CN116899014A - 一种三维拓扑结构多通道神经导管及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种三维拓扑结构多通道神经导管及其制备方法，包括：聚己内酯二醇与六亚甲基二异氰酸酯在三口烧瓶中混合进行预聚反应，3,3’‑二氨基联苯胺作为扩链剂加入到反应体系中进行扩链反应，反应产物用去离子水清洗并真空冻干，得到的导电可降解聚氨酯弹性体溶解于溶剂中，得到纺丝溶液；静电纺丝得到纳米纤维导管；纳米纤维导管装配到模具中进行溶液浇铸、预冻和真空冷冻干燥处理，得到三维拓扑结构多通道神经导管。本发明的神经导管具有能够促进并引导周围神经修复过程中神经细胞攀附和伸长的功能，可有效引导周围神经组织的功能性再生，促进损伤神经功能恢复。
Description
技术领域
本发明属于仿生材料技术领域，特别涉及一种三维拓扑结构多通道神经导管及其制备方法。
背景技术
人体中周围神经系统具有结构复杂、分布广泛的特点，这使得周围神经损伤成为较为常见的一种神经损伤-外伤创伤、缺血缺氧、神经退变等都会引起神经损伤，周围神经损伤会导致神经传导途径中断，靶器官功能受损，进而发生机体功能发生障碍。尽管周围神经具有一定的自我修复能力，但这种自我修复能力是有限的。根据研究，当周围神经缺损较小(一般小于5mm)时，在特定的条件下可以自我修复；而当周围神经缺损较大时，再生的神经难以精确桥接缺损的神经两端，通常情况下无法自我修复，因此长距离的神经损伤需要外在介入进行治疗。目前，治疗长距离神经损伤常用的方法是自体神经移植，仍然是治疗长距离神经损伤的“金标准”，但自体神经移植有供体神经严重不足、需要二次手术以及神经不匹配等问题，而异体神经移植则会引起免疫排斥反应。因此，急需一种具有优良的生物相容性以及促神经再生功能的神经导管，用于长距离周围神经缺损的原位再生。
周围神经的内部是由多个神经束组成的，模拟这种多神经束的结构制备多通道的神经导管。实验表明，这种结构确实能够对神经修复起到非常好的促进作用，多通道的神经导管也为细胞的生长提供较大的细胞附着面积，同时也引导再生轴突的定向生长，避免神经分散紊乱。人工神经导管移植是一种理想的替代自体移植的方法，已有大量的临床结果表明人工神经导管对于30mm以内的神经缺损修复结果与自体移植效果接近。然而，对于30mm以上的长距离神经损伤，开发出相应的人工神经导管产品仍然是一大难点。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种三维拓扑结构多通道神经导管的制备方法，导电可降解聚氨酯弹性体静电纺丝得到神经导管外层，嵌套入模具后，通过热致相分离将导电可降解聚氨酯弹性体溶液浇铸到多通道模具中进行预冻、真空冷冻干燥定型，得到具有三维拓扑结构的多通道神经导管，该神经导管具有能够促进并引导周围神经修复过程中神经细胞攀附和伸长的功能，可有效引导周围神经组织的功能性再生，促进损伤神经功能恢复。
本发明的另一目的是提供一种三维拓扑结构多通道神经导管，通过上述三维拓扑结构多通道神经导管的制备方法制得。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供一种三维拓扑结构多通道神经导管的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：聚己内酯二醇(PCL diol)与六亚甲基二异氰酸酯(HDI)在三口烧瓶中混合，在一定温度下进行预聚反应2～3h，扩链剂3,3’-二氨基联苯胺(DAB)加入到反应体系中，在一定温度下进行扩链反应36～48h，反应结束后，将产物用去离子水清洗并真空冻干，得到导电可降解聚氨酯弹性体(PEAUU)；
步骤2：步骤1中合成的导电可降解聚氨酯弹性体溶解于溶剂中，得到纺丝溶液；
步骤3：步骤2中所得纺丝溶液进行静电纺丝，得到纳米纤维导管；
步骤4：步骤3中所得纳米纤维导管装配到模具中进行溶液浇铸、预冻和真空冷冻干燥处理，得到三维拓扑结构多通道神经导管。
优选地，步骤1中，预聚反应温度为40～80℃，扩链反应温度为40～60℃，才能合成具有综合性能稳定的导电可降解聚氨酯弹性体。
优选地，步骤1中，聚己内酯二醇、六亚甲基二异氰酸酯和3,3’-二氨基联苯胺的摩尔比为1：2：0.5～1.2。
优选地，步骤2中，所述溶剂选自六氟异丙醇(HFIP)、二甲基亚砜(DMSO)、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、四氢呋喃中的一种或多种，纺丝溶液的质量-体积浓度(w/v，单位：g/mL)为5％～20％。
优选地，步骤3中，所述纳米纤维导管的纤维直径为100～1000nm。
优选地，步骤4中，所述溶液浇铸采用的溶液为二甲基亚砜溶解的PEAUU溶液，质量-体积浓度为6％～20％。
优选地，步骤4中，所述模具为内部放置有六个直径为0.1～0.8mm的圆柱状316L不锈钢质轴芯的圆柱体，其为聚四氟乙烯材质的可拆卸模具，包括对称的模具盖口和轴芯塞口、外鞘管和轴芯，以此获得六通道的神经导管。
优选地，步骤4中，预冻温度为-10～-196℃，真空冷冻干燥温度为-75～-120℃。
更优选地，步骤4中，所述三维拓扑结构多通道神经导管的制备包括：
步骤a：称取步骤1中合成得到的导电可降解聚氨酯弹性体，在60～80℃的油浴条件下溶解于二甲基亚砜中，搅拌溶解，获得澄清均一的溶液；
步骤b：将溶液迅速浇铸到带有纳米纤维导管的模具内，迅速放置在-10～-196℃条件下使其相分离，放置时间24h以上；
步骤c：取出模具，退去模具的外壳后浸泡在超纯水与冰的0℃混合液中，5min后将管状支架从模具的轴芯上褪下，继续浸泡在0℃超纯冰水混合液中，每隔6h换一次水交换溶剂48～96h；
步骤d：从去离子水中取出管状支架，以-75～-120℃的温度冷冻干燥48h以上，得到三维拓扑结构多通道神经导管。
本发明还提供一种三维拓扑结构多通道神经导管，其包括外层和内层，所述外层为导电可降解聚氨酯弹性体纳米纤维层，通过静电纺丝工艺得到；所述内层为多通道结构的大孔蓬松海绵基质，通过导电可降解聚氨酯弹性体热致相分离和模塑成型得到。
本发明还提供一种三维拓扑结构多通道神经导管在医用仿生材料中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明中使用导电可降解聚氨酯弹性体作为制备神经导管的基底材料，一方面其导电性能够促进神经修复，另一方面其优异的力学性能和较低的溶胀率能够防止在修复周围神经损伤时由于运动等原因挤压神经造成的二次损伤。
2、本发明中三维拓扑结构多通道神经导管使用六通道的宏观结构模拟周围神经的神经束结构，能够引导神经相关宿主细胞长入，同时对神经修复也有很好的导向作用。
3、本发明中外层使用静电纺丝技术制备纳米纤维层，其孔径能够达到1～10微米，既能够防止外部成纤维细胞侵入形成瘢痕，又能够正常传输营养物质。
4、本发明中内层使用热致相分离的技术制备大孔蓬松海绵状基质，引导、促进神经细胞快速生长，缩短神经修复时间。
5、本发明采用先静电纺丝成管，再将静电纺丝导管嵌套至模具中，最后浇铸导电可降解聚氨酯弹性体溶液的加工过程，与先进行模具浇铸再在外层静电纺丝的加工过程相比，有效消除电纺纤维层与热致相分离大孔蓬松海绵基质之间发生分层、贴合不紧密的可能性，从而防止在周围神经修复的过程中，导管内部空隙导致的神经组织分散紊乱、增生疤痕等问题。
附图说明
图1为实施例中模具的结构示意图，其中：1和3为模具盖口；2为外鞘管；4和6为塞口模具盖上的轴芯塞口；5为轴芯。
图2为实施例中制备的三维拓扑结构多通道神经导管结构示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例制备三维拓扑结构多通道神经导管，步骤如下：
称取3.0g聚己内酯二醇置于三颈烧瓶中，加热至120℃除去水分，并置于氮气氛围中。降温至80℃，加入0.48mL六亚甲基二异氰酸酯，预聚2h，再降温至60℃，加入0.33g 3,3’-二氨基联苯胺，扩链48h。
使用去离子水洗涤3天，放入-80℃冰箱冷冻48h，取出后冷冻干燥60h，得到导电可降解聚氨酯弹性体，保存在-4℃冰箱中备用。
在分析天平上称取0.8g导电可降解聚氨酯弹性体，加入到螺口反应瓶中，再加入10mL六氟异丙醇，置于60℃水浴锅中，磁力搅拌48h，得到均一透明的纺丝溶液。随后，将混合溶液放入针管里放置在静电纺丝台上以15kV的静电压、1mL/h的流速、20cm的针尖到接收器距离进行静电纺丝，得到外径为6mm的导管，室温通风状态下放置三天，使其中残余的有机溶剂挥发完全，再将其放置到聚四氟乙烯模具中备用。
再称取0.1g的导电可降解聚氨酯弹性体，在60℃条件下溶解于1mL的二甲基亚砜中，得到质量-体积浓度为10％的热的导电可降解聚氨酯的二甲基亚砜溶液。随后将溶液迅速浇铸到之前装配好的带有电纺层的订制的聚四氟乙烯模具中，迅速放置在-10℃条件下使其相分离，放置24h。
之后取出模具，退去模具的外壳后浸泡在0℃超纯冰水混合物中，5min后将管状支架从模具的轴芯上褪下继续浸泡在0℃超纯冰水混合物中，每隔6h换一次水交换溶剂48h，从去离子水中取出管状支架后在-75℃条件下冷冻干燥24h，得到外径6mm的内部具有六个内径1mm通道的三维拓扑结构神经导管。
实施例2
称取5.0g聚己内酯二醇置于三颈烧瓶中，加热至120℃除去水分，并置于氮气氛围中。降温至60℃，加入0.8mL六亚甲基二异氰酸酯，预聚2h。再降温至40℃，加入0.56g 3,3’-二氨基联苯胺，扩链36h。
使用去离子水洗涤3天，放入-80℃冰箱冷冻48h，取出后冷冻干燥60h，得到导电可降解聚氨酯弹性体，保存在-4℃冰箱中备用。
在分析天平上称取1.2g导电可降解聚氨酯弹性体，加入到螺口反应瓶中，再加入10mL丙酮，置于60℃水浴锅中，磁力搅拌48h，得到均一透明的纺丝溶液。随后，将混合溶液放入针管里放置在静电纺丝台上以15kV的静电压、1mL/h的流速、20cm的针尖到接收器距离进行静电纺丝，得到外径为8mm的导管，室温通风状态下放置三天，使其中残余的有机溶剂挥发完全，再将其放置到聚四氟乙烯模具中备用。
再称取0.2g的导电可降解聚氨酯弹性体，在60℃条件下溶解于1mL的二甲基亚砜中，得到质量-体积浓度为20％的热的导电聚氨酯的二甲基亚砜溶液。随后将溶液迅速浇铸到之前装配好的带有电纺层的订制的聚四氟乙烯模具中，迅速放置在-196℃条件下使其相分离，放置48h。
之后取出模具，退去模具的外壳后浸泡在0℃超纯冰水混合物中，5min后将管状支架从模具的轴芯上褪下继续浸泡在0℃超纯冰水混合物中，每隔6h换一次水交换溶剂48h，从去离子水中取出管状支架后在-120℃条件下冷冻干燥48h，即得到外径8mm的内部具有六个内径1mm通道的三维拓扑结构神经导管。
实施例2制得的三维拓扑结构多通道神经导管结构如图2所示，外层为电纺层，内层为多通道结构的热致相分离层。
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于，聚己内酯二醇、六亚甲基二异氰酸酯、3,3’-二氨基联苯胺摩尔比调整为1：2：0.5，导电可降解聚氨酯弹性体的导电能力下降。
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于，用于浇铸的导电可降解聚氨酯弹性体的二甲基亚砜溶液的质量-体积浓度为5％，得到的大孔蓬松海绵基质孔径大于10微米。
对比例3
对比例3与实施例1的区别在于，外层电纺溶液(w/v)从8％调整到5％，很难稳定出丝。
性能测试
分别对各实施例和对比例的神经导管与雪旺细胞共同培养48h后，雪旺细胞迁移面积和迁移距离进行统计。
所用导管材料进行灭菌后，取血旺悬浮液以1.0×105个/孔的种植量直接种植到底部铺有导管膜材的24孔板中，24孔板上的每个孔在种植细胞前均用特制的316L不锈钢条叠压，将孔分成两个部分，钢条叠压的区域即为细胞可迁移铺展的区域。12h后待种植的细胞已粘附在样品膜上，小心拿出叠压的钢条，继续培养48h，然后测量细胞迁移情况，具体步骤依次为：4％的多聚甲醛固定孔板里的细胞4h以上，PBS清洗3遍以上，0.1％Triton X-100通透20min，加入罗丹明标记的鬼笔环肽、DAPI染液，分别依次染色15min。最后，在倒置荧光显微镜下观察染色的细胞核与原始状态相比的迁移距离。将细胞迁移距离划分为三个区间＜225μm、225～450μm以及＞450μm，随机选取三个视野，定量统计各个区间中细胞数目，结果见表1和表2：
表1：细胞铺展面积测量数据
| 样品 | 雪旺细胞铺展面积(×106μm2) |
| 实施例1 | 2.1 |
| 实施例2 | 1.9 |
| 对比例1 | 0.7 |
| 对比例2 | 1.1 |
| 对比例3 | 1.5 |
如表1可见，只有严格按照聚氨酯各原材料的配比、纺丝溶液的配置参数、纺丝参数和后处理参数，通过静电纺丝加热致相分离浇铸的方法，才能获得能够促进周围神经修复的多通道神经导管。
表2：定量统计不同迁移距离范围内不同组别的细胞占迁移总细胞数的百分比
| 样品 | ＜225μm(％) | 225～450μm(％) | ＞450μm(％) |
| 实施例1 | 89 | 42 | 19 |
| 实施例2 | 83 | 34 | 16 |
| 对比例1 | 38 | 19 | 7 |
| 对比例2 | 65 | 25 | 11 |
| 对比例3 | 76 | 28 | 13 |
如表2可知，迁移区细胞面积的定量和不同迁移距离处细胞占总迁移细胞的百分数统计结果可见，只有严格按照聚氨酯各原材料的配比、纺丝溶液的配置参数、纺丝参数和后处理参数，通过静电纺丝加热致相分离浇铸的方法，才能获得能够促进周围神经修复相关细胞高效迁移的多通道神经导管。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。
Claims (9)
1.一种三维拓扑结构多通道神经导管的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：聚己内酯二醇与六亚甲基二异氰酸酯在三口烧瓶中混合，在一定温度下进行预聚反应2～3h，3,3’-二氨基联苯胺作为扩链剂加入到反应体系中，在一定温度下进行扩链反应36～48h，反应结束后，将产物用去离子水清洗并真空冻干，得到导电可降解聚氨酯弹性体；
步骤2：步骤1中合成得到的导电可降解聚氨酯弹性体溶解于溶剂中，得到纺丝溶液；
步骤3：步骤2中所得纺丝溶液进行静电纺丝，得到纳米纤维导管；
步骤4：步骤3中所得纳米纤维导管装配到模具中进行溶液浇铸、预冻和真空冷冻干燥处理，得到三维拓扑结构多通道神经导管。
2.根据权利要求1所述三维拓扑结构多通道神经导管的制备方法，其特征在于，步骤1中，预聚反应温度为40～80℃，扩链反应温度为40～60℃。
3.根据权利要求1所述三维拓扑结构多通道神经导管的制备方法，其特征在于，步骤1中，聚己内酯二醇、六亚甲基二异氰酸酯和3,3’-二氨基联苯胺的摩尔比为1：2：0.5～1.2。
4.根据权利要求1所述三维拓扑结构多通道神经导管的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述溶剂选自六氟异丙醇、二甲基亚砜、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺和四氢呋喃中的一种或多种；所述纺丝溶液的质量-体积浓度为5％～20％。
5.根据权利要求1所述三维拓扑结构多通道神经导管的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述纳米纤维导管的纤维直径为100～1000nm。
6.根据权利要求1所述三维拓扑结构多通道神经导管的制备方法，其特征在于，步骤4中，所述溶液浇铸采用的溶液为二甲基亚砜溶解的导电可降解聚氨酯弹性体溶液，质量-体积浓度为6％～20％；
所述模具为内部放置有六个直径为0.1～0.8mm的圆柱状316L不锈钢质轴芯的圆柱体，其为聚四氟乙烯材质的可拆卸模具，包括对称的模具盖口和轴芯塞口、外鞘管和轴芯；
预冻温度为-10～-196℃，真空冷冻干燥温度为-75～-120℃。
7.根据权利要求6所述三维拓扑结构多通道神经导管的制备方法，其特征在于，步骤4中，所述三维拓扑结构多通道神经导管的制备包括：
步骤a：称取所述导电可降解聚氨酯弹性体，在60～80℃的油浴条件下溶解于二甲基亚砜中，搅拌溶解，获得澄清均一的导电可降解聚氨酯弹性体溶液；
步骤b：将步骤a所得的导电可降解聚氨酯弹性体溶液迅速浇铸到带有纳米纤维导管的模具内，迅速放置在-10～-196℃条件下使其相分离，放置时间24h以上；
步骤c：取出模具，退去模具的外壳后浸泡在超纯水与冰的0℃混合液中，5min后将管状支架从模具的轴芯上褪下，继续浸泡在0℃超纯冰水混合液中，每隔6h换一次水交换溶剂48～96h；
步骤d：从去离子水中取出管状支架，以-75～-120℃的温度冷冻干燥48h以上，得到三维拓扑结构多通道神经导管。
8.一种三维拓扑结构多通道神经导管，其特征在于，通过权利要求1至7任一项所述三维拓扑结构多通道神经导管的制备方法制得。
9.根据权利要求8所述的三维拓扑结构多通道神经导管，其特征在于，包括外层和内层，所述外层为导电可降解聚氨酯弹性体纳米纤维层，通过静电纺丝工艺得到；所述内层为多通道结构的大孔蓬松海绵状基质，通过导电可降解聚氨酯弹性体热致相分离和模塑成型得到。
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