米颗粒的核酸包埋效率是约90％至约99％。
在一些实施方案中，本文所述的纳米颗粒具有约10nm至约500nm的中值直径。在一些实施方案中，本文所述的纳米颗粒的中值直径是约50nm至约150nm、约60nm至约140nm、约70nm至约130nm、约80nm至约120nm或约90nm至约110nm。在一些实施方案中，本文所述的纳米颗粒的中值直径是约60nm、约65nm、约70nm、约75nm、约80nm、约85nm、约90nm、约95nm、约100nm、约105nm、约110nm、约115nm或约120nm。纳米颗粒的粒度和粒度分布可使用例如Zetasizer Ultra ZSU 5700(Malvern,USA)通过光散射来测量。在一些实施方案中，粒度分布是单峰的。
LNP制剂的制备
在一个方面，本公开中描述了用于制备LNP组合物的工艺。
用于制备脂质纳米颗粒的工艺可包括若干一般性步骤：(i)在第一储器中提供包含一种或多种核酸分子实体的第一溶液，诸如柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液；(ii)在第二储器中提供包含一种或多种脂质和有机溶剂诸如醇(例如乙醇)的第二溶液；以及(iii)将所述第一溶液与所述第二溶液混合。第一储器任选地与第二储器成流体连通。
在一些实施方案中，本文公开了一种制备包含脂质纳米颗粒的制剂的方法，其中所述纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)氨基脂质，和(iii)一种或多种选自结构脂质、中性脂质和PEG-脂质的脂质。在一些实施方案中，方法包括(a)将氨基脂质的第一部分与一种或多种核酸分子实体在第一溶液中组合，其中所述第一部分占总氨基脂质的0.1mol％至99mol％；(b)将氨基脂质的剩余部分与一种或多种选自结构脂质、中性脂质和PEG-脂质的脂质在第二溶液中组合；(c)将所述第一溶液和所述第二溶液混合，由此产生脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，氨基脂质的第一部分被配置为中和一种或多种核酸分子实体中0.1-99％的磷酸根(基于N:P)，或介于其之间的任何数目或范围。在一些实施方案中，氨基脂质的第一部分被配置为中和一种或多种核酸分子实体中0.5-90％的磷酸根(基于N:P)。在一些实施方案中，氨基脂质的第一部分被配置为中和一种或多种核酸分子实体中约5至90％、10至75％、25至50％、25至75％、50至75％或50至90％的磷酸根(基于N:P)。在一些实施方案中，氨基脂质的第一部分被配置为中和一种或多种核酸分子实体中约10％、15％、25％、50％或75％的磷酸根(基于N:P)。在一些实施方案中，第一溶液是水性缓冲溶液，例如柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，第一溶液还包含核酸稳定剂，例如PEG 400。在一些实施方案中，将第一溶液和第二溶液于管线内混合器中混合。
工艺可任选地包括一个或多个稀释步骤、一个或多个孵育步骤、一个或多个缓冲液更换步骤、一个或多个浓缩步骤和/或一个或多个过滤步骤。在一些实施方案中，稀释步骤涉及通过添加稀释缓冲液进行稀释。在一些实施方案中，稀释步骤涉及用水性缓冲液(例如柠檬酸盐缓冲液或纯水)稀释，例如使用泵送设备(例如蠕动泵)。在一些实施方案中，稀释缓冲液是有机溶液诸如醇。稀释步骤可包括是初始体积的1至20倍或介于其之间的任何数目或范围的稀释。在一些实施方案中，稀释步骤包括是初始体积的1至10倍的稀释。在一些实施方案中，稀释步骤继之以缓冲液更换步骤或孵育步骤。
孵育步骤包括在约室温下并且任选地避光使来自混合步骤的溶液在容器中静置约0至约100小时。在一些实施方案中，孵育步骤进行0至24小时、1分钟至2小时或1分钟至60分钟。在一些实施方案中，孵育步骤进行1分钟至120分钟。在一些实施方案中，孵育步骤继之以缓冲液更换步骤。在一些实施方案中，孵育步骤在缓冲液更换步骤之后。
在一些实施方案中，缓冲液更换步骤包括产生更高浓度的磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液的溶剂更换。在一些实施方案中，缓冲液更换步骤包括移除全部或一部分有机溶剂。在一些实施方案中，缓冲液更换步骤包括通过适合膜(例如10,000mwc蛇皮膜)进行透析。在一些实施方案中，缓冲液更换步骤包括过滤诸如切向流过滤(TFF)。在一些实施方案中，缓冲液更换步骤包括色谱分析，诸如使用脱盐柱例如PD10柱。在一些实施方案中，缓冲液更换步骤包括超滤。超滤包括浓缩稀释溶液，随后透滤，例如使用适合泵送系统(例如泵送设备诸如蠕动泵或其等效物)与适合超滤膜(例如GE中空纤维柱芯或等效物)的联合。
在一些实施方案中，混合步骤提供澄清单相。在一些实施方案中，在混合步骤之后，移除有机溶剂以提供颗粒的悬浮液，其中一种或多种核酸分子实体由一种或多种脂质包封。有机溶剂的选择可涉及对溶剂极性和溶剂可在颗粒形成的后期被移除的容易性的考虑。可充当增溶剂的有机溶剂可处于足以提供一种或多种核酸分子实体和一种或多种脂质的澄清单相混合物的量。有机溶剂可选自氯仿、二氯甲烷、乙醚、环己烷、环戊烷、苯、甲苯、甲醇和其他脂族醇(例如C1至C8)(诸如乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、叔丁醇、异丁醇、戊醇和己醇)中的一者或多者(例如两者)。用于移除有机溶剂的方法可涉及透滤或透析或在减压下蒸发或将惰性气体(例如氮气或氩气)流吹过混合物。
在一些实施方案中，方法还包括添加可用于实现使用本发明组合物的细胞转化的非脂质聚阳离子。适合非脂质聚阳离子的实例包括但不限于海地美溴铵(hexadimethrinebromide)(以商标名称销售，来自Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,Wis.,USA)或海地美铵(hexadimethrine)的其他盐。其他适合聚阳离子包括例如聚L-鸟氨酸、聚L-精氨酸、聚L-赖氨酸、聚D-赖氨酸、聚烯丙胺和聚乙烯亚胺的盐。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒的形成可在单相系统(例如Bligh和Dyer单相或水性和有机溶剂的类似混合物)中或在两相系统中在适合混合下进行。
脂质纳米颗粒可在单相或双相系统中形成。在一些实施方案中，在单相系统中，一种或多种氨基脂质和一种或多种核酸分子实体各自溶解在一定体积的单相混合物中。组合两种溶液提供其中形成复合物的单一混合物。在一些实施方案中，在双相系统中，氨基脂质结合至一种或多种核酸分子实体(其存在于水相中)，因此增加在有机相中的溶解性。
在一些实施方案中，在包括用于容纳水溶液的第一储器和用于容纳有机脂质溶液的第二储器的设备中制备脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，设备包括用于容纳水溶液(诸如一种或多种核酸分子实体的一部分的水溶液)和/或有机溶液的额外储器。设备可包括被配置为以基本上相等的流速将水性和有机脂质溶液泵送至混合区或混合室中的泵机构。在一些实施方案中，混合区或混合室包括T型联接或其等效物，其允许水性和有机流体流组合作为输入物进入T型连接器中，并且所得到的组合的水性和有机溶液退出所述T型连接器进入收集储器或其等效物中。
在一些实施方案中，第一溶液包含水性缓冲液。在一些实施方案中，第一溶液包含水性缓冲液与有机溶剂混合的混合物。在一些实施方案中，存在于水性缓冲液中的有机溶剂是乙醇。在一些实施方案中，第二溶液包含水性缓冲液与有机溶剂混合的混合物。在一些实施方案中，第二溶液包含乙醇。在一些实施方案中，第二溶液包含乙醇和水。在一些实施方案中，水性缓冲液中的乙醇百分比的范围是0.1％至50％，或介于其之间的任何数目或范围。在一些实施方案中，稀释缓冲液包含水性缓冲液。在一些实施方案中，稀释缓冲液包含有机溶剂。在一些实施方案中，稀释缓冲液包含乙醇和水。在一些实施方案中，稀释缓冲液包含在PBS缓冲液中的10％至20％乙醇。
在一些实施方案中，混合包括层流混合、涡旋混合、湍流混合或它们的组合。在一些实施方案中，混合包括交叉混合。在一些实施方案中，混合包括在线混合。在一些实施方案中，混合包括通过第一进入通道引入至少一部分第一溶液，并且通过第二进入通道引入至少一部分第二溶液，并且其中所述第一进入通道与所述第二进入通道之间的角度是约0至180度。在一些实施方案中，第一进入通道与第二进入通道之间的角度是约15至180度、约30至180度、约45至180度、约60至180度、约90至180度，或介于其之间的任何数目或范围。在一些实施方案中，混合包括通过第三进入通道引入一部分第一溶液。混合步骤可通过许多方法进行，例如通过机械装置诸如涡旋混合器。在一些实施方案中，混合步骤包括在线混合。
在一些实施方案中，制备包含本文所述的纳米颗粒的制剂的方法包括过滤步骤。在一些实施方案中，制备包含本文所述的纳米颗粒的制剂的方法包括缓冲液更换。在一些实施方案中，缓冲液更换包括透析、色谱分析或切向流过滤(TFF)。
III.药物组合物
在一个方面，本文公开了包含一种或多种所描述的颗粒组合物的药物组合物。举例来说，药物组合物可包括一种或多种包括一种或多种不同有效载荷的LNP组合物。药物组合物还可包括一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体或辅助成分诸如本文所述的那些。关于配制和制造药物组合物和药剂的一般性指导方针可在例如Remington's The Scienceand Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro；Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,Md.,2006中获得。赋形剂或载体可包括除一种或多种本公开的化合物、一种或多种其他脂质组分和有效载荷以外的任何成分。赋形剂可对制剂赋予功能性(例如药物释放速率控制)和/或非功能性(例如加工助剂或稀释剂)特征。对赋形剂和载体的选择可取决于诸如特定施用模式、赋形剂对溶解性和稳定性的影响以及剂型的性质的因素。胃肠外制剂通常是水性或油性溶液或悬浮液。可使用诸如糖(包括但不局限于葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇等)、盐、碳水化合物和缓冲剂(优选地缓冲至3至9的pH)的赋形剂或载体。在一些实施方案中，LNP组合物可用无菌非水性溶液配制或配制成干燥形式以与适合媒介物诸如无菌无热原水(WFI)联合使用。
在一些实施方案中，赋形剂或载体可占包含纳米颗粒组合物的药物组合物的总质量或体积的大于50％。举例来说，赋形剂或载体可占药物组合物的50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂或载体是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯的。在一些实施方案中，药物组合物可包含0.1％至100％(wt/wt)的一种或多种纳米颗粒组合物。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物和/或药物组合物被冷藏或冷冻以用于储存和/或运输(例如在4℃或更低的温度诸如约-150℃与约0℃之间或约-80℃与约-20℃之间的温度下储存)。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物和/或药物组合物在约-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-130℃或-150℃下冷藏或冷冻。
所描述的LNP组合物和/或药物组合物可施用至任何患者或对象，包括可受益于通过将有效载荷递送至一种或多种特定细胞、组织、器官或系统或它们的组来提供的治疗作用的那些患者或对象。在一些实施方案中，对象是哺乳动物诸如人。在一些实施方案中，对象是非人灵长类动物或哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物诸如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠。
包括一种或多种纳米颗粒组合物的药物组合物可通过药理学领域中已知或今后开发的任何方法制备。一般来说，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合，接着如果合乎需要或必要，那么将产品划分、成形和/或包装成所需单次或多次剂量单位。
本公开的药物组合物可以单一单位剂量形式和/或以多个单一单位剂量形式制备、包装和/或整批销售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分(例如纳米颗粒组合物)的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于活性成分的将施用至对象的剂量，和/或此种剂量的适宜分数，诸如像此种剂量的一半或三分之一。药物组合物可以适于多种施用途径和方法的多种形式制备。举例来说，药物组合物可以液体剂型(例如乳剂、微乳剂、纳米乳剂、溶液、混悬剂、糖浆和酏剂)、可注射形式、固体剂型(例如胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂)、用于表面和/或经皮施用的剂型(例如软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂和贴剂)、混悬剂、粉剂和其他形式制备。
在一些实施方案中，药物组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种有效载荷。在一些实施方案中，药物组合物包含两种不同有效载荷，诸如指导RNA和mRNA。指导RNA和mRNA可位于同一LNP组合物中，或它们可位于单独LNP组合物处。举例来说，药物组合物可包含两种不同LNP组合物，一种包含指导RNA有效载荷，并且另一种包含mRNA有效载荷。再举例来说，药物组合物可包含两种不同LNP组合物，一种包含指导RNA(或mRNA)有效载荷，并且另一种包含mRNA有效载荷与指导RNA有效载荷两者。再举例来说，药物组合物可包含一种LNP组合物，所述LNP组合物包含mRNA有效载荷和指导RNA有效载荷。在一些实施方案中，药物组合物包含两种或更多种不同LNP组合物。在一些实施方案中，两种或更多种不同LNP组合物存在于药物组合物中，以使得一种或多种mRNA分子和一种或多种指导RNA分子处于本文所述的摩尔比或重量比。
gRNA和mRNA有效载荷可以各种摩尔比或重量比存在于药物组合物中。举例来说，药物组合物中gRNA与mRNA的比率按重量计可为0.01至100，和/或介于其之间的任何值。举例来说，药物组合物中gRNA与mRNA的比率按摩尔量计可为0.01至100，和/或介于其之间的任何值。在一些实施方案中，药物组合物中gRNA与mRNA的比率按重量计或按摩尔量计是约1至约50，和/或介于其之间的任何值。在一些实施方案中，药物组合物中gRNA与mRNA的比率按重量计或按摩尔量计是约0.1至约10，和/或介于其之间的任何值。在一些实施方案中，药物组合物中gRNA与mRNA的比率按重量计是约0.2至约5、约0.25至约4、约0.3至约3或约0.5至约2。在一些实施方案中，药物组合物中gRNA与mRNA的比率按摩尔量计是约0.2至约5、约0.25至约4、约0.3至约3或约0.5至约2。在一些实施方案中，药物组合物中gRNA与mRNA的比率按重量计是约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9或约1:10。在一些实施方案中，药物组合物中gRNA与mRNA的比率按摩尔量计是约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9或约1:10。在一些实施方案中，药物组合物中mRNA与gRNA的比率按重量计是约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9或约1:10。在一些实施方案中，药物组合物中mRNA与gRNA的比率按摩尔量计是约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9或约1:10。在一些实施方案中，药物组合物中gRNA与mRNA的比率按重量计是约1:1。在一些实施方案中，药物组合物中gRNA与mRNA的比率按摩尔量计是约1:1。
在一些实施方案中，药物组合物中的gRNA靶向在肝细胞中产生的致病基因。在一些实施方案中，所公开的组合物的靶标细胞选自肝细胞、上皮细胞、造血细胞、上皮细胞、内皮细胞、肺细胞、骨细胞、干细胞、间充质细胞、神经细胞、心脏细胞、脂肪细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、β细胞、垂体细胞、滑膜衬里细胞、卵巢细胞、睾丸细胞、成纤维细胞、B细胞、T细胞、网织红细胞、白细胞、粒细胞和肿瘤细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含超过一种指导RNA。举例来说，药物组合物可包含2、3、4、5种或更多种不同指导RNA。在一些实施方案中，药物组合物包含两种指导RNA分子。在一些实施方案中，药物组合物包含一种mRNA和两种或更多种指导RNA分子。在一些实施方案中，两种或更多种指导RNA分子靶向同一致病基因。在一些实施方案中，两种或更多种指导RNA分子靶向不同基因。在一些具体实施方案中，两种或更多种指导RNA分子靶向在肝细胞中产生的两个单独的目标致病基因。在一些实施方案中，gRNA是sgRNA。在一些实施方案中，gRNA是dgRNA。
IV.使用方法
本文公开的LNP组合物和药物组合物可在体内以及在体外用于基因编辑方法中。在一些实施方案中，方法包括使细胞与本文所述的LNP组合物或药物组合物接触。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是啮齿动物细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是肝脏细胞。在某些实施方案中，细胞是人肝脏细胞。在一些实施方案中，肝脏细胞是肝细胞。在一些实施方案中，肝细胞是人肝细胞。在一些实施方案中，肝脏细胞是干细胞。在一些实施方案中，人肝脏细胞是肝窦内皮细胞(LSEC)。在一些实施方案中，人肝脏细胞是库普弗细胞(Kupffer cell)。在一些实施方案中，人肝脏细胞是肝星形细胞。在一些实施方案中，人肝脏细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，人肝脏细胞是肝干细胞。在一些实施方案中，细胞包含ApoE结合受体。在一些实施方案中，提供了经工程改造细胞；例如经工程改造细胞可源于如本文所述的任一细胞类型。此类经工程改造细胞可根据本文所述的方法产生。在一些实施方案中，经工程改造细胞驻留在对象内的组织或器官例如肝内。
在一些实施方案中，细胞在靶标序列中包含修饰，例如核苷酸的插入或缺失(“插入缺失”)或取代。在一些实施方案中，修饰包括在靶标序列中插入1、2、3、4或5个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，修饰包括在靶标序列中插入1或2个核苷酸。在其他实施方案中，修饰包括缺失靶标序列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，修饰包括缺失靶标序列中的1或2个核苷酸。在一些实施方案中，修饰包括导致靶标序列中的移码突变的插入缺失。在一些实施方案中，修饰包括取代靶标序列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，修饰包括取代靶标序列中的1或2个核苷酸。在一些实施方案中，修饰包括由模板核酸例如本文所述的任何模板核酸的并入所导致的核苷酸插入、缺失或取代中的一者或多者。
在一些实施方案中，方法包括接触细胞群体，诸如经工程改造细胞群体。在一些实施方案中，细胞群体包含在体外培养的经工程改造细胞。在一些实施方案中，群体驻留在对象内的组织或器官例如肝内。在一些实施方案中，群体内至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或更多的细胞是经工程改造的。在某些实施方案中，本文公开的方法产生至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％编辑效率(或“编辑百分比”)，其通过检测插入缺失来确定。在其他实施方案中，本文公开的方法产生至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％DNA修饰效率，其通过检测无论是通过插入、缺失、取代还是以其他方式导致的序列变化来确定。在某些实施方案中，本文公开的方法产生在约5％至约100％、约10％至约50％、约20至约100％、约20至约80％、约40至约100％或约40至约80％之间的编辑效率水平或DNA修饰效率水平。
在一些实施方案中，群体内的细胞包含修饰。在一些实施方案中，修饰包括在靶标序列中插入1、2、3、4或5个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，修饰包括在靶标序列中插入1或2个核苷酸。在其他实施方案中，修饰包括缺失靶标序列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，修饰包括缺失靶标序列中的1或2个核苷酸。在一些实施方案中，修饰包括导致靶标序列中的移码突变的插入缺失。在一些实施方案中，群体中至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或更多的经工程改造细胞包含移码突变。
在一些实施方案中，LNP组合物可用于编辑基因，从而导致基因剔除。在一些实施方案中，LNP组合物可用于编辑基因，从而导致基因修正。在一些实施方案中，LNP组合物可用于编辑细胞，从而导致基因插入。在一些实施方案中，公开了用于使细胞中靶标基因的表达沉默的方法。在一些实施方案中，方法包括使包含表达的靶标基因的细胞与本文所述的LNP组合物或药物组合物在gRNA进入细胞，并且使细胞内所述靶标基因的表达沉默的条件下接触。在某些实施方案中，细胞在哺乳动物诸如人中。在一些实施方案中，用于使靶标基因的表达沉默的方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的本文所述的包含一种或多种gRNA的LNP组合物或药物组合物。在一些实施方案中，相对于在不存在gRNA下(例如缓冲液对照或无关gRNA对照)检测的RNA水平，施用本文所述的包含一种或多种gRNA的LNP组合物或药物组合物使靶标RNA水平降低至少约5％、100％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或在其中的任何范围)。在一些实施方案中，相对于阴性对照诸如像缓冲液对照或无关非靶向gRNA对照，施用包含一种或多种gRNA的LNP组合物或药物组合物使靶标RNA水平降低至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100天或更多天(或在其中的任何范围)。
在一些实施方案中，施用LNP组合物或药物组合物可导致产生持久响应的基因编辑。举例来说，施用可产生一天、一个月、一年或更久的响应持续时间。如本文所用，“响应持续时间”意指在已使用本文公开的LNP组合物或药物组合物编辑细胞之后，所得修饰在施用之后仍然持续某一时期存在。修饰可通过测量靶标蛋白质水平来检测。修饰可通过检测靶标DNA来检测。在一些实施方案中，响应持续时间可为至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少4个月、至少6个月或至少1年。在某些实施方案中，响应持续时间可为约26周。在一些实施方案中，响应持续时间可为至少5年或至少10年。持久响应可在至少6个月之后通过测量靶标蛋白质水平或通过检测靶标DNA来检测到。
在一个方面，本文公开了用于治疗对象的疾病或病况，包括产生对免疫原的免疫应答的方法。在一个实施方案中，疾病或病况可通过施用有效载荷治疗。在一些实施方案中，疾病或病况的特征在于缺失或异常的蛋白质或多肽活性。举例来说，可将包含编码缺失或异常多肽的mRNA的LNP组合物施用或递送至细胞。mRNA的后续翻译可产生多肽，由此减轻或消除由不存在多肽活性或异常的多肽活性所导致的问题。包括在LNP组合物中的有效载荷还可能够改变给定种类的转录速率，由此影响基因表达。
特征在于功能失调的或异常的蛋白质或多肽活性的疾病和/或病况可包括但不限于罕见疾病、感染性疾病(作为疫苗与治疗剂两者)、癌症和增生性疾病、遗传疾病(例如囊性纤维化)、自身免疫疾病、糖尿病、神经变性疾病、心血管和肾血管疾病以及代谢疾病。多种疾病和/或病况的特征可在于缺失的(或基本上减弱以致不发生适当蛋白质功能)蛋白质活性。此类蛋白质可不存在，或它们可基本上是非功能性的。功能失调的蛋白质的一具体实例是囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因的错义突变变体。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于通过施用包含RNA有效载荷的LNP组合物或药物组合物来治疗对象的此类疾病和/或病况的方法，其中所述RNA可为编码拮抗或以其他方式克服存在于所述对象的细胞中的异常蛋白质活性的多肽的mRNA。
尽管已详细描述本发明和它的优势，但应了解可在不脱离如随附权利要求中限定的本发明的精神和范围的情况下在本文中进行各种变化、替代和改变。
本公开的其他实施方案，例如LNP组合物(包括LNP组合物的各种组分)、药物组合物、制备组合物的方法、基因编辑的方法、治疗方法以及使用组合物的其他方法，可见于各种世界和美国专利/专利申请公布中，包括US9868692B2、US20180353434A1、US8492359B2、US9878042B2、US20180148719、US9687448B2、US9415109B2、US7858117B2、US9404127B2、US9504651、US20070087045A1、US20180092848A1、US20170273907A1、US20180147298A1、WO2019067992A1、WO2019067999A1、WO2018185241、WO2018170306A1、WO 2019046809Al、WO2017173054A1、WO2015095340、WO2016197133A1和WO2018191750，所述专利全都在此通过引用以它们的整体并入本文。在WO2016153012 A1、WO2018062413 A1、WO2019027055A1、WO2017/173054Al、WO2015/095340A1、WO2013063468A1、WO2010054401A1和WO 2018/170306中描述了关于LNP组合物、药物组合物和方法的其他描述，所述专利全都在此通过引用以它们的整体并入本文。
在以下实施例中进一步说明本发明，所述实施例仅出于说明目的给出，并且不意图以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1.VL401和VL469的合成：
方案1.
向化合物1(16.0g，100mmol)在甲苯(90mL)中的溶液中添加化合物2(4mL，100mmol)，随后以催化量添加H2SO4(0.1mL)，并且回流6h。在6h之后，TLC显示化合物1完成反应，并且将反应混合物用Na2CO3的溶液(100mL)淬灭并将产物萃取至EtOAc(3×200mL)中。分离有机层，并且蒸发以得到粗品。接着将粗物质通过硅胶(60-120目)柱色谱法来纯化，用20％EtOAc/石油醚洗脱，以提供呈白色固体的化合物3(8.0g，27％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 11.97(s,1H),3.98(t,J＝6.4Hz,2H),2.26(t,J＝7.6Hz,2H),2.18(t,J＝7.6Hz,2H),1.70-1.50(m,6H),1.40-1.20(m,16H),0.88(t,J＝6.4Hz,3H)。
向化合物3(6.0g，20mmol)在CH2Cl2(60mL)中的溶液中添加2-(羟基甲基)丙烷-1,3-二醇(2.11g，20mmol)，随后添加EDC.HCl(5.75g，30mmol)、DMAP(488mg，4mmol)和DIPEA(4.83mL，30mmol)。在室温(RT)下将反应混合物搅拌24h。将反应混合物用水稀释，并且将产物用DCM(2×200mL)萃取。分离有机层，并且蒸发以得到粗品。接着将粗物质通过硅胶(60-120目)柱色谱法来纯化，用50％EtOAc/石油醚洗脱，以提供化合物5(3.5g，45％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm4.45(t,J＝5.2Hz,2H),4.10-4.00(m,4H),3.50-3.35(m,4H),2.26(m,t,J＝7.2Hz,4H),1.90-1.75(m,1H),1.60-1.45(m,6H),1.40-1.20(m,16H),0.85(t,J＝6.4Hz,3H)。
在室温下将化合物5(2.0g，5.15mmol)、DMAP(188mg，1.54mmol)和TBDMS-Cl(850mg，5.67mmol)在吡啶(10mL)中的溶液搅拌3h。将反应混合物用水(20mL)稀释，并且将产物用DCM(2×100mL)萃取。分离有机层，并且蒸发以得到粗品。接着将粗物质通过硅胶(60-120目)色谱法来纯化，用30％EtOAc/石油醚洗脱，以获得呈无色油状物的化合物6(1.2g，46％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 4.51(t,J＝5.2Hz,1H),4.10-3.90(m,4H),3.65-3.50(m,2H),3.45-3.30(m,2H),2.35-2.20(m,4H),1.90-1.80(m,1H),1.60-1.45(m,6H),1.30-1.10(m,16H),0.90-0.75(m,12H),0.10(s,6H)。
向化合物7(375mg，3.10mmol)在CH2Cl2(13mL)中的溶液中添加氯甲酸4-硝基苯酯(965mg，5.16mmol)，随后添加吡啶(0.38mL，5.16mmol)和DMAP(87mg，0.77mmol)，并且将反应持续2h。添加6(1.3g，2.58mmol)，并且在45℃下将反应混合物搅拌16h。将反应混合物用水(50mL)稀释，并且将产物用CH2Cl2(2×50mL)萃取；分离有机层，并且蒸发以得到粗物质。将粗物质通过硅胶柱来纯化，用50％EtOAc/石油醚洗脱，以得到呈黄色油状物的8(700mg，43％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 4.20-3.98(m,8H),3.61(d,J＝5.6Hz,2H),2.50-2.35(m,6H),2.35-2.10(m,6H),1.80-1.70(m,2H),1.60-1.45(m,6H),1.60-1.45(m,5H),1.40-1.20(m,16H),1.00-0.89(m,14H),0.10(s,6H)。
在冰温下，向8(700mg，1.06mmol)在THF(4mL)中的搅拌溶液中添加TBAF(0.46mL，1.593mmol)，并且在室温下将反应混合物搅拌4h。将反应混合物用水(10mL)稀释，并且将产物用CH2Cl2(2×50mL)萃取；分离有机层，并且蒸发以得到粗品。将粗物质通过硅胶柱来纯化，用50％EtOAc/石油醚洗脱，产生了呈无色胶状液体的9(300mg，52％)。
化合物VL401。向9(200mg，0.366mmol)在CH2Cl2(2mL)中的搅拌溶液中添加氯甲酸4-硝基苯酯(965mg，5.16mmol)，随后添加吡啶(0.38mL，5.16mmol)和DMAP(87mg，0.77mmol)；将反应混合物继续搅拌2h，并且添加化合物10(159mg，0.402mmol)并在90℃下将反应混合物搅拌16h。将反应混合物用水(50mL)稀释，并且将产物用CH2Cl2(2×50mL)萃取；分离有机层，并且蒸发以得到粗产物。将粗物质通过硅胶柱来纯化，用6％MeOH/CH2Cl2洗脱，以获得呈胶状液体的VL401(80mg，22％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 7.20-7.10(m,1H),4.85-4.75(m,1H),4.30-4.00(m,10H),3.60-3.30(m,5H),3.00-2.90(m,2H),2.40-2.20(m,10H),1.80-0.80(m,75H)。质量[M+H]+计算值：969.7；实测值：969.6。
化合物VL469。使化合物5A与氯甲酸4-硝基苯酯在二氯甲烷中在吡啶和DMAP存在下反应。接着使由此形成的碳酸4-硝基苯酯与化合物7反应以获得化合物VL469。
实施例2.VL403的合成
方案2.
在0℃下，向可商购获得的化合物13(11.5g，50mmol)在THF(50mL)中的溶液中添加BH3.DMS(2M，在THF中，30mL)。在室温下将反应混合物搅拌24h。将反应混合物用MeOH淬灭，并且将有机层减压浓缩以获得化合物14(10g，92.5％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm3.63(t,J＝6.4Hz,2H),2.20(t,J＝6.4Hz,2H),1.70-1.50(m,4H),1.44(s,9H),1.40-1.30(m,7H)。
向化合物14(4.8g，22.2mmol)在CH2Cl2(70mL)中的搅拌溶液中添加化合物15(6.3g，24.4mmol)，随后添加EDC.HCl(5.5g，28.8mmol)，DMAP(1.4g，11.1mmol)，并且将反应混合物搅拌16h。将反应混合物用水(50mL)稀释，并且将产物用CH2Cl2(2×100mL)萃取；分离有机层，并且蒸发以得到粗产物。将粗产物通过硅胶柱来纯化，用10％EtOAc/石油醚洗脱，以获得呈胶状液体的化合物16(5g，50％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 4.08(t,J＝6.8Hz,2H),2.40-2.20(m,3H),1.70-1.60(m,4H),1.46(s,9H),1.40-1.20(m,30H),0.95-0.85(m,6H)。
化合物17。在0℃下，向化合物16(1.9g，4.18mmol)在CH2Cl2(20mL)中的搅拌溶液中添加TFA(2mL，12.5mmol)，并且将反应混合物搅拌16h。将反应混合物减压浓缩以产生呈胶状液体的化合物17(1.8g，99％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 4.06(t,J＝6.8Hz,2H),2.40-2.25(m,3H),1.80-1.50(m,4H),1.50-1.20(m,30H),1.00-0.85(m,6H)。
向化合物17(1.5g，3.76mmol)在CH2Cl2(20mL)中的搅拌溶液中添加化合物5(2.1g，5.65mmol)，随后添加EDC.HCl(1.1g，5.65mmol)、DIPEA(1mL，5.65mmol)和DMAP(138mg，1.13mmol)，并且将反应混合物搅拌7h。将反应混合物用水(50mL)稀释，并且将产物用CH2Cl2(2×25mL)萃取；分离有机层，并且蒸发以得到粗产物。将粗物质通过硅胶柱来纯化，用20％EtOAc/石油醚洗脱，以获得呈黄色油状物的化合物18(0.6g，21％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 4.25-4.10(m,4H),4.10-4.00(m,4H),3.70-3.60(m,2H),2.60-2.50(m,7H),2.40-2.30(m,7H),1.80-1.50(m,10H),1.50-1.20(m,41H),0.95-0.85(m,9H)。
向化合物7(204mg，1.56mmol)在CH2Cl2(6mL)中的溶液中添加氯甲酸4-硝基苯酯(470mg，2.34mmol)，随后添加吡啶(0.1mL，1.17mmol)和DMAP(14mg，0.11mmol)，并且将反应搅拌4h；添加化合物18(300mg，0.39mmol)，并且在45℃下将反应混合物搅拌18h。将反应混合物用水(20mL)稀释，并且将产物用CH2Cl2(2×50mL)萃取；分离有机层，并且蒸发以得到粗产物。将粗物质通过硅胶柱来纯化，用50％EtOAc/石油醚洗脱，以得到呈黄色油状物的VL403(130mg，35％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 4.25-4.10(m,8H),4.10-4.00(m,4H),2.60-2.50(m,7H),2.40-2.25(m,7H),1.85-1.75(m,2H),1.70-1.60(m,10H),1.50-1.20(m,46H),1.10-0.95(m,6H),0.95-0.85(m,9H)。m/z：[M+H]+计算值：926.7；实测值：926.6。
实施例3.VL404的合成
方案3.
向化合物1(9.6g，54.68mmol)在CH2Cl2(100mL)中的搅拌溶液中添加化合物1A(10g，39.06mmol)，随后添加DCC(8.85g，42.96mmol)和DMAP(2.38g，19.52mmol)。在室温下将反应混合物搅拌18小时。在TLC显示化合物1完全消失之后，将反应混合物用水(100mL)稀释，并且将产物萃取至CH2Cl2(2×100mL)中。分离有机层，在真空中蒸发，并且将获得的粗产物通过硅胶柱来纯化，用50％EtOAc/石油醚洗脱，以获得呈胶状固体的化合物19(6g，26％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 4.90-4.80(m,1H),2.35(t,J＝5.2Hz,2H),2.26(t,J＝5.2Hz,2H),1.80-1.20(m,36H),0.95-0.85(m,6H)。
向化合物19(4.99g，9.99mmol)在CH2Cl2(20mL)中的搅拌溶液中添加化合物5(2.0g，6.666mmol)，随后添加EDC.HCl(1.916g，9.99mmol)、DIPEA(3.48mL，19.99mmol)、DMAP(244mg，1.99mmol)，并且将反应混合物搅拌16h。在TLC显示化合物6完全消失之后，将反应混合物用水(50mL)稀释，并且将产物用CH2Cl2(2×50mL)萃取；分离有机层，并且蒸发以得到粗产物。将粗物质通过硅胶柱来纯化，用50％EtOAc/石油醚洗脱，以产生呈胶状液体的化合物20(2.1g，52％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 4.90-4.70(m,2H),4.20-3.95(m,6H),3.42(t,J＝5.6Hz,2H),2.40-2.20(m,8H),2.10-2.00(m,1H),1.60-1.40(m,14H),1.40-1.10(m,44H),0.85(t,J＝6.4Hz,9H)。
化合物VL404。向化合物7(672mg，5.12mmol)在CH2Cl2(20mL)中的溶液中添加氯甲酸4-硝基苯酯(1.53g，7.62mmol)，随后添加吡啶(0.5mL，6.38mmol)和DMAP(50mg，0.384mmol)，并且将反应搅拌5h。在5h之后，添加化合物20(1.0g，1.28mmol)，并且在45℃下将反应混合物搅拌18h。将反应混合物用水(20mL)稀释，并且将产物用CH2Cl2(2×50mL)萃取；分离有机层，并且蒸发以得到粗产物。将粗物质通过硅胶柱来纯化，用50％EtOAc/石油醚洗脱，以获得呈胶状液体的VL404(510mg，42％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 4.90-4.80(m,1H),4.25-4.00(m,10H),2.60-2.50(m,7H),2.40-2.25(m,8H),1.85-1.75(m,2H),1.70-1.60(m,8H)(1.60-1.45(m,4H),1.40-1.15(m,46H),1.00(t,J＝6.8Hz,6H),0.95-0.85(m,9H)。ELSD-MS m/z计算值：939.74；实测值：940.6。
实施例4.VL406和VL422的合成
方案4.
向化合物11B(5g，18.76mmol)在CH2Cl2(50mL)中的溶液中添加氯甲酸4-硝基苯酯(11.37mg，56.29mmol)，随后添加吡啶(4.53mL，56.29mmol)和DMAP(687mg，5.62mmol)，并且将反应搅拌16h。接着将反应混合物过滤，并且将白色固体丢弃。将滤液蒸发，并且用石油醚湿磨以产生呈胶状液体的23(6g，74％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.27(d,J＝7.2Hz,2H),7.37(d,J＝7.2Hz,2H),5.50-5.30(m,4H),4.28(t,J＝6.4Hz,2H),2.77(t,J＝6.4Hz,2H),2.10-2.00(m,4H),1.85-1.70(m,2H),1.50-1.20(m,18H),0.89(t,J＝7.2Hz,3H)。
向19(3.0g，7.28mmol)在CH2Cl2(30mL)中的溶液中添加化合物4(772mg，7.28mmol)，随后添加EDC.HCl(2.0g，10.9mmol)、DMAP(173mg，1.45mmol)和DIPEA(3.8mL，21.8mmol)。在室温下将反应混合物搅拌5h。将反应混合物用水稀释，并且将产物用CH2Cl2(2×50mL)萃取。分离有机层，并且蒸发以得到粗品。将粗物质通过硅胶(60-120目)柱色谱法来纯化，用EtOAc/石油醚洗脱，以获得纯化合物21和22。1H NMR(21,400MHz,DMSO-d6):δppm4.90-4.80(m,1H),4.46(t,J＝5.2Hz,2H),4.00(d,J＝6.4Hz,2H),3.50-3.30(m,4H),2.30-2.20(m,4H),1.90-1.80(m,1H),1.60-1.40(m,8H),1.40-1.20(m,29H),0.85(t,J＝6.4Hz,6H)。22的1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 4.90-4.80(m,2H),4.20-4.10(m,4H),3.70-3.60(m,2H),2.50-2.20(m,10H),1.80-1.20(m,70H),1.10-1.00(m,2H),1.00-0.90(m,12H)。
化合物21A。向化合物21(1.0g，1.99mmol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液中添加化合物23(517.4mg，1.19mmol)，随后添加TEA(2.8mL，19.98mmol)和DMAP(244mg，1.98mmol)，并且在室温下将反应混合物搅拌18h。在完成之后，将反应混合物用水(20mL)稀释，并且将产物用CH2Cl2(2×50mL)萃取，用盐水(20mL)洗涤并经Na2SO4干燥。将粗产物在二氧化硅柱上纯化，用50％EtOAc/石油醚洗脱，以获得呈胶状液体的21A(220mg，14％)。
向化合物7(99.15mg，0.756mmol)在CH2Cl2(3mL)中的溶液中添加氯甲酸4-硝基苯酯(229mg，1.13mmol)，随后添加吡啶(0.1mL，1.13mmol)和DMAP(7mg，0.05mmol)，并且将反应搅拌4h。添加21A(150mg，0.18mmol)，并且在45℃下将反应混合物搅拌18h。将反应混合物用水(10mL)稀释；将产物用CH2Cl2(2×50mL)萃取；分离有机层，并且蒸发以得到粗物质。将粗物质通过硅胶柱来纯化，用50％EtOAc/石油醚洗脱，以得到呈胶状液体的VL406(122mg，68％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 5.45-5.30(m,4H),4.90-4.80(m,1H),4.25-4.10(m,10H),2.77(t,J＝6.4Hz,2H),2.60-2.40(m,6H),2.35-2.25(m,4H),2.10-2.00(m,4H),1.90-1.80(m,2H),1.70-1.40(m,8H),1.40-1.20(m,47H),1.01(t,J＝7.2Hz,6H),0.95-0.80(m,9H)。m/z：[M+H]+计算值：950.7；实测值：950.6。
向化合物7(1.7g，13.2mmol)在CH2Cl2(20mL)中的溶液中添加氯甲酸4-硝基苯酯(898mg，4.46mmol)，随后添加吡啶(0.4mL，2.23mmol)和DMAP(54mg，0.44mmol)；将反应搅拌30min。添加22(2.0g，2.2mmol)；并且在室温下将反应混合物搅拌16h。将反应混合物用水(10mL)稀释，并且用CH2Cl2(2×50mL)萃取，接着分离有机层，并且蒸发以获得粗物质。将粗物质通过硅胶柱来纯化，用50％EtOAc/石油醚洗脱，以得到呈胶状液体的VL422(770mg，33％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 4.90-4.80(m,2H),4.20-4.10(m,8H),2.60-2.50(m,5H),2.50-2.40(m,1H),2.35-2.25(m,8H),1.90-1.75(m,2H),1.70-1.55(m,8H),1.55-1.45(m,8H),1.40-1.20(m,58H),1.01(t,J＝7.2Hz,6H),0.87(t,J＝7.2Hz,12H)。质量：[M+H]+计算值：1052.8；实测值：1052.6。
实施例5.VL447、VL448、VL449和VL451的合成
方案5.
向化合物7A(195.2mg，1.512mmol)在CH2Cl2(6mL)中的溶液中添加氯甲酸4-硝基苯酯(458mg，2.268mmol)，随后添加吡啶(0.18mL，2.268mmol)和DMAP(14mg，0.1134mmol)，并且将反应搅拌4h。添加化合物21A(300mg，0.378mmol)，随后添加TEA(0.51mg，3.78mmol)和DMAP(13.91mg，0.1134mmol)；在45℃下将反应混合物搅拌18h。将反应混合物用水(10mL)稀释，并且将产物用CH2Cl2(2×50mL)萃取；分离有机层，并且蒸发以获得粗物质。将粗物质通过硅胶柱来纯化，用50％EtOAc/石油醚洗脱，以获得呈胶状液体的VL447(41mg，11％)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δppm 5.45-5.30(m,4H),4.90-4.80(m,1H),4.30-4.10(m,10H),2.77(t,J＝6.4Hz,2H),2.60-2.40(m,7H),2.40-2.25(m,4H),2.10-2.00(m,4H),1.95-1.85(m,2H),1.80-1.70(m,4H),1.70-1.40(m,8H),1.40-1.20(m,46H),0.95-0.85(m,9H)。m/z：[M+H]+计算值：948.74；实测值：948.78。
使用与VL447相同的程序提供呈胶状液体的化合物VL448(102mg，56％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 5.40-5.30(m,4H),4.85-4.75(m,1H),4.20-4.00(m,10H),2.80-2.70(m,2H),2.40-2.20(m,11H),2.10-1.95(m,4H),1.80-1.70(m,2H),1.65-1.40(m,14H),1.40-1.10(m,46H),0.90-0.80(m,9H)。m/z：[M+H]+计算值：962.76；实测值：962.9。
使用与VL447相同的程序提供呈胶状液体的化合物VL449(110mg，60％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 5.40-5.30(m,4H),4.85-4.75(m,1H),4.20-4.00(m,10H),3.60-3.50(m,4H),2.80-2.70(m,2H),2.40-2.20(m,11H),2.10-1.95(m,4H),1.80-1.70(m,2H),1.65-1.40(m,10H),1.40-1.10(m,44H),0.90-0.80(m,9H)。m/z：[M+H]+计算值：964.74；实测值：962.9。
使用与VL447相同的程序提供呈胶状液体的化合物VL451(118mg，39％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 5.40-5.30(m,4H),4.85-4.75(m,1H),4.20-4.00(m,10H),2.80-2.70(m,2H),2.40-2.20(m,11H),2.10-1.95(m,4H),1.80-1.70(m,2H),1.65-1.40(m,14H),1.40-1.10(m,46H),0.90-0.80(m,9H)。m/z：[M+H]+计算值：952.74；实测值：952.6。
实施例6.VL410、VL411、VL421和VL435的合成
VL410的合成。向4E(3g，6.97mmol)在DCM(30mL)中的溶液中添加氯甲酸4-硝基苯酯(4.17g，20.91mmol)、吡啶(1.68mL，20.91mmol)和DMAP(255mg，2.09mmol)，并且将反应搅拌16h。将反应混合物完全蒸发以得到呈胶状液体的24(3.8g，92％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 8.33(d,J＝7.2Hz,2H),7.50(d,J＝7.2Hz,2H),2.75-2.65(m,2H),2.18(s,3H),2.14(s,6H),1.90-1.80(m,2H),1.50-1.00(m,21H),1.00-0.80(m,15H)。
向5(500mg，1.28mmol)在CH2Cl2(10mL)中的搅拌溶液中添加24(536mg，0.90mmol)，随后添加吡啶(0.13mL，1.67mmol)和DMAP(48mg，0.3860mmol)，并且在室温下将反应搅拌16h。将反应混合物用水(20mL)稀释，并且用DCM(2×50mL)萃取，用盐水溶液(20mL)洗涤并用Na2SO4干燥。将粗品在二氧化硅柱上纯化，用25％EtOAc/石油醚洗脱，以得到呈胶状液体的25(320mg，97％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 4.79(d,J＝5.2Hz,1H),4.40-4.20(m,2H),4.20-3.90(m,4H),3.55-3.45(m,2H),2.60-2.50(m,2H),2.40-2.20(m,5H),2.10-1.90(m,8H),1.90-1.70(m,2H),1.70-1.00(m,45H),1.00-0.89(t,J＝7.2Hz,12H)。
向在CH2Cl2(3mL)中的7(248mg，1.89mmol)中添加氯甲酸4-硝基苯酯(814mg，2.83mmol)，随后添加吡啶(0.2mL，2.83mmol)和DMAP(17mg，0.05mmol)，并且将反应搅拌4h。添加25(400mg，0.4732mmol)，并且在45℃下将反应混合物搅拌18h。将反应混合物用水(10mL)稀释，并且用CH2Cl2(2×50mL)萃取，接着分离有机层，并且蒸发以得到粗品。将粗物质通过硅胶柱来纯化，用50％EtOAc/石油醚洗脱，以产生呈胶状液体的VL-410(122mg，26％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 4.33(d,J＝6.0Hz,2H),4.26(d,J＝6.0Hz,2H),4.25-4.15(m,4H),4.05(t,J＝5.6Hz,2H),2.65-2.45(m,8H),2.40-2.25(m,4H),2.08(s,3H),2.05(s,3H),2.02(s,3H),1.80-1.40(m,10H),1.50-1.20(m,32H),1.20-1.00(m,12H),0.90-0.80(m,18H)。HRMS m/z：[M+H]+计算值：1002.75；实测值：1002.83。
方案6
VL411的合成。向化合物4E(1.3g，3.02mmol)在CH2Cl2(15mL)中的溶液中添加氯甲酸4-硝基苯酯(1.21g，6.04mmol)，随后添加吡啶(0.5mL，6.04mmol)和DMAP(110mg，0.9mmol)，并且将反应持续搅拌1h。在1h之后，添加化合物7(2.37g，18.1mmol)，并且在室温下将反应混合物搅拌17h。将反应混合物用水(50mL)稀释；将产物用CH2Cl2(2×50mL)萃取，并且分离有机层并蒸发以得到粗物质。将粗物质通过硅胶柱来纯化，用50％EtOAc和石油醚洗脱，以获得呈胶状液体的VL411(420mg，24％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 4.30(t,J＝6.4Hz,2H),2.70-2.50(m,8H),2.08(s,3H),2.07(s,3H),2.03(s,3H),1.95-1.70(m,4H),1.62-0.95(m,30H),0.90-0.80(m,12H)。
VL421的合成。向化合物21(1.0g，1.83mmol)在CH2Cl2(10mL)中的搅拌溶液中添加化合物24(1.09g，1.83mmol)，随后添加吡啶(0.37mL，3.54mmol)和DMAP(67mg，0.55mmol)，并且在室温下将反应搅拌1h。将反应混合物用水(20mL)稀释，并且用DCM(2×50mL)萃取，用盐水溶液(20mL)洗涤并用Na2SO4干燥。将粗品在二氧化硅柱上纯化，用30％EtOAc/石油醚洗脱，以得到呈胶状液体的25(480mg，30％)。
向化合物7(219mg，0.1.6u7 mmol)在CH2Cl2(4mL)中的溶液中添加氯甲酸4-硝基苯酯(506mg，2.50mmol)，随后添加吡啶(0.26mL，2.50mmol)和DMAP(16mg，0.12mmol)，并且将反应搅拌4h。在4h之后，添加化合物25(400mg，0.41mmol)，并且在45℃下将反应混合物搅拌16h。将反应混合物用水(10mL)稀释；将产物用CH2Cl2(2×50mL)萃取，接着分离有机层，并且蒸发以得到粗物质。将粗物质通过硅胶柱来纯化，用55％EtOAc/石油醚洗脱，以产生呈胶状液体的VL-421(110mg，24％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 4.40-4.20(m,8H),2.65-2.40(m,9H),2.40-2.25(m,4H),2.08(s,3H),2.06(s,3H),2.02(s,3H),1.40-1.20(m,4H),1.70-1.50(m,10H),1.50-1.00(m,56H),0.90-0.80(m,18H)。质量m/z：[M+H]+计算值：1114.88；实测值：1114.93。
VL435的合成。向化合物9(220mg，0.403mmol)在CH2Cl2(2mL)中的溶液中添加化合物4F(214mg，0.403mmol)，随后添加EDC.HCl(115mg，0.604mmol)、DMAP(14mg，0.12mmol)和DIPEA(0.2mL，1.21mmol)。在室温下将反应混合物搅拌16h。在TLC显示化合物9完全消失之后，将反应混合物用水稀释，并且将产物萃取至CH2Cl2(2×20mL)中。分离有机层，并且蒸发以得到粗物质。将粗物质通过硅胶(60-120目)柱色谱法来纯化，用50％EtOAc/石油醚洗脱，随后进行制备型HPLC纯化，提供了呈甲酸盐形式的VL435。将获得的产物用10％NaHCO3溶液洗涤，接着冻干以产生纯VL435(60mg，14％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 4.20-4.12(m,8H),4.00-3.90(m,2H),2.95-2.85(m,2H),2.70-2.60(m,2H),2.45-2.20(m,8H),2.00(s,3H),1.90(s,3H),1.88(s,3H),1.80-1.60(m,5H),1.60-1.00(m,50H),1.00-0.80(m,21H)。质量m/z：[M+H]+计算值：1058.78；实测值：1058.6。
实施例7.PEG-脂质合成
方案7A.
通过PEG-胺与丙烯酸叔丁酯的迈克尔加成(Michael addition)，从所需mPEG-胺101制备化合物102。通过柱色谱法分离单加成物102和二加成物103。酸处理102会提供酸105。用乙酸酐使102乙酰化继之以酸处理会提供羧酸104。用酸处理103会提供二羧酸106。
方案7B.
通过mPEG-OH与丙烯酸叔丁酯的迈克尔加成，从所需mPEG-OH107制备化合物108。用酸处理化合物108会提供羧酸109。
方案7C.
在DIEAN和DAMP存在下使用肽偶联剂HBTU使羧酸109活化继之以添加醇110会提供PEG-脂质VP101。类似地，将醇111-118添加至活化的羧酸中会提供PEG-脂质VP101-VP110。
方案7D.
在DIEAN和DAMP存在下使用肽偶联剂HBTU使羧酸104活化继之以添加醇110会提供PEG-脂质VP111。类似地，将醇111-118添加至活化的羧酸中会提供PEG-脂质VP112-VP119。
方案7E.
醇110与丙烯酸叔丁酯的迈克尔加成会提供酯119。用酸处理酯119会提供123。用肽偶联剂活化羧酸123继之以添加mPEG2000会提供外消旋化合物VP120。类似地，以手性纯110起始会提供对映体VP121和VP122。从相应外消旋或手性纯醇111-113起始，类似地制备PEG-脂质VP123-VP131。
用肽偶联剂活化羧酸123继之以添加mPEG2000-NH2会提供外消旋化合物VP132。类似地，以手性纯110起始会提供对映体VP133和VP134。从相应外消旋或手性纯醇111-113起始，类似地制备PEG-脂质VP135-VP143。
方案7F.
醇114与丙烯酸叔丁酯的迈克尔加成会提供酯127。用酸处理酯127会提供羧酸132。用肽偶联剂活化羧酸132继之以添加mPEG2000会提供VP144。从相应醇115-118起始，类似地制备PEG-脂质VP145-VP148。
用肽偶联剂活化羧酸132继之以添加mPEG2000-NH2会提供VP149。从相应外消旋或手性纯醇115-118起始，类似地制备PEG-脂质VP150-VP153。
方案7G.
在0℃下，向酸137(1g，3.52mmol)在THF(10mL)中的搅拌溶液中添加N-羟基丁二酰亚胺(567mg，4.92mmol)，随后添加DCC(870mg，4.22mmol)，并且在室温下将反应混合物搅拌过夜。在完成之后，将固体过滤，并且将滤液减压蒸发以得到粗物质。将这个粗物质在异丙醇中重结晶，将固体过滤并干燥以获得呈灰白色固体的化合物140(1g，74％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ2.83(s,4H),2.61(t,J＝7.2Hz,2H),1.76-1.72(m,2H),1.40-1.38(m,2H),1.29-1.25(m,26H),0.89(t,J＝6.4Hz,3H)。
在0℃下，向化合物140(113mg，0.296mmol)在CH2Cl2(5mL)中的溶液中添加mPEG2000-NH2(500mg，0.24mmol)，随后添加DIPEA(0.1mL，0.73mmol)，并且在室温下将反应混合物搅拌过夜。在用二氯甲烷(10mL)稀释之后，将反应混合物与冰冷的水一起搅拌15min。分离有机层，用冰冷的水洗涤，经无水Na2SO4干燥，并且减压浓缩以得到粗产物。硅胶柱色谱纯化(10％MeOH/DCM作为洗脱剂)提供了呈灰白色固体的化合物VP154(160mg)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.70(t,1H),3.68-3.31(m,195H),3.23(s,3H),3.06(t,J＝6.0Hz,2H),2.03(t,J＝7.6Hz,2H),1.61-1.44(m,4H),1.27-1.23(m,28H),0.87(t,J＝6.8Hz,3H)。HRMS m/z：[M+H]+计算值：2293.3；实测值：2294.26。
在0℃下，向化合物138(1g，3.90mmol)在THF(10mL)中的搅拌溶液中添加N-羟基丁二酰亚胺(628mg，5.4mmol)，随后添加DCC(964mg，4.68mmol)，并且在室温下将反应混合物搅拌过夜。将反应混合物过滤，并且将滤液减压蒸发以得到粗物质。将这个粗物质在异丙醇中重结晶，将固体过滤并干燥以得到呈白色固体的141(1g，72％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ2.83(s,4H),2.61(t,J＝7.6Hz,2H),1.76-1.70(m,2H),1.42-1.25(m,24H),0.89(t,J＝6.8Hz,3H)。
在0℃下，向化合物141(113mg，0.29mmol)在CH2Cl2(5mL)中的溶液中添加mPEG2000-NH2(500mg，0.24mmol)，随后添加DIPEA(0.1mL，0.73mmol)，并且在室温下将反应混合物搅拌过夜。通过TLC监测反应的进展。在反应完成之后，将混合物用CH2Cl2(10mL)稀释，并且与冰冷的水一起搅拌15min。分离有机层，用冰冷的水洗涤，经无水Na2SO4干燥，并且减压浓缩以得到粗产物。使用10％MeOH/CH2Cl2作为洗脱剂的硅胶柱色谱纯化提供了呈灰白色固体的VP155(0.44g，78.5％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.70(t,1H),3.50-3.36(m,185H),3.23(s,3H),3.06(t,J＝6.8Hz,1H),2.03-1.99(m,2H),1.61-1.46(m,4H),1.27-1.23(m,24H),0.87(t,J＝6.8Hz,3H)。HRMS m/z：[M+H]+计算值：2266.8；实测值：2266.89。
在0℃下，向化合物139(1.6g，7.0mmol)在THF(16mL)中的搅拌溶液中添加N-羟基丁二酰亚胺(1.12g，9.80mmol)，随后添加DCC(1.7g，8.40mmol)，并且在室温下将反应混合物搅拌过夜。将反应混合物过滤，并且将滤液减压蒸发以得到粗物质。将粗品溶于异丙醇(10mL)中，并且在80℃下加热45min，接着冷却至0℃，并且将沉淀的固体过滤并干燥以得到呈白色固体的化合物142(1.6g，74％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ2.83(s,4H),2.61(t,J＝7.2Hz,2H),1.76-1.72(m,2H),1.40-1.25(m,20H),0.89(t,J＝6.4Hz,3H)。
在0℃下，向化合物142(96mg，0.296mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液中添加mPEG2000-NH2(500mg，0.24mmol)，随后添加DIPEA(0.1mL，0.73mmol)，并且在室温下将反应混合物搅拌过夜。将反应混合物用二氯甲烷(10mL)稀释，并且与冰冷的水一起搅拌15min。分离有机层，用冰冷的水洗涤，经无水Na2SO4干燥，并且减压浓缩以得到粗产物。使用10％MeOH/DCM作为洗脱剂的硅胶柱色谱纯化提供了呈灰白色固体的化合物VP156(0.18g，21％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.70(t,1H),3.68-3.34(m,189H),3.23(s,3H),3.06(q,2H),2.03(t,J＝7.2Hz,2H),1.61-1.59(m,2H),1.47-1.46(m,2H),1.46-1.23(m,20H),0.87(t,J＝6.4Hz,3H)。HRMS m/z：[M+H]+计算值：2238.9；实测值：2238.89。
在0℃下，向化合物143(1.0g，3.89mmol)在CH2Cl2(10mL)中的搅拌溶液中添加碳酸N,N′-二丁二酰亚胺酯(1.5g，5.84mmol)，随后添加三乙胺(1.6mL，11.69mmol)，并且在室温下将反应混合物搅拌过夜。在室温下，向以上反应混合物中另外依次添加碳酸N,N′-二丁二酰亚胺酯(1.5g，5.84mmol)和三乙胺(1.6mL，11.69mmol)，并且加热至40℃，持续3天。将反应混合物用冰冷的水(20mL)稀释，并且分离有机层。将有机层用盐水(10mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩。将粗产物通过快速柱色谱法(100-200目硅胶；用20％乙醚/石油醚洗脱)来纯化以提供呈淡黄色胶状物的化合物144(0.75g，1.88mmol，48％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.82-4.78(m,1H),2.82(s,4H),1.71-1.57(m,4H),1.43-1.22(m,24H),0.91-0.87(m,6H)。
在0℃下，向化合物mPEG200-NH2(950mg，0.46mmol)在10mL CH2Cl2中的搅拌溶液中添加吡啶(0.1mL，1.40mmol)，随后添加化合物144(279mg，0.70mmol)，并且在室温下搅拌16h。将反应混合物在减压下完全浓缩。将残余物用CH2Cl2(10mL)稀释，并且与冰冷的水一起搅拌20min。分离有机层，用冰冷的水(10mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并且减压浓缩以得到粗品。将这个粗品通过硅胶柱来纯化，使用10％MeOH/CH2Cl2作为洗脱剂，以产生呈灰白色固体的VP157(0.76g，76％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ6.92(br t,J＝5.6Hz,1H),4.61-4.57(m,1H),3.69-3.67(m,1H),3.59-3.49(m,188H),3.48-3.41(m,3H),3.38-3.333(m,2H),3.24(s,3H),3.02-2.97(m,2H),1.62-1.58(m,2H),1.48-1.39(m,4H),1.31-1.30(m,24H),0.86-0.83(m,6H)。HRMS m/z：[M+H]+计算值：2222.1；实测值：2222.4。
实施例8.用于LNP评估的指导RNA(gRNA)和mRNA
使用可控孔度玻璃载体和可商购获得的亚磷酰胺单体和寡核苷酸合成试剂，在固相寡核苷酸合成和脱保护条件下合成表3中所示的指导RNA(gRNA)(Methods in MolecularBiology,1993,20,81-114；ACS Chem.Biol.2015,10,1181-1187，其通过引用以它的整体并入本文)。通过HPLC纯化脱保护的指导RNA，并且通过质谱测定分析确认每种指导RNA的完整性。每种指导RNA的观察质量与计算质量一致。
表3.用于实施例9-23中所述的研究中的单指导RNA(gRNA)
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*gRNA被设计来靶向小鼠、大鼠、猴和人PCSK9和ANGPTL3基因。#指导RNA序列中的大写和小写字母分别指示携带2’-核糖(2’-OH)和2’-O-甲基(2’-OMe)核糖部分的核苷酸，并且字母‘s’指示硫代磷酸酯(PS)键联。
如本文所用的术语“原间隔区”或“靶标序列”以及它们的语法等效形式可指靶标基因的DNA序列。在天然状态下，原间隔区邻近于PAM(原间隔区邻近基序)。术语“间隔区”可为原间隔区的结合至原间隔区的互补链的RNA形式。间隔区可在指导RNA(gRNA)内。RNA引导的核酸酶的裂解位点在原间隔区序列内。对于图解，请参见图1A。
编码SpCas9、CBE和ABE蛋白的mRNA
通过本领域中熟知的不同方法产生SpCas9、CBE和ABE的mRNA。本文所用的此类方法中的一者是使用T7聚合酶或额外RNA聚合酶变体进行的体外转录(IVT)。通常，mRNA的IVT使用包含T7聚合酶启动子、mRNA编码序列(CDS)、3’和5’非翻译区(UTR)、多腺苷酸尾部和额外复制和转录调节元件的线性化DNA模板。在IVT之前，DNA模板呈质粒、PCR产物或额外双链DNA构建体形式。典型IVT反应包括T7聚合酶、DNA模板、RNA酶抑制剂、帽类似物、无机焦磷酸酶和天然存在的核糖核苷酸(rNTP)诸如GTP、ATP、CTP、UTP，或用经修饰rNTP诸如假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞苷、5-甲氧基尿苷、N6-甲基腺苷和N4-乙酰胞苷取代天然rNTP。帽类似物是二核苷酸或三核苷酸帽结构，其中第一起始核苷酸含有标准2’-羟基、2’-O-甲基或额外2’化学修饰。还在IVT反应之后使用痘苗加帽酶添加帽类似物。在IVT之后，在一些情况下，将DNA酶添加至转录混合物中以移除DNA模板；或者，通过离子交换柱色谱法移除残余DNA。用离子交换色谱法、亲和色谱法、沉淀法、离子配对反相色谱法、酶促反应、尺寸排阻色谱法和/或切向流过滤进行mRNA的纯化和浓缩。使用类似IVT和纯化过程来产生编码SpCas9、CBE和ABE的mRNA；在所有情况下，DNA模板、反应条件和纯化参数都针对特定目标基因加以优化。在一些实施例中，加帽和多腺苷酸化SpCas9 mRNA MS002从商购来源(例如TriLink)获得。在Verve的实验室中制备SpCas9 mRNA MS002和腺苷碱基编辑器(ABE)mRNAMA002和MA004。
腺苷核碱基编辑器mRNA MA002包含含有由以下提供的多核苷酸序列编码的多肽的融合蛋白。
ATGAGCGAGGTCGAGTTCTCTCACGAATATTGGATGAGACACGCTCTCACCCTGGCTAAGAGAGCCAGGGACGAAAGAGAGGTGCCAGTTGGCGCTGTCCTGGTGTTGAACAATCGCGTCATCGGAGAAGGATGGAATCGCGCCATTGGCCTGCACGATCCAACCGCACATGCCGAAATTATGGCTCTGCGGCAAGGCGGCCTCGTGATGCAAAATTACAGACTGATCGATGCTACCCTCTACGTCACCTTCGAGCCCTGTGTCATGTGTGCTGGGGCAATGATTCACTCCCGGATTGGCCGCGTGGTGTTTGGAGTGCGGAATGCCAAGACTGGCGCCGCTGGATCTCTGATGGACGTCCTGCACcatCCTGGGATGAACCACCGGGTCGAGATCACAGAGGGAATTCTGGCTGACGAGTGCGCTGCCCTGCTGTGCaggTTCTTTAGAATGCCtAGAaggGTGTTCAACGCCCAGAAAAAAGCTCAGAGCAGCACCGATTCCGGCGGAAGCAGCGGAGGATCTTCTGGAAGCGAAACCCCAGGCACCAGCGAGTCTGCCACACCAGAATCATCTGGCGGTAGCTCCGGCGGCAGCGACAAGAAGTATTCTATCGGACTGGCCATCGGCACCAACTCTGTTGGATGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACAGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCACTGCTGTTCGACTCTGGCGAAACAGCCGAGGCCACCAGACTGAAGAGAACAGCCCGCAGACGGTACACCAGAAGAAAGAACCGGATCTGCTACCTCCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGACAAGAAGCACGAGAGACACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGAGACTGATCTATCTGGCCCTGGCTCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAATCCTGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGAGTGGATGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCTGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACACCTAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGATCAGTACGCCGACTTGTTTCTGGCCGCCAAGAATCTGAGCGACGCCATCCTGCTGTCCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCACCTCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGATCTGACCCTGCTGAAGGCCCTCGTTAGACAGCAGCTGCCAGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGATGGCGGAGCCAGCCAAGAGGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTCGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACCTTCGACAACGGCAGCATCCCTCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCCATTCTGCGGAGACAAGAGGACTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAAATCCTGACCTTCAGGATCCCCTACTACGTGGGACCACTGGCCAGAGGCAATAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACTCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCTCAGTCCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCTAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTTCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGATCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACAGCGTCGAGATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAATGCCAGCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAGAACGAGGACATCCTTGAGGACATCGTGCTGACACTGACCCTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACATACGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAACTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGACTGTCTCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGATAAGCAGTCCGGCAAGACCATCCTGGACTTTCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATTCACGACGACAGCCTCACCTTCAAAGAGGATATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATTCTCTGCATGAGCACATTGCCAACCTGGCCGGCTCTCCCGCCATTAAGAAAGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTTGTGAAAGTGATGGGCAGACACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGACGGGATATGTACGTGGACCAAGAGCTGGACATCAACAGACTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCCCAGTCTTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTCCTGACCAGATCCGACAAGAATCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTGGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGACAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGCGGAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAAAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATTCTGGACTCTCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAACGACAAACTGATCCGCGAAGTGAAAGTCATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTCTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCATCACGCCCACGACGCCTACCTGAATGCCGTTGTTGGAACAGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAAGAGATTGGCAAGGCAACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACAGAGATCACCCTCGCCAACGGCGAGATCAGAAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGCGAGATTGTGTGGGATAAGGGCAGAGACTTTGCCACAGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAGAAAACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCTAAGCGGAACTCCGACAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGATTCTCCTACCGTGGCCTATAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTCAAGAGCGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCGATCGATTTCCTCGAGGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTCCCCAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCTGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCTAGCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAATGAGCAAAAGCAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTTAGCAAGAGAGTGATTCTGGCCGACGCCAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCTATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAACCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCTCCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACTCTGATCCACCAGTCTATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAACTCGGAGGCGACGAAGGCGCCGATAAGAGAACCGCCGATGGCTCTGAGTTCGAGAGCCCCAAGAAAAAGCGCAAAGTGATGAGCGAGGTCGAGTTCTCTCACGAATATTGGATGAGACACGCTCTCACCCTGGCTAAGAGAGCCAGGGACGAAAGAGAGGTGCCAGTTGGCGCTGTCCTGGTGTTGAACAATCGCGTCATCGGAGAAGGATGGAATCGCGCCATTGGCCTGCACGATCCAACCGCACATGCCGAAATTATGGCTCTGCGGCAAGGCGGCCTCGTGATGCAAAATTACAGACTGATCGATGCTAC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腺苷核碱基编辑器mRNA MA004包含含有由以下提供的多核苷酸序列编码的多肽的融合蛋白，其中u’是N1-甲基假尿苷。
AGGAAAu’AAGAGAGAAAAGAAGAGu’AAGAAGAAAu’Au’AAGAGCCACCAu’GAGCGAGGu’GGAGu’u’CAGCCACGAGu’ACu’GGAu’GCGGCACGCCCu’GACCCu’GGCCAAGCGGGCCCGGGACGAGCGGGAGGu’GCCCGu’GGGCGCCGu’GCu’GGu’GCu’GAACAACCGGGu’GAu’CGGCGAGGGCu’GGAACCGGGCCAu’CGGCCu’GCACGACCCCACCGCCCACGCCGAGAu’CAu’GGCCCu’GCGGCAGGGCGGCCu’GGu’GAu’GCAGAACu’ACCGGCu’GAu’CGACGCCACCCu’Gu’ACGu’GACCu’u’CGAGCCCu’GCGu’GAu’Gu’GCGCCGGCGCCAu’GAu’CCACAGCCGGAu’CGGCCGGGu’GGu’Gu’u’CGGCGu’GCGGAACGCCAAGACCGGCGCCGCCGGCAGCCu’GAu’GGACGu’GCu’GCACCACCCCGGCAu’GAACCACCGGGu’GGAGAu’CACCGAGGGCAu’CCu’GGCCGACGAGu’GCGCCGCCCu’GCu’Gu’GCCGGu’u’Cu’u’CCGGAu’GCCCCGGCGGGu’Gu’u’CAACGCCCAGAAGAAGGCCCAGAGCAGCACCGACAGCGGCGGCAGCAGCGGCGGCAGCAGCGGCAGCGAGACACCCGGCACCAGCGAGAGCGCCACCCCCGAGAGCAGCGGCGGCAGCAGCGGCGGCAGCGACAAGAAGu’ACAGCAu’CGGCCu’GGCCAu’CGGCACCAACAGCGu’GGGCu’GGGCCGu’GAu’CACCGACGAGu’ACAAGGu’GCCCAGCAAGAAGu’u’CAAGGu’GCu’GGGCAACACCGACCGGCACAGCAu’CAAGAAGAACCu’GAu’CGGCGCCCu’GCu’Gu’u’CGACAGCGGCGAGACAGCCGAGGCCACCCGGCu’GAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGu’ACACCCGGCGGAAGAACCGGAu’Cu’GCu’ACCu’GCAGGAGAu’Cu’u’CAGCAACGAGAu’GGCCAAGGu’GGACGACAGCu’u’Cu’u’CCACCGGCu’GGAGGAGAGCu’u’CCu’GGu’GGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCAu’Cu’u’CGGCAACAu’CGu’GGACGAGGu’GGCCu’ACCACGAGAAGu’ACCCCACCAu’Cu’ACCACCu’GCGGAAGAAGCu’GGu’GGACAGCACCGACAAGGCCGACCu’GCGGCu’GAu’Cu’ACCu’GGCCCu’GGCCCACAu’GAu’CAAGu’u’CCGGGGCCACu’u’CCu’GAu’CGAGGGCGACCu’GAACCCCGACAACAGCGACGu’GGACAAGCu’Gu’u’CAu’CCAGCu’GGu’GCAGACCu’ACAACCAGCu’Gu’u’CGAGGAGAACCCCAu’CAACGCCAGCGGCGu’GGACGCCAAGGCCAu’CCu’GAGCGCCCGGCu’GAGCAAGAGCCGGCGGCu’GGAGAACCu’GAu’CGCCCAGCu’GCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCu’Gu’u’CGGCAACCu’GAu’CGCCCu’GAGCCu’GGGCCu’GACCCCCAACu’u’CAAGAGCAACu’u’CGACCu’GGCCGAGGACGCCAAGCu’GCAGCu’GAGCAAGGACACCu’ACGACGACGACCu’GGACAACCu’GCu’GGCCCAGAu’CGGCGACCAGu’ACGCCGACCu’Gu’u’CCu’GGCCGCCAAGAACCu’GAGCGACGCCAu’CCu’GCu’GAGCGACAu’CCu’GCGGGu’GAACACCGAGAu’CACCAAGGCCCCCCu’GAGCGCCAGCAu’GAu’CAAGCGGu’ACGACGAGCACCACCAGGACCu’GACCCu’GCu’GAAGGCCCu’GGu’GCGGCAGCAGCu’GCCCGAGAAGu’ACAAGGAGAu’Cu’u’Cu’u’CGACCAGAGCAAGAACGGCu’ACGCCGGCu’ACAu’CGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGu’u’Cu’ACAAGu’u’CAu’CAAGCCCAu’CCu’GGAGAAGAu’GGACGGCACCGAGGAGCu’GCu’GGu’GAAGCu’GAACCGGGAGGACCu’GCu’GCGGAAGCAGCGGACCu’u’CGACAACGGCAGCAu’CCCCCACCAGAu’CCACCu’GGGCGAGCu’GCACGCCAu’CCu’GCGGCGGCAGGAGGACu’u’Cu’ACCCCu’u’CCu’GAAGGACAACCGGGAGAAGAu’CGAGAAGAu’CCu’GACCu’u’CCGGAu’CCCCu’ACu’ACGu’GGGCCCCCu’GGCCCGGGGCAACAGCCGGu’u’CGCCu’GGAu’GACCCGCAAGAGCGAGGAGACAAu’CACCCCCu’GGAACu’u’CGAGGAGGu’GGu’GGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCu’u’CAu’CGAGCGGAu’GACCAACu’u’CGACAAGAACCu’GCCCAACGAGAAGGu’GCu’GCCCAAGCACAGCCu’GCu’Gu’ACGAGu’ACu’u’CACCGu’Gu’ACAACGAGCu’GACCAAGGu’GAAGu’ACGu’GACCGAGGGCAu’GCGGAAGCCCGCCu’u’CCu’GAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCAu’CGu’GGACCu’GCu’Gu’u’CAAGACCAACCGGAAGGu’GACCGu’GAAGCAGCu’GAAGGAGGACu’ACu’u’CAAGAAGAu’CGAGu’GCu’u’CGACAGCGu’GGAGAu’CAGCGGCGu’GGAGGACCGGu’u’CAACGCCAGCCu’GGGCACCu’ACCACGACCu’GCu’GAAGAu’CAu’CAAGGACAAGGACu’u’CCu’GGACAACGAGGAGAACGAGGACAu’CCu’GGAGGACAu’CGu’GCu’GACCCu’GACCCu’Gu’u’CGAGGACCGGGAGAu’GAu’CGAGGAGCGGCu’GAAGACCu’ACGCCCACCu’Gu’u’CGACGACAAGGu’GAu’GAAGCAGCu’GAAGCGGCGGCGGu’ACACCGGCu’GGGGCCGGCu’GAGCCGGAAGCu’GAu’CAACGGCAu’CCGGGACAAGCAGAGCGGCAAGACCAu’CCu’GGACu’u’CCu’CAAGAGCGACGGCu’u’CGCCAACCGGAACu’u’CAu’GCAGCu’GAu’CCACGACGACAGCCu’GACCu’u’CAAGGAGGACAu’CCAGAAGGCCCAGGu’GAGCGGCCAGGGCGACAGCCu’GCACGAGCACAu’CGCCAACCu’GGCCGGCAGCCCCGCCAu’CAAGAAGGGCAu’CCu’GCAGACCGu’GAAGGu’GGu’GGACGAGCu’GGu’GAAGGu’GAu’GGGCCGGCACAAGCCCGAGAACAu’CGu’GAu’CGAGAu’GGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCCGGGAGCGGAu’GAAGCGGAu’CGAGGAGGGCAu’CAAGGAGCu’GGGCAGCCAGAu’CCu’GAAGGAGCACCCCGu’GGAGAACACCCAGCu’GCAGAACGAGAAGCu’Gu’ACCu’Gu’ACu’ACCu’GCAGAACGGCCGGGACAu’Gu’ACGu’GGACCAGGAGCu’GGACAu’CAACCGGCu’GAGCGACu’ACGACGu’GGACCACAu’CGu’GCCCCAGAGCu’u’CCu’GAAGGACGACAGCAu’CGACAACAAGGu’GCu’GACCCGGAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGu’GCCCAGCGAGGAGGu’GGu’GAAGAAGAu’GAAGAACu’ACu’GGCGGCAGCu’GCu’GAACGCCAAGCu’GAu’CACCCAGCGGAAGu’u’CGACAACCu’GACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCu’GAGCGAGCu’GGACAAGGCCGGCu’u’CAu’CAAGCGGCAGCu’GGu’GGAGACACGGCAGAu’CACCAAGCACGu’GGCCCAGAu’CCu’GGACAGCCGGAu’GAACACCAAGu’ACGACGAGAACGACAAGCu’GAu’CCGGGAGGu’GAAGGu’GAu’CACCCu’CAAGAGCAAGCu’GGu’GAGCGACu’u’CCGGAAGGACu’u’CCAGu’u’Cu’ACAAGGu’GCGGGAGAu’CAACAACu’ACCACCACGCCCACGACGCCu’ACCu’GAACGCCGu’GGu’GGGCACCGCCCu’GAu’CAAGAAGu’ACCCCAAGCu’GGAGAGCGAGu’u’CGu’Gu’ACGGCGACu’ACAAGGu’Gu’ACGACGu’GCGGAAGAu’GAu’CGCCAAGAGCGAGCAGGAGAu’CGGCAAGGCCACCGCCAAGu’ACu’u’Cu’u’Cu’ACAGCAACAu’CAu’GAACu’u’Cu’u’CAAGACCGAGAu’CACCCu’GGCCAACGGCGAGAu’CCGGAAGCGGCCCCu’GAu’CGAGACAAACGGCGAGACAGGCGAGAu’CGu’Gu’GGGACAAGGGCCGGGACu’u’CGCCACCGu’GCGGAAGGu’GCu’GAGCAu’GCCCCAGGu’GAACAu’CGu’GAAGAAGACCGAGGu’GCAGACCGGCGGCu’u’CAGCAAGGAGAGCAu’CCu’GCCCAAGCGGAACAGCGACAAGCu’GAu’CGCCCGGAAGAAGGACu’GGGACCCCAAGAAGu’ACGGCGGCu’u’CGACAGCCCCACCGu’GGCCu’ACAGCGu’GCu’GGu’GGu’GGCCAAGGu’GGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCu’CAAGAGCGu’GAAGGAGCu’GCu’GGGCAu’CACCAu’CAu’GGAGCGGAGCAGCu’u’CGAGAAGAACCCCAu’CGACu’u’CCu’GGAGGCCAAGGGCu’ACAAGGAGGu’GAAGAAGGACCu’GAu’CAu’CAAGCu’GCCCAAGu’ACAGCCu’Gu’u’CGAGCu’GGAGAACGGCCGGAAGCGGAu’GCu’GGCCAGCGCCGGCGAGCu’GCAGAAGGGCAACGAGCu’GGCCCu’GCCCAGCAAGu’ACGu’GAACu’u’CCu’Gu’ACCu’GGCCAGCCACu’ACGAGAAGCu’GAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCu’Gu’u’CGu’GGAGCAGCACAAGCACu’ACCu’GGA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SpCas9 mRNA MS004包含含有由以下提供的多核苷酸序列编码的多肽的融合蛋白，其中u’是N1-甲基假尿苷。
AGGAAAu’AAGAGAGAAAAGAAGAGu’AAGAAGAAAu’Au’AAGAGCCACCAu’GGCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGu’GGGCAu’CCACGGCGu’GCCCGCCGCCGACAAGAAGu’ACAGCAu’CGGCCu’GGACAu’CGGCACCAACAGCGu’GGGCu’GGGCCGu’GAu’CACCGACGAGu’ACAAGGu’GCCCAGCAAGAAGu’u’CAAGGu’GCu’GGGCAACACCGACCGGCACAGCAu’CAAGAAGAACCu’GAu’CGGCGCCCu’GCu’Gu’u’CGACAGCGGCGAGACGGCCGAGGCCACCCGGCu’GAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGu’ACACCCGGCGGAAGAACCGGAu’Cu’GCu’ACCu’GCAGGAGAu’Cu’u’CAGCAACGAGAu’GGCCAAGGu’GGACGACAGCu’u’Cu’u’CCACCGGCu’GGAGGAGAGCu’u’CCu’GGu’GGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCAu’Cu’u’CGGCAACAu’CGu’GGACGAGGu’GGCCu’ACCACGAGAAGu’ACCCCACCAu’Cu’ACCACCu’GCGGAAGAAGCu’GGu’GGACAGCACCGACAAGGCCGACCu’GCGGCu’GAu’Cu’ACCu’GGCCCu’GGCCCACAu’GAu’CAAGu’u’CCGGGGCCACu’u’CCu’GAu’CGAGGGCGACCu’GAACCCCGACAACAGCGACGu’GGACAAGCu’Gu’u’CAu’CCAGCu’GGu’GCAGACCu’ACAACCAGCu’Gu’u’CGAGGAGAACCCCAu’CAACGCCAGCGGCGu’GGACGCCAAGGCCAu’CCu’GAGCGCCCGGCu’GAGCAAGAGCCGGCGGCu’GGAGAACCu’GAu’CGCCCAGCu’GCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCu’Gu’u’CGGCAACCu’GAu’CGCCCu’GAGCCu’GGGCCu’GACCCCCAACu’u’CAAGAGCAACu’u’CGACCu’GGCCGAGGACGCCAAGCu’GCAGCu’GAGCAAGGACACCu’ACGACGACGACCu’GGACAACCu’GCu’GGCCCAGAu’CGGCGACCAGu’ACGCCGACCu’Gu’u’CCu’GGCCGCCAAGAACCu’GAGCGACGCCAu’CCu’GCu’GAGCGACAu’CCu’GCGGGu’GAACACCGAGAu’CACCAAGGCCCCCCu’GAGCGCCAGCAu’GAu’CAAGCGGu’ACGACGAGCACCACCAGGACCu’GACCCu’GCu’GAAGGCCCu’GGu’GCGGCAGCAGCu’GCCCGAGAAGu’ACAAGGAGAu’Cu’u’Cu’u’CGACCAGAGCAAGAACGGCu’ACGCCGGCu’ACAu’CGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGu’u’Cu’ACAAGu’u’CAu’CAAGCCCAu’CCu’GGAGAAGAu’GGACGGCACCGAGGAGCu’GCu’GGu’GAAGCu’GAACCGGGAGGACCu’GCu’GCGGAAGCAGCGGACCu’u’CGACAACGGCAGCAu’CCCCCACCAGAu’CCACCu’GGGCGAGCu’GCACGCCAu’CCu’GCGGCGGCAGGAGGACu’u’Cu’ACCCCu’u’CCu’GAAGGACAACCGGGAGAAGAu’CGAGAAGAu’CCu’GACCu’u’CCGGAu’CCCCu’ACu’ACGu’GGGCCCCCu’GGCCCGGGGCAACAGCCGGu’u’CGCCu’GGAu’GACCCGCAAGAGCGAGGAGACGAu’CACCCCCu’GGAACu’u’CGAGGAGGu’GGu’GGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCu’u’CAu’CGAGCGGAu’GACCAACu’u’CGACAAGAACCu’GCCCAACGAGAAGGu’GCu’GCCCAAGCACAGCCu’GCu’Gu’ACGAGu’ACu’u’CACCGu’Gu’ACAACGAGCu’GACCAAGGu’GAAGu’ACGu’GACCGAGGGCAu’GCGGAAGCCCGCCu’u’CCu’GAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCAu’CGu’GGACCu’GCu’Gu’u’CAAGACCAACCGGAAGGu’GACCGu’GAAGCAGCu’GAAGGAGGACu’ACu’u’CAAGAAGAu’CGAGu’GCu’u’CGACAGCGu’GGAGAu’CAGCGGCGu’GGAGGACCGGu’u’CAACGCCAGCCu’GGGCACCu’ACCACGACCu’GCu’GAAGAu’CAu’CAAGGACAAGGACu’u’CCu’GGACAACGAGGAGAACGAGGACAu’CCu’GGAGGACAu’CGu’GCu’GACCCu’GACCCu’Gu’u’CGAGGACCGGGAGAu’GAu’CGAGGAGCGGCu’GAAGACCu’ACGCCCACCu’Gu’u’CGACGACAAGGu’GAu’GAAGCAGCu’GAAGCGGCGGCGGu’ACACCGGCu’GGGGCCGGCu’GAGCCGGAAGCu’GAu’CAACGGCAu’CCGGGACAAGCAGAGCGGCAAGACCAu’CCu’GGACu’u’CCu’CAAGAGCGACGGCu’u’CGCCAACCGGAACu’u’CAu’GCAGCu’GAu’CCACGACGACAGCCu’GACCu’u’CAAGGAGGACAu’CCAGAAGGCCCAGGu’GAGCGGCCAGGGCGACAGCCu’GCACGAGCACAu’CGCCAACCu’GGCCGGCAGCCCCGCCAu’CAAGAAGGGCAu’CCu’GCAGACCGu’GAAGGu’GGu’GGACGAGCu’GGu’GAAGGu’GAu’GGGCCGGCACAAGCCCGAGAACAu’CGu’GAu’CGAGAu’GGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCCGGGAGCGGAu’GAAGCGGAu’CGAGGAGGGCAu’CAAGGAGCu’GGGCAGCCAGAu’CCu’GAAGGAGCACCCCGu’GGAGAACACCCAGCu’GCAGAACGAGAAGCu’Gu’ACCu’Gu’ACu’ACCu’GCAGAACGGCCGGGACAu’Gu’ACGu’GGACCAGGAGCu’GGACAu’CAACCGGCu’GAGCGACu’ACGACGu’GGACCACAu’CGu’GCCCCAGAGCu’u’CCu’GAAGGACGACAGCAu’CGACAACAAGGu’GCu’GACCCGGAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGu’GCCCAGCGAGGAGGu’GGu’GAAGAAGAu’GAAGAACu’ACu’GGCGGCAGCu’GCu’GAACGCCAAGCu’GAu’CACCCAGCGGAAGu’u’CGACAACCu’GACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCu’GAGCGAGCu’GGACAAGGCCGGCu’u’CAu’CAAGCGGCAGCu’GGu’GGAGACGCGGCAGAu’CACCAAGCACGu’GGCCCAGAu’CCu’GGACAGCCGGAu’GAACACCAAGu’ACGACGAGAACGACAAGCu’GAu’CCGGGAGGu’GAAGGu’GAu’CACCCu’CAAGAGCAAGCu’GGu’GAGCGACu’u’CCGGAAGGACu’u’CCAGu’u’Cu’ACAAGGu’GCGGGAGAu’CAACAACu’ACCACCACGCCCACGACGCCu’ACCu’GAACGCCGu’GGu’GGGCACCGCCCu’GAu’CAAGAAGu’ACCCCAAGCu’GGAGAGCGAGu’u’CGu’Gu’ACGGCGACu’ACAAGGu’Gu’ACGACGu’GCGGAAGAu’GAu’CGCCAAGAGCGAGCAGGAGAu’CGGCAAGGCCACCGCCAAGu’ACu’u’Cu’u’Cu’ACAGCAACAu’CAu’GAACu’u’Cu’u’CAAGACCGAGAu’CACCCu’GGCCAACGGCGAGAu’CCGGAAGCGGCCCCu’GAu’CGAGACGAACGGCGAGACGGGCGAGAu’CGu’Gu’GGGACAAGGGCCGGGACu’u’CGCCACCGu’GCGGAAGGu’GCu’GAGCAu’GCCCCAGGu’GAACAu’CGu’GAAGAAGACCGAGGu’GCAGACCGGCGGCu’u’CAGCAAGGAGAGCAu’CCu’GCCCAAGCGGAACAGCGACAAGCu’GAu’CGCCCGGAAGAAGGACu’GGGACCCCAAGAAGu’ACGGCGGCu’u’CGACAGCCCCACCGu’GGCCu’ACAGCGu’GCu’GGu’GGu’GGCCAAGGu’GGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCu’CAAGAGCGu’GAAGGAGCu’GCu’GGGCAu’CACCAu’CAu’GGAGCGGAGCAGCu’u’CGAGAAGAACCCCAu’CGACu’u’CCu’GGAGGCCAAGGGCu’ACAAGGAGGu’GAAGAAGGACCu’GAu’CAu’CAAGCu’GCCCAAGu’ACAGCCu’Gu’u’CGAGCu’GGAGAACGGCCGGAAGCGGAu’GCu’GGCCAGCGCCGGCGAGCu’GCAGAAGGGCAACGAGCu’GGCCCu’GCCCAGCAAGu’ACGu’GAACu’u’CCu’Gu’ACCu’GGCCAGCCACu’ACGAGAAGCu’GAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCu’Gu’u’CGu’GGAGCAGCACAAGCACu’ACCu’GGACGAGAu’CAu’CGAGCAGAu’CAGCGAGu’u’CAGCAAGCGGGu’GAu’CCu’GGCCGACGCCAACCu’GGACAAGGu’GCu’GAGCGCCu’ACAACAAGCACCGGGACAAGCCCAu’CCGGGAGCAGGCCGAGAACAu’CAu’CCACCu’Gu’u’CACCCu’GACCAACCu’GGGCGCCCCCGCCGCCu’u’CAAGu’ACu’u’CGACACCACCAu’CGACCGGAAGCGGu’ACACCAGCACCAAGGAGGu’GCu’GGACGCCACCCu’GAu’CCACCAGAGCAu’CACCGGCCu’Gu’ACGAGACGCGGAu’CGACCu’GAGCCAGCu’GGGCGGCGACAGCGGCGGCAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGu’AAu’GAu’AGGCGGCCGCu’u’AAu’u’AAGCu’GCCu’u’Cu’GCGGGGCu’u’GCCu’u’Cu’GGCCAu’GCCCu’u’Cu’u’Cu’Cu’CCCu’u’GCACCu’Gu’ACCu’Cu’u’GGu’Cu’u’u’GAAu’AAAGCCu’GAGu’AGGAAGu’Cu’AGA.
实施例9.脂质纳米颗粒(LNP)的制备
在这些研究中用作参考的LNP根据公开的程序制备，并且由公开的LNP赋形剂和基因组编辑器mRNA(Miller等人,Angew.Chem.Int.Ed.2017,56,1059-1063；Yin等人,NatureBiotechnology 2016,34,328-333)和指导RNA(Chadwick等人,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.2017,37,1741–1747；Rossidis等人,Nat.Med.2018,24,1513–1518.doi:10.1038/s41591-018-0184-6；Ding等人,Circ Res.2014,115,488–492)构成。gRNA有效载荷选自表3，并且用于构成这些LNP的mRNA有效载荷MA002、MA004和MS004如实施例8中所述来制备，并且SPcas9mRMA MS002购自TriLink BioTechnologies。参考LNP A1(表4)由来自表1B的公开的脂质501(表1B)、胆固醇(511)、DSPC(512)和PEG-脂质(507或506)构成，如文献(Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,8529–8533)中所述。类似地，基准LNP B1和C1分别由脂质502(WO 2015/095340 A1)和503(Molecular Therapy 2018,26,1509-1519)与胆固醇、DSPC和PEG-DMG的组合(506和507，表1B)构成，如表5中所概述。报道的基因组编辑器核酸酶mRNA和指导RNA用作构成参考LNP的有效载荷。在一种方法中，通过共同配制mRNA和指导RNA来制备LNP制剂A1、B1和C1。在这个共同配制方法中，mRNA与指导RNA的比率从10:1至1:10变化，这产生用于体外和体内基因编辑评估的一系列LNP。在第二方法中：使用与表6中相同的脂质比率分别配制指导RNA和mRNA，接着在各种比率下将用指导RNA和mRNA预配制的LNP一起混合以获得用于基因编辑评估的一系列新的LNP。
表4.LNP A1、B1和C1的示例性脂质组成
实施例10.LNP F1-F25的制备
根据如Molecular Therapy 2018,26,1509-1519中所述的公开的程序制备对照/基准LNP F1。按重量计mRNA与指导RNA的比率1:1用于配制LNP。通过Zeta Sizer UltraZSU5700(Malvern Panalytical Inc.)测量所有LNP的尺寸和多分散性指数(PDI)。本领域普通技术人员应了解，尺寸和PDI受用于测量的测定的准确度及其标准偏差的影响。因此，举例来说，本文中测量的PDI受是平均值的+/-10％的测量准确度的影响，并且LNP平均直径(尺寸)受是平均值的+/-10％的测量准确度的影响。在一些情况下，举例来说，测量变异性可为>10％。通过RiboGreen测定试剂盒(Quant-iTTM RiboGreenTM，Invitrogen)测量RNA包埋百分比。本领域普通技术人员应了解，RNA包埋百分比受用于测量的测定的准确度及其标准偏差的影响。因此，举例来说，每个实施例中测量的RNA包埋百分比受是平均值的+/-10％的测量准确度的影响。在一些情况下，举例来说，测量准确度的测量变异性可为>10％。术语‘RNA包埋百分比’、‘总RNA包埋百分比’、‘RNA包封百分比’和‘总RNA包封百分比’可互换地用作在每种配制之后包封在LNP内的总RNA的量度。
含有504和513的LNP F2-F5的一般性制备方法。
以如表5中所述的摩尔比将脂质和醇溶解在乙醇中。N:P比率保持在3至12。使用微流体混合器诸如来自Precision Nanosystems的Ignite，以水溶液与乙醇的比率3:1将脂质混合物与含有Cas9 mRNA和PCSK9gRNA(1:1)的50mM柠檬酸钠缓冲液(pH 4.8)组合。以最终16.5％乙醇体积收集LNP，并且保持1h，随后在透析盒中相对于PBS(pH 7.4)透析至少18h。使用Amicon超离心过滤器浓缩制剂，并且使其穿过0.2μm过滤器以提供LNP F2-F5(表5)。如上所述测定LNP的尺寸和RNA包埋效率。在一些情况下，混合器是T型混合器。在一些情况下，它是十字型混合器。在一些情况下，水溶液与乙醇的比率是2:1。
替换F2和F3中的504，如表5中所述，使用505制备LNP制剂F6和F7。
通过替换F2和F3中的504，如表5中所述，使用519制备LNP制剂F8和F9。
通过替换F2和F3中的504，如表5中所述，使用508制备LNP制剂F10和F11。
通过替换F2和F3中的504，如表5中所述，使用509制备LNP制剂F12和F13。
通过替换F2和F3中的504，如表5中所述，使用510制备LNP制剂F14和F15。
通过替换F2和F3中的504，如表5中所述，使用514制备LNP制剂F16和F17。
通过替换F2和F3中的504，如表5中所述，使用515制备LNP制剂F18和F19。
通过替换F2和F3中的504，如表5中所述，使用516制备LNP制剂F20和F21。
通过替换F2和F3中的504，如表5中所述，使用517制备LNP制剂F22和F23。
通过替换F2和F3中的504，如表5中所述，使用518制备LNP制剂F24和F25。
在野生型C57BL/6小鼠中评估LNP F1-F5的体内PCSK9基因编辑，并且结果概述于表5中和图1中。
表5.在存在以及不存在作为额外赋形剂的脂肪醇下，通过用氨基脂质501构成的LNP F1-F5在小鼠肝细胞中进行的基因编辑。
*指示给药错误。
表5的携带Cas9 mRNA和PCSK9 gRNA的LNP除LNP F1(0.75mg/kg)之外以0.5mg/kg总RNA剂量静脉内(尾部静脉)施用至野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)。
实施例11.LNP F27-F43的一般性制备方法
以如表5中所述的摩尔比将LNP赋形剂溶解在乙醇中。N:P比率保持在3至12。使用微流体混合器(诸如可从Precision NanoSystems获得的那些)，将脂质混合物与含有Cas9mRNA和PCSK9 gRNA GA010(1:1)的缓冲液(pH 3.0至5.8)组合。在一些情况下，混合器是T型混合器。在一些情况下，它是十字型混合器。在一些情况下，水溶液与乙醇的比率是2:1。在一些情况下，水溶液与乙醇的比率是3:1。以如通过用PEG400的重量除以它所添加到的药物物质缓冲液的重量来计算的某一％，在与脂质混合之前将PEG400添加至含有RNA的药物物质缓冲液中。当在核酸运载物之前或在与核酸运载物共混合之前将PEG400添加至药物物质缓冲液中时，不含有RNA的药物物质缓冲液中的w/w％高于最终含有RNA的药物物质缓冲液中的目标w/w％，以致用RNA进行的最终稀释将PEG400％稀释至目标w/w％。收集LNP，并且在透析盒中相对于缓冲液(pH 6.5至8.0)透析至少18h，或通过PD-10柱进行缓冲液更换。将制剂浓缩，并且使其穿过0.2μm过滤器以提供LNP F27-F43(表6)。通过Zeta Sizer UltraZSU5700(Malvern Panalytical Inc.)测量所有LNP的尺寸和多分散性指数。使用来自Invitrogen的试剂盒Quant-iTTM RiboGreenTM，通过RiboGreen测定来测量RNA包埋百分比。这个数据提供在下表6中。
表6.LNP F27-F43的组成、生理化学特征以及在施用用PEG400构成的LNP F27-F40之后在C57BL/6小鼠肝中的PCSK9基因编辑％的概述。
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*指示注射缺失/剂量不完整。表6的所有LNP都施用至野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)，并且表列了肝中的编辑％。总RNA剂量：0.5或2mg/kg。
表7：相对于用于构成选自表6的LNP的PEG400的量，LNP中包埋的PEG400的％。
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表7的PEG400的包封％通过使用HPLC来测量。配制前PEG400和包埋的PEG400的HPLC峰面积用于计算包封％。
用PEG400配制的LNP的稳定性，尤其是在2-8℃下或在-80℃下储存之后的稳定性。将PEG400添加至有效载荷中使包封率增加，并且改善在冷冻-解冻循环和/或储存之后的LNP稳定性。冷冻缓冲液是具有在6.5-8.5的范围内的pH和在10-100mM的范围内的浓度的缓冲液。在一些情况下，它含有0-50(w/w)％PEG400。进行0-100个冷冻解冻循环，并且使用以下术语来描述：T0指示在冷冻之前的样品，并且Tx是在x个冷冻解冻循环之后的样品。在一些情况下，冷冻解冻循环的数目是3，由符号T3指示。
表8：表6和图3中所述的LNP在0和3个冷冻/解冻循环之后的表征结果。LNP在-80℃下储存。
*PDI：多分散性指数
将相对于药物物质缓冲液的重量在0-50w/w％的范围内的PEG400与在水性缓冲液中的药物物质(mRNA加gRNA)混合，随后与在乙醇中的脂质赋形剂混合以构成LNP，并且将产生的LNP分成两半。将第一半在冷室条件(2-8℃)下储存，并且将第二半在-80℃下冷冻和储存。以0-50个循环的范围将冷冻LNP解冻。测量Z平均尺寸、mRNA包封百分比、RNA降解(通过凝胶电泳)和RNA稳定性(通过HPLC方法)。使用的HPLC方法是具有蒸发光散射检测的离子配对反相高效液相色谱法(IP-RPLC-HPLC-ELSD)以定量相对于输入量，每个样品中的PEG400％。将在-80℃下冷冻和储存的LNP解冻，并且静脉内施用至野生型C57BL/6雌性小鼠以评估基因编辑。在冷室温度下储存的相应LNP用作每种冷冻LNP制剂的参考。相应的无PEG400 LNP用作-80℃储存与冷室储存两者的对照。
实施例12.在-80℃下储存的LNP的体外评估
对于体外编辑效率，将在-80℃下储存的用PEG400构成的LNP在解冻之后与来自小鼠、大鼠、非人灵长类动物和人的永生化细胞系与原代细胞两者一起在存在以及不存在ApoE下在孵育培养基中孵育以评估编辑效率。相应冷室储存的LNP用作研究的参考。使用下一代测序(NGS)和编辑效率分析来测定编辑％，如实施例13中所述。
在一些情况下，配制具有相同脂质组成的多种溶液以获得所需LNP。在一些情况下，运载物是编码eGFP的mRNA。在其他情况下，运载物是用于基因编辑的Cas9 mRNA和指导RNA。一些LNP在药物物质缓冲液中包括0.001-50(w/w)％PEG400，而至少一种其他LNP不包括PEG400。将含有PEG400的LNP分成至少两个部分，接着将其缓冲液更换成冷冻缓冲液、含有0.05-50w/w％PEG400的冷冻缓冲液或PBS。将没有PEG400的LNP分成至少三个部分，接着将其缓冲液更换成冷冻缓冲液、含有0.05-50w/w％PEG400的冷冻缓冲液或PBS。将每种LNP和缓冲液组合分成至少两个样品，一个样品保持在2-8℃(T0)下，而另一样品在-80℃下冷冻。将在-80℃下的样品解冻和冷冻总计1-50次(Tx)。接着将细胞以适当的每孔密度铺于96孔板中，并且将给定剂量的包封在每种LNP中的mRNA递送至细胞(N大于或等于3个孔)。在用LNP对细胞给药之后24-72小时，使用板读取器测量GFP表达。我们已证明，在一些情况下，尽管所有样品都处于冷冻缓冲液中，但在药物物质缓冲液或冷冻缓冲液中没有PEG400的LNP显示在未冷冻T0样品与冷冻/解冻循环T3样品之间存在GFP表达的统计显著损失。PEG400通过它包括在冷冻或药物物质缓冲液中改善了RNA稳定性和功能性，因为这些LNP在3个冷冻/解冻循环之间未遭受功效损失。
体外转染
原代肝细胞：根据制造商的方案培养来自BioIVT的原代人肝脏肝细胞(PHH)、原代食蟹猴肝脏肝细胞(PCH)或原代小鼠肝脏肝细胞(PMH)。简要来说，将细胞解冻并再悬浮在肝细胞解冻培养基中，随后在4℃下在100g下离心10min。丢弃上清液，并且将集结的细胞再悬浮在肝细胞铺板培养基中。每个小瓶含有约500万个用于对一个24孔板铺板的细胞。在37℃下，在5％CO2氛围下，使铺板细胞在组织培养孵育器中沉降和贴壁4-6h。在孵育之后，检查细胞的单层形成。接着用新鲜肝细胞维持培养基(从细胞系供应商BioIVT获得的完全INVITROGRO培养基)替换孵育培养基。因此，细胞为转染做好了准备。来自Thermo Fisher的MessengerMAX用于转染。溶液A：所需量的指导RNA与1:1重量比的mRNA在OptiMEM中混合。溶液B：MessengerMAX在OptiMEM中。在混合溶液A和B之后，在室温下将混合物孵育20min。将60μL的孵育溶液逐滴添加至每个细胞孔中。接着使细胞在37℃下保持3天。收集细胞，并且准备用于使用Thermo Kingfisher进行基因组DNA提取。通过PCR处理提取的基因组DNA以分析基因编辑。接着使扩增的PCR产物经受NGS(MiSeq)。
gDNA分离
根据制造商的方案，使用基于珠粒的提取试剂盒MagMAX-96DNA多样品试剂盒(Thermo-Fisher Scientific)，在KingFisher Flex自动化提取仪器(Thermo-FisherScientific)上从约20mL的猴肝溶解产物分离基因组DNA。根据制造商的方案，使用FastPrep-24系统(MP Bio)使猴肝溶解。将肝装载至具有0.5mL的PBS的2mL溶解介质管(MPBio)中。将提取的基因组DNA在4℃下储存直至进一步使用，或在-80℃下储存以用于长期储存。
实施例13：在存在以及不存在PEG400下在-80℃下储存的LNP的体内评估。
测定在冷室温度下的在存在以及不存在PEG400下构成的LNP以及在-80℃下储存的相应LNP的体内编辑效率，如表6中所述。
在一些情况下，使用C57BL6和LDLr-/-小鼠，每个处理组至少3个动物。以在0.05mg/kg至2mg/kg的范围内的剂量通过静脉内或眶后施用来对动物进行注射。接着在0-14天之后将小鼠处死，收集组织并处理，并且通过下一代测序分析肝的靶标基因中的编辑。在一些情况下，LNP含有商业或内部产生的Cas9 mRNA和相关指导RNA。在大多数情况下，实验的终点是靶标基因中的肝编辑百分比。
用0-50(w/w)％PEG400配制相同脂质组成的LNP。接着将它们的缓冲液更换成PBS或冷冻缓冲液，接着在2-8℃或-80℃下储存。接着如上所述将LNP注射至小鼠中，并且收集肝并分析肝编辑百分比。
使以0-50(w/w)％PEG400配制的LNP经受0-50个冷冻/解冻循环。接着将它们注射至小鼠中，并且分析肝的肝编辑百分比。从配制之后0分钟至52周监测用0-50(w/w)％PEG400配制的LNP的稳定性以获得在2-8℃或-80℃下的RNA降解和结构完整性。
在野生型啮齿动物模型中以及在非人灵长类动物中评估来自实施例10-23的许多配制LNP的基因编辑活性。
根据动物护理、处理和处死的机构伦理指导方针处理小鼠。将小鼠保持在无病原体设施中，自由获取标准食物和水。根据它们的体重，通过眶后途径，用测试物品或作为媒介物的PBS对小鼠给药。给药后第五或第六天收集相关组织。提取基因组DNA，并且通过下一代测序评估靶标序列的编辑百分比以测定编辑效率，并且结果描绘于图4-18中。
基因组DNA分离
根据制造商的方案，使用基于珠粒的提取试剂盒MagMAX-96DNA多样品试剂盒(Thermo-Fisher Scientific)，在KingFisher Flex自动化提取仪器(Thermo-FisherScientific)上从约20μL的小鼠全肝溶解产物分离基因组DNA。根据制造商的方案，使用FastPrep-24系统(MP Bio)使小鼠全肝溶解。将肝装载至具有0.5mL的PBS的2mL溶解介质管(MP Bio)中。将提取的基因组DNA在4℃下储存直至进一步使用，或在-80℃下储存以用于长期储存。
下一代测序(NGS)和编辑效率分析
对目标区域进行下一代测序或深度测序以测定基因编辑的程度。根据制造商的方案，使用Nextera XT DNA文库制备试剂盒(Illumina)制备样品。简要来说，进行两轮PCR，第一轮用以扩增目标区域，并且第二轮用以将为深度测序和样品识别所需的DNA序列添加至初始产物中。根据制造商的方案，在Illumina MiSeq仪器上对最终扩增子测序。
用CRISPResso2流水线(https://www.nature.com/articles/s41587-019-0032-3)分析双端读段。简要来说，将低质量读段滤出，从读段修剪衔接物序列，并且将双端读段合并，并且与扩增子序列比对。将编辑百分比计算为支持插入或缺失的读段的数目除以比对的读段的总数。对于Cas9，将编辑百分比计算为支持插入或缺失的读段的数目除以比对的读段的总数。对于ABE，从编辑窗中的A到G修饰估计编辑百分比。
用CRISPResso2流水线分析双端读段
(https://www.nature.com/articles/s41587-019-0032-3)。简要来说，将低质量读段滤出，从读段修剪衔接物序列，并且将双端读段合并，并且与扩增子序列比对。将编辑百分比计算为支持插入或缺失的读段的数目除以比对的读段的总数。对于Cas9，将编辑百分比计算为支持插入或缺失的读段的数目除以比对的读段的总数。对于ABE，从编辑窗中的A到G修饰估计编辑百分比。
下一代测序(NGS)和编辑效率分析
对目标区域进行下一代测序(NGS)或深度测序以测定基因编辑的程度。根据制造商的方案，使用Nextera XT DNA文库制备试剂盒(Illumina)制备样品。简要来说，进行两轮PCR，第一轮用以扩增目标区域，并且第二轮用以将为深度测序和样品识别所需的DNA序列添加至初始产物中。根据制造商的方案，在Illumina MiSeq仪器上对最终扩增子测序。用CRISPResso2流水线分析双端读段(参见Clement,K.,Rees,H.,Canver,M.C.等人CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis.NatBiotechnol 37,224–226(2019))。简要来说，将低质量读段滤出，从读段修剪衔接物序列，并且将双端读段合并，并且与扩增子序列比对。将编辑百分比计算为支持插入或缺失的读段的数目除以比对的读段的总数。对于Cas9，将编辑百分比计算为支持插入或缺失的读段的数目除以比对的读段的总数。
实施例14.LNP F45-F91、F94-F96、F110、F123-F125和F143-F150的制备。
LNP F45-F91、F94-F96、F110、F123-F125和F143-F150的一般性制备方法。
将脂质溶解在乙醇中。可电离脂质以在40％-70％之间的最终摩尔比包括在LNP中。结构脂质以在30％与60％之间的最终摩尔比包括在LNP中。辅助脂质以在2％与25％之间的最终摩尔比包括在LNP中。隐形脂质以在0.5％与5％之间的最终摩尔比包括在LNP中。N:P比率保持在3至12。
使用微流体混合器，以水溶液与乙醇的比率3:1将脂质混合物与在含有SpCas9mRNA和gRNA(1:1)或ABE mRNA和指导RNA(在比率2:1、3:1、6:1、1:1、1:2、1:3或1:6下)的50mM柠檬酸钠缓冲液(pH 4.0-6.0)中的0.5％PEG400(Millipore Sigma)组合。在一些情况下，混合器是Nanoassemblr(Precision Nanosystems)。在一些情况下，混合器是T型混合器。在一些情况下，它是十字型混合器。在一些情况下，水溶液与乙醇的比率是2:1。
以8.25％或16.5％最终乙醇体积收集LNP，并且保持1h，随后使用PD-10柱(GEHealthcare)、透析或切向流过滤(TFF)过程将其缓冲液更换成PBS或Tris缓冲液。在一些情况下，在16.5％乙醇下收集LNP，接着在配制后立刻或在1小时保持时间之后稀释至8.25％乙醇，随后进行缓冲液更换。在一些情况下，使用Amicon超离心过滤器(100kDa)浓缩制剂，并且使其穿过0.2μm过滤器以提供LNP。如实施例D11中所述进行LNP的尺寸和RNA包埋效率的测定。
实例LNP更详细地描述于表9和表10中。F66-F68、F94、F95和F123制剂使用十字型混合或T型混合制备。F52-F58构成ABE mRNA与指导RNA的比率2:1、3:1、6:1、1:1、1:2、1:3或1:6。F65像F64那样配制，但以506作为隐形脂质。F69-F83和F147-F150构成探索制剂mol％空间的实验设计(DOE)。DoE使用JMP软件设计。
LNP肝编辑图示于图4-10和图17中。
表9.制备用于评估的LNP的组成。
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表9的所选LNP静脉内施用(尾部静脉或RO)至野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)。总RNA剂量连同mRNA和指导RNA一起如表中所给出。N:P比率在3.5-10.0的范围内。每种LNP的肝编辑百分比数据图示于图4-10和图17中。
表10.表9中所述的LNP 5在无菌过滤前和无菌过滤后的表征。
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表10的所选LNP静脉内施用(尾部静脉或RO)至野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)。LNP用具有在4.0与6之间的pH的药物物质缓冲液配制。总RNA剂量连同mRNA和指导RNA一起如表中所给出。每种LNP的肝编辑百分比数据图示于图4-10和图17中。
实施例15.LNP F92和F97-F100的一般性制备方法(通过i脂质N:P比率)。
将脂质溶解在乙醇中。将mRNA和指导RNA(ABE mRNA和指导RNA(1:1)或SpCas9mRNA和gRNA(1:1))添加至含有0.67wt％PEG400的67mM柠檬酸盐缓冲液中以制备含有0.5％PEG400的50mM柠檬酸盐缓冲液。以中和RNA的0.1-99％的“P”(基于N:P)的量将可电离脂质添加至含有RNA的柠檬酸盐缓冲液中。使所得溶液在室温下孵育至少15分钟。
将剩余脂质(其余的i脂质+辅助脂质+结构脂质+隐形脂质)溶解在乙醇中。可电离脂质以在40％-70％之间的最终摩尔比包括在LNP中。结构脂质以在30％与60％之间的最终摩尔比包括在LNP中。辅助脂质以在2％与25％之间的最终摩尔比包括在LNP中。隐形脂质以在0.5％与5％之间的最终摩尔比包括在LNP中。N:P比率保持在3至12。
使用微流体混合器，以水溶液与乙醇的比率3:1将脂质混合物与以上所述的含有RNA的柠檬酸盐缓冲液组合。在一些情况下，混合器是Nanoassemblr(PrecisionNanosystems)。在一些情况下，混合器是T型混合器。在一些情况下，它是十字型混合器。在一些情况下，水溶液与乙醇的比率是2:1。
以最终16.5％乙醇体积收集LNP，并且保持1h，随后使用PD-10柱(GEHealthcare)、透析或切向流过滤(TFF)过程将其缓冲液更换成PBS或Tris缓冲液。在一些情况下，在16.5％乙醇下收集LNP，接着在配制后立刻或在1小时保持时间之后稀释至8.25％乙醇，随后进行缓冲液更换。在一些情况下，使用Amicon超离心过滤器(100kDa)浓缩制剂，并且使其穿过0.2μm过滤器以提供LNP。如实施例11中所述进行LNP的尺寸和RNA包埋效率的测定。
在一些情况下，柠檬酸盐缓冲液构成一个流，而足以中和0.1-90％(基于N:P)的一部分氨基脂质、所有mRNA和所有指导RNA在另一流中。使用混合器(微流体、T型混合器、十字型混合器等)将它们混合。所得溶液于是为下一混合事件中的水性流，在所述下一混合事件中，剩余脂质构成脂质流。使用混合器将两个流混合。接着将所得LNP保持1小时，通过透析、PD-10或TFF将其缓冲液更换成Tris或PBS，然后注射至小鼠中。
实例LNP描述于表11中。LNP肝编辑图示于图11中。基于N:P，F92、F97、F98、F99和F100分别具有10％、15％、25％、50％和75％中和度。
表11.LNP F92和F97-F100的LNP组成和表征(在野生型C57BL/6小鼠中)。
a：配制后；b：无菌过滤后。隐形脂质：507
表11的所有LNP都静脉内施用(RO)至野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)，剂量05mg/kg(总RNA)；mRNA：MA004，并且gRNA：GA256。总RNA剂量连同mRNA和指导RNA一起如表中所给出。氨基脂质502以分别足以中和RNA的10％、15％、25％、50％和75％的“P”(基于N:P)的量添加至含有RNA的柠檬酸盐缓冲液中(在与剩余脂质组分混合之前)，以分别产生F92、F97、F98、F99、F100。所有制剂都含有0.5w/w％PEG400。N:P比率在3.5-10.0的范围内。每种LNP的肝编辑百分比数据图示于图11中。
实施例16.包括低分子量壳聚糖的LNP F93、F101-F103和F155的一般性制备方法。
将脂质溶解在乙醇中。以在0.1–5mg/mL之间的浓度将低分子量壳聚糖(SigmaAldrich)悬浮在含有0.67wt％PEG400的67mM柠檬酸盐缓冲液中。逐滴添加1N HCl直至壳聚糖溶解在溶液中。将mRNA和指导RNA(ABE mRNA和指导RNA(1:1)或SpCas9 mRNA和gRNA(1:1))添加至含有0.67％PEG400的67mM柠檬酸盐缓冲液中以制备含有0.5％PEG400的50mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4.0-6.0)。以壳聚糖与RNA的重量比0.01％-80％将壳聚糖溶液添加至含有RNA的柠檬酸盐缓冲液中。
可电离脂质以在40％-70％之间的最终摩尔比包括在LNP中。结构脂质以在30％与60％之间的最终摩尔比包括在LNP中。辅助脂质以在2％与25％之间的最终摩尔比包括在LNP中。隐形脂质以在0.5％与5％之间的最终摩尔比包括在LNP中。N:P比率保持在3至12。使用微流体混合器，以水溶液与乙醇的比率3:1将脂质混合物与含有RNA/壳聚糖的柠檬酸盐缓冲液组合。在一些情况下，混合器是Nanoassemblr(Precision Nanosystems)。在一些情况下，混合器是T型混合器。在一些情况下，它是十字型混合器。在一些情况下，水溶液与乙醇的比率是2:1。
以最终16.5％乙醇体积收集LNP，并且保持1h，随后使用PD-10柱(GEHealthcare)、透析或切向流过滤(TFF)过程将其缓冲液更换成PBS或Tris缓冲液。在一些情况下，在16.5％乙醇下收集LNP，接着在配制后立刻或在1小时保持时间之后稀释至8.25％乙醇，随后进行缓冲液更换。在一些情况下，使用Amicon超离心过滤器(100kDa)浓缩制剂，并且使其穿过0.2μm过滤器以提供LNP。如实施例11中所述进行LNP的尺寸和RNA包埋效率的测定。
实例LNP描述于表12中。LNP肝编辑图示于图12中。基于RNA重量比，F93、F101、F102、F103和F155在药物物质缓冲液中分别包括1％、0.1％、0.5％、5％和10％壳聚糖。
表12.LNP F93、F01-F103和F155组成和表征以及在野生型C57BL/6小鼠中的评估。
a：配制后；b：无菌过滤后。
表12的所有LNP都静脉内施用(RO)至野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)；剂量：0.05mg/kg(总RNA)；mRNA：MA004，并且gRNA：GA256。F155采用的是GA257。壳聚糖柠檬酸盐溶液以相较于RNA 1％、0.1％、0.5％、5％和1％的重量比添加至含有RNA的柠檬酸盐缓冲液中以分别产生F93、F101、F102、F103和F155。所有制剂都含有0.5w/w％PEG400。N:P比率在3.5-10.0的范围内。每种LNP的肝编辑百分比数据图示于图12中。
实施例17.LNP F104的一般性制备方法
将脂质溶解在乙醇中。以在0.1-5mg/mL之间的浓度将低分子量壳聚糖(SigmaAldrich)悬浮在含有0.67wt％PEG400的67mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4.0-6.0)中。逐滴添加1NHCl直至壳聚糖溶解在溶液中。将mRNA和指导RNA(ABE mRNA和指导RNA(1:1)或SpCas9 mRNA和gRNA(1:1))添加至含有0.67％PEG400的67mM柠檬酸盐缓冲液中以制备含有0.5％PEG400的50mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4.0-6.0)。以壳聚糖与RNA的重量比0.01％-80％将壳聚糖溶液添加至含有RNA的柠檬酸盐缓冲液中。还以中和RNA的0.5-90％的“P”(基于N:P)的量将可电离脂质添加至含有RNA的柠檬酸盐缓冲液中。
可电离脂质以在40％-70％之间的最终摩尔比包括在LNP中。结构脂质以在30％与60％之间的最终摩尔比包括在LNP中。辅助脂质以在2％与25％之间的最终摩尔比包括在LNP中。隐形脂质以在0.5％与5％之间的最终摩尔比包括在LNP中。N:P比率保持在3至12。
使用微流体混合器，以水溶液与乙醇的比率3:1将脂质混合物与含有RNA的柠檬酸盐缓冲液组合。在一些情况下，混合器是Nanoassemblr(Precision Nanosystems)。在一些情况下，混合器是T型混合器。在一些情况下，它是十字型混合器。在一些情况下，水溶液与乙醇的比率是2:1。
以最终16.5％乙醇体积收集LNP，并且保持1h，随后使用PD-10柱(GEHealthcare)、透析或切向流过滤(TFF)过程将其缓冲液更换成PBS或Tris缓冲液。在一些情况下，在16.5％乙醇下收集LNP，接着在配制后立刻或在1小时保持时间之后稀释至8.25％乙醇，随后进行缓冲液更换。在一些情况下，使用Amicon超离心过滤器(100kDa)浓缩制剂，并且使其穿过0.2μm过滤器以提供LNP。如实施例D11中所述进行LNP的尺寸和RNA包埋效率的测定。
实例LNP描述于表13中。肝编辑％在图16中给出。
表13.LNP 104组成和表征以及在野生型C57BL/6小鼠中的评估。
a：配制后；b：无菌过滤后。
表13的LNP静脉内施用(RO)至野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)，剂量：0.05mg/kg(总RNA)；mRNA：MA004，并且gRNA：GA256。基于重量，相对于RNA，1％壳聚糖包括在LNP 104中。在与LNP 104中的剩余脂质混合之前进行N:P的10％中和。LNP 104用0.5％w/w PEG400配制。N:P比率在3.5-10.0的范围内。LNP 104的肝编辑％在图16中给出。
实施例18.LNP F105、F151、F152的一般性制备方法
将脂质溶解在乙醇中。可电离脂质以在40％-70％之间的最终摩尔比包括在LNP中。结构脂质以在30％与60％之间的最终摩尔比包括在LNP中。辅助脂质以在2％与25％之间的最终摩尔比包括在LNP中。隐形脂质以在0.5％与5％之间的最终摩尔比包括在LNP中。N:P比率保持在3至12。
在一些情况下，LNP仅包括SpCas9指导RNA。在其他情况下，LNP仅包括ABE指导RNA。使用微流体混合器，以水溶液与乙醇的比率3:1将脂质混合物与在含有ABE或SpCas9指导RNA的50mM柠檬酸钠缓冲液(pH 4.0-6.0)中的0.5％PEG400(Millipore Sigma)组合。在一些情况下，混合器是Nanoassemblr(Precision Nanosystems)。在一些情况下，混合器是T型混合器。在一些情况下，它是十字型混合器。在一些情况下，水溶液与乙醇的比率是2:1。
在其他情况下，LNP包括SpCas9 mRNA或ABE mRNA。使用微流体混合器，以水溶液与乙醇的比率3:1将脂质混合物与在含有ABE或SpCas9 mRNA的50mM柠檬酸钠缓冲液(pH 4.0-6.0)中的0.5％PEG400(Millipore Sigma)组合。在一些情况下，混合器是Nanoassemblr(Precision Nanosystems)。在一些情况下，混合器是T型混合器。在一些情况下，它是十字型混合器。
与含有mRNA的LNP分开配制指导RNA LNP，并且在一些情况下在1小时保持时间后，在一些情况下在缓冲液更换后，或在其他情况下在无菌过滤后将两种LNP组合。
以最终16.5％乙醇体积收集LNP，并且保持1h，随后使用PD-10柱(GEHealthcare)、透析或切向流过滤(TFF)过程将其缓冲液更换成PBS或Tris缓冲液。在一些情况下，在16.5％乙醇下收集LNP，接着在配制后立刻或在1小时保持时间之后稀释至8.25％乙醇，随后进行缓冲液更换。在一些情况下，使用Amicon超离心过滤器(100kDa)浓缩制剂，并且使其穿过0.2μm过滤器以提供LNP。如实施例D11中所述进行LNP的尺寸和RNA包埋效率的测定。
实例LNP描述于表14中。肝编辑％在图16中给出。
表14.LNP 105、151、152组成和表征以及在野生型C57BL/6小鼠中的评估。
a：配制后；b：无菌过滤后。
表14的所有LNP都静脉内施用(RO)至野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)，剂量：0.05mg/kg(总RNA，mRNA：MA004，gRNA：GA256)。对于F151，使用微流体混合器，以水溶液与乙醇的比率3:1将脂质混合物与在含有ABE指导RNA的50mM柠檬酸钠缓冲液(pH 4.2-5.8)中的0.5％PEG400组合。对于F152，使用微流体混合器，以水溶液与乙醇的比率3:1将脂质混合物与在含有ABE mRNA的50mM柠檬酸钠缓冲液中的0.5％PEG400组合。以最终16.5％乙醇体积收集LNP，并且保持1h，随后进行组合。F151和F152的这个组合产生F105。通过透析将F105LNP透析至Tris缓冲液中。N:P比率在3.5-10.0的范围内。F105的LNP编辑％在图16中给出。
实施例19.F106-F109的一般性制备方法。
如实施例10中所述制备F106-F109。水溶液中mRNA:gRNA比率保持在1:1，并且脂质组成描述于表15中。平均直径和RNA包埋％描述于表16中。
实施例20.F111-F122的一般性制备方法。
如实施例10中所述制备F111-122。水溶液中mRNA:gRNA比率保持在1:1，并且脂质组成描述于表15中。平均直径和RNA包埋％描述于表16中。肝编辑显示于图15中。
实施例21.F126-F142的一般性制备方法。
如实施例19中所述制备F121-F142。水溶液中mRNA:gRNA比率保持在1:1，并且脂质组成描述于表15中。平均直径和RNA包埋％描述于表16中。
表15.LNP F106-F142的组成。N:P比率在3.5-10.0的范围内。
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表16.LNP F106-F142的表征数据。
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除缓冲液更换成Tris的F120之外，表16的所有LNP的缓冲液都更换成PBS。所有LNP都用具有在4.0与6.0之间的pH的药物物质缓冲液配制。
实施例22.包括十六烷基三甲基溴化铵(CTAB或表1B中的524)的F151-F154的一般性制备方法
将脂质溶解在乙醇中。将CTAB(Sigma Aldrich)与含有0.67wt％PEG400的67mM柠檬酸盐缓冲液混合以形成浓度在0.01–5mg/mL之间的溶液。将mRNA和指导RNA(ABE mRNA和指导RNA(1:1)或SpCas9mRNA和gRNA(1:1))添加至含有0.67％PEG400的67mM柠檬酸盐缓冲液中以制备含有0.5％PEG400的50mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4.0-6.0)。以524与RNA的重量比0.01％-80％将524溶液添加至含有RNA的柠檬酸盐缓冲液中。
可电离脂质以在40％-70％之间的最终摩尔比包括在LNP中。结构脂质以在30％与60％之间的最终摩尔比包括在LNP中。辅助脂质以在2％与25％之间的最终摩尔比包括在LNP中。隐形脂质以在0.5％与5％之间的最终摩尔比包括在LNP中。N:P比率保持在3至12。使用微流体混合器，以水溶液与乙醇的比率3:1将脂质混合物与含有RNA/524的柠檬酸盐缓冲液组合。在一些情况下，混合器是Nanoassemblr(Precision Nanosystems)。在一些情况下，混合器是T型混合器。在一些情况下，它是十字型混合器。在一些情况下，水溶液与乙醇的比率是2:1。
以最终16.5％乙醇体积收集LNP，并且保持1h，随后使用PD-10柱(GEHealthcare)、透析或切向流过滤(TFF)过程将其缓冲液更换成PBS或Tris缓冲液。在一些情况下，在16.5％乙醇下收集LNP，接着在配制后立刻或在1小时保持时间之后稀释至8.25％乙醇，随后进行缓冲液更换。在一些情况下，使用Amicon超离心过滤器(100kDa)浓缩制剂，并且使其穿过0.2μm过滤器以提供LNP。如实施例11中所述进行LNP的尺寸和RNA包埋效率的测定。
实例LNP描述于表17中。基于RNA重量比，F151、F152、F153和F154在药物物质缓冲液中分别包括0.1％、0.3％、0.6％和1％524(CTAB)。
表17.LNP F151-F154组成和表征以及在野生型C57BL/6小鼠中的评估。
a：配制后；b：无菌过滤后。
表17的所有LNP都静脉内施用(RO)至野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)；剂量：0.05mg/kg(总RNA)；mRNA：MA004，并且gRNA：GA257。524柠檬酸盐溶液以相较于RNA 0.1、0.3、0.6和1％的重量比添加至含有RNA的柠檬酸盐缓冲液中以分别产生F151、F152、F153和F154。所有制剂都含有0.5w/w％PEG400。N:P比率在3.5-10.0的范围内。
实施例23.
分别通过替换F2和F3中的504，如表5中所述，使用521制备LNP制剂F159和F156。
分别通过替换F2和F3中的504，如表5中所述，使用522制备LNP制剂F157和F158。
实施例24：以如表18中所述的摩尔比将脂质赋形剂溶解在乙醇中。通过将mRNA和gRNA(在1:1重量比下)溶解在50mM柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5-6)中来制备总RNA水性混合物。接着通过使用微流体混合器以3:1的比率将水性流与乙醇流快速混合来配制LNP F151A和F160-F171。N与P的比率保持在3至12之间。将LNP收集在含有按体积计10-25％的最终乙醇浓度的水性缓冲液中，并且在4-6℃下保持1分钟至120分钟，随后使用透析盒(10KDa截断值膜)相对于DPBS来膜透析至少18h。使用Ribogreen定量测定分析获得的纳米颗粒的包埋RNA％，并且通过动态光散射(DLS)测量平均直径(Z平均值)。LNP F151A和F160-F171的包埋百分比和平均粒度(Z平均值)表列在表18中。在表征之后，以0.125mg/kg总RNA剂量通过眶后注射将LNP F151A和F160-F165施用至野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)并在给药之后4天评估小鼠肝中的PCSK9基因编辑％，并且编辑数据显示于图20中。F151A作为参考LNP以相同剂量施用。如实施例13中所述进行体内研究和编辑分析。
表18：LNP F151A和F160-F171的脂质组成和生理化学特征。
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如上(表18)所述配制表19中所示的包封小鼠PCSK9 gRNA GA256和ABE mRNAMA004的LNP制剂F172-F177，并且相对于pH 7.5的50mM Tris来透析。在表征之后，以0.1mg/kg总RNA剂量通过眶后注射将LNP F172-F177施用至野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)并在给药之后4天评估小鼠肝中的PCSK9基因编辑％，并且编辑数据显示于图21中。如实施例13中所述进行体内研究和编辑分析。
表19：LNP F172-F177的脂质组成和生理化学特征。
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如上(表18)所述制备表20中所示的包封小鼠PCSK9 gRNA GA256和ABE mRNAMA004的LNP制剂F151A和F178-181，并且相对于pH 7.5的50mM Tris来透析。LNP F179使用X型混合器制备，并且水性流与乙醇流的混合比保持在3:1的比率。使用TFF来更换LNP F172的缓冲液(pH 7.5的50mM Tris)。如上(表18)所述制备表20中所示的包封小鼠PCSK9 gRNAGA257和ABE mRNA MA004的LNP制剂F151B和F193A-F193C，并且相对于pH 7.5的50mM Tris来透析。LNP F151B包含PEG-脂质507，并且在LNP F193A中，用PEG-脂质VP177替换PEG-脂质507；在LNP F193C中，用VP177替换F193B的PEG-脂质507。LNP F193B和F193C用氨基脂质VL422配制。在表征之后，以0.1mg/kg总RNA剂量通过眶后注射将F151A、F151B、F172、F178-F181和F193A-F193C LNP施用至野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)，并且在给药之后4天评估小鼠肝中的PCSK9编辑％；编辑数据显示于图22A和图22B中。如实施例13中所述进行体内研究和编辑分析。将包含PEG-脂质VP159的LNP对小鼠中的编辑的影响与具有如表20中所示的类似赋形剂组成和氨基脂质的用PEG-脂质507构成的相应LNP进行比较。
表20：LNP F151A、F172和F178-F181的脂质组成和生理化学特征。
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如上(表18)所述使用氨基脂质VL473A制备表21中所示的包封小鼠PCSK9 gRNAGA256和ABE mRNA MA004的LNP制剂F182-186，并且相对于pH 7.5的50mM Tris来透析。在表征之后，以0.1mg/kg总RNA剂量通过眶后注射将LNP F82-F186施用至野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)并在给药之后4天评估小鼠肝中的PCSK9编辑％，并且如实施例13中所述进行体内研究和编辑分析。单个动物的肝中的PCSK9基因编辑表列在表21中。
表21：LNP F182-F186的脂质组成和生理化学特征。
/>
如上所述使用氨基脂质502、VL422、VL454、VL455和VL472A以及PEG-脂质507和VP154制备表22中所示的包封小鼠指导RNA GA256、GA257和GA010以及mRNA MA004的LNP制剂F194-F220、F220A、F220B和F220C。在表征之后，以0.1mg/kg总RNA剂量通过眶后注射将LNP F209-F220施用至野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)并在给药之后4天评估小鼠肝中的PCSK9编辑％，并且单个动物的基因编辑表列在表22中。如实施例13中所述进行体内研究和编辑分析。
表22.LNP F151和F194-F220的脂质组成和生理化学特征。
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实施例25：使用X型混合器配制LNP F188和F190-F193。使用TFF来更换缓冲液(pH7.5的50mM Tris)。在LNP F188和F192制剂中引入PEG400。通过在1小时内静脉内输注来将LNP制剂F188和F190-F193施用至食蟹猴(n＝3)。进行2周研究以评估通过施用LNP，使用指导RNA GA067和mRNA MA004对食蟹猴中ANGPTL3基因的编辑(图23A)。通过静脉内输注将MA004/GA067 LNP施用至食蟹猴，目的是产生对肝中ANGPTL3基因的靶向腺嘌呤碱基编辑。在施用测试物品之后两周，动物经受尸检以收集肝样品，并且将样品在-86至-60℃下储存。通过下一代测序分析剪接位点编辑，从而确认发生碱基变化。以1.5mg/kg(n＝3)施用LNP制剂F188和F192以评估和比较3mol％的PEG-脂质507和VP159在NHP中的影响(图23A)。各自包含氨基脂质VL422的LNP制剂F190和F191在2mg/kg剂量(n＝3)下显示约45％腺嘌呤碱基编辑。每种LNP在赋形剂组成方面不同。
表23.F188、190-F193、F190A和F190B的脂质组成和生理化学特征。
使用X型混合器，从氨基脂质VL422、mRNA MA004和gRNA GA347制备LNP制剂190A和F190B(表23)。使用TFF来更换缓冲液(pH 7.5的50mM Tris)。F190A和F190B分别包含PEG-脂质507和VP159。如上所述进行2周研究以评估通过施用LNP，使用指导RNA GA347和mRNAMA004对食蟹猴中ANGPTL3基因的编辑(图23B)。
实施例26.通过将相应脂肪醇与LNP赋形剂预混合来制备表24中所示的包封小鼠PCSK9 gRNA GA055和spCAS9 mRNA MS004的LNP制剂F122A、F221-F226和F226A-F226C，并且如实施例24中所述制备制剂。在配制后，将LNP F122A和F221-F226相对于pH 7.5的50mMTris来透析。在表征之后，通过眶后注射将LNP F122A和F221-F226施用至野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)；评估小鼠肝中的PCSK9编辑百分比，并且编辑数据显示于图24A中。F122A以0.5和0.25mg/kg RNA剂量给药，并且F221-F226以0.25mg/kg的RNA剂量给药。如实施例13中所述进行体内研究和编辑分析。在单独研究中，通过眶后注射将LNP F122A和F226A-F226C施用至野生型C57BL/6雌性小鼠(n＝5)；并且评估小鼠肝中的PCSK9编辑百分比，并且编辑数据显示于图24B中。
表24：LNP F122A、F221-F226和F226A-F226C的脂质组成和生理化学特征。
实施例27.VL454、VL455、VL472A、VL473A和VL474A的合成
方案8
在25-30℃下，向化合物22(1.0g，1.11mmol)在二氯甲烷(DCM，10mL)中的搅拌溶液中添加氯甲酸4-硝基苯酯(0.67g，3.33mmol)和吡啶(0.26mL，3.33mmol)，随后添加DMAP(0.067g，0.55mmol)。将所得反应混合物搅拌5h，并且添加7B(0.94g，6.66mmol)；在25-30℃下将其再搅拌16h。在反应完成之后，将混合物用水(20mL)稀释，并且萃取至DCM(2×50mL)中。分离有机层，减压浓缩，并且将粗品通过硅胶柱来纯化，使用80％EtOAc/己烷作为洗脱剂，以提供呈淡黄色粘稠液体的VL454(产率：0.32g，26.8％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm4.90-4.80(m,2H),δ4.199-4.119(m,8H),2.52-2.41(m,6H),2.40-2.31(m,8H),1.98-1.82(m,3H),1.72-1.58(m,13H),1.56-1.45(m,10H),1.41-1.33(m,9H),1.31-1.26(m,48H),0.98-0.85(t,12H)。MS m/z：[M+H]+计算值：1064.8；实测值：1065.0。
通过遵循VL454合成方法，从化合物22和7E合成VL455以产生淡黄色粘稠液体(产率：0.30g，25.4％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 4.90-4.80(m,2H),δ4.199-4.119(m,8H),2.61-2.48(m,5H),2.50-2.31(m,6H),2.40-2.31(m,8H),1.98-1.82(m,2H),1.72-1.68(m,8H),1.56-1.45(m,8H),1.41-1.33(m,10H),1.31-1.26(m,44H),0.98-0.85(t,12H)。MSm/z：[M+H]+计算值：1079.9；实测值：1079.9。
通过遵循VL454合成方法(如方案8中所述)，从化合物22和7F合成VL472A以产生淡黄色粘稠液体(产率：0.30g，25.4％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.90-4.80(m,2H),δ4.199-4.119(m,8H),2.71-2.70(t,2H),2.58-2.55(t,2H),2.40-2.31(m,3H),2.32-2.5(m,17H),1.72-1.68(m,8H),1.56-1.45(m,8H),1.41-1.33(m,57H),0.98-0.85(t,12H)。MS m/z：[M+H]+计算值：1067.9；实测值：1067.9。
通过遵循VL454合成方法，从化合物22和7G合成VL473A以产生淡黄色粘稠液体(产率：0.35g，30.0％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.17(s,1H),4.90-4.80(m,2H),δ4.199-4.119(m,6H),3.32-3.26(t,2H),2.66(s,6H),2.41-2.26(m,8H),1.72-1.68(m,9H),1.51-1.45(m,9H),1.41-1.33(m,60H),1.22-1.09(m,7H),0.98-0.85(t,12H)。MS m/z：[M+H]+计算值：1051.9；实测值：1051.9。
通过遵循VL454合成方法，从化合物22和7H合成VL474A以产生淡黄色粘稠液体(产率：0.35g，30％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.90-4.80(m,2H),δ4.199-4.119(m,6H),2.80-2.77(t,2H),2.62-2.48(m,6H),2.41(m,1H),2.31-2.28(m,8H),1.71-1.59(m,10H),1.61-1.41(m,9H),1.41-1.31(m,9H),1.32-1.21(m,50H),1.01-0.99(t,6H),0.98-0.85(t,12H)。MS m/z：[M+H]+计算值：1022.8；实测值：1022.8。
实施例28.VL459、VL460、VL471A、VL475A和VL476A的合成。
如方案9中所示以及如实施例27中所述来合成VL459、VL460、VL471A、VL475A和VL476A。
方案9
VL459从化合物20和7B制备，并且以淡黄色粘稠液体形式分离(0.26g，产率：14.2％)。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ0.84-0.86(t,9H),1.23-1.32(m,44H),1.42-1.59(m,6H),1.62-1.69,(m,14H),1.96-2.01(m,2H),2.28-2.31(m,8H),2.31-2.35(m,1H),2.401-2.51(m,6H),4.03-4.08(t,2H),4.13-4.22(m,8H),4.84-4.88(m,1H)。MS m/z：[M+H]+计算值：952.74；实测值：952.52。
VL460从化合物20和7E制备，并且以淡黄色粘稠液体形式分离(0.42g，产率：22.7％)。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ0.84-0.86(t,9H),1.23-1.32(m,44H),1.42-1.59(m,4H),1.62-1.69,(m,10H),1.83-1.91(m,2H),2.25-2.31(m,12H),2.31-2.34(m,2H),2.40-2.48(m,8H),4.03-4.07(t,2H),4.11-4.21(m,8H),4.81-4.90(m,1H)。MS m/z：[M+H]+计算值：967.7；实测值：967.9。
VL471A从化合物20和7F制备，并且以淡黄色粘稠液体形式分离(0.21g，产率：11％)。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ0.838-0.855(t,9H),1.225-1.317(m,44H),1.416-1.550(m,5H),1.589-1.668,(m,9H),2.258-2.418(m,18H),2.535-2.552(t,2H),2.612-2.634(t,2H),2.692-2.731(t,2H),4.033-4.078(t,2H),4.128-4.255(m,8H),4.843-4.905(m,1H)。MS m/z：[M+H]+计算值：955.7；实测值：955.6。
VL475A从化合物20和7G制备，并且以淡黄色粘稠液体形式产生(0.42g，产率：22.7％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.84-0.86(t,9H),1.03-1.14,(m,6H),1.26-1.34(m,44H),1.42-1.50(m,4H),1.62-1.64,(m,11H),1.60-1.78(m,2H),2.26-2.30(m,9H),2.32-2.65(m,6H),3.29(t,2H),4.04-4.12(m,8H),4.85-4.88(t,1H),6.16(t,1H)。MS m/z：[M+H]+计算值：939.7；实测值：939.9。
VL476A从化合物20和7H制备，并且以淡黄色液体形式纯化(0.28g，产率：16.3％)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ0.84-0.86(t,9H),0.87-0.88(t,6H),1.23-1.38(m,44H),1.50-1.60(m,4H),1.61-1.67,(m,13H),2.27-2.31(m,8H),2.32-2.35(m,1H),2.47-2.53(m,6H),2.78-2.79(t,2H),4.04-4.08(t,2H),4.13-4.12(m,6H),4.84-4.90(m,1H)。MS m/z：[M+H]+计算值：910.7；实测值：910.9。
实施例29.PEG-脂质VP159的合成
方案10A
方案10B
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在20-25℃下，向化合物145(6.5g，10.77mmol)在DCM(10mL)中的搅拌溶液中逐滴添加吡啶(1.73mL，21.54mmol)；接着将化合物146(7.82g，43.08mmol)添加至搅拌溶液中。在室温(RT)下将反应混合物搅拌6h。在反应完成之后，将反应混合物减压浓缩，并且将粗品通过硅胶柱色谱法(Combi-flash)来纯化，使用5％EtOAc/己烷作为洗脱剂，以提供呈无色液体的化合物147(5.4g，84.60％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.251-5.22(m,1H),δ4.22-4.12(m,1H),4.10-4.08(m,1H),3.62-3.54(m,3H),3.54-3.39(m,6H),2.46-2.43(m,2H),1.62-1.57(m,5H),1.50(s,9H),1.30(m,47H),0.98-0.85(m,6H)。
向化合物147(5.0g，76.21mmol)在DCM(25mL)中的搅拌溶液中添加甲酸(40mL)，并且在20-25℃下将反应混合物搅拌4h。将反应混合物浓缩以移除甲酸，并且与甲苯在减压下共蒸发以产生化合物148，其可不经进一步纯化即用于下一步骤中。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.33-5.31(m,1H),4.23-4.11(m,3H),3.61-3.56(m,4H),3.49-3.42(m,8H),2.61-2.56(m,3H),1.56(m,6H),1.27(m,59H),0.90-0.87(m,6H)。
在冰冷的温度下，向化合物148的搅拌溶液中添加HBTU(1.98g，4.999mmol)，随后在惰性氛围下添加在无水DCM(20mL)中的HOBt水合物(0.26g，0.9984mmol)。在冰冷的温度下将混合物搅拌10min，并且添加化合物149(7.141g，3.328mmol)在经分子筛干燥的无水DCM(10mL)中的溶液，随后逐滴添加DIPEA(1.73mL，9.984mmol)。在冰冷的温度下将所得混合物再搅拌10min，移除冷却浴；在室温下将混合物搅拌16h。将反应混合物浓缩以得到粗产物，将其通过反相柱色谱法来纯化，使用乙腈/水作为流动相，以提供呈灰白色固体的所需产物VP159(1.5g，16％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.34-5.33(m,1H),4.26-4.20(m,2H),4.19-4.16(m,1H),4.10-4.06(m,1H),3.83-3.80(m,1H),3.74-3.55(m,176H),3.55-3.54(m,5H),3.47-3.41(m,7H),3.38(s,3H),2.58-2.55(m,2H),1.56-1.53(m,4H),1.29-1.25(m,44H),0.89-0.86(t,6H)。平均质量m/z：[M+Na]+计算值：2732.0，实测值：2732.1。
实施例30.PEG-脂质VP161和VP162的合成
方案11
在室温下，向化合物145(3.0g，0.0046mol)在DCM(30mL)中的搅拌溶液中添加吡啶(0.74mL，0.0092mol)。向以上溶液中添加化合物150(11.98g，0.0069mol)，并且在25℃下继续搅拌12h。将反应混合物减压浓缩，并且将粗化合物通过柱色谱法(中性氧化铝)来纯化，使用80％EtOAc/己烷作为洗脱剂，以提供呈灰白色固体的化合物VP161(5.35g，产率：51.9％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.13(t,J＝5.6Hz,1H),3.86-3.99(m,2H),3.47-3.57(m,4H),3.30-3.49(m,146H),3.07-3.11(m,2H),2.39-2.49(m,2H),1.45-1.55(m,4H),1.45(s,9H),1.20-1.45(m,43H),0.75-0.85(m,6H)。
在冰冷的温度下，向VP161(5.0g，2.2mmol)在DCM(10mL)中的搅拌溶液中添加甲酸(35mL)，并且在室温下将所得反应混合物搅拌6h。将反应混合物浓缩以移除甲酸，并且与甲苯在减压下共蒸馏以得到呈灰白色固体的所需粗产物VP162(4.28g，产率：89.16)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.27(bs,1H),4.06-4.20(m,4H),3.75-3.85(m,3H),3.50-3.70(m,144H),3.30-3.50(m,6H),2.59(t,J＝6Hz,2H),1.53-1.56(m,4H),1.20-1.30(m,45H),0.80-0.90(m,6H)。MS m/z：[M+H]+计算值：2185.4；实测值：2185.0。
实施例31.PEG-脂质VP163、VP164、VP165、VP166和VP177的合成
方案12
在室温下，向硬脂酸(430mg，1.51mmol)在DCM(8.6mL)中的搅拌溶液中添加HOBt(20.4mg，0.15mmol)。在冰冷的温度下，向这个反应混合物中添加HBTU(720.5mg，1.81mmol)，随后添加DIPEA(0.78mL，4.53mmol)。接着在冰冷的温度下添加化合物150(2.61g，1.51mmol)在DCM(2.1mL，5体积)中的溶液，并且在室温下将所得反应混合物搅拌4h。向反应混合物中添加水(30.0mL)，并且用DCM(2×30mL)萃取。将有机层用盐水(30.0mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并且将滤液减压蒸发以得到所需粗品。将粗品通过硅胶柱色谱法(CombiFlash)来纯化，使用10％MeOH/DCM作为洗脱剂，以提供呈灰白色固体的VP163(2.31g，产率：76.74％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.30-6.40(bs,1H),3.38-3.72(m,151H),2.68(bs,3H),2.49(t,J＝8.8Hz,2H),2.19(t,J＝9.6Hz,2H),1.61-1.64(m,4H),1.45(s,9H),1.20-1.45(m,29H),0.80-0.85(m,3H)。MS m/z：[M+Na]+计算值：2019.3；实测值：2019.0。
遵循VP162的合成方法(方案11)合成PEG-脂质VP164。VP164以灰白色固体形式分离(1.81g，产率：88.72％)。6.25(bs,1H),3.54-3.81(m,144H),3.42-3.47(m,3H),2.59(t,J＝6.4Hz,2H),2.17(t,J＝7.6Hz,2H),1.40-1.63(m,4H),1.20-1.45(m,27H),0.80-0.85(m,3H)。MS m/z：[M+H]+计算值：1941.2；实测值：1941.0。
遵循与VP164相同的合成方法，通过使化合物150和花生酸反应来分离呈灰白色固体的PEG-脂质VP165(2.52g，产率：89.0％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.38(bs,1H),3.38-3.72(m,132H),2.47-2.57(m,4H),2.19(t,J＝9.6Hz,1H),1.61-1.64(m,1H),1.43(s,9H),1.20-1.24(m,29H),0.80-0.85(m,3H)。MS m/z：[M+Na]+计算值：2047.3；实测值：2047.0。
遵循与实例VP164相同的合成方法，分离呈灰白色固体的PEG-脂质VP166(2.52g，产率：89.0％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):6.29(bs,1H),5.03(bs,3H),3.54-3.82(m,146H),3.44-3.46(m,3H),2.59(t,J＝6Hz,2H),2.18(t,J＝7.6Hz,2H),1.59-1.63(m,2H),1.25-1.35(s,32H),0.80-0.85(m,3H)。MS m/z：[M+H]+计算值：1969.2；实测值：1969.0。
如实施例33中所述以及根据方案10B来合成PEG-脂质VP177。PEG-脂质VP177以灰白色固体形式分离。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.345-5.309(m,1H),4.33-4.30(m,2H),4.25-4.21(m,1H),4.15-4.10(m,1H),4.01-4.00(m,1H),3.84(m,1H),3.73-3.70(m,3H),3.67-3.65(m,168H),3.57-3.54(m,5H),3.50-3.42(m,8H),3.39(s,3H),1.57-1.54(m,5H),1.30-1.26(m,46H),0.90-0.87(t,6H)。MS m/z：[M+H/2]+计算值：1227.0；实测值：1227.0。
实施例32.氨基脂质VL509、VL510和VL511的合成方案13.
向800(3g，4.23mmol)和801(871mg，8.46mmol)在DCM(60mL)中的搅拌溶液中添加EDC.HCl(1.61g，8.46mmol)和DMAP(774mg，6.34mmol)。在室温下将反应搅拌18h。将反应用DCM(100mL)稀释，并且用水(100mL)洗涤。分离有机层，并且用盐水洗涤，接着经Na2SO4干燥，过滤并在真空下蒸发。将粗产物溶于EtOAc(100mL)中，并且用1N HCl(50mL)处理，接着将有机层用饱和NaHCO3溶液(50mL)洗涤，随后用盐水洗涤，接着经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下蒸发以获得呈无色液体的VL509(2.32g，70％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.87-4.84(m,1H),4.23-4.12(br m,2H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.17(s,2H),2.52-2.49(br m,5H),2.35(s,6H),2.30-2.25(m,4H),2.05-2.00(m,3H),1.64-1.49(m,12H)1.30-1.25(m,48H),0.89-0.86(m,9H)。MS m/z：[M+H]+计算值：795.71；实测值：795.83。
如对于氨基脂质VL509的合成所述，从化合物800和802合成呈淡黄色液体的氨基脂质VL510。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.87-4.84(m,1H),4.14(t,J＝6.4Hz,2H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),2.67-2.59(m,4H),2.49-2.41(m,6H),2.30-2.25(m,4H),2.24(s,6H),1.64-1.49(m,14H)1.30-1.25(m,48H),0.89-0.85(m,9H)。MS m/z：[M+H]+计算值：809.73；实测值：809.84。
如对于氨基脂质VL509的合成所述，从化合物800和803合成呈无色液体的氨基脂质VL511。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.87-4.84(m,1H),4.13(t,J＝6.4Hz,2H),4.07(t,J＝6.8Hz,2H),2.69(t,J＝6.4Hz,2H),2.45-2.30(m,8H),2.30-2.25(m,10H),1.84-1.83(m,2H),1.63-1.30(m,14H)1.30-1.25(m,48H),0.89-0.85(m,9H)。MS m/z：[M+H]+计算值：823.74；实测值：823.93。
实施例33.氨基脂质VL512和VL513的合成
方案14.
向化合物804(1g，1.43mmol)在DCM(10mL)中的溶液中添加氯甲酸4-硝基苯酯(578mg，2.87mmol)，随后添加DIPEA(0.5mL，2.87mmol)和DMAP(35mg，0.286mmol)，并且将反应持续4h。在反应完成之后，添加化合物7G(1.1g，8.58mmol)。在16h之后，将反应混合物用DCM和水稀释；分离有机层，并且蒸发以得到粗品，将其通过硅胶柱来纯化，用5％EtOAc和石油醚洗脱，以得到呈黄色油状物的VL512(320mg，26％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.2(bs,1H),5.37-5.34(m,4H),4.48(t,1H),4.20-4.13(m,6H),3.57-3.54(m,2H),3.41-3.38(m,2H),3.3-3.26(m,2H),2.76(t,2H),2.75-2.28(m,10H),2.07-2.02(m,4H),1.92-1.91(m,2H),1.6-1.52(m,8H),1.37-.127(m,35H),1.06(m,6H),0.89-0.86(m,9H)。MS m/z：[M+H]+计算值：851.5；实测值：851.5。
如对于氨基脂质VL512的合成所述，从化合物804和805合成呈无色液体的氨基脂质VL513(300mg，24.9％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.36-5.34(m,4H),4.48(t,1H),4.20-4.12(m,6H),3.57-3.54(m,2H),3.41-3.38(m,2H),3.25-3.15(m,2H),2.77(t,2H),2.60-2.45(m,5H),2.43-2.34(m,3H),2.30(t,2H),2.1-2.0(m,4H),1.92-1.91(m,2H),1.6-1.52(m,8H),1.37-.127(m,35H),1.06(m,6H),0.89-0.86(m,9H)。MS m/z：[M+H]+计算值：837.7；实测值：837.7。
实施例34.氨基脂质VL514和VL515的合成
方案15
在室温下，向化合物806(0.44g，0.28mmol)在DCM(8mL)中的搅拌溶液中添加801(0.06g，0.56mmol)，随后添加HATU(0.22g，0.58mmol)和DMAP(0.05g，0.42mmol)，接着搅拌16h。将反应混合物用DCM(50mL)稀释，并且用水(25mL)、盐水(25mL)洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并蒸发以得到粗化合物。将获得的粗化合物首先通过硅胶柱来纯化，用3％MeOH/DCM洗脱，接着通过制备型HPLC(流动相A：10MM甲酸铵水溶液，流动相B：乙腈/异丙醇(10:90))来进一步纯化以获得呈淡黄色胶状液体的氨基脂质VL514(0.086g，19％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 4.32(t,2H),4.06(t,4H),3.78(s,2H),3.26(t,2H),3.04(br s,4H),2.83(s,6H),2.33-2.25(m,4H),1.73-1.58(m,8H),1.47-1.25(m,52H),0.89-0.88(m,12H)。MS m/z：[M+H]+计算值：809.6；实测值：809.6。
如对于氨基脂质VL514的合成所述，从化合物806和802合成呈无色液体的氨基脂质VL515(0.49g，33％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm 4.30(t,2H),4.06(t,4H),3.49(t,2H),3.29(t,2H),3.07(br s,4H),2.95(s,8H),2.32-2.28(m,2H),2.21(br s,2H),1.71-1.54(m,12H),1.47-1.25(m,48H),0.89-0.86(m,12H)。MS m/z：[M+H]+计算值：823.6；实测值：823.6。
实施例35.氨基脂质VL516的合成
在0℃下，向化合物806(50g，412mmol)在DCM(1000mL)中的搅拌溶液中添加TBDMS-Cl(224g，1480mmol)，并且添加咪唑(210.8g，3100mmol)。将反应混合物升温至27℃，并且搅拌16h。在完成后，将反应混合物过滤，并且将母液用饱和NaHCO3溶液、水和盐水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩以得到粗化合物，将其用硅胶(230-400目)柱色谱法纯化，用5％EtOAc/石油醚洗脱。收集含有产物的级分，并且减压浓缩以提供呈无色液体的化合物807(100g，产率：49.6％)。在0℃下，向化合物808(36g，215.84mmol)在DCM(1500mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(113mL，647.5mmol)和HATU(123.2g，324.14mmol)。在10min之后，添加807(100g，215.84mmol)。接着，使反应混合物升温至27℃，并且搅拌16h。在完成后，真空移除所有挥发物，并且将残余物用EtOAc稀释。将有机层用饱和NaHCO3溶液、水、盐水洗涤，并且经Na2SO4干燥，过滤并浓缩以得到所需809(108g，74％)。在0℃下，向809(20g，34.72mmol)在THF(300mL)中的搅拌溶液中添加TBAF(1M的THF溶液)(121.5mL，121.52mmol)。将反应混合物升温至27℃，并且搅拌2h以得到中间体809A。向反应混合物中添加EDC.HCl(26.6g，138.8mmol)、亚油酸(38.95g，138.88mmol)和DMAP(850mg，6.94mmol)，在27℃下将所得混合物搅拌16h。在完成后，真空移除所有挥发物，并且将残余物用硅胶(230-400目，用氨中和)柱色谱法纯化，用40-50％EtOAc/石油醚洗脱。收集含有产物的级分，并且减压浓缩以提供呈微黄色浓稠液体的氨基脂质VL516(5.1g，产率：14.4％)。MS m/z：[M+H]+计算值：1022.61；实测值：1022.32。
方案16.
实施例36.氨基脂质VL517的合成
在室温下，向(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-醇(20g，75.1mmol)在DCM(200mL)中的搅拌溶液中添加二氢呋喃-2,5-二酮(9g，90.2mmol)和DMAP(11.9g，97.7mmol)，并且搅拌2h。在完成后，将反应混合物用1N HCl酸化，并且萃取至DCM中。将有机层用水、盐水洗涤，并且经Na2SO4干燥，过滤并浓缩以得到所需化合物810(20g，70％)。向810(8g，13.9mmol)在THF(150mL)中的搅拌溶液中，将EDC.HCl(13.2g，69.4mmol)、DMAP(338mg，2.7mmol)和809A(20.3g，55.5mmol)添加至反应混合物中，并且在27℃下将所得混合物搅拌16h。在完成后，真空移除所有挥发物，并且将残余物用硅胶(230-400目，用三乙胺中和)柱色谱法纯化，用40-50％EtOAc/石油醚洗脱。接着将获得的化合物通过制备型HPLC来纯化，收集含有产物的级分，并且减压浓缩，随后冷冻干燥以提供呈黄色液体的氨基脂质VL517(1.4g，产率：8％)。MS m/z：[M+H]+计算值：1280.88；实测值：1280.05。
方案17.
实施例37.氨基脂质VL518的合成
在0℃下，向化合物808(7.03g，41.95mmol)在THF(60mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(16.6mL，95.35mmol)，随后添加DCC(15.7g，76.28mmol)。接着在室温下将反应混合物搅拌15min。接着在0℃下添加化合物810A(5g，38.14mmol)。在室温下将所得反应混合物搅拌4h。在反应完成之后，将反应混合物过滤，接着将滤液在水(150mL)与DCM(3×150mL)之间分配。将有机层用饱和氯化铵溶液(2×80mL)和饱和盐水溶液(2×80mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，蒸发以提供化合物811(粗品，呈灰白色浓稠油状液体)。粗品811不经任何进一步纯化即直接用于下一步骤中。在室温下将811(7g，28.66mmol)和乙酸(120mL，80％，在水中)搅拌16h。将反应混合物在真空下蒸发。将所得白色固体溶解在水(50ml)中，并且在室温下搅拌15min并过滤。收集所得滤液，并且在真空下蒸发以提供呈粘稠油状物的化合物812(6g，粗品)。在0℃下，向粗品812(6g，29.39mmol)和亚油酸(16.47g，73.47mmol)在DCM(80mL)中的搅拌溶液中添加EDC.HCl(11.26g，58.78mmol)、DIPEA(12.7mL，73.47mmol)和DMAP(1.79g，14.69mmol)。在室温下将反应混合物搅拌16h。将反应混合物在水(100mL)与DCM(3×150mL)之间分配。将有机层用饱和盐水(2×80mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，减压蒸发以得到粗品，将其通过制备型HPLC来进一步纯化，以提供呈黄色胶状物的氨基脂质VL518。MS m/z：[M+H]+计算值：729.61；实测值：729.3。
方案18.
实施例38.氨基脂质VL519和VL520的合成方案19.
向化合物813(5g，22mmol)和化合物814(6.46g，45mmol)在DCM(100mL)中的搅拌溶液中添加EDC.HCl(4.3g，22mmol)和DMAP(547mg，4.5mmol)。在室温(RT)下将反应搅拌18h。将反应用DCM(100mL)稀释，并且用饱和NaHCO3水溶液(50mL)萃取。分离有机层，并且用盐水洗涤，接着经Na2SO4干燥，过滤并在真空下蒸发。将残余物通过硅胶柱色谱法来纯化，使用0-10％EtOAc/石油醚作为洗脱剂，以获得呈无色液体的化合物815(5g，64％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.06(t,J＝6.8Hz,2H),3.40(t,J＝7.2Hz,2H),3.40(t,J＝7.6Hz,2H),2.29(t,J＝7.6Hz,2H),1.85(m,2H),1.72-0.97(m,22H),0.88(m,J＝6.8Hz,3H)。向化合物815(7g，20mmol)在乙醇(28mL)中的溶液中添加化合物816(6.04g，80mmol)，并且在60℃下加热36h。在完成之后，将反应混合物用石油醚(50mL)和水(50mL)稀释。接着分离有机层，并且用盐水溶液洗涤。将所得分离的有机层经无水Na2SO4干燥，并且将残余溶剂在高真空下蒸发。将粗产物溶于戊烷(25mL)中，并且冷却至-78℃。将沉淀的固体过滤，并且用冷戊烷(2×，20mL)洗涤。将固体真空干燥以得到呈灰白色半固体的氨基脂质VL519(2.1g，30％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.07(t,J＝6.8Hz,2H),3.58(t,J＝5.6Hz,2H),2.52(t,J＝5.6Hz,2H),2.40(t,J＝7.2Hz,2H),2.31(t,J＝7.6Hz,2H),2.23(S,3H),1.63-1.58(m,4H),1.49-1.46(m,2H),1.46-1.27(m,18H),0.89(t,J＝6.4Hz,3H)。MS m/z：[M+H]+计算值：344.31；实测值：344.36。
遵循与VL520相同的合成方案，如方案19中所示合成氨基脂质VL520。氨基脂质VL520以灰白色半固体形式分离(3.5g，44％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.07(t,J＝6.8Hz,2H),3.63(t,J＝5.6Hz,4H),2.67(t,J＝5.6Hz,4H),2.54(t,J＝7.2Hz,2H),2.31(t,J＝7.6Hz,2H),1.84-1.83(m,4H),1.59-1.48(m,2H),1.46-1.27(m,18H),0.89(t,J＝6.4Hz,3H)。MS m/z：[M+H]+计算值：374.32；实测值：374.37。
实施例39.如实施例24中所述配制和表征LNP F227-F234。LNP F227-F230使用氨基脂质502和PEG-脂质VP196-VP199配制。制剂F231-F234使用氨基脂质VL422和PEG-脂质VP196-VP199配制。F227-F234的脂质组成描述于表25中。
表25.F227-F234的脂质组成和生理化学特征。
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实施例40.在非人灵长类动物(NHP)中对含有氨基脂质422和454的LNP制剂的评估
使用X型混合器配制表26中所示的LNP F190A和F235-237。使用TFF进行缓冲液更换(pH 7.5的50mM Tris)。F235通过将混合后水性缓冲液中乙醇浓度改变成8％来制备。通过在1小时内静脉内输注来将LNP制剂F190A和F235-F237施用至食蟹猴(n＝3)。进行2周研究以评估通过施用使用指导RNA GA347和mRNA MA004构成的LNP对食蟹猴中ANGPTL3基因的编辑(图25)。将MA004/GA347 LNP施用至食蟹猴，目的是产生对肝中ANGPTL3基因的靶向腺嘌呤碱基编辑。在施用测试物品之后两周，动物经受尸检以收集肝样品，并且将样品在-86至-60℃下储存。通过下一代测序分析剪接位点编辑，从而确认发生碱基变化。以2mg/kg、1.5mg/kg以及以1mg/kg(n＝3)总RNA施用LNP制剂190A以评估NHP中VL422-LNP的编辑活性的剂量响应(图25)。LNP F235、F236和F237以2mg/kg给药(表26)。
所有动物研究(小鼠和猴)都由相应机构动物护理和使用委员会(IACUC)核准。
表26.F190A和F235-F237的脂质组成和生理化学特征。
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除肝编辑之外，在施用LNP制剂F190A和F235-F237后测量NHP(n＝3)中的血清ANGPTL3蛋白。在施用LNP前各种时间点(在-10、-7和-5天)以及在施用LNP后第15天收集全血样品以用于血清ANGPTL3蛋白分析。从收集的血液样品分离血清样品以用于ANGTPL3测量。对于分析ANGPT3蛋白水平，与重组食蟹猴ANGPTL3蛋白(10052-AN，R&D Systems)一起使用人ANGPTL3 ELISA试剂盒(DANL30，R&D Systems,Minneapolis,MN)以分析给药前血清样品和在LNP施用之后在第15天时收集的血清样品的蛋白质水平(根据制造商的说明书)。在第15天时经处理NHP中血清ANGPTL3水平从基线的变化百分比显示于图26中。
实施例41.如方案20中所说明完成PEG-脂质VP196、VP197、VP198和VP199的合成。
方案20.
PEG-脂质VP196：在氩气氛围下，向硬脂酸(3.0g，10.5mmol，1.0当量)在DCM(30mL)中的搅拌溶液中添加HBTU(6.0g，15.8mmol，1.5当量)，随后添加DMAP(0.26g，2.1mmol，0.2当量)。在10-15℃下将混合物搅拌30min，并且添加甘氨酸叔丁酯(146A，1.38g，10.5mmol，1.0当量)，随后逐滴添加DIPEA(4.68mL，26.7mmol，2.5当量)。在10-15℃下将混合物再搅拌10min，移除冷却浴，并且在室温(RT)下将混合物搅拌16h。在反应完成后，将反应混合物减压浓缩以得到粗产物，将其通过使用20-25％EtOAc/己烷进行的柱色谱法来纯化以提供呈白色固体的化合物818(3.32g，79.2％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm,5.91(s,1H),δ3.95-3.94(d,2H),2.24-2.21(t,2H),1.66-1.59(m,2H),1.48(s,9H),1.32-1.25(m,30H),0.90(m,3H)。在室温下，向中间体818(3.3g，8.3mmol)在DCM(18mL)中的搅拌溶液中添加甲酸(29mL)并搅拌16h，并且将混合物浓缩以移除甲酸；与甲苯在减压下共蒸发以得到呈白色固体的粗化合物819，其可不经进一步纯化即用于下一步骤中。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm,12.46(s,1H),δ8.08-8.05(m,1H),3.70-3.68(d,2H),2.10-2.06(m,2H),1.47-1.44(m,2H),1.38-1.27(m,30H),0.90(m,3H)。在10-15℃下，向化合物819(0.5g，1.46mmol，1.0当量)在无水DCM(5mL)中的搅拌溶液中添加HBTU(0.83g，2.19mmol，1.5当量)，随后在惰性氛围下添加HOBt水合物(0.06g，0.43mmol，0.3当量)。在10-15℃下将混合物搅拌30min，并且添加149A(2.92g，1.46mmol，1.0当量)在无水DCM(2.5mL，经分子筛处理)中的溶液，随后逐滴添加DIPEA(0.76mL，4.38mmol，3.0当量)。在10-15℃下继续再搅拌10min，移除冷却浴；在室温下将混合物搅拌16h。在完成后，将反应混合物浓缩以得到粗产物，将其通过使用20-25％MeOH/EtOAc进行的硅胶色谱法来纯化，随后通过使用40-50％乙腈/水进行的反相柱色谱法来纯化，以提供呈白色固体的所需产物VP196(0.63g，18.52％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm,6.09(t,1H),δ4.32-4.29(m,2H),4.08-4.07(d,2H),3.83-3.80(t,1H),3.74-3.66(m,185H),3.62-3.60(t,1H),2.78(s,1H),2.25-2.21(t,2H),1.93(s,6H),1.65-1.60(m,2H),1.29(s,30H),0.89-0.86(t,3H)。MS m/z：[M+H/2]+计算值：1250.28；实测值：1250.60。
PEG-脂质VP197：在10-15℃下，向化合物819(0.5g，1.46mmol，1.0当量)在无水DCM(5mL)中的搅拌溶液中添加HBTU(0.83g，2.19mmol，1.5当量)，随后在惰性氛围下添加HOBt水合物(0.06g，0.43mmol，0.3当量)。在10-15℃下将混合物搅拌30min，并且添加PEG化合物149(2.92g，1.46mmol，1.0当量)在无水DCM(2.5mL)中的溶液，随后逐滴添加DIPEA(0.76mL，4.38mmol，3.0当量)。在10-15℃下将混合物再搅拌10min，移除冷却浴；在室温下将混合物搅拌16h。与VP196类似地纯化和分离VP197，从而以白色固体形式来提供(0.82g，24.11％)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δppm,7.27(t,1H),δ4.31-4.29(m,2H),4.08-4.04(m,2H),3.82-3.80(m,1H),3.76-3.69(m,4H),3.65-3.64(d,172H),3.61-3.57(m,2H),3.56-3.45(m,1H),3.38(s,3H),2.25-2.21(t,3H),1.65-1.59(m,2H),1.29-1.24(m,29H),0.89-0.86(t,4H)。MS m/z：[M+H/2]+计算值：1257.29；实测值：1257.60。
PEG-脂质VP198：在惰性氛围下，向油酸(3.0g，10.6mmol，1.0当量)在DCM(30mL)中的搅拌溶液中添加HBTU(6.05g，15.9mmol，1.5当量)，随后添加DMAP(0.25g，2.1mmol，0.2当量)。在10-15℃下将混合物搅拌30min，并且添加甘氨酸叔丁酯(146A，1.39g，10.6mmol，1.0当量)，随后逐滴添加DIPEA(4.71mL，26.5mmol，2.5当量)。在10-15℃下将混合物再搅拌10min，移除冷却浴，并且在室温下将混合物搅拌16h。在完成后，将反应混合物浓缩以得到粗产物，将其通过使用20-25％EtOAc/己烷进行的硅胶柱色谱法来纯化以提供呈无色液体的化合物820(3.2g，76.5％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm,5.92(s,1H),δ5.38-5.30(d,2H),3.95-3.93(d,2H),2.24-2.20(t,2H),2.03-1.98(m,4H),1.66-1.60(m,3H),1.48(s,9H),1.30-1.27(m,22H),0.90(m,3H)。在20-25℃下，向中间体820(3.1g，7.8mmol，1.0当量)在DCM(15.5mL)中的搅拌溶液中添加甲酸(25mL)，并且搅拌16h。将反应混合物浓缩以移除甲酸，并且与甲苯在减压下共蒸发以得到呈白色固体的所需化合物821(2.6g，97.7％)，其可不经进一步纯化即用于下一步骤中。在10-15℃下，向821(0.5g，1.47mmol，1.0当量)在无水DCM(5mL)中的搅拌溶液中添加HBTU(0.84g，2.2mmol，1.5当量)，随后在氩气氛围下添加HOBt水合物(0.06g，0.43mmol，0.3当量)。在10-15℃下将混合物搅拌30min，并且添加PEG化合物149A(2.94g，1.47mmol，1.0当量)在无水DCM(2.5mL)中的溶液，随后逐滴添加DIPEA(0.77mL，4.41mmol，3.0当量)。在10-15℃下将混合物再搅拌10min，移除冷却浴；在室温下将混合物搅拌16h。以与VP196类似的方式纯化和分离VP198，从而以白色固体形式来提供(0.35g，10.2％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm,6.07(t,1H),6.06(m,2H),5.36-5.32(m,2H),4.32-4.29(t,2H),4.08-4.06(d,2H),3.83-3.80(t,1H),3.74-3.69(m,7H),3.66-3.64(d,178H),3.46-3.45(d,1H),2.25-2.19(m,4H),2.06-1.98(m,4H),1.65-1.60(m,2H),1.30-1.26(d,21H),0.89-0.86(t,3H)。MS m/z：[M+H/2]+计算值：1255.29；实测值：1255.7。
PEG-脂质VP199在10-15℃下，向821(0.5g，1.47mmol，1.0当量)在无水DCM(5mL)中的搅拌溶液中添加HBTU(0.84g，2.2mmol，1.5当量)，随后在氩气氛围下添加HOBt水合物(0.06g，0.43mmol，0.3当量)。在10-15℃下将混合物搅拌30min，并且添加mPEG化合物149(2.94g，1.47mmol，1.0当量)在无水DCM(2.5mL)中的溶液，随后逐滴添加DIPEA(0.77mL，4.41mmol，3.0当量)。在10-15℃下将混合物再搅拌10min，移除冷却浴；在室温下将混合物搅拌16h。以与VP198类似的方式纯化和分离VP199(0.680g，19.9％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm,6.08(s,1H),δ5.35-5.32(m,2H),4.32-4.30(m,2H),4.08-4.07(d,2H),3.83-3.80(m,2H),3.74-3.71(m,4H),3.66-3.64(d,182H),3.56-3.48(m,3H),3.47-3.46(m,1H),3.38(s,3H),2.25-2.21(t,2H),2.06-1.98(q,7H),1.66-1.62(t,2H),1.30-1.26(d,22H),0.89-0.86(t,3H)。MS m/z：[M+H/2]+计算值：1269.2；实测值：1255.5。
实施例42.使用X型混合器配制表27中所示的LNP F238和F239。使用TFF进行缓冲液更换(pH 8的50mM Tris)。LNP F238使用VL404配制，并且F239使用VL422作为氨基脂质配制。当使用相同的LNP组成和RNA有效载荷时，由氨基脂质VL404构成的LNP F238产生129.7nm的平均粒度，并且由氨基脂质VL422构成的F239产生75.6nm的平均粒度。通过在1小时内静脉内输注来将制剂F238和F239施用至食蟹猴(n＝3)。如实施例41中所述进行2周研究以评估通过施用使用指导RNA GA067和mRNA MA004构成的LNP对食蟹猴的肝中ANGPTL3基因的编辑(图27)。分别地，以3mg/kg施用LNP制剂F238，并且以2.6mg/kg总RNA施用F239。NHP的肝中的ANGPTL3编辑百分比说明于图27中。
表27.F238和F239的脂质组成和生理化学特征。
实施方案
非限制性实例实施方案：
1.一种具有式(I)的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R1和R2中的每一者独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、C3-C30杂烷基、C3-C30杂烯基、C3-C30杂炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C2-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的；
X、Y和Z中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-、-S-或键；
每个L独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-N＝CR4-、-CR4＝N-O-、-O-、-S-、-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
R3是-C0-C10亚烷基-NR7R8、-C0-C10亚烷基-杂环烷基或-C0-C10亚烷基-杂环芳基，其中所述亚烷基、杂环烷基和杂环芳基独立地是被取代的或未被取代的；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
R5是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
每个R6独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基，其中所述烷基、所述烯基和炔基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；
R7和R8中的每一者独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基，或R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环基；并且
n、m和q中的每一者独立地是0、1、2、3、4或5。
2.一种具有式(I*)的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R1是氢、C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、C3-C30杂烷基、C3-C30杂烯基、C3-C30杂炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C2-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的；
R2是氢、C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、C3-C30杂烷基、C3-C30杂烯基、C3-C30杂炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C2-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的；
X、Y和Z中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-R11C(＝O)N(R4)R9-、-NR7C(＝O)R9-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-R11C(＝O)OR9-、-R11OC(＝O)R9-、-R11OC(＝O)OR9-、-R11N(R4)C(＝O)OR9-、-R11OC(＝O)N(R4)R9-、-R11(NR4)C(＝O)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝NR4)R9-、-R11C(＝S)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝S)R9-、-R11C(＝S)OR9-、-R11OC(＝S)R9-、-R11OC(＝S)OR9-、-R11N(R4)C(＝S)OR9-、-R11OC(＝S)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝S)N(R4)R9-、-R11C(＝O)SR9-、-R11SC(＝O)R9-、-R11OC(＝O)SR9-、-R11N(R4)C(＝O)SR9-、-R11SC(＝O)N(R4)R9-、-R11C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)R9-、-R11SC(＝S)OR9-、-R11N(R4)C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)N(R4)R9-、-R11C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)R9-、-R11SC(＝O)SR9-、-R11SC(＝S)SR9-、-R11N(R4)C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)N(R4)R9-、-R11OR9-、-R11SR9-、-O-、-S-或键；
每个L独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-N＝CR4-、-CR4＝N-O-、-O-、-S-、-R11C(＝O)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝O)R9-、-R11C(＝O)OR9-、-R11OC(＝O)R9-、-R11OC(＝O)OR9-、-R11N(R4)C(＝O)OR9-、-R11OC(＝O)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝O)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝NR4)N(R4)R9-、-R11C(＝S)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝S)R9-、-R11C(＝S)OR9-、-R11OC(＝S)R9-、-R11OC(＝S)OR9-、-R11N(R4)C(＝S)OR9-、-R11OC(＝S)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝S)N(R4)R9-、-R11C(＝O)SR9-、-R11SC(＝O)R9-、-R11OC(＝O)SR9-、-R11N(R4)C(＝O)SR9-、-R11SC(＝O)N(R4)R9-、-R11C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)R9-、-R11SC(＝S)OR9-、-R11N(R4)C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)N(R4)R9-、-R11C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)R9-、-R11SC(＝O)SR9-、-R11SC(＝S)SR9-、-R11N(R4)C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)N(R4)R9-、-R11O-N＝CR9-、-R11C(R10)＝N-OR9-、-R11OR9-、-R11SR9-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-、-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
R3是-C0-C10亚烷基-NR7R8、-C0-C10亚烷基-杂环烷基或-C0-C10亚烷基-杂环芳基，其中所述亚烷基、杂环烷基和杂环芳基独立地是被取代的或未被取代的；
每个R4独立地是氢、被取代的或未被取代的C1-C16烷基或被取代的或未被取代的C1-C16杂烷基；
R5是氢或被取代的或未被取代的-C0-C10亚烷基-L-R4；
每个R6独立地是氢、C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基，其中所述烷基、所述烯基和炔基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；
R7和R8中的每一者独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C16烷基、被取代的或未被取代的C1-C16杂烷基，或R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环基；并且
每个R9独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C16亚烷基或未被取代的C1-C16亚杂烷基；
每个R10独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C16亚烷基或未被取代的C1-C16亚杂烷基；并且每个R11独立地是被取代的或未被取代的C1-C16亚烷基或未被取代的C1-C16亚杂烷基。
n、m和q中的每一者独立地是0、1、2、3、4或5。
3.如实施方案1或2所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述氨基脂质具有式(Ia)的结构，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R1和R2中的每一者独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、C3-C30杂烷基、C3-C30杂烯基、C3-C30杂炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C2-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的；
X、Y和Z中的每一者独立地是C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-、-S-、-C1-C10亚烷基-O-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
每个L独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-N＝CR4-、-CR4＝N-O-、-O-、-S-、-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
R3是-C0-C10亚烷基-NR7R8或-C0-C10亚烷基-杂环烷基，其中所述亚烷基和杂环烷基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
每个R6独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基，其中所述烷基、所述烯基和炔基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；并且
R7和R8中的每一者独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基，或R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环基。
4.如实施方案1至3中的任一者所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中X和Y各自独立地选自-C(＝O)O-和-OC(＝O)-。
5.如实施方案1至3中的任一者所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R1和R2各自独立地选自被取代的或未被取代的C3-C30烷基或被取代的或未被取代的C3-C30烯基。
6.如实施方案1至3中的任一者所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R1和R2各自独立地选自-C0-C10亚烷基-L-R6。
7.如实施方案6所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中L独立地是-C(＝O)O-或-OC(＝O)-。
8.如实施方案6所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R6是直链或支链C6-C20烷基。
9.如实施方案6所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R6是Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基。
10.如实施方案1至9中的任一者所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R1和/或R2包含非对称杂原子。
11.如实施方案1至10中的任一者所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中Z是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-或-O-，并且R4是氢或CH3。
12.如实施方案1至10中的任一者所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中Z是-OC(＝O)O-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-。
13.如实施方案1至12中的任一者所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R3是-C1-C6亚烷基-NR7R8。
14.如实施方案13所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R7和R8各自独立地是被取代的或未被取代的C1-C6烷基。
15.如实施方案13所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R7和R8各自是-CH2CH3。
16.如实施方案13所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的3-7元杂环烷基。
17.如实施方案1至12中的任一者所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R3是
18.如实施方案1所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述氨基脂质是
19.一种具有式(II)的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R1和R2中的每一者独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、C3-C30杂烷基、C3-C30杂烯基、C3-C30杂炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C1-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的；
X、Y和Z中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-、-S-或键；
每个L独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-N＝CR4-、-CR4＝N-O-、-O-、-S-、-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
R3是-C0-C10亚烷基-NR7R8、-C0-C10亚烷基-杂环烷基或-C0-C10亚烷基-杂环芳基，其中所述亚烷基、杂环烷基和杂环芳基独立地是被取代的或未被取代的；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
每个R6独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基，其中所述烷基、所述烯基和炔基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；
R7和R8中的每一者独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基，或R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环基；
a和b中的每一者独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；并且
m是0、1、2、3、4或5。
20.一种具有式(II*)的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R1和R2中的每一者独立地是氢、C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、C3-C30杂烷基、C3-C30杂烯基、C3-C30杂炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C1-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的；
X、Y和Z中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-C(＝O)-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-、-S-或键；
每个L独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-N＝CR4-、-CR4＝N-O-、-O-、-S-、-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
R3是氢、-C1-C6烷基、-C0-C10亚烷基-NR7R8、-C0-C10亚烷基-杂环烷基或-C0-C10亚烷基-杂环芳基，其中所述烷基、亚烷基、杂环烷基和杂环芳基独立地是被取代的或未被取代的；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
每个R6独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基，其中所述烷基、所述烯基和炔基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；
R7和R8中的每一者独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基，或R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环基；
a和b中的每一者独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；并且
m是0、1、2、3、4或5。
21.如实施方案19或20所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中a和b中的每一者独立地是3、4、5、6、7、8、9或10。
22.如实施方案19至21中的任一者所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中m是1、2、3、4或5。
23.如实施方案19至22中的任一者所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中X和Y各自独立地选自-C(＝O)O-和-OC(＝O)-。
24.如实施方案19至23中的任一者所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R1和R2各自独立地选自被取代的或未被取代的C3-C30烷基或被取代的或未被取代的C3-C30烯基。
25.如实施方案19至23中的任一者所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R1和R2各自独立地选自-C0-C10亚烷基-L-R6。
26.如实施方案25所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中L独立地是-C(＝O)O-或-OC(＝O)-。
27.如实施方案25所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R6是直链或支链C6-C20烷基。
28.如实施方案25所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R6是Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基。
29.如实施方案19至28中的任一者所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中Z是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-或-O-，并且R4是氢或CH3。
30.如实施方案19至29中的任一者所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中Z是-OC(＝O)O-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-。
31.如实施方案19至30中的任一者所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R3是-C1-C6亚烷基-NR7R8。
32.如实施方案31所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R7和R8各自独立地是被取代的或未被取代的C1-C6烷基。
33.如实施方案31所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R7和R8各自是-CH2CH3。
34.如实施方案31所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的3-7元杂环烷基。
35.如实施方案19至30中的任一者所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R3是
36.一种纳米颗粒组合物，所述纳米颗粒组合物包含实施方案1至35中的任一者所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
37.一种具有选自表1A的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
38.一种纳米颗粒组合物，所述纳米颗粒组合物包含具有选自表1A的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
39.如实施方案1或37所述的纳米颗粒组合物，其中所述氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的20mol％至80mol％。
40.如实施方案1或37所述的纳米颗粒组合物，其中所述氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的40mol％至60mol％。
41.如实施方案1或37所述的纳米颗粒组合物，其中所述氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的50mol％至60mol％。
42.如实施方案1或37至40中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述氨基脂质或其盐或溶剂化物包含一个或多个可电离氮原子。
43.如实施方案1或37至40中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒组合物包含一个或多个来自所述一种或多种氨基脂质的可电离氮原子。
44.如实施方案1或37至42中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒组合物仅包含一种氨基脂质或其盐或溶剂化物。
45.如实施方案1或37至43中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒组合物包含一种或多种核酸分子实体。
46.如实施方案44所述的纳米颗粒组合物，其中所述可电离氮原子与存在于所述核酸分子实体中的磷酸根基团的摩尔比(N与P或N/P比率)是约2至约20。
47.如实施方案45所述的纳米颗粒组合物，其中所述N/P比率是约2至约15、约2至约10、约2至约8、约2至约6、约3至约15、约3至约10、约3至约8、约3至约6、约4至约15、约4至约10、约4至约8或约4至约6。
48.如实施方案45所述的纳米颗粒组合物，其中所述N/P比率是约3.5至约10。
49.如实施方案1或37至47中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒组合物包含中性脂质。
50.如实施方案48所述的纳米颗粒组合物，其中所述中性脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约1mol％至约20mol％。
51.如实施方案48或49所述的纳米颗粒组合物，其中所述中性脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约2mol％至约25mol％。
52.如实施方案48或49所述的纳米颗粒组合物，其中所述中性脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约5mol％至约10mol％。
53.如实施方案48至51中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述中性脂质选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、2-油酰基-1-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和神经鞘磷脂。
54.如实施方案48至51中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述中性脂质是DSPC。
55.如实施方案1或37至53中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒组合物包含结构脂质。
56.如实施方案54所述的纳米颗粒组合物，其中所述结构脂质是固醇或其衍生物。
57.如实施方案54或55所述的纳米颗粒组合物，其中所述固醇或所述其衍生物是胆固醇或胆固醇衍生物。
58.如实施方案54至56中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述结构脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约15mol％至约65mol％。
59.如实施方案54至56中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述结构脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约30mol％至约60mol％。
60.如实施方案54至56中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述结构脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约30mol％至约40mol％。
61.如实施方案1或37至59中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒组合物包含PEG脂质。
62.如实施方案60所述的纳米颗粒组合物，其中所述PEG脂质是表2的PEG-脂质。
63.如实施方案60或61所述的纳米颗粒组合物，其中所述PEG脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约0.1mol％至约6mol％。
64.如实施方案60或61所述的纳米颗粒组合物，其中所述PEG脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约2.0mol％至约2.5mol％。
65.如实施方案60至63中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述PEG-脂质的数量平均分子量是约200Da至约5000Da。
66.如实施方案44至64中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述一种或多种核酸分子实体包括靶向目标致病基因的指导RNA(gRNA)。
67.如实施方案65所述的纳米颗粒组合物，其中所述指导RNA是单指导RNA(sgRNA)。
68.如实施方案65或66所述的纳米颗粒组合物，其中所述目标致病基因在肝细胞中产生。
69.如实施方案44至67中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述一种或多种核酸分子实体包括编码SpCas9、CBE和/或ABE蛋白的mRNA。
70.如实施方案1或37至68中的任一者所述的纳米颗粒组合物，所述纳米颗粒组合物还包含核酸稳定剂。
71.一种纳米颗粒组合物，所述纳米颗粒组合物包含：
(a)一种或多种核酸分子实体；
(b)根据实施方案1至35或36中的任一者所述的氨基脂质或其盐或溶剂化物，
其中所述氨基脂质或其盐占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的20mol％至80mol％，
其中所述氨基脂质或其盐包含一个或多个可电离氮原子，并且
其中所述可电离氮原子与存在于所述核酸分子实体中的磷酸根基团的摩尔比是2至12；
(c)中性脂质，所述中性脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的所述总脂质含量的2mol％至25mol％；
(d)结构脂质，所述结构脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的所述总脂质含量的30mol％至60mol％；和
(e)PEG脂质，所述PEG脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的所述总脂质含量的0.1mol％至6mol％。
72.如实施方案37至70中的任一者所述的纳米颗粒组合物，所述纳米颗粒组合物还包含核酸稳定剂。
73.如实施方案71所述的纳米颗粒组合物，其中所述核酸稳定剂包括聚乙二醇、西曲溴铵或壳聚糖。
74.如实施方案71所述的纳米颗粒组合物，其中所述核酸稳定剂包括具有约120至约2000Da的数量平均分子量的聚乙二醇。
75.一种纳米颗粒组合物，所述纳米颗粒组合物包含：
(a)一种或多种核酸分子实体；
(b)氨基脂质或其盐，
其中所述氨基脂质或其盐占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的20mol％至80mol％，
其中所述氨基脂质或其盐包含一个或多个可电离氮原子，并且
其中所述可电离氮原子与存在于所述核酸分子实体中的磷酸根基团的摩尔比是2至12；
(c)中性脂质，所述中性脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的所述总脂质含量的2mol％至25mol％；
(d)结构脂质，所述结构脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的所述总脂质含量的30mol％至60mol％；
(e)PEG脂质，所述PEG脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的所述总脂质含量的0.1mol％至6mol％；和
(f)核酸稳定剂，其中所述核酸稳定剂包括壳聚糖、西曲溴铵、具有约120至约2000Da的数量平均分子量的聚乙二醇或它们的组合。
76.如实施方案71至74中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述核酸稳定剂包括PEG 200、PEG 400或PEG 600。
77.如实施方案71至74中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述核酸稳定剂是PEG 400。
78.如实施方案71至76中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述核酸稳定剂以按总重量计约0.01％至约20％的量存在于所述纳米颗粒组合物中。
79.如实施方案71至76中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述核酸稳定剂以按总重量计约0.5％至约5％的量存在于所述纳米颗粒组合物中。
80.如实施方案44至78中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述一种或多种核酸分子实体包括PCSK9 gRNA。
81.如实施方案44至78中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述一种或多种核酸分子实体包括编码Cas核酸酶的mRNA。
82.如实施方案44至78中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述一种或多种核酸分子实体包括mRNA、gRNA、siRNA、反义寡核苷酸、微RNA、抗微RNA剂、RNA激活剂、适体或它们的组合。
83.如实施方案1或37至81中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒组合物包含抗氧化剂。
84.如实施方案82所述的纳米颗粒组合物，其中所述抗氧化剂包括EDTA。
85.如实施方案1或37至83中的任一者所述的纳米颗粒组合物，所述纳米颗粒组合物还包含表面活性剂。
86.84的纳米颗粒组合物，其中所述表面活性剂是脂肪酸或脂肪醇。
87.84的纳米颗粒组合物，其中所述表面活性剂是C12-C24脂肪醇。
88.如实施方案86所述的纳米颗粒组合物，其中所述C12-C24脂肪醇是月桂醇、十三醇、肉豆蔻醇、十五醇、鲸蜡醇、棕榈油醇、十七醇、硬脂醇、油醇、十九醇、花生醇或它们的组合。
89.如实施方案86所述的纳米颗粒组合物，其中所述C12-C24脂肪醇是油醇、硬脂醇或它们的混合物。
90.如实施方案84至88中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述表面活性剂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约1.0mol％至约10mol％。
91.如实施方案1或37至89中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒的中值直径是约50nm至约150nm。
92.如实施方案1或37至90中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒的多分散性指数是0至0.15。
93.如实施方案1或37至90中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒的多分散性指数是0至0.05。
94.如实施方案44至92中的任一者所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒组合物的核酸包埋效率是至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
95.一种具有式(III)的结构的PEG脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R21和R22中的每一者独立地是被取代的或未被取代的C3-C30烷基、被取代的或未被取代的C3-C30烯基或被取代的或未被取代的C3-C30炔基；
R26、R27和R28中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O(CH2)2C(O)O-、-O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)(CH2)2O-、-OC(O)(CH2)2NH-、-O(CH2)2C(O)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)O-、-O(CH2)2C(NAc)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(O)O-、-NH(CH2)2C(O)NH-、NH(CH2)2C(O)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)O-、-NH(CH2)2C(NAc)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)--OC(O)(CH2)2N(CH3)-、-OC(NH)(CH2)2O-、-OC(NMe)(CH2)2NH-、-O2C(NH)(CH2)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O-、-S-或键；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
R23是-C0-C10亚烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24或-C1-C10亚杂烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24，其中所述亚烷基和亚杂烷基各自独立地是被取代的或未被取代的；
R24独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C3烷基；
R25是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
k1、k2和k3中的每一者独立地是0、1、2、3、4或5；并且
k4是选自1至100的整数。
96.一种具有式(III*)的结构的PEG脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R21是氢、被取代的或未被取代的C1-C30烷基、被取代的或未被取代的C3-C30烯基或被取代的或未被取代的C3-C30炔基；
R22是氢、被取代的或未被取代的C1-C30烷基、被取代的或未被取代的C3-C30烯基或被取代的或未被取代的C3-C30炔基；
R26、R27和R28中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-N(Ac)-、-OC(O)OCH2C(O)O-、-OC(O)OCH2C(O)NH--OC(O)NHCH2C(O)O-、-OC(O)NHCH2C(O)NH-、-OC(O)O(CH2)2C(O)O-、-OC(O)O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)NH(CH2)2C(O)O-、-OC(O)NH(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)O(CH2)3C(O)O-、-OC(O)O(CH2)3C(O)NH-、-OC(O)NH(CH2)3C(O)O-、-OC(O)NH(CH2)3C(O)NH-、-C(O)OCH2C(O)NH--C(O)NHCH2C(O)O-、-C(O)NHCH2C(O)NH-、-C(O)O(CH2)2C(O)O-、-C(O)O(CH2)2C(O)NH-、-C(O)NH(CH2)2C(O)O-、-C(O)NH(CH2)2C(O)NH-、-C(O)O(CH2)3C(O)O-、-C(O)O(CH2)3C(O)NH-、-C(O)NH(CH2)3C(O)O-、-C(O)NH(CH2)3C(O)NH-、-OC(＝O)NR4(CH2)1-3C(＝O)NH-、-OC(＝O)NR4(CH2)1-3C(＝O)O-、-C(＝O)NR4(CH2)1-3C(＝O)NH-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O(CH2)2C(O)O-、-O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)(CH2)2O-、-OC(O)(CH2)2NH-、-O(CH2)2C(O)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)O-、-O(CH2)2C(NAc)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(O)O-、-NH(CH2)2C(O)NH-、NH(CH2)2C(O)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)O-、-NH(CH2)2C(NAc)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)--OC(O)(CH2)2N(CH3)-、-OC(NH)(CH2)2O-、-OC(NMe)(CH2)2NH-、-O2C(NH)(CH2)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O-、-S-或键；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
R23是-C0-C10亚烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24、-C1-C10亚杂烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24、-C0-C10亚烷基-(O-CH2-CH2)k4-R24或-C1-C10亚杂烷基-(O-CH2-CH2)k4-R24，其中所述亚烷基和亚杂烷基各自独立地是被取代的或未被取代的；
R24独立地是氢、被取代的或未被取代的C1-C3烷基、-O-R4、-C(＝O)OR4或-C(＝O)R4；
R25是氢或被取代的或未被取代的C1-C22烷基；
k1、k2和k3中的每一者独立地是0、1、2、3、4或5；并且
k4是选自1至100的整数。
97.如实施方案95所述的PEG脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中
R21是被取代的或未被取代的C3-C30烷基、被取代的或未被取代的C3-C30烯基或被取代的或未被取代的C3-C30炔基；
R22是氢、被取代的或未被取代的C3-C30烷基、被取代的或未被取代的C3-C30烯基或被取代的或未被取代的C3-C30炔基；
R26、R27和R28中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-OC(＝O)NR4(CH2)1-3C(＝O)NH-、-OC(＝O)NR4(CH2)1-3C(＝O)O-、-C(＝O)NR4(CH2)1-3C(＝O)NH-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O(CH2)2C(O)O-、-O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)(CH2)2O-、-OC(O)(CH2)2NH-、-O(CH2)2C(O)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)O-、-O(CH2)2C(NAc)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(O)O-、-NH(CH2)2C(O)NH-、NH(CH2)2C(O)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)O-、-NH(CH2)2C(NAc)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)--OC(O)(CH2)2N(CH3)-、-OC(NH)(CH2)2O-、-OC(NMe)(CH2)2NH-、-O2C(NH)(CH2)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O-、-S-或键；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
R23是-C0-C10亚烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24或-C1-C10亚杂烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24，其中所述亚烷基和亚杂烷基各自独立地是被取代的或未被取代的；
R24独立地是氢、被取代的或未被取代的C1-C3烷基、-O-R4、-C(＝O)OH或-C(＝O)R4；
R25是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
k1、k2和k3中的每一者独立地是0、1、2、3、4或5；并且
k4是选自1至100的整数。
98.如实施方案94至96中的任一者所述的PEG脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R21和R22中的每一者独立地是未被取代的直链C12-C25烷基。
99.如实施方案94至97中的任一者所述的PEG脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，R26、R27和R28中的每一者独立地选自-O(CH2)2C(O)O-、-O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)(CH2)2O-、-OC(O)(CH2)2NH-、-O(CH2)2C(O)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)O-、-O(CH2)2C(NAc)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(O)O-、-NH(CH2)2C(O)NH-、NH(CH2)2C(O)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)O-、-NH(CH2)2C(NAc)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-OC(O)(CH2)2N(CH3)-、-OC(NH)(CH2)2O-、-OC(NMe)(CH2)2NH-、-O2C(NH)(CH2)N(CH3)-和-O(CH2)2C(NH)NH-。
100.如实施方案94至97中的任一者所述的PEG脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R26和R27中的每一者是-O(CH2)2C(O)O-或-O(CH2)2C(O)NH-。
101.如实施方案94至99中的任一者所述的PEG脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R28是-O(CH2)2C(O)O-或-O(CH2)2C(O)NH-。
102.如实施方案94至99中的任一者所述的PEG脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R28是-O-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-。
103.如实施方案94至101中的任一者所述的PEG脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中k1是0，k2是1，并且k3是1。
104.如实施方案94至102中的任一者所述的PEG脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R23是-C0-C3亚烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24，其中R24是H或甲基。
105.如实施方案94至103中的任一者所述的PEG脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中k4是1至50。
106.如实施方案94至104中的任一者所述的PEG脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中R25是氢。
107.一种具有选自表2的结构的PEG脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
108.如实施方案95所述的PEG脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中所述PEG脂质是：
109.一种药物组合物，所述药物组合物包含实施方案1或37至93中的任一者的所述纳米颗粒组合物以及赋形剂或载体。
110.如实施方案108所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含编码基因编辑器核酸酶的mRNA。
111.如实施方案108或109所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含一种或多种指导RNA分子。
112.如实施方案108或109所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含PCSK9指导RNA。
113.如实施方案108或109所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含两种或更多种指导RNA分子。
114.如实施方案112所述的药物组合物，其中所述两种或更多种指导RNA分子靶向两个或更多个目标基因。
115.如实施方案109至113中的任一者所述的药物组合物，其中所述mRNA编码Cas9核酸酶。
116.如实施方案109至113中的任一者所述的药物组合物，其中所述mRNA编码碱基编辑器核酸酶。
117.如实施方案110至115中的任一者所述的药物组合物，其中所述mRNA和所述一种或多种指导RNA分子存在于同一纳米颗粒组合物中。
118.如实施方案110至115中的任一者所述的药物组合物，其中所述mRNA和所述一种或多种指导RNA分子存在于不同纳米颗粒组合物中。
119.如实施方案110至117中的任一者所述的药物组合物，其中所述药物组合物中所述gRNA分子与所述mRNA的比率按重量计或按摩尔量计是约0.01至约100。
120.如实施方案118所述的药物组合物，其中所述药物组合物中所述gRNA分子与所述mRNA的比率按重量计或按摩尔量计是约50:1、约40:1、约30:1、约20:1、约18:1、约16:1、约14:1、约12:1、约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9或约1:10。
121.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)实施方案1或37至93中的任一者所述的第一纳米颗粒组合物，和
(b)实施方案1或37至93中的任一者所述的第二纳米颗粒组合物。
122.如实施方案120所述的药物组合物，其中所述第一纳米颗粒组合物包含基因编辑器mRNA，并且所述第二纳米颗粒组合物包含一种或多种指导RNA分子。
123.120或121的药物组合物，其中所述药物组合物中指导RNA分子与mRNA的比率按重量计或按摩尔量计是约50:1、约40:1、约30:1、约20:1、约18:1、约16:1、约14:1、约12:1、约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9或约1:10。
124.120或121的药物组合物，其中所述药物组合物中指导RNA与mRNA的比率按重量计或按摩尔量计是约1:1。
125.一种将核酸分子实体递送至细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与实施方案1或37至93中的任一者所述的纳米颗粒组合物或实施方案108至123中的任一者所述的药物组合物接触，借此将所述核酸分子实体递送至所述细胞。
126.如实施方案124所述的方法，其中所述细胞在体内、离体或在体外接触。
127.一种在细胞中产生目标多肽的方法，所述方法包括使所述细胞与实施方案1或37至93中的任一者所述的纳米颗粒组合物或实施方案108至123中的任一者所述的药物组合物接触，其中所述纳米颗粒组合物或所述药物组合物包含核酸分子实体，并且其中所述核酸分子实体在所述细胞中翻译，由此产生所述多肽。
128.一种制备药物组合物的方法，所述方法包括将实施方案1或37至93中的任一者所述的第一纳米颗粒组合物和实施方案1或37至93中的任一者所述的第二纳米颗粒组合物组合。
129.一种治疗哺乳动物的疾病或病况的方法，所述方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的实施方案108至123中的任一者所述的药物组合物。
130.一种编辑细胞中的PCSK9基因的方法，所述方法包括使所述细胞与实施方案1或37至93中的任一者所述的纳米颗粒组合物或实施方案108至123中的任一者所述的药物组合物接触，其中所述纳米颗粒组合物或所述药物组合物包含PCSK9指导RNA。
131.一种产生实施方案71至93中的任一者所述的稳定化纳米颗粒组合物的方法，所述方法包括将核酸稳定剂与缺乏所述核酸稳定剂的纳米颗粒组合物组合。
132.如实施方案130所述的方法，其中在冷冻或储存之前将所述核酸稳定剂与所述纳米颗粒组合物组合。
133.如实施方案130所述的方法，其中在添加所述一种或多种核酸实体之前、与此并行或在此之后将所述核酸稳定剂与所述纳米颗粒组合物组合。
134.如实施方案130至132中的任一者所述的方法，其中所述组合包括将所述核酸稳定剂与所述一种或多种核酸实体在水性缓冲液中混合。
135.一种产生稳定化纳米颗粒组合物的方法，所述方法包括：
(a)将核酸稳定剂与一种或多种核酸分子实体组合，由此产生包含稳定化的一种或多种核酸分子实体的溶液；以及
(b)将(a)的所述溶液与包含氨基脂质、中性脂质、结构脂质和PEG脂质中的一者或多者的纳米颗粒组合物组合。
136.如实施方案134所述的方法，其中(a)中的所述组合包括将所述核酸稳定剂与所述一种或多种核酸实体在水性缓冲液中混合。
137.如实施方案130至135中的任一者所述的方法，所述方法还包括收集所述纳米颗粒组合物以及相对于具有约6.5至约8.0的pH的缓冲液透析所述纳米颗粒组合物。
138.如实施方案130至136中的任一者所述的方法，其中所述核酸稳定剂是具有约120至约1000的数量平均分子量的聚乙二醇。
139.一种制备包含脂质纳米颗粒的制剂的方法，其中所述纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)氨基脂质，和(iii)一种或多种选自结构脂质、中性脂质和PEG脂质的脂质，所述方法包括：
(a)将所述氨基脂质的第一部分与所述一种或多种核酸分子实体在第一溶液中组合，其中所述第一部分占总氨基脂质的0.1mol％至99mol％；
(b)将所述氨基脂质的剩余部分与所述一种或多种选自结构脂质、中性脂质和PEG脂质的脂质在第二溶液中组合；
(c)将所述第一溶液和所述第二溶液混合，由此产生所述脂质纳米颗粒。
140.如实施方案138所述的方法，其中所述氨基脂质的所述第一部分被配置为中和所述一种或多种核酸分子实体中0.1-99％的磷酸根(基于N:P)。
141.如实施方案138所述的方法，其中所述氨基脂质的所述第一部分被配置为中和所述一种或多种核酸分子实体中0.5-90％的磷酸根(基于N:P)。
142.如实施方案138所述的方法，其中所述氨基脂质的所述第一部分被配置为中和所述一种或多种核酸分子实体中约10％、15％、25％、50％或75％的磷酸根(基于N:P)。
143.如实施方案138至141中的任一者所述的方法，其中所述第一溶液是水性缓冲溶液。
144.如实施方案138至142中的任一者所述的方法，其中所述第一溶液还包含核酸稳定剂。
145.如实施方案138至143中的任一者所述的方法，其中将所述第一溶液和所述第二溶液于管线内混合器中混合。

Claims (147)

1.一种具有式(I*)的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R1是氢、C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、C3-C30杂烷基、C3-C30杂烯基、C3-C30杂炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C2-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的；
R2是氢、C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、C3-C30杂烷基、C3-C30杂烯基、C3-C30杂炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C2-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的；
X、Y和Z中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、
-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、
-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、
-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、
-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、
-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、
-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、
-SC(＝S)NR4-、-R11C(＝O)N(R4)R9-、-NR7C(＝O)R9-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-R11C(＝O)OR9-、-R11OC(＝O)R9-、-R11OC(＝O)OR9-、-R11N(R4)C(＝O)OR9-、-R11OC(＝O)N(R4)R9-、-R11(NR4)C(＝O)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝NR4)R9-、-R11C(＝S)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝S)R9-、-R11C(＝S)OR9-、-R11OC(＝S)R9-、-R11OC(＝S)OR9-、-R11N(R4)C(＝S)OR9-、-R11OC(＝S)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝S)N(R4)R9-、-R11C(＝O)SR9-、-R11SC(＝O)R9-、-R11OC(＝O)SR9-、-R11N(R4)C(＝O)SR9-、-R11SC(＝O)N(R4)R9-、-R11C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)R9-、-R11SC(＝S)OR9-、-R11N(R4)C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)N(R4)R9-、-R11C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)R9-、-R11SC(＝O)SR9-、-R11SC(＝S)SR9-、-R11N(R4)C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)N(R4)R9-、-R11OR9-、-R11SR9-、-O-、-S-或键；
每个L独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-N＝CR4-、-CR4＝N-O-、-O-、-S-、-R11C(＝O)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝O)R9-、-R11C(＝O)OR9-、-R11OC(＝O)R9-、-R11OC(＝O)OR9-、-R11N(R4)C(＝O)OR9-、-R11OC(＝O)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝O)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝NR4)N(R4)R9-、-R11C(＝S)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝S)R9-、-R11C(＝S)OR9-、-R11OC(＝S)R9-、-R11OC(＝S)OR9-、-R11N(R4)C(＝S)OR9-、-R11OC(＝S)N(R4)R9-、-R11N(R4)C(＝S)N(R4)R9-、-R11C(＝O)SR9-、-R11SC(＝O)R9-、-R11OC(＝O)SR9-、-R11N(R4)C(＝O)SR9-、-R11SC(＝O)N(R4)R9-、-R11C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)R9-、-R11SC(＝S)OR9-、-R11N(R4)C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)N(R4)R9-、-R11C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)R9-、-R11SC(＝O)SR9-、-R11SC(＝S)SR9-、-R11N(R4)C(＝S)SR9-、-R11SC(＝S)N(R4)R9-、-R11O-N＝CR9-、-R11C(R10)＝N-OR9-、-R11OR9-、-R11SR9-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-、-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
R3是-C0-C10亚烷基-NR7R8、-C0-C10亚烷基-杂环烷基、-C0-C10亚烷基-环烷基或-C0-C10亚烷基-杂芳基，其中所述亚烷基、杂环烷基和杂环芳基独立地是被取代的或未被取代的；
每个R4独立地是氢、被取代的或未被取代的C1-C16烷基或被取代的或未被取代的C1-C16杂烷基；
R5是氢或被取代的或未被取代的-C0-C10亚烷基-L-R4；
每个R6独立地是氢、C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基，其中所述烷基、所述烯基和炔基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；
R7和R8中的每一者独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C16烷基、被取代的或未被取代的C1-C16杂烷基，或R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环基；并且
每个R9独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C16亚烷基或未被取代的C1-C16亚杂烷基；
每个R10独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C16亚烷基或未被取代的C1-C16亚杂烷基；并且每个R11独立地是被取代的或未被取代的C1-C16亚烷基或未被取代的C1-C16亚杂烷基，
n、m和q中的每一者独立地是0、1、2、3、4或5。
2.如权利要求1所述的氨基脂质，其中所述氨基脂质具有式(Ia)的结构，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R1和R2中的每一者独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、C3-C30杂烷基、C3-C30杂烯基、C3-C30杂炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C2-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的；
X、Y和Z中的每一者独立地是C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-、-S-、-C1-C10亚烷基-O-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
每个L独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、
-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、
-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、
-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、
-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-N＝CR4-、-CR4＝N-O-、-O-、-S-、-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
R3是-C0-C10亚烷基-NR7R8或-C0-C10亚烷基-杂环烷基，其中所述亚烷基和杂环烷基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
每个R6独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基，其中所述烷基、所述烯基和炔基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；并且
R7和R8中的每一者独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基，或R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环基。
3.如权利要求1所述的氨基脂质，其中所述氨基脂质具有式(Ib)的结构，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
X和Y中的每一者是相同的，并且选自：-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-SC(＝S)O-、-O-、-C1-C10亚烷基-O-和键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
R1和R2是相同的，并且选自：氢、C1-C30烷基、C1-C30杂烷基和Cy-C3-30烷基，其中所述烷基和杂烷基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
每个Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；并且
R7和R8中的每一者独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基，或R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环基；
A是-O-、-CH2-、-S-或-NR12-；
R12是氢、C1-C10烷基或C1-C10杂烷基，其中所述烷基和杂烷基各自独立地是被取代的或未被取代的；并且
Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基或被取代的或未被取代的杂芳基；
p是1、2、3、4、5或6。
4.如权利要求3所述的氨基脂质，其中A是-O-。
5.如权利要求3或4所述的氨基脂质，其中X和Y是-C(＝O)O-或-OC(＝O)-。
6.如权利要求3所述的氨基脂质，其中X和Y中的每一者是-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-和-N(H)C(＝O)O-。
7.如权利要求3、4或6所述的氨基脂质，其中R1和R2中的每一者是
8.如权利要求3所述的氨基脂质，其中所述氨基脂质是
9.如权利要求1至2中任一项所述的氨基脂质，其中X和Y各自独立地选自-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-N(H)C(＝O)O-和-OC(＝O)-。
10.如权利要求1至2中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中R1和R2各自独立地选自被取代的或未被取代的C3-C30烷基或被取代的或未被取代的C3-C30烯基。
11.如权利要求1至2中任一项所述的氨基脂质，其中R1和R2各自独立地选自-C0-C10亚烷基-L-R6。
12.如权利要求11所述的氨基脂质，其中L独立地是-C(＝O)O-或-OC(＝O)-。
13.如权利要求11所述的氨基脂质，其中R6是直链或支链C6-C20烷基。
14.如权利要求11所述的氨基脂质，其中R6是Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基。
15.如权利要求1至14中任一项所述的氨基脂质，其中R1和/或R2包含非对称杂原子。
16.如权利要求1至15中任一项所述的氨基脂质，其中Z是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-或-O-，并且R4是氢或CH3。
17.如权利要求1-2或9-14中任一项所述的氨基脂质，其中Z是-OC(＝O)O-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-。
18.如权利要求1至17中任一项所述的氨基脂质，其中R3是-C1-C6亚烷基-NR7R8。
19.如权利要求18所述的氨基脂质，其中R7和R8各自独立地是被取代的或未被取代的C1-C6烷基。
20.如权利要求18所述的氨基脂质，其中R7和R8各自是-CH2CH3。
21.如权利要求18所述的氨基脂质，其中R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的3-7元杂环烷基。
22.如权利要求1-2或9-14中任一项所述的氨基脂质，其中R3是
23.如权利要求1所述的氨基脂质，其中所述氨基脂质是
/>
/>
24.一种具有式(II*)的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R1和R2中的每一者独立地是氢、C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、C3-C30杂烷基、C3-C30杂烯基、C3-C30杂炔基、C3-C10环烷基、-C0-C10亚烷基-L-R6或-C1-C10亚烯基-L-R6，其中所述烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和环烷基中的每一者独立地是被取代的或未被取代的；
X、Y和Z中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-C(＝O)-、
-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、
-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、
-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、
-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、
-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、
-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、
-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-、-S-或键；
每个L独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、
-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、
-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、
-NR4C(＝O)S-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O-N＝CR4-、-CR4＝N-O-、-O-、-S-、-C1-C10亚烷基-O-、-C1-C10亚烷基-C(＝O)O-、-C1-C10亚烷基-OC(＝O)-或键，其中所述亚烷基是被取代的或未被取代的；
R3是氢、-C1-C6烷基、-C0-C10亚烷基-NR7R8、-C0-C10亚烷基-杂环烷基或-C0-C10亚烷基-杂环芳基，其中所述烷基、亚烷基、杂环烷基和杂环芳基独立地是被取代的或未被取代的；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
每个R6独立地是C3-C30烷基、C3-C30烯基、C3-C30炔基、Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基，其中所述烷基、所述烯基和炔基各自独立地是被取代的或未被取代的；
每个Cy是被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基；
R7和R8中的每一者独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基，或R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的C2-C6杂环基；
a和b中的每一者独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；并且
m是0、1、2、3、4或5。
25.如权利要求24所述的氨基脂质，其中a和b中的每一者独立地是3、4、5、6、7、8、9或10。
26.如权利要求24中任一项所述的氨基脂质，其中m是1、2、3、4或5。
27.如权利要求24至26中任一项所述的氨基脂质，其中X和Y各自独立地选自-C(＝O)O-和-OC(＝O)-。
28.如权利要求24所述的氨基脂质，其中L独立地是-C(＝O)O-或-OC(＝O)-。
29.如权利要求24所述的氨基脂质，其中R6是直链或支链C6-C20烷基。
30.如权利要求24所述的氨基脂质，其中R6是Cy-C3-30烷基、Cy-C3-30烯基或Cy-C3-30炔基。
31.如权利要求24至30中任一项所述的氨基脂质，其中Z是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-或-O-，并且R4是氢或CH3。
32.如权利要求24所述的氨基脂质，其中R7和R8各自是-CH2CH3。
33.如权利要求24所述的氨基脂质，其中R7和R8与它们所连接的氮一起形成被取代的或未被取代的3-7元杂环烷基。
34.如权利要求1-2或9-14中任一项所述的氨基脂质，其中R3是
35.一种具有选自表1A的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
36.一种纳米颗粒组合物，所述纳米颗粒组合物包含具有选自表1A的结构的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
37.一种纳米颗粒组合物，所述纳米颗粒组合物包含权利要求8所述的氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
38.如权利要求1-34或36中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的20mol％至80mol％。
39.如权利要求1-34或36-37中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的40mol％至60mol％。
40.如权利要求1-34或36-39中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述氨基脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的50mol％至60mol％。
41.如权利要求1-34或36-40中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述氨基脂质或其盐或溶剂化物包含一个或多个可电离氮原子。
42.如权利要求1或36至40中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒组合物包含一个或多个来自所述一种或多种氨基脂质的可电离氮原子。
43.如权利要求1或36至42中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒组合物仅包含一种氨基脂质或其盐或溶剂化物。
44.如权利要求1或36至43中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒组合物包含一种或多种核酸分子实体。
45.如权利要求44所述的纳米颗粒组合物，其中所述可电离氮原子与存在于所述核酸分子实体中的磷酸根基团的摩尔比(N与P或N/P比率)是约2至约20。
46.如权利要求45所述的纳米颗粒组合物，其中所述N/P比率是约2至约15、约2至约10、约2至约8、约2至约6、约3至约15、约3至约10、约3至约8、约3至约6、约4至约15、约4至约10、约4至约8或约4至约6。
47.如权利要求45所述的纳米颗粒组合物，其中所述N/P比率是约3.5至约10。
48.如权利要求1或36至47中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒组合物包含中性脂质。
49.如权利要求48所述的纳米颗粒组合物，其中所述中性脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约1mol％至约20mol％。
50.如权利要求48或49所述的纳米颗粒组合物，其中所述中性脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约2mol％至约25mol％。
51.如权利要求48或49所述的纳米颗粒组合物，其中所述中性脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约5mol％至约10mol％。
52.如权利要求48至51中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述中性脂质选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、2-油酰基-1-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和神经鞘磷脂。
53.如权利要求48至51中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述中性脂质是DSPC。
54.如权利要求1或36至53中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒组合物包含结构脂质。
55.如权利要求54所述的纳米颗粒组合物，其中所述结构脂质是固醇或其衍生物。
56.如权利要求54或55所述的纳米颗粒组合物，其中所述固醇或所述其衍生物是胆固醇或胆固醇衍生物。
57.如权利要求54至56中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述结构脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约15mol％至约65mol％。
58.如权利要求54至56中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述结构脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约30mol％至约60mol％。
59.如权利要求54至56中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述结构脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约30mol％至约40mol％。
60.如权利要求1或36至59中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒组合物包含PEG-脂质。
61.如权利要求60所述的纳米颗粒组合物，其中所述PEG-脂质是表2的PEG-脂质。
62.如权利要求60或61所述的纳米颗粒组合物，其中所述PEG-脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约0.1mol％至约6mol％。
63.如权利要求60或61所述的纳米颗粒组合物，其中所述PEG-脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约2.0mol％至约2.5mol％。
64.如权利要求60至63中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述PEG-脂质的数量平均分子量是约200Da至约5000Da。
65.如权利要求44至64中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述一种或多种核酸分子实体包括靶向目标致病基因的指导RNA(gRNA)。
66.如权利要求65所述的纳米颗粒组合物，其中所述指导RNA是单指导RNA(sgRNA)。
67.如权利要求65或66所述的纳米颗粒组合物，其中所述目标致病基因在肝细胞中产生。
68.如权利要求44至67中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述一种或多种核酸分子实体包括编码SpCas9、CBE和/或ABE蛋白的mRNA。
69.如权利要求1或36至68中任一项所述的纳米颗粒组合物，所述纳米颗粒组合物还包含核酸稳定剂。
70.一种纳米颗粒组合物，所述纳米颗粒组合物包含：
(a)一种或多种核酸分子实体；
(b)表1A的氨基脂质或其盐或溶剂化物，
其中所述氨基脂质或其盐占存在于所述纳米颗粒组合
物中的总脂质含量的20mol％至80mol％，
其中所述氨基脂质或其盐包含一个或多个可电离氮原
子，并且
其中所述可电离氮原子与存在于所述核酸分子实体中的磷酸根基团的摩尔比是2至12；
(c)中性脂质，所述中性脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的所述总脂质含量的2mol％至25mol％；
(d)结构脂质，所述结构脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的所述总脂质含量的30mol％至60mol％；和
(e)表2的PEG-脂质，所述PEG-脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的所述总脂质含量的0.1mol％至6mol％。
71.如权利要求36至70中任一项所述的纳米颗粒组合物，所述纳米颗粒组合物还包含核酸稳定剂。
72.如权利要求71所述的纳米颗粒组合物，其中所述核酸稳定剂包括聚乙二醇、西曲溴铵或壳聚糖。
73.如权利要求71所述的纳米颗粒组合物，其中所述核酸稳定剂包括具有约120至约2000Da的数量平均分子量的聚乙二醇。
74.一种纳米颗粒组合物，所述纳米颗粒组合物包含：
(a)一种或多种核酸分子实体；
(b)表1A的氨基脂质或其盐，
其中所述氨基脂质或其盐占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的20mol％至80mol％，
其中所述氨基脂质或其盐包含一个或多个可电离氮原
子，并且
其中所述可电离氮原子与存在于所述核酸分子实体中的磷酸根基团的摩尔比是2至12；
(c)中性脂质，所述中性脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的所述总脂质含量的2mol％至25mol％；
(d)结构脂质，所述结构脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的所述总脂质含量的30mol％至60mol％；
(e)表2的PEG-脂质，所述PEG-脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的所述总脂质含量的0.1mol％至6mol％；和
(f)核酸稳定剂，其中所述核酸稳定剂包括壳聚糖、西曲溴铵、
具有约120至约2000Da的数量平均分子量的聚乙二醇或它们的组合。
75.如权利要求71至74中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述核酸稳定剂包括PEG200、PEG 400或PEG 600。
76.如权利要求71至74中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述核酸稳定剂是PEG400。
77.如权利要求71至76中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述核酸稳定剂以按总重量计约0.01％至约20％的量存在于所述纳米颗粒组合物中。
78.如权利要求71至76中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述核酸稳定剂以按总重量计约0.5％至约5％的量存在于所述纳米颗粒组合物中。
79.如权利要求44至78中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述一种或多种核酸分子实体包括PCSK9 gRNA。
80.如权利要求44至78中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述一种或多种核酸分子实体包括编码Cas核酸酶的mRNA。
81.如权利要求44至78中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述一种或多种核酸分子实体包括mRNA、gRNA、siRNA、反义寡核苷酸、微RNA、抗微RNA剂、RNA激活剂、适体或它们的组合。
82.如权利要求1或36至81中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒组合物包含抗氧化剂。
83.如权利要求82所述的纳米颗粒组合物，其中所述抗氧化剂包括EDTA。
84.如权利要求1或36至83中任一项所述的纳米颗粒组合物，所述纳米颗粒组合物还包含表面活性剂。
85.如权利要求84所述的纳米颗粒组合物，其中所述表面活性剂是脂肪酸或脂肪醇。
86.如权利要求84所述的纳米颗粒组合物，其中所述表面活性剂是C12-C24脂肪醇。
87.如权利要求86所述的纳米颗粒组合物，其中所述C12-C24脂肪醇是月桂醇、十三醇、肉豆蔻醇、十五醇、鲸蜡醇、棕榈油醇、十七醇、硬脂醇、油醇、十九醇、花生醇或它们的组合。
88.如权利要求86所述的纳米颗粒组合物，其中所述C12-C24脂肪醇是油醇、硬脂醇或它们的混合物。
89.如权利要求84至88中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述表面活性剂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质含量的约1.0mol％至约10mol％。
90.如权利要求1或36至89中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒的中值直径是约50nm至约150nm。
91.如权利要求1或36至90中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒的多分散性指数是0至0.15。
92.如权利要求1或36至90中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒的多分散性指数是0至0.05。
93.如权利要求44至92中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒组合物的核酸包埋效率是至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
94.一种具有式(III*)的结构的PEG-脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R21是氢、被取代的或未被取代的C1-C30烷基、被取代的或未被取代的C3-C30烯基或被取代的或未被取代的C3-C30炔基；
R22是氢、被取代的或未被取代的C1-C30烷基、被取代的或未被取代的C3-C30烯基或被取代的或未被取代的C3-C30炔基；
R26、R27和R28中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-N(Ac)-、-OC(O)OCH2C(O)O-、-OC(O)OCH2C(O)NH--OC(O)NHCH2C(O)O-、-OC(O)NHCH2C(O)NH-、-OC(O)O(CH2)2C(O)O-、-OC(O)O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)NH(CH2)2C(O)O-、-OC(O)NH(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)O(CH2)3C(O)O-、-OC(O)O(CH2)3C(O)NH-、-OC(O)NH(CH2)3C(O)O-、-OC(O)NH(CH2)3C(O)NH-、-C(O)OCH2C(O)NH--C(O)NHCH2C(O)O-、-C(O)NHCH2C(O)NH-、-C(O)O(CH2)2C(O)O-、-C(O)O(CH2)2C(O)NH-、-C(O)NH(CH2)2C(O)O-、-C(O)NH(CH2)2C(O)NH-、-C(O)O(CH2)3C(O)O-、-C(O)O(CH2)3C(O)NH-、-C(O)NH(CH2)3C(O)O-、-C(O)NH(CH2)3C(O)NH-、-OC(＝O)NR4(CH2)1-3C(＝O)NH-、-OC(＝O)NR4(CH2)1-3C(＝O)O-、-C(＝O)NR4(CH2)1-3C(＝O)NH-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O(CH2)2C(O)O-、-O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)(CH2)2O-、-OC(O)(CH2)2NH-、-O(CH2)2C(O)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)O-、-O(CH2)2C(NAc)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(O)O-、-NH(CH2)2C(O)NH-、NH(CH2)2C(O)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)O-、-NH(CH2)2C(NAc)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)--OC(O)(CH2)2N(CH3)-、-OC(NH)(CH2)2O-、-OC(NMe)(CH2)2NH-、-O2C(NH)(CH2)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O-、-S-或键；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
R23是-C0-C10亚烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24、-C1-C10亚杂烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24、-C0-C10亚烷基-(O-CH2-CH2)k4-R24或-C1-C10亚杂烷基-(O-CH2-CH2)k4-R24，其中所述亚烷基和亚杂烷基各自独立地是被取代的或未被取代的；
R24独立地是氢、被取代的或未被取代的C1-C3烷基、-O-R4、-C(＝O)OR4或-C(＝O)R4；
R25是氢或被取代的或未被取代的C1-C22烷基；
k1、k2和k3中的每一者独立地是0、1、2、3、4或5；并且
k4是选自1至100的整数。
95.如权利要求94所述的纳米颗粒组合物，其中
R21是被取代的或未被取代的C3-C30烷基、被取代的或未被取代的C3-C30烯基或被取代的或未被取代的C3-C30炔基；
R22是氢、被取代的或未被取代的C3-C30烷基、被取代的或未被取代的C3-C30烯基或被取代的或未被取代的C3-C30炔基；
R26、R27和R28中的每一者独立地是-C(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NR4C(＝O)O-、-OC(＝O)NR4-、-NR4C(＝O)NR4-、-NR4C(＝NR4)NR4-、-C(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)-、-C(＝S)O-、-OC(＝S)-、OC(＝S)O-、-NR4C(＝S)O-、-OC(＝S)NR4-、-NR4C(＝S)NR4-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-OC(＝O)S-、-NR4C(＝O)S-、-OC(＝O)NR4(CH2)1-3C(＝O)NH-、-OC(＝O)NR4(CH2)1-3C(＝O)O-、-C(＝O)NR4(CH2)1-3C(＝O)NH-、-SC(＝O)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝S)O-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-C(＝S)S-、-SC(＝S)-、-SC(＝O)S-、-SC(＝S)S-、-NR4C(＝S)S-、-SC(＝S)NR4-、-O(CH2)2C(O)O-、-O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)(CH2)2O-、-OC(O)(CH2)2NH-、-O(CH2)2C(O)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)O-、-O(CH2)2C(NAc)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(O)O-、-NH(CH2)2C(O)NH-、NH(CH2)2C(O)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)O-、-NH(CH2)2C(NAc)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)--OC(O)(CH2)2N(CH3)-、-OC(NH)(CH2)2O-、-OC(NMe)(CH2)2NH-、-O2C(NH)(CH2)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O-、-S-或键；
每个R4独立地是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
R23是-C0-C10亚烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24或-C1-C10亚杂烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24，其中所述亚烷基和亚杂烷基各自独立地是被取代的或未被取代的；
R24独立地是氢、被取代的或未被取代的C1-C3烷基、-O-R4、-C(＝O)OH或-C(＝O)R4；
R25是氢或被取代的或未被取代的C1-C6烷基；
k1、k2和k3中的每一者独立地是0、1、2、3、4或5；并且
k4是选自1至100的整数。
96.如权利要求94至95中任一项所述的PEG-脂质，其中R21和R22中的每一者独立地是未被取代的直链C12-C25烷基。
97.如权利要求94至96中任一项所述的PEG-脂质，R26、R27和R28中的每一者独立地选自-O(CH2)2C(O)O-、-O(CH2)2C(O)NH-、-OC(O)(CH2)2O-、-OC(O)(CH2)2NH-、-O(CH2)2C(O)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)O-、-O(CH2)2C(NAc)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-O(CH2)2C(NH)NH-、-O(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(O)O-、-NH(CH2)2C(O)NH-、NH(CH2)2C(O)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)O-、-NH(CH2)2C(NAc)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-NH(CH2)2C(NH)NH-、-NH(CH2)2C(NH)N(CH3)-、-OC(O)(CH2)2N(CH3)-、-OC(NH)(CH2)2O-、-OC(NMe)(CH2)2NH-、-O2C(NH)(CH2)N(CH3)-和-O(CH2)2C(NH)NH-。
98.如权利要求94至96中任一项所述的PEG-脂质，其中R26和R27中的每一者是-O(CH2)2C(O)O-或-O(CH2)2C(O)NH-。
99.如权利要求94至98中任一项所述的PEG-脂质，其中R28是-O(CH2)2C(O)O-或-O(CH2)2C(O)NH-。
100.如权利要求94至98中任一项所述的PEG-脂质，其中R28是-O-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-。
101.如权利要求94至100中任一项所述的PEG-脂质，其中k1是0，k2是1，并且k3是1。
102.如权利要求94至101中任一项所述的PEG-脂质，其中R23是-C0-C3亚烷基-(CH2-CH2-O)k4-R24，其中R24是H或甲基。
103.如权利要求94至102中任一项所述的PEG-脂质，其中k4是1至50。
104.如权利要求94至103中任一项所述的PEG-脂质，其中R25是氢。
105.一种具有选自表2的结构的PEG-脂质或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
106.如权利要求94所述的PEG-脂质，其中所述PEG-脂质是：
/>
107.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求或36至93中任一项的所述纳米颗粒组合物以及赋形剂或载体。
108.如权利要求107所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含编码基因编辑器核酸酶的mRNA。
109.如权利要求107或108所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含一种或多种指导RNA分子。
110.如权利要求107或108所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含PCSK9指导RNA。
111.如权利要求107或108所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含两种或更多种指导RNA分子。
112.如权利要求111所述的药物组合物，其中所述两种或更多种指导RNA分子靶向两个或更多个目标基因。
113.如权利要求108至112中任一项所述的药物组合物，其中所述mRNA编码Cas9核酸酶。
114.如权利要求108至112中任一项所述的药物组合物，其中所述mRNA编码碱基编辑器核酸酶。
115.如权利要求109至114中任一项所述的药物组合物，其中所述mRNA和所述一种或多种指导RNA分子存在于同一纳米颗粒组合物中。
116.如权利要求109至114中任一项所述的药物组合物，其中所述mRNA和所述一种或多种指导RNA分子存在于不同纳米颗粒组合物中。
117.如权利要求109至116中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物中所述gRNA分子与所述mRNA的比率按重量计或按摩尔量计是约0.01至约100。
118.如权利要求117所述的药物组合物，其中所述药物组合物中所述gRNA分子与所述mRNA的比率按重量计或按摩尔量计是约50:1、约40:1、约30:1、约20:1、约18:1、约16:1、约14:1、约12:1、约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9或约1:10。
119.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)权利要求36至93中任一项所述的第一纳米颗粒组合物，和
(b)权利要求36至93中任一项所述的第二纳米颗粒组合物。
120.如权利要求119所述的药物组合物，其中所述第一纳米颗粒组合物包含基因编辑器mRNA，并且所述第二纳米颗粒组合物包含一种或多种指导RNA分子。
121.如权利要求119或120所述的药物组合物，其中所述药物组合物中指导RNA分子与mRNA的比率按重量计或按摩尔量计是约50:1、约40:1、约30:1、约20:1、约18:1、约16:1、约14:1、约12:1、约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9或约1:10。
122.如权利要求119或120所述的药物组合物，其中所述药物组合物中指导RNA与mRNA的比率按重量计或按摩尔量计是约1:1。
123.一种将核酸分子实体递送至细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求36至93中任一项所述的纳米颗粒组合物或权利要求107至122中任一项所述的药物组合物接触，借此将所述核酸分子实体递送至所述细胞。
124.如权利要求123所述的方法，其中所述细胞在体内、离体或在体外接触。
125.一种在细胞中产生目标多肽的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求36至93中任一项所述的纳米颗粒组合物或权利要求107至122中任一项所述的药物组合物接触，其中所述纳米颗粒组合物或所述药物组合物包含核酸分子实体，并且其中所述核酸分子实体在所述细胞中翻译，由此产生所述多肽。
126.一种制备药物组合物的方法，所述方法包括将权利要求36至93中任一项所述的第一纳米颗粒组合物和权利要求36至93中任一项所述的第二纳米颗粒组合物组合。
127.一种治疗哺乳动物的疾病或病况的方法，所述方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的权利要求107至122中任一项所述的药物组合物。
128.一种编辑细胞中的PCSK9基因的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求36至93中任一项所述的纳米颗粒组合物或权利要求107至122中任一项所述的药物组合物接触，其中所述纳米颗粒组合物或所述药物组合物包含PCSK9指导RNA。
129.一种产生权利要求71至93中任一项所述的稳定化纳米颗粒组合物的方法，所述方法包括将核酸稳定剂与缺乏所述核酸稳定剂的纳米颗粒组合物组合。
130.如权利要求129所述的方法，其中在冷冻或储存之前将所述核酸稳定剂与所述纳米颗粒组合物组合。
131.如权利要求129所述的方法，其中在添加所述一种或多种核酸实体之前、与此并行或在此之后将所述核酸稳定剂与所述纳米颗粒组合物组合。
132.如权利要求129至131中任一项所述的方法，其中所述组合包括将所述核酸稳定剂与所述一种或多种核酸实体在水性缓冲液中混合。
133.一种产生稳定化纳米颗粒组合物的方法，所述方法包括：
(a)将核酸稳定剂与一种或多种核酸分子实体组合，由此产生包含稳定化的一种或多种核酸分子实体的溶液；以及
(b)将(a)的所述溶液与包含氨基脂质、中性脂质、结构脂质和PEG-脂质中的一者或多者的纳米颗粒组合物组合。
134.如权利要求133所述的方法，其中(a)中的所述组合包括将所述核酸稳定剂与所述一种或多种核酸实体在水性缓冲液中混合。
135.如权利要求129至134中任一项所述的方法，所述方法还包括收集所述纳米颗粒组合物以及相对于具有约6.5至约8.0的pH的缓冲液透析所述纳米颗粒组合物。
136.如权利要求129至135中任一项所述的方法，其中所述核酸稳定剂是具有约120至约1000的数量平均分子量的聚乙二醇。
137.一种制备包含脂质纳米颗粒的制剂的方法，其中所述纳米颗粒包含(i)一种或多种核酸分子实体，(ii)氨基脂质，和(iii)一种或多种选自结构脂质、中性脂质和PEG-脂质的脂质，所述方法包括：
(a)将所述氨基脂质的第一部分与所述一种或多种核酸分子实体在第一溶液中组合，其中所述第一部分占总氨基脂质的0.1
mol％至99mol％；
(b)将所述氨基脂质的剩余部分与所述一种或多种选自结构脂
质、中性脂质和PEG-脂质的脂质在第二溶液中组合；
(c)将所述第一溶液和所述第二溶液混合，由此产生所述脂质纳米颗粒。
138.如权利要求137所述的方法，其中所述氨基脂质的所述第一部分被配置为中和所述一种或多种核酸分子实体中0.1-99％的磷酸根(基于N:P)。
139.如权利要求137所述的方法，其中所述氨基脂质的所述第一部分被配置为中和所述一种或多种核酸分子实体中0.5-90％的磷酸根(基于N:P)。
140.如权利要求137所述的方法，其中所述氨基脂质的所述第一部分被配置为中和所述一种或多种核酸分子实体中约10％、15％、25％、50％或75％的磷酸根(基于N:P)。
141.如权利要求137至140中任一项所述的方法，其中所述第一溶液是水性缓冲溶液。
142.如权利要求137至141中任一项所述的方法，其中所述第一溶液还包含核酸稳定剂。
143.如权利要求137至142中任一项所述的方法，其中将所述第一溶液和所述第二溶液于管线内混合器中混合。
144.一种脂质纳米颗粒制剂，所述脂质纳米颗粒制剂包含：氨基脂质
表2的PEG-脂质、胆固醇和DSPC。
145.如权利要求144所述的脂质纳米颗粒制剂，其中所述PEG-脂质是：
146.如权利要求144所述的脂质纳米颗粒制剂，其中所述PEG-脂质是：
147.一种纳米颗粒组合物，所述纳米颗粒组合物包含：
(a)一种或多种核酸分子实体；
(b)权利要求8所述的氨基脂质或其盐，
其中所述氨基脂质或其盐占存在于所述纳米颗粒组合
物中的总脂质含量的20mol％至80mol％，
其中所述氨基脂质或其盐包含一个或多个可电离氮原
子，并且
其中所述可电离氮原子与存在于所述核酸分子实体中的磷酸根基团的摩尔比是2至12；
(c)中性脂质，所述中性脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的所述总脂质含量的2mol％至25mol％；
(d)结构脂质，所述结构脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的所述总脂质含量的30mol％至60mol％；
(e)权利要求106所述的PEG-脂质，所述PEG-脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的所述总脂质含量的0.1mol％至6mol％；和
(f)核酸稳定剂，其中所述核酸稳定剂包括壳聚糖、西曲溴铵、具有约120至约2000Da的数量平均分子量的聚乙二醇或它们的组合。
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