CN116904335A - 一种Bt菌株及其在防治黄曲条跳甲方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Bt菌株及其在防治黄曲条跳甲方面的应用，属于生物农药技术领域。所述菌株命名为：BS128，于2023年02月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2023209。本发明通过室内生物活性评价，16000IU/mL苏云金芽孢杆菌BS128菌悬液对黄曲条跳甲3d的LC50值为60.0093μg/mL，16000IU/mL BS128菌悬液9000mL/hm2土壤处理对跳甲防治效果为67.66％，16000IU/mL BS128菌悬液9000mL/hm2叶面喷雾对黄曲条跳甲7d和10d防效分别为61.86％、62.16％，对黄曲条跳甲具有较强毒力，对蔬菜黄曲条跳甲防治作用，可应用于防治蔬菜黄曲条跳甲。
Description
技术领域
本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种Bt菌株及其在防治黄曲条跳甲方面的应用。
背景技术
黄曲条跳甲Phyllotreta striolata(Fabricius)属于鞘翅目叶甲科，是一种世界性的害虫，其主要危害白菜、菜心、萝卜等十字花科蔬菜。幼虫和成虫自春到秋均能为害，苗期受害最重，成虫还可以造成白菜软腐病、黑腐病等病害传播蔓延。在我国南方，黄曲条跳甲由次要害虫上升为主要害虫，有超越小菜蛾成为蔬菜生产上第一大害虫的趋势。该虫在海南省1年发生7-8代，世代重叠。随着海南省种植结构的调整，蔬菜种植面积不断扩大，且大部分地区蔬菜连作、套种等普遍，给黄曲条跳甲连续为害创造了适宜的环境，造成该虫已成为海南省蔬菜主要害虫之一。
而值得关注的是黄曲条跳甲合理有效的防治技术仍然是待解决的科学难题，黄曲条跳甲卵、幼虫等在土壤中不易于防治，成虫擅长跳跃并且抗药性较强，且该虫繁殖速度非常快，无有效的防治方法。目前生产上仍以化学防治为主要手段，且多数采取普遍的叶面喷药技术，无法兼顾土壤中的卵、蛹和幼虫，药剂持效期一过，成虫不断羽化出土危害，菜农增加喷药次数和加大用药量，造成害虫产生抗性，造成化学防治手段失灵。这种长期化学药剂防治不仅加剧了黄曲条跳甲抗药性，而且造成农药残留和环境污染。
采用环境友好的生物防治措施替代化学农药是未来现代化蔬菜产业发展的趋势，因此探索一种有效替代化学防治该虫害的绿色可持续生物防治措施是必然趋势。近年来，生物农药逐渐被开发用于植物病虫害的防治，其研究以及应用也越来越受到重视。而苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是目前世界上产量最大、应用最为广泛的一类微生物杀虫剂。Bt等生物农药是生态环境的调节者，是重点需要探索和替代化学防治的一种有效防治技术，因此，急需筛选出对黄曲条跳甲具有较强毒力的的Bt菌株。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种Bt菌株及其在防治黄曲条跳甲方面的应用，该Bt菌株对黄曲条跳甲具有较强毒力，为黄曲条跳甲绿色可持续防控提供了一种有效手段。
一种Bt菌株，所述菌株命名为：BS128，于2023年02月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏号为：CCTCC M 2023209，拉丁文名称为Bacillusthuringiensis BS128，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学保藏中心)。
进一步地，所述Bt菌株的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述Bt菌株的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种菌剂，含有权利要求1所述的Bt菌株。
上述Bt菌株、上述的菌剂在防治黄曲条跳甲方面的应用。
进一步地，所述菌剂中Bt菌株的浓度为16000IU/mL。
进一步地，将所述菌剂进行叶片喷雾。
进一步地，将所述菌剂进行土壤喷雾。
进一步地，所述黄曲条跳甲为菜心黄曲条跳甲。
本发明具有以下优点：本发明公开了一种Bt菌株，从海南省土壤中分离出的一株对黄曲条跳甲高毒力Bt菌株BS128，根据形态学和分子水平鉴定，明确该菌株属于苏云金芽孢杆菌，含有cry8Ga新型杀虫编码基因。本发明通过室内生物活性评价，16000IU/mL苏云金芽孢杆菌BS128菌悬液对黄曲条跳甲3d的LC50值为60.0093μg/mL，16000IU/mL BS128菌悬液9000mL/hm2土壤处理对跳甲防治效果为67.66％(15d)，16000IU/mL BS128菌悬液9000mL/hm2叶面喷雾对黄曲条跳甲7d和10d防效分别为61.86％、62.16％，对黄曲条跳甲具有较强毒力，对蔬菜黄曲条跳甲防治作用，可应用于防治蔬菜黄曲条跳甲。
附图说明
图1为菌株BS128扫描电镜观察，其中，A：7000倍下的BS128；B：10000倍下正在分离的晶体与芽胞注：S：芽胞(spore)；C：伴胞晶体(crystal)。
图2为Bt菌株BS128的cry8类基因PCR产物及酶切检测电泳结果，图中，M1：λDNA/Eco130I(kb)；1：BuiBui KpnI/DraI酶切消化产物；2：BS128 KpnI/DraI酶切消化产物；3：BuiBui(cry8Ca)PCR扩增产物；4：BS128 cry8类引物鉴定PCR扩增产物；M2：100bp ladder(1500，1000～100bp)。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：实施例1：
1 材料与方法
1.1试验材料
供试作物：用于室内活性和田间药效测定菜心品种为005，购于海南林忠民菜种行有限公司，于2021年5月12播种。试验时期，黄曲条跳甲偏重发生。
培养基：LB固体与液体培养基、1/2LB固体与液体培养基、配制方法参见Sambrook(Sambrook J et al.，1989)。
菌株：Bt菌株分离自海南省海口市土壤样品，菌株BuiBui(FERM BP-3465)由中国农业科学院植保所提供。
鉴定引物序列：具体鉴定引物序列参见表1，其中cry1、cry1i、cry2、cry3引物序列参见文献(张杰,宋福平,左雅慧,等.31株苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因型鉴定及表达产物研究[J].微生物学报,2000,40(4):372-378)，cry4～7、cry9、cry10引物序列参见文献(孙晓东,阎伟,李朝绪,等.苏云金芽胞杆菌的鉴定及对椰子织蛾的致死作用[J].生物安全学报,2016,025(001):49-53.)，cry8引物序列参见文献(王志鑫,束长龙,申培立,等.含cry8型基因苏云金芽孢杆菌的分离和鉴定[J].华北农学报,2014,29(06):149-154.)。
表1鉴定引物及序列
供试虫源：从海南农业科学院蔬菜研究所基地菜心基地采集黄曲条跳甲成虫，实验室新鲜菜心叶片饲喂24h后，挑选健康大小一致的成虫作为室内活性测定虫源。
供试药剂：16000IU/mg的Bt菌株(以下称为苏云金芽孢杆菌BS128)，苏云金芽孢杆菌BS128菌悬液(菌株从海南农业科学院蔬菜研究所基地土壤中分离，本实验室生产)；32000IU/mg苏云金杆菌G033A可湿性粉剂(武汉科诺生物科技有限公司生产)；30％噻虫嗪水分散粒剂(瑞士先正达作物保护有限公司)；
1.2试验地概况
试验地位于海南省海南农业科学院蔬菜研究所试验基地，水、肥条件较好，土质为沙壤土，pH6.8，黄曲条跳甲为害较重。
1.3试验方法
1.3.1Bt扫描电镜样品的制备
分离纯化的Bt菌株在1/2LB固体培养基平板上划线，置30℃培养48h，在无菌工作台上刮取少许菌苔，纯水清洗后再加入适当纯水充分悬浮，将砸碎的细小碎片浸润在悬浮液中2min后取出，低温冷冻干燥后备用。
1.3.2Bt质粒的提取与鉴定
分离纯化后的Bt菌株在液体LB中(230rpm/min、30℃)培养12h，采用Narva(NarvaKE et al.，1991)等的方法提取质粒。采用PCR-RFLP方法对杀虫晶体蛋白基因进行鉴定，提取Bt菌株的质粒DNA进行cry1、cry2、cry3、cry4、cry5、cry6、cry7、cry8、cry9、cry10类基因的PCR-RFLP鉴定，鉴定引物参见表1，鉴定方法参见文献(张杰,宋福平,左雅慧,等.31株苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因型鉴定及表达产物研究[J].微生物学报,2000,40(4):372-378.)。
1.3.3黄曲条跳甲室内活性测试
参照中华人民共和国农业行业标准(NY/T 1154.14-2008)，于2018年6月15号进行。将培养好的苏云金芽孢杆菌BS128菌悬液(16000IU/mg)，用无菌水配制成500、300、150、120、90、60、30μg/mL共7个浓度，及空白对照。采用浸叶法，将大小一致的无虫害菜心叶片浸到配制好的菌悬液中10s，晾干后，放入烧杯中，每杯接入饥饿2h预先CO2麻醉的黄曲条跳甲成虫30头，白纱布封口后置于人工气候箱内，24h换用新鲜的菜心叶片继续饲养，每处理重复5次。试验期间设置温度(25±1)℃、湿度80％±5％和光照12L∶12D。于3d后调查。试虫死亡标准为：用镊子轻触后无明显自主反应。
1.3.4田间黄曲条跳甲田间试验
1.3.4.1土壤处理
表2不同药剂田间试验剂量
每个处理设4次重复，共计32个小区，每小区30m2，随机区组排列。在菜心播种时，将G033A可湿性粉剂拌细土后均匀撒施，将BS128菌悬液、30％噻虫嗪水分散粒剂土壤喷雾，各处理均用旋耕机混匀。
1.3.4.2叶面喷雾
试验设计同1.3.2.1，具体试验剂量同表2。每个处理4次重复，共计32个小区，每小区30m2，随机区组排列。采用日本丸山株式会社生产的MBS151型电动式喷雾器均匀喷雾(压力1.0Mpa)，喷孔直径0.5mm，于黄曲条跳甲成虫大发生前7d，进行对菜心植株均匀喷雾，喷雾量600L/hm2。
1.4调查方法
土壤处理试验于菜心齐苗后20d调查叶片受害情况，参照田间药效试验参考农药田间药效试验准则进行，采用对角线5点取样法，每点取4株菜心植株，每小区调查20株，每株按照下列分级方法记录并计算叶片受害指数，参考文献(曹春霞，黄大野，姚经武等.昆虫病原菌防治萝卜黄曲条跳甲田间应用技术[J].中国生物防治学报,2022,36(6):987-991.)。
叶面喷雾试验调查方法同上，于用药前进行基数调查，用药后3d，7d进行调查，按照下列分级方法记录并计算叶片受害指数。
分级标准为，0级：无被害状；1级：叶片上有零星被害状；3级：叶片上有三分之一以下面积被害；5级：叶片上有三分之一至二分之一面积被害；7级：叶片上有二分之一至三分之二面积被害；9级：叶片上有三分之二以上面积被害。
式中，CK0：空白对照区施药前叶片受害指数；CK1：对照区施药后叶片受害指数；PT0：处理区施药前叶片受害指数；PT1：处理区施药后叶片受害指数。
1.5统计方法
采用数据采用SPSS22.0软件进行处理进行数据的多元统计分析，采用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。
2结果与分析
2.1菌株BS128的形态学鉴定
将菌株BS128在1/2LB培养基上培养48小时后形成单菌落，菌落乳白色，圆形或近圆形，边缘整齐，菌落中间较厚，向四周逐渐变薄，一般38h左右可观察到晶体。扫描电镜下观察到Bt菌株芽胞为长圆棒状，晶体为球形与菱形(图1)，初步鉴定该菌株为苏云金芽胞杆菌。
2.2分子水平的鉴定
BS128的DNA的提取方法同3，对其进行测序，基因序列如SEQ ID NO.1所示，大小为3420bp，Composition：1184A；582C；705G；949T；0OTHER，Percentage:35％ A；17％C；21％G；28％ T；0％OTHER；Molecular Weight(kDa):ssDNA:1059.23dsDNA:2108.0DNA序列NCBI比对Bt菌株FCD114(FJ198072.1)最大相似性99％，基因序列存在21个碱基差异。BS128的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列NCBI比对与Bt菌株toxin pbt145-1(ABC42043.1)最大相似性98％，基因序列存在15个氨基酸差异。
cry基因鉴定引物见表1，分别进行各类cry基因鉴定引物的PCR鉴定，PCR反应体同3，选取已知含有cry8Ca基因的Bt日本亚种BuiBui的质粒DNA作为对照，进行cry1、cry1I、cry2、cry3、cry4、cry5、cry6、cry7、cry8、cry9、cry10类基因的PCR-RFLP鉴定，经鉴定发现该菌株内含有cry8类基因(图2，4泳道)，该PCR产物经过KpnI/DraI酶切消化后产生1.2kb、0.5kb、0.3kb三条带(图2，2泳道)，符合cry8Ga的KpnI/DraI酶切消化片段多态，参考文献(孙晓东,阎伟,李朝绪,等.苏云金芽胞杆菌的鉴定及对椰子织蛾的致死作用[J].生物安全学报,2016,025(001):49-53.)。PCR扩增产物经凝胶回收试剂盒(Takara公司)纯化后连接PMD20-T载体(Takara公司)进行克隆，挑取阳性单克隆送样上海生工进行测序，序列经NCBIBLAST比对后与GeneBank已知序列Sequence ID:gb|DQ212788的最大相似性为98％，确定该菌株含有cry8Ga新型杀虫编码基因。
2.3黄曲条跳甲室内活性测试
16000IU/mL苏云金芽孢杆菌BS128菌悬液对黄曲条跳甲3d的LC50值为60.0093μg/mL，LC90为449.2721μg/mL(表3)，表明该Bt菌株对黄曲条跳甲具有较强的毒性。
表3 16000IU/mL菌株BS128菌悬液对菜心黄曲条跳甲的生物活性
2.4土壤处理对黄曲条跳甲的防治效果
调查结果显示，16000IU/mL BS128与32000IU/mg G033A土壤处理防治菜心黄曲条跳甲具较好的防治效果(15d)，其中16000IU/mL BS128菌悬液6000、9000mL/hm2土壤处理对跳甲防治效果为58.93％和67.66％，32000IU/mg G033A可湿性粉剂3000、4500g/hm2土壤处理对跳甲防治效果65.27％、70.89％，与化学杀虫剂30％噻虫嗪水分散粒剂150g/hm2对跳甲防治效果73.02％无显著性差异，效果相当。
表4不同药剂土壤处理对菜心黄曲条跳甲的防治效果-15d
注：表中数据为平均值±标准误，同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著，P＜0.05为有显著性差异。
2.5叶面喷雾对黄曲条跳甲的防治效果
试验结果可以看出(表5)，施用2种不同的Bt菌株各处理用量下，叶面喷雾对黄曲条跳甲在施药后3d作用效果均显著低于化学药剂30％噻虫嗪水分散粒剂；施药后7d和10d，16000IU/mL BS128菌悬液9000mL/hm 2和32000IU/mg G033A可湿性粉剂2250、3000g/hm2与化学杀虫剂30％噻虫嗪水分散粒剂150g/hm2对菜心黄曲条跳甲防治效果无显著性差异，防治效果相当。随着时间增加，化学农药30％噻虫嗪水分散粒剂防治效果逐渐降低，说明持效性不好。
表5不同药剂叶面喷雾对菜心黄曲条跳甲的防治效果
注：表中数据为平均值±标准误，同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著，P＜0.05为有显著性差异。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种Bt菌株，其特征在于，所述菌株命名为：BS128，于2023年02月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2023209。
2.如权利要求1所述的一种Bt菌株，其特征在于，所述Bt菌株的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
3.如权利要求1所述的一种Bt菌株，其特征在于，所述Bt菌株的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
4.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的Bt菌株。
5.如权利要求1所述Bt菌株、权利要求4所述的菌剂在防治黄曲条跳甲方面的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述菌剂中Bt菌株的浓度为16000IU/mL。
7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，将所述菌剂进行叶片喷雾。
8.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，将所述菌剂进行土壤喷雾。
9.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述黄曲条跳甲为菜心黄曲条跳甲。
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