CN116867907A - 确定dna文库的数量和质量 - Google Patents
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Abstract
描述了用于检测DNA文库中的衔接子二聚体(3)的衔接子二聚体特异性探针(33)，其中所述探针(33)具有标记，特别是荧光团(35)，并且被设计成特异性结合到第一衔接子分子(2a)的第一衔接子核苷酸序列和结合到第二衔接子分子(2b)的第二衔接子核苷酸序列。
Description
本发明涉及根据独立权利要求的前序部分的衔接子二聚体特异性探针、检测脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)文库中的衔接子二聚体的方法以及被设计成执行该方法的盒。
现有技术
Hardigan等人的出版物CRISPR/Cas9-targeted Removal of UnwantedSequences From small-RNA Sequencing Libraries.Nucleic Acids Research2019涉及从核酸文库中去除衔接子二聚体。该去除是通过借助CRISPR/Cas9系统对衔接子二聚体进行特异性裂解来实现的。为了检验衔接子二聚体的成功去除，描述了借助定量PCR对衔接子二聚体进行定量。在此使用衔接子重叠的引物。
Shore等人的出版物Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter DimerFormation.PLoS One 2016涉及用于创建可测序的核酸文库的衔接子分子，其中避免形成衔接子二聚体。
WO 2014/144979 A1公开了在核酸文库的制备中减少或抑制形成衔接子二聚体。
WO 2019/222706 A1涉及基因组DNA的测序。提供了涉及多核苷酸文库的方法。
WO 2009/106308 A2描述了用于创建可测序的核酸文库的核酸的处理。
WO 2015/044412 A1公开了用于创建可测序的核酸文库的衔接子分子和避免形成衔接子二聚体。
为了对DNA样品进行测序，如今几乎仅使用新一代测序方法(英语“NextGeneration Sequencing，NGS)。术语NGS是指一系列不同的测序方法，所有这些方法的基本特征在于，可以自动化方式在短时间内并行进行较大量研究。例如，借助NGS可以发现新的疾病相关基因和致病基因突变，即基因物质变化。此类发现有助于理解基本的生物过程并获得关于遗传疾病发生的信息。
NGS方法之一是扩增子测序(英语amplicon sequencing或targetedsequencing)，其中由于相应的样品准备，待测序的DNA片段的片段长度在测序运行之前是已知的。
在NGS中，在每次测序运行之前对DNA文库进行精确的定量和定性分析，以能够确保测序运行的成功。在定量中，确定DNA文库中片段的浓度。在定性分析中，例如确定待测序的DNA片段的片段长度，以及确定不希望的衔接子二聚体或其它假象的形成。定量和定性分析是彼此独立地借助不同的方法和技术进行的。
发明公开
根据本发明，提供了具有独立权利要求的特征的衔接子二聚体特异性探针、检测DNA文库中的衔接子二聚体的方法以及被设计成执行该方法的盒。
尽管可用的NGS方法在所使用的试剂和方案方面不同，但所有NGS方法的基本方法步骤是相同的。首先，必须准备好待测序的DNA以进行测序。为此，待测序的DNA样本被酶促或机械切割成小片段。DNA片段的片段长度取决于各自的方法。然后，通常使用连接步骤将人工制成的被称为衔接子分子的短DNA区块连接到DNA片段的两个自由端。衔接子分子的构建方式使得它们具有与所用引物互补的核苷酸序列。引物是具有已知核苷酸序列的寡核苷酸，其作为用于DNA复制酶，例如DNA聚合酶的起点。
为了能够提供足够拷贝数量的DNA片段以进行测序，例如借助基于聚合酶链式反应(英语polymerase chain reaction，PCR)的方法来扩增具有衔接子分子作为侧翼的DNA片段。如果DNA以片段化、配备有衔接子分子且特异性富集的形式存在，则称为DNA文库(DNA-Library)。
为了对DNA文库进行定量，例如特别合适的是定量实时PCR(英语real-timequantitative PCR，qPCR)，其中扩增的DNA片段在PCR循环过程中实时定量。例如，通过荧光测量进行定量。荧光染料嵌入到DNA片段中，由此导致荧光与扩增的DNA片段数量成比例增加。
在建立DNA文库时，衔接子分子不仅结合到待扩增的DNA片段的自由端，而且还可以相互结合，以形成衔接子二聚体。这些是不希望的并且篡改了对DNA文库中的片段进行定量和随后测序两者的结果。在定量中，具有衔接子分子作为侧翼的DNA片段的数量在存在衔接子二聚体的情况中看起来比实际情况更高，因为衔接子二聚体片段也被一同定量。为了能够评估DNA文库中的片段的定量并能够控制诸如衔接子二聚体之类的假象的形成，因此除了qPCR之外还必须执行用于检验质量的进一步方法。
根据本发明，公开了用于检测衔接子二聚体，特别是DNA文库中的衔接子二聚体的衔接子二聚体特异性探针。所述衔接子二聚体特异性探针包含可用于检测它的标记。该标记特别是荧光团，以使得当荧光团被特定波长的光激发时检测到荧光辐射。替代地，衔接子二聚体特异性探针的标记是化学发光标记，其用于检测由于化学反应(化学发光)或酶促反应(生物发光)产生的光发射。进一步替代地，衔接子二聚体特异性探针的标记是放射性标记，其中检测放射性辐射，或是氧化还原活性组分，其活性通过电化学方法检测。
衔接子二聚体特异性探针例如是所谓的Taqman探针，其包含信号抑制剂(英语Quencher)。例如，在荧光团作为标记的情况下，信号抑制剂猝灭荧光团的荧光信号，这通过使荧光团在被光源激发时将至少一部分其能量释放给信号抑制剂来实现。
仅当信号抑制剂和荧光团在空间上彼此直接靠近时才会发生抑制。在DNA扩增中，特别是互补DNA链的DNA扩增(例如通过聚合酶)中，共价结合到DNA链的探针被降解。由此使信号抑制剂和荧光团彼此分开，并且可以测量荧光团的荧光增加。
衔接子二聚体特异性探针被设计成特异性结合到第一衔接子分子的第一衔接子核苷酸序列和结合到第二衔接子分子的第二衔接子核苷酸序列。
在根据本发明的衔接子二聚体特异性探针的情况中有利的是，可以直接且特异性地通过衔接子二聚体特异性探针来结合衔接子二聚体并因此可以快速且容易地进行检测。因此不需要进一步耗时和/或昂贵的方法来检测衔接子二聚体。
此外公开了在qPCR过程中检测DNA文库中的衔接子二聚体的方法，其中所述DNA文库包含DNA片段和衔接子二聚体，所述DNA片段在两个自由端具有衔接子分子作为侧翼。所述方法包括以下步骤：
a)将衔接子二聚体特异性探针添加到包含DNA文库的qPCR混合物中
b)通过由衔接子二聚体特异性探针发出的信号来确定DNA文库中所包含的衔接子二聚体的数量
c)计算DNA文库中DNA片段的实际数量，其中考虑已确定的衔接子二聚体的数量。
一般来说，qPCR是用于确定DNA文库中DNA片段浓度的非常精确的方法，因为仅使特异性衔接子结合的片段进行扩增并因此定量。然而，如果已形成衔接子二聚体，则引物会在qPCR过程中同样结合到其上，以使得衔接子二聚体同样被一同定量。在这种情况下，所测量的DNA浓度高于实际浓度。
因此，传统上对于精确定量而言必需的是，通过进一步方法，例如凝胶电泳或任选毛细管凝胶电泳来确定DNA文库中所包含的片段的片段长度，以由此可以计算DNA文库中DNA片段的实际数量。在此，从DNA片段的数量中减去衔接子二聚体的数量。
在根据本发明的方法中有利的是，直接在qPCR过程中借助衔接子二聚体特异性探针实时确定DNA文库中的衔接子二聚体的数量。因此，不需要费时且费力的方法，例如确定DNA文库中DNA片段和衔接子二聚体的片段长度，特别是如果DNA片段的片段长度已知的话，例如在用于扩增子测序的DNA文库的情况中那样。在DNA片段的片段长度已知的情况下，可以由校正的定量来计算DNA片段的数量，而无需在qPCR之后接着进行进一步的分析方法和程序。在此有利的是，借助根据本发明的探针和根据本发明的方法来因此节省工作步骤以及时间、财政和材料资源。
所确定的衔接子二聚体数量也可能作为质量特征对于DNA文库是否可用于随后的测序而言是决定性的。
进一步有利的实施方案从从属权利要求中得到。
在该方法的一个特别有利的实施方案中，向所述qPCR混合物中
在步骤a)中此外添加至少一个用于第一衔接子分子的衔接子特异性探针，和
在步骤b)中此外通过由衔接子特异性探针发出的信号来确定所包含的第一衔接子分子的数量，和
在步骤c)中计算DNA文库中DNA片段的实际数量，其中考虑已确定的衔接子二聚体的数量和已确定的第一衔接子分子的数量。
在此有利的是，既直接在qPCR过程中借助衔接子二聚体特异性探针实时检测DNA文库中的衔接子二聚体的数量，又借助衔接子特异性探针检测第一衔接子分子的数量。衔接子特异性探针既结合到作为DNA片段的侧翼的第一衔接子分子，又结合到衔接子二聚体的第一衔接子分子。因此，借助衔接子特异性探针来检测第一衔接子分子的总数。为了计算DNA文库中DNA片段的实际数量，从检测到的第一衔接子分子的数量中减去检测到的衔接子二聚体的数量。因此，不需要费时且费力的方法来确定DNA片段的实际数量，例如确定DNA文库中的DNA片段和衔接子二聚体的片段长度。
因此，在qPCR过程中，并行地通过来自衔接子特异性探针的信号对DNA文库中所包含的片段进行定量，并通过来自衔接子二聚体特异性探针的信号来确定DNA文库的质量。由此节省了工作步骤以及时间、财政、材料资源。
所确定的衔接子二聚体数量也可能作为质量特征对于DNA文库是否可用于随后的测序而言是决定性的。
在该方法的另一有利实施方案中，基于计算DNA文库中DNA片段的实际数量，确定用于随后测序，特别是NGS测序的所用DNA的数量。
确定DNA文库中DNA片段的准确数量对于DNA测序是最重要的。如果测序仪上的DNA负载量太低，则无法发挥全部潜力，因此是不经济的。负载量过多的结果是无法再正确读出测序信号。有利的是，可以借助计算出的DNA文库中DNA片段的实际数量来计算所使用的DNA的最佳量，并且因此实现测序仪的最佳负载量。
此外，所确定的衔接子二聚体的数量对于DNA文库是否可用于测序而言是决定性的。在衔接子二聚体的比例过高时，则不应使用。
有利的是，该方法是已知DNA片段长度的扩增子测序。
在此有利的是，通过特异性的样品制备已知DNA片段的长度。取决于qPCR混合物，需要该参数，以能够通过计算DNA文库的数量和质量来使用最佳量的DNA以进行扩增子测序。任选地，通过选择扩增子测序可以不需要其它方法，特别是用于确定DNA片段的片段长度的方法，由此节省时间和成本以及工作步骤。
本发明的主题还是盒，特别是微流体盒，如例如DE102016222072A1或DE102016222075A1中所描述，其中该盒被设计成执行根据本发明的方法。
用于在qPCR过程中实时检测DNA文库的衔接子二聚体或用于在qPCR过程中实时检测DNA文库的衔接子二聚体和第一衔接子分子的所述方法步骤此时例如全部在该盒内进行。例如，随后的测序也在该盒内进行。例如，用于qPCR的准备步骤也在该盒内进行。
组合的数量和质量控制在微流体系统中特别有利，因为不需要实施进一步的方法。
替代地，手动执行所述的所有步骤。
附图简要说明
本发明的实施方案在附图中示出并且在以下附图的描述中更详细地解释。其中显示了：
图1：根据本发明的用于检测衔接子二聚体的衔接子二聚体特异性探针的示意图，
图2：根据本发明的在qPCR过程中检测DNA文库中的衔接子二聚体的方法的第一实施方案的示意图，
图3：根据本发明的在qPCR过程中检测DNA文库中的衔接子二聚体的方法的第二实施方案的示意图，以及
图4：根据本发明的盒的示意图，其被设计成执行根据图3的方法。
本发明的实施方案
图1中显示了根据本发明的用于检测衔接子二聚体3，特别是DNA文库中的衔接子二聚体3的衔接子二聚体特异性探针33。
所述衔接子二聚体特异性探针33包含与第一衔接子分子2a的衔接子核苷酸序列的一部分互补的第一DNA核苷酸序列8a和与第二衔接子分子2a的衔接子核苷酸序列的一部分互补的第二DNA核苷酸序列8b。借助第一和第二DNA核苷酸序列8a、8b，衔接子二聚体特异性探针33因此特异性结合到衔接子二聚体3。
所述衔接子二聚体特异性探针33包含作为标记的荧光团35。如果荧光团35被特定波长的光激发，则其发射可检测的荧光辐射。在一个未示出的替代性实施方案中，衔接子二聚体特异性探针33的标记是化学发光标记、放射性标记或氧化还原活性组分。
所述衔接子二聚体特异性探针33例如是包含信号抑制剂37的Taqman探针。信号抑制剂37猝灭荧光团35的荧光信号，这通过使荧光团35在被光源激发时将至少一部分其能量释放给信号抑制剂37来实现。
仅当信号抑制剂37和荧光团35在空间上彼此直接靠近时才会发生抑制。在DNA扩增(例如通过DNA聚合酶)中，共价结合到DNA链的衔接子二聚体特异性探针33被降解。由此使信号抑制剂37和荧光团35彼此分开，并且可以测量荧光团35的荧光增加。
在一个替代性实施方案中，衔接子二聚体特异性探针33是不同类型的探针。
图2显示了根据本发明的用于在qPCR过程中检测DNA文库中的衔接子二聚体3的方法的第一实施方案。
首先，图2中未示出，准备DNA样品，以使得存在DNA片段1。为此，DNA样品被酶促或机械地分解成DNA片段1，或替代地，例如借助扩增子PCR(英语targeted PCR)富集特定的DNA片段1。DNA片段1的片段长度取决于各自的方法。
随后，如步骤A所示，将第一衔接子分子2a和第二衔接子分子2b添加至DNA片段1。衔接子分子2a、2b例如是伪双链衔接子分子2a、2b，并且例如通过连接而不对称地附接到DNA片段1的两个自由端1a、1b。第一衔接子分子2a因此特异性结合到DNA片段1的第一自由端1a，并且第二衔接子分子2b因此特异性结合到DNA片段1的第二自由端1b。以这种方式，形成具有衔接子分子2a、2b作为侧翼的DNA片段21。第一衔接子分子2a具有与第一引物互补的核苷酸序列。第二衔接子分子2b具有与第二引物互补的核苷酸序列。衔接子分子2a、2b不仅结合到DNA片段1的自由端，而且还可以彼此结合，尽管效率较低，从而形成衔接子二聚体3。这些是不希望的并且尤其篡改随后对DNA片段1进行定量时的结果。
在图中未示出的进一步的步骤中，具有侧翼的DNA片段21和衔接子二聚体3例如借助PCR方法进行扩增。
由此存在包含DNA片段1和衔接子二聚体3的DNA文库，所述DNA片段在两个自由端具有衔接子分子2a、2b作为侧翼。
为了能够确定DNA片段1和衔接子二聚体3的数量，例如用于对DNA片段1进行分析或测序，进行qPCR。在为此做准备时并且如步骤B所示，将第一引物4a和第二引物4b添加到混合物中，所述引物充当DNA复制酶，例如DNA聚合酶的起点。第一引物4a特异性结合到第一衔接子分子2a的互补核苷酸序列，并且第二引物4b特异性结合到第二衔接子分子2b的互补核苷酸序列。在此，与引物4a、4b互补的衔接子分子2a、2b的核苷酸序列例如仅是衔接子分子2a、2b的核苷酸序列的位于衔接子分子2a、2b各自的未结合端处的子区域。此外，将衔接子二聚体特异性探针33(例如图1所描述的探针)添加到qPCR混合物中。
衔接子二聚体特异性探针33特异性结合到第一衔接子分子2a的第一衔接子核苷酸序列和结合到第二衔接子分子2b的第二衔接子核苷酸序列。因此，衔接子二聚体特异性探针33被设计成特异性结合到衔接子二聚体3。
在随后的qPCR中，具有侧翼的DNA片段21和衔接子二聚体3进行扩增。在DNA扩增过程中，在每个循环之后测量由衔接子二聚体特异性探针33发射的荧光并记录如步骤C中所示的衔接子二聚体特异性荧光曲线333。x轴上显示PCR循环，y轴上显示测量的荧光。借助标准曲线，将分子数量分配给荧光信号。由此可以计算衔接子二聚体3的数量。
此外，扩增的DNA片段1也在每个PCR循环后实时定量。在上述步骤D中，显示了DNA片段1以及DNA嵌入标记5。DNA嵌入标记5，例如荧光染料，如下面的步骤4所示嵌入到DNA片段1中，由此使标记5的信号6，特别是荧光信号与扩增的DNA片段1的数量成比例地增加。另外，图中未示出，DNA嵌入标记5也嵌入到衔接子二聚体3中。因此，在此也检测DNA片段1和衔接子二聚体3的总浓度。可以由此计算出校正的定量，这通过从检测到的总DNA浓度中减去衔接子二聚体3的浓度来实现。如果DNA片段1的片段长度已知，例如在用于扩增子测序的样品准备的情况下那样，则可以计算DNA文库中DNA片段1的实际数量。此外，所确定的衔接子二聚体3的数量可能作为质量特征对于DNA文库是否可用于随后的测序而言是决定性的。
图3显示了根据本发明的用于在qPCR过程中检测DNA文库中的衔接子二聚体3的方法的第二实施方案。
与关于图2描述的第一实施方案中的方法不同，向所述qPCR混合物中，除了在步骤B′中的衔接子二聚体特异性探针33之外还添加衔接子特异性探针22。衔接子特异性探针22特异性结合到第一衔接子分子2a的第一衔接子核苷酸序列。因此，衔接子特异性探针22既结合到作为DNA片段1的侧翼的第一衔接子分子2a，又结合到衔接子二聚体3的第一衔接子分子2a。借助衔接子特异性探针22，因此可以检测第一衔接子分子2a的总数，其代表性地表示具有侧翼的DNA片段21的总数。
在随后的qPCR中，具有侧翼的DNA片段21和衔接子二聚体3进行扩增。在DNA扩增过程中，在每个循环之后检测由衔接子二聚体特异性探针33发射的荧光并记录如步骤C′中所示的衔接子二聚体特异性荧光曲线333。
另外，在每个扩增循环之后，检测由衔接子特异性探针22发射的荧光并记录如步骤C′中所示的衔接子特异性荧光曲线222。x轴上显示各自的PCR循环，y轴上显示测量的荧光。
借助各自的标准曲线，将各自的分子数量分配给衔接子二聚体相关的荧光信号和衔接子相关的荧光信号。这与荧光曲线222、333的记录并行地进行。为了由此计算DNA文库中DNA片段1的实际数量，从已确定的第一衔接子分子2a的数量中减去已确定的衔接子二聚体3的数量。
替代地，图3中未示出，衔接子特异性探针22特异性结合到第二衔接子分子2b的衔接子核苷酸序列。DNA文库中DNA片段1的实际数量是例如与确定用于随后测序，特别是NGS测序的所用DNA分子的数量相关的。
此外，所确定的衔接子二聚体3的数量可能作为质量特征对于DNA文库是否可用于随后的测序而言是决定性的。
取决于例如在图2和图3描述的方法中同时使用的不同DNA片段1的数量以及因此使用的不同衔接子分子2a、2b的数量，可能形成不同假象，特别是衔接子二聚体3。当然，此时可以在该方法中使用用于检测假象的多种不同的嵌合序列特异性探针，例如用于检测衔接子二聚体3的衔接子二聚体特异性探针33。为了检测衔接子分子2a、2b，此时例如可以使用多种各自的衔接子特异性探针22。
图4显示了根据本发明的盒100，特别是微流体盒。盒100被设计成执行根据如上文关于图3描述的第二实施方案的方法。此时，关于图3描述的步骤例如全部在盒100内进行。同样在盒100内例如进行随后的测序。替代地且未在图4中示出，盒100被设计成执行如关于图2描述的第一实施方案的方法，特别是具有随后的测序。
在一个替代性实施方案中，手动执行所述的所有步骤。
Claims (6)
1.用于检测衔接子二聚体(3)，特别是DNA文库中的衔接子二聚体(3)的衔接子二聚体特异性探针(33)，其中所述探针(33)具有标记，特别是荧光团(35)，并且被设计成特异性结合到第一衔接子分子(2a)的第一衔接子核苷酸序列和结合到第二衔接子分子(2b)的第二衔接子核苷酸序列。
2.在qPCR过程中检测DNA文库中的衔接子二聚体(3)的方法，其中所述DNA文库包含DNA片段(1)和衔接子二聚体(3)，所述DNA片段在两个自由端具有衔接子分子(2a、2b)作为侧翼，所述方法包括以下步骤：
a)将根据权利要求1所述的衔接子二聚体特异性探针(33)添加到包含DNA文库的qPCR混合物中
b)通过由衔接子二聚体特异性探针(33)发出的信号来确定DNA文库中所包含的衔接子二聚体(3)的数量
c)计算DNA文库中DNA片段(1)的实际数量，其中考虑已确定的衔接子二聚体(3)的数量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，向所述qPCR混合物中
在步骤a)中此外添加至少一种用于第一衔接子分子(2a)的衔接子特异性探针(22)，和
在步骤b)中此外通过由衔接子特异性探针(22)发出的信号来确定所包含的第一衔接子分子(2a)的数量，和
在步骤c)中计算DNA文库中DNA片段(1)的实际数量，其中考虑已确定的衔接子二聚体(3)的数量和已确定的第一衔接子分子(2a)的数量。
4.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其特征在于，基于计算DNA文库中DNA片段(1)的实际数量，确定用于随后测序，特别是NGS测序的所用DNA的数量。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，其是已知DNA片段(1)的长度的扩增子测序。
6.盒(100)，特别是微流体盒(100)，其中所述盒(100)被设计成执行根据权利要求2-5中任一项所述的方法。
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