CN116867903A

CN116867903A - 用于改进的细胞转染的方法和系统

Info

Publication number: CN116867903A
Application number: CN202180094273.5A
Authority: CN
Inventors: L·D·德特曼; N·A·詹金斯; D·科巴克; D·K·科利赫; P·B·兰特; S·P·莫泰瓦里安; K·C·奥尔森; J·W·帕夫利切克; A·S·特里特; V·温盖特
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2023-10-10

Abstract

本公开提供了用于用核酸(如质粒DNA)转染宿主细胞的改进的方法和系统，用于大规模有效地产生生物产物(如AAV载体)的目的。

Description

用于改进的细胞转染的方法和系统

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年12月21日提交的美国临时申请号63/199,367和于2021年12月6日提交的美国临时申请号63/264,997的权益，这些临时申请中的每一个的内容在此都通过引用以其整体并入。

技术领域

本公开一般涉及用核酸转染细胞的领域，并且更具体地涉及用于以维持高转染效率的方式制备转染混合体并将其递送到细胞中的改进的方法和系统。

背景技术

生物科技行业中许多产品的生产涉及将遗传材料(如DNA质粒)引入到宿主细胞中，宿主细胞用作活工厂，其代谢和生物合成活动由材料中所包含的遗传信息指导。该信息可以编码具有治疗或工业实用性的蛋白质，其实例包括单克隆抗体、酶、凝血因子和基因疗法载体的蛋白质组分。该信息还可以包括核苷酸序列，其在宿主细胞中不表达为蛋白质，而是被转录或复制并与其他组分组合，其实例是衍生自腺相关病毒(AAV)的经修饰的基因组，当将该基因组与在相同细胞中表达的AAV结构蛋白包装时，可以形成可用于基因疗法的重组AAV载体。

将遗传材料引入到细胞中可以以多种方式实现。例如，遗传材料可以使用病毒载体引入，或物理地引入，如通过基因枪或电穿孔。但最常见的转染方法中的一种使用被称为转染试剂的化合物，其复合并缩合核酸以形成微小的颗粒，该颗粒可以被细胞摄取，并且受到细胞机器的作用以引导复制、转录或蛋白质表达。在这些方法中，通常将转染试剂混合在具有所关注核酸的溶液中，从而形成所谓的转染混合体。

许多不同的化学化合物可以用作转染试剂，其实例包括磷酸钙、人工脂质体和阳离子聚合物，如二乙氨基乙基(DEAE)-葡聚糖和聚乙烯亚胺(PEI)。通常，基于化学的转染试剂富含正电荷，其可以屏蔽带负电荷的DNA或RNA的磷酸盐主链，从而促进复合的转染试剂和核酸的颗粒通过细胞膜进入到细胞中，细胞膜通常具有负电荷。

依据宿主细胞实际摄取、到达宿主细胞核或有能力引导细胞行为的遗传材料的比例，许多变量可以影响转染效率。例如，众所周知，由于磷酸钙方法对转染混合体的pH高度敏感，所以必须仔细地控制变量以优化转染效率，并且因此宿主细胞在转染的核酸中的遗传信息的指导下产生期望的产物。影响不同转染试剂的效率的另一变量是在将转染混合体添加到待转染的细胞中之前孵育转染混合体的时间量。例如，已经报道，延长含有氯化钙或PEI的转染混合体的孵育会降低转染效率，这可能是因为较长的孵育导致复合的转染试剂和核酸的颗粒较大(Jordan,M,et al.,Transfecting mammalian cells:optimization ofcritical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation,Nuc.Acids Res.24(4):596-601(1996)；Sang,Y,et al.,Salt ions and relatedparameters affect PEI–DNA particle size and transfection efficiency inChinese hamster ovary cells,Cytotechnology 67:67-74(2015)。

当在相对小的规模下进行转染时，转染混合体孵育时间和转染效率之间的反比关系不是重要的问题。在制备有限体积的转染混合体之后，在颗粒尺寸增加到显著降低效率的程度之前，可以相对快速地将其添加到细胞中，如通过泵送或倾倒。然而，在工业规模下，可能需要数十至数百升的转染混合体来转染培养中的数百至数千升细胞，随后在制备混合体和以局部浓度不提高到毒性水平的速率将其添加到细胞中之间出现的延迟可能是显著的，同时伴随转染效率的降低。对于一些从本质上来说需要许多复杂的步骤来制造和纯化的产品，如基因疗法载体，整个制造过程开始时的低转染效率将不可避免地降低产率和增加成本，可能使有前景的治疗剂的生产变得不经济。

因此，本领域仍然需要用于在相对短的时间段内制备相对大体积的转染混合体并将其递送到培养中的细胞中以便维持高水平的转染效率的方法和系统。

发明内容

本公开通过提供新颖的方法和系统来解决本领域中的这些和其他问题，该新颖的方法和系统用于在相对短的时间段内制备甚至大体积的转染混合体并将其递送到培养中的细胞中，从而导致高水平的转染效率。这些方法和系统适用于转染生长至高密度的细胞，可以用于在细胞中有效地产生许多不同的生物产物，包括蛋白质以及多组分生物产物，例如基因疗法载体。

本领域技术人员将识别或将能够使用不超过常规实验查明本文描述的发明的具体实施方案的许多等效物。此类等效物旨在被以下枚举的实施方案(E)涵盖。

E1.在第一实施方案中，本公开提供了用核酸瞬时地转染细胞的方法，该方法包含以下步骤：(i)制备包含核酸和转染剂的转染混合体，以及(ii)将该转染混合体添加到培养中的细胞样品中。

E2.根据E1所述的方法，其中在某些实施方案中，制备转染混合体的步骤包含将包含核酸的第一溶液和包含转染剂的第二溶液混合。

E3.根据E1至E2中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，制备转染混合体并将其添加到培养中的细胞中的步骤是不连续进行的，如以单次剂量方式或以多次分段剂量方式。

E4.根据E1至E2中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，制备转染混合体并将其添加到培养中的细胞中的步骤是连续进行的。

E5.根据E1至E4中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，开始制备转染混合体和开始添加转染混合体之间的时间为约、至多或至少30分钟或更短，如29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1分钟，或更短时间，或任何前述具体枚举的值之间的值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

E6.根据E1至E4中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，开始制备转染混合体和开始添加转染混合体之间的时间为约、至少或至多300秒或更短，如约290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、155、150、145、140、135、130、125、120、115、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25或20秒，或更短时间，或任何前述具体枚举的值之间的值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

E7.根据E1至E6中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，添加步骤进行约、至少或至多2小时或更短，如1.5小时、1小时，或约55、50、45、40、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5分钟，或更短时间，或任何前述具体枚举的值之间的值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

E8.根据E1至E2中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，(i)开始制备转染混合体和开始添加转染混合体之间的时间为约、至少或至多300秒或更短，如290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、155、150、145、140、135、130、125、120、115、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、如30、25或20秒，或更短时间，或任何前述具体枚举的值之间的值或包含任何前述具体枚举的值的范围；并且(ii)添加步骤进行约、至少或至多2小时或更短，如1.5小时、1小时，或约55、50、45、40、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5分钟，或更短时间，或任何前述具体枚举的值之间的值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

E9.根据E1至E2中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，(i)开始制备转染混合体和开始添加转染混合体之间的时间为约、至少或至多4分钟、3分钟、120秒、90秒、60秒或30秒，或任何前述具体枚举的值之间的值，或包含任何前述具体枚举的值的范围；并且(ii)添加步骤进行约、至少或至多45、40、35、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5分钟，或任何前述具体枚举的值之间的值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

E10.根据E1至E2中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，(i)开始制备转染混合体和开始添加转染混合体之间的时间为约、至少或至多15至180秒、30至120秒、45至120秒、60至120秒、70至110秒、80至110秒、80至100秒、85至95秒、75至95秒、65至95秒、55至95秒、50至95秒、55至90秒、55至85秒、55至80秒、55至75秒、55至70秒或55至65秒；并且(ii)添加步骤进行约、至少或至多5至60分钟、10至60分钟、15至60分钟、20至60分钟、25至55分钟、25至35分钟、30至50分钟、35至50分钟、35至45分钟、40至50分钟或45至50分钟。

E11.根据E1至E2中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，(i)开始制备转染混合体和开始添加转染混合体之间的时间为约、至少或至多55至95秒；并且(ii)添加步骤进行约、至少或至多30至45分钟。

E12.根据E1至E11中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，转染剂是聚阳离子转染剂。

E13.根据E12所述的方法，其中在某些实施方案中，聚阳离子转染剂是聚亚烷基亚胺，如聚乙烯亚胺。

E14.根据E12所述的方法，其中在某些实施方案中，聚阳离子转染剂是聚乙烯亚胺(PEI)。

E15.根据E14所述的方法，其中在某些实施方案中，PEI是线性的。

E16.根据E14所述的方法，其中在某些实施方案中，PEI是支化的。

E17.根据E14所述的方法，其中在某些实施方案中，PEI是同质的。

E18.根据E14所述的方法，其中在某些实施方案中，PEI是异质的。

E19.根据E14所述的方法，其中在某些实施方案中，PEI是完全或部分水解的、完全或部分脱酰基的、衍生的或缀合的。

E20.根据E14所述的方法，其中在某些实施方案中，PEI是盐酸盐或游离碱。

E21.根据E14至E20中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，PEI的平均分子量(Mn或Mw)为约500道尔顿(D)至1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700或800kD，或任何前述具体枚举的值之间的值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

E22.根据E14至E21中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，PEI的平均分子量(Mn或Mw)为约10至100kD。

E23.根据E14至E22中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，PEI的平均分子量(Mn或Mw)为约40kD。

E24.根据E14至E20中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，PEI的多分散性指数(PDI)为约、至少或至多1、1.05、1.10、1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.65、1.70、1.75、1.80、1.85、1.90、1.95、2.00、2.05、2.10、2.15、2.20、2.25、2.30、2.35、2.40、2.45、2.50、2.55、2.60、2.65、2.70、2.75、2.80、2.85、2.90、2.95、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30，或任何前述具体枚举的值之间的值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

E25.根据E1至E24中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)。

E26.根据E25所述的方法，其中在某些实施方案中，DNA是基本上纯化的质粒DNA(pDNA)。

E27.根据E26所述的方法，其中在某些实施方案中，pDNA在微生物中繁殖，如酵母或细菌。

E28.根据E26至E27中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，pDNA是基本上超螺旋的、带切口环状的或线性的。

E29.根据E26至E28中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，pDNA包含第一类型的质粒。

E30.根据E29所述的方法，其中在某些实施方案中，所述第一类型的质粒的尺寸在从约500个碱基对(bp)至约3个兆碱基对(Mbp)的范围内。

E31.根据E26至E28中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，pDNA包含两种或更多种类型的质粒，其中每种类型的核苷酸序列至少部分是独特的。

E32.根据E26至E28中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，pDNA包含三种类型的质粒，其中每种类型的核苷酸序列至少部分是独特的。

E33.根据E29至E32中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，pDNA的类型中的至少一种包含用于表达转基因的序列。

E34.根据E33所述的方法，其中在某些实施方案中，转基因的序列编码RNA或蛋白质。

E35.根据E33至E34中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，pDNA还包含与转基因可操作地连接的遗传控制区。

E36.根据E35所述的方法，其中在某些实施方案中，遗传控制区包含启动子和任选的增强子。

E37.根据E35至E36中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，遗传控制区在细胞中是组成型活性的，或在外源性环境因子的存在下是可诱导的。

E38.根据E29至E32中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，pDNA的类型中的至少一种包含表达细小病毒复制所需的一种或多种病毒辅助因子的序列。

E39.根据E38所述的方法，其中在某些实施方案中，细小病毒是腺相关病毒(AAV)。

E40.根据E38所述的方法，其中在某些实施方案中，病毒辅助因子是腺病毒或单纯疱疹病毒辅助因子。

E41.根据E29至E32中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，质粒DNA的类型中的至少一种包含细小病毒rep基因。

E42.根据E29至E32中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，质粒DNA的类型中的至少一种包含细小病毒cap基因。

E43.根据E33至E42中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，第一类型的质粒包含转基因序列，并且至少第二类型的质粒包含用于表达病毒辅助因子、rep基因或cap基因的序列。

E44.根据E33至E42中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，第一类型的质粒包含转基因序列和用于表达病毒辅助因子的序列，并且至少第二类型的质粒包含rep基因或cap基因。

E45.根据E33至E42中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，第一类型的质粒包含转基因序列和rep基因，并且至少第二类型的质粒包含用于表达病毒辅助因子或cap基因的序列。

E46.根据E33至E42中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，第一类型的质粒包含转基因序列和cap基因，并且至少第二类型的质粒包含用于表达病毒辅助因子或rep基因的序列。

E47.根据E33至E42中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，第一类型的质粒包含转基因序列，并且第二类型的质粒包含用于表达病毒辅助因子、rep基因和cap基因的序列。

E48.根据E33至E42中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，第一类型的质粒包含与遗传控制区可操作地连接的转基因序列，第二类型的质粒包含细小病毒rep基因和细小病毒cap基因，并且第三类型的质粒包含用于表达病毒辅助因子的序列。

E49.根据E1至E48中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞或昆虫细胞。

E50.根据E49所述的方法，其中在某些实施方案中，哺乳动物细胞是HEK293细胞或其变体，如HEK293E、HEK293F、HEK293H、HEK293T或HEK293FT细胞、A549细胞、BHK细胞、CHO细胞、HeLa细胞或Vero细胞。

E51.根据E49所述的方法，其中在某些实施方案中，昆虫细胞是Sf9细胞或Sf1细胞。

E52.根据E1至E51中任一项所述的方法、其中在某些实施方案中，转染时样品中活细胞(vc)的密度为至少或约10x10⁶vc/mL、15x10⁶vc/mL、20x10⁶vc/mL、25x10⁶vc/mL、30x10⁶vc/mL、40x10⁶vc/mL或50x10⁶vc/mL或更大，或任何前述具体枚举的值之间的值，或包含任何前述具体枚举的值的范围，如约10x10⁶至30x10⁶vc/mL、15x10⁶至25x10⁶vc/mL或16x10⁶至24x10⁶vc/mL。

E53.根据E1至E52中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，细胞样品的体积为至少或约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000或10000升(L)或更大，或任何前述具体枚举的值之间的值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

E54.根据E1至E53中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，待添加到细胞样品中的转染混合体的总体积或质量为至少或约细胞样品的体积或质量的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％或更大，或任何前述具体枚举的值之间的值或包含任何前述具体枚举的值的范围；或者为至少或约10、50、100、150、200、250、300、350、400、500、1000、1500或2000升或千克，或更大，或任何前述具体枚举的值之间的值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

E55.根据E2至E54中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，核酸溶液包含生理相容性流体，如水、细胞生长培养基(与悬浮培养的细胞的培养基相同类型或不同类型)、右旋糖、盐水(如磷酸盐缓冲盐水)或其他流体。

E56.根据E2至E55中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，转染剂溶液包含生理相容性流体，如水、细胞生长培养基(与悬浮培养的细胞的培养基相同类型或不同类型)、右旋糖，或盐水(如磷酸盐缓冲盐水)或其他流体。

E57.根据E55至E56中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，生理相容性流体是相同的。

E58.根据E55至E56中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，生理相容性流体是不同的。

E59.根据E2至E58中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，核酸溶液包含质粒DNA。

E60.根据E1至E59中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，添加到细胞样品中的转染混合体的体积作为该细胞样品和转染混合体的组合体积的分数为至少或约0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45或0.5或更大，或任何前述具体枚举的值之间的分数，或包含任何前述具体枚举的值的分数范围。

E61.根据E55至E58中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，核酸溶液和转染试剂溶液基于体积或质量以从约5:1至约1:5的范围内的比率混合。

E62.根据E61所述的方法，其中在某些实施方案中，核酸溶液和转染试剂溶液基于体积或质量以约1:1的比率混合。

E63.根据E31所述的方法，其中在某些实施方案中，转染混合体中所述第一和至少第二类型的质粒的摩尔比为1:1，偏差不超过±20％。

E64.根据E32所述的方法，其中在某些实施方案中，所述第一、第二和第三类型的质粒的摩尔比为1:1:1，偏差不超过±20％。

E65.根据E31所述的方法，其中在某些实施方案中，转染混合体中所述第一和至少第二类型的质粒的摩尔比不为1:1。

E66.根据E32所述的方法，其中在某些实施方案中，所述第一、第二和第三类型的质粒的摩尔比不为1:1:1。

E67.根据E26至E66中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，转染混合体包含足够的pDNA，使得样品中的每百万个活细胞中细胞转染至少或约0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4或5微克，或更多(μg/1x10⁶ vc)，或任何前述具体枚举的值之间的值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

E68.根据E26至E66中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，转染混合体包含足够的pDNA，使得每毫升细胞样品中细胞转染至少或约1、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5、25、27.5或30微克，或更多，或任何前述具体枚举的值之间的值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

E69.根据E14至E24中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，转染混合体包含足够的PEI，使得样品中的每百万个活细胞中细胞转染为至少或约0.5、1、2.5、5、10或15微克，或更多(μg/1x10⁶ vc)，或任何前述具体枚举的值之间的值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

E70.根据E26至E69中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，转染混合体中PEI的质量与pDNA的质量的比率在从约10:1至约1:10的范围内，例如约9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2.9:1、2.8:1、2.7:1、2.6:1、2.5:1、2.4:1、2.3:1、2.2:1、2.1:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9，或任何前述具体枚举的比率之间的某个其他比率，或包含任何前述具体枚举的比率的范围。

E71.根据E1至E70中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，该方法还包含将转染混合体和细胞样品混合，在某些实施方案中，该混合可以在搅拌罐生物反应器中进行，每体积功率输入为至少或约20、30、40、50、60或70瓦特/立方米(W/m³)，或更大，或任何前述具体枚举的值之间的值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

E72.根据E1至E71中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，该方法还包含将转染的细胞在足以产生由转染的核酸编码的生物产物的条件下孵育一段时间。

E73.根据E1至E71中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，该方法还包含将转染的细胞在足以产生重组AAV载体的条件下孵育一段时间。

E74.根据E72至E73中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，孵育进行至少或约12、24、36、48、56、72、84或96小时或更长，或任何前述具体枚举的值之间的值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

E75.根据E1至E74中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，该方法还包含浓缩转染的细胞并且去除至少一部分培养基。

E76.根据E73至E74中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，该方法进一步包含裂解转染的细胞。

E77.根据E76所述的方法，其中在某些实施方案中，该方法还包含纯化重组AAV载体。

E78.根据E2至E77中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，核酸溶液和转染试剂溶液混合在一起之前储存在单独的容器中。

E79.根据E2至E78中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，将核酸溶液和转染试剂溶液在与储存容器流体连通的开放或封闭室中混合。

E80.根据E79所述的方法，其中在某些实施方案中，混合室与转染培养细胞样品的容器流体连通。

E81.根据E79至E80中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，该方法还包含将核酸溶液和转染试剂溶液从储存容器泵送到混合室中，并且此后泵送到细胞培养容器中。

E82.根据E79至E81中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，核酸溶液和转染试剂溶液的混合是机械地实现的，如通过搅拌、涡旋、振动、搅动或声学混合，或非机械地实现的，如通过扩散或通过流体流动(无论是层流还是湍流)的混合效应。

E83.根据E78至E82中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，核酸溶液和转染试剂溶液的混合在储存容器之间的流体连通的第一部位处开始，在某些实施方案中，存储容器是混合室，该混合室经由至少两个入口连接从每个储存容器单独通向细胞培养容器的流体路径，经由至少一个出口连接通向细胞培养容器的流体路径。

E84.根据E83所述的方法，其中在某些实施方案中，从混合室通向细胞培养容器的流体路径分开，然后在到达所述容器之前重新连接。

E85.根据E83至E84中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，从混合室通向细胞培养容器的流体路径被一个或多个分支分开，该一个或多个分支经由中间流体路径在下游重新连接，以允许不间断的流体流到细胞培养容器。

E86.根据E83至E85中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，从混合室通向细胞培养容器的流体路径被一个或多个分支分开，每个分支都有上游入口和两个或更多个分开的出口，这些出口经由中间流体路径在下游重新连接，以允许不间断的流体流到细胞培养容器。

E87.根据E85至E86中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，分支与中空连接器成一体。

E88.根据E79所述的方法，其中在某些实施方案中，混合室包含与储存容器流体连通的两个入口，以及与细胞培养容器流体连通的一个出口，其中在某些实施方案中，每个入口和出口之间的角度小于、等于或超过90度，而在某些其他实施方案中，每个入口各自和出口之间的角度相同或不同。

E89.根据E83至E87中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，从混合室通向细胞培养容器的流体路径在其总长度的至少一部分上被配置为一个或多个线圈，在某些实施方案中，每个线圈可以是扁平的线圈，其螺旋缠绕，如围绕圆柱体或锥体(以单层或正循环方式)，或环形缠绕。

E90.根据E79至E89中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，储存容器经由多个流体路径与细胞培养容器流体地连通，每个流体路径包含一个混合室。

E91.根据E79至E90中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，混合室包含中空连接器或由其组成。

E92.根据E79至E91中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，流体连通经通过管发生，和/或流体路径包含管或由其组成。

E93.根据E79至E92中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，在进行该方法期间与流体流动相关的雷诺数Re不超过3500或4000的值。

E94.根据E79至E92中任一项所述的方法，其中在某些实施方案中，在进行该方法期间流体流动是非湍流的。

E95.根据E77所述的方法，其中在某些实施方案中，该方法有效产生重组AAV载体，其滴度为至少或约1x10¹⁰、5x10¹⁰、1x10¹¹、5x10¹¹、1x10¹²、5x10¹²或1x10¹³个载体基因组/毫升(vg/mL)转染后的细胞悬浮液，或更多，或任何前述具体枚举的值之间的滴度，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

E96.根据E95所述的方法，其中在某些实施方案中，重组AAV载体滴度通过ITRqPCR测定。

E97.根据E95所述的方法，其中在某些实施方案中，重组AAV载体滴度通过转基因qPCR测定。

E98.根据E77所述的方法，其中在某些实施方案中，该方法有效产生重组AAV载体，其在通过尺寸排阻色谱纯化之后UV260/UV280吸光度比值为至少或约0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8或更大，或任何前述具体枚举的值之间的UV260/UV280吸光度比值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

E99.在另一实施方案中，本公开提供了一种用于用核酸连续转染培养中的细胞样品的系统，该系统包含：(i)用于容纳核酸溶液的装置，(ii)用于容纳转染试剂溶液的装置，(iii)用于容纳培养中的细胞样品的装置，(iv)用于连续混合所述溶液以形成转染混合体的装置，以及(v)用于从各自的溶液容纳装置到混合装置并从该混合装置到细胞样品容纳装置的流体连通的装置。

E100.根据E99所述的系统，其中在某些实施方案中，所述系统还包含用于引起从核酸溶液和转染试剂溶液的溶液容纳装置到混合装置并从该混合装置到细胞样品容纳装置的流体连通的装置。

E101.根据E99至E100中任一项所述的系统，其中该系统包含：(i)用于核酸溶液的容器，(ii)用于转染剂溶液的容器，(iii)与每个所述容器流体连通的混合室，(iv)用于与所述混合室流体连通的细胞样品的容器，以及(v)至少一个泵。

E102.根据E99至E101中任一项所述的系统，其中该系统被配置为在60分钟或更短时间内连续形成至少50L转染混合体并将其递送到至少500L悬浮培养中的细胞中，其中转染混合体通过混合分别包含核酸和转染试剂的溶液形成，并且其中转染混合体一旦形成，就在30分钟或更短时间内将其递送到细胞中。

E103.根据E102中所述的系统，其中该系统被配置为在45分钟或更短时间内连续形成所述至少50L转染混合体并将其递送到悬浮培养中的细胞中，并且其中转染混合体一旦形成，就在15分钟或更短时间内将其递送到细胞中。

E104.根据E102至E103中任一项所述的系统，其中该系统被配置为在30分钟或更短时间内连续形成所述至少50L转染混合体并将其递送到悬浮培养中的细胞中，并且其中转染混合体一旦形成，就在10分钟或更短时间内将其递送到细胞中。

E105.根据E99至E101中任一项所述的系统，其中该系统被配置为在60分钟或更短时间内连续形成至少100L转染混合体并将其递送到至少1000L悬浮培养中的细胞中，其中转染混合体通过混合分别包含核酸和转染试剂的溶液形成，并且其中转染混合体一旦形成，就在30分钟或更短时间内将其递送到细胞中。

E106.根据E105中所述的系统，其中该系统被配置为在45分钟或更短时间内连续形成所述至少100L转染混合体并将其递送到悬浮培养中的细胞中，并且其中转染混合体一旦形成，就在15分钟或更短时间内将其递送到细胞中。

E107.根据E105至E106中任一项所述的系统，其中该系统被配置为在30分钟或更短时间内连续形成所述至少100L转染混合体并将其递送到悬浮培养中的细胞中，并且其中转染混合体一旦形成，就在10分钟或更短时间内将其递送到细胞中。

E108.根据E99至E107中任一项所述的系统，其中该系统被配置成使得与流体流动相关的雷诺数Re不超过3500或4000的值。

E109.在另一实施方案中，本公开提供了一种由根据E1至E98中任何实施方案所述的方法制造的生物产物。

E110.根据E109所述的产物，其中在某些实施方案中，所述产物是蛋白质、核酸、疫苗或其组分、病毒、或重组病毒载体。

E111.根据E110所述的产物，其中在某些实施方案中，该生物产物是选自由以下各项组成的组的蛋白质：抗体、具有免疫球蛋白Fc结构域的蛋白质融合体、凝血因子、酶和酶原。

E112.根据E110所述的产物，其中在某些实施方案中，该生物产物是选自由以下各项组成的组的重组病毒载体：腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体和反转录病毒载体。

附图说明

图1.用于转染的示例性系统，其展示了用于单独容纳(在该实施方案中，50L生物过程容器)转染试剂(在该实施方案中，PEI)和核酸(在该实施方案中，用于产生重组AAV载体的三种DNA质粒)的装置、泵装置(在该实施方案中，蠕动泵)、混合装置(在该实施方案中，用作静态在线混合器的T型连接器)、细胞容纳装置(在该实施方案中，容量250L的一次性使用搅拌罐生物反应器)，以及从溶液容器到T型混合器并从T型混合器到生物反应器的流体连通装置(在该实施方案中，热塑性弹性体管路)。如该实施方案中所展示的，从混合器到生物反应器的管路是盘绕的，用以改进转染混合体的混合。

图2.用于转染的示例性系统，其展示了用于将转染混合体递送到细胞中的两个平行的子组装件的使用。每个子组装件通过管与单独的用于溶液中的转染试剂(在该实施方案中，PEI)和核酸(在该实施方案中，质粒DNA)的容器连接，并且包含将PEI或pDNA溶液从其各自的容器中抽取的蠕动泵、用作PEI和pDNA溶液的静态在线混合器的T型连接器、用于将从T型混合器泵送到生物反应器的转染混合体进一步混合和培养的盘管，以及容纳待转染的细胞的最终生物反应器(在本实施方案中，2000L生物反应器)培养。平行使用两个或更多个此类子组装件允许在相对短的时间段内递送甚至大体积的转染混合体到细胞中。

图3.设计为测试重组AAV载体的滴度的实验的结果图形，该重组AAV载体由使用团注法转染的HEK293细胞产生，该滴度作为转染混合体在被添加到细胞中之前孵育的时间的函数。在这些实验中，测试了介于2和125分钟之间的孵育时间。细胞在15mL规模培养中生长并转染。

图4.设计为测试重组AAV载体的滴度的实验的结果图形，该重组AAV载体由使用团注法转染的HEK293细胞产生，该滴度作为转染混合体在被添加到细胞中之前孵育的时间的函数。在这些实验中，测试了介于1.5和20分钟之间的孵育时间。细胞在15mL规模培养中生长并转染。

图5.设计为测试重组AAV载体的滴度的实验的结果图形，该重组AAV载体由使用静态在线混合器连续转染的HEK293细胞产生，该滴度作为转染混合体在被添加到细胞中之前孵育的时间的函数。在这些实验中，测试了介于0.75和5分钟之间的孵育时间。细胞在1L规模培养中生长并转染。

图6.设计为测试重组AAV载体的比例的实验的结果图形，该重组AAV载体由连续转染的含有完整衣壳的HEK293细胞产生(依照SEC A260/A280 UV吸光度比所体现的)，该比例作为转染时活细胞密度(VCD)的函数。将孵育时间(90秒)和添加时间(30分钟)保持恒定。细胞在1L规模培养中生长并转染。

图7.设计为测试重组AAV载体的滴度的实验的结果图形，该重组AAV载体由连续转染的HEK293细胞产生，该滴度作为转染时活细胞密度(VCD)的函数。将孵育时间(90秒)和添加时间(30分钟)保持恒定。细胞在1L规模培养中生长并转染。

图8.设计为测试重组AAV载体的比例的实验的结果图形，该重组AAV载体由连续转染的含有完整衣壳的HEK293细胞产生(依照SEC A260/A280 UV吸光度比所体现的)，该比例作为用于转染的质粒DNA的量(表示为μg/百万个细胞)的函数。将孵育时间(90秒)和添加时间(30分钟)保持恒定。细胞在1L规模培养中生长并转染。

图9.在不同规模和不同流动条件下使用连续流动转染系统产生的AAV载体的相对效力与每个实验计算的雷诺数(Re)进行比较的实验的结果图形。高于约3500的Re值与较低的相对载体效力和较低的完整衣壳百分比相关。在图中，圆圈是指来自在10L规模下产生的载体的数据，正方形是指来自在250L规模下产生的载体的数据，以及三角形是指来自在2000L规模下产生的载体的数据。

具体实施方式

用于转染宿主细胞的方法

如本文所用，转染(transfection)(以及类似转染(transfect)的相关术语)是指通过非病毒方法将核酸引入到真核细胞中的过程，包括化学方法或物理方法。因此，转染细胞是已通过转染过程将外源性核酸引入到其中的细胞。如本领域已知的，转染可以是瞬时的或稳定的。在瞬时转染的情况下，转染的DNA或RNA在细胞或其子代中存在有限的时间段，在DNA的情况下，不整合到基因组中。在稳定转染的情况下，引入到细胞中的DNA可以作为附加体质粒或整合到染色体中长时间存在。通常，为了产生稳定转染的细胞，将含有选择标记物以及用于表达期望的生物产物的一个或多个基因的质粒转染到细胞中，然后将细胞在选择性压力(即，杀死未转染的细胞或外源性DNA(包括其选择标记物)由于某种原因丢失的转染的细胞的条件)下生长和维持。例如，质粒可以含有抗生素抗性基因，并且可以通过将抗生素添加到生长细胞的培养基中来选择转染细胞。在某些实施方案中，引入到稳定转染的宿主细胞中的用于产生生物产物的基因受诱导型启动子控制，并且除非在细胞生长时引入诱导启动子的环境因素，如药物、金属离子或温度上升，否则不表达或仅以低水平表达。本公开的方法和系统可以用于制备稳定和瞬时转染的细胞二者。

在某些实施方案中，转染是化学介导的，其中转染试剂与核酸形成复合物，该复合物比未复合的核酸更容易被受者宿主细胞摄取。因此，转染试剂是指化学化合物或包含添加到核酸中以增强摄取核酸进入宿主细胞的化学化合物的组合物。转染试剂和核酸的混合物或组合被称为转染混合体。

如在实例中进一步描述的，本发明人观察到转染混合体孵育的时间(即，在将转染试剂和核酸混合在一起之后)和转染效率之间的依赖性。更具体地，在制备转染混合体之后直到将混合体添加到细胞中以转染它们的时段越长，表观转染效率就越低。虽然不希望受任何特定的操作理论束缚，但这种效应可能是由于溶液中的转染试剂和核酸之间形成的颗粒复合物的尺寸随时间而增加所导致的，使得存在某种最佳尺寸(这可能不是精确已知的)，超过该尺寸转染效率开始下降。尽管在PEI作为转染试剂、质粒DNA作为核酸且转染细胞产生的腺相关病毒(AAV)载体的产量的特定情况下观察到这种效应，但孵育时间和转染效率之间的反比关系并不被认为是这种变量组合所独有的，而是许多基于化学的转染系统、核酸类型和由转染的细胞产生的产物的特征。

如上文所指出，当体积较小(例如几升左右，适合于实验室使用)时，转染混合体递送到细胞中可以相对快速地完成，使得制备转染混合体(通过将所有需要的成分混合在一起来制备)和将其递送到细胞中之间的延迟较短(数分钟至数十分钟)，并且因此不会显著地影响转染效率。然而，如将理解的，随着在培养中生长的细胞的体积的增加，制备相应大体积的转染混合体，然后在不发生降低转染效率的延迟的情况下将其递送到细胞中，在技术上变得越来越具有挑战性。这可能是由于多种原因而导致的，但特别相关的是将混合体充分混合的时间和将混合体递送到细胞中的时间，以便确保在整个细胞培养中充分分布，同时维持充足的细胞活力。

至于混合，将较大体积的转染试剂和核酸组合并充分混合需要较长的时间，这是确保尽可能多的核酸被复合所需的。并且，这种延迟不一定能通过更快的混合来大大地减少，因为在产生可能干扰复合物形成或损伤核酸的剪切力之前，混合速率不能提高得太高。在实现充分混合之前，含有转染试剂和核酸的溶液之间的粘度差异可能还需要更多的时间。随着混合的进行，与混合过程相关的延迟也可能导致颗粒在不同的时间形成。当较小的颗粒刚刚开始形成时，早些时候形成的颗粒的尺寸可能会增加到超过最佳值。因此，转染混合体可能含有一系列的颗粒尺寸，但仅少数颗粒尺寸可能对转染是最佳的。可能导致过长的孵育时间的延迟的第二原因与将混合体递送到细胞中所需的时间相关。存在至少两个问题。众所周知，某些转染试剂(如PEI)可能对细胞有毒，并且应该足够缓慢地将其添加到细胞培养中，甚至在混合的情况下也应如此，以避免局部浓度过高的区域，从而维持足够的细胞活力。另一因素是，应该足够缓慢地添加混合物，使其在整个细胞培养中充分分布并混合，以便实现大多数细胞的转染。两个因素都需要在将整个体积的转染混合体最终递送到细胞中之前延迟一段时段；不能一次添加所有的混合体。

通常，将包含转染试剂(或包含组合时产生转染试剂的组分)和单独的核酸的溶液在大口烧杯、混合罐或某个其他合适的容器中组合，然后混合在一起，如用搅拌棒混合，或在具有搅拌桨、桨状物等的较大器皿中混合。然后，一旦将混合体充分混合，就可以将其孵育一段足以允许复合的转染试剂和核酸的颗粒形成的时间，在此之后将混合体添加到烧瓶或生物反应器中的培养中的细胞中。添加步骤可以以本领域已知的多种方式进行，例如，将混合体通过泵送到细胞培养中，将容纳混合体的容器悬浮在细胞培养器皿上方并允许重力将混合体通过管进料到培养基中，或通过对容纳混合体的封闭容器加压，以便迫使混合体穿过与培养器皿连接的管或管道并进入到培养基中。然而，由于上文概述的原因，当混合体体积较大时，这些方案不太合适。将数十至数百升的混合物充分混合并转运到细胞培养罐中所需的延迟随体积而增加，最终将转染效率和/或由转染的细胞合成的期望的生物产物的生产率降低至不可接受的程度。

寻求在与工业规模生物过程相关的转染混合体和培养细胞的大体积下维持高水平的转染效率，本发明人开发了用于制备转染混合体并将其递送到细胞中的改进方法和相关系统。具体地，尽管是非限制性实施方案，但这些方法包括连续地(并且在某些实施方案中同时地)制备和递送大体积的转染混合体，从而确保转染试剂和核酸的充分混合以及此后递送到细胞中，以便实现转染而不会出现常规方法的过度延迟特征。以这种方式，甚至出于在工业规模下制造复杂的多组分生物产物(如基因疗法载体)的目的，也可以实现高水平的转染效率。

根据某些实施方案，转染宿主细胞的方法包含制备转染混合体并将宿主细胞样品与转染混合体接触的步骤，如通过将转染混合体添加或递送到此类样品中。此类方法可以使用如本文所描述的用于转染的系统来进行。如本文所用，“转染混合体”是转染试剂和核酸在液体悬浮液或溶液中的混合物，其类型、量和比例适用于转染宿主细胞。在某些实施方案中，可以首先分别制备包含转染试剂和核酸的溶液，随后将其混合在一起以制备或形成转染混合体。以这种方式，鉴于孵育时间对转染效率的潜在影响，可以仔细地控制转染混合体的孵育时间，如在实例中进一步探索的。本公开的方法和系统可以用于使用不同的转染试剂和核酸类型来转染多种细胞类型，以有效地产生不同的生物产物。

在分别制备包含用于转染的转染试剂和核酸的溶液之后，将溶液混合在一起以制备或形成待递送到用于转染的细胞样品中的转染混合体。在某些实施方案中，混合使用本文描述的用于转染的系统的混合装置来实现。在某些实施方案中，制备转染混合体的步骤在与将细胞与转染混合体接触的步骤暂时地分离的离散步骤中进行。在一个离散步骤中制备所有转染混合体随后接触细胞被称为单剂量转染，而在多个离散步骤(每个步骤随后接触细胞)中制备所有转染混合体被称为分段剂量转染。在该方法的其他实施方案中，该过程是连续进行的，这意指制备或形成转染混合体与将细胞与转染混合体接触同时(至少某一时段内)发生。在连续过程的某些实施方案中，在转染混合体的一部分刚刚开始制备或形成的同时，早些时候形成的另一部分正与用于转染的细胞接触，如通过将该部分添加或递送到细胞样品中。然而，在某些实施方案中，连续过程可以被中断，使得转染混合体的总体积被不连续地添加到细胞样品中。参考本公开的系统，此种中断可以如下进行：使泵装置停止工作一个或多个时段，然后任选地重新启动此种泵装置，直到形成总体积的转染混合体并将其递送到细胞样品中。

本公开的转染方法可以使用两个时间因素来描述。第一个时间因素是孵育时间，其是转染混合体或其部分在被添加到用于转染的细胞样品中之前孵育的总时间。当转染试剂溶液和核酸溶液首次接触并开始混合在一起以形成转染混合体时，孵育时间开始，并且当将如此形成的转染混合体添加或递送到细胞样品中时，孵育时间结束。参考本公开的系统，当转染试剂溶液和核酸溶液在混合装置中或在混合装置处首次彼此接触时，孵育时间开始，并且当如此形成的转染混合体离开流体连通装置进入到细胞容纳装置中时，孵育时间结束。第二个时间因数是添加时间，其是将预定体积(如总体积)的转染混合体添加或递送(包括在连续过程中)到用于转染的细胞样品中所需的时间。参考本公开的系统，当使转染试剂溶液和核酸溶液开始流动到混合装置时，添加时间开始，并且当已经将待添加或递送的转染混合体的最后一部分添加或递送到细胞容纳装置中的细胞样品中时，添加时间结束。本公开的系统可以被配置为控制孵育时间，以确保持续时间足够短且转染效率高，以及控制总添加时间。

转染试剂

本公开的方法可以与任何合适的基于化学的转染试剂一起使用。在某些实施方案中，通过将呈粉末或其他固体形式的转染试剂溶解在合适的溶剂中，或用合适的稀释剂将转染试剂的浓缩储备溶液稀释来制备转染试剂溶液。可以使用本领域已知的支持所选转染试剂和核酸的复合的任何生物相容性溶剂或稀释剂，其非限制性实例包括盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖溶液、Ringer乳酸盐溶液、细胞生长培养基或水。此类溶剂和稀释剂可以补充本领域已知的其他成分，如盐、缓冲液或洗涤剂。在其他实施方案中，转染试剂需要两种或更多种化学组分的组合，这些化学组分中的任何一种都可以呈固体或液体形式。转染试剂溶液可以是同质的，含有一种类型的转染试剂，或可以是异质的，含有不同类型的转染试剂，或含有一种主要类型的转染试剂，其本身通过提供一系列分子量来提供而异质，如具有不同的立体化学形式或某个其他类型的异质性。转染试剂溶液一旦制备好，就可以将其暂时储存在合适的系统容纳装置中，如本文所描述的。

在某些实施方案中，转染试剂可以是具有使核酸(例如，DNA)缩合的能力的阳离子化合物，包括但不限于阳离子单体和聚合物，并且可以包括阳离子多糖、多肽、其他聚合物和脂质，包括阳离子脂质体和脂质纳米颗粒。用于本公开的方法和系统的阳离子化合物可以是线性的、支化的或其他配置的，并且可以进行衍生化以以期望的方式修饰其属性。用作转染试剂的阳离子化合物可以以任何合适的分子量来提供，在非限制性实施方案中，该分子量可以在从约50至约1,250,000道尔顿(Da)的范围内，也可以是其他分子量和范围。

阳离子化合物可以包括但不限于壳聚糖；鱼精蛋白；聚-L-赖氨酸(PLL)；聚胺(PA)；聚亚烷基亚胺(PAI)；聚乙烯亚胺(PEI)或其衍生物；聚[a-(-氨基丁基)-L-乙醇酸]；聚酰胺胺；聚(2-二甲基氨基)甲基丙烯酸乙酯(PDMAEMA)；多组氨酸；组蛋白；聚精氨酸；聚(4-乙烯基吡啶)；聚(乙烯胺)；聚(4-乙烯基-N-烷基吡啶鎓卤化物)；N4′-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-氯化三甲基铵(DOTMA)；N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-甲基硫酸三甲基铵(DOTAP)；1,2-二油烯基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DODMA)；N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基甲酰胺基)乙基]-3,4-二[油烯基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)；O-烷基磷脂酰胆碱；二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)；3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-Cholesterol·HCl)；N-(4-苄氧羰基)-N,N-二甲基l-2,3-双(油酰基氧基)丙烷-1-铵(DOBAQ)；1,2-二肉豆蔻酰基-3-二甲基铵-丙烷(DAP)；N⁴-胆甾醇基-精胺盐酸盐(GL67)。

示例性的市售转染试剂包括但不限于PEI MAX(Polysciences)、MAXGENE(Polysciences)、FUGENE(Roche)、TRANSFECTIN(Bio-Rad)、CLONFECTIN(Clontech)、DREAMFECT(OZ Biosciences)、TRANSFAST(Promega)、ESCORT(Sigma-Aldrich)、LIPOGEN(InvivoGen)、TRANSIT-EXPRESS(Mirus)、GENEJUICE(Novagen)、SUPERFECT(Qiagen)、GENEJAMMER(Stratagene)、LIPOFECTAMINE2000(Invitrogen)、X-TREMEGENE(Roche)、SIIMPORTER(Upstate)、BLOCK-IT(Invitrogen)、RNAIFECT(Qiagen)、GENEERASER(Stratagene)、RIBOJUICE(Novagen)、HIPERFECT^TM(Qiagen)、GENESILENCER(Genlantis)、SIPORT(Ambion)、SILENTFEC(Bio-Rad)、SIFECTOR(B-Bridge)、TRANSIT-SIQUEST(Mirus)、TRANSIT-TKO(Mirus)、JETSI(Polyplus)、PEI-PRO(Polyplus)、FECTOVIR(Polyplus)和CODEBREAKER(Promega)。

PEI

在某些实施方案中，聚阳离子转染试剂是聚乙烯亚胺(PEI)。PEI可以多种形式和分子量获得，并且本领域已知的能有效地转染宿主细胞的任何形式或分子量的PEI都可以用于本公开的方法和系统中。在某些实施方案中，PEI可以是线性的、支化的，或呈梳形、网状或树枝状大分子的形式，或呈某个其他形式。在某些实施方案中，PEI可以呈盐形式(例如，盐酸盐)或如游离碱的非离子化形式。PEI的制备剂可以是同质的，这意指它们含有单一形式和/或尺寸的PEI，或可以是异质的，这意指它们含有多种形式和/或者尺寸的PEI。在某些实施方案中，PEI可以通过将各种其他聚合物、配体、取代基或部分与PEI中的一个或多个原子附接来进行官能化、衍生化或修饰，该各种其他聚合物、配体、取代基或部分的非限制性实例包括碳水化合物、脂质、多肽、壳聚糖、甘露糖基化壳聚糖、半乳糖基化壳聚糖、葡聚糖、普鲁兰多糖(pullulan)、聚乙二醇、烷基链、胆固醇、聚(环氧乙烷)-b-聚(环氧丙烷)-b-(环氧乙烷)嵌段共聚物、叶酸、转铁蛋白、氨基酸、肽或赖氨酸-组氨酸肽，许多其他物质也是可能的。在某些实施方案中，化学取代发生在PEI聚合物链中的一个或多个伯胺、仲胺或叔胺处。PEI的组合物或制备剂可以包含一种或多种类型的官能化、衍生化或经修饰形式的PEI的混合物和组合。

为了在本公开的方法和系统中使用，可以将固体PEI或PEI的浓缩溶液溶解或稀释在合适的溶剂或稀释剂中以制备PEI的储备溶液。可以用于溶解或稀释PEI的示例性非限制性溶剂包括极性溶剂，如水、乙醇或丙酮，或这些溶剂的混合物，或本领域已知的其他极性溶剂，以及任选地添加的其他成分，例如盐(例如，NaCl)或缓冲液。可以将PEI的储备溶液的pH调节至任何期望的pH或pH范围，如约pH 4至9、pH 5至8、pH 7至8或某个其他pH范围。

在某些实施方案中，PEI的制备剂通过包含具有不同数量的亚单位的PEI分子而是异质的。如本领域已知的，此类制备剂中PEI(如线性或支化的PEI)的分子量(MW)可以以不同的方式表示。例如，在某些实施方案中，MW可以是数均MW，其可以缩写为Mn。因此，在某些实施方案中，用于本公开的方法和系统的PEI的数均MW(Mn)可以为至少或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、450、500、550、600、650、700、750、800kDa或更大，或任何前述值之间的Mn，或包含任何前述值的范围。在其他实施方案中，PEI的异质制备剂中PEI的MW可以表示为重均MW，其可以缩写为MW。因此，在某些实施方案中，用于本公开的方法和系统的PEI(如线性或支化的PEI)的重均MW(Mw)可以为至少或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、450、500、550、600、650、700、750、800kDa或更大，或任何前述值之间的Mw，或包含任何前述值的范围。PEI的制备剂中PEI的分子量可以使用本领域已知的不同分析方法来测定，如凝胶渗透色谱、尺寸排阻色谱、激光散射、基质辅助激光解吸/离子化质谱法或其他方法。

如果PEI制备剂的数均分子量和重均分子量是已知的，则制备剂的多分散性指数(PDI)可以计算为比率Mw/Mn，其对制备剂中PEI的异质性进行定量。如果PDI的值恰好为1，则PEI是单分散的或同质的，这意指制备剂中的PEI聚合物含有相同数量的亚单位。然而，PDI值大于1表明异质性增加，如聚合物的摩尔质量分布的宽度中所体现的。在某些实施方案中，用于本公开的方法和系统的PEI的制备剂的PDI可以恰好为1或超过1，如至少或约1.05、1.10、1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.65、1.70、1.75、1.80、1.85、1.90、1.95、2.00、2.05、2.10、2.15、2.20、2.25、2.30、2.35、2.40、2.45、2.50、2.55、2.60、2.65、2.70、2.75、2.80、2.85、2.90、2.95、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或更高，或任何前述值之间的PDI值，或包含任何前述值的PDI范围。

如本领域已知的，线性PEI的化学合成可能导致N-丙酰基基团的不完全去除，其程度可以通过NMR光谱分析来估计。此外，此类N-丙酰基基团的不完全去除减少PEI聚合物链中可质子化氮的数量，这可能降低PEI出于转染的目的可以与DNA或其他核酸缩合的效力。如果需要，则可以将PEI未完全脱酰基的PEI制备剂水解，如通过用HCl处理PEI，以去除所有或基本上所有的剩余N-丙酰基基团。与仅部分水解的PEI相比，此种完全水解的PEI作为转染试剂可能更有效。然而，即使部分水解的PEI作为转染试剂仍然可能有效。因此，在某些实施方案中，用于本公开的方法和系统的PEI可以是至少或约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％不含N-丙酰基基团(即，去丙酰化)，如通过NMR光谱分析所确定的，或任何前述百分比之间的百分比，或包含任何前述百分比的范围。

如本领域已知的，线性PEI分子在聚合物链的每一端处都含有伯胺基团，并且沿着聚合物主链含有仲胺基团，而支化PEI分子额外地在出现分支点的地方具有叔胺基团。线性PEI中伯胺基团的平均数量与仲胺基团的平均数量的比率，以及支化PEI中伯胺基团的平均数量与仲胺基团的平均数量与叔胺基团的平均数量的比率可以根据此类分子的长度和/或复杂性而变化，并且用于本公开的方法和系统中的PEI可以具有任何合适的伯胺基团与仲胺基团的比率，或伯胺基团与仲胺基团与叔胺基团的比率。因此，例如，在某些非限制性实施方案中，支化PEI可以具有比率为大约1:2:1的伯胺基团、仲胺基团和叔胺基团，或具有某个其他比率的伯胺基团、仲胺基团和叔胺基团。

市售PEI制备剂的实例包括但不限于G20、/>FG、/>G35、P和/>1595(全部来自BASF)；/>SP-003、/>SP-006、/>SP-012、/>SP-018、/>SP-200、/>SP-1000和/>SP-1050(全部来自Nippon Shokubai)；以及TRANSPORTER/>PEI25k^TMPEI/>和/>(全部来自Polysciences)。关于PEI及其用途的额外信息可以见于例如Thomas,M,et al.,Fulldeacylation of polyethylenimine dramatically boostsits gene deliveryefficiency and specificity to mouse lung,PNAS 102(16):5679-84(2005)；Pandey,APand Sawant,KK,Polyethylenimine:A versatile,multifunctional non-viral vectorfor nucleic acid delivery,Mat.Sci.Eng.C,68:904-18(2016)；Godbey,WT,et al.,Sizematters:Molecular weight affectsthe efficiency of poly(ethylenimine)as a genedelivery vehicle,J.Biomed.Mats.Res.45(3):268-75(1999)；Boussif,O,et al.,Aversatile vectorfor gene and oligonucleotide transfer into cells in cultureand in vivo:Polyethylenimine,PNAS 92:7297-301(1995)；Virgen-Ortiz,JJ,et al.,Polyethylenimine:a very useful ionic polymer in the design ofimmobilizedenzyme biocatalysts,J.Mater.Chem.B 5:7461-90(2017)；Park,IH andChoi,E-J,Characterization of branched polyethylenimine by laser lightscatteringand viscometry,Polymer 37(2):313-9(1996)；Kircheis,R,et al.,Designandgene delivery activity of modified polyethylenimines,Adv.DrugDeliv.Rev.53:341-58(2001)；Wong,SY and Putnam,D,The stochastic effectofpolydispersity on polymeric DNA delivery vectors,J.Appl.Polym.Sci.135:45965(2018)；Baker,A,et al.,Polyethylenimine(PEI)is a simple,inexpensiveandeffective reagent for condensing and linking plasmid DNA to adenovirusforgene delivery,Gene Ther.4:773-82(1997)；von Harpe,A,et al.,Characterizationof commercially available and synthesized polyethyleniminesfor gene delivery,J.Control.Rel.69:309-22(2000)；Ulasov,AV,et al.,Properties of PEI-basedPolyplex Nanoparticles That Correlate With TheirTransfection Efficacy,Mol.Ther.19(1):103-12(2011)；Hou,S,et al.,Formation and structure of PEI/DNAcomplexes:quantitative analysis,SoftMatt.7:6967-72(2011)。

核酸

本公开的方法和系统可以与期望转染宿主细胞的任何合适的核酸一起使用。在某些实施方案中，溶液中的核酸通过将呈固体形式的核酸(例如，作为冷冻干燥物)溶解在合适的溶剂中，或将浓缩的核酸储备溶液稀释在合适的稀释剂中来制备。如果需要，则可以在使用之前将核酸储备溶液冷冻储存，以增强其稳定性。可以使用本领域已知的支持所选转染试剂和核酸的复合的任何生物相容性溶剂或稀释剂，其非限制性实例包括盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖溶液、林格氏乳酸盐溶液、细胞生长培养基或水。此类溶剂和稀释剂可以补充本领域已知的其他成分，如缓冲液、盐或洗涤剂。用于制备用于转染的核酸溶液的溶剂或稀释剂可以与用于制备转染试剂溶液的溶剂和稀释剂相同或不同。核酸溶液一旦制备好，就可以将其暂时储存在合适的系统容纳装置中，如本文所描述的。

本文使用的术语“核酸”是指所有形式的核酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，包括寡核苷酸和多核苷酸。DNA可以包括但不限于单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、三链DNA、基因组DNA、互补DNA(cDNA)、反义DNA、质粒DNA、其他附加体形式的DNA、染色体(包括例如细菌和酵母人工染色体)、噬菌体DNA(如λ噬菌体)、粘粒DNA或杆粒DNA。RNA可以包括但不限于单链RNA、双链RNA、信使RNA(mRNA)或前mRNA(即，未剪接的信息)、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、短发夹RNA、微小RNA(miRNA)、反义RNA、小或短干扰RNA(siRNA)。核酸(无论是DNA还是RNA)包括天然存在的、合成的和有意修饰或改变的序列(例如，变体核酸)。核酸可以具有任何核碱基序列，在许多实施方案中该核碱基是发现于RNA和DNA二者中的腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)，以及DNA的胸腺嘧啶(T)和RNA的尿嘧啶(U)，但在其他实施方案中，核酸可以包括不太常见的碱基，如核苷肌苷(I)(或脱氧肌苷)中的次黄嘌呤。用于本公开的方法和系统的核酸还可以包括并入核苷酸的核酸，该核苷酸包含旨在改变核酸的结构和/或功能的变体或经修饰的碱基、核苷糖或磷酸基团，以及经化学地或酶促地修饰或衍生化以实现相似目标的核酸。在某些实施方案中，用于本公开的方法和系统的核酸可以与蛋白质复合以形成核糖核蛋白(RNP)复合物，其可以被转染。

在某些实施方案中，核酸所包含的核碱基序列编码一种或多种多肽，或编码一个或多个功能性RNA分子，而在其他实施方案中，核酸可以包含具有固有的催化活性的核苷酸序列(例如，核酶)，或可以将其并入到超分子结构中，如病毒或衍生自病毒如腺病毒、腺相关病毒(AAV)或慢病毒的重组载体。

在某些实施方案中，用于本公开的方法和系统的核酸是质粒DNA(缩写为pDNA)。通常，质粒是发现于细菌中的环状双链染色体外DNA元件，其独立于细菌染色体而复制，并且携带负责各种非必需细菌属性的基因，如赋予抗生素抗性的酶(例如，amp或kan基因)。如众所周知的，可以使用基因工程技术以不同方式对质粒进行修饰，包括通过添加新基因和其他遗传信息进行修饰。可以将此类重组质粒在细菌中复制至高拷贝数，纯化，然后用于转染真核宿主细胞，其中质粒中所包含的遗传信息可以指导生物产物的生物合成。质粒可以具有不同的构象，包括超螺旋、松弛环状、带切口开放环状或线性构象，其他构象也是可能的。用于本公开的方法和系统的核酸(包括质粒)可以是任何合适的尺寸，例如，约500个碱基对至300万个碱基对或某个其他尺寸，并且可以使用本领域普通技术人员熟悉的任何技术来制备。例如，可以在转化的细菌中大量生长质粒，在此之后可以使用本领域已知的不同技术来分离和纯化质粒。

根据某些实施方案，用于本公开的方法和系统的质粒可以被修饰以包括能够指导在细胞中产生期望的生物产物的任何基因(转基因或感兴趣的基因)，例如但不限于多肽。此类基因可以来自任何物种，包括但不限于动物物种(包括但不限于哺乳动物物种，例如但不限于人)、植物物种、真菌物种或细菌物种。如本领域已知的，可以将其他遗传调控序列包括在质粒中，以指导宿主细胞的转录、翻译和翻译后机制，从而有效地产生期望的生物产物。例如，在某些非限制性实施方案中，除基因之外，质粒还可以被工程化以包括启动子以引导基因的转录起始，以及任选的增强子以提高转录速率。启动子和/或增强子可以是组成型的或组织特异性的，使得它们仅在某些细胞类型中具有活性或更具有活性，或响应于外源性信号(如某些药物、重金属、热休克等)而可诱导。在其他实施方案中，可以包括转录终止子(如聚腺苷酸化信号序列)以表明宿主细胞停止从质粒中的基因转录。在其他实施方案中，可以包括非编码外显子或内含子(其可以或可以不中断编码序列)，其在一些情况下已被证明可以稳定转录物或允许选择性剪接。在某些实施方案中，基因可以提供有包括Kozak共有序列的起始密码子，以增强起始密码子处的翻译起始。然而，在其他实施方案中，基因可以提供有非共有起始密码子，其允许通过在基因的其他地方使用替代起始密码子来翻译多个基因产物。在某些实施方案中，基因可以提供有一个或多个终止密码子。在某些实施方案中，基因序列是天然存在的，但在其他实施方案中，可以对基因序列进行密码子优化，以匹配细胞来源的物种中优选的密码子频率，例如人密码子优化的。可以以本领域已知的具有功能性的任何顺序布置遗传调控序列。例如，增强子可以定位在基因的5’，但也可以定位在基因的3’，并且在一些情况下仍然发挥增强转录的作用。

用于本公开的方法和系统的质粒可以源于细菌的任何种类或菌株，并且可以是足以包含根据需要发挥作用所需的所有遗传信息的任何尺寸，该遗传信息包括但不限于复制起始点、选择标记物(如抗生素抗性基因)、多克隆位点、感兴趣的基因，以及引导转录和/或翻译的遗传控制区。用于转染的核酸可以包含单一类型的质粒或多种独立类型的质粒(例如，2、3、4种或更多种)，这些质粒在尺寸上可以相似或不同，并且每种质粒相对于转染混合物中的其他类型的质粒含有一些独特的遗传信息。如果使用多于一种类型的质粒来转染宿主细胞，则每种类型的质粒可以以相等的摩尔浓度或不同的化学计量存在于核酸中。

在某些实施方案中，核酸(包括但不限于质粒DNA、杆粒DNA或其他类型的DNA或核酸)包含产生重组病毒载体所需的基因和/或其他遗传信息，该重组病毒载体的非限制性实例包括腺病毒(AdV)载体、腺相关病毒(AAV)载体、反转录病毒载体(如衍生自鼠白血病病毒(MuLV)的γ反转录病毒载体)或慢病毒载体(LV)(如衍生自人免疫缺陷病毒HIV-1和HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒或山羊关节炎脑炎病毒的慢病毒载体)。如本领域已知的，可以通过将编码病毒辅助因子(如来自腺病毒(AdV)或疱疹病毒(HSV)的病毒辅助因子)、AAV Rep蛋白、AAV衣壳蛋白的基因以及包含AAV顺式元件和转基因的载体基因组引入到宿主细胞中(如通过转染)来在宿主细胞中制造重组AAV载体，该载体基因组被设计为包装到AAV衣壳中。相似地，可以通过将编码LV辅助因子(如gal、pol和rev)、异源病毒包膜糖蛋白(如VSV-g)的基因以及含有转基因和用于包装到载体中的LV顺式元件的转移载体(如SIN转移载体)引入到宿主细胞中(如通过转染)来在宿主细胞中制造LV载体。慢病毒载体产生还描述在Merten,O-W,et al.,Production of lentiviralvectors,Mol Ther Methods Clin Dev 3:16017,doi:10.1038/mtm.2016.17(2016)中。

在某些实施方案中，可以将在宿主细胞中产生期望的生物产物(包括但不限于重组病毒载体)所需的基因包含在1、2、3、4种或更多种类型的用于转染的质粒中。例如，如本领域已知的，重组AAV载体通常使用所谓的三重转染技术来产生，其中将所有病毒(例如，AdV或HSV)辅助因子的基因包含在第一质粒中，将AAV rep和AAV cap基因一起包含在第二质粒中，并且将载体基因组包含在第三质粒中。然而，这种布置不是必需的，并且可以将必要的基因和其他序列包含在两个甚至仅一个质粒上。例如，可以将所有辅助因子以及rep和cap基因包含在一个质粒中，并且载体基因组由第二质粒包含，或可以将所有这些基因和序列包含在仅一个质粒中。通常，实际考虑指导选择，因为非常大的质粒可能更难大量产生和/或可能对剪切力更敏感。在某些实施方案中，用于重组AAV载体产生的质粒还可以包括：复制起始点和抗生素抗性基因，其用于促进细菌在抗生素选择(例如，通过将氨苄青霉素(ampicillin)、卡那霉素(kanamycin)或本领域已知的其他抗生素添加到细菌培养基中来选择)下生长；真核遗传控制区，如用于转录转染的细胞中的基因的启动子和任选的一种或多种增强子；转录终止信号序列(如聚腺苷酸化信号序列)；以及潜在的促进宿主细胞中有效载体产生的其他遗传序列。在某些实施方案中，重组AAV或LV(或其他病毒衍生的)载体产生所需的一种或多种基因可以由宿主细胞自身产生，并且在此类实施方案中，不必在质粒中提供该基因。例如，可以用表达辅助因子、Rep、衣壳蛋白的基因或LV载体产生所需的基因中的一些来稳定地转染宿主细胞，以创建所谓的产生者或包装细胞系。可替代地，宿主细胞的基因组可以被修饰以组成型地或在诱导型调控元件的控制下表达此类基因。

在某些实施方案中，含有AAV载体基因组的质粒可以包括：作为基因组的一部分的两个AAV反向末端重复序列(ITR)，其定位在基因组序列的每一端处；在遗传调控元件的控制下的治疗性转基因，如驱动转导的目标细胞中的转录的启动子和任选的增强子；以及转录终止信号序列。AAV载体基因组可以任选地包括其他序列，如内含子、填充序列(其可以独自地通过确保总体的基因组尺寸接近衣壳的包装容量来发挥作用)、促进产生所谓的自互补载体(scAAV)的经修饰的ITR，以及本领域已知的其他序列。

宿主细胞

本公开的方法和系统可以用于转染任何合适的宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞包括本领域已知的可转染的并能够从由于转染而引入到细胞中的遗传信息产生生物产物的任何真核细胞。宿主细胞可以是来自不同的门、纲、目、科、属或种的真核细胞。非限制性实例包括植物细胞、真菌细胞或动物细胞。更具体的非限制性实例包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以包括人细胞、绵羊细胞、猪细胞、鼠细胞、大鼠细胞、牛细胞或来自其他哺乳动物的细胞。宿主细胞可以是能够在培养中无限生长的原代细胞或细胞系。细胞系的实例包括HEK(人胚胎肾)细胞(如HEK293细胞或其变体，如HEK 293E、HEK 293F、HEK 293H、HEK 293T或HEK 293FT细胞)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(如CHO-K1、CHO-DXB11、CHO-DG44、CHO-S、CHOK1SV^TM或CHOK1SV GS-KO^TM细胞)、HeLa细胞、HT1080细胞、COS细胞(如COS7细胞)、VERO细胞、PerC.6细胞、Sp2/0细胞、NS0细胞、NIH 3T3细胞、W138细胞、BHK细胞、HEPG2细胞、A549细胞、C2C12细胞、H9C2细胞、HCT116细胞、HepG2细胞、HT-29细胞、Huh7细胞、Jurkat细胞、K562细胞、LnCaP细胞、MCF7细胞、PC-12细胞、PC-3细胞、RAW264.7细胞、U2OS细胞、C127细胞、AGE1.HN细胞、CAP细胞、HKB-11细胞或MDCK细胞，其他细胞系也是可能的。示例性昆虫细胞包括但不限于Sf9细胞、Sf1细胞、Sf21细胞、Tn-368细胞、ExpiSf9细胞、D.Mel2细胞、BTI-Tn-5B1细胞或BTI-Tn-5B1-4细胞，其他细胞也是可能的。

对于重组AAV载体的产生，示例性的非限制性宿主细胞可以包括HEK293细胞(或其变体，如HEK 293E、HEK 293F、HEK 293H、HEK 293T或HEK 293FT细胞)，包括适于悬浮生长和/或在不存在血清或其他动物产物的情况下生长的HEK293。然而，根据本领域普通技术人员的知识，用于产生重组AAV载体的其他细胞是可能的。

宿主细胞培养格式

用于在培养中(包括在高体积和高密度下)生长和维持细胞的技术是多种多样的，并且是本领域普通技术人员所熟悉的。可以将宿主细胞以多种格式在贴壁细胞培养中或在悬浮培养中生长。正如工业中常见的那样，通常将宿主细胞在来自衍生自主细胞库的工作细胞库的培养中生长，但这一惯例不应被视为是限制性的。

在某些实施方案中，可以将宿主细胞在烧瓶、滚瓶、中空纤维或本领域已知的其他格式的贴壁细胞培养中生长。可以将细胞在其生长的同一容器中转染，或者通过化学、酶促或其他处理从其底物释放出来，然后转移到用于转染的不同器皿或容器中。

也可以将宿主细胞在本领域普通技术人员熟悉的各种尺寸和格式的专用器皿(通常被称为生物反应器)中悬浮生长，包括在高体积和高密度下悬浮生长。非限制性实例包括瓶、罐(其可以打开或关闭以减少污染)，甚至具有适当厚壁的大塑料袋。生物反应器可以由许多材料制造，并且可以被设计成多次使用或一次性使用，这些包括不锈钢、玻璃和塑料。生物反应器可以设计有流体输入和输出(如具有管和阀)，并且可以被配置为允许温度控制、气体交换和内容物的混合，如通过搅拌、混合或某个其他搅动方法，以维持有利于最佳的细胞生长、活力和生产率的环境条件。可以将悬浮生长的细胞在其生长的同一容器(例如，生物反应器)中转染，或转移到用于转染的不同器皿或容器中。在某些实施方案中，当待转染的细胞的最终细胞密度和/或体积很大时，根据本公开的方法和系统，可以将来自工作细胞库的细胞在一系列尺寸不断增加的容器中生长，以在被转移到用于持续生长和/或转染的大体积生物反应器或其他器皿或容器中之前扩大其数量。根据某些实施方案，可以将贴壁细胞在悬浮于生物反应器中的微载体上生长，并且以与悬浮生长的细胞相似的方式在同一器皿中进行转染。

悬浮培养中生长的细胞的混合可以使用本领域已知的任何方法或设备来进行。例如，在某些实施方案中，可以将细胞悬浮在搅拌罐生物反应器中的培养基中生长，该搅拌罐生物反应器由叶轮主动地搅拌。混合可以在生物反应器中以任何合适的速率和/或功率输入/单位培养基体积(P/V)进行，在某些实施方案中，功率输入/单位培养基体积可以表示为瓦特/立方米(W/m³)。因此，例如，在某些实施方案中，悬浮培养中的细胞的生长阶段期间的混合可以被进行成使得P/V的值为至少或约5、10、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100W/m³或更大，或任何前述具体枚举的P/V值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的P/V值的范围。细胞生长期间的混合可以以恒定的速率或功率输入值进行，或可以以不同的速率或功率输入值进行。关于搅拌生物反应器中的功率输入的额外信息可以见于例如Kaiser,SC,et al.,Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at LaboratoryScale,J.Vis.Exp.(135),e56078,doi:10.3791/56078(2018)。

在本文描述的方法和系统中，转染可以在生长宿主细胞的同一细胞培养基中发生，或可以去除生长培养基并用新鲜供应的相同类型的培养基或不同类型的培养基替换(例如，通过灌注)，在其中将发生转染。在添加转染混合体之后，可以添加相同或不同类型的培养基以淬灭进一步的转染。在转染之后，可以将细胞在培养中维持一段时间，以允许期望的生物产物的生物合成。在此期间，无论与生长和/或转染细胞的培养基相同还是不同的培养基也可以被交换(例如，通过灌注)，以维持用于持续的细胞活力和期望的生物产物的细胞合成的最佳条件。

宿主细胞培养基

如上文所指出，可以将宿主细胞在培养基(包含细胞生长和/或活力所需的所有宏量和微量营养素的水性溶液)中生长，并且在培养基中转染。众所周知，培养基配方可以被设计或修饰以优化特定细胞类型的生长和/或生产率以及生长条件。培养基可以由原材料制备，但也可以从商业上获得预先制备的培养基，其具有多种格式，如粉末或浓缩的储液。培养基还可以补充有有助于特定生物产物的最佳生长或产生的成分。例如，培养基可以补充有动物血清，如胎牛血清，尽管某些细胞可能适于在不添加血清的情况下生长至高密度。培养基补充物的其他非限制性实例包括抗生素、表面活性剂、生长因子、激素、氨基酸、谷氨酰胺、维生素、盐和某些酶正常发挥作用所需的金属离子。

用于某些哺乳动物细胞生长的各种经典培养基广泛可用(并且如果需要可以定制)，包括F17培养基(也以专有名称FreeStyle^TM已知(Thermo-Fisher Scientific)、HamF12或F12K培养基、Dulbecco最小必需培养基(DMEM)、RPMI 1640培养基、DMEM/F12培养基、Ham F-10培养基、培养基199、Ames培养基、BGJb培养基(Fitton-Jackson Modification)、Click培养基、CMRL-1066培养基、Fischer培养基、Glascow极限必需培养基(GMEM)、Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)、L-15培养基(Leibovitz)、McCoy 5A改良的培养基、NCTC培养基、Swim S-77培养基、Waymouth培养基和William培养基E，其他培养基也是可能的。用于某些昆虫细胞生长的示例性培养基包括Express Five SFM、Sf-900 II SFM、Sf-900 III或ExpiSf CD，其他培养基也是可能的。

宿主细胞培养体积

本公开的方法和系统可以用于转染在生物反应器或者其他器皿或容器中以各种体积(即，细胞自身的组合体积和生长或悬浮待转染的细胞的细胞培养基或其他流体的体积)生长或维持的宿主细胞。因此，在某些实施方案中，添加有或递送有转染混合体的细胞悬浮液的体积可以在从约1升(L)至50000L；1L至10000L；2L至50000L；2L至10000L；5L至10000L；10L至10000L；20L至10000L；50L至10000L；100L至5000L；200L至5000L；200L至4000L；200L至3000L；500L至2500L；500L至2000L；1000L至2000L；750L至2000L；750L至1500L；800L至1400L；900L至1300L；1000L至1200L的范围内；或为至少或约1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240、1250、1260、1270、1280、1290、1300、1310、1320、1330、1340、1350、1360、1370、1380、1390、1400、1410、1420、1430、1440、1450、1460、1470、1480、1490、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000或50000L或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

宿主细胞密度

本公开的方法和系统可以用于转染各种活细胞密度的宿主细胞。此类细胞密度可以通过将细胞在培养中(如在生物反应器中的悬浮培养中)生长至目标活细胞密度或其范围来实现，而在其他实施方案中，目标细胞密度可以通过根据需要使用与转染相容的培养基或其他流体浓缩或稀释宿主细胞样品来实现。培养中的细胞的活力可以使用本领域普通技术人员已知的任何方法来确定，例如，通过采集一小部分细胞样品，添加活性染料，如锥虫蓝，然后在血细胞计上对除染料外的细胞总数进行计数，由此可以容易地计算每毫升(或任何其他体积)的活细胞数。可替代地，可以在培养中的生长或维持期间使用传感器(如介电常数传感器)实时监测活细胞密度，关于此的更多信息可以例如见于Metze,S,et al.,Monitoring online biomass with a capacitance sensor during scale-up ofindustrially relevant CHO cell culture fed-batch processes in single-usebioreactors,Bioprocess Biosys.Eng.43:193-205(2020)。本领域普通技术人员将熟悉用于定量细胞培养样品中的活细胞密度的其他方法。

在本公开的某些实施方案中，转染开始时添加有或递送有转染混合体的宿主细胞样品的活细胞密度可以为至少或约0.01x10⁶、0.1x10⁶、0.5x10⁶、1x10⁶、2x10⁶、3x10⁶、4x10⁶、5x10⁶、6x10⁶、7x10⁶、8x10⁶、9x10⁶、10x10⁶、11x10⁶、12x10⁶、13x10⁶、14x10⁶、15x10⁶、16x10⁶、17x10⁶、18x10⁶、19x10⁶、20x10⁶、21x10⁶、22x10⁶、23x10⁶、24x10⁶、25x10⁶、26x10⁶、27x10⁶、28x10⁶、29x10⁶、30x10⁶、35x10⁶、40x10⁶、45x10⁶、50x10⁶、55x10⁶、60x10⁶、65x10⁶、70x10⁶、75x10⁶、80x10⁶、85x10⁶、90x10⁶、95x10⁶或100x10⁶个活细胞/毫升(vc/mL)流体(如悬浮细胞的细胞培养基)或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。因此，例如，在某些实施方案中，转染之前宿主细胞的活细胞密度范围可以为从约0.01x10⁶至100x10⁶vc/mL；0.05x10⁶至50x10⁶vc/mL；17x10⁶至19x10⁶vc/mL；10x10⁶至20x10⁶vc/mL；11x10⁶至20x10⁶vc/mL；12x10⁶至20x10⁶vc/mL；13x10⁶至20x10⁶vc/mL；14x10⁶至20x10⁶vc/mL；15x10⁶至20x10⁶vc/mL；16x10⁶至20x10⁶vc/mL；17x10⁶至20x10⁶vc/mL；18x10⁶至20x10⁶vc/mL；19x10⁶至20x10⁶vc/mL；10x10⁶至21x10⁶vc/mL；11x10⁶至21x10⁶vc/mL；12x10⁶至21x10⁶vc/mL；13x10⁶至21x10⁶vc/mL；14x10⁶至21x10⁶vc/mL；15x10⁶至21x10⁶vc/mL；16x10⁶至21x10⁶vc/mL；17x10⁶至21x10⁶vc/mL；18x10⁶至21x10⁶vc/mL；19x10⁶至21x10⁶vc/mL；20x10⁶至21x10⁶vc/mL；10x10⁶至22x10⁶vc/mL；11x10⁶至22x10⁶vc/mL；12x10⁶至22x10⁶vc/mL；13x10⁶至22x10⁶vc/mL；14x10⁶至22x10⁶vc/mL；15x10⁶至22x10⁶vc/mL；16x10⁶至22x10⁶vc/mL；17x10⁶至22x10⁶vc/mL；18x10⁶至22x10⁶vc/mL；19x10⁶至22x10⁶vc/mL；20x10⁶至22x10⁶vc/mL；21x10⁶至22x10⁶vc/mL；10x10⁶至23x10⁶vc/mL；11x10⁶至23x10⁶vc/mL；12x10⁶至23x10⁶vc/mL；13x10⁶至23x10⁶vc/mL；14x10⁶至23x10⁶vc/mL；15x10⁶至23x10⁶vc/mL；16x10⁶至23x10⁶vc/mL；17x10⁶至23x10⁶vc/mL；18x10⁶至23x10⁶vc/mL；19x10⁶至23x10⁶vc/mL；20x10⁶至23x10⁶vc/mL；21x10⁶至23x10⁶vc/mL；10x10⁶至24x10⁶vc/mL；11x10⁶至24x10⁶ vc/mL；12x10⁶至24x10⁶ vc/mL；13x10⁶至24x10⁶ vc/mL；14x10⁶至24x10⁶ vc/mL；15x10⁶至24x10⁶ vc/mL；16x10⁶至24x10⁶vc/mL；17x10⁶至24x10⁶ vc/mL；18x10⁶至24x10⁶ vc/mL；19x10⁶至24x10⁶ vc/mL；20x10⁶至24x10⁶ vc/mL；21x10⁶至24x10⁶ vc/mL；22x10⁶至24x10⁶ vc/mL；23x10⁶至24x10⁶ vc/mL；0.1x10⁶至25x10⁶ vc/mL；0.25x10⁶至25x10⁶ vc/mL；0.5x10⁶至25x10⁶ vc/mL；1x10⁶至25x10⁶vc/mL；2x10⁶至25x10⁶ vc/mL；2.5x10⁶至25x10⁶ vc/mL；5x10⁶至25x10⁶ vc/mL；6x10⁶至25x10⁶ vc/mL；7x10⁶至25x10⁶vc/mL；8x10⁶至25x10⁶ vc/mL；9x10⁶至25x10⁶ vc/mL；10x10⁶至25x10⁶ vc/mL；11x10⁶至25x10⁶ vc/mL；12x10⁶至25x10⁶ vc/mL；13x10⁶至25x10⁶ vc/mL；14x10⁶至25x10⁶vc/mL；15x10⁶至25x10⁶ vc/mL；16x10⁶至25x10⁶ vc/mL；17x10⁶至25x10⁶ vc/mL；18x10⁶至25x10⁶ vc/mL；19x10⁶至25x10⁶ vc/mL；20x10⁶至25x10⁶ vc/mL；21x10⁶至25x10⁶vc/mL；22x10⁶至25x10⁶ vc/mL；23x10⁶至25x10⁶ vc/mL；24x10⁶至25x10⁶ vc/mL；10x10⁶至26x10⁶ vc/mL；11x10⁶至26x10⁶ vc/mL；12x10⁶至26x10⁶ vc/mL；13x10⁶至26x10⁶ vc/mL；14x10⁶至26x10⁶ vc/mL；15x10⁶至26x10⁶ vc/mL；16x10⁶至26x10⁶ vc/mL；17x10⁶至26x10⁶vc/mL；18x10⁶至26x10⁶ vc/mL；19x10⁶至26x10⁶ vc/mL；20x10⁶至26x10⁶ vc/mL；21x10⁶至26x10⁶ vc/mL；22x10⁶至26x10⁶ vc/mL；23x10⁶至26x10⁶ vc/mL；24x10⁶至26x10⁶ vc/mL；25x10⁶至26x10⁶ vc/mL；10x10⁶至27x10⁶ vc/mL；11x10⁶至27x10⁶ vc/mL；12x10⁶至27x10⁶vc/mL；13x10⁶至27x10⁶ vc/mL；14x10⁶至27x10⁶ vc/mL；15x10⁶至27x10⁶ vc/mL；16x10⁶至27x10⁶ vc/mL；17x10⁶至27x10⁶ vc/mL；18x10⁶至27x10⁶ vc/mL；19x10⁶至27x10⁶ vc/mL；20x10⁶至27x10⁶ vc/mL；21x10⁶至27x10⁶ vc/mL；22x10⁶至27x10⁶ vc/mL；23x10⁶至27x10⁶vc/mL；24x10⁶至27x10⁶ vc/mL；25x10⁶至27x10⁶ vc/mL；26x10⁶至27x10⁶ vc/mL；10x10⁶至28x10⁶ vc/mL；11x10⁶至28x10⁶ vc/mL；12x10⁶至28x10⁶ vc/mL；13x10⁶至28x10⁶ vc/mL；14x10⁶至28x10⁶ vc/mL；15x10⁶至28x10⁶ vc/mL；16x10⁶至28x10⁶ vc/mL；17x10⁶至28x10⁶vc/mL；18x10⁶至28x10⁶ vc/mL；19x10⁶至28x10⁶ vc/mL；20x10⁶至28x10⁶ vc/mL；21x10⁶至28x10⁶ vc/mL；22x10⁶至28x10⁶ vc/mL；23x10⁶至28x10⁶ vc/mL；24x10⁶至28x10⁶ vc/mL；25x10⁶至28x10⁶ vc/mL；26x10⁶至28x10⁶ vc/mL；27x10⁶至28x10⁶ vc/mL；10x10⁶至29x10⁶vc/mL；11x10⁶至29x10⁶ vc/mL；12x10⁶至29x10⁶ vc/mL；13x10⁶至29x10⁶ vc/mL；14x10⁶至29x10⁶ vc/mL；15x10⁶至29x10⁶ vc/mL；16x10⁶至29x10⁶ vc/mL；17x10⁶至29x10⁶ vc/mL；18x10⁶至29x10⁶ vc/mL；19x10⁶至29x10⁶ vc/mL；20x10⁶至29x10⁶ vc/mL；21x10⁶至29x10⁶vc/mL；22x10⁶至29x10⁶ vc/mL；23x10⁶至29x10⁶ vc/mL；24x10⁶至29x10⁶ vc/mL；25x10⁶至29x10⁶ vc/mL；26x10⁶至29x10⁶ vc/mL；27x10⁶至29x10⁶ vc/mL；28x10⁶至29x10⁶ vc/mL；2x10⁶至30x10⁶ vc/mL；5x10⁶至30x10⁶ vc/mL；10x10⁶至30x10⁶ vc/mL；11x10⁶至30x10⁶vc/mL；12x10⁶至30x10⁶ vc/mL；13x10⁶至30x10⁶ vc/mL；14x10⁶至30x10⁶ vc/mL；15x10⁶至30x10⁶vc/mL；16x10⁶至30x10⁶ vc/mL；17x10⁶至30x10⁶ vc/mL；18x10⁶至30x10⁶ vc/mL；19x10⁶至30x10⁶ vc/mL；20x10⁶至30x10⁶ vc/mL；21x10⁶至30x10⁶ vc/mL；22x10⁶至30x10⁶ vc/mL；23x10⁶至30x10⁶ vc/mL；24x10⁶至30x10⁶ vc/mL；25x10⁶至30x10⁶vc/mL；26x10⁶至30x10⁶vc/mL；27x10⁶至30x10⁶vc/mL；28x10⁶至30x10⁶vc/mL；29x10⁶至30x10⁶vc/mL、10x10⁶至35x10⁶vc/mL；11x10⁶至35x10⁶vc/mL；12x10⁶至35x10⁶vc/mL；13x10⁶至35x10⁶vc/mL；14x10⁶至35x10⁶vc/mL；15x10⁶至35x10⁶vc/mL；16x10⁶至35x10⁶vc/mL；17x10⁶至35x10⁶vc/mL；18x10⁶至35x10⁶vc/mL；19x10⁶至35x10⁶vc/mL；20x10⁶至35x10⁶vc/mL；21x10⁶至35x10⁶vc/mL；22x10⁶至35x10⁶vc/mL；23x10⁶至35x10⁶vc/mL；24x10⁶至35x10⁶vc/mL；25x10⁶至35x10⁶vc/mL；26x10⁶至35x10⁶vc/mL；27x10⁶至35x10⁶vc/mL；28x10⁶至35x10⁶vc/mL；29x10⁶至35x10⁶vc/mL、30x10⁶至35x10⁶vc/mL、31x10⁶至35x10⁶vc/mL、32x10⁶至35x10⁶vc/mL、33x10⁶至35x10⁶vc/mL、34x10⁶至35x10⁶vc/mL、10x10⁶至40x10⁶vc/mL；11x10⁶至40x10⁶vc/mL；12x10⁶至40x10⁶vc/mL；13x10⁶至40x10⁶vc/mL；14x10⁶至40x10⁶vc/mL；15x10⁶至40x10⁶vc/mL；16x10⁶至40x10⁶vc/mL；17x10⁶至40x10⁶vc/mL；18x10⁶至40x10⁶vc/mL；19x10⁶至40x10⁶vc/mL；20x10⁶至40x10⁶vc/mL；21x10⁶至40x10⁶vc/mL；22x10⁶至40x10⁶vc/mL；23x10⁶至40x10⁶vc/mL；24x10⁶至40x10⁶vc/mL；25x10⁶至40x10⁶vc/mL；26x10⁶至40x10⁶vc/mL；27x10⁶至40x10⁶vc/mL；28x10⁶至40x10⁶vc/mL；29x10⁶至40x10⁶vc/mL、30x10⁶至40x10⁶vc/mL、31x10⁶至40x10⁶vc/mL、32x10⁶至40x10⁶vc/mL、33x10⁶至40x10⁶vc/mL、34x10⁶至40x10⁶vc/mL、35x10⁶至40x10⁶vc/mL、36x10⁶至40x10⁶vc/mL、37x10⁶至40x10⁶vc/mL、38x10⁶至40x10⁶vc/mL或39x10⁶至40x10⁶vc/mL，或某个其他范围。在某些实施方案中，宿主细胞是悬浮培养中的HEK293细胞或其变体。

用于转染的浓度、体积和比率

用于本公开的方法和系统的转染试剂溶液(包括但不限于含有PEI的溶液)可以以转染试剂(包括但并不限于PEI)的任何合适浓度来制备，该浓度包括至少或约0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、5、7.5、10、20或50毫克或更多转染试剂(包括但不限于PEI)/毫升(mg/mL)溶解或稀释转染试剂的溶剂或稀释剂或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。在其他实施方案中，用于本公开的方法和系统的转染试剂溶液中转染试剂的浓度可以为至少或约0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、5、7.5、10、20、50、500mM或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

用于本公开的方法和系统的核酸溶液(包括但不限于含有质粒DNA的溶液)可以以核酸(包括但并不限于pDNA)的任何合适浓度来制备，该浓度包括至少或约0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、5、7.5、10、20、50mg或更多核酸/mL溶解或稀释核酸(包括但不限于pDNA)的溶剂或稀释剂或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。在其他实施方案中，用于本公开的方法和系统的核酸溶液中核酸的浓度可以为至少或约0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、5、7.5、10、20、50、500mM或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

如上文所指出，本领域已知的支持所选转染试剂和核酸的复合的任何生物相容性溶剂或稀释剂都可以用于制备转染试剂溶液和核酸溶液，该溶剂或稀释剂的非限制性实例包括盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖溶液、Ringer乳酸盐溶液、细胞生长培养基(例如，F17培养基)或水。另外，在某些实施方案中，此类溶剂和稀释剂还可以包含其他成分，如盐、缓冲剂或洗涤剂，其非限制性实例是普朗尼克(pluronic)，如浓度为0.2％的普朗尼克。

在含有多于一种类型的核酸(例如，含有不同核苷酸序列的不同DNA质粒)的核酸溶液或转染混合体中，不同类型的核酸可以以不同的摩尔比存在。因此，例如，在某些实施方案中，在包含至少两种类型的质粒的核酸溶液或转染混合体中，任何两种此类类型的质粒可以以以下的摩尔比存在：约50:1至约1:50、20:1至约1:20、10:1至约1:10、9:1至约1:9、8:1至约1:8、7:1至约1:7、6:1至约1:6、5:1至约1:5、4:1至约1:4或3:1至约1:3，或这些范围所涵盖的任何比率，包括例如约3:1、2.9:1、2.8:1、2.7:1、2.6:1、2.5:1、2.4:1、2.3:1、2.2:1、2.1:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9或1:3，或任何前述具体枚举的比率之间的某个其他比率，或包含任何前述具体枚举的比率的范围，其他比率也是可能的，其中比率中的第一(先行)和第二(后续)数字分别代表核酸溶液或转染混合体中第一和第二类型的质粒的摩尔数或摩尔浓度的相对量。在某些实施方案中，核酸溶液或转染混合体中第一和第二类型的DNA质粒的摩尔比为约1:1，其中任一值的偏差不超过±50％、±40％、±30％、±20％、±10％或±5％。在某些示例性的非限制性实施方案中，第一质粒类型包含用于腺病毒辅助因子和/或AAV Rep和AAV衣壳蛋白的基因，并且第二质粒类型包含AAV载体基因组，其包含在遗传调控元件(如启动子和任选的增强子)的控制下的基因，以及至少一个AAV反向末端重复序列。

在某些实施方案中，在包含至少三种类型的质粒的核酸溶液或转染混合体中，任何三种此类类型的质粒可以以以下的摩尔比存在：1:1:1、1:1:2、1:1:3、1:2:1、1:2:2、1:2:3、1:3:1、1:3:2、1:3:3、2:1:1、2:1:2、2:1:3、2:2:1、2:2:2、2:2:3、2:3:1、2:3:2、2:3:3、3:1:1、3:1:2、3:1:3、3:2:1、3:2:2、3:2:3、3:3:1、3:3:2、3:3:3、1:2:2、1:2:3或1:3:3，或任何前述具体枚举的比率之间的某个其他比率，或包含任何前述具体枚举的比率的范围，其他比率也是可能的，其中比率中的第一、第二和第三数字分别代表核酸溶液或转染混合体中第一、第二和第三类型的质粒的摩尔数或摩尔浓度的相对量。在某些实施方案中，三种质粒的相对摩尔浓度为约1:1:1、1:1:2、1:1:3、1:2:1、1:2:2、1:2:3、1:3:1、1:3:2、1:3:3、2:1:1、2:1:2、2:1:3、2:2:1、2:2:2、2:2:3、2:3:1、2:3:2、2:3:3、3:1:1、3:1:2、3:1:3、3:2:1、3:2:2、3:2:3、3:3:1、3:3:2、3:3:3、1:2:2、1:2:3或1:3:3，其中第一、第二或第三值的偏差不超过±50％、±40％，±30％、±20％，±10％或±5％。在某些示例性的非限制性实施方案中，第一质粒类型包含用于腺病毒辅助因子的基因，第二质粒类型包含编码AAV Rep和AAV衣壳蛋白的基因，并且第三质粒类型包含AAV载体基因组，其包含在遗传调控元件(如启动子和任选的增强子)的控制下的基因，以及至少一个AAV反向末端重复序列。

用于本公开的方法和系统的转染试剂溶液和核酸溶液可以以任何合适的量单独地制备，该量可以表示为体积或质量。在某些实施方案中，所制备的转染试剂溶液(包括但不限于PEI的溶液)的体积或质量在从约0.1至5000升(L)或千克(kg)或更大的范围内，或至少或约0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000L或kg或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。在某些实施方案中，所制备的核酸溶液(包括但不限于pDNA的溶液)的体积或质量在从约0.1至5000L或kg或更大的范围内，或至少或约0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000L或kg或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

用于本公开的方法和系统的转染混合体可以以任何合适的量制备，该量的全部或一部分最终将被递送或添加到待转染的细胞样品中，并且该量可以表示为体积或质量。在某些实施方案中，通过将转染试剂溶液(包括但不限于含有PEI的溶液)和核酸溶液(包括，但不限于含有pDNA的溶液)混合在一起制备的转染混合体的总体积或质量在从约0.1至10000L或kg的范围内，或至少或约0.1、0.2、0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、550、600、650、700、750、800、950、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500或10000L或kg或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。如上文所指出，在某些实施方案中，用于转染的转染混合体的总体积或质量可以制备为单剂量，或代替地在一段时间内连续地形成，与此同时将转染混合体的一部分添加或递送到用于转染的细胞样品中。

可以以任何合适的量将用于本公开的方法和系统的转染混合体递送或添加到待转染的细胞样品中，该量可以表示为体积或质量。在某些实施方案中，递送或添加到用于转染的细胞中的转染混合体(包括但不限于含有PEI和pDNA的转染混合体)的总体积或质量在从约0.1至10000L或kg的范围内，或至少或约0.1、0.2、0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、550、600、650、700、750、800、950、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500或10000L或kg或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。如上文所指出，在某些实施方案中，可以将用于转染的转染混合体的总体积或质量作为单剂量递送或添加到细胞中，或代替地可以在通过将转染试剂溶液和核酸溶液混合在一起形成转染混合体的同时，将用于转染的转染混合体的总体积或质量连续地递送或添加到细胞中。

用于本公开的方法和系统的转染试剂溶液和核酸溶液一旦制备好，就可以以任何合适的体积比或质量比将其混合在一起以形成转染混合体。在某些实施方案中，可以以例如以下的比率将转染试剂溶液(包括但不限于含有PEI的溶液)和核酸溶液(包括但不限于含有pDNA的溶液)组合以形成转染混合体：约50:1至1:50、20:1至1:20、10:1至1:10、9:1至1:9、8:1至1:8、7:1至1:7、6:1至1:6、5:1至1:5、4:1至1:4或3:1至1:3，或这些范围所涵盖的任何比率，包括例如约9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9，或任何前述具体枚举的比率之间的某个其他比率，或包含任何前述具体枚举的比率的范围，其他比率也是可能的，其中第一和第二数字分别表明基于体积(例如，升)或质量(例如，千克)组合的转染试剂溶液和核酸溶液的相对量。在某些实施方案中，以基于体积或质量的大约1:1的比率将转染试剂溶液和核酸溶液组合。在某些实施方案中，本公开的系统可以被配置为实现期望的体积比的混合，例如，通过将泵装置设置为在不同的泵送速率下操作，其中期望在一段时间内将不同量的转染试剂溶液和核酸溶液混合。在某些实施方案中，将所制备的转染试剂溶液和核酸溶液的总体积组合以形成用于转染细胞的转染混合体，而在其他实施方案中，组合的体积小于此类溶液的总体积。

用于本公开的方法和系统的转染混合体可以包括任何合适浓度的转染试剂(包括但不限于PEI)和核酸(包括但并不限于pDNA)。在某些实施方案中，转染混合体可以含有浓度为以下的转染试剂(包括但不限于PEI)：至少或约0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、5、7.5、10、20或50mg/mL或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。在其他实施方案中，转染混合体中转染试剂的浓度可以为至少或约0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、5、7.5、10、20、50、500mM或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。在某些实施方案中，转染混合体可以含有浓度为以下的核酸(包括但不限于pDNA)：至少或约0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、5、7.5、10、20、50mg/mL或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。在其他实施方案中，转染混合体中核酸的浓度可以为至少或约0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、5、7.5、10、20、50、500mM或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

用于本公开的方法和系统的转染混合体可以包括任何合适质量比的转染试剂(包括但不限于PEI)和核酸(包括但并不限于pDNA)。在某些实施方案中，转染混合体中转染试剂(包括但不限于PEI)的质量与核酸(包括但并不限于pDNA)的质量的比率可以在约100:1至约1:100、约50:1至约1:50、约20:1至约1:20或约10:1至约1:10的范围内，或这些范围所涵盖的任何比率，包括例如约9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2.9:1、2.8:1、2.7:1、2.6:1、2.5:1、2.4:1、2.3:1、2.2:1、2.1:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9，或任何前述具体枚举的比率之间的某个其他比率，或包含任何前述具体枚举的比率的范围，其他比率也是可能的，其中第一和第二数字分别表明转染混合体中的转染试剂和核酸基于质量(例如，克或毫克)的相对量。

在某些实施方案中，转染试剂是包含多个伯胺基团、仲胺基团和/或叔胺基团的聚阳离子聚合物，其非限制性实例包括PEI，如线性PEI或支化PEI。如本领域已知的，可以计算聚合物溶液中的胺基团中氮原子的摩尔浓度，也可以计算核酸溶液中的磷酸基团中磷原子的摩尔密度。一旦已知转染试剂和核酸各自的储备溶液中胺和磷酸盐的摩尔浓度，也就可以计算将转染试剂溶液和核酸溶液组合成转染混合体时氮原子数与磷原子数的摩尔比并将其表示为N/P比率。如本领域已知的，N/P比率可以变化，这已被示出为对转染效率具有影响。参见，例如，Boussif,O,et al.,A versatile vector for gene and oligonucleotidetransfer into cells in culture and in vivo:Polyethylenimine,PNAS 92:7297-7301(1995)。用于本公开的方法和系统的转染混合体可以包括任何期望的N/P比。因此，例如，在某些实施方案中，包含聚阳离子聚合物(如PEI)和核酸(如pDNA)的转染混合体的N/P比可以为至少或约0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450或500或更大，或任何前述具体枚举的N/P比之间的某个其他比率，或包含任何前述具体枚举的N/P比的范围。

本公开的方法可以被进行成使得任何合适量的转染试剂和核酸用于转染细胞。在某些实施方案中，用于转染细胞的转染试剂和核酸的量可以表示为它们的量相对于待转染的一定数量的活细胞的比率。例如，转染中使用的转染试剂和核酸的量可以以微克/百万个活细胞来表示。因此，在某些实施方案中，转染试剂(包括但不限于PEI)的质量与待转染的百万个活细胞的比率可以在从约0.1至50μg/1x10⁶个活细胞；0.5至30μg/1x10⁶个活细胞；0.75至10μg/1x10⁶个活细胞；1至3μg/1x10⁶个活细胞的范围内；或约1.65μg/1x10⁶个活细胞，或可以为至少或约0.1、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.65、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50μg/1x10⁶个活细胞或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。同样地，在某些实施方案中，核酸(包括但不限于pDNA)的质量与待转染的百万个活细胞的比率可以在从约0.05至20μg/1x10⁶个活细胞；0.1至10μg/1x10⁶个活细胞；0.25至7.5μg/1x10⁶个活细胞；0.5至5μg/1x10⁶个活细胞；0.5至2.5μg/1x10⁶个活细胞；0.5至1.0μg/1x10⁶个活细胞的范围内，或为约0.75μg/1x10⁶个活细胞，或可以为至少或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10μg/1x10⁶个活细胞或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。知道待转染的活细胞的大概总数，则可以控制用于转染的转染试剂溶液中转染试剂的浓度和/或用于转染的转染试剂溶液的量，以将足够量的转染试剂递送到待转染的细胞中，以实现期望的转染试剂质量与细胞数量比率。相似地，可以控制用于转染的核酸溶液中核酸的浓度和/或用于转染的核酸溶液的量，以将足够量的核酸递送到待转染的细胞中，以实现期望的核酸质量与细胞数量比率。

在其他实施方案中，用于转染细胞的转染试剂和核酸的量可以表示为它们的量相对于待转染的一定体积的细胞样品的比率。例如，转染中使用的转染试剂和核酸的量可以以微克/毫升悬浮在将进行细胞转染的流体(例如，细胞生长培养基)中的细胞来表示。因此，在某些实施方案中，转染试剂(包括但不限于PEI)的质量与mL待转染的细胞样品的比率可以在从约0.1至50μg/mL；0.5至30μg/mL；0.75至10μg/mL；1至3μg/mL的范围内；或约1.65μg/mL，或可以为至少或约0.5、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.65、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50μg/mL或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。同样地，在某些实施方案中，核酸(包括但不限于pDNA)的质量与mL待转染的细胞样品的比率可以在从约0.05至20μg/mL；0.1至10μg/mL；0.25至7.5μg/mL；0.5至5μg/mL；0.5至2.5μg/mL；0.5至1.0μg/mL的范围内，或为约0.75μg/mL，或可以为至少或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10μg/mL或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。知道待转染的细胞悬浮液的大概总体积，则可以控制用于转染的转染试剂溶液中转染试剂的浓度和/或用于转染的转染试剂溶液的量，以将足够量的转染试剂递送到待转染的细胞中，以实现期望的转染试剂质量与体积比率。相似地，可以控制用于转染的核酸溶液中核酸的浓度和/或用于转染的核酸溶液的量，以将足够量的核酸递送到待转染的细胞中，以实现期望的核酸质量与体积比率。

可以以任何合适的量将用于本公开的方法和系统的转染混合体(包括但不限于含有PEI和pDNA的转染混合体)递送或添加到用于转染的细胞样品中。在某些实施方案中，添加到用于转染的细胞样品中的转染混合体的量可以表示为待转染细胞样品的量的基于重量比重量(w/w)、重量比体积(w/v)或体积/体积(v/v)的百分比。因此，例如，在某些实施方案中，递送或添加到用于转染的细胞样品中的转染混合体的量可以为细胞样品(例如，作为其中将进行细胞转染的流体(如细胞生长培养基)中的悬浮液)的量的至少或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45％或更大(基于w/w、w/v或v/v)，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。在示例性的非限制性实施方案中，可以添加到细胞样品中的转染混合体的量为细胞样品体积的32.65％(w/v)。

转染混合体的孵育时间可以是任何合适的时段，其为悬浮液或溶液中的转染试剂和核酸提供足够的时间以形成能够高效率地转染宿主细胞的转染试剂与核酸的复合物(包括但不限于PEI/pDNA复合物)。当一部分转染试剂溶液和一部分核酸溶液首次彼此接触时，孵育时间段开始，并且当将如此形成的转染混合体递送或添加到用于转染的细胞样品中时，孵育时间段结束。参考本公开的用于转染的系统，在某些实施方案中，孵育时间是转染混合体从混合装置流体地连通到细胞容纳装置所需的时间(例如，在非限制性实施方案中，孵育时间是将转染混合体通过连接混合器和生物反应器的管从静态在线混合器泵送到包含培养中的细胞的生物反应器中所需的时间)。在某些实施方案中，转染混合体的孵育时间可以为至少或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850或900秒或更长，或任何前述具体枚举的时间值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的时间值的范围。在其他实施方案中，孵育时间可以为约900秒或更短，如约900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、155、150、145、140、135、130、125、120、115、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5秒或更短时间，或任何前述具体枚举的时间值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的时间值的范围。

转染混合体的添加时间可以是足以将预定体积或质量的转染混合体(包括但不限于含有PEI和pDNA的转染混合体)递送或添加到用于转染的细胞样品中的任何合适的时段。在某些实施方案中，转染混合体的预定体积或质量是出于转染目的所制备的转染混合体的总体积或质量，或其某个部分。在某些实施方案中，转染混合体的预定体积或质量为待转染的细胞样品的体积或质量的至少或约5％、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45％或更大。参考本公开的用于转染的系统，在某些实施方案中，添加时间是预定体积或质量的转染试剂溶液(包括但不限于含有PEI的溶液)和核酸溶液(包括而不限于含有pDNA的溶液)从溶液容纳装置流体地连通到混合装置中并从混合装置流体地连通到细胞容纳装置所需的时间。根据示例性的非限制性实施方案，添加时间可以是将预定体积或质量的转染试剂溶液(包括但不限于含有PEI的溶液)和核酸溶液(包括但不限于含有pDNA的溶液)通过管从它们的容器泵送到静态在线混合器(在此处它们开始混合以形成转染混合体)中，然后通过另一管从混合器泵送到含有待转染的细胞的生物反应器中所需的时间。在某些实施方案中，转染试剂溶液和核酸溶液的预定体积或质量是出于转染目的所制备的此类溶液的总体积或质量，或其某个部分。

在某些实施方案中，转染混合体的添加时间可以为至少或约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、160、170或180分钟或更长，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。在其他实施方案中，添加时间可以为约180分钟或更短，如约180、170、160、150、145、140、135、130、125、120、115、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5或1分钟或更短时间，或任何前述具体枚举的时间值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的时间值的范围。

在某些示例性的非限制性实施方案中，本公开的方法和系统可以使用在大概如表1中所阐述的范围内的孵育时间和添加时间来进行和配置。在其他实施方案中，表1中的值可以变化±30％、±25、±20％、±15、±10％或±5％。

表1

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在某些实施方案中，可以在将转染混合体递送或添加到待转染的细胞样品中期间对细胞样品进行搅拌、搅动或混合，以实现转染混合体的彻底分布并与细胞样品混合，并且防止形成可能对细胞活力产生负面影响的局部高浓度转染混合体。在混合期间，可以将环境因素(如温度、pH和氧合)控制在可接受的范围内。在某些实施方案中，混合可以发生在添加转染混合体的整个时段期间，或发生在此种时间的一部分期间，如添加转染混合体的时间的至少或约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在某些实施方案中，此种混合可以进行至少或约5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、75分钟、80分钟、90分钟或180分钟或更长，或包括前述时间中的任何两个并介于其之间的范围，或添加转染混合体的某个其他时间范围。

在将转染混合体递送或添加到用于转染的细胞样品中期间的混合可以使用本领域已知的任何方法或设备来进行。例如，在某些实施方案中，可以将细胞悬浮在搅拌罐生物反应器中的培养基中，该搅拌罐生物反应器由叶轮主动地搅拌。混合可以在生物反应器中以任何合适的速率和/或功率输入/单位培养基体积(P/V)进行，在某些实施方案中，功率输入/单位培养基体积可以表示为瓦特/立方米(W/m³)。因此，例如，在某些实施方案中，在将转染混合体递送或添加到用于转染的细胞样品中期间的混合可以被进行成使得功率输入/体积为至少或约5、10、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100W/m³或更大，或任何前述具体枚举的P/V值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的P/V值的范围。混合与可以用于生长或维持悬浮培养中的细胞的混合相比，可以以相同或不同的速率进行。

在将转染混合体添加到细胞中之后的任选步骤

一旦将转染混合体添加或递送到宿主细胞样品中，就可以进行额外的方法步骤，包括例如孵育细胞以允许转染发生、阻止进一步的转染、孵育细胞以允许由转染的核酸中所包含的遗传信息指导的生物产物的生物合成，以及用于纯化此类生物产物的下游处理步骤。

在本公开的方法和系统的某些实施方案中，在将所有转染混合体添加到用于转染的细胞样品中之后，可以将细胞和转染混合体的混合物孵育一段时间，以允许细胞摄取转染试剂和核酸的复合物(包括但不限于PEI/pDNA复合物)。在某些实施方案中，转染孵育时间可以为至少或约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、7、8、9或10小时或更长，或任何前述具体枚举的时间值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的时间值的范围。

在某些实施方案中，可以在转染孵育时段期间对细胞和转染混合体的混合物进行搅拌、搅动或混合。在混合期间，可以将环境因素(如温度、pH和氧合)控制在可接受的范围内。在某些实施方案中，混合可以发生在整个孵育时段期间，或发生在此种时间的一部分期间，如孵育时段的至少或约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在某些实施方案中，此种混合可以进行至少或约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、7、8、9或10小时或更长，或任何前述具体枚举的时间值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的时间值的范围。在转染孵育时段期间的混合可以使用本领域已知的任何方法或设备来进行。例如，在某些实施方案中，可以将细胞悬浮在搅拌罐生物反应器中的培养基中，该搅拌罐生物反应器由叶轮主动地搅拌。混合可以以任何合适的速率和/或功率输入/单位培养基体积来进行。因此，例如，在某些实施方案中，在孵育时段期间的混合可以被进行成使得功率输入/体积为至少或约5、10、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100W/m³或更大，或任何前述具体枚举的P/V值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的P/V值的范围。混合与可以用于生长或维持悬浮培养中的细胞的混合相比，可以以相同或不同的速率进行，或同时添加转染混合体。在某些实施方案中，在转染孵育时段期间不进行主动搅拌。

在本公开的方法和系统的某些实施方案中，将淬灭培养基添加到转染的细胞样品中，以阻止细胞进一步摄取转染试剂和核酸的复合物(包括但不限于PEI/pDNA)，从而降低细胞毒性。可以以转染的细胞样品的体积或质量(即细胞样品和转染混合体的组合体积)的基于重量比重量(w/w)、重量比体积(w/v)或体积/体积(v/v)的任何合适的百分比，将用于本公开的方法和系统的淬灭培养基添加或递送到转染的细胞样品中。在某些实施方案中，添加到转染的细胞样品中以阻止转染的淬灭培养基的基于w/w、w/v或v/v的百分比为转染的细胞样品的体积或质量的至少或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40％或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。在示例性的非限制性实施方案中，可以通过将约13％w/v CDM4培养基(任选地包括葡聚糖硫酸酯)添加到转染的细胞样品中来淬灭转染。

在本公开的方法和系统的某些实施方案中，将转染的细胞在适合于允许转染到细胞中的核酸中所包含的遗传信息表达的条件下孵育足够的时间。在某些实施方案中，此种表达将导致生物产物的生物合成，该生物产物可以从细胞中释放出来和/或保留在细胞内。在某些实施方案中，转染后孵育时段为至少或约6、7、8、9、10、11、12、15、16、18、20、24、25、30、35、36、40、42、45、48、50、54、55、60、65、66、68、70、72、75、80、90或100小时或更长，或任何前述具体枚举的时间之间的某个其他时间，或包含任何前述具体枚举的时间的范围。

在某些实施方案中，可以在转染后孵育时段期间对转染的细胞进行搅拌、搅动或混合。在混合期间，可以将环境因素(如温度、pH和氧合)控制在可接受的范围内。培养基可以被交换或添加到细胞培养中，以维持足够高水平的营养物质和/或低水平的代谢副产物，如通过灌注或补充喂养。在转染后孵育时段期间，可以采集并分析转染的细胞样品或悬浮它们的培养基样品，以检测生物产物的表达。在某些实施方案中，混合可以发生在整个孵育时段期间，或发生在此种时间的一部分期间，如孵育时段的至少或约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在某些实施方案中，此种混合可以进行至少或约6、7、8、9、10、11、12、15、16、18、20、24、25、30、35、36、40、42、45、48、50、54、55、60、65、66、68、70、72、75、80、90或100小时或更长，或任何前述具体枚举的时间之间的某个其他时间，或包含任何前述具体枚举的时间的范围。

在转染后孵育时段期间的混合可以使用本领域已知的任何方法或设备来进行。例如，在某些实施方案中，可以将细胞悬浮在搅拌罐生物反应器中的培养基中，该搅拌罐生物反应器由叶轮主动地搅拌。混合可以以任何合适的速率和/或功率输入/单位培养基体积来进行。因此，例如，在某些实施方案中，在转染后孵育时段期间的混合可以被进行成使得功率输入/体积为至少或约5、10、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100W/m³或更大，或任何前述具体枚举的P/V值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的P/V值的范围。混合与可以用于生长或维持悬浮培养中的细胞的混合相比，可以以相同或不同的速率进行，同时将转染混合体添加到细胞，和/或在转染孵育期间进行。

在转染后孵育步骤之后，可以对转染的细胞和/或转染后维持它们的培养基进行进一步处理，以分离并纯化由细胞因转染而合成的生物产物。在某些实施方案中，在生物产物从完整细胞分泌出来或以其他方式释放出来的情况下，可以将培养基与细胞分离，如通过过滤来分离，然后进行进一步处理以纯化产物。在其他实施方案中，在生物产物保留在完整细胞内的情况下，可以使用本领域已知的任何方法裂解细胞以将产物释放到周围的培养基中，如机械地，例如用高压均质器或珠磨机，或非机械地，其可以涵盖物理、化学或生物方法。物理方法的实例包括将细胞暴露于加热、冻融循环、渗透性休克、超声处理或空化；化学方法的实例包括用碱或洗涤剂处理细胞；并且生物方法的实例包括用酶处理细胞。在裂解细胞之后，可以以本领域已知的多种方式(如离心或过滤)去除细胞碎片和残余物。宿主细胞DNA(如基因组DNA)可以通过用核酸内切酶(如Benzonase)处理裂解液，或将某些洗涤剂添加到裂解液中以沉淀宿主细胞DNA从而形成可以与上清液分离的絮凝物来去除。然后可以使部分澄清的裂解液(如上清液或滤液)经受额外的下游处理步骤以纯化期望的生物产物。

考虑到待纯化的生物产物的性质，任何合适的下游处理步骤都是可能的，例如在感胶离子盐(如硫酸铵)中沉淀或色谱。本领域已知许多类型的色谱，包括但不限于尺寸排阻色谱(SEC)；亲和色谱(例如，其中将能够与生物产物特异性地结合的亲和配体(如抗体或其抗原结合片段、凝集素、蛋白A、蛋白G、蛋白L或聚糖等)附着于固定相)；固定化金属螯合色谱(IMAC)；嗜硫吸附色谱；疏水相互作用色谱(HIC)；多元色谱(MMC)；假亲和色谱；以及离子交换色谱(IEX或IEC)，如阴离子交换色谱(AEX)或阳离子交换色谱(CEX)。在其他实施方案中，下游处理步骤可以包含脱盐或缓冲液更换、过滤(如超滤、纳滤和/或渗滤)或浓缩生物产物，例如使用切向流过滤(TFF)。使用多于一个下游处理步骤是可能的，并且可以根据本领域普通技术人员的知识，以任何顺序进行多个下游处理步骤。

在某些实施方案中，生物产物是重组AAV载体，并且用于纯化载体的下游步骤是至少一个色谱步骤。在某些实施方案中，色谱步骤包含基于抗体的亲和配体纯化，其中附着于固定相的抗体(例如，IgG)或其抗体片段或者单链骆驼抗体(如重链可变区骆驼抗体)特异性地结合某些衣壳。用于纯化重组AAV载体的亲和树脂的非限制性实例包括SepharoseAVB、POROS CaptureSelect AAVX、POROS CaptureSelect AAV8和POROS Capture SelectAAV9。参见，例如，erova,O,et al.,Affinity Chromatography Accelerates ViralVector Purification for Gene Therapies,BioPharm Intl.eBook pp.27-35(2017)；Mietzsch,M,et al.,Characterization of AAV-Specific Affinity Ligands:Consequences for Vector Purification and Development Strategies,Mol.Ther.Meth.&Clin.Dev.,19:362-73(2020)；Rieser,R,et al.,Comparison ofDifferent Liquid Chromatography-Based Purification Strategies for Adeno-Associated Virus Vectors,Pharmaceutics 13,748(2021)(doi.org/10.3390/pharmaceutics13050748)。在其他实施方案中，配体可以与某些衣壳特异性地结合的细胞表面受体分子相同或结构上相关，如聚糖，例如唾液酸(例如，O-连接或N-连接唾液酸)、半乳糖、肝素或硫酸乙酰肝素，或蛋白聚糖，如乙酰肝素或硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)。例如，含有唾液酸残基的亲和树脂可以用于纯化包含与唾液酸特异性地结合的衣壳(例如，AAV1、AAV4、AAV5或AAV6)的重组体AAV载体；含有半乳糖的亲和基质可以用于纯化具有与半乳糖特异性地结合的衣壳(例如，AAV9)的载体；并且含有肝素、乙酰肝素或HSPG的亲和基质可以用于纯化具有与HSPG特异性地结合的衣壳(例如，AAV2、AAV3、AAV3b、AAV6或AAV13)的AAV载体。在其他示例性的非限制性实施方案中，取决于载体的物理化学特征，如衣壳上的电荷，AAV载体可以通过阴离子交换、阳离子交换或疏水相互作用色谱来进一步纯化，其他方法也是可能的。

在纯化的任何阶段之前或期间，样品中重组AAV载体的量可以通过本领域已知的多种技术来定量，如通过使用定量PCR(qPCR)(其使用针对ITR或者表达盒的转基因或其他部分中的序列的引物)或使用数字液滴PCR(ddPCR)来定量，并且表示为载体基因组/单位体积(如毫升)(vg/mL)的滴度。参见，例如，Dobnik,D,et al.,Accurate Quantification andCharacterization of Adeno-Associated Viral Vectors,Front.Microbiol.,Vol.10,Art.1570,pp.1-13(2019)；Wang,Y,et al.,AqPCR Method for AAV Genome Titer withddPCR-Level of Accuracy and Precision,Mol.Ther.:Methods&Clin.Devel.,19:341-6(2020)；Werling,NJ,et al.,Systematic Comparison and Validation of QuantitativeReal-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Product,Hum.Gene Ther.Meth.26:82-92(2015)。

在纯化的任何阶段之前或期间，可以以本领域已知的多种方式确定并表示样品中重组AAV载体的纯度。例如，可以在变性聚丙烯酰胺凝胶上分析载体制备剂，并且对其进行银染色，以确定不同病毒蛋白VP1、VP2和VP3相对于细胞蛋白的比例。还可以使用不同的技术来检测完整衣壳与空衣壳相比的比例，完整衣壳的百分比越大，表明纯度越高。如本文所用，“完整衣壳”是被认为含有载体基因组的衣壳，并且“空衣壳”是被认为不含有或几乎不含有核酸的衣壳。例如，可以使用透射电子显微镜(包括cryoEM)对载体制备剂中的衣壳进行可视化，并且手动地或使用计算机化图像识别算法对完整衣壳和空衣壳的数量进行计数。可以使用分析超速离心来获得更高的分辨率，其可以辨别完整衣壳、部分完整衣壳和空衣壳。

用于按照污染空衣壳的量来估计AAV载体纯度的方便方法是测量载体制备剂(如通过尺寸排阻色谱纯化的载体制备剂)在260nm和280nm的UV光吸收率，然后计算两个波长的吸收比率(UV260/UV280比率)。通过计算特定载体的衣壳和基因组的理论消光系数，可以从UV260/UV280比率计算出其衣壳和基因组在制备剂中的相对浓度，较高的UV260/UV280值表明完整衣壳的比例更大。

关于用于测试载体纯度的方法的额外信息描述在以下文献中：Burnham B,etal.,Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinantadeno-associated viral vectors,Hum.Gene Ther.Meth.,26(6):228–242(2015)；Subramanian,S,et al.,Filling Adeno-Associated Virus Capsids:EstimatingSuccess by Cryo-Electron Microscopy,Hum.Gene Ther.,30(12):1449-60(2019)；McIntosh,NL,et al.,Comprehensive characterization and quantification of adenoassociated vectors by size exclusion chromatography and multi angle lightscattering,Nat.Sci.Reports,11:3012,pp.1-12(2021)；Sommer,JM,etal.,Quantification of Adeno-Associated Virus Particles and Empty Capsids byOptical Density Measurement,Mol.Ther.,7(1):122-8(2003)；Wu,D,et al.,RapidCharacterization of AAV gene therapy vectors by Mass Photometry,bioRxiv2021.02.18.431916(doi.org/10.1101/2021.02.18.431916)。

生物产物

本公开的用于转染的方法和系统可以用于产生可以由转染的宿主细胞合成的多种生物产物。生物产物可以由转染的核酸中所包含的遗传信息(例如，DNA质粒中的蛋白质编码序列)编码，但生物产物也可以由细胞在外源地引入的指令的指导下使用内源性遗传信息产生。例如，可以指导细胞产生其通常可能不会产生的生物产物，原因在于，通过转染引入了激活通常静止的转录程序的核酸中所包含的遗传信息，如通过转染编码转录激活因子或阻遏蛋白的质粒DNA来引入。适合于在转染到宿主细胞之后表达生物产物的载体(如质粒)的构建是本领域普通技术人员熟悉的。例如，可以将编码蛋白质或非编码RNA分子的基因在组成型或诱导型转录控制元件(例如，启动子和增强子)的控制下克隆到表达载体中，在细菌中生长至高水平，纯化，然后用于转染表达该基因的哺乳动物宿主细胞或其他类型的宿主细胞。参见，例如，Kaufman,R,Overview of Protein Expression in MammalianCells,Current Protocols in Molecular Biology,14:16.12.1-16.12.6(1991)；Hunter,M,et al.,Optimization of Protein Expression in Mammalian Cells,Curr.Protoc.Protein Sci.95(1):e77(2019)；Tripathi NK and Shrivastava A,RecentDevelopments in Bioprocessing of Recombinant Proteins:Expression Hosts andProcess Development,Front.Bioeng.Biotechnol.7:420(2019)。

本领域普通技术人员将熟悉生物产物的许多实例，并且此类产物的类型和性质不是限制性的。实例包括对疾病或病症(包括人、动物或其他生物体的疾病或病症)具有治疗和/或预防效果的生物产物，其具有工业适用性。生物产物可以由转染的宿主细胞分泌到培养基中，或可以保留在宿主细胞内，因此需要宿主细胞破碎或裂解以释放产物以用于随后的纯化。生物产物包括但不限于任何种类的肽、多肽或蛋白质，包括糖蛋白或具有本领域已知的其他类型的翻译后修饰(如脂质分子的共价添加)的蛋白质。在某些实施方案中，蛋白质可以包括标准或非标准氨基酸，可以具有野生型氨基酸序列，或是其天然存在的变体，或是被修饰或工程化以具有新颖属性的非天然变体或版本，如嵌合蛋白或融合蛋白，包括多肽或其结构域与另一具有不同功能的多肽或其结构域的融合，如与来自免疫球蛋白(例如IgG)或白蛋白的Fc区的蛋白质融合，其延长融合伴侣，例如酶(例如，凝血因子)，的血清半衰期。在其他实施方案中，蛋白质可以是单链多肽或包含多个多肽链，这些多肽链可以彼此共价地或非共价地结合。在某些实施方案中，蛋白质可以是具有治疗或预防实用性的酶或酶原((如在用于由于有害突变(如编码溶酶体酶的基因中的突变)而导致的任何酶活性缺乏症的替代疗法中使用的酶，如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶或α-L-艾杜糖醛酸酶)或工业酶；凝血因子，如因子V、因子Va、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子VIIIa、因子IX、因子IXa、因子X、因子Xa或von Willebrand因子；任何类型(例如IgG)、克隆类型(例如，单克隆抗体)或特异性类型的抗体或其抗原结合片段；或生长因子、激素或细胞因子，如ILGF-1、ILGF-2、PDGF、EGF、NGF、NF-3、NF-4、BDNF、GDGF、Epo、TGFα、TGFβ、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-2、IL-4、IL-12、GMCSF、淋巴毒素、胰岛素、胰高血糖素、甲状腺激素、促甲状腺激素、甲状旁腺激素或生长激素)。在某些实施方案中，生物产物可以是衍生自微生物(如寄生虫、真菌、细菌和病毒)或衍生自癌细胞的蛋白质或其他分子或此类蛋白质或分子的片段、区域或结构域，其用作疫苗或其组分中的抗原。在其他实施方案中，生物产物包括脂质、碳水化合物和核酸。

在其他实施方案中，生物产物可以是大型超分子复合物，如亚细胞细胞器(例如，核糖体、线粒体等)、疫苗、病毒(例如，杆状病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、疱疹病毒等)、被工程化以杀死癌细胞的经修饰的病毒(溶瘤病毒)或重组载体(包括用于基因疗法的重组载体、衍生自病毒的重组载体或使用病毒组分的重组载体)，其非限制性实例包括重组腺病毒(AdV)载体、腺相关病毒(AAV)载体(或衍生自其他类型的细小病毒的腺相关病毒(AAV)载体)或慢病毒载体(例如，衍生自HIV或其他反转录病毒的慢病毒载体)。

腺相关病毒(AAV)载体

本公开的用于转染的方法和系统可以用于在转染的宿主细胞中产生衍生自腺相关病毒(AAV)的重组载体，即腺相关病毒载体，其可以用于基因疗法以预防或治疗动物的病症和疾病，包括人的病症和疾病。此类AAV载体可以包括本领域已知的或尚待开发的多种类型的衣壳和转基因。

如本领域众所周知的，AAV是一种小型无包膜、明显非致病的病毒，其取决于某些其他病毒来提供被称为辅助因子的基因产物，该基因产物对其自身的复制至关重要，生物学的这种奇特现象使AAV非常适合用作重组载体。例如，腺病毒(AdV)可以通过在由腺病毒和AAV共同感染的细胞中提供某些腺病毒因子，如E1A、E1B55K、E2A和E4orf6蛋白以及VARNA来用作辅助病毒。已发现，AAV的许多类型感染某些动物(如哺乳动物和鸟类)和物种(如人和恒河猴)的能力受到限制，并且具有在物种内相比其他组织更容易感染某些组织(如肝脏或肌肉)的趋势，这种现象被称为组织趋向性，基于与不同的细胞表面受体的特异性结合。感染人的AAV的一种被称为AAV2的类型在生物学上得到了特别明确的表征，尽管许多其他类型已在创建基因疗法载体方面发现了实用性。

本质上，AAV基因组是一条单链DNA，在AAV2中约4.7千碱基长，其含有被称为rep和cap的两个基因。借助于来自两个启动子的转录物的选择性剪接，rep基因产生四种相关的多功能蛋白，称为Rep(AAV2中的Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)，它们参与基因组的复制和包装以及病毒基因的表达。来自控制cap基因的单个启动子的转录物的选择性剪接产生三种相关的结构蛋白，VP1、VP2和VP3，其中总共60个蛋白分别以大约1:1:10的比率自组装以形成病毒的二十面体衣壳。VP1是三种VP蛋白中最长的，并且在其氨基末端区域中含有不存在于VP2中的氨基酸，而VP2比VP3长，并且在其氨基末端区域含有不存在于VP3中的氨基酸。衣壳包围并保护AAV基因组，并且还负责与细胞表面受体的特异性结合和到细胞核的细胞内运输。

除rep和cap基因之外，完整的AAV基因组在其5'和3'端中的每一端处定位有相对短的(AAV2中为145个核苷酸)序列元件，该元件被称为反向末端重复序列(ITR)。ITR含有嵌套回文序列，其可以通过Watson-Crick碱基配对进行自退火，以形成T形或发夹二级结构。在AAV2中，ITR具有病毒生命周期所需的重要功能，其包括将单链DNA基因组转换成基因表达所需的双链形式，以及通过Rep蛋白将单链AAV基因组包装到衣壳组装体中。

在AAV2病毒粒子在细胞表面上结合其同源受体之后，病毒颗粒通过内吞作用进入细胞。在达到溶酶体的低pH时，衣壳蛋白经受构象变化，其使衣壳逃逸到胞质溶胶中，然后被转运到细胞核中。一旦到达那里，衣壳就会分解，从而释放基因组，该基因组可以被细胞DNA聚合酶作用以从3'端处的ITR开始合成第二DNA链，该链在自退火之后充当引物。然后可以开始将rep和cap基因表达到mRNA和蛋白质中，随后形成新的病毒颗粒。

AAV结构和生命周期的相对简单，以及在人中不致病的事实，激发研究者对AAV进行工程化改造并且使其适应于用作用于基因疗法的重组载体。如最初构思的，这是通过将AAV2的整个基因组(包括两个ITR)克隆到质粒中、将rep和cap基因去除到单独的质粒中，以及用基因表达盒代替它们来完成的，该基因表达盒包含与编码抗生素抗性标记物的转基因可操作地连接的异源转录控制区。在第二质粒中，包括rep和cap基因但缺少ITR的AAV2基因组代替地侧接有腺病毒末端重复序列，其可以增强rep和cap基因的表达，但既不会与AAVITRs同源地重组，也不支持将rep和cap基因包装到衣壳中。然后将这两种质粒(基因组质粒和rep/cap辅助质粒)转染到已用腺病毒感染的哺乳动物细胞中，以提供辅助因子。产生了重组AAV病毒粒子，其可以转导宿主细胞并赋予对抗生素的抗性。Samulski,RJ,et al.,Helper-Free Stocks of Recombinant Adeno-Associated Viruses:Normal IntegrationDoes Not Require Viral Gene Expression,J.Virol.63(9):3822-8(1989)；Xiao,X,etal.,Adeno-associated virus(AAV)vectors for gene transfer,Adv.DrugDeliv.Revs.12:201-15(1993)。

然而，与辅助病毒共感染被认为是不期望的，因为辅助病毒，主要是腺病毒和单纯疱疹病毒，都是已知的人类病原体。后来的研究澄清了哪些病毒辅助因子对AAV复制至关重要，使研究人员能够从转染到细胞中的单独质粒上所提供的基因中表达这些因子，并且发现可以在不依赖辅助病毒共感染的情况下有效地产生重组AAV载体。明显地，Rep、衣壳蛋白(VP1、VP2、VP3)和AdV辅助因子在细胞中表达并发挥作用，以用从含有载体基因组序列的质粒拷贝的载体基因组来组装和包装衣壳。在用不同布置的元件进行实验的情况下，当将一个质粒中所含有的用于腺病毒辅助因子的基因、第二质粒中所含有的AAV rep和cap基因和第三质粒中所含有的载体基因组转染到细胞中时(所谓的三重转染技术)，以及当将rep和cap基因以及载体基因组组合在单个质粒中时(允许仅用两个质粒转染)，研究人员成功地产生了高水平的重组AAV载体。Grimm,D,et al.,Novel tools for production ofrecombinant adenoassociated virus vectors,Hum Gene Ther 9:2745-60(1998)；Matsushita,T,et al.,Adeno-associated virus vectors can be efficientlyproduced without helper virus,Gene Ther.5:938-45(1998)；Xiao,X,et al.,Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in theabsence of helper adenovirus,J.Virol.72:2224-32(1998)。

在上文概述的用于产生载体的方案中，载体基因组中保留的唯一病毒序列是ITR，其在将基因组包装到衣壳中并在转导目标细胞之后表达转基因方面发挥关键作用。由于rep和cap基因存在于侧接有ITR的通常情况之外，因此它们不会被包装到载体中。因此，虽然载体(如病毒)能够与目标细胞结合并将其基因组输送到细胞中，但它们不能复制和创建新的载体颗粒。出于这个原因，术语“转导”通常用于指这一过程，而不是术语“感染”。

尽管已经开发了产生重组AAV载体的替代方案，如在昆虫细胞中使用杆状病毒系统，但用包含AAV载体生物合成所需的遗传信息的表达载体转染宿主细胞仍然是一种有效的方法。因此，本公开的转染方法和系统可以有效地应用于在宿主细胞中，特别是在更大规模的情况下产生任何设计的AAV载体，先前的转染方法在更大规模的情况下可能效率较低。在某些实施方案中，本公开的方法和系统可以用于用表达载体(如质粒)转染宿主细胞，该表达载体包含AAV rep基因、AAV cap基因、包含感兴趣的基因的AAV载体基因组和用于病毒辅助因子的基因。可以将前面提及的遗传信息包括在任何数量的质粒中，如含有AAV载体产生所需的所有基因的单个质粒，或其中可以以不同的组合和布置包括基因的多个质粒。在某些实施方案中，可以使用单独的质粒来容纳AAV载体产生所需的基因中的每种基因。

可以使用本领域已知的适合于在转染到宿主细胞(如哺乳动物宿主细胞，如HEK293、HeLa、A549、BHK、Vero或其他哺乳动物细胞或细胞系)中之后表达外源基因的任何质粒。如本领域已知的，质粒可以含有起源于自然界中出现的质粒的主链，其可以被修饰，如通过删除不必要的序列并添加赋予一些期望的属性的外源性序列来修饰。例如，质粒通常含有细菌复制起始点(ORI)和细菌抗生素抗性基因(例如，针对氨苄青霉素、卡那霉素等)，其允许质粒在细菌(例如，大肠杆菌(E.coli)等)中生长至非常高的拷贝数，在此之后可以将它们纯化并用于转染真核宿主细胞。示例性的非限制性质粒主链包括pUC、pBR322、pSC101、pGEM以及本领域已知的许多其他质粒主链。质粒还可以有效地含有克隆位点或多克隆位点(MCS)，其为外源性DNA序列插入到质粒中提供方便的限制性酶位点。在其他实施方案中，质粒还可以包括驱动插入在MCS中的基因的表达的启动子、终止插入在MCS中的基因的转录的转录终止子元件(例如，polyA信号序列)。在某些实施方案中，质粒可以含有病毒复制起始点，如Epstein-Barr病毒(EBV)或SV40病毒ORI，其允许在转染到分别表达EBVEBNA1或SV40大T抗原蛋白的哺乳动物细胞中之后质粒的游离型扩增。可以将许多其他元件包括在质粒中，并且可以使用本领域已知的不同方法来构建可用于在哺乳动物和其他类型的细胞中表达基因的质粒。参见，例如，Gill,DR,et al.,Progress and Prospects:Thedesign and production of plasmid vectors,Gene Ther.,16:165-71(2009)；Plasmids101:ADesktop Reference(3^rd Ed.),Addgene(2017)。

尽管质粒的使用通常便于通过转染将重组AAV载体产生所需的遗传元件引入到宿主细胞中，但也可以使用其他类型的DNA表达载体，非限制性实例是微环DNA和被称为Doggybone DNA的共价闭合线性DNA构建体。参见，例如，Gill,DR,et al.,Progress andProspects:The design and production of plasmid vectors,Gene Ther.,16:165-71(2009)；Scott,VL,et al.,Novel synthetic plasmid and Doggybone^TMDNA vaccinesinduce neutralizing antibodies and provide protection from lethal influenzachallenge in mice,Human Vaccines&Immunotherapeutics,11(8):1972-82(205),DOI:10.1080/21645515.2015.1022008。

在某些实施方案中，三重质粒格式(如上文描述的三重质粒格式)可以与本公开的用于转染的方法和系统结合使用。在此类实施方案中，第一质粒可以含有AAV血清型或变体(如AAV2或其他变体)的基因组，其包括rep和cap基因(rep/cap质粒)并且不包括病毒ITR序列；第二质粒可以含有载体基因组序列，其在5’和3’处侧接有AAV ITR(载体质粒)；并且第三质粒可以含有用于表达病毒辅助因子的基因(辅助质粒)。在rep/cap质粒中，除ITR序列的删除之外，可以在没有修饰的情况下包括AAV基因组。在该实施方案中，rep和cap基因可以从它们的天然启动子表达。然而，在其他实施方案中，特别是当期望表达来自不同AAV病毒的rep和cap基因(例如，来自AAV2的Rep和来自不同血清型或变体的cap基因)时，可以将rep和cap基因的编码序列作为由天然启动子或异源启动子控制的单独的转录单元包括在质粒中。例如，可以将rep基因包括在由其天然启动子(在AAV2的情况下为p5和p19)控制的rep/cap质粒中，而cap基因可以由宿主细胞中的组成型活性启动子而不是其天然启动子控制。可以将不同的转录单元插入到rep/cap质粒中，使得它们在相同的方向或不同的方向上转录。可以以本领域已知的任何方式对存在于天然AAV基因组序列中的启动子序列、翻译起始位点和RNA剪接位点进行修饰，以调节从Rep/Cap质粒表达的不同Rep和Cap蛋白的比例。如所指出的，rep和cap基因可以来源于相同类型的AAV，如AAV2，其他相同类型也是可能的，或rep和cap基因可以来源于不同类型的AAV。在某些实施方案中，使用来自AAV2的rep基因，并且cap基因选自除AAV2之外的AAV类型。与rep和cap基因一样，可以将用于表达病毒辅助因子的序列包括在辅助质粒中，因为它们存在于衍生出它们的病毒的基因组中，或代替地可以将它们作为由天然或异源启动子控制的单独的转录单元来包括，并且以任何合适的布置或方向插入到辅助质粒中，或可以作为单独的转录单元包括在单独的质粒上。

尽管经常使用三重转染方法，但它不是唯一可能的方法，并且在其他实施方案中，可以将产生重组AAV载体所需的元件包括在更少或更多的质粒上。例如，在某些实施方案中，可以将AAV rep和cap基因以及用于表达病毒辅助因子的序列都包括在一个质粒上，而将载体基因组提供在第二质粒上。在双质粒方法的另一实施方案中，可以将AAV rep和cap基因以及载体基因组的序列包括在一个质粒上，并且可以将用于表达病毒辅助因子的序列包括在第二质粒上。在又另一方案中，可以使用四种质粒，一种含有载体基因组的序列，第二种含有用于表达病毒辅助因子的序列，第三种含有AAV rep基因，并且第四种含有由异源启动子控制的AAV cap基因。其他配置和布置也是可能的，如本领域普通技术人员将理解的。在某些实施方案中，可以将不同的质粒在不同的细菌培养中复制至高拷贝数，纯化，然后以任何期望的化学计量比组合以转染宿主细胞并产生AAV载体。

本领域已知的能有效地产生重组AAV载体的任何病毒辅助因子都可以与本公开的方法和系统结合使用。在某些实施方案中，辅助病毒是HSV-1，并且示例性辅助因子包括HSV-1基因产物UL5、UL8、UL52和ICP8。在其他实施方案中，辅助病毒是腺病毒5，并且示例性辅助因子包括AdV5基因产物E1A，E1B55K、E2A、E4orf6和VA RNA。

在其他实施方案中，辅助病毒是HPV-16，并且示例性辅助因子包括HPV-16基因产物E1、E2和E6。并且在其他实施方案中，辅助病毒是HBoV1，并且示例性辅助因子包括HBoV1基因产物NS2、NS4、NP1和BocaSR。关于此类辅助因子的更多信息可以见于例如Meier,AF,etal.,The Interplay between Adeno-Associated Virus and Its Helper Viruses,Viruses 12:662(2020),doi:10.3390/v12060662。在某些实施方案中，重组AAV载体的产生可以使用组成型地表达一种或多种病毒辅助因子的宿主细胞来进行，在这种情况下，可能没有必要通过转染提供所有必需的辅助因子。因此，例如，已知HEK293细胞组成型地表达腺病毒辅助因子E1A和E1B，使得一个或多个辅助质粒只需要含有用于表达必需的病毒辅助因子E2A、E4orf6和VA RNA的序列。虽然通常期望从转染到宿主细胞中的质粒或其他表达载体表达病毒辅助因子，但使用与辅助病毒(如AdV5或其他辅助病毒)的共感染来产生重组AAV载体并不排除与本公开的方法和系统的使用结合。

在某些实施方案中，本公开的方法和系统可以与稳定地表达产生重组AAV载体所需的一些元件的细胞系结合使用，否则这些元件需要通过转染来提供。例如，包装细胞系含有稳定整合的AAV rep和cap基因，并且在此类细胞中产生载体需要用含有AAV载体基因组的质粒瞬时地转染它们，以及用辅助病毒感染。包装细胞还描述在例如Clement,N and JCGrieger,Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors forclinical trials,Mol.Ther.Meth.&Clin.Dev.(2016)3,16002(doi:10.1038/mtm.2016.2)中。

与本公开的用于转染的方法和系统的使用结合而产生的重组AAV载体可以包括适合于预期用途(如在基因疗法中的用途)的任何序列、结构、功能性子元件布置和配置的AAV载体基因组内的任何感兴趣的基因。由于AAV载体通常是设计的，因此感兴趣的基因的选择仅受衣壳的包装能力限制，使得当基因与载体功能所需的基因组中的所有其他元件(如转录控制区和ITR)组合时，在AAV2的情况下，基因的长度不超过大约5千碱基，尽管已经开发了超过包装极限的实验策略。

出于基因疗法的目的，感兴趣的基因可以是任何基因，其产物将被理解为预防或治疗但不一定治愈任何疾病或病况。在某些实施方案中，基因疗法旨在预防或治疗以由天然存在的基因产生的产物的异常低量甚至不存在为特征的疾病或病况，如可能由于功能丢失突变而发生的疾病或病况。关于此类实施方案，感兴趣的基因可以是旨在通过在表达时提供相同或相似的基因产物来补偿缺陷基因的基因。非限制性实例是被设计以表达凝血因子IX的功能性版本的载体，该功能性版本用于由天然凝血因子IX基因的功能丢失突变引起的血友病B的基因疗法。然而，在其他实施方案中，感兴趣的基因可以是旨在抵消目标细胞中有害的功能获得突变的影响的基因。在某些实施方案中，感兴趣的基因可以编码转录激活因子以增加产生期望的基因产物的内源性基因的活性，或相反地，编码转录阻遏因子以降低产生不期望的基因产物的内源性基因的活性。在某些实施方案中，感兴趣的基因可以编码蛋白质(通过信使RNA来编码)(包括之前部分中描述的作为可以由转染的细胞产生的生物产物的实例的此类蛋白质)或具有不同于编码蛋白质的功能的RNA分子，如反义RNA或调控性非编码RNA分子，如微RNA(miRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、piwi作用RNA、增强子RNA或长非编码RNA。感兴趣的基因中的蛋白质编码序列可以是密码子优化的，并且翻译起始位点(例如，Kozak序列或非共识起始位点)可以被修饰以增加或减少其启动翻译的趋势。在某些实施方案中，借助于使用替代启动子、替代翻译起始位点和/或替代剪接位点，感兴趣的基因可以编码多于一个开放阅读框(并且因此产生具有不同序列的多肽)。在其他实施方案中，载体基因组可以包含多于一个感兴趣的基因，每个基因都是其自身单独的转录单元的一部分。在某些实施方案中，感兴趣的基因的产物保留在其中表达其的细胞内，和/或从其中表达以在生物体中的其他地方起作用的细胞分泌出来。

除感兴趣的基因之外，与转导的目标细胞中的感兴趣的基因可操作地连接并控制其转录的转录控制区也可以根据载体的预期用途进行设计选择和优化。在某些实施方案中，转录控制区包含用于募集RNA聚合酶转录复合物的启动子，以及任选的一个或多个增强子元件，其可以起到增加转录速率的作用。

转录控制区可以是组成型活性的，这意指它们能够在许多不同的细胞类型中表达转基因。实例包括来自某些病毒的控制区，如CMV IE启动子/增强子、RSV启动子/增强子或SV40启动子，或来自在大多数真核细胞中具有活性的看家基因的控制区，如二氢叶酸还原酶基因启动子、细胞质β-肌动蛋白基因启动子或磷酸甘油激酶(PGK)基因启动子，许多其他控制区也是已知的。在其他实施方案中，转录控制区可以是组织特异性的，这意指它们仅主要或至少优先地在特定类型的细胞(如肝、肌肉或神经元细胞)中具有活性。在其他实施方案中，转录控制区可以是可诱导的，这意指在不存在某些环境条件(如升高的温度或缺氧)的情况下它们是无活性的或仅是最低活性的，或除非存在某些化学物质或化合物，例如药物(例如，抗生素)或毒素(例如，重金属)，否则它们是无活性的或仅是最低活性的。

转录控制区可以包含与天然存在于基因中的核苷酸序列相同的核苷酸序列，或可以被修饰以通过相对于发现于自然界的序列改变、添加或去除核苷酸来改善其功能和/或减少其长度，或甚至可以是完全合成的。转录控制区可以衍生自与转基因相同的基因(同源)。可替代地，转录控制区可以衍生自与衍生出转基因的基因完全不同的基因(异源)。转录控制区可以通过包括来自一种类型基因的启动子并将其与来自一个或多个不同基因(包括来自不同物种的基因)的一个或多个增强子结合而是杂交的。如载体基因组中所布置的，增强子元件可以与启动子邻接或相邻，或代替地可以定位在启动子的上游或下游的一段距离处。在某些实施方案中，可以将通常在原生背景中以单个拷贝形式存在的增强子元件提供在多个拷贝中。

除感兴趣的基因和转录控制区之外，AAV载体基因组的许多其他方面也可以根据载体的预期用途进行设计选择和优化。在某些实施方案中，载体基因组还可以包含来自基因的5’和/或3’端的未翻译区、额外的终止密码子、非编码外显子、内含子、填充物和填料序列、转录终止信号(例如，polyA信号序列)、稳定RNA转录物的元件、剪接供体和受体位点、lox位点、调控性miRNA的结合位点、增强mRNA的核输出的元件(如土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE))，以及根据经验显示出可以改善感兴趣的基因的表达的任何其他元件，即使机制可能是不确定的。

在某些实施方案中，载体基因组可以被设计以用于编辑或以其他方式修饰目标细胞的基因组的目的。例如，载体基因组可以包括侧接有同源臂的感兴趣的基因，该同源臂旨在促进载体基因组和目标细胞基因组之间的同源重组。在另一实例中，载体基因组可以被设计以通过表达能够结合gRNA并切割gRNA靶向的DNA序列的引导RNA(gRNA)和/或核酸内切酶(如Cas9或相关的核酸内切酶，如SaCas9)来进行CRISPR基因编辑。本领域已知的用于基因组编辑的其他策略也可以通过AAV载体来实施，如工程化锌指核酸酶的表达。

本领域已知的，通常用于AAV载体的ITR来源于AAV2，但也可以使用衍生自其他血清型和天然存在的AAV分离株的ITR，或杂交的甚至完全合成的ITR。在某些非限制性实施方案中，载体基因组包括两个完整的ITR，一个在单链DNA基因组的每一端处。然而，在其他实施方案中，AAV载体可以被产生成使得缺少末端分解位点的突变第三ITR定位在基因组的中心处或附近。这些所谓的自互补AAV(scAAV)基因组可以在衣壳脱壳之后自退火成双链形式，从而允许基因表达立即进行而不需要第二链合成，如传统单链AAV基因组的情况一样。来源于一种类型的AAV的ITR可以用于其中衣壳来源于相同类型的AAV或不同类型的AAV的载体(其被称为假型载体)。例如，AAV2 ITR可以用于由AAV2衣壳或AAV5衣壳(被命名为AAV2/5的假型载体)或来自除AAV2之外的AAV的某个其他衣壳包壳的基因组。

正如载体基因组的设计有很大的自由度一样，AAV载体可以使用许多不同的天然存在和经修饰的AAV衣壳来制造。曾经，从生物样品中仅分离出灵长类动物AAV的六种类型(AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5和AAV6)，其中前五种在结构上十分不同，可以基于抗体交叉反应度实验被分类为不同的血清型。后来，通过使用靶向先前发现的AAV的cap基因中的高度保守区的引物对来自恒河猴的DNA进行PCR扩增，发现了两种新颖的AAV，其被称为AAV7和AAV8。Gao,G,et al.,Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys asvectors for human gene therapy,PNAS(USA)99(18):11854–11859(2002)。随后，使用相似的方案从人和非人长类动物组织中克隆了许多新颖的AAV，极大地扩展了已知AAV cap蛋白序列的范围。Gao,G,et al.,Clades of Adeno-Associated Viruses Are WidelyDisseminated in Human Tissues,J Virol.78(12):6381–6388(2004)。许多AAV cap蛋白序列彼此高度相似，或与先前鉴定的AAV高度相似，并且虽然衣壳通常被称为不同的AAV“血清型”，但如果通过抗体交叉反应度进行测试，则并非所有此类衣壳都必然预期会是免疫地可区分的。

研究已确认，不同的AAV衣壳具有不同的组织趋向性以及其他属性，这些其他属性可能使一种衣壳在特定应用中比另一种更可取。例如，取决于正在被测试的群体，人可能由于暴露于天然存在的AAV而具有高的中和抗体滴度，这可能会干扰具有相同或相似的衣壳的AAV载体转导目标细胞的能力。因此，在设计用于基因疗法的载体时，在一些情况下，衣壳的选择可以由衣壳的免疫原性和/或待治疗患者的血清阳性率来引导。

可以从使用本公开的方法和系统转染的细胞产生的AAV载体可以包括本领域已知的适合于预期用途(如在基因疗法中的用途)的任何衣壳。此类衣壳包括来自天然存在的AAV的衣壳，以及经修饰或工程化的衣壳。例如，天然存在的衣壳可以通过在cap蛋白序列中插入肽或进行氨基酸取代来修饰，该序列旨在以某种方式改善衣壳功能，如组织趋向性、免疫原性、稳定性或可制造性。其他实例包括通过将氨基酸或结构域从一种已知衣壳交换到另一已知衣壳(其有时被称为镶嵌或嵌合衣壳)而产生的具有改进属性的新颖衣壳，或采用DNA改组和定向进化方法生成和选择的新颖衣壳。在某些示例性的非限制性实施方案中，由转染的宿主细胞产生的AAV载体可以包括以下衣壳中的任何一种：AAV1、AAV2、AAV3、AAB3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-DJ/9、AAV-LK03、AAV-PHP.B、AAV-Anc80、AAV2.5、AAV2i8、AAVHSC1、AAVHSC2、AAVHSC3、AAVHSC4、AAVHSC5、AAVHSC6、AAVHSC7、AAVHSC8、AAVHSC9、AAVHSC10、AAVHSC11、AAVHSC12、AAVHSC13、AAVHSC14、AAVHSC15、AAVHSC16、AAVHSC17、RHM4-1、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAV-NP22、AAV-NP66、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.61、AAV8G9、AAV-TT或AAVhu.37，其他许多衣壳也是可能的。参见例如但不限于描述在WO 2015/121501和WO 2017/023724中的AAV衣壳蛋白)。

在某些实施方案中，使用本公开的用于转染的方法和系统能有效地产生高滴度和高纯度的重组AAV载体。在某些实施方案中，通过使用本公开的方法和系统的转染产生的重组AAV载体的纯化制备剂的滴度可以被计算为至少或约1x10⁹、1x10¹⁰、1x10¹¹、1.5x10¹¹、2x10¹¹、2.5x10¹¹、3x10¹¹、3.5x10¹¹、4x10¹¹、4.5x10¹¹、5x10¹¹、5.5x10¹¹、6x10¹¹、6.5x10¹¹、7x10¹¹、7.5x10¹¹、8x10¹¹、8.5x10¹¹、9x10¹¹、9.5x10¹¹、1x10¹²、1.25x10¹²、1.5x10¹²、1.75x10¹²、2x10¹²、2.25x10¹²、2.5x10¹²、3x10¹²、3.5x10¹²、4x10¹²、4.5x10¹²、5x10¹²、5.5x10¹²、6x10¹²、6.5x10¹²、7x10¹²、7.5x10¹²、8x10¹²、8.5x10¹²、9x10¹²、9.5x10¹²或1x10¹³个载体基因组/毫升(vg/mL)转染后细胞悬浮液或更大，或任何前述具体枚举的值之间的滴度，或包含任何前述具体枚举的值的范围。在某些实施方案中，通过使用本公开的方法和系统的转染产生的重组AAV载体的纯化制备剂的A260/A280比率可以为至少或约0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.00、1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.10、1.11、1.12、1.13、1.14、1.15、1.16、1.17、1.18、1.19、1.20、1.21、1.22、1.23、1.24、1.25、1.26、1.27、1.28、1.29、1.30、1.31、1.32、1.33、1.34、1.35、1.36、1.37、1.38、1.39、1.40、1.41、1.42、1.43、1.44、1.45、1.46、1.47、1.48、1.49、1.50、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.60、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.70、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79或1.80或更大，或任何前述具体枚举的值之间的A260/A280比率，或包含任何前述具体枚举的值的范围。在其他实施方案中，通过使用本公开的方法和系统的转染产生的重组AAV载体的纯化制备剂的纯度可以表示为载体制备剂中完整衣壳的百分比，其可以为至少或约20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大，或任何前述具体枚举的值之间的完整衣壳的任何百分比，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

在本公开的用于转染的方法和系统的某些实施方案中，其中三种质粒用于产生重组AAV载体，该三种类型的质粒可以以相等的摩尔比或不相等的摩尔比用于转染。因此，例如，在非限制性实施方案中，核酸溶液或转染混合体中第一、第二和第三类型质粒的摩尔比可以为约1:1:1、1:1:2、1:1:3、1:2:1、1:2:2、1:2:3、1:3:1、1:3:2、1:3:3、2:1:1、2:1:2、2:1:3、2:2:1、2:2:2、2:2:3、2:3:1、2:3:2、2:3:3、3:1:1、3:1:2、3:1:3、3:2:1、3:2:2、3:2:3、3:3:1、3:3:2、3:3:3、1:2:2、1:2:3或1:3:3，其中第一、第二或第三值的偏差不超过±30％、±20％，±10％或±5％。在某些实施方案中，第一类型质粒包含AAV rep和cap基因，第二类型质粒包含用于表达病毒辅助因子的序列，并且第三类型质粒包含AAV载体基因组的序列。在任何这些实施方案中，宿主细胞可以是HEK293细胞或其衍生物或其他细胞，并且AAV载体可以包含AAV9衣壳或另一衣壳。

在某些实施方案中，本公开的用于连续转染宿主细胞的方法和系统可以用于或被配置为大规模高效地产生重组AAV载体。因此，例如，在某些实施方案中，培养中的宿主细胞(如HEK293细胞及其衍生物)的体积(转染前)为至少或约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000或10000L或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围，该值可以被转染以产生重组AAV载体。在任何这些实施方案中，宿主细胞可以是HEK293细胞或其衍生物或其他细胞，并且AAV载体可以包含AAV9衣壳或另一衣壳。

在某些实施方案中，本公开的用于连续转染细胞的方法和系统可以用于或被配置为通过用转染混合体转染宿主细胞来大规模(例如，转染前细胞培养体积为至少或约100L、500L、1000L、2000L、5000L或更大)高效地产生AAV载体，该转染混合体已孵育小于或约25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3分钟或更短时间，如小于或约175、170、165、160、155、150、145、140、135、130、125、120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35或30秒或更短时间，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。例如，在某些实施方案中，孵育时间可以为约30至180秒、30至150秒、30到135秒、45至135秒、60至135秒或90至135秒，如约135秒。在任何这些实施方案中，宿主细胞可以是HEK293细胞或其衍生物或其他细胞，并且AAV载体可以包含AAV9衣壳或另一衣壳。

在某些实施方案中，本公开的用于连续转染细胞的方法和系统可以用于或被配置为通过用预定体积的转染混合体(如基本上整个体积的转染混合体)转染宿主细胞来大规模(例如，转染前细胞培养体积为至少或约100L、500L、1000L、2000L、5000L或更大)高效地产生AAV载体，该预定体积的转染混合体在如下时间内被添加到培养中的细胞中：小于或约90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15或10分钟或更短时间，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。在某些实施方案中，添加时间可以为约10至60分钟、10至30分钟、15至60分钟，15至30分钟或30至60分钟。在任何这些实施方案中，宿主细胞可以是HEK293细胞或其衍生物或其他细胞，并且AAV载体可以包含AAV9衣壳或另一衣壳。

在某些实施方案中，本公开的用于连续转染细胞的方法和系统可以被配置成使得可以大规模(例如，转染前细胞培养体积为至少或约100L、500L、1000L、2000L、5000L或更大)产生AAV载体，同时系统内转染混合体的流动不超过以下的雷诺数(Re)值：5500、5000、4500、4000、3500、3400、3300、3200、3100、3000、2900、2800、2700、2600、2500、2400、2300、2200、2000、1000或500或更小，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。在某些实施方案中，本公开的用于连续转染细胞的方法和系统可以被使用或配置成使得可以在至少1000L的细胞培养体积中产生AAV载体，同时系统内转染混合体的流动不超过3500或4000的雷诺数(Re)值。在任何这些实施方案中，宿主细胞可以是HEK293细胞或其衍生物或其他细胞，并且AAV载体可以包含AAV9衣壳或另一衣壳。

在某些实施方案中，本公开的用于连续转染细胞的方法和系统可以用于或被配置为通过用包含PEI和质粒DNA的转染混合体转染宿主细胞来大规模(例如，转染前细胞培养体积为至少或约100L、500L、1000L、2000L、5000L或更大)高效地产生AAV载体。在这些实施方案中的某些中，使用足够的pDNA来制备转染混合体，使得以以下值或范围转染细胞：至少或约0.1、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10μg/1x10⁶个活细胞或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围，如约0.1至10μg/1x10⁶个活细胞、0.25至1.5μg pDNA/10⁶个活细胞、0.25至7.5μg/1x10⁶个活细胞、0.5至5μg/1x10⁶个活细胞、0.5至2.5μg/1x10⁶个活细胞、0.5至1.0μg pDNA/10⁶个活细胞、0.5至0.75μg pDNA/10⁶个活细胞，如大于0.25μgpDNA/10⁶个活细胞或约0.5μg pDNA/10⁶个活细胞或约0.75μg pDNA/10⁶个活细胞。在这些实施方案中的某些中，使用足够的PEI来制备转染混合体，使得PEI与pDNA的质量比为至少或约0.1、0.5、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、5、6、7、8、9或10，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围，例如约1.4至3.0、1.8至2.6、2.0至2.4，或约2.2。在这些实施方案的某些中，制备含有足够的pDNA和足够的PEI的转染混合体，使得以约0.75μg pDNA/10⁶个活细胞转染细胞，并且使得PEI与pDNA的质量比为约2.2。在任何这些实施方案中，PEI可以是线性PEI，如线性完全去丙酰化PEI，如40kDa线性完全去丙酰化PEI。在任何这些实施方案中，宿主细胞可以是HEK293细胞或其衍生物或其他细胞，并且AAV载体可以包含AAV9衣壳或另一衣壳。

在某些实施方案中，本公开的用于连续转染细胞的方法和系统可以用于或被配置为通过用转染混合体转染宿主细胞来大规模(例如，转染前细胞培养体积为至少或约100L、500L、1000L、2000L、5000L或更大)高效地产生AAV载体，该转染混合体从包含PEI的转染试剂溶液和包含质粒DNA的核酸溶液制备，其中该转染试剂溶液中的PEI浓度(w/v)在从约5％至45％、10％至30％、10％至40％、15％至35％、15％至30％、15％至25％、15％至20％的范围内，或约18％或10.4％、18.2％或41.7％，并且其中该核酸溶液中的pDNA浓度(w/v)在从约2％至20％、4％至18％、5％至15％、6％至16％、6％至14％、6％至12％、6％至10％、6％至8％、7％至8％的范围内，或约8％或4.4％、7.7％或17.7％。在任何这些实施方案中，可以将等体积的含有PEI的溶液和含有pDNA的溶液组合以形成转染混合体。在任何这些实施方案中，可以将PEI和pDNA溶解或稀释在任选地补充有10mM Glutamax和0.2％Pluronic F-68的F17培养基中。在任何这些实施方案中，宿主细胞可以是HEK293细胞或其衍生物或其他细胞，并且AAV载体可以包含AAV9衣壳或另一衣壳。

在某些实施方案中，本公开的用于连续转染细胞的方法和系统可以用于或被配置为通过用转染混合体转染宿主细胞来大规模(例如，转染前细胞培养体积为至少或约100L、500L、1000L、2000L、5000L或更大)高效地产生AAV载体，该转染混合体的量为转染前细胞培养体积或质量的至少或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40％或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围，例如约10％至60％、15％至55％、20％至50％、25％至45％、30％至40％、30％至38％、30％至36％、31％至34％、32％至33％，或转染前细胞培养体积或质量的约33％、14.26％、32.65％或57.21％。在任何这些实施方案中，宿主细胞可以是HEK293细胞或其衍生物或其他细胞，并且AAV载体可以包含AAV9衣壳或另一衣壳。

在某些实施方案中，本公开的用于连续转染细胞的方法和系统可以用于或被配置为通过大规模(例如，转染前细胞培养体积为至少或约100L、500L、1000L、2000L、5000L或更大)转染宿主细胞并在转染时以以下的高密度(活细胞/毫升(vc/mL)培养物)转染宿主细胞来产生AAV载体：至少或约1x10⁶、2x10⁶、3x10⁶、4x10⁶、5x10⁶、6x10⁶、7x10⁶、8x10⁶、9x10⁶、10x10⁶、11x10⁶、12x10⁶、13x10⁶、14x10⁶、15x10⁶、16x10⁶、17x10⁶、18x10⁶、19x10⁶、20x10⁶、21x10⁶、22x10⁶、23x10⁶、24x10⁶、25x10⁶、26x10⁶、27x10⁶、28x10⁶、29x10⁶、30x10⁶、35x10⁶、40x10⁶、45x10⁶或50x10⁶vc/mL或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围，例如约10x10⁶至30x10⁶vc/mL、15x10⁶至25x10⁶vc/mL或16x10⁶至24x10⁶vc/mL，或约18x10⁶±0.2vc/mL。在任何这些实施方案中，宿主细胞可以是HEK293细胞或其衍生物或其他细胞，并且AAV载体可以包含AAV9衣壳或另一衣壳。

在某些实施方案中，本公开的用于连续转染细胞的方法和系统可以用于或被配置为通过大规模(例如，转染前细胞培养体积为至少或约100L、500L、1000L、2000L、5000L或更大)转染宿主细胞来产生高滴度的AAV载体。AAV载体滴度可以使用本领域已知的任何方法来确定，其实施方案包括检测AAVITR序列、转基因序列或独特地存在于AAV载体基因组中的某个其他序列的定量PCR测定。因此，在某些实施方案中，AAV载体既可以大规模产生，也可以以以下的滴度(载体基因组(或基因组拷贝)/mL转染后培养中的细胞)产生：至少约1x10⁹、1x10¹⁰、1x10¹¹、1.5x10¹¹、2x10¹¹、2.5x10¹¹、3x10¹¹、3.5x10¹¹、4x10¹¹、4.5x10¹¹、5x10¹¹、5.5x10¹¹、6x10¹¹、6.5x10¹¹、7x10¹¹、7.5x10¹¹、8x10¹¹、8.5x10¹¹、9x10¹¹、9.5x10¹¹、1x10¹²、1.25x10¹²、1.5x10¹²、1.75x10¹²、2x10¹²、2.25x10¹²、2.5x10¹²、3x10¹²、3.5x10¹²、4x10¹²、4.5x10¹²、5x10¹²、5.5x10¹²、6x10¹²、6.5x10¹²、7x10¹²、7.5x10¹²、8x10¹²、8.5x10¹²、9x10¹²、9.5x10¹²或1x10¹³vg/mL细胞或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。在任何这些实施方案中，宿主细胞可以是HEK293细胞或其衍生物或其他细胞，并且AAV载体可以包含AAV9衣壳或另一衣壳。

在某些实施方案中，本公开的用于连续转染细胞的方法和系统可以用于或被配置为通过大规模(例如，转染前细胞培养体积为至少或约100L、500L、1000L、2000L、5000L或更大)转染宿主细胞来产生具有高比例的完整衣壳(即，含有完整基因组的衣壳)的AAV载体(或反过来说，仅部分完整衣壳的比例较低)。完整衣壳的比例可以使用本领域已知的任何方法来估计，其实施方案包括纯化AAV载体(如通过尺寸排阻色谱来纯化)，测量260nm和280nm两个波长处的UV吸光度(例如，用分光光度计测量)，然后计算A260/A280值。因此，在某些实施方案中，AAV载体既可以大规模生产，也可以以具有以下的A260/A280值的纯化形式产生：至少约0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.00、1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.10、1.11、1.12、1.13、1.14、1.15、1.16、1.17、1.18、1.19、1.20、1.21、1.22、1.23、1.24、1.25、1.26、1.27、1.28、1.29、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。使用本领域普通技术人员熟悉的其他方法，可以测量仅部分全载体的百分比(在期望较低值的情况下)。因此，在某些实施方案中，AAV载体既可以大规模产生，也可以以其中非完整衣壳的百分比为以下值或范围的纯化形式产生：小于或约60％、55％、50％、45％、40％、35％、25％、20％、15％、10％或5％或更小，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。在任何这些实施方案中，宿主细胞可以是HEK293细胞或其衍生物或其他细胞，并且AAV载体可以包含AAV9衣壳或另一衣壳。

在某些实施方案中，本公开的用于连续转染细胞的方法和系统可以用于或被配置为以以下的滴度大规模(例如，转染前细胞培养体积为至少或约100L、500L、1000L、2000L、5000L或更大)产生AAV载体：至少约1x10⁹、1x10¹⁰、1x10¹¹、1.5x10¹¹、2x10¹¹、2.5x10¹¹、3x10¹¹、3.5x10¹¹、4x10¹¹、4.5x10¹¹、5x10¹¹、5.5x10¹¹、6x10¹¹、6.5x10¹¹、7x10¹¹、7.5x10¹¹、8x10¹¹、8.5x10¹¹、9x10¹¹、9.5x10¹¹、1x10¹²、1.25x10¹²、1.5x10¹²、1.75x10¹²、2x10¹²、2.25x10¹²、2.5x10¹²、3x10¹²、3.5x10¹²、4x10¹²、4.5x10¹²、5x10¹²、5.5x10¹²、6x10¹²、6.5x10¹²、7x10¹²、7.5x10¹²、8x10¹²、8.5x10¹²、9x10¹²、9.5x10¹²或1x10¹³ vg/mL转染后细胞或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围，并且以具有以下的A260/A280值的纯化形式产生：至少约0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.00、1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.10、1.11、1.12、1.13、1.14、1.15、1.16、1.17、1.18、1.19、1.20、1.21、1.22、1.23、1.24、1.25、1.26、1.27、1.28、1.29、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。在任何这些实施方案中，宿主细胞可以是HEK293细胞或其衍生物或其他细胞，并且AAV载体可以包含AAV9衣壳或另一衣壳。

在某些实施方案中，本公开的用于连续转染细胞的方法和系统可以用于或被配置为以以下的滴度大规模(例如，转染前细胞培养体积为至少或约100L、500L、1000L、2000L、5000L或更大)产生AAV载体：至少约1x10⁹、1x10¹⁰、1x10¹¹、1.5x10¹¹、2x10¹¹、2.5x10¹¹、3x10¹¹、3.5x10¹¹、4x10¹¹、4.5x10¹¹、5x10¹¹、5.5x10¹¹、6x10¹¹、6.5x10¹¹、7x10¹¹、7.5x10¹¹、8x10¹¹、8.5x10¹¹、9x10¹¹、9.5x10¹¹、1x10¹²、1.25x10¹²、1.5x10¹²、1.75x10¹²、2x10¹²、2.25x10¹²、2.5x10¹²、3x10¹²、3.5x10¹²、4x10¹²、4.5x10¹²、5x10¹²、5.5x10¹²、6x10¹²、6.5x10¹²、7x10¹²、7.5x10¹²、8x10¹²、8.5x10¹²、9x10¹²、9.5x10¹²或1x10¹³ vg/mL转染后细胞或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围，并且以其中非完整衣壳的百分比为以下值或范围的纯化形式产生：小于或约60％、55％、50％、45％、40％、35％、25％、20％、15％、10％或5％或更小，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。在某些实施方案中，宿主细胞是HEK293细胞或其衍生物或其他细胞，并且AAV载体可以包含AAV9衣壳或另一衣壳。

在某些实施方案中，本公开的用于连续转染细胞的方法和系统可以用于或被配置为大规模(例如，转染前细胞培养体积为至少或约100L、500L、1000L、2000L、5000L或更大)并且以以下的活细胞密度产生AAV载体：至少或约10x10⁶、15x10⁶、20x10⁶、25x10⁶、30x10⁶、40x10⁶或50x10⁶ vc/mL，或包含任何前述具体枚举的值的范围，例如约10x10⁶至30x10⁶ vc/mL、15x10⁶至25x10⁶ vc/mL或16x10⁶至24x10⁶ vc/mL，其中用孵育25、20、15、10、5、4、3、2或1分钟或更短时间的转染混合体转染细胞，其中在90、80、70、60、50、40、30、20、10或5分钟或更短时间内将体积(或质量)为转染前细胞培养体积(或质量)的至少10％、20％或30％的转染混合体添加到细胞中，并且其中与转染混合体的流动相关的雷诺数Re不超过3500或4000的值。在任何这些实施方案中，转染试剂可以是PEI，并且核酸可以是质粒DNA，并且可以使用足够量的PEI和pDNA来制备转染混合体，使得以大于0.25μg pDNA/10⁶个活细胞转染细胞，并且PEI与pDNA的质量比为至少1。在任何这些实施方案中，使用本公开的用于转染的方法或系统可以有效地产生滴度为以下的重组AAV载体：至少1x10⁹、1x10¹⁰、1x10¹¹、2x10¹¹、3x10¹¹、4x10¹¹、5x10¹¹、6x10¹¹、7x10¹¹、8x10¹¹、9x10¹¹或1x10¹² vg/mL转染后细胞，并且当纯化时，A260/A280比率为至少1.0。在任何这些实施方案中，宿主细胞可以是HEK293细胞或其衍生物或其他细胞，并且AAV载体可以包含AAV9衣壳或另一衣壳。

在某些实施方案中，本公开的用于连续转染细胞的方法和系统可以用于或被配置为通过用转染混合体在至少1000L的培养体积(转染前)中以约18x10⁶ vc/mL的活细胞密度转染宿主细胞来产生AAV载体，该转染混合体在添加到细胞中之前孵育约135秒，并且含有足够的质粒DNA，使得以约0.75μg DNA/10⁶个活细胞转染细胞，并且含有足够的PEI，使得PEI与pDNA的质量比为约2.2。在这些实施方案中的某些中，用于连续转染的系统被配置成使得系统内转染混合体流动的雷诺数值小于4000或3500。在这些实施方案中的某些中，用于转染的混合体的总体积为转染前细胞体积的约33％。在这些实施方案中的某些中，将等体积的含有浓度为约18-19％(w/v)的PEI的溶液和含有浓度为约7-8％(w/v)的质粒DNA的溶液混合以形成转染混合体。在这些实施方案中的某些中，将基本上整个体积的转染混合体添加到细胞中的添加时间为约30分钟。在任何这些实施方案中，PEI可以是线性PEI，如线性完全去丙酰化PEI，如40kDa线性完全去丙酰化PEI。在任何这些实施方案中，可以将PEI和pDNA溶解或稀释在任选地补充有10mM Glutamax和0.2％Pluronic F-68的F17培养基中。在任何这些实施方案中，DNA可以包括三种不同类型的质粒，一种含有用于表达病毒辅助因子的序列，一种含有AAV rep和cap基因，并且一种含有包含治疗性转基因的AAV载体基因组。在任何这些实施方案中，使用该方法或系统能有效地产生滴度为以下的AAV载体：至少1x10⁹、1x10¹⁰、1x10¹¹、2x10¹¹、3x10¹¹、4x10¹¹、5x10¹¹、6x10¹¹、7x10¹¹、8x10¹¹、9x10¹¹或1x10¹²vg/mL转染后细胞，并且当纯化时，A260/A280比率为至少1.0。在任何这些实施方案中，宿主细胞可以是HEK293细胞或其衍生物或其他细胞，并且AAV载体可以包含AAV9衣壳或另一衣壳。

用于转染宿主细胞的系统

本公开额外地提供了可用于进行本文公开的转染方法的系统。此类系统提供了用于容纳转染试剂溶液的装置、用于容纳核酸溶液的装置、用于将转染试剂溶液和核酸溶液混合在一起的装置，以及用于容纳待转染的宿主细胞的装置。系统还包含用于各种容纳装置和混合装置之间和之中的流体连通的装置。

本公开的系统包含用于容纳转染试剂溶液的装置以及用于容纳核酸溶液的装置(溶液容纳装置)。溶液容纳装置可以是适合于容纳将与细胞接触的溶液的任何容器，包括例如器皿、贮器、瓶、塑料袋(如WAVE Bioreactor^TM)、大玻璃瓶、罐或一次性使用混合器(SUM)，其他容器也是可能的。溶液容纳装置可以具有入口和/或出口开口或通口，以允许例如气体交换以及流体(如转染试剂溶液和核酸溶液)的引入和/或离开，或探针的安装。溶液容纳装置可以由适合于容纳将与细胞接触的溶液的任何材料制造，这些材料包括例如玻璃、刚性或柔性塑料或者金属合金(如不锈钢)。示例性塑料包括聚酰胺、聚碳酸酯、聚乙烯(包括低密度聚乙烯(LDPE))、聚醚砜、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、醋酸纤维素、乙烯醋酸乙烯酯、乙烯-乙烯基醇(EVOH)、尼龙和/或前述任何一种的组合，其他塑料也是可能的。溶液容纳装置可以密封或对大气开放，但如果开放，则可以包括过滤器以防止污染。如果需要，可以采用控制装置，其用于控制参数(如温度、pH、气体含量、压力)和溶液容纳装置的内容物的混合。溶液容纳装置可以提供有用于混合内容物的装置，如电机驱动的轴装式搅拌棒等，或使用脉冲盘的脉冲混合器，或一些其他混合技术。溶液容纳装置还可以提供有用于监测其中容纳的溶液的体积的装置或与其结合使用。因此，例如，溶液容纳装置可以包括校准至内部体积的刻度尺，或可以将机械或电子秤放置在溶液容纳装置下面，以监测重量的变化，重量的变化可能与内部流体的体积相关。

溶液容纳装置可以具有任何合适的体积。在某些实施方案中，溶液容纳装置可以容纳以下的最大量：至少约1、5、10、20、30、50、100、200、250、300、400、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、10000升或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

用于容纳转染试剂溶液和核酸溶液的容纳装置可以是相同类型或不同类型。在某些实施方案中，用于不同溶液的容纳装置可以是整体的，即，一个物理单元的一部分，但具有用于容纳单独的溶液的单独的贮器或室。在其他实施方案中，用于不同溶液的容纳装置是物理地分离的。系统可以针对转染试剂溶液和核酸溶液中的每一种具有一个容纳装置(因此，如果物理地分离，则总共两个)，或可以针对不同类型的溶液中的每一种具有多个此种容纳装置，对于每种溶液，该多个此种容纳装置的数量可以相同或不同。

本公开的系统还包含用于将先前分离的转染试剂溶液和核酸溶液混合在一起的装置。在某些实施方案中，混合装置是系统的元件或组件，其中转染试剂和核酸的单独溶液彼此初次在系统中相遇并开始混合在一起，即使完全混合可能并不总是甚至通常在混合装置中发生。代替地，关于此类实施方案，在添加到细胞中之前，混合可以在系统的其他方面中继续完成，包括例如在位于混合装置下游的流体连通装置中继续完成。在其他实施方案中，在转染试剂溶液和核酸溶液离开混合装置到细胞容纳装置之前，混合装置能有效地完全或几乎完全地混合它们，从而形成转染混合体。

在某些实施方案中，混合装置可以具有移动部件，其实例包括搅拌器，如具有轴的电动搅拌器，轴上附接有带、叶片、桨状物、螺旋桨或类似物，或缺少轴的搅拌器，如与磁力驱动器或电磁驱动器配对的磁力搅拌棒，或使用脉冲盘的脉冲混合器。其他实例包括与转子配对的定子、起泡器(其将空气或其他气体引入到形成气泡的液体体积的底部处或朝向其引入，当气泡上升时，气泡使液体移位并将其搅动，从而使其混合)或采用声波将动能赋予液体以产生它们的混合物的混合器，其实例包括谐振声学混合器和超声混合器。混合装置还可以包括静态混合器，其缺少移动部件，但含有以引起混合的方式连续地干扰流过、流经或流穿它们的流体的元件。静态混合器的实例包括板式或晶片型静态混合器，以及封装元件静态混合器，其具有壳体和一个或多个挡板，其可以具有多种配置，如螺旋线或平角叶片。静态混合器的额外实例包括低压降或较低压降静态混合器、界面表面生成器静态混合器、分流静态混合器和径向静态混合器。系统可以包含单个混合装置(以及任何相关的混合容纳装置，如下文所描述的)或多个此种混合装置(以及任何相关的混合容纳装置)，其可以是相同或不同的类型。

混合装置还可以与的容纳装置(混合容纳装置)结合使用，如器皿、瓶、罐、容器或室，其意在在将转染试剂溶液和核酸溶液完全地或部分地混合在一起时暂时容纳或储存它们。此种容纳装置可以被选择或设计以与混合装置一起工作。例如，瓶、罐或其他容器可以被设计以容纳电机驱动的搅拌器，或被安装到电动平台上，该电动平台振动或搅动容器的内容物。在另一实例中，厚壁柔性塑料袋(如WAVE Bioreactor^TM)可以用作容器，该容器被安装到摆动或旋转的平台上。混合容纳装置可以包括开口或通口以及出口，该开口或通口用作入口，待混合的液体(例如，转染试剂溶液和核酸溶液)可以通过该入口引入，并且混合物(例如，转染混合体)可以通过该出口离开。如果混合不使用连续过程，则相同的开口或通口可以用作入口和出口。混合容纳装置可以密封或对大气开放，但如果开放，则可以包括过滤器以防止污染。如果需要，则可以采用用于控制混合容纳装置内容物的温度的装置。在某些实施方案中，静态混合器的壳体用作混合容纳装置，是系统中发生混合的位置。混合容纳装置可以由适合于容纳将与细胞接触的溶液的多种材料制造，这些材料包括玻璃、塑料和金属合金，如不锈钢。示例性塑料包括聚酰胺、聚碳酸酯、聚乙烯(包括低密度聚乙烯(LDPE))、聚醚砜、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、醋酸纤维素、乙烯醋酸乙烯酯、乙烯-乙烯基醇(EVOH)、尼龙和/或前述任何一种的组合，其他塑料也是可能的。

根据某些非限制性实施方案，混合装置是具有多个管状臂的中空元件，该管状臂从臂相遇并接合的至少一个汇合处突出，以允许接合的臂之间或之中的流体连通。转染试剂溶液和核酸溶液在泵压力或重力下通过单独的臂流动到溶液相遇的中空元件中，开始混合，然后作为转染混合体通过至少一个其他臂离开。在某些实施方案中，中空元件由一个整体件制造，但也可以由多个子元件制造。在某些实施方案中，中空元件混合装置包括内部元件，如挡板，其干扰内部的流体流动，从而增强溶液的混合。在某些实施方案中，中空元件与流体连通装置整合成一体，而在其他实施方案中，中空元件是经由连接器、配件、密封件与流体连通装置连接的离散元件。在后者的实施方案中，中空元件的臂的长度可以相同或不同。在某些实施方案中，中空元件的臂具有圆形横截面，而在其他实施方案中，横截面是某个其他形状，如椭圆形、正方形、长方形、三角形、六边形等，并且若干个臂的内部尺寸可以相同或不同。

中空元件的内部尺寸可以是任何合适的尺寸。在某些实施方案中，中空元件的臂的横截面内部尺寸(如圆形横截面的孔或腔的内径)为至少或约0.5、0.8、1.6、3.2、4.8、6.4、8、0.5、0.8、1.6、3.2、4.8、6.4、8、9.6、6.4、9.6、12.7、15.9、8、12、16、9.6、12.7、15.9、19、25.4毫米或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

在某些实施方案中，中空元件具有用于转染试剂溶液和核酸溶液的两个入口和用于转染混合体的一个出口。在该实施方案中，入口可以与从分别容纳转染试剂溶液和核酸溶液的溶液容纳装置引出的流体连通装置(下文进一步描述)连接(每种溶液分别有一个入口)，并且出口可以与通向细胞容纳装置(下文进一步描述)的流体连通装置连接。然而，在其他实施方案中，中空元件可以含有多于两个入口(通常但不一定是偶数个)，以容纳与多组溶液容纳装置的连接。例如，两组溶液容纳装置可以与具有总共四个入口和一个或多个出口的中空构件连接。同样地，中空构件可以具有多个出口，以容纳经由合适的流体连通装置与多个细胞容纳装置的连接。在某些非限制性实施方案中，中空元件混合装置可以具有2个、3个、4个、5个、6个或更多个入口，以及1、2、3、4、5个或更多个出口。

中空元件混合装置的臂可以是共面的，或者一个或多个臂可以相对于由同一中空元件的任何两个其他臂的相交形成的平面成角度。中空元件混合装置的任何两个臂之间的相交角可以在从大于0度至小于180度的范围内，并且三个或更多个臂之间的相交角可以全部是相等或不相等的，或是相等和不相等角度的组合。在非限制性实施方案中，中空元件混合装置可以是T形的，其中三个臂(其中两个用作入口，并且一个用作出口)是共面的并且以大约90度相遇，而在另一非限制性实施方案中，元件是Y形的，其中三个臂是共面的，其两个臂(用作入口)与第三臂(出口)以在从大于90度至小于180度的范围内的相等角度相交。在某些非限制性实施方案中，中空元件混合装置包含以以下的角度相交的两个臂：小于180度，或约170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、45、40、30、25、20、15度或大于0度，包括前述具体枚举的值之间的所有角度和包含前述具体枚举的值的范围。

在某些实施方案中，系统可以至少包含与第一混合装置串联的第二混合装置。在某些实施方案中，此种第二混合装置位于第一混合装置的下游，从这个意义上来说，从第一混合装置离开的转染混合体直接或间接地流动到第二混合装置中，当转染混合体继续流向细胞容纳装置时，其在离开此种第二混合装置之前经受进一步的混合。例如，在某些实施方案中，第二混合装置可以是具有入口臂或通口的中空元件，该入口臂或通口随后分开或分支成两个或更多个管状流体路径，该两个或更多个管状流体路径然后在下游在发生额外混合的汇合处重新结合，在此之后转染混合体经由出口臂或通口离开。

本公开的系统还包含用于容纳待转染的宿主细胞的装置(细胞容纳装置)。细胞容纳装置的实例包括不同类型的贮器、瓶、大玻璃瓶、罐、塑料袋、生物反应器，其他细胞容纳装置也是可能的。细胞容纳装置可以被设计成一次性使用(如一次性使用生物工艺袋)，在此之后细胞容纳装置被丢弃或回收，或细胞容纳装置被设计成多次使用(如不锈钢生物反应器罐)。细胞容纳装置可以具有不同的体积，并且由适合于容纳活宿主细胞的任何材料制造，这些材料包括例如玻璃、刚性或柔性塑料或者金属合金(如不锈钢)。示例性塑料包括聚酰胺、聚碳酸酯、聚乙烯(包括低密度聚乙烯(LDPE))、聚醚砜、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、醋酸纤维素、乙烯醋酸乙烯酯、乙烯-乙烯基醇(EVOH)、尼龙和/或前述任何一种的组合，其他塑料也是可能的。

因为无论在生长阶段、转染期间还是在这之后，宿主细胞通常对环境条件高度敏感，本公开的系统可以配置有额外的装置，以将对细胞活力、生长和/或细胞容纳装置内的转染效率重要的条件维持在预定范围内。此类环境条件的实例包括氧气和CO₂水平、pH、温度以及细胞代谢所需的营养物质和其他培养基组分，以及本领域技术人员所熟悉的其他环境条件。用于维持期望的环境条件的装置可以与细胞容纳装置整合成一体或分离。细胞容纳装置可以装有传感器，以检测各种环境参数与优选目标值或范围的偏差，可以自动或手动地作用于如目标值或范围等信息以校正偏差。

在某些实施方案中，如果需要，则可以使用内部喷雾器或外部气体交换装置来引入氧气或其他气体(如CO₂)以控制pH，并且可以使用浸入在浸泡细胞的流体中的加热元件和/或冷却线圈来控制温度。可替代地，细胞容纳装置可以在外部添加或去除热量，如通过用加热垫包裹罐或使用双夹套罐来添加或去除，这允许加热或冷却的水在生长或维持细胞的生物反应器的内壁上循环。细胞容纳装置还可以配置有用于通过机械(例如，搅拌器、叶轮、旋转壁或摇摆平台)、气动(例如，剧烈喷雾)或液压(例如，泵送)搅动来混合内容物的装置，以确保营养物质、pH、代谢副产物、气体、温度等的均匀分布。细胞容纳装置可以对大气开放，任选地包括过滤器以防止污染，但如果需要，则可以密封，甚至可以加压以增加溶解在浸泡细胞的流体中的气体(如氧气)的量，和/或防止起泡。系统还可以配置有位于细胞容纳装置内部或外部的灌注装置，用于保留细胞，同时允许去除细胞废物和耗尽的培养基并添加最佳细胞生长和/或生产率所需的新鲜培养基或其他组分。灌注装置的非限制性实例包括中空纤维过滤设备，如切向流和交替切向流过滤设备，其他灌注装置也是可能的，如填充床生物反应器和流化床生物反应器。

细胞容纳装置可以具有一个或多个入口和/或出口开口、通口或排放口，以允许例如气体交换、引入和去除流体(如转染混合体、新的或旧的培养基、培养基补充物、缓冲液、防泡剂、抗生素或其他药物)或插入传感器探针。此类开口、通口或排放口可以位于各种位置，如在细胞容纳装置的顶部、底部或侧面处。如果需要，则入口和出口开口、通口或排放口可以任选地装有阀，以控制气体或流体流动的方向。

细胞容纳装置可以具有任何合适的体积。在某些实施方案中，细胞容纳装置可以容纳以下的最大量：至少或约1、5、10、20、30、50、100、200、250、300、400、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、10000升或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

本公开的系统还可以包含流体连通的装置，包括但不限于(i)从用于容纳转染试剂溶液和核酸溶液的装置到混合装置(以及任何相关的混合容纳装置)，以允许溶液从溶液容纳装置流动到混合装置(以及任何相关的混合容纳装置)，以及(ii)从混合装置(以及任何相关的混合容纳装置)到细胞容纳装置，以允许转染混合体从混合装置(以及任何相关的混合容纳装置)流到到细胞容纳装置。后流体连通装置内的转染混合体可以在其流向细胞容纳装置时继续混合。另外，可以结合与流体连通装置的总长度和横截面面积有关的设计选择来调节流率(其可能与泵送速率相关)，以产生预定的总混合或孵育时间，该总混合或孵育时间在转染混合体首次形成时开始，并且在出于转染的目的将相同部分添加到宿主细胞中时结束。

在某些实施方案中，流体连通装置是管、软管或管道，其可以由适合于容纳将与细胞接触的溶液的任何材料制造，如玻璃、塑料或金属合金，如不锈钢。示例性塑料包括聚酰胺、聚碳酸酯、聚乙烯(包括低密度聚乙烯(LDPE)和线性低密度聚乙烯)、聚醚砜、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚氯乙烯、聚氨酯、醋酸纤维素、乙烯醋酸乙烯酯、乙烯-乙烯基醇(EVOH)、氟化乙烯丙烯(FEP)、全氟烷氧基(PFA)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、尼龙、硅酮和/或前述任何一种的组合，其他塑料也是可能的。与本公开的系统一起使用的流体连通装置可以是一次性使用的或多次使用的。

可以以普通技术人员熟悉的任何抗渗漏方式(如通过快速连接器、联轴器、螺纹接头、摩擦或压缩配件、密封件、焊接接头等)将流体连通装置(如管、软管或管道)与该系统的其他装置(如溶液容纳装置、混合装置(以及任何相关的混合容纳装置)和细胞容纳装置、入口或出口通口，视情况而定)附接或连接。任选地，流体连通装置可以包括或装有防止不期望的流体流动的阀、夹具等，以及用于去除超过某一尺寸的颗粒(如污染物，包括微生物)的过滤器。

本公开的系统可以具有任何数量的单独流体连通装置。根据某些实施方案，单个流体连通装置(如管、软管或管道)连接每个溶液容纳装置和混合装置(以及任何相关的混合容纳装置)。在其他实施方案中，多个流体连通装置连接每个溶液容纳装置和混合装置(以及任何相关的混合容纳装置)，它们的数量可以相同或不同。根据某些实施方案，单个流体连通装置(如管、软管或管道)连接混合装置(以及任何相关的混合容纳装置)和细胞容纳装置。在其他实施方案中，多个流体连通装置连接混合装置(以及任何相关的混合容纳装置)和细胞容纳装置。根据示例性的非限制性实施方案，系统可以包含从两个溶液容纳装置中的每一个到混合装置的一个流体连通装置，以及从混合装置到细胞容纳装置的一个额外流体连通装置，系统中总共有三个流体连通装置。然而，其他系统可以具有不同总数的单独流体连通装置。

在某些实施方案中，流体连通装置(如管、软管或管道)可以具有圆形横截面，而在其他实施方案中，横截面是某个其他形状，如椭圆形、正方形、长方形、三角形、六边形等。流体连通装置的内部尺寸可以是任何合适的尺寸。在某些实施方案中，流体连通装置的横截面内部尺寸(在圆形横截面的情况下，其是孔或腔的直径)为至少或约0.5、0.8、1.6、3.2、4.8、5、6、6.4、7、8、9、9.6、10、11、12、12.7、13、14、15、15.9、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、25.4、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100毫米(mm)或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。在某些实施方案中，混合装置和下游细胞容纳装置之间的流体连通装置是具有圆形横截面和在以下的范围内的内径的管道或管：从约0.5至7.5厘米(cm)、0.5至5cm、0.5至4cm、0.5至3cm、0.5至2.5cm、0.5至2cm、0.5至1.5cm、0.5至1cm、0.75至7.5cm、0.75至5cm、0.75至4cm、0.75至3cm、0.75至2.5cm、0.75至2cm、0.75至1.5cm、0.75至1cm、1至7.5cm、1至5cm、1至4cm、1至3cm、1至2.5cm、1至2cm、1至1.5cm、1.5至7.5cm、1.5至5cm、1.5至4cm、1.5至3cm、1.5至2.5cm或1.5至2cm。

流体连通装置的壁可以具有任何合适的厚度。在某些实施方案中，流体连通装置的壁的厚度(如管、软管或管道的壁的厚度)可以为至少或约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10毫米或更厚，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。在系统内，系统内任何流体连通装置的尺寸可以与同一系统内其他流体连通装置的尺寸相同或不同。

该系统的流体连通装置(例如，管、软管或管道)可以具有不同的长度，并且在包含多于一个流体连通装置的系统中，每个此种流体连通装置的长度可以与同一系统中其他流体连通装置的长度不同。流体连通装置可以具有任何合适的长度。在某些实施方案中，流体连通装置的长度为至少或约0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200英尺或米或更长，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。在某些实施方案中，混合装置和细胞容纳装置之间的流体连通装置的长度长于溶液容纳装置和混合装置之间的液体连通装置的长度。

在某些实施方案中，流体连通装置(如管、软管或管道)可以在其总长度的至少一部分上被配置为一个或多个线圈(例如，1、2、3、4、5个或更多个线圈)，每个线圈都可以是扁平线圈、螺旋线圈(如围绕圆柱体或锥体，单层或正交循环地缠绕)、缠绕的环形线圈或一些其他线圈配置。流体连通装置的总长度中被盘绕的部分可以是任何合适的部分。在某些实施方案中，盘绕的流体连通装置的总长度的百分比为至少或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95％，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。在某些实施方案中，每个线圈的线圈半径(平均或恒定)可以为至少或约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150厘米或英寸或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。

本公开的系统还可以包含用于将通过系统的流体从溶液容纳装置泵送到混合装置(以及任何相关的混合容纳装置)并从混合装置泵送到细胞容纳装置的装置(泵装置)。在某些实施方案中，泵装置是蠕动泵、隔膜泵(包括气动隔膜泵、双隔膜泵、隔膜计量泵或四元隔膜泵)、罗茨泵(包括旋转罗茨泵)、齿轮泵、活塞泵(包括旋转活塞泵)、偏心螺杆泵、容积泵(包括旋转式容积泵)、离心泵，其中的任何一种都可以是一次性使用泵或多此使用泵。在其他实施方案中，本公开的系统可以依赖重力使流体流动通过一部分甚至整个系统，以实现转染试剂和核酸溶液的混合和此后的宿主细胞转染。本公开的系统可以具有任何数量的泵装置，例如1、2、3、4、5个或更多个泵装置。泵装置可以被配置为与系统组件中的任何一个或多个一起功能地操作，该系统组件包括例如溶液容纳装置、混合装置(以及任何相关的混合容纳装置)、细胞容纳装置以及系统的任何其他部件之间的流体连通装置，并且泵装置可以位于任何系统组件的内部或外部。在示例性的非限制性实施方案中，泵装置可以是蠕动泵，其与用作溶液容纳装置和混合装置之间的流体连通装置的柔性管结合使用。一个此种泵可以在多于一个此种管上操作，或在其他实施方案中，每个此种管都可以提供有其自己的专用蠕动泵，在这种情况下，该系统可以包含至少两个此种泵。在具有两个或更多个泵的实施方案中，系统可以任选地进一步包含控制装置，以调控和协调从不同的溶液容纳装置泵送的速率，使得每次大约恒定量(其可以相等或不相等)的转染试剂溶液和核酸溶液被泵送到混合装置。

根据示例性的非限制性实施方案，本公开的系统可以被配置为包括两个一次性使用混合器，以在一方面容纳转染试剂溶液并在另一方面容纳核酸(例如，质粒DNA)溶液。从每个SUM引出的是柔性塑料管，其中一部分被安装到蠕动泵上(因此，总共两个泵)。然后将每个管的另一端与“T”或“Y”型连接器的入口连接，该连接器用作静态在线混合器，在此处溶液开始混合。连接器的出口附接有较长的混合器后塑料管，该塑料管可以沿着其长度包含一个或多个线圈，终止于生物反应器的通口并与其连接。在操作中，将含有转染试剂和核酸的溶液添加到它们各自的SUM中(或在SUM中制备)。启动蠕动泵并将其设置为期望的泵送速率，使溶液从SUM流出，穿过管并进入到连接器中，在连接器中溶液彼此相遇并开始混合在一起，从而形成转染混合体。离开混合器后，混合体沿着较长的管朝向生物反应器行进，同时继续混合和孵育，从而形成能够被细胞摄取的颗粒。管的长度连同其内径以及泵送速率决定孵育时间。在经过混合器后管之后，转染混合体然后进入生物反应器，在此处它与悬浮细胞混合，从而导致悬浮细胞被核酸转染。

如上文所描述的，本公开的系统可以具有多个子组件。例如，在某些实施方案中，系统可以包括转染试剂溶液、核酸溶液和宿主细胞各自的一个容纳装置，同时包括多个子系统(如两个或更多个)，每个子系统包含混合装置(以及任何相关的混合容纳装置)、流体连通装置和任选的泵装置。通过包括多个此种子系统，系统可以被配置为更快速地将给定体积的转染混合体递送到细胞中，而不需要根据期望的预定值改变转染混合体孵育时间。该实施方案的非限制性实例展示在图2中，其他配置也是可能的。

考虑到如泵送速率和流体连通装置的尺寸等变量，本公开的系统可以被配置为控制转染混合体的孵育时间和将总转染体积添加到细胞中的时间(添加时间)。总转染体积是转染试剂溶液和核酸溶液的组合体积，并且相当于待送到待转染的细胞中的转染混合体的总体积。总转染体积取决于变量，如待转染的细胞的体积和/或此类细胞的活细胞密度。添加时间是将总转染体积添加到细胞中所需的时间。添加时间取决于变量，如细胞容纳装置充分混合并分配悬浮或浸泡细胞的流体中的转染混合体以防止出现局部毒性浓度的能力。孵育时间是转染试剂溶液和核酸溶液接触形成转染混合体的时间，当两种溶液在混合装置中彼此相遇并开始混合时，孵育时间开始，并且当将转染混合体添加到细胞容纳装置中的细胞中时，孵育时间结束。实现期望的孵育时间和添加时间的系统参数可以如下计算。

一旦确定了总转染体积和添加时间，就可以计算转染试剂溶液和核酸溶液的需要量，以及实现目标孵育时间所需的管(或功能地等效的流体连通装置)的流率和长度。在某些实施方案中，以1:1比率将每种溶液与另一溶液混合以形成转染混合体，但取决于转染试剂和核酸在它们各自溶液中的浓度，其他比率也是可能的。在两种溶液1:1混合的情况下，每种溶液的体积将是目标总转染体积的一半。然后将该值除以添加时间，以确定每种溶液所需的泵送速率(体积/时间)。在两种溶液中的每一种由其自己的泵提供服务的系统实施方案中，该值将是每个泵的泵送速率。通过系统的总流率就是泵送速率的总和。为了计算实现目标孵育时间所需的管路(或功能地等效的流体连通装置)的长度，将期望的孵育时间乘以离开混合装置的转染混合体的流率(系统的总流率)，然后将该乘积除以每单位长度管路的体积。一组示例性计算示出在实例6中。

考虑到如泵送速率和流体连通装置的尺寸等变量，本公开的系统可以被配置为控制通过系统的流动是层流还是湍流，如通过雷诺数所表示的。雷诺数(Re)是描述流体流动的无量纲数，其可以根据流体密度(rho(ρ)，单位为kg/m³)、流体粘度(mu(μ)，单位为Pa*s)和流体的线速度(v，单位为m/s)来计算。在流体流动通过管道或相似结构的情况下，雷诺数的公式由下式给出：

其中D是管道的内径(单位为米)。例如，仅作为说明而非限制，如果转染混合体的密度为1000kg/m³，粘度为1mPa*s，并且其通过内径为1cm的管的速度为0.4m/s，则与此种转染混合体的流动相关的雷诺数(Re)将为4000。

在某些实施方案中，转染混合体的密度为997kg/m³，并且转染混合体的粘度为8.90x10^-4Pa*s(或0.89mPa*s)，但这些值可以取决于使用的转染试剂的类型和溶液中此种试剂和核酸的浓度以及温度而不同。因此，在某些实施方案中，20℃下转染混合体的密度为约950、960、970、975、980、981、982、983、984、985、986、987、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、1000、1001、1002、1003、1004、1005、1006、1007、1008、1009、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020、1025、1030、1040或1050kg/m³，或任何前述值之间的某个其他值，或包括并介于任何前述值之间的某个范围。在某些实施方案中，20℃下转染混合体的动态粘度为约0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99、1.00、1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.10、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、6、7、8、9或10mPa*s，或任何前述值之间的某个其他值，或包括并介于任何前述值之间的某个范围。

该系统中转染混合体的线速度可以是任何合适的线速度。在某些实施方案中，本公开的系统的流体连通装置(如连接混合装置与下游细胞容纳装置的管或管道)中转染混合体的线速度为至少或约0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50米/秒(m/s)或更大，或任何前述值之间的某个其他值，或包括并介于任何前述值之间的某个范围。

该系统中转染混合体的流率可以是任何合适的流率。在某些实施方案中，本公开的系统中转染混合体的流率为至少或约1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000、1500、2000、2200、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、10500、11000、11500、12000、12500、13000、13500、14000、15000、15500、16000、16500、17000、17500、18000、18500、19000、19500或20000或更大毫升/分钟(mL/分钟)，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包括并介于任何前述具体枚举的值之间的某个范围。

在某些实施方案中，可以使用以下公式将通过具有圆形横截面的管道或管的流率转换为流体以特定流率移动通过管道或管的线速度

其中v为流体速度(m/s)，Q为流体流率(m³/s)，D为管道或管的内径(m)。因此，例如，如果转染混合体以5000mL/分钟的流率移动通过内径为0.5英寸的管，则可以转换单位并计算出流体通过管的速度为大约0.658m/s。

在某些实施方案中，本公开的系统中转染混合体的流率可以表示为以克或千克/单位时间(如秒或分钟)为单位的转染混合体的质量。因此，例如，在某些实施方案中，本公开的系统中转染混合体的流率为至少或约1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000、1500、2000、2200、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、10500、11000、11500、12000、12500、13000、13500、14000、15000、15500、16000、16500、17000、17500、18000、18500、19000、19500或20000或更大克/分钟(g/分钟)，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包括任何并介于前述具体枚举的值之间的某个范围。

考虑到转染混合体的密度和粘度，然后控制其流动通过连接混合装置和细胞容纳装置的选定内径的管路(或功能地等效的流体连通装置)的速率(例如，通过控制将转染试剂溶液和核酸溶液泵送到混合装置中的速率)，则可以按照Re控制流体流动(无论是层流还是湍流)的性质。在某些实施方案中，层流被认为在2000、3000、4000或5000的Re值以下发生，而湍流被认为在这些Re值以上发生。根据某些实施方案，本公开的系统中转染混合体的流动的Re为至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000或更大，或任何前述具体枚举的值之间的某个其他值，或包含任何前述具体枚举的值的范围。因此，例如，在某些实施方案中，本公开的方法被进行成和/或本公开的系统被设计和实施成使得与转染混合体通过从混合装置到细胞容纳装置的流体连通装置的流动相关的雷诺数Re不超过4000的值，或在以下的范围内：约100至4000、200至4000、300至4000、400至4000、500至4000、600至4000、700至4000、800至4000、900至4000、1000至4000、1100至4000、1200至4000、1300至4000、1400至4000、1500至4000、1600至4000、1700至4000、1800至4000、1900至4000、2000至4000、2100至4000、2200至4000、about 2300至4000、2400至4000、2500至4000、2600至4000、2700至4000、2800至4000、2900至4000、3000至4000、3100至4000、3200至4000、3300至4000、3400至4000、3500至4000、3600至4000、3700至4000、3800至4000或3900至4000或某个其他范围。

在某些实施方案中，为方便起见，转染混合体的密度和粘度可以被假设为与20℃下的水相同(分别地，ρ≈997kg/m³，并且μ≈1.00mPa·s)，并且可以计算转染混合体通过呈具有圆形横截面的管道或管形式的流体连通装置的最大线速度，这将导致与流动相关的雷诺数的值为4000或更小。因此，例如，在本公开的方法和系统的某些实施方案中，如果用于将转染混合体从混合装置携带到细胞容纳装置的管具有内径D，并且转染混合体以速度v流动通过该内径，则与此种流动相关的雷诺数Re将不超过4000的值，其中D≥0.32cm并且v≤1.264m/s，D≥0.64cm并且v≤0.632m/s，D≥1.27cm并且v≤0.316m/s，D≥1.91cm并且v≤0.211m/s，D≥2.54cm并且v≤0.158m/s，D≥3.18cm并且v≤0.126m/s，D≥3.81cm并且v≤0.105m/s，D≥4.45cm并且v≤0.090m/s，D≥5.08cm并且v≤0.079m/s，D≥5.72cm并且v≤0.070m/s，D≥6.35cm并且v≤0.063m/s，D≥6.99cm并且v≤0.057m/s，D≥7.62cm并且v≤0.053m/s，D≥8.26cm并且v≤0.049m/s，D≥8.89cm并且v≤0.045m/s，D≥9.53cm并且v≤0.042m/s，D≥10.16cm并且v≤0.039m/s，D≥10.80cm并且v≤0.037m/s，D≥11.43cm并且v≤0.035m/s，D≥12.07cm并且v≤0.033m/s，或其中D≥12.70cm并且v≤0.032m/s。

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根据前述的详细描述，本发明的其他目的、特性和优点将是显而易见的。然而，应当理解，以下的详细描述和具体实例虽然指示了本发明的具体实施方案，但仅以举例说明的方式给出，因为根据这些详细描述和实例，本发明的精神和范围内的各种变化、修饰和等效物对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的，并且落在所附权利要求的范围内。

除非另有指示，否则与一组实施方案中的一个或多个成员有关的术语“或”的使用在含义上相当于“和/或”，并且不要求它们相互排斥。除非另有指示，否则多个明确列举的数值范围还描述了以下范围：其下界源自明确列举的范围中的任何一个范围的下界或上界，并且其上界源自明确列举的范围中的任何其他范围的上界或下界。因此，例如，明确列举的范围的系列“10-20、20-30、30-40、40-50、100-150、200-250、275-300”还描述了范围10-50、50-100、100-200和150-250，以及许多其他范围。除非另有指示，否则在一系列数值或范围之前使用术语“约”不仅旨在修饰紧接在其之后出现的值或范围，而且旨在修饰同一系列中随后出现的每个值或范围。因此，例如，短语“约1、2或3”相当于“约1、约2或约3”。

出于所有目的，本文引用的所有出版物和参考文献，包括但不限于文章、摘要、专利、专利申请(无论是否发布)和生物序列(包括但不限于由特定数据库参考号标识的生物序列)，在此都通过引用以其整体并入，其程度等同于每个单独的出版物或参考文献均被具体地并单独地指示为通过引用并入的程度。本申请直接或间接地要求优先权的任何专利申请也通过引用以其整体并入本文。

除非另有指示，否则下文中的实例描述了使用本领域普通技术人员众所周知的常规标准技术进行的实验。这些实例是说明性的，但并不限制本发明。

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实施例

实施例1：使用小规模单剂量转染的转染效率的时间依赖性

该实施例描述了小规模实验，以确定转染混合体的孵育时间与从用单剂量转染混合体转染的宿主细胞产生的AAV载体的数量之间的关系。

将含有制造用于表达微小肌营养不良蛋白的重组AAV载体所需的遗传信息的三种类型的质粒组合在F17培养基中，并且将样品分配到板孔中。第一质粒(辅助质粒)含有腺病毒辅助功能，第二质粒(转基因质粒)含有AAV载体基因组，该载体基因组包括AAV2 ITR、肌肉特异性增强子和启动子、编码人肌营养不良蛋白衍生的微小肌营养不良蛋白的基因(被命名为Optidys3978)、转录终止子序列和第二AAV2 ITR，并且第三质粒(rep/cap)含有AAV2rep基因和AAV9 cap基因。用于该实施例和其他实施例的质粒还描述在WO 2017/221145中。将不同的质粒以2.0(辅助):1.6(rep/cap):1.0(转基因)的质量比组合，分别相当于0.94:1.93:1.00的摩尔比，并且将pDNA和PEI以2.2:1的质量比组合。在使用之前将质粒储液(约1mg/mL)冷冻储存。如使用Beckman Coulter Vi Cell XR所测定的，使用足够的pDNA，使得每1x10⁶个活细胞添加1μg pDNA。

然后将F17培养基中40kDa的完全去丙酰化线性聚乙烯亚胺(PEI)添加到质粒样品中，一次一个样品。添加PEI后，通过移液管将转染试剂溶液和质粒溶液混合10秒，然后孵育不同量的时间，以形成含有PEI和pDNA的复合物。在孵育之后，以单次剂量方式将所得转染混合体(3mL)添加到含有悬浮适应的HEK293细胞的Ambr生物反应器(Sartorius)(15mL容量；每个混合体样品一个生物反应器)中，其活细胞密度为大约18x10⁶个细胞/mL。在添加转染混合体之后三小时，通过添加1.5mL单剂量的CDM4HEK293培养基来淬灭转染，随后孵育68-72小时以产生AAV载体，在此之后收获细胞，并且使用对载体基因组中的AAV ITR具有特异性的定量PCR(qPCR)测定来对AAV载体进行滴度测定。

如图3所示，针对转染混合体的孵育时间，绘制AAV滴度(表示为载体基因组/mL细胞培养物(vg/mL))的图形。数据示出，相对较短的转染混合体孵育时间(约3-15分钟)导致高的AAV滴度，而超过约15分钟的孵育时间导致AAV产量大幅度下降，然后约25-30分钟后稳定。进行相似的实验以研究更短的转染混合体孵育时间对AAV滴度的影响，结果如图4所示。在该实验中，甚至约1.5至2.5分钟非常短的孵育时间也导致高的AAV滴度，而超过约5-6分钟的孵育时间导致AAV滴度的时间依赖性减少。

实施例2：使用小规模连续转染的转染效率的时间依赖性

该实施例描述了小规模实验，以确定转染混合体的孵育时间与从使用连续过程转染的宿主细胞产生的AAV载体的数量之间的关系，该连续过程采用静态在线混合器制备转染混合体。

在这些实验中使用与实施例1中相同类型的质粒、转染试剂、培养基和细胞，但使用连续转染过程用更大体积的细胞在1L规模下进行转染。在F17培养基中分别制备等体积的pDNA溶液和PEI溶液，并将其分配到瓶中(每种溶液一个瓶)。当培养中的活细胞密度达到大约18x10⁶个细胞/mL时，用总体积为约229mL的转染混合体(转染前细胞培养体积的32.65％w/v)转染约700mL细胞。分别制备足够的pDNA溶液和PEI溶液，使得每1x10⁶个活细胞添加0.75μg pDNA，并且转染混合体中PEI与pDNA的质量比为2.2:1。质粒的质量比为2.0(辅助):1.6(rep/cap):1.0(转基因)，分别相当于摩尔比为0.94:1.93:1.00。在制备了所有的转染混合体并将其添加到生物反应器中之后，将细胞孵育3小时，然后通过添加CDM4HEK293培养基(转染前细胞培养体积的13.1％w/v)淬灭转染。然后将细胞孵育68-72小时以允许产生AAV载体，在对培养样品中的AAV载体进行纯化和测定之后，包括使用对微小肌营养不良蛋白转基因具有特异性的qPCR测定的滴度，并且在尺寸排阻色谱(SEC)纯化之后，用分光光度计确定的260nm和280nm处的UV吸光度比值近似表示完整衣壳与空衣壳的比例(参见，例如，Sommer,JM etal.,Mol Ther 7(1):122-8(2003))。还计算了雷诺数，如本文别处所描述的。

转染通过包含静态在线混合器的系统进行。更具体地，该系统包括用于分别容纳PEI溶液和pDNA溶液的两个瓶。从每个瓶引出的是相等长度的柔性塑料管(Saint-GobainC-flex，尺寸16(1/8英寸内径，1/4英寸外径))，其插入穿过蠕动泵(Masterflex；每个管一个蠕动泵)，并且在其末端处与T型流体连接器的入口连接，使得两个管中的每一个的末端以180°角相遇并与出口成直角。与出口连接的是通向总体积为1L的搅拌罐玻璃生物反应器(Broadley-James Bionet)的相似管。改变从连接器到生物反应器的管的长度以及泵送速率，以控制转染混合体从T型连接器行进到生物反应器的时间(孵育时间)和将PEI溶液和pDNA溶液作为转染混合体的总组合体积添加到生物反应器中的时间(添加时间)。在这些实验中，含有PEI和pDNA的溶液的体积相等，并且每个泵的速率也相同。

来自这些实验的结果总结在表2中，并且以图形形式呈现在图5中。尽管测试的最短和最长孵育时间导致高的AAV载体滴度，但数据趋势表明约2.25分钟(135秒)的转染混合体孵育时间产生最高的平均AAV载体滴度。

表2

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实施例3：使用小规模连续转染的转染效率的时间依赖性

该实施例描述了确定活细胞密度和pDNA量对AAV载体滴度和SEC UV260/UV280值的影响的实验。

实验设计与实施例2中的实验设计相似，不同之处在于活细胞密度(VCD)不同，并且系统管长度和泵送速率保持恒定以实现90秒的恒定孵育时间和30分钟的添加时间。总泵送速率为7.6mL/分钟(由两个泵以该速率的一半进行)，从混合器到生物反应器的管路长度为143cm，并且计算出的雷诺数为57。由于VCD不同而转染混合体中pDNA的总量与实施例2中相同并保持恒定，因此在这些实验中每百万个活细胞中pDNA的质量也不同。

这些实验的结果总结在表3中，并且以图形形式呈现在图6、7和8中。数据表明，转染时的活细胞密度与SEC UV260/UV280比率之间呈正相关(图6)，这表明较高的VCD有利于细胞产生完整衣壳。VCD也与AAV载体滴度呈弱正相关(图7)。相反，每百万个被转染的活细胞中pDNA的数量与SEC UV260/UV280比率呈负相关(图8)，这表明每细胞中较高数量的pDNA会使细胞减少完整衣壳的产生，这通常被认为是不期望的。虽然未示出，但已确定，当每百万个细胞中pDNA的数量减少到0.25μg时，不会产生AAV载体。

表3

实施例4：使用连续转染在中试规模下产生AAV载体

该实施例描述了使用本公开的方法和系统在250L规模下产生AAV载体。如其他实施例中所描述的，使用静态在线混合器和短的受控转染混合体孵育时间的连续转染过程在小规模下产生高滴度和高百分比的AAV载体完整衣壳。该实施例描述了确定用与临床药物供应或小规模商业制造一致的较大体积的细胞实施的相似过程是否可以产生相似结果的实验。

总体实验设计与实施例2和3中的总体实验设计相似，并且使用相同类型的质粒、转染试剂、培养基和细胞。使用较大的组件构建与实施例2中描述的静态在线混合系统相似的静态在线混合系统，以容纳较大体积的转染混合体和细胞。连接用于容纳PEI溶液和pDNA溶液的贮器、T型连接器(用作静态在线混合器)和生物反应器的管路(Saint-Gobain C-flex)具有3/8英寸内径和5/8英寸外径。从混合器通向生物反应器的管的大部分长度盘绕在一个或多个柱周围，以提高混合效果。将用于将PEI和pDNA的溶液从它们的容器中泵送到混合器并然后泵送到生物反应器的蠕动泵彼此校准，并且设置成计算得出的为产生期望的转染混合体孵育时间和添加时间的流率的一半。将PEI溶液和pDNA溶液的容器安装在电子秤上，使得可以检测和校正泵送速率的小差异，以确保将等量的两种溶液组合。

对于转染，分别制备足够的pDNA溶液和PEI溶液，使得每1x10⁶个活细胞添加0.75μg pDNA，并且转染混合体中PEI与pDNA的质量比为2.2:1。质粒的质量比为2.0(辅助):1.6(rep/cap):1.0(转基因)，分别相当于摩尔比为0.94:1.93:1.00。用于稀释PEI和pDNA的储液的培养基中补充有Glutamax^TM(ThemoFisher Scientific)(最终浓度为10mM)和0.2％Pluronic F-68。由于这些实验需要较大体积的细胞，因此通过多个阶段从工作细胞库中扩展细胞，这些阶段包括在两个摇瓶、WAVE生物反应器、50L一次性生物反应器中生长，并且最终在250L生物反应器(ThermoFisher 250L 5:1Aegis5-14)中充满。

当细胞达到大约18x10⁶个细胞/mL的目标活细胞密度时，停止灌注，并且开始转染，以相同的速率将PEI溶液和pDNA溶液泵送到系统中，形成转染混合体30至90秒，然后递送到生物反应器中的细胞中。在3小时之后，通过泵入CDM4HEK293培养基淬灭转染。然后，根据需要添加新鲜营养物质供给培养基，将细胞孵育72小时，以允许产生AAV载体，在此之后采集样品，纯化载体并且进行测定，以确定滴度(通过用于ITR或转基因序列的qPCR来确定)并估计完整衣壳的比例(通过260nm和280nm处的吸光度比值来估计)。结果总结在表4中。如通过qPCR滴度测定，250L中试规模下的连续转染产生了与对照单剂量转染相当的载体量，并且持续产生了具有更高的SEC UV260/UV280值的载体，这表明该规模下的连续转染导致比单剂量转染更高比例的完整衣壳。

表4

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实施例5：使用连续转染在大规模下产生AAV载体

该实施例描述了使用本公开的方法和系统在2000L规模下产生AAV载体。如其他实施例中所描述的，使用静态在线混合器和短的受控转染混合体孵育时间的连续转染过程在小规模和中试规模下产生高滴度和高百分比的AAV载体完整衣壳。该实施例描述了确定用与大规模商业药物供应制造一致的较大体积的细胞实施的相似过程是否可以产生相似结果的实验。

总体实验设计与实施例2、3和4中的总体实验设计相似，并且使用相同类型的质粒、转染试剂、培养基和细胞。使用更大的组件构建与实施例2和3中描述的静态在线混合系统相似的静态在线混合系统，以容纳较大体积的转染混合体和细胞。在所有实验中，连接T型连接器(用作静态在线混合器)与生物反应器的管路的内径为0.75英寸，并且长度为78英尺。在编号的实验中，如图2示意性地示出的，使用了两组混合组装件，以实现将转染混合体更快速地添加到生物反应器中。将悬浮适应的HEK293细胞在补充有来自工作细胞库的冷冻小瓶中的10mM Glutamax^TM(ThemoFisher Scientific)和0.2％Pluronic F-68的FreeStyle^TMF17培养基(ThermoFisher Scientific)中生长，并且通过摇瓶、10L WAVE袋、50L WAVE袋、200L生物反应器的中间步骤扩展，并且最后进入到2000L一次性使用生物反应器(Cytiva Xcellerex XDR 2000)中生长。在最终的生物反应器中，灌注细胞以去除用过的培养基并添加新鲜的培养基，将细胞生长至大约18x10⁶个细胞/mL的目标活细胞密度(VCD)(但实际的VCD根据实验有所不同)，然后用转染混合体连续地转染细胞。

当细胞达到其目标VCD时，制备等体积的含有PEI和pDNA的溶液，以形成总体积为转染前细胞培养体积的32.7％(w/v)的转染混合体。在解冻之后，将指定量的每种质粒储液转移到含有指定量的补充有10mM Glutamax^TM和0.2％Pluronic F-68的F17培养基的一次性使用混合器(SUM)中。在单独的SUM中，将指定量的完全去丙酰化40KDa线性聚乙烯亚胺(PEI)的储液(1mg/mL)稀释在补充有10mM Glutamax^TM和0.2％Pluronic F-68的F17培养基中，以用作转染试剂。在转染之前和转染期间，将每个SUM的内容物缓慢地混合长达15分钟。

为了开始转染，以相似的速率将PEI溶液和质粒溶液从SUM泵送到与用作静态在线混合器的T型连接器的入口附接的管中。在T型连接器的交叉点相遇后，PEI溶液和质粒溶液开始混合在一起以形成转染混合体，当混合体沿着T型连接器出口和含有HEK293细胞的生物反应器之间的另一较长的管行进时，这种混合和形成过程继续进行。将从T型连接器通向生物反应器的管的部分管(孵育管)盘绕，以促进PEI溶液和质粒溶液的混合。对后管的长度和直径进行选择，以基于泵送速率实现从T型连接器到生物反应器的某一混合体孵育时间。在添加转染混合体期间，搅动生物反应器内容物以在细胞之间分配混合体。在添加所有混合物之后，3小时以后通过泵入CDM4HEK293培养基来淬灭转染。然后将细胞孵育68-72小时，在此之后对从细胞样品中分离出的AAV载体的滴度和完整衣壳比例进行分析。

用于十四种不同实验的条件总结在表5中，并且结果总结在表6中。AAV载体滴度使用对转基因序列具有特异性的定量PCR测定来确定，并且表示为载体基因组/毫升。在通过尺寸排阻色谱(SEC UV260/UV280)纯化之后，通过测量260nm和280nm处的UV吸光度比值来估计完整衣壳与空衣壳的比例。结果与中试规模(250L)转染实验一致，该实验产生6.29E+11vg/mL的平均载体滴度和1.06的平均SEC UV260/UV280值。

表5

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表6

实施例6：实现目标孵育时间的管路长度计算

该实施例描述了在本公开的系统中，在1L规模下实现转染混合体孵育时间所需的管路长度的示例性计算。在该实施例中，将PEI(转染试剂)和质粒DNA的溶液包含在单独的贮器中，并且由蠕动泵(每种溶液一个蠕动泵)泵送通过通向呈三通连接器形式的静态在线混合器的管路，将输送PEI/pDNA转染混合体的第三管从该静态在线混合器运行到含有待转染的细胞的生物反应器。基于某些已确定的变量，计算第三管的长度以实现预定的转染混合体孵育时间。

在该实施例中，期望的总转染混合体体积为229mL(115mL PEI溶液+115mL pDNA溶液)；期望的添加时间为30分钟；期望的孵育时间为90秒(1.5分钟)；并且从混合器到生物反应器的管的孔径为3.175毫米(0.125英寸)。首先，计算出实现添加时间所需的系统流率。根据系统流率，还可以计算出两个泵中的每一个的泵送速率(假设转染试剂溶液和质粒DNA溶液的1:1混合物)。

总转染混合体体积/添加时间＝系统流率

229mL/30分钟＝7.63mL/分钟

泵送速率(每个泵)＝系统流率/2

7.63mL/分钟/2＝3.82mL/分钟/泵

接下来，使用1cm长圆柱体的体积公式(3.14*r²*h)计算出将转染混合体输送到生物反应器的管的体积/单位长度(mL/cm)。

(管路内径/2)²*3.14*高度＝体积

(0.3175cm/2)²*3.14*1cm＝0.08mL/cm

最后，根据给定系统流率和管路孔径，可以如下计算出实现从三通混合器到生物反应器的期望孵育时间的管路的长度。

(孵育时间*流率)/管路体积/cm＝长度

(1.5分钟*7.63mL/分钟)/0.08mL/cm＝145cm

因此，在该实施例描述的系统中，在给定7.63mL/分钟的系统流率的情况下，需要145cm的具有3.175孔径的将混合器与生物反应器连接的管路，以在将转染混合体添加到细胞中之前将其混合和孵育90秒。

实施例7：计算出的雷诺数对AAV载体效力的影响

该实验描述了在三个不同的规模下，与静态在线混合器和生物反应器之间的转染混合体的流率相关的计算出的雷诺数(Re)对相对AAV载体效力的影响。

含有编码微小肌营养不良蛋白的转基因的AAV载体通过三种不同规模(10L、250L和2000L)下的悬浮培养中的HEK293宿主细胞的瞬时三重转染来产生。三种质粒包括用于先前实施例的辅助、rep/cap和微小肌营养不良蛋白转基因。

2000L规模实验与实施例5中所描述的相同，并且250L规模实验与实例4中所描述的相同。10L规模实验使用与更大规模实验相似的试剂和方法，以及使用静态在线混合器的转染系统，尽管规模相应较小。

基于用于这些实验的系统的泵送速率和其他特征，计算出每个实验的雷诺数，并且将其与从每个实验产生的AAV载体的效力相关联。载体效力通过测量用载体转导的分化肌管在体外产生的微小肌营养不良蛋白的量来确定。另外，使用毛细管凝胶电泳方法估计未完全填充有DNA的衣壳(部分填充的衣壳)的百分比。一般而言，较高百分比的完整衣壳被期望的。雷诺数(Re)被计算为Re＝ρvD/μ，其中ρ是转染混合体的密度(假设为997kg/m³)，v是转染混合体流动通过管路时的线速度(m/s)，D是管道的内径(m)，并且μ是粘度(假设为8.90x10^-4Pa*s)。

结果如表7所示。可以看到，与湍流相关的较高Re值(Re>4000)导致较低的载体效力，而与非湍流相关的较低Re值(Re<4000)导致较高的载体效力。这种关系在250L和2000L的产生规模下都是一致的。相同数据的图示表明，相对载体效力与雷诺数呈负相关(图9)。在更大的2000L规模下，在与非湍流相关的Re值较低的实验中产生的载体的部分填充的衣壳的百分比也有所降低。这些结果表明，用于AAV载体产生的连续流动转染系统可以被设计为避免转染混合体的湍流(例如，使得Re值＜4000)，以最大限度地提高潜在的载体效力和/或所得药物物质中完整衣壳的百分比。还研究了效力和孵育时间(转染混合体经过从静态在线混合器到生物反应器的管的长度的时间)之间的关系，但未发现相关性(数据未示出)。

表7

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Claims

1.一种用于用核酸转染宿主细胞的方法，该方法包含连续地形成包含转染试剂和核酸的转染混合体并将其递送到培养中的细胞中。

2.根据权利要求1所述的方法，其中转染混合体通过将单独的溶液混合来形成，每种溶液分别包含所述转染试剂和所述核酸。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转染试剂是阳离子聚合物。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转染试剂是聚乙烯亚胺(PEI)。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸是DNA。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述DNA是质粒DNA(pDNA)或杆粒DNA。

7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中所述转染试剂溶液和该核酸溶液包含细胞培养基。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转染混合体一旦形成，就在小于或约25、15、10、5或4分钟或者小于或约180、150、135、120、90、60、45、30或15秒内将其递送到该细胞中。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在小于或约120、90、60、45、40、30、20、15、10或5分钟内将基本上整个体积的转染混合体递送到该细胞中。

10.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述转染混合体包含足够的DNA，使得以以下值或范围转染细胞：至少或约0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00μg DNA/10⁶个活细胞，或从约0.50至1.00μg DNA/10⁶个活细胞的范围。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述转染混合体包含足够的PEI，使得所述转染混合体中PEI与DNA的质量比为至少或约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5或3.0，或在1.2至3.2的范围内，或为约2.2。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将转染混合体递送到活细胞(vc)密度为以下的细胞中：至少或约10x10⁶、15x10⁶、20x10⁶、25x10⁶、30x10⁶、35x10⁶、40x10⁶、45x10⁶或50x10⁶ vc/mL培养体积，或从约10x10⁶至30x10⁶ vc/mL、约15x10⁶至25x10⁶ vc/mL或约16x10⁶至24x10⁶ vc/mL的范围。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中递送到所述细胞中的转染混合体的体积为转染前细胞培养体积的至少或约10％、20％、25％、30％、35％、40％或45％，或在从约25％至45％或约30％至40％的范围内。

14.根据权利要求2至13中任一项所述的方法，其中所述转染试剂溶液包含10％至30％PEI(w/v)，并且该核酸溶液包含5％至15％DNA(w/v)。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞或昆虫细胞。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是BHK细胞、CHO细胞、HEK293细胞或HeLa细胞。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸包含编码生物产物或其组分的序列。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述核酸还包含与所述编码生物产物或其组分的序列可操作地连接的转录控制区。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述转录控制区包含启动子和任选的增强子。

20.根据权利要求17所述的方法，其中所述生物产物包含蛋白质或重组病毒载体的组分。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述重组病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体或反转录病毒载体。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸包含选自由以下各项组成的组的序列元件：用于病毒辅助因子的基因、AAV rep基因、AAV cap基因和载体基因组，该载体基因组包含能够被包装在AAV衣壳中的转基因。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在转染之前，培养中的细胞的体积为至少100L、500L或1000L。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包含在完成转染之后孵育细胞，并且分离由细胞因转染而制造的生物产物。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述生物产物是重组AAV载体，其中该方法能有效地产生滴度为以下的重组AAV载体：至少或约1x10¹⁰、5x10¹⁰、1x10¹¹、5x10¹¹、1x10¹²、5x10¹²或1x10¹³个载体基因组/毫升(vg/mL)转染后细胞悬浮液，并且其中该方法能有效地产生在通过尺寸排阻色谱纯化之后UV260/UV280吸光度比值为以下的重组AAV载体：至少或约0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8。

26.一种由根据权利要求24所述的方法产生的生物产物。

27.根据权利要求26所述的生物产物，其中所述生物产物是重组AAV载体。

28.一种用于转染细胞的系统，该系统包含(i)用于分别容纳转染试剂溶液和核酸溶液的装置，(ii)用于从它们各自的容纳装置泵送所述溶液的装置，(iii)用于混合所述溶液、形成转染混合体的装置，(iv)用于容纳待转染细胞的装置，以及(v)用于从所述溶液容纳装置到所述混合装置并从所述混合装置到所述细胞容纳装置的流体连通的装置。

29.根据权利要求28所述的系统，其中所述混合装置包含静态在线混合器。

30.根据权利要求28或29中任一项所述的系统，其中所述系统被配置成使得所述系统内转染混合体的流动不是湍流的。

31.根据权利要求28至30中任一项所述的系统，其中所述系统被配置成使得与所述系统内转染混合体的流动相关的雷诺数Re不超过3500的值。

32.根据权利要求28至30中任一项所述的系统，其中所述系统被配置成使得与所述系统内转染混合体的流动相关的雷诺数Re不超过4000的值。