CN116887864A - 一种用于克服免疫抑制或刺激抗癌免疫应答的药物组合和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明关于一种克服肿瘤微环境中之免疫抑制或刺激针对癌症之免疫应答的方法，其包含向个体投与组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂与酪氨酸激酶抑制剂(TKI)之组合。

Description

一种用于克服免疫抑制或刺激抗癌免疫应答的药物组合和 方法
技术领域
本发明关于免疫疗法。特定言之，本发明提供一种药物组合及其在调节肿瘤微环境及癌症免疫疗法中之应用。
背景技术
肿瘤免疫学中癌症治疗之新时代将在使用免疫-肿瘤学(IO)疗法以提高抗癌免疫应答方面提供巨大进展。免疫检查点抑制剂(ICI)为最有前景的IO疗法之一，其可以释放细胞毒性T淋巴球(CTL)有效攻击及杀灭肿瘤之能力，尤其靶向PD-1(程序化细胞死亡蛋白1)/PD-L1(程序化死亡配位体1)轴阻断之ICI。迄今为止，已开发出若干STI。然而，仅约20％患者对抗PD-1/抗PD-L1抗体单药疗法有应答。约80％之患者不获得由原发性及获得性抗性引起之临床益处。因此，对PD1/PD-L1阻断之抗性为克服免疫疗法之极其重要问题。
原发性抗性指无藉由PD-1/PD-L1阻断进行应答之情况。相较于免疫疗法与化学疗法或靶向疗法，免疫疗法具有相对较高之原发性抗性比率，且因此临床益处受到限制。据估计，约60％接受免疫疗法之患者具有原发性抗性。然而，获得性抗性指对PD-1/PD-L1阻断之初始应答随着疾病进展而发生且最终发生复发的情况。据估计，约20％接受免疫疗法之患者具有获得性抗性。对PD1/PD-L1阻断之低应答率及原发性或获得性抗性可与肿瘤微环境(TME)相关(Annals of Oncology,第27卷,第8期,2016年8月,第1492页至第1504页)。TME为控制肿瘤免疫应答之动态及复杂之组合物。PD-1/PD-L1阻断之原发性或获得性抗性之主要机制可包括若干因素，诸如TME状态、PD-L1表现、肿瘤新抗原表现及呈递、细胞信号路径、免疫基因表现及表观遗传修饰。
诸多组合治疗策略希望藉由PD-1/PD-L1阻断克服抗药性问题。许多方法集中于藉由使用抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体与其他试剂之组合来增加对PD1/PD-L1阻断之敏感性。然而，此等药物组合无法达成所要治疗益处，且其功效及安全性是可疑的。
发明内容
本发明人出人意料地发现，酪氨酸激酶抑制剂(TKI)加组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂经由调变TME而显著改良抗癌功效。此外，TKI加与ICI组合之HDAC抑制剂藉由PD1/PD-L1阻断显著克服原发性或获得性抗性，且提高免疫疗法之功效。
在一个态样中，本发明提供一种经由克服肿瘤微环境中之免疫抑制或刺激抗癌免疫应答来抑制或治疗个体中之癌症的方法，其包含向该个体投与包含组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂或其药学上可接受之盐及酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或其药学上可接受之盐的组合；其中该HDAC抑制剂或其药学上可接受之盐及酪氨酸激酶抑制剂或其药学上可接受之盐调配为一种药剂，或该HDAC抑制剂及酪氨酸激酶抑制剂各自调配为用于同时、分开或依序投与之单一药剂。
在另一态样中，本发明提供一种药物组合，其用于经由克服肿瘤微环境中之免疫抑制或刺激抗癌免疫应答来抑制或治疗个体中之癌症的方法中，其中该组合包含组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂或其药学上可接受之盐及酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或其药学上可接受之盐；其中该HDAC抑制剂或其药学上可接受之盐及酪氨酸激酶抑制剂或其药学上可接受之盐调配为一种药剂，或该HDAC抑制剂及酪氨酸激酶抑制剂各自调配为用于同时、分开或依序投与之单一药剂。
在另一态样中，本发明亦提供药物组合，其包含组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂或其药学上可接受之盐及酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或其药学上可接受之盐；其中该HDAC抑制剂或其药学上可接受之盐及酪氨酸激酶抑制剂或其药学上可接受之盐调配为一种药剂，或该HDAC抑制剂及酪氨酸激酶抑制剂各自调配为用于同时、分开或依序投与之单一药剂。在本发明之一些实施例中，药物组合中HDAC抑制剂及TKI之量分别在约10％(w/w)至约70％(w/w)及约10％(w/w)至约70％(w/w)的范围内。在另一实施例中，药物组合进一步包含免疫检查点抑制剂。在本发明之一些实施例中，组合中免疫检查点抑制剂之量在约0.5％(w/w)至约20％(w/w)的范围内。
在另一态样中，本发明提供一种包含组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂或其药学上可接受之盐与酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或其药学上可接受之盐的组合之用途，其用于制造单一药剂或多种药剂，该药剂用于经由克服肿瘤微环境中之免疫抑制或刺激免疫应答来抑制或治疗个体中之癌症，其中该HDAC抑制剂或其药学上可接受之盐及酪氨酸激酶抑制剂或其药学上可接受之盐调配为一种药剂，或该HDAC抑制剂及酪氨酸激酶抑制剂各自调配为用于同时、分开或依序投与之单一药剂。
在本发明之一些实施例中，本文所描述之组合中HDAC抑制剂及TKI之量分别在约10％(w/w)至约70％(w/w)及约10％(w/w)至约70％(w/w)的范围内。
在一个实施例中，本发明提供一种经由克服肿瘤微环境中之免疫抑制或刺激免疫应答来治疗个体中之癌症的方法，其包含向该个体投与包含组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂或其药学上可接受之盐、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或其药学上可接受之盐与免疫检查点抑制剂(ICI)之组合；其中该组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂或其药学上可接受之盐、该酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或其药学上可接受之盐及该免疫检查点抑制剂调配为一种药剂，或该HDAC抑制剂或其药学上可接受之盐、该酪氨酸激酶抑制剂或其药学上可接受之盐及该免疫检查点抑制剂中之一或两者调配为用于同时、分开或依序投与之多种药剂。
在另一实施例中，本发明提供一种药物组合，其用于经由克服肿瘤微环境中之免疫抑制或刺激抗癌免疫应答来治疗个体中之癌症的方法中，其中该组合包含组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂或其药学上可接受之盐、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或其药学上可接受之盐与免疫检查点抑制剂之组合；其中组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂或其药学上可接受之盐、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或其药学上可接受之盐及免疫检查点抑制剂(ICI)调配为一种药剂，或HDAC抑制剂或其药学上可接受之盐、酪氨酸激酶抑制剂或其药学上可接受之盐及免疫检查点抑制剂中之一或两者调配为用于同时、分开或依序投与之多种药剂。
在另一实施例中，本发明提供一种组合在制造单一药剂或多种药剂中之用途，其用于经由克服肿瘤微环境中之免疫抑制或刺激免疫应答来抑制或治疗个体中之癌症，其中该组合包含组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂或其药学上可接受之盐、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或其药学上可接受之盐与免疫检查点抑制剂(ICI)之组合；其中该组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂或其药学上可接受之盐、该酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或其药学上可接受之盐及该免疫检查点抑制剂调配为一种药剂，或该HDAC抑制剂或其药学上可接受之盐、该酪氨酸激酶抑制剂或其药学上可接受之盐及该免疫检查点抑制剂中之一或两者调配为用于同时、分开或依序投与之多种药剂。
在本发明之一个实施例中，本文中所描述之组合中免疫检查点抑制剂之量在约0.5％(w/w)至约20％(w/w)的范围内。
在一个实施例中，在本文所描述之组合中，组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂或其药学上可接受之盐、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或其药学上可接受之盐及免疫检查点抑制剂之量分别在约10％(w/w)至约70％(w/w)、约10％(w/w)至约70％(w/w)及约0.5％(w/w)至约20％(w/w)的范围内。
在本发明之一些实施例中，本文所描述之免疫检查点抑制剂为抗细胞毒性T淋巴球抗原4(CTLA-4)抗体或试剂、抗程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)抗体或试剂、抗程序化死亡-配位体1(PD-L1)抗体或试剂、抗T细胞免疫球蛋白及黏蛋白域3(TIM-3)抗体或试剂、抗B淋巴球及T淋巴球衰减因子(BTLA)抗体或试剂、抗含V域Ig之T细胞活化抑制因子(VISTA)抗体或试剂、抗淋巴球活化基因3(LAG-3)抗体或试剂、KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)抑制剂或抗体、A2AR(腺苷A2A受体)抑制剂、CD276抑制剂或抗体或VTCN1抑制剂或抗体。更优选地，免疫检查点抑制剂为派姆单抗(pembrolizumab)、兰利珠单抗(lambrolizumab)、皮立珠单抗(pidilizumab)、纳武单抗(nivolumab)、度伐利尤单抗(durvalumab)、阿维鲁单抗(avelumab)或阿特珠单抗(atezolizumab)。
在本发明之一些实施例中，本文所描述之癌症包括(但不限于)黑色素瘤、头颈癌、梅克尔细胞癌(merkel cell carcinoma)、肝细胞癌、肾细胞癌、大肠直肠癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、食道鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳癌、胃癌、食管胃交界部癌、典型霍奇金氏淋巴瘤(classical Hodgkin lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkinlymphoma)、尿道上皮癌、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、神经胶母细胞瘤、胰脏癌、良性前列腺增生、前列腺癌、卵巢癌、慢性淋巴球性白血病、梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、急性骨髓性白血病、胆囊癌、胆管癌、膀胱癌及子宫癌。
在另一实施例中，癌症为免疫检查点抑制剂抗性癌症或未能对癌症免疫疗法起应答之癌症。
在一个实施例中，个体尚未接受癌症疗法。在另一实施例中，个体已接受癌症疗法但未能治疗。在一些实施例中，癌症疗法为放射线疗法、化学疗法或免疫疗法。在另一实施例中，免疫疗法为抗PD1免疫疗法、抗PD L1免疫疗法或抗CTL4免疫疗法。
在本发明之一些实施例中，如本文所描述之HDAC抑制剂或其药学上可接受之盐为必须抑制I类HDAC之I类选择性HDAC抑制剂或泛HDAC抑制剂。HDAC抑制剂或其药学上可接受之盐之实例包括(但不限于)苯甲酰胺类HDAC抑制剂。优选地，HDAC抑制剂为西达本胺(Chidamide)、恩替诺特(Entinostat)、伏立诺他(Vorinostat)、罗米地辛(Romidepsin)、帕比司他(Panobinostat)、贝利司他(Belinostat)、丙戊酸(Valproic acid)、莫塞替诺特(Mocetinostat)、艾贝司他(Abexinostat)、普雷司他(Pracinostat)、瑞米司他(Resminostat)、吉维司他(Givinostat)、奎诺司他(Quisinostat)、度马诺司他(Domatinostat)、奎斯司他(Quisnostat)、CUDC-101、CUDC-907、普雷司他(Pracinostat)、西他司他(Citarinostat)、卓西司他(Droxinostat)、艾贝司他(Abexinostat)、瑞考司他(Ricolinostat)、泰克地那林(Tacedinaline)、非美诺司他(Fimepinostat)、突巴辛(Tubacin)、瑞米司他(瑞米司他)、ACY-738、替诺斯汀(Tinostamustine)、土巴他汀A(Tubastatin A)、吉维司他(Givinostat)及达诺司他(Dacinostat)。
在本发明之一些实施例中，如本文所描述之TKI或其药学上可接受之盐为受体酪氨酸激酶之抑制剂。优选地，如本文所描述之TKI或其药学上可接受之盐为血管内皮生长因子受体(VEGFR)之抑制剂。TKI或其药学上可接受之盐之实例包括(但不限于)卡博替尼(Cabozantinib)、瑞戈非尼(Regorafenib)、阿西替尼(Axitinib)、阿法替尼(Afatinib)、尼达尼布(Ninetedanib)、克唑替尼(Crizotinib)、阿来替尼Alectinib)、曲美替尼(Trametinib)、达拉非尼(Dabrafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、鲁索利替尼(Ruxolitinib)、维罗非尼(Vemurafenib)、索拉非尼(Sorafenib)、普纳替尼(Ponatinib)、康奈非尼(Encorafenib)、布加替尼(Brigatinib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、达沙替尼(Dasatinib)、伊马替尼(Imatinib)、乐伐替尼(Lenvatinib)、凡德他尼(Vandetanib)、索凡替尼(surufatinib)及司曲替尼(Sitravatinib)。
在一些其他实施例中，如本文所描述之组合之实例包括(但不限于)以下：
(i)抗CTLA4抗体、抗PD1或抗PD L1抗体(ICI)、瑞戈非尼、卡博替尼、依鲁替尼(Ibrutinib)、阿西替尼或其药学上可接受之盐(TKI)及西达本胺或西达本胺-k30或其药学上可接受之盐(HDAC)；
(ii)抗CTLA-4抗PD1或抗PD L1抗体(ICI)、瑞戈非尼、卡博替尼、依鲁替尼、阿西替尼或其药学上可接受之盐(TKI)及西达本胺-HCl盐(HDAC)。
在一些其他实施例中，如本文所描述之组合之实例包括(但不限于)以下：
(1)抗-CTLA-4抗体(ICI)+瑞戈非尼(TKI)+西达本胺或西达本胺-k30(HDAC)；
(2)抗-CTLA-4抗体(ICI)+卡博替尼(TKI)+西达本胺或西达本胺-k30(HDAC)；及
(3)抗CTLA-4抗体(ICI)+卡博替尼(TKI)+西达本胺-HCl盐(HDAC)。
在本发明之一些实施例中，如本文所述之方法或组合进一步包含投与一或多种额外抗癌剂。
图式简单说明
图1(A)至(C)显示一线抗PD-1 Ab治疗之连续治疗时程及应答结果。带有皮下CT26肿瘤之雄性Balb/c小鼠(1×106个细胞/小鼠)用抗PD-1 Ab之一线疗法治疗(平均肿瘤体积：当开始治疗时为113mm3)。小鼠用2.5mg/kg之抗PD-1 Ab或IgG腹膜内(i.p.)投与，每3天一次，持续3次给药。当小鼠在肿瘤缩小下对抗PD-1 Ab作出应答时，再给予三次给药。(A)连续治疗时程、(B)与用抗IgG抗体治疗6次之对照组相比，来自对一线抗PD-1 Ab治疗起应答之小鼠的肿瘤尺寸(mm3)、(C)(B)之肿瘤倍数变化。
图2(A)至(C)显示具有抗PD-1抗体原发性抗性之小鼠中之二线治疗的结果。在一线抗PD-1抗体疗法中，若肿瘤显示肿瘤体积之2.5至3倍连续增加且体积＜600mm3，则小鼠定义为具有原发性抗性。此等小鼠随后再入选且分成二线治疗中的五组以用于功效研究。在二线治疗中，抗IgG抗体作为对照且抗IgG及抗CTLA-4抗体以2.5mg/kg腹膜内(i.p.)投与，每3天一次，持续6次给药。二线治疗中之组合为：抗CTLA-4抗体(2.5mg/kg)与西达本胺-HCl盐(50mg/kg)加塞内昔布(Celecoxib)(50mg/kg)组合；抗CTLA-4抗体(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)组合；及抗CTLA-4抗体(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)组合。经口投与组合，每天一次，持续16次。(A)肿瘤尺寸(mm3)、(B)肿瘤倍数变化、(C)小鼠体重3。
图3(A)至(C)显示在抗PD-1抗体疗法期间患有过度进展性疾病(HPD)肿瘤之小鼠中二线治疗的结果。在投与一线抗PD-1抗体三次之后，若肿瘤体积>600mm3，则小鼠定义为患有过度进行性疾病(HPD)。此等小鼠随后再入选二线治疗以用于功效研究。二线治疗中之组合为抗CTLA-4抗体(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加西达本胺-HCl盐(50mg/kg)之组合。该组合腹膜内及经口投与。每3天一次腹膜内投与抗体持续6次给药，且每天一次投与卡博替尼与西达本胺-HCl盐之组合持续16天。(A)肿瘤倍数变化、(B)小鼠体重、(C)抗CTLA-4抗体与卡博替尼加西达本胺-HCl盐之组合，实现2CR，9SD，其中ORR为18.1％。
图4(A)至(F)显示抗PD-1 Ab原发性抗性小鼠之二线治疗中个别肿瘤体积之结果(如图2及3中所示)。(A)作为对照之抗IgG抗体组，实现5PD，其中ORR为0％。(B)抗CTLA-4抗体组，实现5SD及2PD，其中ORR为0％。(C)抗CTLA-4抗体与西达本胺-HCl盐加塞内昔布组之组合，实现3CR、4SD及1PD，其中ORR为37.5％。(D)抗CTLA-4抗体与瑞戈非尼加西达本胺-k30组之组合，实现5CR及1PR，2SD，其中ORR为62.5％。(E)抗CTLA-4抗体与卡博替尼加西达本胺-k30组之组合，实现3CR及1PR，3SD，其中ORR为57.1％。(F)在HPD小鼠中，用抗CTLA-4抗体与卡博替尼加西达本胺-HCl盐之组合治疗实现2CR，9SD，其中ORR为18.1％。
图5(A)至(E)显示针对一线抗PD-1抗体治疗之获得性抗性的二线治疗的结果。小鼠用2.5mg/kg之抗PD-1抗体之一线治疗腹膜内治疗，每3天一次，持续6次给药。若肿瘤体积在2倍至3倍治疗下，且随后经由所有6次治疗增加超过2倍，则小鼠定义为对抗PD-1抗体具有获得性抗性(复发)。此等小鼠随后用抗CTLA-4抗体与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合的二线治疗来治疗用于功效研究。(A)为了比较，显示来自图2(A)之不同治疗中的肿瘤尺寸。(B)针对具有获得性抗PD-1抗体抗性之一线及二线治疗之小鼠的治疗时程及肿瘤尺寸。(C)在用抗EGFR-4抗体与瑞戈非尼加西达本胺-k30方案之组合之二线治疗后，具有获得性抗PD-1抗体抗性之小鼠中的个别肿瘤体积。治疗实现1CR及6SD，其中ORR为14.1％。(D)对抗PD-1抗体具有原发性抗性之小鼠在二线治疗之后的总存活率。(E)对抗PD1抗体具有获得性抗性之小鼠在二线治疗后的总存活率。
图6(A)至(G)显示在携带CT26肿瘤之小鼠模型中单独或与抗PD-1抗体组合之乐伐替尼治疗的抗肿瘤作用及免疫性评估之结果。按指示用不同治疗模式治疗携带CT26肿瘤之Balb/c小鼠。抗IgG抗体，IgG对照(2.5mg/kg)；抗PD-1单株抗体，PD-1(2.5mg/kg)；乐伐替尼(10mg/kg)；抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与乐伐替尼(10mg/kg)之组合。(A)总肿瘤体积。(B)个别肿瘤体积。(C)小鼠体重。(D)动物存活率。(E)复发率。(F)再攻击时程之实验设计。(G)携带回归CT26肿瘤(亦即，达成CR或PR应答)之小鼠在第34天用CT26细胞再攻击且在第51天评估复发。再攻击诱导之复发定义为相比于第41天之肿瘤尺寸，肿瘤增加至少2倍且肿瘤体积超过300mm3。CT26细胞再攻击之后的复发率示于各组中。在肿瘤植入后，按指示治疗携带CT26肿瘤之小鼠，且在肿瘤体积为3000mm3时实施安乐死。资料以平均值±SEM给出；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，使用Tukey检验之单向ANOVA。*，与IgG相比；#，与PD-1相比。
图7(A)及(B)显示适配器博替尼、依鲁替尼、阿西替尼、奥拉帕尼及西达本胺-k30与抗PD-1抗体之组合之功效比较的结果。按指示用不同治疗模式治疗携带CT26肿瘤之Balb/c小鼠。抗IgG抗体，IgG对照(2.5mg/kg)；抗PD-1单株抗体，PD-1(2.5mg/kg)；西达本胺-k30(50mg/kg)；塞内昔布(50mg/kg)；卡博替尼(30mg/kg)；依鲁替尼(6mg/kg)；阿西替尼(12.5mg/kg)；奥拉帕尼(50mg/kg)。(A)总肿瘤体积及小鼠体重。(B)个别肿瘤体积。在肿瘤植入后，按指示治疗携带CT26肿瘤之小鼠，且在肿瘤体积为3000mm3时实施安乐死。资料以平均值±SEM给出；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，使用Tukey检验之单向ANOVA。*，与IgG相比；#，与PD-1相比。
图8(A)至(F)显示携带CT26肿瘤之小鼠之卡博替尼加塞内昔布或西达本胺-k30与抗PD-1抗体之组合的治疗应答及免疫性评估之结果。按指示用不同治疗模式治疗携带CT26肿瘤之Balb/c小鼠。抗IgG抗体，IgG对照(2.5mg/kg)；抗PD-1单株抗体，PD-1(2.5mg/kg)；卡博替尼(30mg/kg)；西达本胺-k30(50mg/kg)；塞内昔布(50mg/kg)。(A)总肿瘤体积。(B)个别肿瘤体积。(C)小鼠体重。(D)动物存活率。(E)复发率。(F)携带回归CT26肿瘤之小鼠用CT26细胞再攻击且如图6(G)中所描述评估。CT26细胞再攻击之后的复发率示于各组中。在肿瘤植入后，按指示治疗携带CT26肿瘤之小鼠，且在肿瘤体积为3000mm3时实施安乐死。资料以平均值±SEM给出；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，使用Tukey检验之单向ANOVA。*，与IgG相比；#，与PD-1相比。
图9(A)至(K)显示在携带CT26肿瘤之小鼠中不同酪氨酸激酶抑制剂与Chidamide-k30之组合的治疗应答及免疫性评估的结果。按指示用不同治疗模式治疗携带CT26肿瘤之Balb/c小鼠。媒剂，5％ DMSO；乐伐替尼(10mg/kg)；阿西替尼(30mg/kg)；瑞戈非尼(30mg/kg)；卡博替尼(30mg/kg)；及西达本胺-k30(50mg/kg)。(A)单独或与西达本胺-k30治疗剂组合之乐伐替尼、阿西替尼之总肿瘤体积；(B)个别肿瘤体积；(C)小鼠体重；(D)动物存活率；及(E)复发率。(F)单独或与西达本胺-k30治疗剂组合之瑞戈非尼、卡博替尼之总肿瘤体积；(G)个别肿瘤体积、(H)小鼠体重、(I)动物存活率；及(J)复发率。(K)携带回归CT26肿瘤之小鼠用CT26细胞再攻击且如图6(G)中所描述评估。CT26细胞再攻击之后的复发率示于各组中。在肿瘤植入后，按指示治疗携带CT26肿瘤之小鼠，且在肿瘤体积为3000mm3时实施安乐死。资料以平均值±SEM给出；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，使用Tukey检验之单向ANOVA。*，与IgG相比；#，与PD-1相比。使用对数秩(Mantel-Cox)测试测定总存活率之p值，比较各组，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图10(A)至(K)显示携带CT26肿瘤之小鼠之卡博替尼及瑞戈非尼与西达本胺-k30加抗PD-1抗体之组合的治疗应答及免疫性评估之结果。按指示用不同治疗模式治疗携带CT26肿瘤之Balb/c小鼠。抗IgG抗体，IgG对照(2.5mg/kg)；抗PD-1单株抗体，PD-1(2.5mg/kg)；卡博替尼(30mg/kg)；瑞戈非尼(30mg/kg)；西达本胺-k30(50mg/kg)。与卡博替尼之组合以(A)总肿瘤体积、(B)个别肿瘤体积、(C)小鼠体重、(D)动物存活率及(E)复发率显示。然而，与瑞戈非尼之组合显示于(F)总肿瘤体积、(G)个别肿瘤体积、(H)小鼠体重、(I)动物存活率及(J)复发率中。(K)携带回归CT26肿瘤之小鼠用CT26细胞再攻击且如图6(G)中所描述评估。CT26细胞再攻击之后的复发率示于各组中。在肿瘤植入后，按指示治疗携带CT26肿瘤之小鼠，且在肿瘤体积为3000mm3时实施安乐死。资料以平均值±SEM给出；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，使用Tukey检验之单向ANOVA。*，与IgG相比；#，与PD-1相比。使用对数秩(Mantel-Cox)测试测定总存活率之p值，比较各两组，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图11(A)至(T)显示在携带CT26之小鼠中之ICI与TKI加HDAC抑制剂(HDACi)的组合之治疗应答的结果。按指示用不同治疗模式治疗携带CT26肿瘤之Balb/c小鼠。IgG，抗IgGAb作为对照(2.5mg/kg)；抗PD-1单株抗体PD-1(2.5mg/kg)；抗PD-L1单株抗体(2.5mg/kg)、PD-L1(2.5mg/kg)；抗CTLA-4单株抗体(2.5mg/kg)、CTLA-4(2.5mg/kg)；瑞戈非尼(30mg/kg)；卡博替尼(30mg/kg)；西达本胺-k30(50mg/kg)；伏立诺他(150mg/kg)；恩替诺特(20mg/kg)；RMC-4550(30mg/kg)。首先，在携带CT26肿瘤之小鼠中评估抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加不同HDAC抑制剂之组合。记录(A)总肿瘤体积、(B)个别肿瘤体积、(C)小鼠体重、(D)动物存活率及复发率。第二，在携带CT26之小鼠中评估抗PD-1 Ab与卡博替尼加不同HDAC抑制剂之组合。记录(E)总肿瘤体积、(F)个别肿瘤体积、(G)小鼠体重、(H)动物存活率及复发率。第三，在携带CT26之小鼠中评估不同ICI与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合。(I)总肿瘤体积、(J)个别肿瘤体积、(K)小鼠体重、(L)动物存活率及复发率。第四，在携带CT26之小鼠中评估不同ICI与卡博替尼加西达本胺-k30之组合。记录(M)总肿瘤体积、(N)个别肿瘤体积、(O)小鼠体重、(P)动物存活率及复发率。第五，在携带CT26之小鼠中评估抗PD-1 Ab与不同TKI加西达本胺-k30之组合。记录(Q)总肿瘤体积、(R)个别肿瘤体积、(S)小鼠体重、(T)动物存活率及复发率。在肿瘤植入后，按指示治疗携带CT26肿瘤之小鼠，且在肿瘤体积为3000mm3时实施安乐死。资料以平均值±SEM给出；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，使用Tukey检验之单向ANOVA。*，与IgG相比；#，与PD-1相比。使用对数秩(Mantel-Cox)测试测定总存活率之p值，比较各组，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图12(A)及(B)显示携带CT26之小鼠肿瘤中淋巴球及骨髓衍生之MDSC之免疫细胞群体分析的结果。携带CT26肿瘤之小鼠用作为对照物之抗IgG Ab，IgG(2.5mg/kg)；抗PD-1单株抗体，PD-1(2.5mg/kg)；卡博替尼(30mg/kg)；瑞戈非尼(30mg/kg)；西达本胺-k30(50mg/kg)治疗。按指示用不同治疗模式治疗携带CT26肿瘤之小鼠。治疗后第9天分离肿瘤样品以分析肿瘤中之细胞群体。(A)各治疗组之肿瘤尺寸及肿瘤中之CD3、CD4、CD8及Treg细胞群体之流式细胞量测术结果。结果显示为平均值+SD。*p<0.05对比抗IgG Ab，(n＝8至12)。(B)肿瘤中骨髓衍生之CD11b、PMN-MDSC、M-MDSC及肿瘤巨噬细胞群之流式细胞量测术的结果。结果显示为平均值+SD。*p<0.05对比抗IgG Ab。(n＝8至12)。
图13(A)至(D)显示经由调节携带CT26肿瘤之小鼠之TME中的基因表现，藉由西达本胺-HCl盐/西达本胺-k30与卡博替尼/瑞戈非尼加抗CTLA-4 Ab之组合来克服对一线抗PD-1 Ab治疗之抗性。在开始藉由RNA-seq进行基因表现之二线治疗之后第13天分析肿瘤。与(A)干扰素γ、(B)干扰素β、(C)T细胞介导之细胞毒性及(D)血管生成活性相关之基因表现与评分的热图。NES：归一化富集分数；FDR：错误发现率。依据其各别成员基因之平均log2(TPM)计算卷标分数；P值：曼-惠特尼测试(Mann-Whitney test)，双尾。TPM，转录数/百万；DGE，差异基因表现。
图14(A)至(E)显示在抗PD-1 Ab与瑞戈非尼/卡博替尼加西达本胺-k30之组合的方案中，西达本胺为关键组分，该方案显著调节携带CT26肿瘤之小鼠的TME中之基因表现。在开始藉由RNA-seq进行基因表现之治疗之后第9天分析肿瘤。与(A)趋化因子活性、(B)免疫应答、(C)干扰素γ、(D)跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性及(E)血管生成活性相关之基因表现的热图用评分显示。NES：归一化富集分数；FDR：错误发现率。依据其各别成员基因之平均log2(TPM)计算卷标分数；P值：曼-惠特尼测试(Mann-Whitney test)，双尾。TPM，转录数/百万；DGE，差异基因表现。
图15(A)至(L)显示在携带CT26之小鼠中，TKI加HDAC抑制剂(西达本胺-k30)与或不与抗PD-1抗体之组合的治疗应答的结果。按指示用不同治疗模式治疗携带CT26肿瘤之Balb/c小鼠。IgG，抗IgG Ab作为对照(2.5mg/kg)；媒剂、5％ DMSO；PD-1、抗PD-1单株抗体(2.5mg/kg)；瑞戈非尼(30mg/kg)；卡博替尼(30mg/kg)；西达本胺-k30(50mg/kg)；司曲替尼(20mg/kg)；塞内昔布(50mg/kg)。首先，在携带CT26肿瘤之小鼠中评估抗PD-1 Ab与具有或不具有西达本胺-k30之瑞戈非尼的组合。记录(A)总肿瘤体积、(B)个别肿瘤体积、(C)小鼠体重、(D)动物存活率及复发率。第二，评估在携带CT26之小鼠中抗-PD-1 Ab与具有或不具有西达本胺-k30之卡博替尼的组合。记录(E)总肿瘤体积、(F)个别肿瘤体积、(G)小鼠体重、(H)动物存活率及复发率。第三，在携带CT26之小鼠中评估不同TKI与西达本胺-k30之组合。(I)总肿瘤体积、(J)个别肿瘤体积、(K)小鼠体重、(L)动物存活率及复发率。在肿瘤植入后，按指示治疗携带CT26肿瘤之小鼠，且在肿瘤体积为3000mm3时实施安乐死。资料以平均值±SEM给出；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，使用Tukey检验之单向ANOVA。*，与IgG相比；#，与PD-1相比。使用对数秩(Mantel-Cox)测试测定总存活率之p值，比较各组，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
实施方式
除非另外规定，否则本文所使用之所有技术及科学术语具有与本发明所属领域之本领域的技术人员通常所理解相同之含义。尽管类似或等效于本文所描述之方法及材料的任何方法及材料可用于本发明之实践或测试中，但现在描述较佳方法及材料。所提及之所有公开案均以引用的方式并入本文中。
术语”“一(a及an)”指冠词之一个或超过一个(亦即，至少一个)语法对象。藉助于实例，“元素”意谓一种元素或大于一种元素。除非另外说明，否则“或”之使用意谓“及/或”。
如本文所使用，术语“个体”、“个人”或“患者”在本文中可互换地使用，且指脊椎动物，优选地为哺乳动物，更优选地为人类。哺乳动物包括(但不限于)鼠类、猿猴、人类、农畜、运动型动物及宠物。亦涵盖活体外获得或活体外培养之生物实体之组织、细胞及其后代。
如本文所使用，“治疗有效量”意谓足以治疗罹患疾病之个体(例如神经变性病)或减轻与疾病相关之症状或并发症的量。
如本文所使用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”及其类似术语指减少或改善病症及/或与其相关的症状。应了解，虽然不排除，但治疗障碍或病症并不需要完全消除与其相关的障碍、病症或症状。
如本文所使用，术语“免疫疗法”指藉由包含诱导、提高、抑制或以其他方式改良免疫应答之方法治疗罹患疾病或处于感染或遭受疾病复发之风险中的个体。
如本文所使用，术语“程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)”指属于CD28家族之免疫抑制受体。PD-1在活体内主要在先前活化之T细胞上表现，且结合于两种配位体PD-L1与PD-L2。如本文所使用，术语“PD-1”包括人类PD-1(hPD-1)、hPD-1之变异体、同功异型物及物种同源物，及具有hPD-1之至少一种常见抗原决定基之类似物。可依据GenBank寄存编号U64863找到完整的hPD-1序列。
如本文所使用，术语“程序化死亡-配位体1(PD-L1)”为PD-1之两种细胞表面醣蛋白配位体之一(另一者为PD-L2)，其在结合至PD-1后下调T细胞活化及细胞介素分泌。如本文所使用，术语“PD-L1”包括人类PD-L1(hPD-L1)、hPD-L1之变异体、同功异型物及物种同源物，以及与hPD-L1具有至少一个共同抗原决定基之类似物。完整hPD-L1序列可见于Genbank寄存编号Q9NZQ7。
如本文所使用，“抗体”及其“抗原结合片段”涵盖天然存在之免疫球蛋白(例如IgM、IgG、IgD、IgA、IgE等)以及非天然存在之免疫球蛋白，包括例如单链抗体、嵌合抗体(例如人类化鼠抗体)、异结合物抗体(例如双特异性抗体)、Fab'、F(ab').sub.2、Fab、Fv及rIgG。如本文所使用，“抗原结合片段”为全长抗体之一部分，其保留特异性识别抗原之能力，以及此类部分之各种组合。
如本文所使用，术语“癌症”系指特征为异常细胞在体内不受控生长之一组广泛疾病。不受调控之细胞分裂及生长导致恶性肿瘤形成，该等恶性肿瘤侵入邻近组织且亦可经由淋巴系统或血流转移至身体之远程部分。如本文所使用，“癌症”指原发性、转移性及复发性癌症。
如本文所使用，如本文所使用之术语“组合”、“治疗组合”或“药物组合”定义一个单位剂型中的固定组合或用于组合投与的分装部分之套组，其中化合物A及化合物B可同时独立地或在时间间隔内分别地投与。
如本文所使用，术语“药学上可接受”在本文中定义指适合于与个体(例如哺乳动物或人类)之组织接触而无过度毒性、刺激过敏性应答及与合理益处/风险比相称之其他问题并发症的彼等化合物、材料、组合物及/或剂型，其在合理医学判断之范畴内。
如本文所使用，术语“共投与”或“组合投与”定义为涵盖向单个患者投与所选治疗剂，且意欲包括未必藉由相同投与途径投与或同时投与试剂之治疗方案。
本发明开发集中于调节肿瘤微环境组分，藉此移除肿瘤微环境中之免疫抑制或刺激抗癌细胞之免疫系统的方法及组合。肿瘤微环境为促成肿瘤引发、肿瘤进展及对疗法之应答的癌症生物学之重要态样。肿瘤微环境由异质细胞群体组成，异质细胞群体包括恶性细胞及经由广泛串扰支持肿瘤增殖、侵袭及转移性潜能的细胞。肿瘤细胞通常诱导免疫抑制微环境，其有利于产生免疫细胞之免疫抑制群，诸如骨髓衍生之抑制细胞(MDSC)及调节性T细胞(Treg)。因此，肿瘤微环境内之标靶未经揭示可帮助引导且改良藉由增强宿主抗癌免疫应答起作用之各种癌症疗法，尤其免疫疗法之作用。该方法及组合不仅在抑制或治疗癌症中提供有利作用而且提供同步作用。
因此，本发明之第一态样提供一种克服肿瘤微环境中之免疫抑制或刺激抗癌天然之免疫应答或对一线免疫检查点抑制剂疗法具有抗性的方法，其包含向个体投与组蛋白去乙酰酶抑制剂与酪氨酸激酶抑制剂之组合。在一个实施例中，该方法包含将HDAC抑制剂及TKI与免疫检查点抑制剂组合之组合投与个体。可替代地，本发明提供HDAC抑制剂及TKI之药物组合在制造用于克服肿瘤微环境中之免疫抑制或刺激抗癌免疫应答之药剂中的用途。可替代地，本发明提供一种用于克服肿瘤微环境中之免疫抑制或刺激抗癌免疫应答之药物组合，其中该药物组合包含HDAC抑制剂及TKI。优选地，药物组合进一步包含免疫检查点抑制剂。
本发明之第二态样为提供包含HDAC抑制剂及TKI之药物组合。优选地，药物组合进一步包含免疫检查点抑制剂。
在一个实施例中，药物组合中HDAC抑制剂及TKI之量分别在约10％(w/w)至约70％(w/w)及约10％(w/w)至约70％(w/w)的范围内。
在一些实施例中，药物组合中HDAC抑制剂之量在约20％(w/w)至约70％(w/w)、约30％(w/w)至约70％(w/w)、约40％(w/w)至约70％(w/w)、约20％(w/w)至约60％(w/w)、约30％(w/w)至约60％(w/w)、约40％(w/w)至约60％(w/w)或约35％(w/w)至约60％(w/w)的范围内。
在一些实施例中，药物组合中TKI之量在约20％(w/w)至约70％(w/w)、约30％(w/w)至约70％(w/w)、约40％(w/w)至约70％(w/w)、约20％(w/w)至约60％w/w)、约30％(w/w)至约60％w/w)、约40％(w/w)至约60％(w/w)或约35％(w/w)至约60％(w/w)的范围内。
HDAC抑制剂具有显著改良免疫调节活性之极有效的表观遗传调变特性。HDAC为催化自组蛋白上之离氨酸移除乙酰基的酶类别。此类去乙酰化使得组蛋白更紧密地包裹DNA。HDAC抑制控制引起基因表现调节之染色质重塑。HDAC已显示为藉由介导之基因表现参与致癌转化，该基因表现影响细胞周期进程、增殖及细胞凋亡。研究作为癌症以及寄生虫、感染(诸如AIDS)及发炎疾病之可能治疗标靶之HDAC。基于其辅助域与酵母组蛋白去乙酰酶之同源性，18种当前已知之人类组蛋白去乙酰酶归类为四组(I至IV)。包括HDAC1、HDAC2、HDAC3及HDAC8之I类系关于酵母RPD3基因；IIA类包括HDAC4、HDAC5、HDAC7及HDAC9；包括HDAC6及HDAC10之IIB类是关于酵母Hda1基因；III类，亦称为去乙酰化酶，是关于irS2基因且包括SIRT1-7；及仅含有HDAC11类之IV类具有I类及II类二者之特征。
在本发明之一个实施例中，HDAC抑制剂为I类HDAC或II类HDAC之抑制剂。优选地，HDAC抑制剂为I类HDAC之选择性抑制剂。在一些实施例中，HDAC抑制剂为苯甲酰胺类之组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂。在一些实施例中，HDAC抑制剂包括(但不限于)西达本胺、恩替诺特、伏立诺他、罗米地辛、帕比司他、贝利司他、丙戊酸、莫塞替诺特、艾贝司他、普雷司他、瑞米司他、吉维司他、奎诺司他、度马诺司他、奎斯司他、CUDC-101、CUDC-907、普雷司他、西他司他、卓西司他、艾贝司他、瑞考司他、泰克地那林、非美诺司他、突巴辛、瑞米司他、ACY-738、替诺斯汀、土巴他汀A、吉维司他及达诺司他。在一些实施例中，HDAC抑制剂为西达本胺、恩替诺特、伏立诺他或莫塞替诺特。
酪氨酸激酶(TK)为催化将磷酸酯基团自ATP转移至酪氨酸残基之酶。其充当细胞功能中之开关，诸如触发细胞存活、分化、增殖之信号转导。TK属于一类含有受体酪氨酸激酶(RTK)及非受体酪氨酸激酶之酶。RTK为细胞过程之关键调节剂，且鉴别为与若干病理生理疾病有关。迄今为止，已鉴别出二十种RTK之子家族，诸如人类中之EGFR(表皮生长因子受体)、FGFR(纤维母细胞生长因子受体)、VEGFR(血管内皮生长因子受体)、RETR(RET受体)、EPHR(Eph受体)及DDR(盘盘状蛋白域受体)。RTK分子含有两个区，包括具有单个跨膜螺旋之细胞外配位体结合区，及含有具有额外羧基-(C-)末端之蛋白酪氨酸激酶域以及近膜调节区之细胞质区。优选地，根据本发明之TKI为血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂，包括VEGFR1、VEGFR2及VEGFR3以抑制血管生成。更优选地，TKI为卡博替尼、瑞戈非尼、阿西替尼、阿法替尼、尼达尼布、克唑替尼、阿来替尼、曲美替尼、达拉非尼、舒尼替尼、鲁索替尼、维罗非尼、索拉非尼、普纳替尼、康奈非尼、布加替尼、帕唑帕尼、达沙替尼、伊马替尼、乐伐替尼、凡德他尼、索凡替尼或司曲替尼。
尽管不意欲受任何理论限制，但咸信多靶向激酶抑制剂拥有极有效的调变TME及提高免疫应答之能力，尤其与免疫检查点抑制剂(诸如抗PD-1或抗PD-L1抗体)组合。其达成比PD-1/PD-L1阻断单药疗法更佳的治疗功效结果。
在一个实施例中，免疫检查点抑制剂可与本文所描述之药物组合组合使用以刺激抗癌细胞免疫应答且治疗癌症。适用于本发明之免疫检查点抑制剂包含抑制性受体之拮抗剂，其抑制PD-1、CTLA-4、T细胞免疫球蛋白3、B及T淋巴球衰减因子、T细胞活化或淋巴球活化基因3路径之V域Ig抑制因子，诸如抗PD-1抗体或试剂、抗PD-L1抗体或试剂、抗CTLA-4抗体或试剂、抗TIM-3(T细胞免疫球蛋白-3)抗体或试剂、抗BTLA(B及T淋巴球衰减因子)抗体或试剂、抗VISTA(T细胞活化之V域Ig抑制因子)抗体或试剂、抗LAG-3(淋巴球活化基因3)抗体或试剂、KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)抗体或试剂、TIM-3(T细胞免疫球蛋白域及黏蛋白域3)抗体或试剂、A2AR(腺苷A2A受体)抑制剂、CD276抗体或试剂及VCTN1抗体或试剂。PD-1或PD-L1抑制剂之实例包括但不限于阻断人类PD-1之人类化抗体，诸如派姆单抗(抗PD-1Ab，商品名)或皮立珠单抗(抗PD-1 Ab)、/>(抗PD-L1 Ab，阿维鲁单抗)、/>(抗PD-L1 Ab，德瓦鲁单抗)及/>(抗PD-L1 Ab，阿特珠单抗)以及全人类抗体，诸如纳武单抗(抗PD-1 Ab，商品名/>)及西米普利单抗-rwlc(cemiplimab-rwlc)(抗PD-1 Ab，商品名/>)。其他PD-1抑制剂可包括表现可溶性PD-1配位体，包括阻断人类PD1/PD-L1，诸如BMS-1166之小分子药物，但不限于PD-L2 Fc融合蛋白，亦称为B7-DC-Ig或AMP-244及目前在研究及/或开发中用于疗法之其他PD-1抑制剂。另外，免疫检查点抑制剂可包括(但不限于)阻断PD-L1之人类化或全人类抗体(诸如德瓦鲁单抗及MIH1)及当前所研究之其他PD-L1抑制剂。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂之量在约0.5％(w/w)至约15％(w/w)、0.5％(w/w)至约10％(w/w)、0.5％(w/w)至约5％(w/w)、1.0％(w/w)至约20％(w/w)、1.0％(w/w)至约15％(w/w)、1.0％(w/w)至约10％(w/w)或1.0％(w/w)至约5％(w/w)的范围内。
在一个实施例中，HDAC抑制剂及TKI与免疫检查点抑制剂同时或以任一顺序或交替而依序投与。在本发明之一些实施例中，HDAC抑制剂、TKI及免疫检查点抑制剂同时投与。
在另一实施例中，该方法进一步包含投与一或多种额外抗癌剂。额外抗癌剂为本文所描述或此项技术中已知之任何抗癌剂。在一个实施例中，额外抗癌剂为化学疗法或基于铂之双重化学疗法。在一个实施例中，额外抗癌剂为抗VEGF抗体或VEGFR小分子抑制剂。在其他实施例中，抗癌剂为铂剂(例如顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin))、有丝分裂抑制剂(例如紫杉醇(paclitaxel)、白蛋白结合之紫杉醇、多烯紫杉醇(docetaxel)、克癌易(taxotere)、docecad)、氟化长春花生物碱(例如长春氟宁(vinflunine)、javlor)、长春瑞宾(vinorelbine)、长春花碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide)或培美曲塞吉西他滨(pemetrexed gemcitabin)。在一个实施例中，额外抗癌剂为5-氟尿嘧啶(5-FU)。在某些实施例中，额外抗癌剂为此项技术中已知之任何其他抗癌剂。
本发明之药物组合可用“载剂”调配。如本文所使用，“载剂”包括任何溶剂、分散介质、媒剂、包衣、稀释剂、抗细菌剂及/或抗真菌剂、等张剂、吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体及其类似物。此项技术已熟知用于药物活性物质之该介质及/或该等试剂的用途。举例而言，药物组合可专门调配成以固体或液体形式投与，包括适于以下之形式：(1)经口投与，例如灌药(水性或非水性溶液或悬浮液)、口含锭、糖衣药丸、胶囊、丸剂、锭剂(例如靶向经颊、舌下及全身性吸收之锭剂)、大丸剂、散剂、颗粒剂、施用于舌头之糊剂；(2)非经肠投与，例如藉由以例如无菌溶液或悬浮液或持续释放调配物形式皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射；(3)局部施用，例如以乳膏、洗剂、凝胶、软膏或控制释放贴片或喷雾剂形式施用于皮肤；(4)阴道内或直肠内，例如以子宫托、乳膏、栓剂或泡沫形式；(5)舌下；(6)经眼；(7)经皮；(8)经黏膜；或(9)经鼻。
在另一态样中，本发明提供一种治疗个体之癌症的方法，该方法包含向该个体投与本发明之药物组合。
在一些实施例中，癌症包括(但不限于)黑色素瘤、头颈癌、梅克尔细胞癌、肝细胞癌、肾细胞癌、大肠直肠癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、食道鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳癌、胃癌、食管胃交界部癌、典型霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、尿道上皮癌、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、神经胶母细胞瘤、胰脏癌、良性前列腺增生、前列腺癌、卵巢癌、慢性淋巴细胞性白血病、梅克尔细胞癌、急性骨髓性白血病、胆囊癌、胆管癌、膀胱癌或子宫癌。
在一些实施例中，本发明之药物组合可以单一调配物或药剂形式提供。在其他实施例中，本发明之药物组合可以分离调配物或药剂形式提供。药物组合可以适于一或多种较佳投与途径之多种形式及/或复数种形式调配。因此，药物组合可以经由一或多种已知途径投与，包括例如经口、非经肠(例如经皮内、经皮、经皮下、经肌内、经静脉内、经腹膜内等)或局部(例如经鼻内、经肺内、经乳房内、经阴道内、经子宫内、经皮内、经皮、经直肠等)。药物组合或其一部分可以投与至黏膜表面，诸如藉由投与至例如鼻黏膜或呼吸道黏膜(例如藉由喷雾剂或气雾剂)。药物组合或其一部分亦可以经由持续或延迟释放投与。
调配物可宜以单位剂型呈现且可藉由药剂学技术中熟知之任何方法来制备。制备与药学上可接受之载剂之组合的方法包括使本发明之药物组合与构成一或多种附属成分之载剂结合的步骤。一般而言，调配物可藉由使活性化合物与液体载剂、细粉状固体载剂或两者均匀及/或紧密地结合，且随后必要时使产物成形为所需调配物来制备。
有效治疗包括癌症之特定病症或病况之化合物之量将视病症或病况之性质而定，且可藉由标准临床技术确定。另外，活体外分析可视情况用于帮助鉴别最佳剂量范围。待用于调配物中之精确剂量亦将视投与途径及疾病或病症之进展而定，且应根据医师之判断及各患者之情况来决定。对于组合或组合之各组分而言，较佳剂量将在0.01至1000mg/kg体重、0.1mg/kg至100mg/kg、1mg/kg至100mg/kg、10mg/kg至75mg/kg、0.1至1mg/kg等的范围内。
藉由以下实例来说明本发明。应理解，将根据如本文所阐述之本发明之范畴及精神广泛地解释特定实例、材料、量以及程序。
实例
材料与方法
为了克服原发性及获得性抗性及HPD至一线PD-1检查点阻断疗法。携带皮下CT26肿瘤之雄性Balb/c小鼠(1×106个细胞/小鼠)用抗PD-1抗体(购自InvivoMab，cat#BE00146)之一线疗法治疗(平均肿瘤体积：在治疗开始时为113mm3)，以2.5mg/kg腹膜内(i.p.)投与，每3天一次持续3次给药来治疗。当肿瘤对用抗PD-1抗体治疗(其中肿瘤显著收缩)作出应答时，则连续给予治疗持续3次给药(亦即总计6次给药)。若肿瘤在抗PD-1抗体治疗开始时收缩(在3次给药之后)，则其由于连续抗PD-1抗体治疗(亦即总6次给药)而逐渐生长，此系由于部分有效地抑制肿瘤生长，且进一步尺寸变大以产生获得性抗性。当肿瘤在抗PD-1抗体治疗开始时(3次给药之后)未应答且满足肿瘤体积连续增加2.5至3次之标准时(且肿瘤体积<600mm3)，其视为原发性抗性。然而，过度进展性疾病(HPD)定义为在一线抗PD-1抗体治疗之3次给药之后肿瘤生长大于600mm3。此等小鼠具有原发性抗性、获得性抗性及HPD之小鼠随后在二线疗法中重新入选以用于功效研究，如图1(A)中所示。二线疗法如下。作为对照之抗IgG抗体(购自InvivoMab，cat#BE0089，Bio X Cell)、抗PD-1抗体(购自InvivoMab，cat#BE0146，Bio X Cell)及抗CTLA-4抗体(购自InvivoMab，cat#BE0164，Bio XCell)以2.5mg/kg经腹膜内投与，每3天一次持续6次给药。抗CTLA-4 Ab(2.5mg/kg)+西达本胺-HCl(50mg/kg)+塞内昔布(50mg/kg)、抗CTLA-4 Ab(2.5mg/kg)+瑞戈非尼(30mg/kg)+西达本胺-k30(50mg/kg)及抗CTLA-4Ab(2.5mg/kg)+卡博替尼(30mg/kg)+西达本胺-k30(50mg/kg)每天经口投与，持续16次。每2至3天量测肿瘤直径，且使用卡尺计算肿瘤体积(以mm3计)。自治疗开始量测抗癌活性，直至肿瘤体积达到3,000mm3。肿瘤体积计算为长度×宽度2×0.5。
动物模型中之抗大肠直肠癌活性。动物研究由中国台北医科大学机构动物护理及使用委员会(Taipei Medical University Institutional Animal Care and UseCommittee)(TMU IACUC，编号：LAC-2020-0103、LAC-2019-0644)批准及监督。对于所有动物实验，使用六至八周龄雄性BALB/c小鼠。CT26细胞系购自ATCC。CT26肿瘤细胞系在37℃、5％CO2下在补充有10％(v/v)FBS之RPMI-1640中生长。藉由将1×106个CT26细胞与基质胶(354248，)一起皮下注射至小鼠左侧腹中来建立肿瘤，且藉由量测两个垂直直径来确定生长。在随机分组及治疗之前，使肿瘤生长8至12天(肿瘤尺寸约110至250mm3)。当肿瘤体积达到3000mm3以上时，对动物实施安乐死。抗IgG抗体(BE0089，Lot#716719J3，Bio XCell)、抗PD-1抗体(BE0146、Lot#717918D1、Lot#735019J3、Lot#780120J3、Lot#735019O1，Bio X Cell)、抗PD-L1抗体(BE0101，Lot#720619F1，Bio X Cell)及抗CTLA-4抗体(BE0164，Lot#702418A2B，Bio X Cell)以2.5mg/kg腹膜内投与，一周两次持续三周。在100μL之无菌PBS(pH 7.4，Invitrogen Life Technologies)中将所有抗体稀释至适当浓度。给予阿西替尼(HY-10065，30mg/kg，每天经口，美国MedChemExpress)、乐伐替尼(HY-10981，10mg/kg，每天经口，美国MedChemExpress)、奥拉帕尼(HY-10162，50mg/kg，每天经口，美国MedChemExpress)、依鲁替尼(HY-10997，6mg/kg，每天经口，美国MedChemExpress)、卡博替尼(HY-13016，30mg/kg，每天经口，美国MedChemExpress)、瑞戈非尼(HY-1031，30mg/kg，每天经口，美国MedChemExpress)、RMC-4550(HY-116009，30mg/kg，每天经口，美国MedChemExpress)、司曲替尼(HY-16961，20mg/kg，每天经口，美国MedChemExpress)、恩替诺特(HY-12163，20mg/kg，经口q2d，美国MedChemExpress)、伏立诺他(HY-10221，150mg/kg，每天经口，美国MedChemExpress)、西达本胺-k30或西达本胺-HCl盐(50mg/kg，每天经口，产自中国台湾台北GNTbm)、塞内昔布(50mg/kg，每天经口，胶囊//>PfizerPharmaceuticals LLC)持续16天。将阿西替尼、乐伐替尼、奥拉帕尼、依鲁替尼、卡博替尼、瑞戈非尼、恩替诺特、伏立诺他、RMC-4550、司曲替尼及塞内昔布溶解于DMSO中且在投与之前稀释于PBS中。将西达本胺-k30及西达本胺-HCl盐溶解于水中。当肿瘤体积达到3000mm3以上时，对动物实施安乐死。自治疗开始量测抗癌活性，直至肿瘤体积达到3,000mm3。肿瘤体积计算为长度×宽度2×0.5。在此研究中，吾等定义完全应答(CR，在治疗结束后三天，携带肿瘤之小鼠中肿瘤生长<0.5倍)；部分应答(PR，在治疗结束后三天，携带肿瘤之小鼠中肿瘤尺寸≥0.5倍肿瘤生长，但<1倍肿瘤生长)；稳定疾病(SD，在治疗结束后三天，携带肿瘤之小鼠中肿瘤尺寸≥1倍肿瘤生长，但<5倍肿瘤生长)；进展性疾病(PD，在治疗结束后三天，携带肿瘤之小鼠中肿瘤尺寸≥5倍肿瘤生长)来评估治疗功效。复发定义为在第一次肿瘤评估后，具有CR或PR应答之小鼠的肿瘤生长至少5倍时。
为了说明本发明之组合可克服用抗PD-1 Ab治疗之后的抗药性问题，首先用抗PD-1 Ab治疗所有小鼠。
动物模型中之肿瘤再攻击。治疗后具有PR/CR应答之所有小鼠均在对侧用CT26细胞再攻击(请参见表6(F))。在初次肿瘤评估(第27±2天)之后的第34±2天进行用CT26之再攻击，其为7天(第41±2天)，其中注射5×106个CT26细胞/小鼠。在用CT26细胞再攻击之后，使肿瘤再生长7天(第41±2天)以测定基线为1倍。再过10天(第51±2天)之后，针对再攻击评估肿瘤生长。若满足以下准则中之两者，则将应答视为再攻击诱导之复发(recurrence/relapse)：首先，当相较于第41±2天之基线，肿瘤尺寸超过2倍；其次，第51±2天之肿瘤体积超过300mm3。复发发生在免疫性未充分活化时。若抑制肿瘤生长，则意谓免疫性经活化。
动物模型中之存活率。肿瘤评估之后，每三天或四天量测一次小鼠之肿瘤体积(每周两次)。当肿瘤体积达到3,000mm3时，携带肿瘤之小鼠经视为死亡。对所有治疗组进行记录及分析。
流式细胞量测术。以下抗体及试剂用于流式细胞量测术：CD8a PerCP-Cy5.5(53-6.7；BioLegend)、CD4 PE(GK 1.5；BioLegend)、CD25 PerCP-Cy5.5(PC61；BioLegend)、Foxp3 PE(MF14；BioLegend)、CD3 APC(17A2；BioLegend)、CD11b APC(M1/70；BioLegend)、Ly-6C PerCP-Cy5.5(HK 1.4；BioLegend)、Ly-6G PE(1 A8；BioLegend)、MHC-ll-PE(BM8；BioLegend)、CD45 FITC(30-F11；BioLegend)。流式细胞量测术用测径规(BD Biosciences)进行，且用FACSDiva软件(BD Biosciences)分析数据。
为了评估肿瘤中肿瘤浸润淋巴球之水平，进行进一步分析以分析瘤内CD8+、CD4+、调节T细胞(Treg)、PMN-MDSC、M-MDSC、TAM群。在开始卡博替尼或瑞戈非尼治疗之后第12天自小鼠切除之肿瘤样品首先纯化肿瘤浸润淋巴球，其中存在或不存在西达本胺-k30加抗PD-1 Ab。简言之，收获原发性肿瘤组织，称重且切碎成细小碎片。将含1mg/mL胶原蛋白酶IV(Sigma-Aldrich)之HBSS(Invitrogen Life Technologies)以每200mg肿瘤组织1mL之比率添加至各样品中。样品在37℃下在翻转震荡器上培育150分钟。所得组织匀浆经0.4μm过滤且在PBS(BD Biosciences)中洗涤三次，经由Percoll梯度分离以分离单核细胞，且每个样品1×106个细胞用于抗体标记。使用此前建立之CD45+CD3+CD8的表现型标准评估CD8+T细胞；使用此前建立之CD45+CD3+CD25+FoxP3+的表现型标准评估Treg细胞水平；使用此前建立之CD45+/CD11b+/Ly6G+/Ly6C-及CD45+/CD11b+/Ly6G-/Ly6C+的表现型标准分别评估PMN-MDSC及M-MDSC细胞水平；使用此前建立之CD45+CD11b+CHM-ll+Ly6C+的表现型标准评估TAM细胞水平，且将总单核细胞用作公分母。
RNA定量及定性。将在一线抗PD-1 Ab疗法之后的抗药性小鼠随机分组且经不同方案治疗，且切除肿瘤并在开始二线治疗之后的第13天收集。将天然携带CT26肿瘤之小鼠随机分组且用不同方案治疗，且切除肿瘤且在开始治疗之后的第9天收集。所有肿瘤样品在液氮中速冻，且样品接着在Trizol(Invitrogen Life Technologies)中均质化。使用SimpliNanoTM-Biochrom分光亮度计(Biochrom，MA，USA)检查RNA纯度及定量。藉由Qsep100DNA/RNA分析器(BiOptic Inc.，中国台湾)监测RNA降解及完整性。结果显示于图13及14中。
转录组测序之文库制备。将每样品1μg总RNA之总量用作RNA样品制备之输入材料。使用KAPA mRNA高制备型试剂盒(瑞士巴塞尔罗氏之KAPA生物系统(KAPA Biosystems,Roche,Basel,Switzerland))遵循制造商之建议产生测序文库，且添加索引代码以将序列定性至每一样本。PCR产物使用KAPA纯珠粒系统纯化，且在Qsep100DNA/RNA分析器(BiOpticInc.，中国台湾)上评估文库质量。
生物信息。藉由CASAVA碱基识别将藉由高通量测序获得之原始资料(IlluminaNovaSeq 6000平台)转型成原始测序读数且储存为FASTQ格式。使用FastQC及MultiQC检查fastq档案之质量。藉由Trimmomatic(v0.38)过滤所获得之原始成对末端读数以丢弃低品质读数，修整接头序列，且用以下参数消除劣质碱基：LEADING:3TRAILING:3SLIDINGWINDOW:4:15MINLEN:30。将所获得之高质量数据(清晰读数)用于后续分析。来自各样品之读段对藉由HISAT2软件(v2.1.0)与参考基因体比对。使用FeatureCounts(v1.6.0)对定位至个别基因之读段数目进行计数。对于基因表现，在无生物重复之情况下使用DEGseq(v1.36.1)进行“M值之切尾均值(Trimmed Mean)”(TMM)的归一化且有生物重复之情况下使用DESeq2(v1.22.1)进行“相对Log表现体”(RLE)的归一化。在R中使用DEGseq(无生物重复)及DESeq2(有生物复制)进行两种病况之分化表现基因(DEG)之分析，其分别基于负二项分布及泊松分布模型。使用本杰明(Benjamini)及Hochberg之方法调节所得p值，以控制FDR。使用clusterProfiler(v3.10.1)进行DEG之GO及KEGG路径富集分析。以1,000个排列进行基因体富集分析(GSEA)以自分子卷标数据库(MSigDB)鉴别富集之生物功能及活化路径。MSigDB系与GSEA软件一起使用之注释基因体集合，该软件包括标志基因体、位置基因体、经验证基因体、模体基因体、计算基因体、GO基因体、致癌基因体及免疫基因体。另外，使用R中之WGCNA(v1.64)藉由基于表现模式之相关系数之共表现网络封装建构加权基因共表现网络分析(WGCNA)。
实例1：为克服在携带CT26之小鼠中的藉由酪氨酸激酶抑制剂加HDAC抑制剂与抗CTLA-4抗体之来自一线抗PD-1 Ab治疗之抗性
在此实例中，用二线疗法治疗小鼠以模拟在人类一线癌症疗法中发生的一线抗药性之治疗，其中接受第一线抗PD-1抗体疗法之大部分人类癌症患者将产生抗性，包括原发性及获得性抗性或过度进展性疾病(HPD)-用于在一线抗PD-1抗体疗法已失败时评估使用酪氨酸激酶抑制剂加HDAC抑制剂与抗CTLA-4抗体之组合的二线疗法的抗癌效力。为评估一线抗PD-1抗体抗药性之不同治疗之有效性，设计具有治疗时程之平台，如图1(A)中所概述。如图1中所示，首先，110只小鼠用作为一线治疗之抗PD-1抗体治疗，且10只小鼠用作为阴性对照之抗IgG抗体治疗。110只小鼠中之18只藉由一线抗PD-1抗体治疗实现应答，其中获得16.4％(18/110)之客观应答率(ORR)。如图1(B)及(C)中所示，与携带CT26肿瘤之小鼠模型中之抗IgG Ab组相比，显著抑制对一线抗PD-1 Ab治疗起应答之小鼠的肿瘤体积。110只小鼠中之八十五只显示对一线抗PD-1抗体治疗之原发性抗性，其中发生率为77.3％(85/110)。此外，用一线抗PD-1抗体治疗之获得性抗性逐渐发展且最终以28％(7/25)之发生率复发，如表1中所示。此等结果表明对用一线抗PD-1抗体治疗之原发性抗性为癌症免疫疗法之极具挑战性的问题。吾人对TKI加HDAC抑制剂是否可经由调节TME来改良ICI敏感性有兴趣。对于研究，在用抗PD-1抗体(2.5mg/kg；Lot#735019O1)经腹膜内投与持续三次给药(每3天一次给药)之一线治疗之前，使肿瘤生长8天(肿瘤尺寸平均为约113mm3)。在对一线抗PD-1抗体治疗起应答之小鼠中，肿瘤受到抑制或维持，亦即，肿瘤继续缩小且达成CR或PR应答，其中ORR为16.4％。然而，当肿瘤符合治疗失败准则时：(1)在三次给药之一线抗PD-1抗体治疗之后，在第16天肿瘤体积连续增加2.5至3倍(肿瘤尺寸平均为396.8mm3)，及(2)肿瘤体积为<600mm3，将小鼠定义为产生原发性抗性且再入选二线治疗。将对抗PD-1 Ab疗法具有原发性抗性之此等小鼠进一步随机分组。关于HPD小鼠(发病率约10％，11/110)，定义为具有过度进展性疾病，其中肿瘤体积>600mm3，平均肿瘤体积为754.7mm3，如图1(A)中所示。如所指示存在九个不同治疗组(n＝9至10只小鼠/组)。将具有原发性抗性之小鼠随机分为五个不同二线治疗组，包括抗IgG Ab(2.5mg/kg；Lot#716719J3)、抗CTLA-4 Ab(2.5mg/kg；Lot#702418A2B)、作为阳性对照之抗CTLA-4 Ab与西达本胺-HCl盐(50mg/kg)加塞内昔布之组合、抗CTLA-4 Ab与瑞戈非尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合及抗CTLA-4 Ab与卡博替尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组。抗CTLA-4抗体经腹膜内(i.p.)投与持续六次给药(每3天一次给药)。西达本胺-k30、西达本胺-HCl盐、瑞戈非尼及卡博替尼藉由经口投予每天一次持续16天来给予。如图2(A)及2(B)所示，抗CTLA-4 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合，及抗CTLA-4 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合组的两个组比抗CTLA-4 Ab与西达本胺-HCl盐加塞内昔布组及仅抗CTLA-4 Ab组之阳性对照更强效抑制肿瘤生长。此等结果表明抗CTLA-4 Ab与瑞戈非尼或卡博替尼加西达本胺-k30之组合具有TME活性之极有效调节以克服对抗PD-1 Ab之一线治疗的原发性抗性。此结果亦表明抗CTLA-4Ab与西达本胺-k30加瑞戈非尼或卡博替尼之组合方案比抗CTLA-4 Ab与西达本胺-HCl盐加塞内昔布之组合方案更有力地克服原发性抗性。如图2(C)中所示，各治疗组中之小鼠的体重未显著减轻。如图3(A)至3(C)中所示，用抗CTLA-4 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加西达本胺-HCl盐(50mg/kg)之组合治疗HPD小鼠16天，且大型肿瘤意外地展示生长抑制且藉由在此治疗方案下连续缩小来控制一些肿瘤。结果表明抗CTLA-4 Ab与西达本胺-HCl盐加卡博替尼之组合为恢复HPD之极有效的方案。吾人之先前研究已证明与西达本胺-k30相比，西达本胺-HCl盐更有效地调变TME。此结果亦表明，相较于原发性抗性小鼠，HPD小鼠中之更快肿瘤生长需要用抗CTLA-4 Ab与卡博替尼加西达本胺-HCl盐之组合治疗以经由TME中之免疫调节显著抑制肿瘤生长，从而提高免疫应答。各抗药小鼠之个别结果亦示于图4中。在抗IgG Ab组中，5只小鼠实现具有快速肿瘤生长之PD。用抗CTLA-4 Ab之治疗实现5只SD小鼠及2只PD小鼠(相较于抗IgG Ab)。用抗CTLA-4 Ab与西达本胺-HCl盐加塞内昔布之组合作为阳性对照之治疗显示3个小鼠达成CR且4个小鼠达成SD，且1个小鼠达成PD(应答率37.5％)。然而，用抗CTLA-4 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合治疗显示5只小鼠达成CR，1只小鼠达成PR，且仅2只小鼠达成SD(应答率62.5％)。当为抗CTLA-4 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合时，结果表明3只小鼠达成CR，1只小鼠达成PR，且3只小鼠达成SD(应答率57.1％)。然而，用抗CTLA-4Ab与卡博替尼加西达本胺-HCl盐之组合治疗HPD小鼠显示2只小鼠达成CR且9只小鼠达成SD(应答率18.1％)。尽管HPD小鼠之免疫应答率非常高，但在用此二线方案治疗之后大多数肿瘤被抑制生长。此结果为令人感兴趣的，因为HPD肿瘤极难以有效减少及抑制。关于获得性抗性之发生率，观测到初始一线抗PD-1 Ab治疗对携带CT26之小鼠具有有效应答，但在用抗PD-1 Ab连续治疗之后，其并未有效地抑制肿瘤生长。此现象定义为对抗PD-1 Ab治疗之获得性抗性。吾人关注评估抗PTLA-4 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合在对抗PD-1 Ab具有获得性抗性之小鼠中的治疗作用，如图5中所示。使用方案抗CTLA-4 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合的治疗有效地抑制对抗PD-1 Ab具有原发性抗性之小鼠中的肿瘤生长(如图5(A)及图2(A)中所示)，然而，相同方案表明对抗PD-1Ab治疗具有获得性抗性之小鼠中肿瘤生长显著抑制，如图5(B)中所示，其显示1个小鼠达成CR且6个小鼠达成SD(应答率14.1％)，如图5(C)中所示。此外，吾人对评估具有原发性、获得性抗性或HPD对抗PD-1 Ab治疗之小鼠的存活率有兴趣。如图5(D)中所示，对于具有原发性抗性之小鼠，抗CTLA-4 Ab(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合达成87.5％之总存活率；抗CTLA-4 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组达成71.4％之总存活率；作为阳性对照之抗CTLA-4 Ab(2.5mg/kg)与西达本胺-HCl盐(50mg/kg)加塞内昔布(50mg/kg)之组合组达成37.5％之总存活率。此结果表明与阳性对照组相比，此两组在延长存活率方面极有力。关于HPD小鼠，用抗CTLA-4 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加西达本胺-HCl盐(50mg/kg)之组合治疗达成45.4％之极好总存活率。此结果值得注意，因为HPD小鼠仅达成18.1％之ORR，但由于显著抑制肿瘤生长而达成45.4％之总存活率。结果引起方案可能已具有TME之强调变能力，从而导致连续肿瘤抑制，其将甚至在治疗结束之后一个月维持。在抗CTLA-4 Ab与瑞戈非尼/卡博替尼加西达本胺-k30之组合的方案之治疗组中亦出现类似结果，其中总存活率更佳于ORR。如图5(E)中所示，具有获得性抗性之小鼠在用抗CTLA-4 Ab(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合治疗之后达成57.1％之总存活率。此类似于HPD小鼠之存活率。此等结果充分表明，抗CTLA-4 Ab与瑞戈非尼/托扎替尼加西达本胺-HCl盐/西达本胺-k30之组合具有极有效活性以调变TME且显著提高免疫应答以克服对一线抗PD-1 Ab治疗之抗性。如表2中所示，在最后一次药物投与之后3天进行初始ORR评估，然而由于观测到连续肿瘤缩小，在最后一次药物投与之后10天额外安排第二次ORR评估。在对一线抗PD-1 Ab疗法具有原发性抗性之小鼠中，用抗CTLA-4 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合组治疗将ORR自62.5％显著提高至87.5％，且在第二次评估中将CR自5只显著增加至7只小鼠。类似现象亦显示于抗CTLA-4 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合组中：其在对一线抗PD-1 Ab疗法具有原发性抗性之小鼠中，在第二次评估中将ORR自57.1％显著增加至100％且将CR/PR自4只显著提高至7只小鼠。关于HPD小鼠，在第二次评估中用抗CTLA-4 Ab与卡博替尼加西达本胺-HCl盐之组合之治疗使ORR自18.1％显著增加至45.4％。最后，针对对一线抗PD-1 Ab疗法具有获得性抗性之小鼠，用抗CTLA-4 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合治疗亦表明在第二次评估中增加之抗癌活性，ORR为14.2％至28.5％。综合而言，所有此等结果表明抗CTLA-4 Ab与瑞戈非尼/卡博替尼加西达本胺-HCl盐/西达本胺-k30之组合之方案极有力地克服对一线抗PD-1 Ab治疗之原发性、获得性抗性及HPD。
表1.每3天一次用抗PD-1及抗IgG(作为阴性对照)抗体(2.5mg/kg)之一线疗法治疗携带皮下CT26肿瘤之一百二十只雄性Balb/c小鼠，持续3次给药。
*：应答率(CR％加PR％)：18/110，16.4％；**：获得性抗性率：7/25，28.0％；***：原发性电阻率：85/110，77.3％。
表2.在对一线抗PD-1 Ab治疗具有原发性、获得性抗性或HPD之携带CT26之小鼠中用不同二线方案治疗之后的应答率。
*：复发(relapse/recurrence)定义为在第一次肿瘤评估后，具有CR或PR应答之小鼠的肿瘤生长至少5倍时。&：在二线治疗的最后一次投与之后10天的第二次肿瘤评估
#：对CT26再攻击具有抗性之小鼠。
-：未测试
应答评估准则：相较于基线之肿瘤尺寸之倍数变化
PD：x≧5；SD：1≦x<5；PR：0.5≦x<1；CR：x<0.5
实例2：为了研究携带CT26之小鼠中TKI与抗PD-1 Ab之组合之抗癌作用。
若干报告指示，乐伐替尼具有可提高携带肿瘤之小鼠模型中之抗PD-1 Ab免疫应答率之强力免疫调变特性。吾人关注重新搜寻更有力方案以调变TME以提高免疫应答率。首先，吾人评估携带CT26之小鼠模型中之乐伐替尼及乐伐替尼与抗PD-1Ab之组合。如图6(A)及6(B)中所示，乐伐替尼(10mg/kg)与或不与抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)之组合比单独的抗PD-1Ab(2.5mg/kg)更显著地抑制肿瘤生长。个体肿瘤评估显示在抗PD-1 Ab组中1只小鼠达成CR，1只小鼠达成PR，4只小鼠达成SD，且5只小鼠达成PD(应答率18％)。乐伐替尼组显示1只小鼠达成CR，2只小鼠达成PR，5只小鼠达成SD，且2只小鼠达成PD(应答率30％)。抗PD-1 Ab与乐伐替尼之组合组显示2只小鼠达成CR，7只小鼠达成SD，且3只小鼠达成PD(应答率17％)。尽管在抗PD-1 Ab与乐伐替尼之组合组中，免疫应答率似乎较低，但8只小鼠显示肿瘤生长之显著抑制，如图6(B)中所示。相较于如图6(C)中所示之抗IgG或抗PD-1 Ab组，仅乐伐替尼及乐伐替尼与抗PD-1 Ab之组合治疗组中之体重轻度地减少。此外，存活率如图6(D)中所示分析。在肿瘤植入后，当肿瘤体积达到3000mm3时，对携带CT26肿瘤之小鼠实施安乐死。与抗PD-1 Ab组相比较，抗PD-1 Ab与乐伐替尼之组合或仅乐伐替尼之方案在延长存活率方面更有力。如图6(E)中所示，复发率显示抗PD-1 Ab与乐伐替尼之组合具有比仅乐伐替尼或抗PD-1 Ab治疗更多更强之能力以激活免疫系统以避免复发。接下来，吾人有兴趣评估如图6(F)中所概述之再攻击实验中藉由不同治疗刺激的免疫性。具有CR或PR之小鼠进入7天的冲洗阶段(直至第34±2天)，而无需任何进一步治疗。随后，藉由再将相同种类之癌细胞(CT26；5×106)接种于相对的侧腹进行再攻击额外7天(第41±2天)，且随后将肿瘤体积测定为基线(1倍)。使再攻击肿瘤生长10天，且随后评定以评估肿瘤生长(第51±2天)。当免疫满足两种条件时，其定义为阴性：肿瘤体积超过300mm3，或肿瘤尺寸相比于基线超过2倍。若免疫记忆在治疗之后活化，则免疫为活性的且对具有相同抗原之癌细胞之识别具有特异性，且将抑制在再攻击期间接种之肿瘤生长，因此免疫定义为阳性。若免疫记忆未被诱导或未完全活化，导致在再攻击(肿瘤复发)期间接种之肿瘤生长，则免疫性将定义为阴性。如图6(G)中所示，在抗PD-1 Ab组中，达成PR及CR之2只小鼠在再攻击之后显示0％肿瘤复发。结果表明，此等PR及CR小鼠达成100％总体免疫记忆。在乐伐替尼与抗PD-1Ab之组合组中，达成CR之2只小鼠在再攻击之后显示0％肿瘤复发。其亦表明患有CR或PR之此等小鼠中的100％总体免疫记忆。在仅乐伐替尼组中，达成CR/PR之3只小鼠在再攻击之后显示33％肿瘤复发。其表明67％总体免疫记忆。再攻击实验用于确认该等方案是否刺激免疫系统直接或间接地活化免疫记忆的能力。
实例3：为了研究携带CT26之小鼠中酪氨酸激酶抑制剂(TKI)与抗PD-1 Ab之组合之抗癌作用。
吾人极有兴趣评估在携带CT26之小鼠模型中与抗PD-1 Ab组合之多个TKI以提高免疫应答率。如图7(A)中所示，卡博替尼、依鲁替尼、阿西替尼及奥拉帕尼，聚ADP-核糖聚合酶抑制剂(PARPi)与抗PD-1 Ab组合。相较于抗PD-1 Ab与依鲁替尼、阿西替尼及奥拉帕尼组合之治疗，卡博替尼与抗PD-1 Ab组合之方案明显抑制肿瘤生长。如图7(B)中所示之个别肿瘤尺寸(倍数变化)及ORR指示抗PD-1抗体(2.5mg/kg)组达成1CR、1SD及7PD，其中ORR(客观应答率)为11％；卡博替尼(30mg/kg)与抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)之组合组达成1CR、7SD及1PD，其中ORR为11％；阿西替尼(12.5mg/kg)与抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)之组合组达成1CR、2SD及6PD，其中ORR为11％；依鲁替尼(6mg/kg)与抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)之组合组达成1CR、1SD及7PD，其中ORR为11％；奥拉帕尼(50mg/kg)与抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)之组合组达成1SD及8PD，其中ORR为0％。在此研究中，卡博替尼(30mg/kg)与抗PD-1Ab(2.5mg/kg)之组合达成相对于TME对照之最佳抗肿瘤作用。接下来，吾人感兴趣的是评估抗PD-1 Ab与卡博替尼加COX-2抑制剂或HDAC抑制剂之组合是否可提高免疫应答率。提出添加抑制PGE2合成之COX-2抑制剂或HDAC抑制剂至与卡博替尼抗PD-1 Ab组合之方案的可能性可改良抗癌活性。如图8(A)中所示，抗PD-1抗体(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加塞内昔布(50mg/kg)或加西达本胺-k30(50mg/kg)组合之方案在与仅抗PD-1 Ab治疗相比抑制肿瘤生长方面实现极佳作用。塞内昔布为选择性COX-2抑制剂，且西达本胺为苯甲酰胺基HDAC抑制剂，选择性地抑制HDAC1、HDAC2、HDAC3及HDAC10。如图8(B)中所示之个别肿瘤尺寸(倍数变化)及ORR指示抗PD-1抗体(2.5mg/kg)组达成1CR、1PR、2SD及4PD，其中ORR为25％；抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加塞内昔布(50mg/kg)之组合组达成4CR及3SD，其中ORR为57％；抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组达成6CR及1PR，其中ORR为100％。此等数据表明，与抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加塞内昔布(50mg/kg)之组合组相比，抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组达成相对于TME对照之较佳ORR。此为第一次发现TKI加HDAC抑制剂与ICI之组合显著提高免疫应答率，其可归因于TME之调节。如图8(C)中所示，藉由不同方案治疗，小鼠体重无显著损失。在植入后，当肿瘤体积达到3000mm3时，对携带CT26肿瘤之小鼠实施安乐死。如图8(D)中所示，抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合方案与其他组相比在延长存活率方面极有力，在第60天达成100％存活率。此结果表明卡博替尼加西达本胺-k30可在TME中具有强力的免疫调节活性。随后，如图8(E)中所示评估各组中之复发率。结果表明抗PD-1 Ab、抗PD-1Ab与卡博替尼加西达本胺-k30或塞内昔布之组合组无复发。在再攻击实验中，如图6(F)中所概述，研究藉由用抗PD-1 Ab、抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30或塞内昔布之组合组治疗而活化之免疫性。如图8(F)中所示，在再攻击之后无肿瘤生长发生。结果表明此等PR及CR小鼠达成100％总体免疫记忆以识别在再攻击期间接种之CT26细胞。此显示抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30或塞内昔布之组合之方案极有效地活化免疫记忆活性以避免复发发生。
实例4：为了研究携带CT26之小鼠中酪氨酸激酶抑制剂(TKI)与西达本胺-k30之组合之抗癌作用。
接着，吾人有兴趣研究在携带CT26肿瘤之小鼠模型中，TKI加西达本胺之方案是否具有TME之强力调节及免疫应答之显著提高。如图9(A)中所示，将若干TKI与西达本胺-k30组合以测试其抑制肿瘤生长之能力。西达本胺-k30与乐伐替尼或阿西替尼组合之方案比仅乐伐替尼、阿西替尼及西达本胺-k30治疗更有效地抑制肿瘤生长。如图9(B)中所示之个别肿瘤尺寸(倍数变化)及ORR指示西达本胺-k30(50mg/kg)组达成2CR、4SD及2PD，其中ORR为25％；乐伐替尼(10mg/kg)组达成1PR、5SD及2PD，其中ORR为12.5％；阿西替尼(30mg/kg)组达成3CR、1SD及4PD，其中ORR为37.5％；乐伐替尼(10mg/kg)与西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组达成3CR、3SD及2PD，其中ORR为37.5％；阿西替尼(30mg/kg)与西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组达成4CR、3SD及1PD，其中ORR为50％。似乎西达本胺-k30与乐伐替尼或阿西替尼之组合对TME之调节具有累加作用，TME之调节表明于携带CT26肿瘤之小鼠之免疫应答率中。如图9(C)中所示，在不同治疗中，小鼠体重无显著损失。在植入后，当肿瘤体积达到3000mm3时，对携带CT26肿瘤之小鼠实施安乐死。如图9(D)中所示，西达本胺-k30与阿西替尼或乐伐替尼之组合与与仅乐伐替尼或西达本胺-k30治疗相比，显示存活率提高。亦如图9(E)中所示评估复发率。结果表明TKI与西达本胺-k30之组合可具有更强力活性以活化免疫系统来避免复发。为进一步证明理论，吾人已研究在携带CT26肿瘤之小鼠模型中与西达本胺-k30组合之其他TKI。瑞戈非尼及卡博替尼为两种所测试之强效经口多激酶抑制剂。卡博替尼为一种用于抑制c-MET、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、AXL及RET之强效多酪氨酸激酶抑制剂。瑞戈非尼为用于抑制VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、TIE-2、RET、KIT及PDGFR之经口多激酶抑制剂。如图9(F)中所示，西达本胺-k30与瑞戈非尼或卡博替尼之组合与仅西达本胺-k30、瑞戈非尼及卡博替尼治疗相比，极有效地抑制肿瘤生长。如图9(G)中所示之个别肿瘤尺寸(倍数变化)及ORR指示西达本胺-k30(50mg/kg)组达成2CR、4SD及2PD，其中ORR为25％；瑞戈非尼(30mg/kg)组达成2PR、4SD及2PD，其中ORR为25％；卡博替尼(30mg/kg)组达成3CR、2SD及2PD，其中ORR为43％；瑞戈非尼(30mg/kg)与西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组达成7CR及1SD，其中ORR为87.5％；卡博替尼(30mg/kg)与西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组达成5CR、1PR及2SD，其中ORR为75％。似乎西达本胺-k30与瑞戈非尼之组合与西达本胺-k30与卡博替尼之组合相比，对携带CT26肿瘤小鼠中的TME之调节具有较有效之协同效应，且因此提高免疫应答率。综合而言，此等数据表明西达本胺-k30与瑞戈非尼或卡博替尼之组合相对于西达本胺-k30与阿西替尼或乐伐替尼之组合治疗，在携带CT26肿瘤之小鼠中在调节TME中更有效且显著增强免疫应答率。如图9(H)中所示，小鼠体重未显著变化。评估西达本胺-k30与瑞戈非尼或卡博替尼之组合组之存活率。如图9(I)中所示，西达本胺-k30与瑞戈非尼之组合相对于西达本胺-k30与卡博替尼之组合，在延长存活期方面极有效。数据揭露西达本胺-k30与瑞戈非尼或卡博替尼之组合的方案提高免疫应答率及存活率，而不与ICI组合。此提高西达本胺-k30与瑞戈非尼或卡博替尼之组合之方案具有足以活化CTL或NK细胞以杀死肿瘤细胞之独特TME调节特性的可能性，而没有与ICI之任何组合。为进一步证实此等两种组合之抗癌效能，监测复发。如图9(J)中所示，基于在达成CR之7只小鼠中未发生复发之观测，西达本胺-k30与瑞戈非尼之组合在活化免疫系统/抗癌活性方面极有效；然而在西达本胺-k30与卡博替尼之组合组及单一疗法组中，达成CR之一些小鼠具有复发。再攻击实验(如图6(F)中所示而概述)指示西达本胺-k30与卡博替尼之组合的方案与西达本胺-k30与瑞戈非尼之组合的方案相比，可更有效地诱导记忆T细胞之产生，如图9(K)中所示。基于复发及再攻击实验之结果，似乎极有可能在用西达本胺-k30与瑞戈非尼之组合治疗之后达成CR之7只小鼠由于完全肿瘤辐射而未复发，然而，之后一些小鼠(2/7)未成功地发展或仅部分活化免疫记忆，导致在再攻击期间接种之肿瘤生长。
实例5：为了研究携带CT26之小鼠中抗PD-1 Ab与卡博替尼或瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合之抗癌活性。
在图9中，吾人之结果表明西达本胺-k30与卡博替尼或瑞戈非尼之组合对肿瘤生长活性具有极有效抑制。接着，吾人感兴趣的系研究在携带CT26肿瘤之小鼠模型中添加抗PD-1 Ab至与卡博替尼或瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合的方案。如图10(A)中所示，抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合的方案与作为阳性对照之抗PD-1 Ab与卡博替尼之组合的方案或抗PD-1 Ab与西达本胺-k30加塞内昔布之组合的方案相比，在抑制肿瘤生长方面更有效(该阳性对照先前已显示为用于免疫疗法之治疗之极具前景的组合)。此结果表明，卡博替尼可为比三重组合中之塞内昔布更有效的药物。根据资料，表明卡博替尼可比塞内昔布更充分地控制TME。如图10(B)中所示之个别肿瘤尺寸(倍数变化)及ORR指示抗PD-1Ab(2.5mg/kg)组达成1CR、3SD及5PD，其中ORR为11％；抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与西达本胺-k30(50mg/kg)加塞内昔布(50mg/kg)之组合组(作为阳性对照)达成5CR、1SD及3PD，其中ORR为56％；抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)之组合组达成3CR、1PR、3SD及2PD，其中ORR为44.0％；抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组达成5CR及4SD，其中ORR为56％。似乎两组抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合组及阳性对照组达成56％之ORR。然而，似乎，相较于用抗PD-1 Ab与西达本胺-k30加塞内昔布之组合治疗之小鼠的肿瘤，用抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合治疗各小鼠之肿瘤更显著地抑制生长(未抑制三个小鼠中之肿瘤，如图10(B)中所示)。如图10(C)中所示，用抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合治疗最初引起重量下降，但最终小鼠体重在连续治疗之后恢复。评估抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合组相较于抗PD-1 Ab与卡博替尼之组合组的存活率。如图10(D)中所示，抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合的方案比抗PD-1 Ab与卡博替尼之组合的方案在延长存活期方面更有效。在植入后，当肿瘤体积达到3000mm3时，对携带CT26肿瘤之小鼠实施安乐死。此结果亦表明西达本胺为改善抗PD-1 Ab与卡博替尼之组合的方案以显著提高携带CT26肿瘤之小鼠中之ORR及存活率的极重要组分。亦基于如图10(E)中所示之复发率之评估，抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合的方案与抗PD-1 Ab与卡博替尼之组合的方案相比，在避免复发方面更有效。此结果亦表明抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合组完全活化免疫系统以监测癌细胞且避免复发。接下来，吾人感兴趣的系评估抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合之三重组合方案。如图10(F)中所示，抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合的方案与抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)之组合的方案相比，在抑制肿瘤生长方面更有效。将抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与西达本胺-k30(50mg/kg)加塞内昔布(50mg/kg)之组组合作为阳性对照。此结果亦表明西达本胺为改善抗PD-1 Ab与瑞戈非尼之组合的方案以显著提高用于抑制肿瘤生长之免疫应答率的关键组分。如图10(G)中所示之个别肿瘤尺寸(倍数变化)及ORR指示抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)组达成1CR、3SD及5PD，其中ORR为11％；抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与西达本胺-k30(50mg/kg)加塞内昔布(50mg/kg)之组合组(作为阳性对照)达成5CR、1SD及3PD，其中ORR为56％；抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)之组合组达成5SD及4PD，其中ORR为0％；抗PD-1Ab(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组达成3CR及6SD，其中ORR为33％。尽管抗PD-1Ab(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组中之ORR比抗PD-1 Ab与西达本胺-k30加塞内昔布阳性对照之组合组的ORR低，但与其中三个小鼠中之肿瘤未经抑制之阳性对照组相比，各小鼠中之肿瘤生长受到显著抑制，如图10(G)中所示。如图10(H)中所示，抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合之治疗最初引起重量减轻，但最终小鼠体重在连续治疗之后恢复。评估抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合组相较于抗PD-1 Ab与瑞戈非尼之组合组的存活率。如图10(I)中所示，抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合的方案比抗PD-1 Ab与瑞戈非尼之组合的方案在延长存活期方面更有效。此结果再次证明西达本胺为对抗PD-1 Ab与瑞戈非尼之组合的方案有贡献的极重要组分，以显著提高携带CT26肿瘤之小鼠中之存活率。吾人惊讶的是抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合的方案的ORR仅为33％，但总存活率高达77％。显然，方案对肿瘤免疫活性具有极强调变，且尽管停止给与药物，但其继续缩小肿瘤。可在对使用抗PD-1 Ab之一线疗法具有抗药性之小鼠中发现类似结果，该等小鼠随后用抗PD-1 Ab与瑞戈非尼/卡博替尼加西达本胺-k30之组合的二线疗法治疗，如图4及5(D)中所示。如图10(J)中所示评估复发率。在抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合组中，小鼠均无一者经历复发。进行再挑战实验且结果示于图10(K)中。抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合组与抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合组两者具有极有效的免疫活化以防止藉由再攻击过程接种之肿瘤生长。此外，吾人亦发现在用抗PD-1 Ab与卡博替尼之组合组治疗之后，具有CR或PR之小鼠中之总体免疫率较低。基于免疫力活化之结果，提出抗PD-1 Ab与多激酶抑制剂(诸如瑞戈非尼或卡博替尼加西达本胺-k30)之组合的方案活化特异性免疫记忆，且因此进行强抗癌活性。控制TME以提高肿瘤免疫应答率及避免复发是有益的。西达本胺，次型选择性HDAC1、HDAC2、HDAC3及HDAC10抑制剂及强效表观遗传免疫调节剂，已批准用于R/R PTCL(复发性/难治性外周T细胞淋巴瘤)及由中国NMPA进行之ER+/Her-2-乳癌治疗。
实例6：为了研究在携带CT26之小鼠中ICI与酪氨酸激酶抑制剂(TKI)加组蛋白去乙酰酶抑制剂(HDACi)之组合的抗癌活性。
进一步在携带CT26肿瘤之小鼠中研究抗PD-1 Ab与TKI加HDAC之组合的效能及抗癌机制。如图11(A)中所示，吾等评估抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加不同HDAC抑制剂(诸如西达本胺(抑制HDAC1、HDAC2、HDAC3及HDAC10)、伏立诺他(SAHA、泛HDAC抑制剂)及恩替诺特(抑制HDAC1、HDAC2及HDAC3)之组合。结果表明抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合与抗PD-1 Ab与伏立诺他或恩替诺特之组合相比，对肿瘤生长具有更强效抑制。如图11(B)中所示之个别肿瘤尺寸(倍数变化)及ORR指示抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)组达成4SD及6PD，其中ORR(客观应答率)为0％；抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组达成2CR、1PR及7PD，其中ORR为30％；抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)加伏立诺他(150mg/kg)之组合组达成3CR、1PR、2SD及4PD，其中ORR为40％；抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)加恩替诺特(20mg/kg)之组合组达成3CR、1PR、1SD及5PD，其中ORR为40％。尽管抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组的ORR比抗PD-1 Ab与瑞戈罗非加伏立诺他(ORR为40％)或恩替诺特(ORR为40％)之组合组的ORR更低(ORR为30％)，但与抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加伏立诺他或恩替诺特之组合组(分别为4PD及5PD)相比，在抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组中在各小鼠中显著抑制肿瘤生长(无一小鼠得到PD，如图11(B)中所示)。如图11(C)中所示，抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30或恩替诺特之组合组最初降低了体重，但接着小鼠体重最终恢复。如图11(D)中所示，总存活率如下所示：抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合组>抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加恩替诺特之组合组>抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加伏立诺他之组合组>抗PD-1 Ab组。值得注意地，发现获得ORR之小鼠均无复发(图11(D)之右侧图)。接下来，测试与卡博替尼之三重组合。如图11(E)中所示，卡博替尼(30mg/kg)与西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组作为对照(亦在图9中研究)显示比抗PD-1Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组更有效的肿瘤生长抑制。然而，抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)或恩替诺特(20mg/kg)之组合的方案与抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加伏立诺他(150mg/kg)之组合的方案或仅抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)治疗相比，在抑制肿瘤生长方面更有效。如图11(F)中所示之个别肿瘤尺寸(倍数变化)及ORR指示抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)组达成4SD及6PD，其中ORR(客观应答率)为0％；抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组达成4CR、5SD及1PD，其中ORR为40％；抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加伏立诺他(150mg/kg)之组合组达成1CR、2PR、4SD及3PD，其中ORR为30％；抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加恩替诺特(20mg/kg)之组合组达成3CR、2PR、3SD及1PD，其中ORR为56％。卡博替尼(30mg/kg)与西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组达成6CR、3SD及1PD，其中ORR为60％，其与图9(G)相比显示类似结果。尽管抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组的ORR比抗PD-1 Ab与卡博替尼加恩替诺特(ORR为56％)之组合组的ORR更低(ORR为40％)，但与抗PD-1 Ab与卡博替尼加伏立诺他之组合组或仅抗PD-1 Ab治疗(分别为3PD及6PD)相比，在抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)或恩替诺特(20mg/kg)之组合组中在各小鼠中显著抑制肿瘤生长(仅一只小鼠得到PD，如图11(F)中所示)。如图11(G)中所示，仅卡博替尼与西达本胺-k30之组合组最初降低了体重，但最终小鼠体重恢复。如图11(H)中所示，总存活率如下所示：抗PD-1Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合组>抗PD-1 Ab与卡博替尼加恩替诺特之组合组>抗PD-1 Ab与卡博替尼加伏立诺他之组合组>抗PD-1 Ab组。尽管具有较高ORR，卡博替尼(30mg/kg)与西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组与抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合组具有相同存活率。此结果再次表明尽管已停止给予药物，抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合组具有极有效之免疫调节活性。在抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合组及卡博替尼(30mg/kg)与西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组中无复发。接下来，吾人感兴趣的系在携带CT26肿瘤之小鼠中评估肿瘤生长抑制与不同ICI组合之活性，诸如抗PD-1/抗PD-L1/抗CTLA-4 Ab与瑞戈非尼/卡博替尼加西达本胺-k30之组合的方案。如图11(I)中所示，抗PD-L1 Ab(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合的方案与抗CTLA-4 Ab(2.5mg/kg)或抗-PD-1 Ab(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合的方案相比，在抑制肿瘤生长方面更有效。如图11(J)中所示之个别肿瘤尺寸(倍数变化)及ORR指示抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)组达成4SD及6PD，其中ORR为0％；抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组达成2CR、1PR及7PD，其中ORR为30％；抗PD-L1 Ab(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组达成5CR、3PR及1SD，其中ORR为89％；抗CTLA-4 Ab(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组达成4CR、2PR及4SD，其中ORR为60％。抑制肿瘤生长之活性如下：抗PD-L1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合>抗CTLA-4Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合>方案>抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合的方案>抗PD-1 Ab方案。如图11(K)中所示，抗PD-L1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合组最初严重降低了体重，但接着小鼠体重最终恢复。抗CTLA-4/抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合组最初体重发生轻微降低且最终小鼠体重亦恢复。此等结果表明，抗PD-L1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合的方案具有更有效的肿瘤生长抑制活性，但可具有更强的毒性存在且可需要进一步评估其他治疗方案。如图11(L)中所示，吾人确认不同ICI与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合组是否具有不同总存活率。总存活率如下所示：抗CTLA-4 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合组>抗PD-L1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合组>抗PD-1Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合组>抗PD-1 Ab组。两种药物组合(抗CTLA-4Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合以及抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合)之ORR低于总存活率可能与此类方案在有效调节TME中之抗癌机制相关。然而，仅一只小鼠在抗PD-L1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合组中具有复发。此亦表明此等方案极有效地活化免疫系统以避免复发。如图11(M)中所示，抗CTLA-4 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合比其他方案治疗更有效地抑制肿瘤生长。如图11(N)中所示之个别肿瘤尺寸(倍数变化)及ORR指示抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)之组合组达成4SD及6PD，其中ORR为0％；卡博替尼(30mg/kg)与西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组达成6CR、3SD及1PD，其中ORR为60％；抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组达成4CR、5SD及1PD，其中ORR为40％；抗PD-L1 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组达成3CR、3PR及4SD，其中ORR为60％；抗CTLA-4 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组达成8CR、1PR及1SD，其中ORR为90％。抑制肿瘤生长之活性如下：抗CTLA-4 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合>卡博替尼与西达本胺-k30之组合的方案>抗PD-L1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合的方案>抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合的方案。如图11(O)中所示，仅抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合组通常维持体重。然而，抗PD-L1/抗CTLA-4 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合组或卡博替尼与西达本胺-k30之组合组最初体重严重降低，但接着最终小鼠体重恢复。如图11(P)中所示，总存活率如下所示：抗CTLA-4Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合组>抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合组＝抗PD-L1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合组＝卡博替尼加西达本胺-k30之组合组>抗PD-1 Ab组。仅一只小鼠在抗PD-L1 Ab与卡博替尼加西达本胺之组合组中具有复发。此结果亦表明此等方案极有效地活化免疫系统以避免复发。接着，吾人感兴趣的系比较抗PD-1Ab与不同TKI加西达本胺-k30之组合的方案。如图11(Q)中所示，抗PD-1 Ab与瑞戈非尼或卡博替尼加西达本胺-k30之组合的方案比其他方案更有效地抑制肿瘤生长。RMC-4550为熟知有效SHP-2抑制剂且报告表明当在动物模型中与抗PD-1 Ab组合时，其在改善ORR方面有效。然而，吾等数据显示，在与抗PD-1 Ab加西达本胺-k30组合的方案时，与携带CT26肿瘤之小鼠中之瑞戈非尼或卡博替尼相比，RMC-4550不具有增加抗癌活性之能力。如图11(R)中所示之个别肿瘤尺寸(倍数变化)及ORR指示抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)组达成4SD及6PD，其中ORR为0％；抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组达成2CR、1PR及7PD，其中ORR为30％；抗PD-L1 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组达成4CR、5SD及1PD，其中ORR为40％；抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与RMC-4550(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组达成1CR、1PR、2SD及6PD，其中ORR为20％。抑制肿瘤生长之活性如下：抗PD-L1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合的方案>抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合的方案>抗PD-1 Ab与RMC-4550加西达本胺-k30之组合的方案。小鼠体重显示于图11(S)中。如图11(T)中所示，总存活率如下所示：抗PD-1Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合组＝抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合组>抗PD-1 Ab与RMC-4550加西达本胺-k30之组合组>抗PD-1 Ab组。仅抗PD-1 Ab与RMC-4550加西达本胺-k30之组合组具有复发。如表3中所示，在最后一次药物投与之后3天进行正常ORR评估。然而如表4中所示，出人意料地发现在停止药物投与之后，携带CT26肿瘤之小鼠中之肿瘤继续缩小，因此在给予最后一次药物之后第10天进行第二次ORR评估。在第二次ORR评估中，抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组之ORR显著增强30％至60％。最初达成SD之3只小鼠持续具有肿瘤缩小且达成1PR及2CR，因为药物作用持续活化小鼠免疫系统中之CTL及NK，从而在第二次评估中引起4CR、2PR、3SD及1PD之结果。类似现象亦存在于抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)加恩替诺特(20mg/kg)之组合组中，ORR自40％增加至50％。此外，发现在抗CTLA-4 Ab(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组中，ORR自60％增加至80％且达成更多小鼠获得CR。尽管抗PD-L1 Ab之ORR(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组未改变，但更多小鼠变为CR(5至8)。在抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组中，ORR显著增强40％至60％。尽管抗PD-1Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加恩替诺特(20mg/kg)之组合组之ORR无变化，但更多小鼠变为CR(3至5)。类似现象亦存在于抗PD-L1/抗CTLA-4 Ab(2.5mg/kg)与卡博替尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合组中，CR分别自3增加至5及8增加至9。此等数据表明，抗PD-1/抗PD-L1/抗CTLA-4 Ab与瑞戈非尼或卡博替尼加西达本胺-k30或恩替诺特之组合对CTL或NK之活化具有极有效活性。此为重要发现，携带CT26肿瘤之小鼠中之ICI与TKI加HDACi之组合的固有抗癌效能藉由观测具有初始SD或PR作为加强免疫性之延迟发展的含义之小鼠中的改良之抗癌功效来揭露。最后，进一步藉由再攻击实验研究免疫性(如表4之右上方行中所示)。研究显示，几乎所有方案在免疫性刺激方面具有显著活性且因此有效地抑制由再攻击接种之CT26癌细胞的增殖。然而，仅两种方案(抗PD-1 Ab与卡博替尼加恩替诺特之组合及抗PD-1 Ab与RMC-4550加西达本胺之组合)出现肿瘤生长。
表3.具有或不具有ICI之HDAC抑制剂加酪氨酸激酶抑制剂在携带CT26肿瘤之小鼠模型中之功效。
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*：复发(relapse/recurrence)定义为在第一次肿瘤评估后，具有CR或PR应答之小鼠的肿瘤生长至少5倍时。
#：对CT26再攻击具有抗性之小鼠。
应答评估准则：相较于基线之肿瘤尺寸之倍数变化
PD：x≧5；SD：1≦x<5；PR：0.5≦x<1；CR：x<0.5
表4.在携带CT26肿瘤之小鼠模型中ICI与TKI加HDAC抑制剂之组合的抗癌活性。
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*：复发(relapse/recurrence)定义为在第一次肿瘤评估后，具有CR或PR应答之小鼠的肿瘤生长至少5倍时。&：在最后一次药物投与之后10天的第二次肿瘤评估
#：对CT26再攻击具有抗性之小鼠。
应答评估准则：相较于基线之肿瘤尺寸之倍数变化
PD：x≧5；SD：1≦x<5；PR：0.5≦x<1；CR：x<0.5
实例7：在携带CT26肿瘤之小鼠中与或不与西达本胺-k30组合之抗PD-1 Ab加卡博替尼或瑞戈非尼之间的肿瘤细胞群之比较
为了测定用抗PD-1 Ab与卡博替尼/瑞戈非尼之组合或抗-PD-1 Ab与卡博替尼/瑞戈非尼加西达本胺-k30之三重组合治疗是否影响肿瘤中之骨髓细胞及T细胞群，在开始治疗后第9天分离肿瘤样品，且藉由流式细胞量测术(FACS)评估免疫细胞。如图12中所示，在具有或不具有西达本胺-k30之抗PD-1 Ab与卡博替尼或瑞戈非尼之组合治疗之后，CD4+T细胞及Treg显著改变，如图12(A)中所示。流式细胞量测术结果表明抗PD-1 Ab与卡博替尼或瑞戈非尼之组合对减少Treg细胞有效，其有利于响应于肿瘤扩展而活化肿瘤中之免疫性。另外，仅PD-1 Ab+瑞戈非尼+西达本胺-k30之组合的方案引起CD8+T细胞浸润之显著增加。关于MDSC，已知此等骨髓衍生之不成熟细胞通常在携带肿瘤之宿主中升高且具有有效免疫抑制活性。与其他方案相比，抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合的治疗显著减少肿瘤中之PMN-MDSC细胞及肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，如图12(B)中所示，表明此三重组合更可能藉由引导免疫抑制细胞PMN-MDSC细胞及TAM消耗而引起肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)增加之结果。
实例8：经由调节携带CT26肿瘤之小鼠中之TME中的基因表现，藉由西达本胺-k30与卡博替尼/瑞戈非尼加抗CTLA-4 Ab之组合来克服对一线抗PD-1 Ab治疗之抗性。
如图13中所示，分析藉由用不同二线方案治疗来调节以克服对一线抗PD-1 Ab治疗之抗药性的基因表现。如图13(A)中所示，结果表明，抗CTLA-4 Ab与西达本胺-k30加卡博替尼或瑞戈非尼之组合的方案与西达本胺-HCl盐与具有或不具有抗CTLA-4 Ab疗法之塞内昔布之组合及仅抗CTLA-4 Ab相比，在诱导干扰素γ相关之基因表现方面更有效。类似结果亦表明，与西达本胺-HCl盐与具有或不具有抗CTLA-4Ab之塞内昔布之组合的方案及仅抗CTLA-4 Ab相比，抗CTLA-4 Ab与西达本胺-k30加卡博替尼或瑞戈非尼之组合的方案显著地增强干扰素-β相关之基因表现，如图13(B)中所示。分析与T细胞介导之细胞毒性相关之基因表现，如图13(C)中所示。抗CTLA-4 Ab与西达本胺-k30加卡博替尼或瑞戈非尼之组合的方案与西达本胺-HCl盐与塞内昔布之组合或仅抗CTLA-4 Ab相比，在诱导T细胞介导之细胞毒性相关基因表现方面更有效。然而，血管生成活性相关之基因表现在抗CTLA-4 Ab与西达本胺-k30加瑞戈非尼之组合的方式中显著下调，与如图13(D)中所示。综合而言，上文所描述之基因表现之所有调节暗示为了有效地克服由一线抗PD-1 Ab治疗所引起之抗性，TME调节涉及受包括CT26肿瘤中之免疫细胞之细胞影响的基因表现。
实例9：西达本胺为用于显著调节携带CT26肿瘤之小鼠之TME中之基因表现的抗PD-1 Ab与瑞戈非尼/卡博替尼加西达本胺-k30之组合的方案中的关键组分。
如图14中所示，CT26肿瘤之基因表现分析显示藉由西达本胺之免疫相关路径的多血症之诱导。如图14(A)中所示，仅抗PD-1 Ab与抗PD-1 Ab与卡博替尼之组合的方案之比较显示抗PD-1 Ab与卡博替尼之组合的方案在增加趋化因子活性相关基因表现位准方面更有效。此外，吾人出乎意料地发现抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合的方案与抗PD-1 Ab或抗PD-1 Ab与卡博替尼之组合的方案相比，在增强趋化因子活性相关基因表现方面更有效。对于抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合的方案，亦显示类似结果。如图14(B)中所示分析免疫应答相关基因表现。抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合的方案与仅抗PD-1 Ab或抗PD-1 Ab与卡博替尼之组合的方案相比，在增加免疫应答相关基因表现方面更有效。对于抗PD-1Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合的方案，亦显示类似结果。接下来，吾人分析如图14(C)中所示之标志干扰素γ应答相关基因表现。抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合的方案与仅抗PD-1 Ab或抗PD-1 Ab与卡博替尼之组合的方案相比，在增加标志干扰素γ应答相关基因表现方面更有效。类似结果亦显示指示抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合的方案与仅抗PD-1 Ab或抗PD-1 Ab与瑞戈非尼之组合的方案相比，在增加标志干扰素γ应答相关基因表现方面更有效。分析对基因表现下调之影响。如图14(D)中所示，与仅抗PD-1 Ab或抗PD-1 Ab与瑞戈非尼之组合组相比，跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性相关之基因表现在抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合组中更显著下调。如图14(E)中所示，与仅抗PD-1 Ab或抗PD-1 Ab与瑞戈非尼之组合组相比，血管生成活性相关之基因表现在抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合组中显著下调。在开始用包括西达本胺-k30之组合治疗之后第9天观测到基因表现之显著调节，引起趋化因子活性、免疫应答及标志干扰素γ相关基因之上调。此等结果表明，抗PD-1 Ab与瑞戈非尼/卡博替尼加西达本胺-k30之组合可补充且增加携带CT26肿瘤之小鼠模型中之免疫疗法的功效。然而，当与仅抗PD-1Ab或抗PD-1 Ab与瑞戈非尼之组合组相比时，与跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性及血管生成活性有关之基因表现之下调在抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合组中显著。综合而言，吾等数据表明且支持ICI与TKI加HDACi之组合的方案在TME中具有强效调节活性以增加携带CT26肿瘤之小鼠之免疫应答率。
实例10：为了再次确认在携带CT26之小鼠中ICI与酪氨酸激酶抑制剂(TKI)加组蛋白去乙酰酶抑制剂(HDACi)之组合的抗癌活性。
进一步研究抗PD-1 Ab与不同TKI加西达本胺-k30之组合的抗癌活性，以再次确认其在携带CT26肿瘤之小鼠中的效力。如图15(A)至图15(D)所示，评估抗PD-1Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合的方案。图15(A)中之结果表明抗PD-1 Ab(2.5mg/kg)与瑞戈非尼(30mg/kg)加西达本胺-k30(50mg/kg)之组合与抗PD-1 Ab与瑞戈非尼之组合相比，对肿瘤生长具有更强效抑制。如图15(B)中所示之个别肿瘤尺寸(倍数变化)及ORR指示抗PD-1 Ab组达成8PD，其中ORR(客观应答率)为0％；抗PD-1Ab与瑞戈非尼之组合组达成5SD及1PD，其中ORR为0％；抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合组达成3CR及4SD，其中ORR为43％。数据显示抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合的方案比抗PD-1 Ab与瑞戈非尼之组合的方案具有更有效抗肿瘤活性。如图15(C)中所示，抗PD-1 Ab与瑞戈非尼之组合组及抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合组最初降低了体重，但接着小鼠体重最终恢复。总存活率显示于图15(D)中。抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合组>抗PD-1Ab与瑞戈非尼之组合组>抗PD-1 Ab组。抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合组未发生复发。结果亦表明，抗PD-1 Ab与瑞戈非尼加西达本胺-k30之组合组对活化免疫系统极有效以避免复发。如图15(E)至图15(H)所示，评估抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合的方案。图15(E)中之结果表明抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合比抗PD-1 Ab与卡博替尼之组合具有更有效的肿瘤生长抑制。如图15(F)中所示之个别肿瘤尺寸(倍数变化)及ORR指示抗PD-1 Ab组达成8PD，其中ORR(客观应答率)为0％；抗PD-1 Ab与卡博替尼之组合组达成1CR、6SD及1PD，其中ORR为13％；抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合组达成3CR、1PR及4SD，其中ORR为50％。数据显示抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合的方案比抗PD-1 Ab与卡博替尼之组合的方案具有更有效抗肿瘤活性。如图15(G)中所示，小鼠体重未显著变化。如图15(H)中所示，与其他组相比，抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合的方案延长存活率，在第54天达成63％存活率。接下来，评估各组中的复发率。结果表明，抗PD-1 Ab与卡博替尼之组合组与抗PD-1 Ab与卡博替尼加西达本胺-k30之组合组中不存在复发。接着，吾人确认TKI与HDACi之组合是否具有比在ICI存在下更有效之肿瘤生长抑制活性。如图15(I)至图15(L)所示，评估不同TKI与西达本胺-k30之组合的方案。如图15(I)中所示，瑞戈非尼与西达本胺-k30之组合与司曲替尼与西达本胺-k30之组合的两组显示优良抗肿瘤活性。如图15(J)中所示之个别肿瘤尺寸(倍数变化)及ORR指示瑞戈非尼与西达本胺-k30之组合组达成6CR、1PR及1SD，其中ORR为88％；卡博替尼与西达本胺-k30之组合组达成1CR及7SD，其中ORR为13％；司曲替尼与西达本胺-k30之组合组达成6CR及1SD，其中ORR为86％。如图15(K)中所示，小鼠体重未显著变化。如图15(L)中所示，与其他组相比，瑞戈非尼与西达本胺-k30之组合的方案显著延长存活率，在第54天达成100％存活率。此数据表明瑞戈非尼与西达本胺-k30之组合具有有效免疫调节活性。复发率之结果表明，不同TKI与西达本胺-k30之组合组中不存在复发。第二次肿瘤评估及免疫性/免疫记忆之结果显示于表5中，其曾经证实如实例4及6中所陈述之结论(图9及表4)。在不存在抗PD-1 Ab之情况下用瑞戈非尼与西达本胺-k30之组合的方案治疗显示一些具有完全肿瘤辐射之小鼠中之不完全或部分免疫性，且在抗PD-1存在下，显示对于在第二次肿瘤评估中所观测到之增强之抗癌活性，免疫延迟发展。
表5.具有或不具有ICI之HDAC抑制剂加酪氨酸激酶抑制剂在携带CT26肿瘤之小鼠模型中之功效。
*：复发(relapse/recurrence)定义为在第一次肿瘤评估后，具有CR或PR应答之小鼠的肿瘤生长至少5倍时。&：在二线治疗的最后一次投与之后10天的第二次肿瘤评估
#：对CT26再攻击具有抗性之小鼠。
应答评估准则：相较于基线之肿瘤尺寸之倍数变化
PD：x≧5；SD：1≦x<5；PR：0.5≦x<1；CR：x<0.5
虽然已结合上文所阐述之特定实施例来描述本发明，但对其之许多替代方案及其修改及变化对于一般熟习此项技术者而言将显而易见。所有此等替代方案、修改及变化被视为属于本发明之范畴内。

Claims (20)

1.一种包含组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂或其药学上可接受之盐及酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或其药学上可接受之盐的组合之用途，其用于制造用以藉由克服肿瘤微环境中之免疫抑制或刺激免疫应答来抑制或治疗个体中之癌症的单一药剂或多种药剂，其中该HDAC抑制剂或其药学上可接受之盐及酪氨酸激酶抑制剂或其药学上可接受之盐调配为一种药剂，或该HDAC抑制剂及酪氨酸激酶抑制剂各自调配为用于同时、分开或依序投与之单一药剂。
2.一种组合在制造用于藉由克服肿瘤微环境中之免疫抑制或刺激免疫应答来抑制或治疗个体中之癌症的单一药剂或多种药剂中之用途，其中该组合包含组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂或其药学上可接受之盐、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或其药学上可接受之盐与免疫检查点抑制剂(ICI)之组合；其中该组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂或其药学上可接受之盐、该酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或其药学上可接受之盐及该免疫检查点抑制剂调配为一种药剂，或该HDAC抑制剂或其药学上可接受之盐、酪氨酸激酶抑制剂或其药学上可接受之盐及免疫检查点抑制剂中之一或两者调配为用于同时、分开或依序投与之多种药剂。
3.如权利要求1或2所述之用途，其中该癌症为黑色素瘤、头颈癌、梅克尔细胞癌(merkelcellcarcinoma)、肝细胞癌、肾细胞癌、大肠直肠癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、食道鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳癌、胃癌、食管胃交界部癌、典型霍奇金氏淋巴瘤(classical Hodgkinlymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma)、尿道上皮癌、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、神经胶母细胞瘤、胰脏癌、良性前列腺增生、前列腺癌、卵巢癌、慢性淋巴球性白血病、梅克尔细胞癌、急性骨髓性白血病、胆囊癌、胆管癌、膀胱癌或子宫癌。
4.如权利要求1或2所述之用途，其中该癌症为免疫检查点抑制剂抗性癌症或对癌症免疫疗法不起应答之癌症。
5.如权利要求1或2所述之用途，其中该个体尚未接受癌症疗法。
6.如权利要求5所述之用途，其中该个体已接受癌症疗法但治疗失败。
7.如权利要求1或2所述之用途，其中该HDAC抑制剂或其药学上可接受之盐为必须抑制I类HDAC之I类选择性HDAC抑制剂或泛HDAC抑制剂。
8.如权利要求1或2所述之用途，其中该HDAC抑制剂或其药学上可接受之盐为苯甲酰胺类HDAC抑制剂。
9.如权利要求1或2所述之用途，其中该HDAC抑制剂或其药学上可接受之盐为西达本胺(Chidamide)、恩替诺特(Entinostat)、伏立诺他(Vorinostat)、罗米地辛(Romidepsin)、帕比司他(Panobinostat)、贝利司他(Belinostat)、丙戊酸(Valproic acid)、莫塞替诺特(Mocetinostat)、艾贝司他(Abexinostat)、普雷司他(Pracinostat)、瑞米司他(Resminostat)、吉维司他(Givinostat)奎诺司他(Quisinostat)、度马诺司他(Domatinostat)、奎斯司他(Quisnostat)、CUDC-101、CUDC-907、普雷司他(Pracinostat)、西他司他(Citarinostat)、卓西司他(Droxinostat)、艾贝司他(Abexinostat)、瑞考司他(Ricolinostat)、泰克地那林(Tacedinaline)、非美诺司他(Fimepinostat)、突巴辛(Tubacin)、瑞米司他、ACY-738、替诺斯汀(Tinostamustine)、土巴他汀A(Tubastatin A)、吉维司他(Givinostat)或达诺司他(Dacinostat)或其药学上可接受之盐。
10.如权利要求1或2所述之用途，其中该TKI或其药学上可接受之盐为受体酪氨酸激酶之抑制剂。
11.如权利要求1或2所述之用途，其中该TKI或其药学上可接受之盐为血管内皮生长因子受体(VEGFR)之抑制剂。
12.如权利要求1或2所述之用途，其中该TKI或其药学上可接受之盐为卡博替尼(Cabozantinib)、瑞戈非尼(Regorafenib)、阿西替尼(Axitinib)、阿法替尼(Afatinib)、尼达尼布(Nintedanib)、克唑替尼(Crizotinib)、阿来替尼(Alectinib)、曲美替尼(Trametinib)、达拉非尼(Dabrafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、鲁索利替尼(Ruxolitinib)、维罗非尼(Vemurafenib)、索拉非尼(Sorafenib)、普纳替尼(Ponatinib)、康奈非尼(Encorafenib)、布加替尼(Brigatinib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、达沙替尼(Dasatinib)、伊马替尼(Imatinib)、乐伐替尼(Lenvatinib)、凡德他尼(Vandetanib)、索凡替尼(surufatinib)或司曲替尼(Sitravatinib)或其药学上可接受之盐。
13.如权利要求2所述之用途，其中该免疫检查点抑制剂为抗细胞毒性T-淋巴球抗原4(CTLA-4)抗体、抗程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)抗体、抗程序化死亡-配位体1(PD-L1)抗体、抗T细胞免疫球蛋白及黏蛋白域3(TIM-3)抗体、抗B淋巴球及T淋巴球衰减因子(BTLA)抗体、抗含V域Ig之T细胞活化抑制因子(VISTA)抗体、抗淋巴球活化基因3(LAG-3)抗体、A2AR(腺苷A2A受体)抑制剂、CD276(B7同系物3)抑制剂或抗体、VCTN1抑制剂或抗体、KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)抑制剂或抗体。
14.如权利要求2所述之用途，其中该免疫检查点抑制剂为派姆单抗(pembrolizumab)、兰利珠单抗(lambrolizumab)、皮立珠单抗(pidilizumab)、纳武单抗(nivolumab)、度伐利尤单抗(durvalumab)、阿维鲁单抗(avelumab)或阿特珠单抗(atezolizumab)。
15.如权利要求1或2所述之用途，其中该组合中该HDAC抑制剂及该TKI之量分别在约10％(w/w)至约70％(w/w)及约10％(w/w)至约70％(w/w)的范围内。
16.如权利要求2所述之用途，其中该组合中免疫检查点抑制剂之量在约0.5％(w/w)至约20％(w/w)的范围内。
17.如权利要求1或2所述之用途，其中该组合进一步包含一或多种额外抗癌剂。
18.一种药物组合，其包含如下药物组合，该药物组合包含组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂或其药学上可接受之盐及酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或其药学上可接受之盐；其中该HDAC抑制剂或其药学上可接受之盐及酪氨酸激酶抑制剂或其药学上可接受之盐调配为一种药剂，或该HDAC抑制剂及酪氨酸激酶抑制剂各自调配为用于同时、分开或依序投与之单一药剂；其中该药物组合中该HDAC抑制剂及该TKI之量分别在约10％(w/w)至约70％(w/w)及约10％(w/w)至约70％(w/w)的范围内。
19.如权利要求18所述之药物组合，其中该药物组合进一步包含免疫检查点抑制剂。
20.如权利要求19所述之药物组合，其中该药物组合中之该免疫检查点抑制剂在约0.5％(w/w)至约20％(w/w)的范围内。
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