CN116898858A - 一种治疗非小细胞肺癌的药物 - Google Patents

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CN116898858A CN202311016574.3A CN202311016574A CN116898858A CN 116898858 A CN116898858 A CN 116898858A CN 202311016574 A CN202311016574 A CN 202311016574A CN 116898858 A CN116898858 A CN 116898858A
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杨文强
王陈晨
徐慧
钱越
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Jinzhou Medical University
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Abstract

本发明提供了一种治疗非小细胞肺癌的药物，属于医药领域，所述药物的原料组分包括吉非替尼和穿心莲内酯，其中，吉非替尼的浓度为12～20μM，穿心莲内酯的浓度为200～250μM，药物的剂型为口服液体制剂或口服片剂。实验结果显示，本发明提供的药物对PC9/G细胞凋亡相关蛋白和基因的表达有显著的抑制作用，相较于单独使用吉非替尼或穿心莲内酯具有更好的抑制效果，二者之间存在一定的协同作用关系。

Description

一种治疗非小细胞肺癌的药物
技术领域
本发明属于医药领域，尤其涉及一种治疗非小细胞肺癌的药物。
背景技术
肺癌是一种常见的恶性肿瘤和主要的肿瘤死亡原因，它是仅次于乳腺癌和前列腺癌的第三大癌症，但在所有癌症相关死亡中所占的比例最大。其中，非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌病例的85％，由于NSCLC早期症状不典型，早期诊断存在较大的困难，70％-80％的患者在确诊时已进展为中晚期阶段，失去了手术切除等根治性治疗的机会。
目前，以苷类、紫杉类、培美曲塞等为代表的新型化疗药物不断投入临床应用，药物疗效较第一代化疗药物有所提高，但总体生存获益改善并不明显，部分患者甚至出现严重的毒副作用，严重危害人类健康和生命，因此探寻新的治疗药物已经成为肺癌研究的热点。
随着对NSCLC发病机制的深入研究及新型分子靶向药物的不断研发、应用，临床实践逐渐证实，吉非替尼这一类表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(Epidermal growthfactorreceptor—Tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)在治疗晚期NSCLC患者时，以其相对较好的治疗效果以及显著改善生活质量的作用，为晚期NSCLC的治疗提供了新的机遇。然而，虽然非小细胞肺癌患者对EGFR-TKIs的应答率很高，但在治疗9-13个月后人体产生的耐药现象仍不可避免，并且这种获得性耐药性60％是EGFR T790M突变产生的。因此，迫切需要一种新的有效策略以提高EGFR-TKIs的敏感性。
穿心莲内酯是一种从穿心莲(苦味之王)中分离出来的二萜内酯。穿心莲是一种重要的草药，用于许多种疾病的治疗，例如呼吸道感染、发烧、细菌性痢疾和腹泻。研究发现，在淋巴瘤细胞系和原发性肿瘤样本中，穿心莲内酯能够诱导ROS产生和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)依赖性细胞凋亡。穿心莲内酯诱导的细胞凋亡是通过线粒体途径介导的，但依赖于细胞系和患者样本中的半胱天冬酶。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种治疗非小细胞肺癌的药物，本发明通过将穿心莲内酯和吉非替尼联用，获得了一种无细胞毒性且能有效治疗非小细胞肺癌的药物。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
一种治疗非小细胞肺癌的药物，包括吉非替尼和穿心莲内酯；所述吉非替尼的浓度为12～20μM，所述穿心莲内酯的浓度为200～250μM。
优选的，所述吉非替尼的浓度为14～18μM，所述穿心莲内酯的浓度为220～240μM。
优选的，所述吉非替尼和穿心莲内酯的摩尔比为1～5:1～5。
优选的，所述药物的剂型为口服液体制剂或口服片剂。
本发明还提供了穿心莲内酯和吉非替尼在制备促进PC9/G细胞凋亡的试剂中的应用。
本发明还提供了穿心莲内酯和吉非替尼在制备抑制PC9/G细胞增殖的试剂中的应用。
本发明还提供了穿心莲内酯和吉非替尼在制备抑制Bcl-2、K167、PCNA中的一种或多种基因表达的抑制剂中的应用。
本发明还提供了穿心莲内酯和吉非替尼在制备抑制Cleabed-casepase-3、BAX中的一种或多种蛋白表达的抑制剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过将穿心莲内酯和吉非替尼联合应用于制备治疗非小细胞肺癌的药物，显著促进了PC9/G细胞的凋亡，抑制了PC9/G细胞的增殖，且制得的药物无细胞毒性作用，相较于单独使用吉非替尼和穿心莲内酯具有更好的治疗作用。同时，实验结果显示，穿心莲内酯和吉非替尼存在协同作用，能够显著抑制Bcl-2、K167、PCNA基因的表达以及Cleabed-casepase-3、BAX蛋白的表达。
附图说明
图1为使用吉非替尼和穿心莲内酯分别处理H1299和PC9细胞后测得的细胞存活率；
图2为使用穿心莲内酯对PC9细胞分别处理24h和48h后测得的流式细胞凋亡结果图；
图3为使用穿心莲内酯对PC9细胞分别处理24h和48h后获得的流式细胞凋亡柱状图；
图4为不同药物处理PC9/G细胞后测得的细胞存活率；
图5为使用CalcuSyn2.0软件计算获得的剂量效应曲线图；
图6为使用倒置相差显微镜观察的细胞凋亡形态图；
图7为不同药物处理PC9/G细胞24h和48h的流式细胞凋亡结果图；
图8为不同药物处理PC9/G细胞24h和48h的流式细胞凋亡柱状图；
图9为不同药物处理PC9/G细胞后测得的细胞凋亡相关蛋白表达结果；
图10为不同药物处理PC9/G细胞后测得的P-Akt蛋白表达的结果；
图11为实施例5的显影结果，其中，“-”代表未添加穿心莲内酯或吉非替尼，“+”代表添加穿心莲内酯或吉非替尼；
图12为不同药物处理PC9/G细胞后测得的Bcl-2基因表达的结果；
图13为不同药物处理PC9/G细胞后测得的PCNA基因表达的结果；
图14为不同药物处理PC9/G细胞后测得的K167基因表达的结果；
图15为不同药物处理PC9/G细胞后测得的Caspase-3基因表达的结果；
图16为不同药物处理PC9/G细胞后测得的Bax基因表达的结果；
图17为不同药物处理PC9/G细胞后测得的P53基因表达的结果；
图18为不同药物处理PC9/G细胞后测得的JC-1荧光探针染色结果；
图19为不同药物处理PC9/G细胞24h的流式细胞凋亡结果图；
图20为不同药物处理PC9/G细胞48h的流式细胞凋亡结果图；
图21为不同药物处理PC9/G细胞24h和48h的流式细胞凋亡柱状图。
具体实施方式
本发明提供了一种治疗非小细胞肺癌的药物，包括吉非替尼和穿心莲内酯；所述吉非替尼的浓度为12～20μM，所述穿心莲内酯的浓度为200～250μM。
在本发明中，所述吉非替尼的浓度优选为14～18μM，进一步优选为15～17μM，更进一步优选为16μM；所述穿心莲内酯的浓度优选为220～240μM，进一步优选为225～235μM，更进一步优选为230μM；所述吉非替尼和穿心莲内酯的摩尔比优选为1～5:1～5，进一步优选为2～4:2～4，更进一步优选为3:3；所述药物的剂型优选为口服液体制剂或口服片剂。
本发明还提供了穿心莲内酯和吉非替尼在制备促进PC9/G细胞凋亡的试剂中的应用。
本发明还提供了穿心莲内酯和吉非替尼在制备抑制PC9/G细胞增殖的试剂中的应用。
本发明还提供了穿心莲内酯和吉非替尼在制备抑制Bcl-2、K167、PCNA中的一种或多种基因表达的抑制剂中的应用。
本发明还提供了穿心莲内酯和吉非替尼在制备抑制Cleabed-casepase-3、BAX中的一种或多种蛋白表达的抑制剂中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1吉非替尼、穿心莲内酯对细胞增殖活性的影响
采用CCK-8法进行检测，具体步骤为：取对数生长期的PC9、H1299细胞，胰酶消化，离心，按6×104/mL细胞浓度制成不同的细胞悬液，备用；分别取100μL细胞悬液铺于96孔板中，拍打混匀，置于37℃孵育箱静置培养24h，待细胞贴壁后弃去各个孔中的培养基，在每个孔中分别加入含有不同浓度的穿心莲内酯(Andro)(其终浓度分别为320、160、80、40、20μM)、吉非替尼(Gef)(其终浓度分别为20、40、80、160、320μM)的预热好的培养液，每个浓度重复5孔，并设置对照组(不加药组)和空白组，置于37℃、饱和湿度、5％CO2孵育箱静置培养24h和48h；分别在24h和48h加入10μL/孔的CCK-8溶液，置于37℃、饱和湿度、5％CO2孵育箱静置培养2h，在酶标仪上测定450nm处的OD值。并根据公式(1)计算细胞存活率。结果如图1所示。
细胞存活率＝[(A实验-A空白)/(A对照-A空白)]×100％公式(1)
同时，获得如表1所示的不同药物对细胞的IC50值。
表1不同药物对细胞的IC50值
由图1和表1可知，穿心莲内酯能够显著抑制PC9或H1299细胞的增殖，且随着药物浓度的增加，穿心莲内酯对PC9和H1299细胞的增殖抑制作用也相应增强。与使用穿心莲内酯相比，吉非替尼对PC9或H1299细胞增殖的抑制能力较差，细胞的存活率更高。
根据上述结果选取穿心莲内酯作为药物，采用上述方法处理HPAEpiC和293T细胞。结果显示，低浓度的穿心莲内酯(0-300μM)对HPAEpiC、293T细胞无明显的细胞毒作用。而高浓度的穿心莲内酯(≥320μM)对HPAEpiC、293T细胞的细胞毒作用明显。该结果表明，穿心莲内酯在本研究的给药剂量下，对正常组织细胞没有明显的细胞毒性作用。
综上，选取240μM为穿心莲内酯的使用浓度；选取16μM为吉非替尼的使用浓度。
实施例2穿心莲内酯对PC9细胞的影响
采用流式细胞术检测穿心莲内酯对PC9细胞凋亡的影响。具体步骤为：将PC9细胞按照4×105/mL的浓度铺于96孔板中，在37℃下培养24h，在孔中加入浓度为70μM的穿心莲内酯溶液，继续培养24h和48h；吸出孔内液体，用PBS清洗1次，胰酶消化并制成细胞悬液，以1000rpm离心4min，重复2次后用1mL的AnnexinV试剂重悬细胞；分别取100μL细胞悬液转移至不同的流式管中，分别加入5μL FITCAnnexinV和5μL 7-AAD活性染色液，并设置FITCAnnexinV和7-AAD单染管，轻轻涡旋细胞；25℃暗孵育15min，分别加入400μL AnnexinV Binding Buffer；30min内使用流式细胞仪进行分析。并设置对照组(不加药组)。结果如图2和图3所示。
由图2-3可知，穿心莲内酯能够显著促进PC9细胞的凋亡，从而抑制PC9细胞的增殖。
实施例3不同药物对PC9/G细胞的影响
采用CCK-8法检测吉非替尼、穿心莲内酯、穿心莲内酯和吉非替尼复合物对PC9/G细胞增殖率的影响。具体方法与实施例1相同。其中，穿心莲内酯的使用浓度分别为1、2、4、8、16、32μM，吉非替尼的使用浓度分别为20、40、80、160、320μM，穿心莲内酯和吉非替尼复合物的使用浓度分别为20、40、80、160、320μM，其中，穿心莲内酯和吉非替尼复合物在制备时以其各自的IC50值等比加药。结果如图4所示。
同时，使用CalcuSyn2.0软件计算穿心莲内酯和吉非替尼的协同作用。结果如图5所示。
由图4-5可知，当吉非替尼的使用浓度为8μM时，二者联合用药与单独使用穿心莲内酯时的细胞凋亡率看不出明显差异；当吉非替尼使用浓度为32μM时，二者联合用药后细胞凋亡率过高。因此选择吉非替尼的使用浓度为16μM。当吉非替尼使用浓度为16μM时，经流式细胞术检测出开始有凋亡效果；当吉非替尼使用浓度为32μM时，细胞凋亡率超过50％。
实施例4不同药物对细胞核形态的影响
对经不同药物处理的细胞使用Hoechst33342染色液染色，观察细胞核的形态。具体方法为：取出细胞个数为1×105个/ml的处于对数生长期的PC9/G细胞2mL，分别置于含240μM穿心莲内酯、16μM吉非替尼、240μM穿心莲内酯与16μM吉非替尼混合液的完全培养基中培养24h；将3组不同药物处理后的细胞放置于37℃、湿度饱和、5％CO2的培养箱中培养24h和48h，收集细胞；取出6孔板，在每孔中分别加入1mL的Hoechst33342染色液，并使染色液充分覆盖细胞，置于培养箱中反应15min，将染色液弃除，使用PBS清洗后用倒置相差显微镜观察细胞凋亡形态。结果如图6所示。
同时，采用流式细胞术检测不同药物对PC9/G细胞的凋亡率。具体方法与实施例2相同。其中，穿心莲内酯的使用浓度为240μM、吉非替尼的使用浓度为16μM、穿心莲内酯与吉非替尼的使用浓度分别为240μM、16μM。测定结果如图7和图8所示。
由图7和图8可知，与单独使用穿心莲内酯和吉非替尼相比，穿心莲内酯和吉非替尼联用后对PC9/G细胞的抑制作用显著增强，即，穿心莲内酯和吉非替尼具有协同作用。
实施例5不同药物对PC9/G细胞凋亡相关蛋白表达的影响
取细胞个数为1×105个/ml对数生长期的PC9/G细胞，用0.25％胰酶消化、离心，制成细胞悬液，将重悬的细胞悬液接种到培养皿中。细胞生长至80％时，分别置于含有240μM穿心莲内酯、16μM吉非替尼、240μM穿心莲内酯与16μM吉非替尼混合液的完全培养基中培养24h，继续放在培养箱培养24h和48h后，提取蛋白；同时，设置空白对照组；
同时，按照99:1的比例将RIPA与PMSF配制成裂解液，在冰上对细胞裂解30min，待裂解完全，以12000rpm、4℃离心15min；将离心后的上清移至1.5mL离心管中，4℃储存备用；并按照50:1的比例将SolutionA液与Solution B液混合，制得BCA工作液；
将稀释至0.5mg/mL的蛋白标准品依照0μL、1μL、2μL、4μL、8μL、12μL、16μL、20μL的体积分别加入到对应的96孔板中，每个孔用PBS补齐到20μL。加1μL蛋白样本至样品孔，用PBS补足到20μL。以上均设置两个复孔，以便计算吸光度平均值；最后每个孔再加入200μL的BCA工作液，37℃避光放置30min；用酶标仪监测各孔在562nm处的吸光度，根据公式(2)计算出样本中的蛋白浓度。根据得出的蛋白浓度制备终浓度为2-4μg/μL的蛋白样品。
蛋白浓度＝标准曲线计算的蛋白浓度×20(样本稀释倍数)公式(2)
将玻璃板清洁干净后固定，配置15％的分离胶溶液并混匀，吸取制备的蛋白样品溶液缓缓注入玻璃板夹层，切勿产生气泡，用无水乙醇封闭，凝固40min后倒掉，无水乙醇晾干；配置浓缩胶，加到玻璃板中，插梳子，等待30min至完全凝固；固定好玻璃胶板，里层用新配置的电泳液，观察有无漏液现象，外层用回收的电泳液，拔出梳子；加样后打开电源，设定初始电压为80V，当溴酚蓝指示条带跑出浓缩胶后，把电压调至120V，待到最小marker跑到胶的底部停止电泳；
配置1×的转膜液(转膜液配方：Tris 3.0g，Glycine 14.4g，甲醇:200ml，加去离子水至1000ml)，将厚滤纸浸泡在转膜液中，将孔径为0.2μm的PVDF膜在甲醇中激活3-5min后取出，将激活的PVDF膜放到转膜液中，取下胶板上的胶，弃掉浓缩胶，在转膜液中浸泡，按照纸-膜-胶-纸的原则，依次取出放在半干转转模仪器上，打开电源，12V恒压转膜20min；称取0.5g BSA粉末溶解到10mL 1×TBST中，制得5％BSA封闭液；将PVDF膜放入封闭液中，置于桌面混匀，封闭1.5h；
分别对目的蛋白的抗体按1:1000的体积比稀释，内参抗体按1:1500的体积比稀释后，按照比例加到5％BSA封闭液中；将PVDF膜放到相对应的抗体中在4℃下孵育10h；回收一抗，加入10mL 1×TBST，洗膜5min，重复3次；用1×TBST以1:10000(体积比)的比例稀释二抗，孵育2h后用TBST置于混匀仪上洗5min，重复4次，即可显影；将A、B液按照1:1比例混匀制得ECL显影液，把显影液均匀分布到PVDF膜上，放入显影仪曝光。结果如图9、图10、图11所示。
由图9-11可知，穿心莲内酯和吉非替尼联用后对Cleabed-casepase-3和BAX蛋白的抑制作用显著增强。
实施例6不同药物对PC9/G细胞凋亡相关基因表达的影响
将实施例4中培养获得的经过不同药物处理过的PC9/G细胞置于37℃孵箱中，培养24h和48h，弃去培养基，用PBS清洗细胞，用胰酶消化2min，终止，并把细胞收集在无RNA酶的1.5mL离心管中，1000rpm离心3min，弃上清；加入600μL含有β-巯基乙醇的裂解液(每毫升裂解液含β-巯基乙醇20μL)，涡旋振荡至充分混匀，再加入360μL无水乙醇，用移液枪上下吹匀；将700μL裂解液加入到核酸纯化柱中，12000rpm、4℃离心1min，弃掉穿柱液，将纯化柱再次放回收集管中，再次离心至所有穿柱液被离出，弃掉收集管，换成2mL的新收集管，在新的纯化柱中加入700μL洗涤液1(10mM Tris-HCl(pH7.5)，80％乙醇)，12000rpm、4℃离心1min，再次去掉穿柱液，在纯化柱中继续加入600μL的洗涤液2(10mM Tris-HCl(pH7.5)，70％乙醇)，再次离心弃液，在纯化柱中继续加入250μL的冲洗液2(10mM Tris-HCl(pH7.5)，70％乙醇)，12000rpm、4℃离心2min，将纯化柱换到新的1.5mL EP管中，加50μL无RNA酶的水到纯化柱的膜中心，12000rpm、离心1min洗掉RNA，然后再次弃掉纯化柱；用NanodropTMOne/One C微量紫外-可见光分光光度计检测RNA的浓度和纯度，所测得样品OD260/OD280比值应在1.8-2.0之间，才能用于后续的实验。
按照PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒的说明书进行反转录，将样品浓度调整至1000ng/20μL，要确定样品量一致，将RNA反转录为cDNA，以此为模板进行定量扩增(反转录反应条件见表2)。
由南京金斯瑞生物科技有限公司合成引物。以18s作为内参基因，检测相关基因的相对表达量并绘制柱状图(基因引物序列见表3)。按照ABIQuantStudio 3定量PCR仪的操作方法进行操作(反应体系见表4，反应条件见表5)，每个样品均设置3个复孔，实验重复3次，使用2-ΔΔct法计算凋亡相关mRNA的相对表达水平。结果如图12-17所示。
表2反转录条件
表3相关基因引物序列
表4 qRT-PCR反应体系
表5 qRT-PCR反应条件
由图12-17可知，穿心莲内酯和吉非替尼联合处理组显著抑制了Bcl-2、K167和PCNA基因的表达。
实施例7不同药物对PC9/G细胞线粒体膜电位的影响
待PC9/G细胞生长至60-80％汇合时，用分别含有穿心莲内酯、吉非替尼、穿心莲内酯与吉非替尼混合液的完全培养基培养24h或48h；同时，取50μL JC-1(200X)加入到8mL的超纯水中进行稀释，剧烈摇晃使JC-1充分溶解，加入2mL JC-1染色缓冲液(5X)，充分混匀，获得JC-1染色工作液(注：六孔板的每个孔需加入的染色液的量为1mL)。
将CCCP细胞凋亡诱导剂(10mM)取出，按照1:1000(体积比)的比例加入到培养基中，从10mM稀释到10μM，CCCP处理细胞20min后，使用JC-1染色工作液对细胞进行染色(注：对于多数的细胞，10μM CCCP在处理细胞20min后细胞内的线粒体的膜电位会完全的丧失，正常的细胞经JC-1染色后应显示红色荧光，而JC-1染色后观察应呈绿色荧光)。
将贴壁的细胞取出，弃掉培养液，用新鲜PBS清洗细胞一次，随后加入1mL的培养基，在每个孔再加入1mL的JC-1染色工作液，待充分混匀后，在细胞培养箱内孵育20min；并在孵育过程中按照每1mL的JC-1染色缓冲液(5X)加入4mL蒸馏水的比例配制所需的JC-1染色缓冲液(1X)，并放置于冰上；孵育结束后，弃上清，用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤，加入2mL细胞培养液，在倒置相差显微镜下进行观察拍照。
取出六孔板，用PBS清洗一次，加入胰酶消化2min，1000rpm离心4min，吸掉培养液，加入1mL培养液重悬，再加入0.5mL的JC-1染色工作液，不断颠倒混匀，混匀后置于细胞培养箱中孵育20min；孵育结束后，600×g、4℃离心3min，弃上清；用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次后加入1mL JC-1染色缓冲液(1X)将细胞重悬，600×g、4℃离心3min，沉淀细胞，弃上清。重复上述操作2次，使用流式细胞仪进行分析。结果如图18-21所示。
结果显示，由穿心莲内酯组、穿心莲内酯和吉非替尼联合处理组处理的细胞中存在更多的正常细胞，对非小细胞肺癌具有较好的治疗作用，而吉非替尼不能达到治疗非小细胞肺癌的作用；且穿心莲内酯组、穿心莲内酯和吉非替尼联合处理组中凋亡细胞占总细胞的百分比分别为34.28％、44.10％，与吉非替尼组和对照组存在显著差别。
此外，上述实施例1-7中使用的细胞均购自中国科学院昆明动物研究所。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种治疗非小细胞肺癌的药物，其特征在于，包括吉非替尼和穿心莲内酯；所述吉非替尼的浓度为12～20μM，所述穿心莲内酯的浓度为200～250μM。
2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述吉非替尼的浓度为14～18μM，所述穿心莲内酯的浓度为220～240μM。
3.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述吉非替尼和穿心莲内酯的摩尔比为1～5:1～5。
4.根据权利要求1～3任一项所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为口服液体制剂或口服片剂。
5.穿心莲内酯和吉非替尼在制备促进PC9/G细胞凋亡的试剂中的应用。
6.穿心莲内酯和吉非替尼在制备抑制PC9/G细胞增殖的试剂中的应用。
7.穿心莲内酯和吉非替尼在制备抑制Bcl-2、K167、PCNA中的一种或多种基因表达的抑制剂中的应用。
8.穿心莲内酯和吉非替尼在制备抑制Cleabed-casepase-3、BAX中的一种或多种蛋白表达的抑制剂中的应用。
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