CN116870250A - 一种抗菌骨水泥及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗菌骨水泥及其制备方法和应用，属于材料科学及医学技术领域。本发明所制备的抗菌骨水泥，由粉剂、抗生素和液剂三部分组成，所述粉剂、抗生素和液剂的用量比为：1g:0.01g‑0.1g:0.4‑0.6mL，粉剂包括呋喃基聚合物、过氧化苯甲酰和造影剂；液剂包括甲基丙烯酸甲酯单体、对苯二酚和N.N二甲基对甲苯胺。本发明将抗生素采用物理掺杂的方式纳入非浸出的呋喃基骨水泥中，发展一种兼具非释放性与可释放性抗菌性能结合的双功能化抗菌骨水泥，其具备及时有效抗感染和长期抑菌能力，实现在骨科及临床医学等领域的使用。

Description

一种抗菌骨水泥及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于材料科学及医学技术领域，具体涉及一种抗菌骨水泥及其制备方法和应用。

背景技术

聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)骨水泥已成为研究和应用较多的一种人工合成骨科植入材料，使用前包括固相粉剂与液相剂，混合后可以在术中注射并且快速成型，固化后生物力学强度大，生物相容性好，可为骨缺损部位提供有效支撑或为其它植入物提供加固，被广泛应用于多种骨科手术，但PMMA骨水泥缺乏有效的抗菌性能，因此当发生细菌侵入时，容易导致感染的发生。

为了赋予骨水泥抗菌性能，可将抗菌基团与骨水泥基质共价结合，这称为非浸出性抗菌骨水泥。与可浸出的载抗生素骨水泥(ALBC)不同，固定的抗菌剂通常通过酯键或酰胺键连接到聚合物骨架上，它们表现出较强的化学稳定性，并可产生长期的抗菌效果。近年来的研究表明，甲基硝基呋喃、苯并噻唑等杂环化合物具有良好的抗菌活性。当这些杂环化合物共价掺入骨水泥中制备苯并噻唑骨水泥或呋喃基骨水泥(NFBC)时，它们均表现出良好的抗菌活性。然而，虽然这种非浸出性抗菌骨水泥表现出长期的抗菌能力，但由于抗菌基团难以被释放出来，因此对于急性感染的处理难以实行。

抗生素水泥即是在骨水泥中添加抗生素以达到人工关节置换术后预防感染和治疗感染的作用，而现有的抗生素骨水泥一般只表现为一种性能，即可能机械性能优异，抗生素的释放能力较差，或者抗生素释放能力优异，但其本身机械性能较差；如果通过增加抗生素含量来提高抗感染能力，会使得病菌具备一定的抗药性，因此该抗生素水泥在长时间使用后其抗感染能力远远下降，无法长期达到抗菌效果。因此，亟需开发一种既具有及时有效抗感染能力，同时兼具长期抑菌能力的良好生物相容性的载抗生素呋喃基骨水泥复合材料。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗菌骨水泥的制备方法及其应用，以解决PMMA骨水泥材料无法同时具备及时有效抗感染和长期抑菌能力的问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种抗菌骨水泥，由粉剂、抗生素和液剂三部分组成，所述粉剂、抗生素和液剂的用量比为1g:0.01g-0.1g:0.4-0.6mL；所述粉剂包括呋喃基聚合物、过氧化苯甲酰和造影剂；所述液剂包括甲基丙烯酸甲酯单体、对苯二酚和N.N二甲基对甲苯胺。

所述抗菌骨水泥通过如下步骤制备：

S1.将呋喃基聚合物粉末、过氧化苯甲酰和造影剂混合，消毒，制得骨水泥的粉剂后，再加入抗生素；

S2.将甲基丙烯酸甲酯单体、对苯二酚和N.N二甲基对甲苯胺混合，即制得骨水泥的液剂；

S3.将混有抗生素的粉剂和液剂混合搅拌均匀，固化后得到抗菌骨水泥。

进一步的，所述粉剂中呋喃基聚合物粉末、过氧化苯甲酰、造影剂重量百分比为64-88wt％，1-20wt％，8-20wt％；

进一步的，所述液剂中甲基丙烯酸甲酯单体、对苯二酚和N.N二甲基对甲苯胺体积百分比分别为97.5-99％，0.05-2％，0.5-2％。

进一步的，所述造影剂为硫酸钡或二氧化锆中的任意一种。

进一步的，所述抗菌骨水泥优选的制备方法为：

S1.将80wt％的呋喃基聚合物粉末、10wt％过氧化苯甲酰和10wt％造影剂混合，消毒，制得骨水泥的粉剂后，再加入抗生素；

S2.将98％甲基丙烯酸甲酯单体、1％对苯二酚和1％N,N二甲基对甲苯胺混合，即制得骨水泥的液剂；

S3.将混有抗生素的粉剂和液剂混合搅拌均匀，固化后得到抗菌骨水泥。

进一步的，所述抗生素为万古霉素、庆大霉素或替加环素中的任意一种。

所述抗菌骨水泥在制备抗感染骨科植入材料中的应用。

本发明的有益效果：

1.本发明提供的抗菌骨水泥具有及时有效抗感染能力，同时兼具长期抑菌能力，且生物相容性优异。

2.本发明采用物理掺杂的方式将抗生素纳入呋喃基骨水泥中，所制备的骨水泥在其自身具有非释放抗菌性能的同时，被赋予可释放抗菌能力。

3.本发明中粉剂与液剂中的原料进行科学配比，提高注射性能，降低毒性风险，各原料协同配合，使得该抗菌骨水泥广泛应用于临床医学领域。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1是本发明实施例10中各组的抑菌圈示意图；

图2是本发明实施例11各组细胞不同时间点相对增殖率柱形图；

图3是本发明实施例12光镜下腹腔注射各组浸提液3天后肝脏、肾脏组织学变化。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1-9

一种抗菌骨水泥的制备方法，包括如下步骤：

按照粉剂与液剂40g:20mL进行配比

S1.在无菌、室温(23℃±1℃)及避光的环境下将32g的p(10％NFMA-co-MMA)粉末(其参照JianjunChu,etal."Preparationofnew bio-basedantibacterialacrylicbonecementviamodificationwitha biofunctionalmonomerofnitrofurfurylmethacrylate."Polymer Chemistry13(2023)制备方法合成)、4g过氧化苯甲酰和4g造影剂混合，环氧乙烷消毒，制得粉剂后，再依次分别加入表1中相应含量的抗生素(若抗生素形状不均需提前充分研磨)；

S2.将19.6mL甲基丙烯酸甲酯单体、2mL对苯二酚和2mL二甲基对甲苯胺混合，即制得液剂；

S3.将载有抗生素的粉剂和液剂混合搅拌均匀，固化后得到抗菌骨水泥，用环氧乙烷消毒储存待用，即得到9组(实施例1-9)载抗生素的呋喃基抗菌骨水泥。

抗生素的种类及添加含量如表1所示：

表1

对比例1

一种抗菌骨水泥的制备方法，包括如下步骤：

其制备方法与实施例1相同，区别之处在于不添加任何抗生素。

实施例10

抗菌骨水泥的抗菌性能试验

采用方法：药敏试验

1.对实施例1-9组和对比例1制备的抗菌骨水泥进行药敏试验，对比例1作为空白对照组。每组对单种质控菌株重复5次实验。

2.质控菌株：

(1)金黄色葡萄球菌(S.aureus)(ATCC25923)；

(2)大肠埃希菌(E.coli)(ATCC25922)。

在药敏试验中为保证实验菌株的生物学特性，所有菌株的传代数不超过4代。

3.实验步骤：

(1)无菌要求：以《中华人民共和国药典》为标准，严格灭菌相关物品，对相关菌种的复苏、传代等操作均在超净工作台内进行，严格遵循无菌操作规范，避免发生污染。

(2)菌株复苏：使用生理盐水将相关质控冷冻干燥菌株(0代)制作成菌悬液，用接种环取菌悬液按照四区划线法接种于血琼脂培养基上，于37℃、5％CO₂的环境下在恒温培养箱培养18-24h。

(3)菌株传代：继续通过四区划线法，将相关复苏质控菌株于血琼脂培养基上进行涂布，于37℃、5％CO₂的环境下在恒温培养箱培养18-24h进行传代。

(4)菌悬液制备：用无菌咽拭子棉签取传代后的相关质控菌株于3mL生理盐水中进行稀释，通过浊度仪时刻控制浊度，将其制作成菌浓度为(1.5×108)CFU/mL(0.5麦氏标准单位)的菌悬液。

(5)菌株接种：使用无菌咽拭子棉签，将棉签前部完全浸末于菌悬液中，拿出时轻压管壁以除去多余菌液，然后将菌悬液接种于MH琼脂培养基。先在培养基表面画“十”字形，然后沿不同方向均匀涂抹4次，最后在培养基底部涂抹一圈封边，保证细菌被充分接种。

(6)抗菌骨水泥样品放置：用无菌镊夹取样品，向MH琼脂培养基中分别放置实施例1-9和对比例1制备的抗菌骨水泥样品。每个MH培养基中放置的样品为3个，各样品中心距需大于24mm，试件距平板内距需大于15mm，于37℃、5％CO₂的环境下在恒温培养箱培养18-24h。从第二天开始重复使用前1天放置的抗菌骨水泥样品，以分析其抗菌周期。

(7)抗菌结果记录与分析：每日定时对各组培养基进行观察，其中菌苔的生长应均匀、连续，抑菌圈应在抗菌骨水泥样品周围呈透明圆环状，即无菌生长。观察试件周围的抑菌圈直径大小，并用游标卡尺进行测量与记录(mm)。当某组中5个重复对照组的抑菌圈直径均为6mm时，则认为该组试件无明显释放性抗菌性能，记录为“-”。

(8)评价标准：按照药敏试验一般判定标准，根据试件周围抑菌圈直径大小判断细菌对试件的敏感程度：极敏(>20mm)；高敏(15mm-20mm)；中敏(10mm-14mm)；低敏(<10mm)；不敏(0mm)。当抑菌圈直径为低敏(<10mm)时，则认为当前试件对细菌抗菌性能较差。

抗菌性能结果如图1所示，其中(1)：实施例1、2、3(万古霉素组)对金黄色葡萄球菌的抑菌圈；(2)：实施例1、2、3(万古霉素组)对大肠埃希菌的抑菌圈；(3)：实施例4、5、6(庆大霉素组)对金黄色葡萄球菌的抑菌圈；(4)：实施例4、5、6(庆大霉素组)对大肠埃希菌的抑菌圈；(5)：实施例7、8、9(替加环素组)对金黄色葡萄球菌的抑菌圈；(6)：实施例7、8、9(替加环素组)对大肠埃希菌的抑菌圈；(7)：对比例1对金黄色葡萄球菌的抑菌圈；(8)：对比例1对大肠埃希菌的抑菌圈。

对比例1在金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌中均无抑菌圈产生，表现为无释放性抗菌性能。实施例1、2、3(万古霉素组)仅在金黄色葡萄球菌中发挥释放性抗菌性能，在大肠埃希菌中无释放性抗菌性能。三种抗生素均可在呋喃基骨水泥中持续缓释，展现出不同程度持续性抗菌性能。各组抑菌圈直径在第1天最大，表明抗菌性能在第1天最强，随着实验周期延长抑菌圈直径逐渐减小，说明抗菌性能逐渐减弱。7天实验中仅4、5、6(庆大霉素组)对两种细菌持续表现为中敏(10mm-14mm)及以上的抗菌性能，无低敏(<10mm)情况出现。

实施例11

生物相容性：细胞增殖和毒性试验(体外)

1.分组：将实施例1-9所制备的抗菌骨水泥样品分别置于细胞培养基(RPMI1640培养基)，抗菌骨水泥样品与液体的比例为0.2g/mL^-1，于37℃、5％CO₂恒温培养箱内浸提24h，取出材料，调整浸提液pH值为7.4,存入4℃冰箱待用。每组重复3次试验

2.检测细胞：MC3T3-E1细胞(小鼠胚胎成骨细胞前体细胞)

3.实验步骤：

(1)无菌要求：以《中华人民共和国药典》为标准，严格灭菌相关物品，对相关菌种的复苏、传代等操作均在超净工作台内进行，严格遵循无菌操作规范，避免发生污染。

(2)细胞复苏：先将双蒸水预热到37℃，然后从液氮罐里取出装有MC3T3-E1成骨细胞的冻存管(内含1mL细胞混合液)，迅速将其置入已经预温好的37℃双蒸水中，轻摇冻存管使其快速溶解，然后置入超净台备用。先将10mL新鲜制备的RPMI1640培养基加入15mL灭菌离心管，然后将冻存管内所有冻融的细胞悬液添加至该离心管，于常温下1000rpm离心3分钟，吸取上层培养基，用1mL培养基重悬管底沉淀的细胞，轻轻吹打后加入细胞培养瓶中，补足培养基后于37℃、5％CO₂的环境下在恒温培养箱培养。定时换液并观察，当细胞融合在80％左右时可传代。

(3)细胞培养：用1640培养基(包含10％胎牛血清、1％双抗)于37℃、5％CO₂的环境下在恒温培养箱培养MC3T3-E1细胞。

(4)细胞铺板：通过胰酶将对数生长期的MC3T3-E1细胞消化为单细胞悬液，按照100uL/孔的体积接种于96孔板中(细胞密度：5×10³个/孔)，然后于37℃、5％CO₂的环境下在恒温培养箱培养24h。

(5)置换浸提液：移除原培养基溶液，按照分组替换成相应细胞培养基浸提液。

(6)CCK8检测：在培养的第1天、第3天及第5天时，往每孔内加入加1/10体积CCK8试剂，并于37℃、5％CO₂的环境下在培养箱中培养1-4h。然后在显微镜下观察各组细胞的形态学，通过酶联免疫监测仪在450nm波长上测定吸光度(Opticaldensity,OD)，计算出各组细胞相对增殖率，进一步判断细胞毒性分级。

计算公式：细胞活力＝[(A-C)/(B-C)]×100％

A：含有MC3T3-E1细胞、CCK8试剂和各组培养基的孔的吸光度

B：含有MC3T3-E1细胞、CCK8试剂和空白培养基的孔的吸光度

C：空白孔的吸光度

4评价标准：按照GB/T16886及ISO10993标准评价细胞形态学变化与细胞毒性分级，表2为细胞形态学变化评价标准，表3为细胞毒性分级标准；

表2

毒性	细胞形态
		无毒	贴壁生长良好，形态正常，呈梭形或者不规则三角形
轻度	贴壁生长良好，可见少数细胞圆缩，偶见悬浮细胞
		中度	贴壁生长不佳，细胞圆缩达1/3以上，见悬浮死细胞
重度	基本不贴壁，悬浮死细胞达90％以上

表3

相对增殖率(％)	毒性分级	细胞毒性评价
			≥100	0	无毒
75-99	1	无毒
			50-74	2	轻度
25-49	3	中度
			1-24	4	中度
0	5	重度

根据细胞毒性分级标准进行分析，如图2所示，在实施例1、2、3(万古霉素组)和实施例4、5、6(庆大霉素组)中，第1天中毒力分级均为1级，表现为无细胞毒性；在第3天和第5天中，除实施例6无细胞毒性以外，其余各组毒性分级均达到2级，表现为轻度细胞毒性。在实施例7、8、9(替加环素组)中，第1天、第3天和第5天中毒性分级为0级或1级，均表现为无毒性。进行t检验，实施例1-9第1天与第5天的细胞增殖率差异均有统计学意义(P<0.05)。说明三种抗生素组随实验周期延长均对MC3T3-E1成骨细胞增殖有不同程度的抑制作用，其中替加环素组对成骨细胞抑制程度最低。

实施例13

生物相容性：急性毒性试验(体内实验)

1.分组：将实施例3、6、9所制备的抗菌骨水泥样品分别置于生理盐水(0.9％氯化钠)，抗菌骨水泥样品与液体的比例为0.2g/mL^-1，于37℃、5％CO₂恒温培养箱内浸提24h，取出样品，调整浸提液pH值为7.4,存入4℃冰箱待用，使用前浸提液需重新预热至37℃。补充非浸提处理的空白生理盐水组作为阴性对照组，合计4组，每组重复10次试验。

2.实验动物：SPF级C57小鼠。

3.实验步骤：

(1)模型建立：取40只2g左右的健康SPF级C57小鼠，以50mL/kg的剂量分别在各组小鼠腹腔注射相应浸提液。

(2)一般观察：在给药前及给药后第1天、第2天和第3天观察动物的一般状态(体温、呼吸、食欲与运动等情况)及毒性表现(呕吐、腹泻、惊厥等情况)。第3天(72h后)处死动物，取出肝脏、肾脏行病理学观察。

(3)取材与固定：使用拉颈处死法将小鼠处死，无菌环境下取其肝脏和肾脏。

(4)切片制作：用生理盐水将肝脏和肾脏洗净，除去血渍，然后修整边缘，置入装有10％福尔马林溶液的5mLEP管中固定24h，然后使用相应浓度的乙醇对组织进行脱水硬化，再使用二甲苯进行透明，随后使用软蜡和硬蜡浸渗，等待蜡块凝固冷却后行修块与切片处理，切片的厚度为5um。在35℃温水进行展片，除去蜡片皱褶，然后将其置于甘油载玻片上，放入60℃恒温箱中干燥24h。

(5)HE染色：取干燥后的切片，使用相应浓度的乙醇行脱蜡处理，然后使用苏木素进行染色，洗净后以1％盐酸乙醇分化，分色后洗净再用伊红染色，使用不同浓度乙醇脱水，再使用二甲苯进行透明，最后用盖玻片封片。

(6)镜下观察：在显微镜下观察切片中肝、肾细胞及组织情况并分析。

4.评价标准：如表4动物毒性反应分级标准所示，按照GB/T16886及ISO10993标准评价动物毒性反应。

表4

在腹腔给药前以及给药后的第1天、第2天和第3天中观察c57小鼠情况，实施例3、6、9和空白生理盐水组中小鼠一般状态良好，未出现呼吸困难、腹部刺激、运动减少、眼睑下垂、腹泻、震颤及发绀等毒性表现，无小鼠出现死亡。第3天处死小鼠，取样时未见有腹腔粘连，如图3所示为各实验组肝脏、肾脏组织切片，其中(1)(2)为实施例3的肝脏、肾脏组织切片，(3)(4)为实施例6肝脏、肾脏组织切片，(5)(6)为实施例9肝脏、肾脏组织切片，(7)(8)为空白生理盐水组的肝脏、肾脏组织切片。

肝肾细胞和组织无明显变性或坏死，无毒性改变。说明庆大霉素组、万古霉素组及替加环素组均对c57小鼠无急性毒性。

因此，万古霉素、硫酸庆大霉素和替加环素三种抗生素均可有效从呋喃基骨水泥中释放出来并发挥抗菌作用。载抗菌剂的呋喃基骨水泥的抗菌性能与抗生素的添加量呈正相关，在40g骨水泥中加入4g抗生素时抗菌性能最强，2g时居中，1g时最弱。庆大霉素组和替加环素组比万古霉素组表现出更广谱的抗菌范围及更强的抗菌性能，其中庆大霉素组抗菌周期最长，综合抗菌性能最佳。载替加环素呋喃基骨水泥对成骨细胞的活性影响最小，拥有比载万古霉素或硫酸庆大霉素呋喃基骨水泥更好的生物相容性。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种抗菌骨水泥，其特征在于，由粉剂、抗生素和液剂三部分组成，所述粉剂、抗生素和液剂的用量比为：1g:0.01g-0.1g:0.4-0.6mL；

所述粉剂包括：按照质量百分含量计，包括呋喃基聚合物64-88_wt％、过氧化苯甲酰1-20wt％、造影剂8-20wt％；

所述液剂包括：按照体积百分含量计，包括甲基丙烯酸甲酯单体97.5-99％、对苯二酚0.05-2％和N.N二甲基对甲苯胺0.5-2％。

2.根据权利要求1所述的一种抗菌骨水泥，其特征在于，所述造影剂为硫酸钡或二氧化锆中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的一种抗菌骨水泥，其特征在于，所述抗生素为万古霉素、庆大霉素或替加环素中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的一种抗菌骨水泥的制备方法，其特征在于，包括如下步骤制备：

S1.将呋喃基聚合物、过氧化苯甲酰和造影剂混合，消毒，制得骨水泥的粉剂后，再加入抗生素；

S2.将甲基丙烯酸甲酯单体、对苯二酚和N.N二甲基对甲苯胺混合，即制得骨水泥的液剂；

S3.将混有抗生素的粉剂和液剂混合搅拌均匀，固化后得到抗菌骨水泥。

5.根据权利要求1所述抗菌骨水泥在抗感染骨科植入材料中的应用。