CN116898862A - 一种抑菌组合物、抑菌药物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抑菌组合物、抑菌药物及应用，属于天然化合物与抗生素联合应用技术领域；所述抑菌组合物由维生素C和磺胺甲恶唑组成。在本发明的抑菌组合物中，维生素C和磺胺甲恶唑各自发挥其抗菌活性从而达到体内外协同抗菌效果。维生素C可显著增加致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等病原体对磺胺甲恶唑的敏感性，提高磺胺甲恶唑杀菌能力，减少磺胺甲恶唑的使用剂量，降低磺胺甲恶唑的毒副作用。本发明的抑菌组合物在体外具有较强的协同抗肠出血性大肠杆菌活性，对感染肠出血性大肠杆菌的小鼠也具有一定的疗效。本发明的抑菌组合物可应用于致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等致病菌所致感染的临床治疗，为寻找已有抗菌药物增敏剂提供参考。

Description

一种抑菌组合物、抑菌药物及应用
技术领域
本发明属于天然化合物与抗生素联合应用技术领域，具体涉及一种抑菌组合物、抑菌药物及应用。
背景技术
根据世卫组织全球抗微生物药物耐药性和使用监测系统(GLASS)2022年报告，在低收入和中等收入国家，导致致命感染或常见感染的病原体对抗生素的耐药性明显增强。抗菌药物耐药性是全世界人类健康的一个主要威胁，估计每年直接导致127万人死亡。因此，全球迫切需要发现新的抗微生物药物种类和治疗方案以对抗细菌感染。复方新诺明是世界卫生组织推荐使用的关键抗菌药物之一，由两种不同叶酸拮抗剂磺胺甲恶唑(Sulfamethoxazole)和甲氧苄啶(Trimethoprim)以1:5的质量比例组合而成。磺胺甲恶唑是应用最早的人工合成抗菌药物，一般认为其为抑菌剂；其化学结构与叶酸前体物质对氨基苯甲酸类似，能竞争结合二氢喋酸合成酶，抑制二氢蝶酸的合成，最终引起甲硫氨酸、甘氨酸、泛酸、嘌呤以及胸腺嘧啶缺乏。磺胺甲恶唑因其抗菌谱广、成本低廉，对葡萄球菌和大肠杆菌具有较强抗菌效果，常用于治疗泌尿道感染、肠道感染以及禽霍乱等，或与甲氧苄啶组合作为复方新诺明被频繁用于治疗呼吸道感染、伤寒、及沙门氏菌感染、卡氏肺孢子虫病、奴卡菌病等，也可用于预防流行性脑膜炎和疟疾。甲氧苄啶通过抑制细菌二氢叶酸还原酶活性、阻断四氢叶酸叶酸合成来抑制细菌生长；最初作为磺胺类药物的增效剂使用，是复方新诺明的另一种主要活性成分。自二十世纪60年代末起，复方新诺明在世界范围内得到广泛应用，耐药性问题也随之而来。尽管如此，复方新诺明因其抗菌谱广、成本低廉容易获得等优点，目前仍然在世界卫生组织推荐使用的关键抗菌药物中占有一席之地。病原菌对复方新诺明的耐药性可细分为对两种单一成分的耐药性。从临床数据来看，甲氧苄啶的耐药性问题远比磺胺甲恶唑严重。自1972年以来，已在多种致病性病原菌中鉴定了20多种不同的二氢叶酸还原酶突变基因，这些突变基因大多位于可转移遗传元件如质粒上，病原菌通过获得这些突变基因对甲氧苄啶产生耐药。因此，有必要开发磺胺甲恶唑的新型增效剂，与前者组成新的联合抗菌药物组合，以有效应对日益严重的甲氧苄啶耐药性问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑菌组合物、抑菌药物及应用，抑菌组合物中的维生素C能提高磺胺甲恶唑的抗菌作用，减少磺胺甲恶唑的使用剂量。
本发明提供了一种抑菌组合物，由维生素C和磺胺甲恶唑组成。
优选的，当所述抑菌组合物的抑菌对象为致病性大肠杆菌时，所述维生素C和磺胺甲恶唑的质量比为(0.011～5.632)：(0.000125～0.001)；当所述抑菌组合物的抑菌对象为沙门氏菌时，所述维生素C和磺胺甲恶唑的质量比为(0.044～5.632)：(0.000625～0.005)。
优选的，当所述抑菌组合物的抑菌对象为致病性大肠杆菌时，所述维生素C和磺胺甲恶唑的质量比为(0.044～2.816)：(0.00025～0.0005)；当所述抑菌组合物的抑菌对象为沙门氏菌时，所述维生素C和磺胺甲恶唑的质量比为(0.176～2.816)：(0.00125～0.0025)。
优选的，当所述抑菌组合物的抑菌对象为致病性大肠杆菌时，所述维生素C和磺胺甲恶唑磺胺的质量比为3：0.1或8.806：1；当所述抑菌组合物的抑菌对象为沙门氏菌时，所述维生素C和磺胺甲恶唑磺胺的质量比为8.806：1。
本发明还提供了上述方案所述的抑菌组合物在制备杀菌剂或抑菌药物中的应用。
本发明还提供了上述方案所述的抑菌组合物在制备抗致病菌或者治疗致病菌感染的药物中的应用。
优选的，所述致病菌包括肠道致病菌；所述肠道致病菌包括致病性大肠杆菌和/或沙门氏菌。
优选的，所述致病性大肠杆菌包括肠出血性大肠杆菌；所述沙门氏菌包括鼠伤寒沙门氏菌。
本发明还提供了一种抑菌药物，包括上述方案所述的抑菌组合物和药学上可接受的辅料。
优选的，所述抑菌组合物中维生素C为注射剂型，磺胺甲恶唑为口服剂型。
本发明提供了一种抑菌组合物，由维生素C和磺胺甲恶唑组成。在本发明的抑菌组合物中，维生素C和磺胺甲恶唑各自发挥其抗菌活性，能够达到良好的体内外协同抗菌效果。维生素C可显著增加致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等病原体对磺胺甲恶唑的敏感性，降低磺胺甲恶唑对病原体的最小抑菌浓度，提高磺胺甲恶唑杀菌能力，减少磺胺甲恶唑的使用剂量，降低磺胺甲恶唑的毒副作用。体外实验结果证明，维生素C可以显著增加致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等病原体对磺胺甲恶唑的敏感性，并赋予抑菌抗生素磺胺甲恶唑杀菌能力。小鼠感染动物模型也证实，维生素C可以显著促进磺胺甲恶唑对感染致病性大肠杆菌小鼠的治疗效果。磺胺甲恶唑与维生素C的组合物，可应用于致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等致病菌所致感染的临床治疗，为寻找已有抗菌药物增敏剂(例如叶酸拮抗剂类抗生素增敏化合物)提供了参考。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为磺胺甲恶唑与维生素C联用对致病性大肠杆菌的体外杀菌曲线图(**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，与磺胺甲恶唑单独处理组相比)；
图2为磺胺甲恶唑与维生素C联用对鼠伤寒沙门氏菌的体外杀菌曲线图(**P<0.01，****P<0.0001，与磺胺甲恶唑单独处理组相比；┈代表检测限)；
图3为实施例3中给药四天各组小鼠粪便载菌量(**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，与模型组相比)；
图4为实施例3中给药四天后各组小鼠盲肠内容物中致病菌载量(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
具体实施方式
本发明提供了一种抑菌组合物，由维生素C和磺胺甲恶唑组成。
在本发明中，当所述抑菌组合物的抑菌对象为致病性大肠杆菌时，所述维生素C和磺胺甲恶唑的质量比优选为(0.011～5.632)：(0.000125～0.001)，更优选为(0.044～2.816)：(0.00025～0.0005)，进一步优选为3：0.1或8.806：1。
在本发明中，当所述抑菌组合物的抑菌对象为致病性大肠杆菌时，所述维生素C和磺胺甲恶唑的质量比为(0.011～5.632)：(0.000125～0.001)，维生素C和磺胺甲恶唑联合抗菌能达到部分协同或显著协同作用；当所述抑菌组合物的抑菌对象为致病性大肠杆菌时，所述维生素C和磺胺甲恶唑的质量比为(0.044～2.816)：(0.00025～0.0005)，维生素C和磺胺甲恶唑联合抗菌能达到显著协同作用。在本发明中，当所述抑菌组合物的抑菌对象为致病性大肠杆菌时，浓度为0.044mg/mL、0.088mg/mL、1.408mg/mL维生素C与浓度为0.0005mg/mL磺胺甲恶唑；浓度为0.176mg/mL、0.704mg/mL、2.816mg/mL维生素C与浓度为0.00025mg/mL磺胺甲恶唑；浓度为0.352mg/mL维生素C与浓度为0.000125mg/mL磺胺甲恶唑具有显著协同作用，其中维生素浓度为0.352mg/mL、磺胺甲恶唑浓度为0.000125mg/mL时为最优药物组合。
在本发明中，当所述抑菌组合物的抑菌对象为沙门氏菌时，所述维生素C和磺胺甲恶唑的质量比优选为(0.044～5.632)：(0.000625～0.005)，更优选为(0.176～2.816)：(0.00125～0.0025)。在本发明中，当所述抑菌组合物用于体外抑制沙门氏菌时，所述维生素C和磺胺甲恶唑的质量比优选为8.806：1。
在本发明中，当所述抑菌组合物的抑菌对象为沙门氏菌时，所述维生素C和磺胺甲恶唑的质量比为(0.044～5.632)：(0.000625～0.005)，维生素C和磺胺甲恶唑联合抗菌能达到部分协同或显著协同作用；当所述抑菌组合物的抑菌对象为沙门氏菌时，所述维生素C和磺胺甲恶唑的质量比为(0.176～2.816)：(0.00125～0.0025)，维生素C和磺胺甲恶唑联合抗菌能达到显著协同作用。在本发明中，当所述抑菌组合物的抑菌对象为沙门氏菌时，浓度为0.176mg/mL、1.408mg/mL维生素C与浓度为0.0025mg/mL磺胺甲恶唑；浓度为0.352mg/mL、0.704mg/mL、2.816mg/mL维生素C与浓度为0.00125mg/mL磺胺甲恶唑具有显著协同作用，其中维生素浓度为0.352mg/mL、磺胺甲恶唑浓度为0.00125mg/mL时为最优药物组合。
在本发明中，所述维生素C和磺胺甲恶唑各自发挥其抗菌活性从而达到体内外协同抗菌效果。维生素C可显著增加致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等病原体对磺胺甲恶唑的敏感性，降低磺胺甲恶唑对病原体的最小抑菌浓度，提高磺胺甲恶唑杀菌能力，减少磺胺甲恶唑的使用剂量，降低磺胺甲恶唑的毒副作用。
在本发明中，所述磺胺甲恶唑优选为磺胺甲恶唑粉末；所述磺胺甲恶唑和维生素C来源于常规市售。在本发明中，所述磺胺甲恶唑和维生素C购自于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。
本发明还提供了上述方案所述的抑菌组合物在制备杀菌剂或抑菌药物中的应用。
在本发明中，所述杀菌剂或抑菌药物的抑菌对象优选的包括致病菌；所述致病菌优选的包括肠道致病菌；所述肠道致病菌优选的包括致病性大肠杆菌和/或沙门氏菌；所述致病性大肠杆菌优选的包括肠出血性大肠杆菌；所述肠出血性大肠杆菌包括肠出血性大肠杆菌O157:H7；所述肠出血性大肠杆菌O157:H7的保藏编号优选为CICC 21530；所述沙门氏菌优选的包括鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；所述鼠伤寒沙门氏菌的保藏编号优选为CICC 21484。
在本发明中，当所述杀菌剂或抑菌药物的抑菌对象为致病性大肠杆菌时，所述维生素C的浓度优选为0.044mg/mL、0.088mg/mL、1.408mg/mL、0.176mg/mL、0.352mg/mL、0.704mg/mL或2.816mg/mL；所述磺胺甲恶唑的浓度优选为0.000125mg/mL、0.00025mg/mL或0.0005mg/mL。
在本发明中，当所述杀菌剂或抑菌药物的抑菌对象为沙门氏菌时，所述维生素C的浓度优选为0.352mg/mL、0.176mg/mL、0.704mg/mL、1.408mg/mL或2.816mg/mL；所述磺胺甲恶唑的浓度优选为0.00125mg/mL或0.0025mg/mL。
本发明对所述杀菌剂或抑菌药物的使用方法没有特殊限制，采用本领域的常规方法即可。
本发明还提供了上述方案所述的抑菌组合物在制备抗致病菌或者治疗致病菌感染的药物中的应用。
在本发明中，所述致病菌优选的包括肠道致病菌；所述肠道致病菌优选的包括致病性大肠杆菌和/或沙门氏菌。在本发明中，所述致病性大肠杆菌优选的包括肠出血性大肠杆菌；所述肠出血性大肠杆菌优选的包括肠出血性大肠杆菌O157:H7；所述肠出血性大肠杆菌O157:H7的保藏编号优选为CICC 21530。在本发明中，所述沙门氏菌优选的包括鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；所述鼠伤寒沙门氏菌的保藏编号优选为CICC 21484。
在本发明中，所述抗致病菌包括体外和/或体内抗致病菌。
在本发明中，所述治疗致病菌感染优选的包括减少肠道致病菌定植数量和排菌量。
在本发明中，将所述药物用于体内抗肠出血性大肠杆菌时，所述抑菌组合物中维生素C的工作剂量以小鼠给药计优选为3g/kg，所述抑菌组合物中磺胺甲恶唑的工作剂量以小鼠给药计优选为100mg/kg。
在本发明中，所述抑菌组合物中维生素C为注射剂型，磺胺甲恶唑为口服剂型；所述药物优选为控释制剂。
本发明还提供了一种抑菌药物，包括上述方案所述的抑菌组合物和药学上可接受的辅料。
在本发明中，所述抑菌组合物中维生素C为注射剂型，磺胺甲恶唑为口服剂型。
在本发明中，所述口服剂型优选为片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂。在本发明中，所述抑菌药物优选为控释制剂。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种抑菌组合物、抑菌药物及应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明所述的磺胺甲恶唑和维生素C是已商业化的化学合成化合物，可采用任何已公开文献制备或直接购买分析级产品。本发明所述的体外研究包括棋盘法和杀菌曲线测定法。棋盘法中的微量棋盘稀释法，是最常用的联合用药筛选方法之一。微量棋盘稀释法以药物的最低抑菌浓度为最高浓度进行稀释，力图找到两种药物在亚抑菌浓度下仍能表现出较强抑菌活性的组合。本发明所述的FIC值是联合抑菌指数值，是对两种药物联合药物敏感作用的评价指标。两种抗菌药同时使用时，可出现显著协同、部分协同、相加、无关和拮抗五种情况，其判读标准：FIC≤0.5，显著协同效应；0.5<FIC<1，部分协同效应；FIC＝1，相加效应；1<FIC<4，无关效应；FIC≥4，拮抗效应。本发明采用常用的体外杀菌曲线测定法分析磺胺甲恶唑和维生素C的体外抗菌效果。本发明采取灌胃法构建致病性大肠杆菌O157:H7感染小鼠模型，该方法较常用于肠道致病菌感染小鼠模型的构建，不易造成小鼠急性损伤，且有利于模拟肠道致病菌感染后肠道排菌情况。
下面通过采取磺胺甲恶唑与维生素C对致病性大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌敏感性和杀菌效果的体外研究以及磺胺甲恶唑联合维生素C对感染致病性大肠杆菌小鼠的治疗作用进行详细说明。
实施例1对致病性大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌对磺胺甲恶唑联合维生素C敏感性的体外研究
1、实验菌种：肠出血性大肠杆菌(Escherichia coli O157:H7)CICC 21530；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)CICC 21484。
2、主要试剂：磺胺甲恶唑粉末；维生素C；酵母水解物；胰蛋白胨(均购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)；七水合硫酸镁；一水合柠檬酸；三水合磷酸氢二甲；磷酸氢钠铵四水合物；细胞培养用D-(+)-葡萄糖；氯化钠(均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。
3、实验方法：分别配制6mg/mL磺胺甲恶唑母液(溶解于二甲基亚砜)和176.12mg/mL维生素C母液(溶解于双蒸水)；配制LB液体生长培养基和E基本培养基(MgSO4·7H2O0.2g，Citric acid·H2O 2g，K2HPO4·3H2O 13g，NaNH4HPO4·4H2O 3.5g，用Milli-Q超纯水定容至1L，121℃高温高压灭菌15min，待冷却后加入终浓度为0.5％的葡萄糖)。两种药物母液事先分别用基本培养基进行2倍连续稀释，采用棋盘设计法将相应浓度的两种药物或空白基本培养基各50μL混合并加于96孔板中，每个孔板同时设置单药物组、菌液阴性组以及不含药物组作为对照。O157:H7和Salmonella typhimurium于新鲜LB液体中在37℃下培养至OD600nm≈0.6左右，收集菌体用E基本培养基重悬洗涤2遍，然后在每孔中添加100μl新鲜菌液使其终浓度为105cfu/ml，菌液阴性对照孔用空白基本培养基代替，微孔板在37℃下静置避光培养36～48h后观察菌液是否澄清并分别读取药物单独处理时的最小抑菌浓度MICA、MICB，以及两种化合物共同处理时每种药物的最小抑菌浓度A、B。以上实验重复三次。
4、数据处理：按照式1所示公式计算出分级抑制浓度指数(FICI)值：
式1中，A为磺胺甲恶唑，B为维生素C。
5、实验结果
表1磺胺甲恶唑与维生素C对O157:H7的联合抗菌作用
由表1可知，对O157:H7的联合抗菌中，浓度为0.044mg/mL、0.088mg/mL、1.408mg/mL维生素C与浓度为0.0005mg/mL磺胺甲恶唑；浓度为0.176mg/mL、0.704mg/mL、2.816mg/mL维生素C与浓度为0.00025mg/mL磺胺甲恶唑；浓度为0.352mg/mL维生素C与浓度为0.000125mg/mL磺胺甲恶唑具有显著协同作用，其中维生素浓度为0.352mg/mL、磺胺甲恶唑浓度为0.000125mg/mL时为最优药物组合。
表2磺胺甲恶唑与维生素C对Salmonella typhimurium的联合抗菌作用
由表2可知，对Salmonella typhimurium的联合抗菌中，浓度为0.176mg/mL、1.408mg/mL维生素C与浓度为0.0025mg/mL磺胺甲恶唑；浓度为0.352mg/mL、0.704mg/mL、2.816mg/mL维生素C与浓度为0.00125mg/mL磺胺甲恶唑具有显著协同作用，其中维生素浓度为0.352mg/mL、磺胺甲恶唑浓度为0.00125mg/mL时为最优药物组合。
通过微量棋盘稀释法鉴定磺胺甲恶唑与维生素C对致病性大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的联合药物敏感作用结果可知，维生素C增加了致病性大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌对磺胺甲恶唑的敏感性，联合处理使得磺胺甲恶唑在亚抑制浓度仍具有抑菌效果。
实施例2磺胺甲恶唑联合维生素C对致病性大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌杀菌效果的体外测定
1、实验菌种：肠出血性大肠杆菌(Escherichia coli O157:H7)CICC 21530；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。
2、主要试剂:琼脂粉(均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。
3、实验方法：O157:H7和Salmonella typhimurium分别于新鲜LB液体中在37℃下培养至OD600nm≈0.6左右，收集菌体用E基本培养基(配方参照实施例1)重悬洗涤2遍，将菌液接种至10mL含或不含176.12μg/mL维生素C的含有20μg/mL或100μg/mL磺胺甲恶唑的E基本培养基中使其终浓度为106cfu/ml，菌液在37℃下静置避光培养。每隔24h取接种后的菌液100μL在900mL E基本培养基中经过10倍连续稀释后取适当梯度稀释液10μL点涂于LB固体培养基上，37℃下静置培养16h后对菌落数计数。上述实验重复三次。
4、数据处理：按照下述公式计算出培养体系中的活菌浓度对数值
Log10(CFU/mL)＝Log10(平板计数×稀释倍数×100)
5、实验结果：磺胺甲恶唑单独或联合维生素C对O157:H7的体外杀菌曲线见图1，详细数据见表3，由图1和表3可知当仅用10×MIC磺胺甲恶唑处理O157:H7时，磺胺甲恶唑仅表现出抑菌效果。当磺胺甲恶唑与176.12μg/mL(1mM)维生素C配伍使用时，表现出明显的联合杀菌效果(p<0.05)。磺胺甲恶唑单独或联合维生素C对Salmonella typhimurium的体外杀菌曲线见图2，详细数据见表4，由图2和表4可知当仅用10×MIC磺胺甲恶唑处理Salmonellatyphimurium时，磺胺甲恶唑仅表现出抑菌效果。当磺胺甲恶唑与176.12μg/mL(1mM)维生素C配伍使用时，表现出明显的联合杀菌效果(p<0.05)。
表3磺胺甲恶唑单独或联合维生素C对O157:H7的体外杀菌效果
注：与SMX单药处理组相比，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
表4磺胺甲恶唑单独或联合维生素C对Salmonella typhimurium的体外杀菌效果
注：与SMX单药处理组相比，**P<0.01，****P<0.0001。
实施例3磺胺甲恶唑联合维生素C对感染O157:H7小鼠的体内治疗效果
1、实验材料：肠出血性大肠杆菌(Escherichia coli O157:H7)CICC21530pBAD24；Balb/c雌性小鼠，SPF级，6～8周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
2、主要试剂：氢氧化钠、浓盐酸(均购自国药集团)；抗坏血酸钠、硫酸链霉素(均购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；无菌0.9％NaCl、磷酸盐缓冲液1×PBS(均购自北京索莱宝科技有限公司)
实验方法：将磺胺甲恶唑溶解于0.9％NaCl中(先用1M氢氧化钠溶解，然后用10M盐酸调pH 7.0，并保持最终的盐离子浓度为0.9％NaCl，终浓度为15mg/kg)。用PBS溶解抗坏血酸钠配制200mg/mL注射液，用氢氧化钠调pH为7.0。用0.9％NaCl溶解链霉素，用氢氧化钠调pH为7.0，终浓度为200mg/mL。将36只雌性Balb/c小鼠随机分为6组每组6只，由于小鼠不易感染致病性大肠杆菌O157:H7，因此，先将所有小鼠每天灌胃1g/kg的链霉素，一天一次，连续灌胃3次，确保小鼠粪便中的菌数目降低到103CFU/g以下。O157:H7 pBAD24(转染有pBAD24质粒的O157:H7)于新鲜LB液体中在37℃下培养至OD600nm≈0.6左右，收集菌体用PBS重悬洗涤2遍，除空白组外其余组小鼠经灌胃感染1×109CFU/mL O157:H7 pBAD24菌液。感染48小时后解剖其中一组小鼠取其盲肠内容物测定其中的O157:H7 pBAD24菌数目作为盲肠病原菌定植量的初始对照组(图3中的对照组)。同时其他组进行分组给药，
空白组：灌胃等SMX体积生理盐水+腹腔注射等Vit C体积PBS；
模型组：灌胃等SMX体积生理盐水+腹腔注射等Vit C体积PBS；
磺胺甲恶唑组：灌胃100mg/kg SMX+腹腔注射等Vit C体积PBS；
维生素C组：灌胃等SMX体积生理盐水+腹腔注射3g/kg Vit C；
联合组：灌胃100mg/kg SMX+腹腔注射3g/kgVit C。
每隔12h给药一次，持续给药四天，感染后每天观察小鼠状态记录小鼠体重，并取粪便监测小鼠粪便中的O157:H7 pBAD24数目变化。待给药4天后，将全部小鼠处死，并测定小鼠肠溶物中的细菌数目。小鼠粪便和肠溶物中的细菌数目的测定方法如下：首先，在粪便或肠溶物中加入1mL无菌PBS溶液，涡旋震荡至全部溶解。800rpm离心5min，取上清于新EP管中，重复离心一次后，取上清于新EP管中5000rpm离心5min，弃上清。将所得到的沉淀中加入1mL无菌PBS溶液，重悬，然后10倍梯度逐一稀释菌液。从每个稀释梯度的菌液中各取10μL逐一涂到氨苄抗性的LB固体平板上，放置12h后计数。
3、数据处理：
粪便或肠溶物中的细菌数目＝log10(计数数目×稀释倍数/粪便或者肠溶物的质量(g))。
4、感染后各组小鼠体重变化比率见表5。给药四天各组小鼠粪便载菌量见图3和表6。给药四天后各组小鼠盲肠内容物中致病菌载量见图4和表7。
表5感染后各组小鼠体重变化比率
注：与空白组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.0001。
表6给药四天各组小鼠粪便载菌量
注：同一处理时间下，与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001。
表7给药四天后各组小鼠盲肠内容物中致病菌载量
注：与感染但未给药的对照组相比，**P<0.01，***P<0.001；与维生素C组相比,#P<0.05。
由表5可知，空白组小鼠的体重在监测时间内呈逐渐增长趋势，模型组、磺胺甲恶唑组和维生素C组小鼠的体重从感染2天后开始下降，6天后体重均显著低于空白组(P<0.0001)。联合组小鼠的体重在感染3天内表现出下降趋势，在给药2天后体重逐渐回升，给药4天后体重显著高于模型组(P<0.01)，而磺胺甲恶唑组和维生素C组小鼠在给药四天内均与模型组相比无统计学差异(P>0.5)。
通过图3和表6各组小鼠粪便菌载量可知，各组小鼠粪便载菌量随感染时间延长而逐渐减少，而在给药1天后联合组小鼠粪便菌载量显著少于模型组(P<0.01)，随着给药次数增多小鼠粪便菌载量持续显著低于模型组(P<0.0001)。
通过图4和表7各组小鼠盲肠内容物载菌量可知，在经过不同条件处理四天后，磺胺甲恶唑组小鼠盲肠定植的O157:H7数量显著低于对照组小鼠治疗前的初始定植量(P<0.05)。联合组小鼠盲肠定植的O157:H7数量显著低于对照组小鼠治疗前的初始定植量(P<0.001)和维生素C组小鼠治疗4天后的定植量(P<0.05)。
5、实验结论
通过小鼠体重变化结果可知，感染O157:H7后小鼠进食减少表现出体重下降，仅当磺胺甲恶唑与维生素C联合用药时可以缓解感染O157:H7引起的体重减轻。感染O157:H7后小鼠粪便持续排菌，仅当磺胺甲恶唑与维生素C联合用药时小鼠排菌量持续显著低于模型组。结合盲肠初始定植量和经不同处理治疗4天后的各组小鼠盲肠定植量结果可知磺胺甲恶唑与维生素C联合用药时对O157:H7的杀菌作用更强，减少肠道致病菌定植数量。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种抑菌组合物，其特征在于，由维生素C和磺胺甲恶唑组成。
2.根据权利要求1所述的抑菌组合物，其特征在于，当所述抑菌组合物的抑菌对象为致病性大肠杆菌时，所述维生素C和磺胺甲恶唑的质量比为(0.011～5.632)：(0.000125～0.001)；当所述抑菌组合物的抑菌对象为沙门氏菌时，所述维生素C和磺胺甲恶唑的质量比为(0.044～5.632)：(0.000625～0.005)。
3.根据权利要求1所述的抑菌组合物，其特征在于，当所述抑菌组合物的抑菌对象为致病性大肠杆菌时，所述维生素C和磺胺甲恶唑的质量比为(0.044～2.816)：(0.00025～0.0005)；当所述抑菌组合物的抑菌对象为沙门氏菌时，所述维生素C和磺胺甲恶唑的质量比为(0.176～2.816)：(0.00125～0.0025)。
4.根据权利要求1所述的抑菌组合物，其特征在于，当所述抑菌组合物的抑菌对象为致病性大肠杆菌时，所述维生素C和磺胺甲恶唑磺胺的质量比为3：0.1或8.806：1；当所述抑菌组合物的抑菌对象为沙门氏菌时，所述维生素C和磺胺甲恶唑磺胺的质量比为8.806：1。
5.权利要求1～4任意一项所述的抑菌组合物在制备杀菌剂或抑菌药物中的应用。
6.权利要求1～4任意一项所述的抑菌组合物在制备抗致病菌或者治疗致病菌感染的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述致病菌包括肠道致病菌；所述肠道致病菌包括致病性大肠杆菌和/或沙门氏菌。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述致病性大肠杆菌包括肠出血性大肠杆菌；所述沙门氏菌包括鼠伤寒沙门氏菌。
9.一种抑菌药物，其特征在于，包括权利要求1～4任意一项所述的抑菌组合物和药学上可接受的辅料。
10.根据权利要求9所述的抑菌药物，其特征在于，所述抑菌组合物中维生素C为注射剂型，磺胺甲恶唑为口服剂型。
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