CN116848269A - 多价颗粒组合物和使用方法 - Google Patents

多价颗粒组合物和使用方法 Download PDF

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陈长征
董国强
罗易灵
周华
孙天强
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Abstract

本文提供了用于阻断病毒感染的多价颗粒和多价颗粒的组合物。

Description

多价颗粒组合物和使用方法
交叉引用
本申请要求2020年10月30日提交的美国临时申请号63/108,105和2021年5月20日提交的美国临时申请号63/191,245的权益，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。
序列表
本申请包含按ASCII格式以电子方式提交并特此以引用的方式整体并入的序列表。所述ASCII副本创建于2021年10月25日，名称为48295-701601_SL.txt并且大小为107,372字节。
援引并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，其程度如同明确且单独地指示每个单独的出版物、专利或专利申请都以引用的方式并入。
发明内容
在某些实施方案中，本文公开了一种多价颗粒，其包含融合蛋白，融合蛋白包含结合病毒蛋白的哺乳动物多肽和跨膜多肽，其中融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少约10个拷贝。在一些实施方案中，病毒蛋白来自SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV、呼吸道合胞病毒、HIV或其组合。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含对病毒蛋白具有结合特异性的受体。在一些实施方案中，受体包含病毒进入受体或病毒附着受体。在一些实施方案中，受体是病毒进入受体和病毒附着受体。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含受体的细胞外结构域。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含配体或分泌蛋白。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含ACE2、TRMPSS2、DPP4、CD4、CCR5、CXCR4、CD209或CLEC4M。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，跨膜多肽将融合蛋白锚定到多价颗粒的双分子层。在一些实施方案中，跨膜多肽包含刺突糖蛋白跨膜区、哺乳动物膜蛋白、包膜蛋白、核衣壳蛋白或细胞跨膜蛋白。在一些实施方案中，跨膜多肽包含VSVG跨膜区、刺突蛋白S1跨膜区、刺突蛋白S2跨膜区、辛德毕斯病毒包膜(SINDBIS)蛋白、来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白、麻疹病毒融合(F)蛋白的包膜糖蛋白、RD114、BaEV、GP41或GP120。在一些实施方案中，VSVG跨膜区包含全长VSVG跨膜区或截短VSVG跨膜区。在一些实施方案中，跨膜多肽包含VSVG跨膜区和VSVG胞质尾区。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少约50个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少约75个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少约100个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少约150个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少约200个拷贝。
在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含ACE2，并且跨膜多肽包含VSVG跨膜区。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含ACE2，并且跨膜多肽包含刺突蛋白S2跨膜区。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含ACE2，并且跨膜多肽包含包膜病毒的表面糖蛋白跨膜区。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含DPP4，并且跨膜多肽包含来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白。在一些实施方案中，来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白是来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白的变体。在一些实施方案中，多价颗粒还包含第二融合蛋白，第二融合蛋白包含结合病毒蛋白的第二哺乳动物多肽和第二跨膜多肽，其中第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少约10个拷贝。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含对病毒蛋白具有结合特异性的受体。在一些实施方案中，受体包含病毒进入受体或病毒附着受体。在一些实施方案中，受体是病毒进入受体和病毒附着受体。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含受体的细胞外结构域。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含配体或分泌蛋白。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含ACE2、TRMPSS2、DPP4、CD4、CCR5、CXCR4、CD209或CLEC4M。
在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含跨膜锚定蛋白。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含刺突糖蛋白跨膜区、哺乳动物膜蛋白、包膜蛋白、核衣壳蛋白或细胞跨膜蛋白。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含VSVG跨膜区、刺突蛋白S1跨膜区、刺突蛋白S2跨膜区、辛德毕斯病毒包膜(SINDBIS)蛋白、来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白、麻疹病毒融合(F)蛋白的包膜糖蛋白、RD114、BaEV、GP41或GP120。在一些实施方案中，VSVG跨膜区包含全长VSVG跨膜区或截短VSVG跨膜区。在一些实施方案中，跨膜多肽包含VSVG跨膜区和VSVG胞质尾区。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少约50个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少约75个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少约100个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少约150个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少约200个拷贝。
在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含ACE2，并且第二跨膜多肽包含VSVG跨膜区。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含ACE2，并且第二跨膜多肽包含刺突蛋白S2跨膜区。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含ACE2，并且第二跨膜多肽包含包膜病毒的表面糖蛋白。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含DPP4，并且第二跨膜多肽包含来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白。在一些实施方案中，来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白是来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白的变体。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含病毒进入受体，并且第二哺乳动物多肽包含病毒附着受体。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含ACE2，跨膜多肽包含VSVG跨膜区、刺突蛋白S1跨膜区、刺突蛋白S2跨膜区或包膜病毒的表面糖蛋白，第二哺乳动物多肽包含硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，并且第二跨膜多肽包含VSVG跨膜区、刺突蛋白S1跨膜区、刺突蛋白S2跨膜区或包膜病毒的表面糖蛋白。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含CD4，并且第二哺乳动物肽包含CCR5、CXCR4或两者。
在一些实施方案中，多价颗粒在中和测定中包含小于5皮摩尔(pM)的IC50。在一些实施方案中，多价颗粒在中和测定中包含小于2.5皮摩尔(pM)的IC50。在一些实施方案中，多价颗粒在中和测定中包含小于1皮摩尔(pM)的IC50。在一些实施方案中，多价颗粒不包含病毒遗传物质。在一些实施方案中，多价颗粒是合成的。在一些实施方案中，多价颗粒是重组的。在一些实施方案中，多价颗粒是病毒样颗粒。在一些实施方案中，多价颗粒是细胞外囊泡。在一些实施方案中，多价颗粒是外泌体。在一些实施方案中，多价颗粒是核外粒体。在一些实施方案中，融合蛋白还包含寡聚化结构域。在一些实施方案中，在寡聚化结构域中有二聚化结构域。在一些实施方案中，二聚化结构域包含亮氨酸拉链二聚化结构域。在一些实施方案中，寡聚化结构域是三聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含病毒表面蛋白的融合后寡聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含VSV-G蛋白的D4融合后三聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含登革E蛋白融合后三聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含foldon三聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含人α1(I)胶原的C-前导肽。在一些实施方案中，寡聚化结构域是四聚化结构域。在一些实施方案中，四聚化结构域包含流感神经氨酸酶干结构域。
在一些实施方案中，寡聚化结构域包含与根据SEQ ID NO:5-18或28的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，当融合蛋白在多价颗粒的表面上表达时，寡聚化结构域在多价颗粒的外部。在一些实施方案中，当融合蛋白在多价颗粒的表面上表达时，寡聚化结构域在多价颗粒的外部并且与信号肽相邻。在一些实施方案中，当融合蛋白在多价颗粒的表面上表达时，寡聚化结构域在多价颗粒的内部。在一些实施方案中，当融合蛋白在多价颗粒的表面上表达时，寡聚化结构域在多价颗粒的内部并且与跨膜多肽相邻。在一些实施方案中，融合蛋白包含信号肽。
在一些实施方案中，融合蛋白的结构域从N-末端到C-末端按以下顺序排列：
(a)信号肽、结合病毒表面蛋白的病毒进入受体的细胞外结构域、寡聚化结构域、跨膜多肽和细胞溶质结构域；
(b)信号肽、结合病毒表面蛋白的病毒进入受体的细胞外结构域、跨膜多肽、寡聚化结构域和细胞溶质结构域；或
(c)信号肽、寡聚化结构域、病毒进入受体的细胞外结构域、跨膜多肽和细胞溶质结构域。
在某些实施方案中，本文公开了组合物，其包含：第一核酸序列，其编码多价颗粒，多价颗粒包含融合蛋白，融合蛋白包含结合病毒蛋白的病毒进入受体的细胞外结构域和跨膜多肽，其中当多价颗粒被表达时，融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少约10个拷贝；和赋形剂。在一些实施方案中，病毒蛋白来自SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV、呼吸道合胞病毒、HIV或其组合。在一些实施方案中，组合物还包含第二核酸序列，其编码一种或多种包装病毒蛋白。在一些实施方案中，一种或多种包装病毒蛋白是慢病毒蛋白、逆转录病毒蛋白、腺病毒蛋白或其组合。在一些实施方案中，一种或多种包装病毒蛋白包含gag、pol、pre、tat、rev或其组合。在一些实施方案中，组合物还包含第三核酸序列，其编码复制无能病毒基因组、报道分子、治疗性分子或其组合。
在一些实施方案中，病毒基因组来源于水疱性口炎病毒、麻疹病毒、肝炎病毒、流感病毒或其组合。在一些实施方案中，报道分子是荧光蛋白或荧光素酶。在一些实施方案中，荧光蛋白是绿色荧光蛋白。在一些实施方案中，治疗性分子是免疫调节蛋白、细胞信号调节分子、增殖调节分子、细胞死亡调节分子或其组合。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含对病毒蛋白具有结合特异性的受体。在一些实施方案中，受体包含病毒进入受体或病毒附着受体。在一些实施方案中，受体是病毒进入受体和病毒附着受体。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含受体的细胞外结构域。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含配体或分泌蛋白。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含ACE2、TRMPSS2、DPP4、CD4、CCR5、CXCR4、CD209或CLEC4M。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQID NO:2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，跨膜多肽包含跨膜锚定蛋白。在一些实施方案中，跨膜多肽包含刺突糖蛋白跨膜区、哺乳动物膜蛋白、包膜蛋白、核衣壳蛋白或细胞跨膜蛋白。在一些实施方案中，跨膜多肽包含VSVG跨膜区、刺突蛋白S1跨膜区、刺突蛋白S2跨膜区、辛德毕斯病毒包膜(SINDBIS)蛋白、来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白、麻疹病毒融合(F)蛋白的包膜糖蛋白、RD114、BaEV、GP41或GP120。在一些实施方案中，VSVG跨膜区包含全长VSVG跨膜区或截短VSVG跨膜区。在一些实施方案中，跨膜多肽包含VSVG跨膜区和VSVG胞质尾区。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白还包含寡聚化结构域。在一些实施方案中，寡聚化结构域是二聚化结构域。在一些实施方案中，二聚化结构域包含亮氨酸拉链二聚化结构域。在一些实施方案中，寡聚化结构域是三聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含病毒表面蛋白的融合后寡聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含VSV-G蛋白的D4融合后三聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含登革E蛋白融合后三聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含foldon三聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含人α1(I)胶原的C-前导肽。在一些实施方案中，寡聚化结构域是四聚化结构域。在一些实施方案中，四聚化结构域包含流感神经氨酸酶干结构域。在一些实施方案中，寡聚化结构域包含与根据SEQ ID NO:5-18或28的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，当融合蛋白在多价颗粒的表面上表达时，寡聚化结构域在多价颗粒的外部。在一些实施方案中，当融合蛋白在多价颗粒的表面上表达时，寡聚化结构域在多价颗粒的外部并且与信号肽相邻。在一些实施方案中，当融合蛋白在多价颗粒的表面上表达时，寡聚化结构域在多价颗粒的内部。在一些实施方案中，当融合蛋白在多价颗粒的表面上表达时，寡聚化结构域在多价颗粒的内部并且与跨膜多肽相邻。在一些实施方案中，当融合蛋白被表达时，它在多价颗粒的表面上表达至少约50个拷贝。在一些实施方案中，当融合蛋白被表达时，它在多价颗粒的表面上表达至少约75个拷贝。在一些实施方案中，当融合蛋白被表达时，它在多价颗粒的表面上表达至少约100个拷贝。在一些实施方案中，当融合蛋白被表达时，它在多价颗粒的表面上表达至少约150个拷贝。在一些实施方案中，当融合蛋白被表达时，它在多价颗粒的表面上表达至少约200个拷贝。
在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含ACE2，并且跨膜多肽包含VSVG跨膜区。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含ACE2，并且跨膜多肽包含刺突蛋白S2跨膜区。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含ACE2，并且跨膜多肽包含包膜病毒的表面糖蛋白。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含DPP4，并且跨膜多肽包含来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白。在一些实施方案中，来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白是来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白的变体。在一些实施方案中，组合物还包含第四核酸序列，其编码第二融合蛋白，第二融合蛋白包含结合病毒蛋白的第二哺乳动物多肽和第二跨膜多肽，其中当第二融合蛋白被表达时，它在多价颗粒的表面上表达至少约10个拷贝。
在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含对病毒蛋白具有结合特异性的受体。在一些实施方案中，受体包含病毒进入受体或病毒附着受体。在一些实施方案中，受体是病毒进入受体和病毒附着受体。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含受体的细胞外结构域。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含配体或分泌蛋白。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含ACE2、TRMPSS2、DPP4、CD4、CCR5、CXCR4、CD209或CLEC4M。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含跨膜锚定蛋白。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含刺突糖蛋白跨膜区、哺乳动物膜蛋白、包膜蛋白、核衣壳蛋白或细胞跨膜蛋白。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含VSVG跨膜区、刺突蛋白S1跨膜区、刺突蛋白S2跨膜区、辛德毕斯病毒包膜(SINDBIS)蛋白、来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白、麻疹病毒融合(F)蛋白的包膜糖蛋白、RD114、BaEV、GP41或GP120。在一些实施方案中，VSVG跨膜区包含全长VSVG跨膜区或截短VSVG跨膜区。在一些实施方案中，VSVG跨膜区包含VSVG跨膜区和VSVG胞质尾区。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第二融合蛋白还包含寡聚化结构域。在一些实施方案中，寡聚化结构域是二聚化结构域。在一些实施方案中，二聚化结构域包含亮氨酸拉链二聚化结构域。在一些实施方案中，寡聚化结构域是三聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含病毒表面蛋白的融合后寡聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含VSV-G蛋白的D4融合后三聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含登革E蛋白融合后三聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含foldon三聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含人α1(I)胶原的C-前导肽。在一些实施方案中，寡聚化结构域是四聚化结构域。在一些实施方案中，四聚化结构域包含流感神经氨酸酶干结构域。在一些实施方案中，寡聚化结构域包含与根据SEQ ID NO:5-18或28的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，当第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达时，寡聚化结构域在多价颗粒的外部。在一些实施方案中，当第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达时，寡聚化结构域在多价颗粒的外部并且与信号肽相邻。在一些实施方案中，当第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达时，寡聚化结构域在多价颗粒的内部。在一些实施方案中，当第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达时，寡聚化结构域在多价颗粒的内部并且与跨膜多肽相邻。在一些实施方案中，当第二融合蛋白被表达时，它在多价颗粒的表面上表达至少约50个拷贝。在一些实施方案中，当第二融合蛋白被表达时，它在多价颗粒的表面上表达至少约75个拷贝。在一些实施方案中，当第二融合蛋白被表达时，它在多价颗粒的表面上表达至少约100个拷贝。在一些实施方案中，当第二融合蛋白被表达时，它在多价颗粒的表面上表达至少约150个拷贝。在一些实施方案中，当第二融合蛋白被表达时，它在多价颗粒的表面上表达至少约200个拷贝。
在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含ACE2，并且第二跨膜多肽包含VSVG跨膜区。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含ACE2，并且第二跨膜多肽包含刺突蛋白S2跨膜区。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含ACE2，并且第二跨膜多肽包含包膜病毒的表面糖蛋白。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含DPP4，并且第二跨膜多肽包含来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白。在一些实施方案中，来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白是来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白的变体。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含病毒进入受体，并且第二哺乳动物多肽包含病毒附着受体。
在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含ACE2，跨膜多肽包含VSVG跨膜区、刺突蛋白S1跨膜区、刺突蛋白S2跨膜区或包膜病毒的表面糖蛋白，第二哺乳动物多肽包含硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，并且第二跨膜多肽包含VSVG跨膜区、刺突蛋白S1跨膜区、刺突蛋白S2跨膜区或包膜病毒的表面糖蛋白。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含CD4，并且第二哺乳动物肽包含CCR5、CXCR4或两者。在一些实施方案中，第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列在同一载体内。在一些实施方案中，第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列在不同载体内。在一些实施方案中，第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列在同一载体内。在一些实施方案中，第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列在不同载体内。在一些实施方案中，编码第一融合蛋白和第二融合蛋白的核酸序列以及第二核酸序列和第三核酸序列是mRNA。在一些实施方案中，编码第一融合蛋白和第二融合蛋白的核酸序列以及第二核酸序列和第三核酸序列是DNA。在一些实施方案中，组合物包含载体，其中载体是慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
在某些实施方案中，本文公开了药物组合物，其包含本文所公开的多价颗粒和药学上可接受的赋形剂。
在某些实施方案中，本文公开了治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括向对象施用本公开的多价颗粒或本公开的组合物。在一些实施方案中，多价颗粒静脉内施用。在一些实施方案中，多价颗粒通过吸入施用。在一些实施方案中，多价颗粒通过腹膜内注射施用。在一些实施方案中，多价颗粒通过皮下注射施用。在一些实施方案中，病毒感染包括SARS CoV-2、SARS CoV-1、MERS CoV的感染。在一些实施方案中，组合物静脉内施用。在一些实施方案中，组合物通过吸入施用。在一些实施方案中，组合物通过腹膜内注射施用。在一些实施方案中，组合物通过皮下注射施用。在一些实施方案中，组合物包含脂质体。在一些实施方案中，组合物包含腺相关病毒(AAV)。在一些实施方案中，组合物包含脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，组合物包含聚合物。在一些实施方案中，SARS CoV-2、SARSCoV-1、MERS CoV在体内被多价颗粒或组合物有效地中和。在一些实施方案中，多价颗粒或组合物抑制病毒感染的呼吸道症状。在一些实施方案中，多价颗粒或组合物诱导针对病毒感染的不同毒株的强大免疫力。在一些实施方案中，病毒感染包括SARS CoV-2的感染，并且多价颗粒或组合物诱导针对SARS CoV-2的德尔塔变体的强大免疫力。
在某些实施方案中，本文公开了产生针对有需要的对象的病毒感染的免疫力的方法，所述方法包括向对象施用本公开的多价颗粒或本公开的组合物和病毒感染的病毒。在一些实施方案中，多价颗粒静脉内施用。在一些实施方案中，多价颗粒通过吸入施用。在一些实施方案中，多价颗粒通过腹膜内注射施用。在一些实施方案中，多价颗粒通过皮下注射施用。在一些实施方案中，病毒感染包括SARS CoV-2、SARS CoV-1、MERS CoV的感染。在一些实施方案中，组合物静脉内施用。在一些实施方案中，组合物通过吸入施用。在一些实施方案中，组合物通过腹膜内注射施用。在一些实施方案中，组合物通过皮下注射施用。在一些实施方案中，组合物包含脂质体。在一些实施方案中，组合物包含腺相关病毒(AAV)。在一些实施方案中，组合物包含脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，组合物包含聚合物。
在一些实施方案中，SARS CoV-2、SARS CoV-1、MERS CoV在体内被多价颗粒或组合物有效地中和。在一些实施方案中，多价颗粒或组合物抑制病毒感染的呼吸道症状。在一些实施方案中，多价颗粒或组合物诱导针对病毒感染的不同毒株的强大免疫力。在一些实施方案中，病毒感染包括SARS CoV-2的感染，并且多价颗粒或组合物诱导针对SARS CoV-2的德尔塔变体的强大免疫力。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中特别地阐述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在附图中：
图1A描绘具有由ACE2细胞外结构域和病毒包膜蛋白的膜锚定区段组成的融合蛋白的假性分型慢病毒颗粒的示意图。图1B描绘不同多价颗粒的ACE2效价的定量蛋白质印迹分析。图1C显示如使用qNano仪器通过可调电阻脉冲传感分析(Tunable Resistive PulseSensing Analysis)所确定的ACE2-VGTM MVP的颗粒大小分布。图1D显示ACE2-VGTM MVP的代表性电子显微镜图像，标称放大率为150,000X。
图2A描绘使用293T/ACE2细胞作为靶细胞的微量中和测定的结果。图2B描绘不同多价颗粒对假病毒感染的最大抑制。图2C描绘中和诱饵ACE2-MVP与假病毒颗粒之间的化学计量比，如通过P24ELISA测定所确定。图2D描绘使用诱饵ACE2-MVP和两种中和抗体的微量中和测定的结果。
图3A描绘用SARS CoV-1刺突假性分型(pseudotyped)的慢病毒(CoV-1PVP)的中和。图3B描绘在使用VERO-E6细胞作为靶细胞的CoV-1PVP中和中ACE2-MVP的中和活性。图3C描绘使用293T/ACE2细胞作为靶细胞的针对Cov-1、Cov-2 WT和Cov-2 D614G假性分型病毒的微量中和测定的结果。图3D描绘使用H1573/ACE2细胞作为靶细胞的针对Cov-1、Cov-2 WT和Cov-2 D614G假性分型病毒的微量中和测定的结果。图3E显示在使用293T/ACE2细胞作为靶细胞的假病毒感染测定中ACE2-VGTM MVP针对多种SARS CoV-2变体的中和活性的比较。
图4A描绘具有包含来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白(HCΔ18)和DPP4细胞外结构域的融合蛋白的诱饵DPP4-MVP的示意图。图4B描绘不同多价颗粒的HCΔ-DPP4效价的定量蛋白质印迹分析。图4C描绘在使用H1650细胞作为靶细胞的微量中和测定中测试了DDP4-MVP针对用MERS刺突假性分型的慢病毒(MERS-PVP)的中和活性。图4D显示NA75-DPP4 MVP的设计和产生。示意图示出具有DPP4细胞外结构域与来自流感病毒的神经氨酸酶跨膜结构域的融合物的DPP4展示构建体。NA75-DPP4 MVP通过将NA75-DPP4展示构建体与慢病毒包装构建体和慢病毒报道分子构建体共同转染而生成。图4E显示在使用H1650细胞作为靶细胞的MERS假病毒感染测定中确定的NA75-DPP4 MVP的中和活性。
图5描绘展示酶失活(enzymatic-inactive)H2A-ACE2的诱饵MVP(指定为H2A/ACE2-MVP)针对CoV-2假病毒的中和活性降低。在使用293T/ACE2细胞作为靶细胞的SARSCoV-2假病毒感染测定中，确定了展示野生型ACE2或酶失活H2A/ACE2的诱饵MVP的中和活性。
图6A-6E描绘野生型和酶失活ACE2在多价颗粒上的寡聚化展示。图6A描绘具有呈三聚化结构域的D4结构域的融合后VSV-G的结构。图6B描绘示出寡聚化ACE2展示构建体的示意图，所述构建体具有ACE2细胞外结构域与VSVG跨膜结构域的融合物(ACE2-VGTN)以实现单体展示或其与D4融合后三聚化结构域和VSVG跨膜结构域的融合物(ACE2-D4VG)以实现三聚体展示。展示野生型ACE2(WT-ACE2)和酶失活ACE2(H2A/ACE2)的诱饵MVP通过将对应的ACE2展示构建体与慢病毒包装构建体和慢病毒报道分子构建体共同转染而生成。图6C描绘通过定量蛋白质印迹分析确定了诱饵MVP上ACE2分子的拷贝数。图6D显示ACE2-D4VG MVP的代表性TRPS分析。图6E显示H2A/ACE2-D4VG MVP的代表性电子显微镜图像，标称放大率为150,000X。
图7A-7C描绘通过酶促失活H2A/ACE2在MVP上的寡聚化展示来加强诱饵MVP的中和活性。图7A描绘单体和三聚体野生型ACE2-MVP和酶促失活H2A/ACE2 MVP的中和活性，如在使用293T/ACE2细胞作为靶细胞的SARS CoV-2假病毒感染测定中所确定。图7B描绘单体和三聚体野生型ACE2 MVP和酶促失活H2A/ACE2MVP的中和活性，如在使用VERO-E6细胞作为靶细胞的SARS CoV-1假病毒感染测定中所确定。图7C在使用293T/ACE2细胞作为靶细胞的假病毒感染测定中比较了H2A/ACE2-D4VG MVP针对多种SARS CoV-2变体的中和活性。
图8A-8B描绘ACE2-MVP在预混合的活SARS CoV-2病毒中和测定中的抗病毒活性。在SARS CoV-2活病毒中和测定中确定了单体野生型ACE2-MVP:WT-VGTM(图8A)和三聚体酶促失活H2A/ACE2-MVP:H2A-D4VG的中和活性(图8B)。
图9A-9B描绘经由PRNT测定确定了三聚体H2A/ACE2-MVP针对活野生型SARS CoV-2(图9A)或南非变体SARS CoV-2(图9B)的中和活性。
图10A-10B描绘三聚体H2A/ACE2-MVP在仓鼠的SARS CoV-2活病毒感染的暴露后治疗中的功效。图10A描绘三聚体H2A/ACE2-MVP治疗对体重减轻的影响，并且图10B描绘三聚体H2A/ACE2-MVP治疗对肺中的病毒载量的影响。
图11A-11B显示三聚体H2A/ACE-MVP在hACE2转基因小鼠的SARS CoV-2活病毒和变体感染的暴露后治疗的功效。图11A描绘三聚体H2A/ACE-MVP治疗对SARS CoV-2感染的hACE2转基因小鼠的存活的影响。图11B显示感染SARS CoV-2的原始WA毒株的hACE2转基因小鼠的体重减轻的效果。图11C描绘三聚体H2A/ACE2-MVP治疗对SARS CoV-2德尔塔变体感染的hACE2转基因小鼠的存活的影响。图11D显示感染SARS CoV-2德尔塔变体的hACE2转基因小鼠的体重减轻的效果。
图12A-12D显示使用三聚体H2A/ACE2-MVP治疗从原发性SARS CoV-2感染挽救的hACE2转基因小鼠对以原始SARS CoV-2毒株或德尔塔变体毒株的重感染具有抗性。图12A显示SARS CoV-2重攻击对受感染的hACE2转基因小鼠的体重的影响。图12B显示SARS CoV-2重攻击对受感染的hACE2转基因小鼠的存活的影响。图12C显示德尔塔变体重攻击对受感染的hACE2转基因小鼠的体重的影响。图12D显示德尔塔变体重攻击对受感染的hACE2转基因小鼠的存活的影响。
图13A-13D显示基于EV的ACE2-D4VG MVP的表征和体外中和功效。图13A显示使用qNano仪器通过可调电阻脉冲传感分析确定的基于EV的ACE2-D4VG MVP的颗粒大小分布。图13B显示在使用293T/ACE2细胞作为靶细胞的SARS CoV-2假病毒感染测定中确定的基于EV的ACE2-D4VG MVP的中和活性。图13C显示在SARS CoV-2活病毒中和测定中确定的基于EV的ACE2-D4VG MVP的中和活性。图13D显示基于EV的ACE2-D4VG MVP在图19C中描述的同一活病毒中和测定中的细胞毒性。
图14A示出单体展示载体的载体设计，所述单体展示载体表达由连接到VSVG跨膜和细胞内结构域的蛋白质组成的融合蛋白。图14B示出三聚体展示载体的载体设计，所述三聚体展示载体表达由连接到VSVG的D4融合后三聚化结构域，之后连接到VSVG的跨膜和细胞内结构域的蛋白质组成的融合蛋白。
图15A-15C示出单体包膜颗粒的生成。图15A显示通过将ACE2受体假性分型在具有病毒基因组的基于慢病毒的病毒样颗粒上的单体诱饵MVP产生。图15B显示通过将ACE2受体假性分型在不具有病毒基因组的基于慢病毒的病毒样颗粒上的单体诱饵MVP产生。图15C显示通过用ACE2受体假性分型细胞外囊泡的单体诱饵MVP产生。
图16A-16C示出三聚体包膜颗粒的生成。图16A-16C显示三聚体诱饵MVP的体外产生。图16A显示通过将ACE2受体假性分型到具有病毒基因组的基于慢病毒的病毒样颗粒上的三聚体诱饵MVP产生。图16B显示通过将ACE2受体假性分型到不具有病毒基因组的基于慢病毒的病毒样颗粒上的三聚体诱饵MVP产生。图16C显示通过用ACE2受体假性分型细胞外囊泡的三聚体诱饵MVP产生。
图17A-17C显示混合的单体和三聚体诱饵MVP的体外产生。图17A显示通过将病毒进入受体假性分型到具有病毒基因组的基于慢病毒的病毒样颗粒上的混合的单体和三聚体诱饵MVP产生。图17B显示通过将病毒进入受体假性分型到不具有病毒基因组的基于慢病毒的病毒样颗粒上的混合的单体和三聚体诱饵MVP产生。图17C显示通过用病毒进入受体假性分型细胞外囊泡的混合的单体和三聚体诱饵MVP产生。
图18A-18E示出D4三聚化结构域的位置和长度对诱饵MVP的中和功效的影响。图18A描绘诱饵受体展示构型，其中D4三聚化结构域位于诱饵MVP的外部并且与跨膜结构域相邻。图18B描绘诱饵受体展示构型，其中D4三聚化结构域位于诱饵MVP的内部并且与跨膜结构域相邻。图18C描绘诱饵受体展示构型，其中D4三聚化结构域位于诱饵MVP的外部并且在信号肽之后。图18D描绘用于诱饵受体在诱饵MVP上的三聚体展示的D4截短。图18E显示在使用293T/ACE2细胞作为靶细胞的SARS CoV-2假病毒感染测定中确定的D4位置和长度不同的ACE2-D4VG MVP的中和活性。
图19A-19C示出利用各种寡聚化结构域的诱饵受体展示载体的设计构型(列于表4)。图19A描绘诱饵受体展示构型，其中寡聚化结构域位于诱饵MVP的外部并且与跨膜结构域相邻。图19B描绘诱饵受体展示构型，其中寡聚化结构域位于诱饵MVP的内部并且与跨膜结构域相邻。图19C描绘诱饵受体展示构型，其中寡聚化结构域位于诱饵MVP的外部并且在信号肽之后。
具体实施方式
除非另有说明，否则本公开采用在本领域技术范围内的常规分子生物学技术。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
定义
贯穿本公开内容，多个实施方案以范围格式给出。应当理解，范围格式的描述只是为了方便和简明，而不应被解释为对任何实施方案的范围的硬性限制。因此，除非上下文另有明确规定，否则对范围的描述应被认为明确公开了所有可能的子范围以及该范围内精确到下限单位十分之一的各个数值。例如，对诸如从1至6的范围的描述应被认为已经明确公开了诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等子范围，以及该范围内的各个值，例如，1.1、2、2.3、5和5.9。无论范围的宽度如何，这都是适用的。这些中间范围的上限和下限可独立地包括在更小的范围内，并且也被涵盖于本公开内容中，受所述范围中任何具体排除的限值所约束。除非上下文另有明确规定，否则在所述范围包括限值之一或两者的情况下，排除了这些所包含的限值中的任一个或两者的范围也被包括在本公开内容中。
本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而非旨在限制任何实施方案。如本文所用，单数形式“一个(a/an)”、“一种(a/an)”和“所述(the)”也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确指示。还将理解，当在本说明书中使用术语“包括”(“comprises”和/或“comprising”)时，其指定了所述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组分的存在，但并不排除一个或多个其他特征、整体、步骤、操作、元素、组分和/或其群组的存在或添加。如本文所用，术语“和/或”包括一个或多个相关联的所列项目的任何和所有组合。
除非特别说明或从上下文可以明显看出，否则如本文所用，术语“约”在提及数值或数值范围时应理解为是指所述数值+/-其10％，或对于一个范围中列出的值，则指从比列出的下限低10％到比列出的上限高10％。
多价颗粒
COVID-19大流行病在人的生命和经济活动方面造成了巨大的损失。目前的策略，诸如用于中和病毒的抗体疗法，不是完全有效的。这部分是由于病毒能够适应策略，有效地进入宿主细胞，同时避开宿主免疫系统的控制。几乎所有病毒都利用多价策略以实现附着和宿主细胞进入。每个病毒体都展示数百个刺突蛋白拷贝，它们可以同时与多个宿主细胞受体和附着蛋白拷贝相互作用。
就冠状病毒而言，SARS CoV-2病毒体展示数百个三聚体刺突蛋白拷贝，并且利用刺突蛋白与宿主细胞蛋白之间的局部三聚体以及全局多价相互作用以实现附着和进入。例如，宿主细胞受体血管紧张素转换酶2(ACE2)和二肽基肽酶4(DPP4)分别被用作SARS CoV-1/2和MERS冠状病毒的进入受体。病毒体上致密包装的刺突蛋白使它们能够与宿主细胞表面上的多个ACE2或DPP4拷贝相互作用。病毒通过多价相互作用而获得的功能性亲和力的加强是指数级的，并且几乎所有的有包膜和无包膜病毒都使用这种多价策略以实现附着和宿主细胞进入。这为病毒提供了巨大的优势。最值得注意的是，多价策略使病毒能够将以毫摩尔结合亲和力的相对较弱的单价相互作用变成以在纳摩尔至皮摩尔范围内的功能性亲和力的超强多价相互作用，继而产生低价或单价结合剂(诸如中和抗体和重组蛋白抑制剂)需要克服的高阈值。此外，病毒的突变率高并且与宿主细胞多价结合来促进免疫逃逸。刺突诱变和新颖的糖基化模式可以有效地破坏抗体和其他低效价病毒阻断剂的中和功能，而对病毒附着和进入几乎没有影响。目前的病毒中和分子开发没有解决病毒体和宿主细胞相互作用的多价性。出现了对目前的经临床测试的中和抗体的组合具有抗性的突变，并且此类突变使现有的疗法无效或效果不佳。
鉴于病毒体上的三聚体和多价刺突呈递是SASR CoV-2通过快速诱变逃逸免疫控制的能力的基础，这里我们描述了展示多个病毒进入受体(诸如ACE2和DPP4)拷贝的多价颗粒(MVP)，反映了病毒体上刺突蛋白的三聚体多价模式。我们证明了，MVP有效抵消病毒与宿主细胞蛋白之间的多价相互作用，并且对诸如冠状病毒的病毒的效力提高。最重要的是，MVP对刺突诱变不敏感，并且因此是防变异的(variant-proof)中和治疗剂。最后，在代表性动物模型中对SARS CoV-2感染的治疗可以有效挽救致死性感染，并且诱导针对包括德尔塔变体的优势SARS CoV-2毒株的强大免疫力。
在一些实施方案中，本文描述了展示作为SARS CoV-1/2的中和诱饵的ACE2进入受体的MVP。在一些实施方案中，ACE2 MVP抑制SARS CoV-2病毒的感染，在假病毒和活病毒中和测定中IC50低于皮摩尔(sub-picomolar)。在一些实施方案中，ACE2 MVP比ACE2重组蛋白或治疗性中和抗体更有效。在一些实施方案中，每个ACE2MVP中和至少约10个假性分型SARSCoV-2病毒体，并且ACE2密度较高的MVP可以更彻底地抑制病毒感染。在一些实施方案中，本公开的ACE2 MVP可以在低于皮摩尔的IC50下中和SARS CoV-2变体和SARS CoV-1，并且因此对利用ACE2作为进入受体的演化中的SARS冠状病毒具有广泛的中和作用。在一些实施方案中，ACE2 MVP对刺突诱变不敏感，并且因此是防变异的中和治疗剂。在一些实施方案中，展示二肽基肽酶4的MVP(DPP4-MVP)是MERS CoV的进入受体，可以在皮摩尔IC50下抑制MERS假病毒的感染。在一些实施方案中，ACE2 MVP有效地从致死性SARS CoV-2感染中挽救动物。在一些实施方案中，用ACE2 MVP治疗SARS CoV-2感染有效地诱导针对包括德尔塔变体的优势SARS CoV-2毒株的强大免疫力。
在一些实施方案中，本文描述了多价颗粒，其包含融合蛋白，融合蛋白包含跨膜多肽和结合病毒蛋白的哺乳动物多肽。在一些实施方案中，病毒蛋白来自SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV、呼吸道合胞病毒、HIV或其组合。在一些实施方案中，病毒蛋白来自SARS-CoV-2。在一些实施方案中，病毒蛋白来自MERS-CoV。在一些实施方案中，病毒蛋白来自SARS-CoV-1。
本文设想了各种多价颗粒。在一些实施方案中，多价颗粒是合成的。在一些实施方案中，多价颗粒是重组的。在一些实施方案中，多价颗粒不包含病毒遗传物质。在一些实施方案中，多价颗粒是病毒样颗粒(viral-like particle)或病毒样颗粒(virus-likeparticle)。如本文所用，病毒样颗粒(viral-like particle)和病毒样颗粒(virus-likeparticle)可以互换。在一些实施方案中，病毒样颗粒是合成的。在一些实施方案中，病毒样颗粒是重组的。在一些实施方案中，病毒样颗粒不包含病毒遗传物质。在一些实施方案中，多价颗粒是细胞外囊泡。在一些实施方案中，多价颗粒是外泌体。在一些实施方案中，多价颗粒是核外粒体。
在一些实施方案中，如本文所述的多价颗粒包含融合蛋白，其中融合蛋白在多价颗粒的表面上以多个拷贝表达。在一些实施方案中，融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400或多于400个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约5至约400、约20至约400、约10至约300、约20至约300、约20至约200、约50至约150、约20至约100或约50至约100个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约10个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约25个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约50个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约75个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约100个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约125个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约150个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约175个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约200个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约225个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约250个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约275个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约300个拷贝。
在一些实施方案中，多价颗粒是病毒样颗粒。在一些实施方案中，如本文所述的病毒样颗粒包含融合蛋白，其中融合蛋白在病毒样颗粒的表面上以多个拷贝表达。在一些实施方案中，融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400或多于400个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约5至约400、约20至约400、约10至约300、约20至约300、约20至约200、约50至约150、约20至约100或约50至约100个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约10个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约25个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约50个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约75个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约100个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约125个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约150个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约175个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约200个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约225个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约250个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约275个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约300个拷贝。
在一些实施方案中，多价颗粒是细胞外囊泡。在一些实施方案中，如本文所述的细胞外囊泡包含融合蛋白，其中融合蛋白在细胞外囊泡的表面上以多个拷贝表达。在一些实施方案中，融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400或多于400个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约5至约400、约20至约400、约10至约300、约20至约300、约20至约200、约50至约150、约20至约100或约50至约100个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约10个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约25个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约50个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约75个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约100个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约125个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约150个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约175个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约200个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约225个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约250个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约275个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约300个拷贝。
在一些实施方案中，多价颗粒是外泌体。在一些实施方案中，如本文所述的外泌体包含融合蛋白，其中融合蛋白在外泌体的表面上以多个拷贝表达。在一些实施方案中，融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400或多于400个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约5至约400、约20至约400、约10至约300、约20至约300、约20至约200、约50至约150、约20至约100或约50至约100个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约10个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约25个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约50个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约75个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约100个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约125个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约150个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约175个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约200个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约225个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约250个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约275个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约300个拷贝。
在一些实施方案中，多价颗粒是核外粒体。在一些实施方案中，如本文所述的核外粒体包含融合蛋白，其中融合蛋白在核外粒体的表面上以多个拷贝表达。在一些实施方案中，融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400或多于400个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约5至约400、约20至约400、约10至约300、约20至约300、约20至约200、约50至约150、约20至约100或约50至约100个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约10个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约25个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约50个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约75个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约100个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约125个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约150个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约175个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约200个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约225个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约250个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约275个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约300个拷贝。
在一些实施方案中，多价颗粒是具有复制能力的病毒(replication competentvirus)。在一些实施方案中，如本文所述的具有复制能力的病毒包含融合蛋白，其中融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上以多个拷贝表达。在一些实施方案中，融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400或多于400个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约5至约400、约20至约400、约10至约300、约20至约300、约20至约200、约50至约150、约20至约100或约50至约100个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约10个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约25个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约50个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约75个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约100个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约125个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约150个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约175个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约200个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约225个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约250个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约275个拷贝。在一些实施方案中，融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约300个拷贝。
在一些实施方案中，如本文所述的多价颗粒包含第二融合蛋白，其中第二融合蛋白在多价颗粒的表面上以多个拷贝表达。在一些实施方案中，第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400或多于400个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约5至约400、约20至约400、约10至约300、约20至约300、约20至约200、约50至约150、约20至约100或约50至约100个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约10个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约25个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约50个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约75个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约100个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约125个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约150个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约175个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约200个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约225个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约250个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约275个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在多价颗粒的表面上表达至少或约300个拷贝。
在一些实施方案中，如本文所述的病毒样颗粒包含第二融合蛋白，其中第二融合蛋白在病毒样颗粒的表面上以多个拷贝表达。在一些实施方案中，第二融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400或多于400个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约5至约400、约20至约400、约10至约300、约20至约300、约20至约200、约50至约150、约20至约100或约50至约100个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约10个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约25个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约50个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约75个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约100个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约125个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约150个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约175个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约200个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约225个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约250个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约275个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在病毒样颗粒的表面上表达至少或约300个拷贝。
在一些实施方案中，如本文所述的细胞外囊泡包含第二融合蛋白，其中第二融合蛋白在细胞外囊泡的表面上以多个拷贝表达。在一些实施方案中，第二融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400或多于400个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约5至约400、约20至约400、约10至约300、约20至约300、约20至约200、约50至约150、约20至约100或约50至约100个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约10个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约25个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约50个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约75个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约100个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约125个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约150个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约175个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约200个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约225个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约250个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约275个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在细胞外囊泡的表面上表达至少或约300个拷贝。
在一些实施方案中，如本文所述的外泌体包含第二融合蛋白，其中第二融合蛋白在外泌体的表面上以多个拷贝表达。在一些实施方案中，第二融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400或多于400个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约5至约400、约20至约400、约10至约300、约20至约300、约20至约200、约50至约150、约20至约100或约50至约100个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约10个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约25个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约50个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约75个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约100个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约125个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约150个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约175个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约200个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约225个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约250个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约275个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在外泌体的表面上表达至少或约300个拷贝。
在一些实施方案中，如本文所述的核外粒体包含第二融合蛋白，其中第二融合蛋白在核外粒体的表面上以多个拷贝表达。在一些实施方案中，第二融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400或多于400个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约5至约400、约20至约400、约10至约300、约20至约300、约20至约200、约50至约150、约20至约100或约50至约100个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约10个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约25个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约50个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约75个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约100个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约125个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约150个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约175个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约200个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约225个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约250个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约275个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在核外粒体的表面上表达至少或约300个拷贝。
在一些实施方案中，如本文所述的具有复制能力的病毒包含第二融合蛋白，其中第二融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上以多个拷贝表达。在一些实施方案中，第二融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400或多于400个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约5至约400、约20至约400、约10至约300、约20至约300、约20至约200、约50至约150、约20至约100或约50至约100个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约10个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约25个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约50个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约75个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约100个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约125个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约150个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约175个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约200个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约225个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约250个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约275个拷贝。在一些实施方案中，第二融合蛋白在具有复制能力的病毒的表面上表达至少或约300个拷贝。
在一些实施方案中，本文描述了包含改善的结合特性的多价颗粒。在一些实施方案中，多价颗粒包含小于100pM、小于200pM、小于300pM、小于400pM、小于500pM、小于600pM、小于700pM、小于800pM或小于900pM的与病毒蛋白的结合亲和力(例如，KD)。在一些实施方案中，多价颗粒包含小于1nM、小于1.2nM、小于2nM、小于5nM或小于10nM的KD。在一些情况下，多价颗粒包含小于1nM的KD。在一些情况下，多价颗粒包含小于1.2nM的KD。在一些情况下，多价颗粒包含小于2nM的KD。在一些情况下，多价颗粒包含小于5nM的KD。在一些情况下，多价颗粒包含小于10nM的KD。
在一些实施方案中，多价颗粒在中和测定中包含小于20皮摩尔(pM)的IC50。在一些实施方案中，多价颗粒在中和测定中包含小于15皮摩尔(pM)的IC50。在一些实施方案中，多价颗粒在中和测定中包含小于10皮摩尔(pM)的IC50。在一些实施方案中，多价颗粒在中和测定中包含小于5皮摩尔(pM)的IC50。在一些实施方案中，多价颗粒在中和测定中包含小于2.5皮摩尔(pM)的IC50。在一些实施方案中，多价颗粒在中和测定中包含小于1皮摩尔(pM)的IC50。在一些实施方案中，多价颗粒在中和测定中包含小于0.5皮摩尔(pM)的IC50。
哺乳动物多肽
在一些实施方案中，本文描述了多价颗粒，其包含融合蛋白，融合蛋白包含结合病毒蛋白的哺乳动物多肽和跨膜多肽，其中哺乳动物多肽包含对病毒蛋白具有结合特异性的受体。在一些实施方案中，受体包含病毒进入受体或病毒附着受体。在一些实施方案中，受体是病毒进入受体和病毒附着受体。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含受体的细胞外结构域。在一些实施方案中，哺乳动物多肽是I型受体。在一些实施方案中，哺乳动物多肽是II型受体。在一些实施方案中，哺乳动物多肽是多跨的(multi-span)跨膜蛋白。在一些实施方案中，哺乳动物多肽是从头设计的病毒结合蛋白。在一些实施方案中，从头设计的病毒结合蛋白包括使用噬菌体展示或酵母展示。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含配体或分泌蛋白。
在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含ACE2、TRMPSS2、DPP4、CD4、CCR5、CXCR4、CD209或CLEC4M。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含ACE2。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含DPP4。
在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有至少80％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少95％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少98％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少99％序列同源性的氨基酸序列。
在一些情况下，哺乳动物多肽包含有至少包含具有SEQ ID NO:1的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或多于800个连续氨基酸的部分的氨基酸序列。
如本文所用，关于序列的术语“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为：在比对序列并引入空位(如果需要以实现最大序列同一性百分比)后，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分，候选序列中与特定序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于测定氨基酸序列同一性百分比的比对可以本领域熟知的各种方式来实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，诸如EMBOSS MATCHER、EMBOSS WATER、EMBOSS STRETCHER、EMBOSS NEEDLE、EMBOSS LALIGN、BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括为了在被比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。
在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与、和或相对于给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性百分比(其可以替代地以短语表述为与、和或相对于给定氨基酸序列B具有或包含某一氨基酸序列同一性百分比的给定氨基酸序列A)计算如下：100乘分数X/Y，其中X是序列比对程序ALIGN-2在A和B的程序比对中被评分为相同匹配的氨基酸残基数，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列同一性百分比将不等于B与A的氨基酸序列同一性百分比。除非另外明确说明，否则本文所用的全部氨基酸序列同一性百分比值如紧接上一段中所述那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ IDNO:2的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少75％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ IDNO:2的氨基酸序列具有至少80％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少98％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少99％序列同源性的氨基酸序列。
在一些情况下，哺乳动物多肽包含有至少包含具有SEQ ID NO:2的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720或多于720个连续氨基酸的部分的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文描述了多价颗粒，其包含融合蛋白，融合蛋白包含结合病毒蛋白的哺乳动物多肽和跨膜多肽，其中多价颗粒还包含第二融合蛋白，第二融合蛋白包含结合病毒蛋白的第二哺乳动物多肽和第二跨膜多肽。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含对病毒蛋白具有结合特异性的受体。在一些实施方案中，受体包含病毒进入受体或病毒附着受体。在一些实施方案中，受体是病毒进入受体和病毒附着受体。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含受体的细胞外结构域。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽是I型受体。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽是II型受体。在一些实施方案中，哺乳动物多肽是多跨的(multi-span)跨膜蛋白。在一些实施方案中，哺乳动物多肽是从头设计的病毒结合蛋白。在一些实施方案中，从头设计的病毒结合蛋白包括使用噬菌体展示或酵母展示。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含配体或分泌蛋白。
在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含ACE2、TRMPSS2、DPP4、CD4、CCR5、CXCR4、CD209或CLEC4M。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含ACE2。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含DPP4。
在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQID NO:1的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQID NO:1的氨基酸序列具有至少95％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少98％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少99％序列同源性的氨基酸序列。
在一些情况下，第二哺乳动物多肽包含有至少包含具有SEQ ID NO:1的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或多于800个连续氨基酸的部分的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQID NO:2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少75％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQID NO:2的氨基酸序列具有至少95％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少98％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少99％序列同源性的氨基酸序列。
在一些情况下，第二哺乳动物多肽包含有至少包含具有SEQ ID NO:2的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720或多于720个连续氨基酸的部分的氨基酸序列。
寡聚化结构域
在一些实施方案中，多价颗粒包含寡聚化结构域。在一些实施方案中，融合蛋白包含寡聚化结构域。在一些实施方案中，寡聚化结构域是二聚化结构域。在一些实施方案中，二聚化结构域包含亮氨酸拉链二聚化结构域。在一些实施方案中，寡聚化结构域是三聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含病毒表面蛋白的融合后寡聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含VSV-G蛋白的D4融合后三聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含登革E蛋白融合后三聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含foldon三聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含人α1(I)胶原的C-前导肽。在一些实施方案中，寡聚化结构域是四聚化结构域。在一些实施方案中，四聚化结构域包含流感神经氨酸酶干结构域。
表1.示例性寡聚化结构域序列
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在一些实施方案中，寡聚化结构域包含表1中公开的氨基酸序列，或与表1中的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性)。在一些情况下，寡聚化结构域包含有至少包含具有根据表1的任一序列的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130个连续氨基酸序列的部分的氨基酸序列。在一些实施方案中，寡聚化结构域包含与根据SEQ ID NO:5-18和28中任一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
跨膜多肽
在一些实施方案中，本文描述了多价颗粒，其包含融合蛋白，融合蛋白包含结合病毒蛋白的哺乳动物多肽和跨膜多肽。在一些实施方案中，跨膜多肽包含水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜多肽包含水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)的跨膜结构域和细胞溶质结构域。在一些实施方案中，跨膜多肽包含登革E蛋白的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜多肽包含登革E蛋白的跨膜结构域和细胞溶质结构域。在一些实施方案中，跨膜多肽包含流感血凝素(HA)的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜多肽包含流感血凝素(HA)的跨膜结构域和细胞溶质结构域。在一些实施方案中，跨膜多肽包含HIV表面糖蛋白GP120或GP41的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜多肽包含HIV表面糖蛋白GP120或GP41的跨膜结构域和细胞溶质结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含麻疹病毒表面糖蛋白血凝素(H)蛋白的跨膜多肽。在一些实施方案中，跨膜多肽包含麻疹病毒表面糖蛋白血凝素(H)蛋白的跨膜结构域和细胞溶质结构域。在一些实施方案中，跨膜多肽包含流感神经氨酸酶(NA)的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜多肽包含流感神经氨酸酶(NA)的跨膜结构域和细胞溶质结构域。
表2.示例性跨膜多肽序列
在一些实施方案中，跨膜多肽包含表2中公开的氨基酸序列，或与表2中的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性)。在一些情况下，跨膜多肽包含有至少包含具有根据表2的任一序列的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130个连续氨基酸序列的部分的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文描述了多价颗粒，其包含融合蛋白，融合蛋白包含结合病毒蛋白的哺乳动物多肽和跨膜多肽。在一些实施方案中，跨膜多肽将融合蛋白锚定到多价颗粒的脂质双分子层。在一些实施方案中，跨膜多肽包含刺突糖蛋白、哺乳动物膜蛋白、包膜蛋白、核衣壳蛋白或细胞跨膜蛋白。在一些实施方案中，跨膜多肽包含VSVG的跨膜结构域、刺突蛋白S1、刺突蛋白S2、辛德毕斯病毒包膜(SINDBIS)蛋白、来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白、麻疹病毒融合(F)蛋白的包膜糖蛋白、RD114、BaEV、GP41或GP120。在一些实施方案中，跨膜多肽包含VSVG跨膜区。在一些实施方案中，VSVG跨膜区包含全长VSVG跨膜区或截短VSVG跨膜区。在一些实施方案中，跨膜多肽包含VSVG跨膜区和VSVG胞质尾区。在一些实施方案中，来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白是来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白的变体。在一些情况下，变体是HCΔ18。
在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ IDNO:3的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少75％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少80％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少95％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少98％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ IDNO:3的氨基酸序列具有至少99％序列同源性的氨基酸序列。
在一些情况下，跨膜多肽包含有至少包含具有SEQ ID NO:3的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或多于490个连续氨基酸的部分的氨基酸序列。
在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ IDNO:4的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少75％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少80％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少95％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少98％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜多肽包含与根据SEQ IDNO:4的氨基酸序列具有至少99％序列同源性的氨基酸序列。
在一些情况下，跨膜多肽包含有至少包含具有SEQ ID NO:4的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、800、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240、1250或多于1250个连续氨基酸的部分的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文描述了多价颗粒，其包含融合蛋白，融合蛋白包含结合病毒蛋白的哺乳动物多肽和跨膜多肽，其中多价颗粒还包含第二融合蛋白，第二融合蛋白包含结合病毒蛋白的第二哺乳动物多肽和第二跨膜多肽。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含刺突糖蛋白的跨膜区、哺乳动物膜蛋白、包膜蛋白、核衣壳蛋白或细胞跨膜蛋白。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含VSVG的跨膜区、刺突蛋白S1、刺突蛋白S2、辛德毕斯病毒包膜(SINDBIS)蛋白、来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白、麻疹病毒融合(F)蛋白的包膜糖蛋白、RD114、BaEV、GP41或GP120。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含VSVG跨膜区。在一些实施方案中，VSVG跨膜区包含全长VSVG跨膜区或截短VSVG跨膜区。在一些实施方案中，跨膜多肽包含VSVG跨膜区和VSVG胞质尾区。在一些实施方案中，来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白是来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白的变体。在一些情况下，变体是HCΔ18。
在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ IDNO:3的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少75％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ IDNO:3的氨基酸序列具有至少80％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少95％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少98％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少99％序列同源性的氨基酸序列。
在一些情况下，第二跨膜多肽包含有至少包含具有SEQ ID NO:3的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或多于490个连续氨基酸的部分的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ IDNO:4的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ IDNO:4的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少75％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ IDNO:4的氨基酸序列具有至少80％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少95％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少98％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二跨膜多肽包含与根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少99％序列同源性的氨基酸序列。
在一些情况下，第二跨膜多肽包含有至少包含具有SEQ ID NO:4的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、800、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240、1250或多于1250个连续氨基酸的部分的氨基酸序列。
哺乳动物多肽和跨膜多肽组合
在一些实施方案中，本文描述了多价颗粒，其包含融合蛋白，融合蛋白包含结合病毒蛋白的哺乳动物多肽和跨膜多肽。在一些实施方案中，哺乳动物多肽是I型受体。在一些实施方案中，哺乳动物多肽是II型受体。
在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含ACE2、TRMPSS2、DPP4、CD4、CCR5、CXCR4、CD209或CLEC4M，并且跨膜多肽包含VSVG的跨膜区、刺突蛋白S1、刺突蛋白S2、辛德毕斯病毒包膜(SINDBIS)蛋白、来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白、麻疹病毒融合(F)蛋白的包膜糖蛋白、RD114、BaEV、GP41或GP120。
在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含ACE2，并且跨膜多肽包含VSVG跨膜区。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含ACE2，并且跨膜多肽包含刺突蛋白S1跨膜区。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含ACE2，并且跨膜多肽包含刺突蛋白S2跨膜区。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含ACE2，并且跨膜多肽包含包膜病毒的表面糖蛋白的跨膜区。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含ACE2，并且跨膜多肽包含辛德毕斯病毒包膜(SINDBIS)蛋白的跨膜区。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含ACE2，并且跨膜多肽包含BaEV跨膜区。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含ACE2，并且跨膜多肽包含GP41跨膜区。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含ACE2，并且跨膜多肽包含GP120跨膜区。
在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含CD4，并且跨膜多肽包含VSVG跨膜区。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含CD4，并且跨膜多肽包含刺突蛋白S1跨膜区。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含CD4，并且跨膜多肽包含刺突蛋白S2跨膜区。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含CD4，并且跨膜多肽包含包膜病毒的表面糖蛋白的跨膜区。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含CD4，并且跨膜多肽包含辛德毕斯病毒包膜(SINDBIS)蛋白跨膜区。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含CD4，并且跨膜多肽包含BaEV跨膜区。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含CD4，并且跨膜多肽包含GP41跨膜区。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含CD4，并且跨膜多肽包含GP120跨膜区。
在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含DPP4，并且跨膜多肽包含来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白。在一些实施方案中，来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白是来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白的变体。在一些实施方案中，变体是HCΔ18。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含DPP4，并且跨膜多肽包含麻疹病毒融合(F)蛋白的包膜糖蛋白。
在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含TRMPSS2，并且跨膜多肽包含来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白。在一些实施方案中，来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白是来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白的变体。在一些实施方案中，变体是HCΔ18。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含TRMPSS2，并且跨膜多肽包含麻疹病毒融合(F)蛋白的包膜糖蛋白。
在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含CD209，并且跨膜多肽包含来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白。在一些实施方案中，来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白是来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白的变体。在一些实施方案中，变体是HCΔ18。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含CD209，并且跨膜多肽包含麻疹病毒融合(F)蛋白的包膜糖蛋白。
在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含CLEC4M，并且跨膜多肽包含来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白。在一些实施方案中，来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白是来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白的变体。在一些实施方案中，变体是HCΔ18。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含CLEC4M，并且跨膜多肽包含麻疹病毒融合(F)蛋白的包膜糖蛋白。
在一些实施方案中，本文描述了多价颗粒，其包含融合蛋白，融合蛋白包含结合病毒蛋白的哺乳动物多肽和跨膜多肽，其中多价颗粒还包含第二哺乳动物多肽和第二跨膜多肽。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽是I型受体。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽是II型受体。
在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含ACE2、TRMPSS2、DPP4、CD4、CCR5、CXCR4、CD209或CLEC4M，并且第二跨膜多肽包含VSVG的跨膜区、刺突蛋白S1、刺突蛋白S2、辛德毕斯病毒包膜(SINDBIS)蛋白、来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白、麻疹病毒融合(F)蛋白的包膜糖蛋白、RD114、BaEV、GP41或GP120。
在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含ACE2，并且第二跨膜多肽包含VSVG跨膜区。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含ACE2，并且第二跨膜多肽包含刺突蛋白S1跨膜区。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含ACE2，并且第二跨膜多肽包含刺突蛋白S2跨膜区。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含ACE2，并且第二跨膜多肽包含包膜病毒的表面糖蛋白的跨膜区。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含ACE2，并且第二跨膜多肽包含辛德毕斯病毒包膜(SINDBIS)蛋白跨膜区。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含ACE2，并且第二跨膜多肽包含BaEV跨膜区。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含ACE2，并且第二跨膜多肽包含GP41跨膜区。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含ACE2，并且第二跨膜多肽包含GP120跨膜区。
在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含CD4，并且第二跨膜多肽包含VSVG跨膜区。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含CD4，并且第二跨膜多肽包含刺突蛋白S1跨膜区。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含CD4，并且第二跨膜多肽包含刺突蛋白S2跨膜区。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含CD4，并且第二跨膜多肽包含包膜病毒的表面糖蛋白的跨膜区。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含CD4，并且第二跨膜多肽包含辛德毕斯病毒包膜(SINDBIS)蛋白跨膜区。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含CD4，并且第二跨膜多肽包含BaEV跨膜区。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含CD4，并且第二跨膜多肽包含GP41跨膜区。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含CD4，并且第二跨膜多肽包含GP120跨膜区。
在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含DPP4，并且第二跨膜多肽包含来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白。在一些实施方案中，来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白是来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白的变体。在一些实施方案中，变体是HCΔ18。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含DPP4，并且第二跨膜多肽包含麻疹病毒融合(F)蛋白的包膜糖蛋白。
在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含TRMPSS2，并且第二跨膜多肽包含来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白。在一些实施方案中，来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白是来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白的变体。在一些实施方案中，变体是HCΔ18。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含TRMPSS2，并且第二跨膜多肽包含麻疹病毒融合(F)蛋白的包膜糖蛋白。
在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含CD209，并且第二跨膜多肽包含来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白。在一些实施方案中，来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白是来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白的变体。在一些实施方案中，变体是HCΔ18。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含CD209，并且第二跨膜多肽包含麻疹病毒融合(F)蛋白的包膜糖蛋白。
在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含CLEC4M，并且第二跨膜多肽包含来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白。在一些实施方案中，来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白是来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白的变体。在一些实施方案中，变体是HCΔ18。在一些实施方案中，第二哺乳动物多肽包含CLEC4M，并且第二跨膜多肽包含麻疹病毒融合(F)蛋白的包膜糖蛋白。
在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含ACE2，跨膜多肽包含VSVG跨膜区、刺突蛋白S2跨膜区或包膜病毒的表面糖蛋白，第二哺乳动物多肽包含硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，并且第二跨膜多肽包含VSVG跨膜区、刺突蛋白S2跨膜区或包膜病毒的表面糖蛋白。在一些实施方案中，哺乳动物多肽包含CD4，并且第二哺乳动物肽包含CCR5、CXCR4或两者。
在一些实施方案中，本文描述了多价颗粒，其包含融合蛋白，融合蛋白包含结合病毒蛋白的哺乳动物多肽和跨膜多肽，其中多价颗粒还包含寡聚化结构域。
在一些实施方案中，寡聚化结构域是二聚化结构域。在一些实施方案中，二聚化结构域包含亮氨酸拉链二聚化结构域。在一些实施方案中，寡聚化结构域是三聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含病毒表面蛋白的融合后寡聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含VSV-G蛋白的D4融合后三聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含登革E蛋白融合后三聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含foldon三聚化结构域。在一些实施方案中，三聚化结构域包含人α1(I)胶原的C-前导肽。在一些实施方案中，寡聚化结构域是四聚化结构域。在一些实施方案中，四聚化结构域包含流感神经氨酸酶干结构域。
在一些实施方案中，当融合蛋白在多价颗粒的表面上表达时，寡聚化结构域在多价颗粒的外部。在一些实施方案中，当融合蛋白在多价颗粒的表面上表达时，寡聚化结构域在多价颗粒的外部并且与信号肽相邻。在一些实施方案中，当融合蛋白在多价颗粒的表面上表达时，寡聚化结构域在多价颗粒的外部并且与跨膜结构域相邻。在一些实施方案中，当融合蛋白在多价颗粒的表面上表达时，寡聚化结构域在多价颗粒的内部。在一些实施方案中，当融合蛋白在多价颗粒的表面上表达时，寡聚化结构域在多价颗粒的内部并且与跨膜多肽相邻。
在一些实施方案中，融合蛋白包含信号肽。
在一些实施方案中，融合蛋白的结构域从N-末端到C-末端按以下顺序排列：(a)信号肽、哺乳动物多肽、寡聚化结构域、跨膜多肽和细胞溶质结构域；(b)信号肽、哺乳动物多肽、跨膜多肽、寡聚化结构域和细胞溶质结构域；或(c)信号肽、寡聚化结构域、哺乳动物多肽、跨膜多肽和细胞溶质结构域。在一些实施方案中，融合蛋白的结构域从N-末端到C-末端按以下顺序排列：信号肽、哺乳动物多肽、寡聚化结构域、跨膜多肽和细胞溶质结构域。在一些实施方案中，融合蛋白的结构域从N-末端到C-末端按以下顺序排列：信号肽、哺乳动物多肽、跨膜多肽、寡聚化结构域和细胞溶质结构域。在一些实施方案中，融合蛋白的结构域从N-末端到C-末端按以下顺序排列：信号肽、寡聚化结构域、哺乳动物多肽、跨膜多肽和细胞溶质结构域。
本文公开了融合蛋白，其包含跨膜多肽、细胞溶质结构域、哺乳动物多肽和寡聚化结构域，其中当融合蛋白在多价颗粒的表面上表达时，融合蛋白以寡聚体形式展示。
表3.示例性融合蛋白序列
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在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少80％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少95％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少98％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少99％序列同源性的氨基酸序列。
在一些情况下，融合蛋白或第二融合蛋白包含有至少包含具有SEQ ID NO:29的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720或多于720个连续氨基酸的部分的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少80％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少95％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少98％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少99％序列同源性的氨基酸序列。
在一些情况下，融合蛋白或第二融合蛋白包含有至少包含具有SEQ ID NO:30的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720或多于720个连续氨基酸的部分的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少75％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少80％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少95％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少98％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少99％序列同源性的氨基酸序列。
在一些情况下，融合蛋白或第二融合蛋白包含有至少包含具有SEQ ID NO:31的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720或多于720个连续氨基酸的部分的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少75％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少80％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少95％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少98％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少99％序列同源性的氨基酸序列。
在一些情况下，融合蛋白或第二融合蛋白包含有至少包含具有SEQ ID NO:32的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720或多于720个连续氨基酸的部分的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少75％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少80％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少95％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少98％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少99％序列同源性的氨基酸序列。
在一些情况下，融合蛋白或第二融合蛋白包含有至少包含具有SEQ ID NO:33的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720或多于720个连续氨基酸的部分的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少75％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少80％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少95％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少98％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少99％序列同源性的氨基酸序列。
在一些情况下，融合蛋白或第二融合蛋白包含有至少包含具有SEQ ID NO:34的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720或多于720个连续氨基酸的部分的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少75％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少80％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少95％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少98％序列同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白或第二融合蛋白包含与根据SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少99％序列同源性的氨基酸序列。
在一些情况下，融合蛋白或第二融合蛋白包含有至少包含具有SEQ ID NO:35的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720或多于720个连续氨基酸的部分的氨基酸序列。
用于生成多价颗粒的组合物
在一些实施方案中，本文描述了组合物，其包含多价颗粒，多价颗粒包含融合蛋白，融合蛋白包含结合病毒蛋白的哺乳动物多肽和跨膜多肽。在一些实施方案中，组合物包含第一核酸序列，其编码本文所述的多价颗粒。
在一些实施方案中，用于生成多价颗粒的组合物还包含第二核酸序列，其编码一种或多种包装病毒蛋白。在一些实施方案中，一种或多种包装病毒蛋白是慢病毒蛋白、逆转录病毒蛋白、腺病毒蛋白或其组合。在一些实施方案中，一种或多种包装病毒蛋白包含gag、pol、pre、tat、rev或其组合。
在一些实施方案中，用于生成多价颗粒的组合物还包含第二核酸序列，其编码用于将哺乳动物多肽特异性地靶向细胞外囊泡的表面的表达构建体。在一些实施方案中，第二核酸序列编码用于将哺乳动物多肽特异性地靶向外泌体的表面的表达构建体。在一些实施方案中，第二核酸序列编码用于将哺乳动物多肽特异性地靶向核外粒体的表面的表达构建体。
在一些实施方案中，用于生成多价颗粒的组合物还包含第三核酸序列，其编码复制无能病毒基因组、报道分子、治疗性分子或其组合。在一些实施方案中，组合物还可包含第三核酸序列，其编码具有复制能力的病毒基因组、报道分子、治疗性分子或其组合。在一些实施方案中，病毒基因组来源于水疱性口炎病毒、麻疹病毒、肝炎病毒、流感病毒或其组合。
在一些实施方案中，报道蛋白是荧光蛋白或酶。示例性报道基因包括但不限于乙酰羟酸合酶(AHAS)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、天蓝色荧光蛋白、黄水晶荧光蛋白、橙色荧光蛋白、樱桃荧光蛋白、绿松石荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、辣根过氧化物酶(HRP)、荧光素酶(Luc)、胭脂碱合酶(NOS)、章鱼碱合酶(OCS)、荧光素酶及其衍生物。确定报道基因的调节的方法是本领域中熟知的并且包括但不限于荧光光度法(例如，荧光光谱法、荧光激活细胞分选(FACS)、荧光显微术)和抗生素抗性确定。在一些实施方案中，报道分子是荧光蛋白。在一些实施方案中，荧光蛋白是绿色荧光蛋白。在一些实施方案中，报道蛋白发出绿色荧光、黄色荧光或红色荧光。在一些实施方案中，报道分子是酶。在一些实施方案中，酶是β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、β-内酰胺酶或荧光素酶。
在一些实施方案中，治疗性分子是免疫调节蛋白、细胞信号调节分子、增殖调节分子、细胞死亡调节分子或其组合。在一些实施方案中，治疗性分子是免疫检查点分子。示例性免疫检查点分子包括但不限于CTLA4、PD1、OX40和CD28。在一些实施方案中，治疗性分子是一种炎性细胞因子。在一些实施方案中，炎性细胞因子包括IL-1、IL-12或IL-18。在一些实施方案中，治疗性分子是增殖细胞因子。在一些实施方案中，增殖细胞因子包括IL-4、IL-7或IL-15。在一些实施方案中，细胞死亡分子包括Fas或死亡受体。
在一些实施方案中，用于生成多价颗粒的组合物还包含第四核酸序列，其编码第二融合蛋白，第二融合蛋白包含结合如本文所述的病毒蛋白的第二哺乳动物多肽和第二跨膜多肽。
在一些实施方案中，第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列在同一载体内。在一些实施方案中，第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列在不同载体内。在一些实施方案中，第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列在同一载体内。在一些实施方案中，第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列在不同载体内。
在一些实施方案中，本文使用了各种载体。在一些实施方案中，载体是真核生物或原核生物载体。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，载体是慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。示例性载体包括但不限于哺乳动物表达载体：pSF-CMV-NEO-NH2-PPT-3XFLAG、pSF-CMV-NEO-COOH-3XFLAG、pSF-CMV-PURO-NH2-GST-TEV、pSF-OXB20-COOH-TEV-FLAG(R)-6His、pCEP4 pDEST27、pSF-CMV-Ub-KrYFP、pSF-CMV-FMDV-daGFP、pEF1a-mCherry-N1载体、pEF1a-tdTomato载体、pSF-CMV-FMDV-Hygro、pSF-CMV-PGK-Puro、pMCP-tag(m)和pSF-CMV-PURO-NH2-CMYC；细菌表达载体：pSF-OXB20-BetaGal、pSF-OXB20-Fluc、pSF-OXB20和pSF-Tac；植物表达载体：pRI 101-AN DNA和pCambia2301；和酵母表达载体：pTYB21和pKLAC2；以及昆虫载体：pAc5.1/V5-His A和pDEST8。
组合物和药物组合物
在一些实施方案中，本文描述了组合物，其包含多价颗粒，多价颗粒包含融合蛋白，融合蛋白包含结合病毒蛋白的哺乳动物多肽和跨膜多肽。在一些实施方案中，本文描述了药物组合物，其包含多价颗粒，多价颗粒包含融合蛋白，融合蛋白包含结合病毒蛋白的哺乳动物多肽和跨膜多肽。
对于向对象施用，如本文所公开的多价颗粒可以与一种或多种药学上可接受的载剂或赋形剂一起以药物组合物的形式提供。在一些实施方案中，如本文所公开的多价颗粒可以与一种或多种载剂或赋形剂一起以组合物的形式提供。术语“药学上可接受的载剂”包括但不限于任何不干扰成分的生物活性的有效性并且对所施用的患者无毒的载剂。合适的药用载剂的实例是本领域熟知的，并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液诸如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。此类载剂可以通过常规方法配制并且可以合适的剂量施用于对象。优选地，组合物是无菌的。这些组合物还可以包含佐剂，诸如防腐剂、乳化剂和分散剂。可以通过纳入各种抗细菌剂和抗真菌剂来确保微生物作用的预防。
药物组合物可以是任何合适的形式(这取决于所需的施用方法)。它可以呈单位剂量的形式提供，可以在密封容器中提供，并且可以作为药盒的一部分提供。这种药盒可包括使用说明。它可以包括多个所述单位剂型。
药物组合物可以适用于通过任何适当途径的施用，包括肠胃外(例如，皮下、肌肉内、静脉内或吸入)途径。此类组合物可以通过制药领域已知的任何方法来制备，例如通过在无菌条件下将活性成分与载剂或赋形剂混合来制备。
本公开的物质的剂量可以在很大的范围内变化，这取决于待治疗的疾病或病症、待治疗的个体的年龄和状况等，并且医师将最终确定待使用的适当剂量。
使用方法
在一些实施方案中，本文所述的多价颗粒用于治疗病毒感染。在一些情况下，病毒感染由SARS-CoV-1引起。在一些情况下，病毒感染由SARS-CoV-2引起。在一些情况下，病毒感染由MERS-CoV引起。在一些情况下，病毒感染由呼吸道合胞病毒引起。在一些情况下，病毒感染由HIV引起。
在一些情况下，对象是哺乳动物。在一些情况下，对象是小鼠、兔子、狗、猪、牛或人。通过本文所述的方法治疗的对象可以是婴儿、成人或儿童。如本文所述的包含多价颗粒的药物组合物或组合物可以静脉内、皮下或吸入施用。在一些实施方案中，多价颗粒静脉内施用。在一些实施方案中，多价颗粒通过吸入施用。在一些实施方案中，多价颗粒通过腹膜内注射施用。在一些实施方案中，多价颗粒通过皮下注射施用。
在一些实施方案中，本文描述了治疗有需要的对象的感染的方法，所述方法包括向对象施用本文所述的多价颗粒。在一些实施方案中，感染包括SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV、呼吸道合胞病毒、HIV或其组合的感染。在一些实施方案中，感染包括SARS-CoV-1的感染。在一些实施方案中，感染包括SARS-CoV-2的感染。在一些实施方案中，感染包括MERS-CoV的感染。
在一些实施方案中，多价颗粒通过吸入施用至对象。在一些实施方案中，多价颗粒通过鼻内递送施用至对象。在一些实施方案中，多价颗粒通过气管内递送施用至对象。在一些实施方案中，多价颗粒通过腹膜内注射施用至对象。在一些实施方案中，多价颗粒通过皮下注射施用至对象。在一些实施方案中，与施用多价颗粒之前从对象取得的感染基线测量结果相比，向对象施用多价颗粒足以减少或消除感染。在一些实施方案中，减少至少约1倍、5倍、10倍、20倍、40倍、60倍、80倍或高达约100倍。
在一些实施方案中，本文描述了治疗有需要的对象的感染的方法，所述方法包括向对象施用组合物，其中组合物包含编码本文所公开的第一融合蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，本文描述了治疗有需要的对象的感染的方法，所述方法包括向对象施用组合物，其中组合物包含编码本文所公开的第一融合蛋白和本文所公开的第二融合蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，感染包括SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV、呼吸道合胞病毒、HIV或其组合的感染。在一些实施方案中，核酸序列包含mRNA。在一些实施方案中，核酸序列包含DNA。
在一些实施方案中，组合物通过吸入施用至对象。在一些实施方案中，组合物通过鼻内递送施用至对象。在一些实施方案中，组合物通过气管内递送施用至对象。在一些实施方案中，组合物通过腹膜内注射施用至对象。在一些实施方案中，组合物通过皮下注射施用至对象。在一些实施方案中，与施用组合物之前从对象取得的感染基线测量结果相比，向对象施用组合物足以减少或消除感染。在一些实施方案中，减少至少约1倍、5倍、10倍、20倍、40倍、60倍、80倍或高达约100倍。
在一些实施方案中，编码第一融合蛋白和第二融合蛋白的mRNA以及第二核酸序列和第三核酸序列是吸入施用的。在一些实施方案中，编码第一融合蛋白和第二融合蛋白的mRNA以及第二核酸序列和第三核酸序列是通过鼻内递送施用的。在一些实施方案中，编码第一融合蛋白和第二融合蛋白的mRNA以及第二核酸序列和第三核酸序列是通过气管内递送施用的。在一些实施方案中，编码第一融合蛋白和第二融合蛋白的mRNA以及第二核酸序列和第三核酸序列是通过腹膜内注射施用的。在一些实施方案中，编码第一融合蛋白和第二融合蛋白的mRNA以及第二核酸序列和第三核酸序列是通过皮下注射施用的。在一些实施方案中，与施用组合物之前从对象取得的感染基线测量结果相比，向对象施用组合物足以减少或消除感染。在一些实施方案中，减少至少约1倍、5倍、10倍、20倍、40倍、60倍、80倍或高达约100倍。
在一些实施方案中，编码第一融合蛋白和第二融合蛋白的DNA以及第二核酸序列和第三核酸序列是吸入施用的。在一些实施方案中，编码第一融合蛋白和第二融合蛋白的DNA以及第二核酸序列和第三核酸序列是通过鼻内递送施用的。在一些实施方案中，编码第一融合蛋白和第二融合蛋白的DNA以及第二核酸序列和第三核酸序列是通过气管内递送施用的。在一些实施方案中，编码第一融合蛋白和第二融合蛋白的DNA以及第二核酸序列和第三核酸序列是通过腹膜内注射施用的。在一些实施方案中，编码第一融合蛋白和第二融合蛋白的DNA以及第二核酸序列和第三核酸序列是通过皮下注射施用的。在一些实施方案中，与施用组合物之前从对象取得的感染基线测量结果相比，向对象施用组合物足以减少或消除感染。在一些实施方案中，减少至少约1倍、5倍、10倍、20倍、40倍、60倍、80倍或高达约100倍。
在一些实施方案中，组合物包含脂质体。在一些实施方案中，脂质体包含鱼精蛋白脂质体。在一些实施方案中，脂质体包含阳离子聚合物脂质体。在一些实施方案中，组合物包含脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，组合物包含阳离子脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，组合物包含阳离子脂质、胆固醇纳米颗粒。在一些实施方案中，组合物包含阳离子脂质、胆固醇、PEG纳米颗粒。在一些实施方案中，组合物包含树枝状体纳米颗粒。
在一些实施方案中，组合物包含腺相关病毒(AAV)。在一些实施方案中，组合物包含聚合物。在一些实施方案中，组合物包含鱼精蛋白。在一些实施方案中，组合物包含多糖颗粒。在一些实施方案中，组合物包含阳离子聚合物。在一些实施方案中，组合物包含阳离子纳米乳液。在一些实施方案中，组合物包含转染试剂。在一些实施方案中，组合物包含树突状细胞。
阐述以下实施例是为了向本领域技术人员更清楚地说明本文所公开的实施方案的原理和实践，而不应解释为限制任何请求保护的实施方案的范围。除非另有说明，否则所有份数和百分比均以重量计。
实施例
给出以下实施例是为了说明本公开的多个实施方案的目的，而并非意图以任何方式限制本公开。这些实施例以及目前代表优选实施方案的本文所述方法是示例性的，而并非旨在限制本公开的范围。本领域技术人员将会想到其变化以及包含在由权利要求的范围所限定的本公开的精神之内的其他用途。
实施例1：展示ACE2受体的诱饵多价颗粒(ACE2-MVP)的设计和产生
ACE2-MVP通过用由ACE2细胞外结构域和病毒包膜蛋白的膜锚定区段组成的融合蛋白假性分型慢病毒颗粒所生成(图1A)。简而言之，ACE2-MVP通过将ACE2融合构建体与表达基本包装组分(诸如Gag-Pol和Rev蛋白)的慢病毒包装构建体和编码GFP/荧光素酶报道分子的病毒基因组转移载体共同转染所生成(实施例20)。还在没有转移载体的情况下包装了不具有病毒基因组的ACE2-MVP。针对将ACE2蛋白锚定到假慢病毒颗粒的膜，测试了若干病毒包膜蛋白，包括VSV-G(水疱性口炎病毒的糖蛋白)、HCΔ18(来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白的突变型式)和S2(SARS CoV-2刺突蛋白的融合结构域)。还测试了ACE2与全长VSVG或仅具有跨膜区和细胞溶质尾的截短VSV-G的融合物。
在ACE2融合蛋白的变化中，ACE2与VSVG跨膜结构(VGTM)和S2跨膜结构(S2TM)融合产生ACE2-MVP，其在病毒样颗粒表面上具有高ACE2融合蛋白拷贝，如通过定量蛋白质印迹分析所确定(图1B)。这些假性分型MVP分别在颗粒上展示约八个ACE2-S2TM拷贝或236个ACE2-VGTM拷贝，为测试效价对ACE2-MVP的中和功能的影响提供了基础。ACE2-VGTM MVP的平均颗粒直径为134±34nm，如通过使用qNano的可调电阻脉冲传感分析(TRPS)所确定(图1C)。ACE2-VGTM MVP的形态通过cryoEM分析，以标称放大率150,000X进行表征(图1D)。
实施例2：ACE2-MVP对SARS CoV-2病毒感染的有效抑制
在微量中和测定中，针对用SARS CoV-2刺突蛋白假性分型的慢病毒(CoV-2PVP)，使用293T/ACE2细胞作为靶细胞，确定了ACE2-MVP的中和活性(实施例20)。重组ACE2在假病毒中和测定中的IC50为3.68±1.14nM，如图2A所示。相比之下，展示ACE2-VGTM或ACE2-S2TM的诱饵MVP的IC50值分别为0.23±0.09pM或2.18±0.07pM，其效力是单价ACE2重组蛋白的至少1000倍或10,000倍(图2A)。结果证明，ACE2诱饵受体的中和功能因递增的效价而显著增强。值得注意的是，展示约236个ACE2拷贝的ACE2-VGTM MVP的效力是展示约8个ACE2拷贝的ACE2-S2TM MVP的约10倍。此外，ACE2-VGTM MVP对假病毒感染的最大抑制为约600倍，并且ACE2-S2TM MVP和ACE2重组蛋白为约100至200倍(图2B)。最后，由于ACE2 MVP和CoV-2PVP都是假性分型慢病毒颗粒，所以通过P24 ELISA测定确定中和MVP与假病毒颗粒之间的化学计量比。如图2C所示，一个ACE2-VGTM MVP或ACE2-S2TM MVP颗粒分别中和约18或3个假病毒颗粒。中和一个假病毒颗粒需要约131个重组ACE2蛋白拷贝。值得注意的是，ACE2-VGTM MVP的效力是用于临床研究的再生元(Regeneron)抗体混合物中所用的两种抗体的近100倍(图2D)。
图2A-2D显示，ACE2-MVP上较高的ACE2效价与增强的中和活性相关。图2A-2C显示各种抗CoV-2化合物的中和活性，包括ACE2重组蛋白，并且在使用293T/ACE2细胞作为靶细胞的SARS CoV-2假病毒感染测定中确定了展示ACE2-VGTM或ACE2-S2TM的MVP。图2A显示ACE2-VGTM MVP、ACE2-S2TM MVP、ACE2蛋白和裸(bald)颗粒的IC50值。图2B显示ACE2-VGTMMVP、ACE2-S2TM MVP和ACE2蛋白的最大中和和总抑制倍数。图2C显示ACE2-VGTM MVP、ACE2-S2TM MVP和ACE2蛋白的病毒颗粒与抗病毒化合物的分子比。图2D显示使用以293T/ACE2细胞作为靶细胞的SARS CoV-2假病毒感染测定确定的展示ACE2-VGTM和临床阶段中和抗体的诱饵MVP的中和活性。
实施例3：ACE2-MVP对ACE2靶向冠状病毒具有广泛的中和作用
ACE2被SARS CoV-1和演化中的SARS CoV-2用作进入受体，并且因此ACE2-VGTMMVP可能对这些病毒具有广泛的中和活性。在使用293T/ACE2细胞作为靶细胞的微量中和测定中测试了ACE2-MVP针对用SARS CoV-1刺突假性分型的慢病毒(CoV-1PVP)的中和活性。重组ACE2在假病毒中和测定中的IC50为14.3±5.51nM(图3A)，其效力是它对CoV-2PVP的活性的约1/4-1/5(图2A)。相比之下，ACE2-VGTM MVP的IC50为0.13±0.06pM，与它针对CoV-2PVP的中和活性是可比的(图2A)。这些结果证明，ACE2-VGTM MVP是针对CoV-1和CoV-2病毒的高效中和化合物，而ACE2重组蛋白显示对CoV-1的效力小得多的中和化合物。此外，当在中和测定中使用与ACE2-VGTM MVP可比的浓度时，每个颗粒具有约8个ACE2拷贝的ACE2-S2TMMVP没有可检测的中和活性(图3A)。还在使用VERO-E6细胞作为靶细胞的CoV-1PVP中和中测试了ACE2-MVP的中和活性，并且针对ACE2重组蛋白和ACE2-VGTM MVP观察到相似的IC50值(图3B)。概括地说，高效价的ACE2-VGTM MVP在中和CoV-1和CoV-2假病毒方面具有同等效力，并且此外，MVP上较高的ACE2效价看起来克服了刺突与进入受体之间较低的亲和力。
SARS CoV-2也在快速突变，并且一些突变更具传播性和致病性。有趣的是，在使用293T/ACE2细胞作为靶细胞的微量中和测定中，ACE2-S2TM MVP在中和D614G刺突假性分型病毒(D614G-PVP)中的IC50为41.8±16fM，其效力是针对CoV-1PVP和CoV-2PVP的至少3-5倍(图3C)。在使用H1573/ACE2细胞作为靶细胞的微量中和测定中，ACE2-S2TM MVP针对CoV-1、CoV-2和D614G-PVP具有可比的中和活性(图3D)。最后，ACE2-VGTM MVP对具有N439K、N501Y、E484K和E484Q+L452R突变的CoV-2变体具有同等效力(图3E)。这些结果支持，高效价ACE2-VGTM MVP在中和SARS CoV-1、SARS CoV-2和多种CoV-2变体假病毒中具有同等效力，并且此外，MVP上较高的ACE2效价对于克服病毒刺突与宿主细胞进入受体之间的较低结合亲和力至关重要，证明ACE2-MVP是针对所有利用ACE2作为进入受体的新兴冠状病毒的有力的中和化合物。
图3A-3E显示ACE2-MVP对SARS-CoV-1病毒的有效中和作用，并且中和取决于颗粒表面上展示的ACE2分子的拷贝。图3A显示展示ACE2-VGTM或ACE2-S2TM的诱饵MVP在使用293T/ACE2细胞的SARS CoV-1假病毒感染测定中的中和活性。图3B显示展示ACE2-VGTM或ACE2-S2TM的ACE2-MVP在使用VERO-E6细胞的SARS CoV-1假病毒感染测定中的中和活性。图3C显示ACE2-VGTM MVP在使用293T/ACE2细胞的假病毒感染测定中针对CoV-1、CoV-2和D614G CoV-2的中和活性。图3D显示ACE2-VGTM MVP在使用H1573/ACE2细胞的假病毒感染测定中针对CoV-1、CoV-2和D614GCoV-2的中和活性。图3E显示在使用293T/ACE2细胞作为靶细胞的假病毒感染测定中ACE2-VGTM MVP针对多种SARS CoV-2变体的中和活性的比较。
实施例4：DPP4-MVP对MERS冠状病毒感染的有效抑制
MERS冠状病毒利用DPP4作为进入受体。为了测试相似的诱饵MVP策略是否可用于中和MERS病毒，通过用由来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白的突变体型式的膜锚定区段(HCΔ18)和DPP4细胞外结构域组成的融合蛋白假性分型慢病毒颗粒生成了DPP4-MVP(图4A)。麻疹包膜蛋白和DPP4都是II型跨膜蛋白。在HCΔ-DPP4假性分型构建体中，HCΔ18的N-末端和跨膜区被保留，并且C-末端区域(膜外)被DPP4的对应区域替代。DPP4-MVP通过将293T细胞与HCΔ-DPP4假性分型构建体和表达基本慢病毒包装组分(诸如Gag-Pol和Rev蛋白)的慢病毒包装构建体和编码GFP/荧光素酶报道分子的慢病毒基因组转移载体共同转染所生成。如通过定量蛋白质印迹分析所确定(图4B)，DPP4-MVP在颗粒上展示约15个HCΔ-DPP4拷贝。
在使用H1650细胞作为靶细胞的微量中和测定中，测试了DDP4-MVP针对用MERS刺突假性分型的慢病毒(MERS-PVP)的中和活性。DPP4-MVP在假病毒中和测定中的IC50为2.96±1.33pM，而重组DPP4的IC50多于48nM(图4C)。这些结果证明，针对MERS冠状病毒的高效中和MVP可以通过展示多个低亲和力II型进入受体拷贝来生成。此外，还将评估在微量中和测定中DPP4-MVP在中和活MERS冠状病毒感染中的IC50。
最后，为了进一步优化II型病毒进入受体的展示，通过将神经氨酸酶N-末端和跨膜区与DPP4细胞外结构域融合(图4D)以因此生成NA75-DPP4 MVP来测试慢病毒VLP上DPP4的展示。NA75-DPP4MVP在假病毒中和测定中的IC50为0.87pM(图4E)。结果证明，通过展示多个低亲和力II型进入受体拷贝，可以生成针对MERS冠状病毒的高效中和诱饵MVP。
图4A-4E显示展示多个诱饵DPP4受体拷贝的DPP4-MVP的设计和活性。图4A显示HCΔ-DPP4-MVP的设计和产生。示意图示出具有DPP4细胞外结构域与来自麻疹病毒的HCΔ18跨膜结构域的融合物的DPP4展示构建体。HCΔ-DPP4 MVP通过将DPP4展示构建体与慢病毒包装构建体和慢病毒报道分子构建体共同转染所生成。图4B显示用于确定HCΔ-DPP4 MVP上DPP4分子的拷贝数的定量蛋白质印迹分析。图4C显示各种抗MERS化合物的中和活性，包括DPP4重组蛋白，并且在使用H1650细胞作为靶细胞的MERS假病毒感染测定中确定了HCΔ-DPP4 MVP。图4D显示NA75-DPP4 MVP的设计和产生。示意图示出具有DPP4细胞外结构域与来自流感病毒的神经氨酸酶跨膜结构域的融合物的DPP4展示构建体。NA75-DPP4 MVP通过将NA75-DPP4展示构建体与慢病毒包装构建体和慢病毒报道分子构建体共同转染所生成。图4E显示在使用H1650细胞作为靶细胞的MERS假病毒感染测定中确定的NA75-DPP4 MVP的中和活性。
实施例5：展示酶促失活ACE2的诱饵MVP的中和效力降低
ACE2是人血管紧张素系统的关键调控因子。它通过催化血管紧张素II(血管收缩剂)水解成血管紧张素(1-7)(血管扩张剂)来降低血压。已经在89名健康志愿者中在I期研究中并且在患有急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的患者中在II期研究中测试了人重组ACE2。虽然可以建立安全窗口，但是活性ACE2对血管紧张素(1-7)产生和血压的急性影响为使用ACE2蛋白作为SARS CoV-2中和治疗剂带来了安全问题。此外，破坏ACE2催化功能的突变(诸如H374A和H378A)还显著减少ACE2与CoV-2刺突蛋白的结合，因此有可能损害针对SARSCoV-2的中和潜力ACE2中和诱饵。为此，在假病毒中和测定中，证明展示单体H2A/ACE2-VGTM的诱饵MVP的IC50为377±79.4fM，而展示单体WT/ACE2-VGTM的诱饵MVP的IC50为211±93.7fM(图5)。这一结果证实，失活性突变确实对ACE2-MVP的中和功能有一些不利的影响。
图5显示展示酶失活H2A-ACE2的多价颗粒(指定为H2A/ACE2MVP)针对CoV-2假病毒的中和活性降低。在使用293T/ACE2细胞作为靶细胞的SARS CoV-2假病毒感染测定中确定了H2A/ACE2MVP和野生型ACE2-MVP的中和活性。
实施例6：具有寡聚化ACE2展示的诱饵MVP具有增强的中和效力
值得注意的是，基于蛋白质印迹分析，ACE2-VGTM构建体(图1A)可用于在MVP的表面上展示多个单体ACE2分子拷贝。虽然具有单体ACE-VGTM的ACE2 MVP在中和CoV-1和CoV-2中非常有效，但是单体ACE2展示模式与刺突蛋白的三聚体展示模式不匹配。通过生成展示具有与刺突蛋白匹配的三聚体模式的多价ACE2的MVP，检查了提高ACE2-MVP的中和效力的作用。此类设计可进一步提高病毒上的刺突三聚体与诱饵MVP上的ACE2三聚体之间的局部亲合力和多价交互作用。在局部亲合力和结合力增强的情况下，H2A突变对ACE2诱饵MVP的中和功能的不利影响可被克服。
使用了来自VSV-G蛋白的D4融合后三聚化结构域(图6A)。设计了三聚体ACE2展示构建体(指定为ACE2-D4VG)，以产生具有ACE2的细胞外结构域、D4三聚化结构域以及VSVG跨膜和细胞溶质结构域的融合蛋白(图6B)。生成了三聚体展示构建体，其与野生型和酶促失活ACE2融合蛋白一起表达，分别指定为WT/ACE2-D4VG和H2A/ACE2-D4VG(图6B)。经由将293T细胞与ACE2展示构建体、编码结构组分的慢病毒包装构建体和编码GFP报道分子的慢病毒基因组转移载体共同转染，通过用WT/ACE2-D4VG或H2A/ACE2-D4VG构建体假性分型慢病毒病毒样颗粒(VLP)，产生诱饵MVP(图6B)。将ACE2-MVP纯化，并且通过p24 ELISA分析确定其浓度。经由定量蛋白质印迹和PAGE分析确定MVP上ACE2融合蛋白的拷贝数和寡聚体构型(图6C)。发现三聚体ACE2展示构建体在展示野生型ACE2和H2A/ACE2中都非常有效。值得注意的是，ACE2-VGTM展示具有主要是单体ACE2融合蛋白的构建体假性分型VLP，而ACE2-D4VG展示具有高水平的寡聚化ACE2的构建体假性分型VLP(图6C)。ACE2-D4VG MVP的平均颗粒直径为153±34nm，如通过使用qNano的可调电阻脉冲传感分析(TRPS)所确定(图6D)。ACE2-D4VGMVP的形态通过cryoEM分析，以标称放大率150,000X进行表征(图6E)。
图6A-6E显示野生型和酶促失活ACE2在多价颗粒上的寡聚化展示的设计、生成和活性。图6A显示具有呈三聚化结构域的D4结构域的融合后VSV-G的结构。图6B显示示出寡聚化ACE2展示构建体的示意图，所述构建体具有ACE2细胞外结构域与VSVG跨膜结构域的融合物(ACE2-VGTM)以实现单体展示或其与D4融合后三聚化结构域和VSVG跨膜结构域的融合物(ACE2-D4VG)以实现三聚体展示。具有野生型ACE2(WT-ACE2)和酶失活ACE2(H2A/ACE2)的多价颗粒展示构建体通过将对应的ACE2展示构建体与慢病毒包装构建体和慢病毒报道分子构建体共同转染所生成。图6C显示通过定量蛋白质印迹分析确定的在ACE2-MVP上ACE2分子的拷贝数。图6D显示ACE2-D4VG MVP的代表性TRPS分析。图6E显示H2A/ACE2-D4VG MVP的代表性电子显微镜图像，标称放大率为150,000X。
实施例7：展示三聚体H2A/ACE2的诱饵MVP在假病毒中和测定中是SARS CoV-2病毒的最有效的抑制剂
使用293T/ACE2或VERO-E6细胞作为靶细胞，在假病毒中和测定中证明了用野生型和突变体H2A/ACE2假性分型的三聚体和单体ACE2-MVP针对SARS CoV-2或CoV-1的中和活性(图7A，B)。发现展示三聚体WT/ACE2和H2A/ACE的诱饵MVP都是高效的抑制剂，其中和CoV-2假病毒的IC50分别为66.8±18.1fM和98.3±24.0fM。相比之下，用单体WT/ACE2假性分型的诱饵MVP以211±93.7fM的IC50中和CoV-2假病毒，与其对应的三聚体ACE2-MVP相比，效力降至低于1/3(图5，图7A)。显示展示三聚体WT/ACE2和H2A/ACE的MVP都是高效的抑制剂，其中和CoV-1假病毒的IC50分别为204±73.7fM和428±87.6fM。相比之下，用单体WT/ACE2和H2A/ACE假性分型的MVP以440±139fM或890 237fM的IC50中和CoV-1假病毒，与其对应的三聚体ACE2-MVP相比，效力降至低于1/2(图5，图7B)。这些结果证明，具有三聚体ACE2展示的MVP可以进一步提高WT和H2A突变体ACE2-MVP对CoV-2和CoV-1假病毒的中和效力。
图7A-7C显示通过MVP上的寡聚化展示H2A/ACE2的酶促失活ACE2的中和活性。图7A显示在使用293T/ACE2细胞作为靶细胞的SARS CoV-2假病毒感染测定中确定的展示野生型ACE2的ACE2-MVP或以单体或三聚体形式的酶促失活H2A/ACE2-MVP的中和活性。图7B显示在使用VERO-E6细胞作为靶细胞的SARS CoV-1假病毒感染测定中确定的展示野生型ACE2的ACE2-MVP或以单体或三聚体形式的酶促失活H2A/ACE2-MVP的中和活性。图7C在使用293T/ACE2细胞作为靶细胞的假病毒感染测定中比较了H2A/ACE2-D4VG MVP针对多种SARS CoV-2变体的中和活性。
实施例8：展示H2A/ACE2的诱饵MVP是针对活SARS CoV-2病毒的有效抑制剂
进一步表征了单体和三聚体ACE2-MVP针对活CoV-2病毒的中和功能。单体和三聚体ACE2-MVP均显示在此微量中和测定中将病毒滴度降低超过六个对数至不可检测的水平(图8A-8B)。值得注意的是，单体WT/ACE2-MVP以IC50 57±46pM中和活CoV-2病毒(图8A)，而三聚体HA/ACE2-MVP以IC50 3.5±3.3pM中和活CoV-2病毒(图8B)。这些结果证明，寡聚化H2A/ACE2-MVP针对活CoV-2病毒感染明显更有效。尽管如此，单体ACE2-MVP仍然是高效的抑制剂。
图8A-8B显示ACE2-MVP在预混合的活CoV-2病毒中和测定中的抗病毒活性。图8A显示使用SARS CoV-2活病毒中和测定确定的单体野生型ACE2-MVP(ACE2WT-VGTM MVP)的中和活性。图8B显示使用SARS CoV-2活病毒中和测定确定的三聚体、酶促失活H2A/ACE2-MVP(H2A/ACE2-D4VG MVP)的中和活性。
H2A/ACE2诱饵MVP在PRNT中有效中和B.1.351南非变体：进一步检查了在PRNT测定中，单体WT/ACE2-MVP和三聚体H2A/ACE2-MVP是否可有效地中和含有E484K和N501Y突变的活CoV-2的B.1.351南非毒株(图9A-9B)。单体WT/ACE2-MVP分别以IC50 0.98pM和0.77pM中和了原始的USA-WA1/2020毒株和南非B.1.351毒株(图9A)。相比之下，三聚体H2A/ACE2-MVP分别以0.58pM和0.28pM中和了原始的USA-WA1/2020毒株和南非B.1.351毒株(图9B)。值得注意的是，在PRNT测定中，单体WT/ACE2-MVP和三聚体H2A/ACE2-MVP针对南非B.1.351毒株的效力是可比的或略高。此外，三聚体H2A/ACE2-MVP在活病毒中和测定中的表现一直优于单体WT/ACE2-MVP。清楚的是，单体ACE2-MVP和三聚体H2A/ACE2-MVP均是针对原始的USA-WA1/2020毒株和南非B.1.351毒株(目前大流行中令人担忧的关键变体之一)的高效的抑制剂，提供了中和抗体的另一关键优势。
图9A显示在活病毒PRNT测定中，展示单体野生型ACE2的ACE2-MVP针对SARS CoV-2的原始华盛顿毒株或SARS CoV-2的南非变体的中和活性。图9B显示在活病毒PRNT测定中，展示三聚体H2A/ACE2的ACE2-MVP针对SARS CoV-2的原始华盛顿毒株或SARS CoV-2的南非变体的中和活性。
实施例9：展示H2A/ACE2的诱饵MVP在仓鼠中是活SARS CoV-2病毒的有效抑制剂
接种CoV-2病毒的金仓鼠高度模拟人的更严重的疾病。受影响的仓鼠出现容易观察到的临床症状，包括体重快速下降，伴有非常高的肺中病毒载量和严重的肺部组织结构。为了评估H2A/ACE2-MVP治疗受感染的动物的能力，用2.3x 104Pfu SARS CoV-2病毒攻击仓鼠，然后用1x 1011个H2A/ACE2-MVP颗粒通过IN递送来治疗仓鼠。治疗在病毒攻击后的4小时开始，并且给予两次/天，总计五剂。观察到，H2A/ACE2-MVP治疗显著减少了受攻击的仓鼠的体重减轻(图10A)，并且还以多于一个对数减少了肺中病毒载量(图10B)。总之，仓鼠研究证明，H2A/ACE2-MVP针对仓鼠中的CoV-2感染具有有效的中和和治疗作用。
图10A显示三聚体H2A/ACE-MVP在SARS CoV-2活病毒感染的暴露后治疗中对仓鼠体重减轻的影响。图10B显示三聚体H2A/ACE-MVP在SARS CoV-2活病毒感染的暴露后治疗中对仓鼠的肺中病毒载量的影响。
实施例10：采用ACE2-MVP的治疗有效地从SARS CoV-2的致死性感染中挽救小鼠
SARS CoV-2感染导致K18-hACE2转基因小鼠的致死现象，并且诱导症状和病变，重演了人的严重COVID-19的许多明确的特征。在受感染的小鼠中观察到肺的高病毒滴度，其蔓延到脑和其他器官，伴随着炎性细胞因子的大量上调以及单核细胞、中性粒细胞和活化的T细胞的浸润。这个模型已被用于测试疫苗和治疗剂在预防SARS-CoV-2诱导的致死性感染中的功效。
研究了IN递送ACE2-MVP是否可保护ACE2转基因小鼠免遭SARS CoV-2感染相关症状和致死现象。K18-hACE2小鼠用2800pfu的SARS CoV-2(毒株USA-WA1/2020)攻击，并且用IN递送的5个剂量的H2A/ACE2-D4VG MVP(每个剂量1x 1011个颗粒)治疗。在感染后4小时开始给药，随后在感染后第1天和第2天每天给药两次。治疗组的小鼠没有表现出呼吸道症状，并且全部都在感染后存活下来(图11A)，而安慰剂组的所有小鼠在感染后大约第6天因感染而死。此外，与安慰剂组相比，治疗组的小鼠经历了中等或没有经历呼吸道症状，并且只有短暂的体重减轻(图11B)。结果证明，H2A/ACE2 MVP可以挽救致死性SARS CoV-2感染，并且完全预防K18-hACE2转基因小鼠模型(重演了人的严重COVID-19的模型)中的呼吸道症状。
此外，还研究了IN递送ACE2-MVP是否保护ACE2转基因小鼠免遭德尔塔变体感染相关症状和致死现象。K18-hACE2小鼠用800pfu的SARS CoV-2(德尔塔变体NR55674)攻击，并且用IN递送的5个剂量的H2A/ACE2-D4VG MVP(每个剂量1x 1011个颗粒)治疗。同样，在感染后4小时开始给药，随后在感染后第1天和第2天每天给药两次。治疗组的小鼠没有表现出呼吸道症状，并且除一只以外全部都在感染后存活下来(图11C)，而安慰剂组的所有小鼠在感染后大约第6天因感染而死。此外，与安慰剂组相比，治疗组的五只存活小鼠经历了中等或没有经历呼吸道症状，并且只有短暂的体重减轻(图11D)。因此，H2A/ACE2 MVP挽救了致死性SARS CoV-2德尔塔变体感染，并在很大程度上防止了K18-hACE2转基因小鼠模型中的呼吸道症状，证明ACE2-MVP有可能被用作针对利用ACE2作为进入受体的所有SARS CoV-2变体的治疗剂。
图11A-11B显示三聚体H2A/ACE-MVP在hACE2转基因小鼠的SARS CoV-2活病毒感染的暴露后治疗的功效。图11A显示三聚体H2A/ACE-MVP治疗对用SARS CoV-2的WA毒株攻击的ACE2小鼠的存活的影响。图11B显示三聚体H2A/ACE2 MVP治疗对用SARS CoV-2的WA毒株攻击的ACE2小鼠的体重减轻的影响。图11C描绘三聚体H2A/ACE-MVP治疗对SARS CoV-2德尔塔变体感染的hACE2转基因小鼠的存活的影响。图11D显示感染SARS CoV-2德尔塔变体的hACE2转基因小鼠的体重减轻的效果。
实施例11：对SARS CoV-2感染的ACE2-MVP治疗诱导针对显性德尔塔变体的强大免疫力
为了检查对SARS CoV-2的诱饵MVP治疗可能如何影响感染后抗病毒免疫的发展，我们在初始感染之后30天用各种SARS CoV-2毒株重新攻击从初次感染中挽救的hACE2小鼠。首先，小鼠用原始的SARS CoV-2毒株攻击，这是初次感染中使用的同一病毒毒株。在重新攻击的存活者中没有观察到明显的呼吸道症状、体重减轻(图12A)或死亡(图12B)。此外，另一组从用SARS CoV-2的德尔塔变体的初次感染挽救的hACE2小鼠以约9000Pfu重新攻击，此病毒剂量是初次感染中使用的病毒剂量的至少三倍。同样，没有观察到明显的呼吸道症状、体重减轻(图12C)或死亡(图12D)。值得注意的是，对SARS CoV-2感染的hACE2小鼠的ACE2-MVP治疗不仅从致死性感染中挽救了这些小鼠，而且通过大幅降低这些小鼠中的峰值病毒载量，消除了所有呼吸道症状。然而，这些小鼠针对原始的SARS CoV-2毒株以及德尔塔变体都发展出强大的免疫力。因此，由于ACE2-MVP治疗而从初次攻击中存活的hACE2小鼠针对原始的SARS CoV-2毒株以及德尔塔变体发展出强大的免疫力。
图12A-12D显示，通过H2A/ACE2-D4VG MVP挽救的ACE2小鼠对用原始的SARS CoV-2毒株以及德尔塔变体的再次攻击具有抗性。用三聚体H2A/ACE2 MVP从初次SARS CoV-2攻击中存活的ACE2小鼠再次用原始的SARS CoV-2毒株以及德尔塔变体攻击。图12A显示SARSCoV-2重攻击对ACE2转基因小鼠的体重的影响。图12B显示SARS CoV-2重攻击对ACE2转基因小鼠的存活的影响。图12C显示德尔塔变体重攻击对ACE2转基因小鼠的体重的影响。图12D显示德尔塔变体重攻击对ACE2转基因小鼠的存活的影响。
实施例12：基于EV的ACE2-MVP是针对活CoV-2病毒的高效的抑制剂
通过只用三聚体诱饵受体展示载体(图6A)而不用慢病毒包装载体转染293T细胞，生成了展示多个ACE2拷贝的EV，指定为基于EV的ACE2-MVP。如通过TRPS分析所确定，基于EV的ACE2-MVP的平均直径为131±29nm(图13A)。此外，展示三聚体H2A/ACE2的EV是高效的抑制剂，以IC50 26±12fM中和CoV-2假病毒。此外，三聚体基于EV的ACE2-MVP在感染后活CoV-2微量中和测定中以IC50 14pM中和活CoV-2病毒，并且将病毒滴度降低了多于五个对数(图13C)，而没有明显的细胞毒性(图13D)。结果证明，基于EV的ACE2-MVP是SARS CoV-2的高效的中和剂。
图13A-13D显示基于EV的ACE2-MVP的颗粒分析和体外中和功效。图13A显示使用qNano仪器通过可调电阻脉冲传感分析确定的基于EV的ACE2-MVP的颗粒大小分布。图13B显示在使用293T/ACE2细胞作为靶细胞的SARS CoV-2假病毒感染测定中确定的基于EV的ACE2-MVP的中和活性。图13C显示如在SARS CoV-2活病毒中和测定中确定的基于EV的ACE2-MVP的中和活性。图13D显示如在SARS CoV-2活病毒中和测定中确定的基于EV的ACE2-MVP的细胞毒性。
实施例13：诱饵MVP展示载体的设计策略
上文呈现的结果证明，诱饵MVP是针对大流行病毒的一类新颖的高效的抗病毒药。诱饵MVP被设计成其靶向病毒的镜像，并且展示与病毒包膜上的寡聚体多价刺突蛋白匹配的病毒进入受体。为了实现在VLP和细胞外囊泡(EV)上的有效蛋白质展示，制备了两种不同类型的包膜颗粒展示载体。
如图14A中所示，设计了表达由连接到VSVG跨膜和细胞内结构域的病毒进入受体诱饵的细胞外结构域组成的融合蛋白的单体展示载体，以在VLP和EV的表面上展示数百个单体蛋白拷贝。除使用适于与相似的多价展示模式化病毒刺突蛋白形成高亲合力相互作用的单体形式以外，包膜颗粒被制成与病毒刺突蛋白的寡聚体展示形式匹配，以进一步以单独的寡聚体结合伴侣的水平增强亲合力。为此，如图14B所示，设计了三聚体展示载体，其表达由连接至VSVG的D4融合后三聚化结构域，然后是VSVG的跨膜和细胞内结构域的病毒进入受体诱饵的细胞外结构域组成的融合蛋白。所述载体用于在VLP和EV的表面上展示数百个三聚体蛋白拷贝，并且非常适于与病毒包膜上相似的寡聚体蛋白形成高亲合力相互作用。
图14A-14B显示以不同的寡聚体形式在包膜颗粒上多价展示诱饵病毒进入受体的载体。图14A显示通过使用表达由连接到VSVG跨膜和细胞内结构域的诱饵病毒进入受体组成的融合蛋白的载体在包膜颗粒上的病毒进入受体的单体展示。图14B显示通过使用表达由连接到VSVG的D4融合后三聚化结构域，之后连接到VSVG的跨膜和细胞内结构域的蛋白质组成的融合蛋白的载体，在包膜颗粒上的病毒进入受体的三聚体或寡聚体展示。
实施例14：单体诱饵MVP的生成
多价诱饵受体在VLP和使用单体展示载体的细胞外囊泡的表面上被展示为单体。单体基于VLP的诱饵MVP用病毒RNA基因组产生，在所述基因组中，单体肽展示构建体与慢病毒包装构建体表达基本包装组分(包括Gag-Pol和Rev蛋白)和编码GFP/荧光素酶报道分子的病毒基因组转移，如图15A所示。如图15B所示，通过将展示载体仅与慢病毒包装构建体共同转染而不与病毒基因组转移载体共同转染，产生了不具有RNA基因组的单体基于VLP的诱饵MVP。如图15C所示，通过在293T细胞中仅转染单体肽展示载体，产生了包括诱饵外泌体和诱饵核外粒体的单体基于EV的诱饵MVP。图15A显示通过将ACE2受体假性分型在具有病毒基因组的基于慢病毒的病毒样颗粒上的单体诱饵MVP产生。图15B显示通过将ACE2受体假性分型在不具有病毒基因组的基于慢病毒的病毒样颗粒上的单体诱饵MVP产生。图15C显示通过用ACE2受体假性分型细胞外囊泡的单体诱饵MVP产生。
实施例15：三聚体诱饵MVP的生成
多价诱饵受体在VLP和使用三聚体展示载体的细胞外囊泡的表面上被展示为三聚体。三聚体基于VLP的诱饵MVP用病毒RNA基因组产生，其中三聚体肽展示构建体和慢病毒包装构建体表达基本包装组分(包括Gag-Pol和Rev蛋白)和编码GFP/荧光素酶报道分子的病毒基因组转移，如图16A所示。如图16B所示，通过将展示载体仅与慢病毒包装构建体共同转染而不与病毒基因组转移载体共同转染，产生了不具有RNA基因组的三聚体基于VLP的包膜颗粒。如图16C所示，通过在293T细胞中仅转染三聚体肽展示载体，产生了包括诱饵外泌体和诱饵核外粒体的三聚体基于EV的诱饵MVP。
图16A-16C显示三聚体诱饵MVP的体外产生。图16A显示通过将ACE2受体假性分型到具有病毒基因组的基于慢病毒的病毒样颗粒上的三聚体诱饵MVP产生。图16B显示通过将ACE2受体假性分型到不具有病毒基因组的基于慢病毒的病毒样颗粒上的三聚体诱饵MVP产生。图16C显示通过用ACE2受体假性分型细胞外囊泡的三聚体诱饵MVP产生。
实施例16：混合的单体和三聚体诱饵MVP的生成
为了进一步增加诱饵展示密度，通过共同转染单体和三聚体诱饵展示构建体，生成了展示混合的单体和三聚体诱饵受体的包膜颗粒。此类设计被用来增加展示的肽的密度或产生不同的展示诱饵的组合。混合的单体和三聚体诱饵MVP通过共同转染单体和三聚体展示载体用VLP和EV建立。
为了产生具有病毒RNA基因组的混合的诱饵MVP，将混合的单体和三聚体诱饵受体展示构建体与表达基本包装组分(诸如Gag-Pol和Rec蛋白)的慢病毒包装构建体和编码GFP/荧光素酶报道分子的病毒基因组转移载体共同转染，如图17A所示。如图17B所示，不具有RNA基因组的混合的诱饵MVP通过将混合的单体和三聚体展示载体仅与慢病毒包装构建体但不与病毒基因组转移载体一起共转染来产生。如图17C所示，包含混合的诱饵外泌体和诱饵核外粒体的混合的基于EV的诱饵MVP通过将混合的单体和三聚体展示肽构建体转染到293T细胞中来产生。
图17A-17C显示混合的单体和三聚体诱饵MVP的体外产生。图17A显示通过将病毒进入受体假性分型到具有病毒基因组的基于慢病毒的病毒样颗粒上的混合的单体和三聚体诱饵MVP产生。图17B显示通过将病毒进入受体假性分型到不具有病毒基因组的基于慢病毒的病毒样颗粒上的混合的单体和三聚体诱饵MVP产生。图17C显示通过用病毒进入受体假性分型细胞外囊泡的混合的单体和三聚体诱饵MVP产生。
实施例17：诱饵MVP上展示的诱饵蛋白的寡聚化构型
如图18A-18C所示，通过修改展示载体，对诱饵MVP进行遗传编程，以展示各种构型的感兴趣的肽。将VSVG D4三聚化结构域放置在融合肽的各种位置处：(1)细胞外并且与跨膜结构域并置；(2)细胞内并且与跨膜结构域并置；(3)细胞外并且在信号肽之后(图18A-18C)。此外，D4三聚化结构域的长度从85至100至130个氨基酸变化(图18D)。显示D4位置和长度不同的H2A/ACE2-D4VG MVP是高效的抑制剂，以低于1pM的IC50中和CoV-2假病毒(图18E)。
此外，各种寡聚化结构域可用于适于诱饵受体的功能的不同表面展示模式(图19A-19C)。除VSVG D4三聚化结构域之外，使用登革E蛋白融合结构域或foldon结构域在VLP和EV的表面上产生三聚体展示模式。亮氨酸拉链结构域和流感神经氨酸酶干结构域分别用于在VLP和EV的表面上产生二聚体和四聚体展示模式。表4中总结了示例性寡聚化结构域和效价。在这些展示构型的情况下，有可能对具有混合的单体、二聚体、三聚体和四聚体展示模式的组合诱饵MVP进行编程，以优化其在靶细胞调控或病毒中和中的功能。
表4.示例性寡聚化结构域和效价
实施例18：示例性序列
表5.序列
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实施例19：讨论
使用展示高拷贝数的诱饵病毒进入受体的诱饵多价颗粒，建立了中和新出现的冠状病毒的新颖策略。展示ACE2或DPP4的MVP有效地中和了SARS CoV-1/CoV-2、新出现的CoV-2变体和MERS冠状病毒。诱饵MVP具有明显的效力，经常以低于皮摩尔的IC50中和其靶病毒，并且在活病毒中和和抗病毒测定中完全消除病毒滴度。此外，诱饵MVP的效力是其对应的单效价或低效价重组进入受体蛋白的多于10,000倍。这种增强与这些颗粒的表面上展示的病毒进入受体拷贝数相关。在每个MVP只有低达十个受体拷贝的情况下，诱饵MVP已经比许多临床阶段的中和抗体更有效力，并且通过展示更多的诱饵受体，其效力进一步增加几个数量级。结果证明，MVP上的病毒受体的高效价是使诱饵MVP的中和效力最大的关键。
多价相互作用导致诱饵MVP的有效中和：SARS CoV-2病毒体以及许多其他有包膜病毒和非包膜病毒展示了数百个大型刺突蛋白拷贝，并利用刺突与宿主细胞蛋白之间的多价相互作用以实现附着和进入。病毒通过多价相互作用而获得的功能性亲和力的加强是指数级的，并且几乎所有的有包膜和无包膜病毒都使用这种多价策略以实现附着和宿主细胞进入。这为病毒提供了巨大的优势。最值得注意的是，多价策略使病毒能够将以毫摩尔结合亲和力的相对较弱的单价相互作用变成以在纳摩尔至皮摩尔范围内的功能性亲和力的超强多价相互作用，继而产生低价或单价结合剂(诸如中和抗体和重组蛋白抑制剂)需要克服的高阈值。
与中和抗体形成对比，ACE2-MVP和DPP4-MVP被设计成充当诱饵靶细胞，并且很容易与对应的SARS冠状病毒病毒体的刺突蛋白形成多价相互作用。ACE2-MVP和DPP4-MVP都具有皮摩尔范围的IC50，并且比临床上测试的许多中和抗体有效得多。在每个颗粒多于200个ACE2分子拷贝(这与每个病毒体的刺突蛋白的数目可比)下，ACE2-MVP以可比的功能亲和力有效地与靶细胞竞争结合病毒。值得注意的是，ACE2-MVP在病毒与靶细胞结合之后有效地阻止病毒进入，指示诱饵MVP通过多价相互作用依附到附着到细胞的病毒上，并且阻止它们与靶细胞融合。总之，这些发现说明，多价相互作用是诱饵MVP有效中和的基础。
诱饵MVP产生了针对病毒的防变异的多价陷阱：病毒利用高突变率和与宿主细胞的多价结合来获得在靶向的细胞进入和免疫逃逸中的优势。刺突诱变和新颖的糖基化模式可以有效地破坏抗体和其他低效价病毒阻断剂的中和功能，使病毒在与我们的免疫系统的猫捉老鼠游戏(cat-and-mouse game)中获胜。有可能的是，出现了对目前的经临床测试的中和抗体的组合具有抗性的突变，并且使这些疗法的效果不佳。不足为奇的是，开发有效的针对病毒的低效价中和化合物或通过使用高效的抗体生成通用疫苗仍然是一个挑战。
相比之下，在不失去或显著改变其原有的向性的情况下，病毒将无法逃逸对应的诱饵MVP的中和控制。取消刺突和ACE2结合的突变取消了病毒体与ACE2-MVP和靶细胞的相互作用，而增强刺突和ACE2结合的突变加强病毒体与ACE2-MVP和靶细胞的相互作用。本公开的ACE2-MVP以与原始的SARS CoV-1和CoV-2病毒相比可比的或更高的效率中和D614GCoV-2病毒。因此，广泛中和利用ACE2作为宿主细胞受体的所有SARS冠状病毒的ACE2-MVP产生病毒难以逃逸的多价陷阱。在SARS CoV-2进化到采用新的宿主细胞受体或跳到人类身上的新的动物源性冠状病毒的情况下，一旦鉴别了其宿主细胞受体，就可以容易地开发诱饵MVP。作为诱饵MVP策略的适应性的证明，产生了针对MERS的DPP4-MVP，证明了这些诱饵MVP在中和MERS病毒中是高效的。除效力高之外，诱饵MVP策略还有效地对抗了现有的病毒免疫规避策略，提供了优于中和抗体的另一重要优势。
作为模块化抗病毒药的构建模块的诱饵MVP：诱饵MVP作为有效抗病毒药的证明说明了通过构建展示病毒附着和进入所需的通用特征的MVP来阻断病毒进入细胞的模块化方法。这种方法使得能够使用病毒致病原因的相对常数(宿主细胞受体)开发抗病毒药。与开发针对不断演化中的刺突或表面糖蛋白的中和抗体相比，所述方法的优势显而易见。诱饵MVP可以被构建成精确地模拟靶细胞，使得病毒在分子身份和多价功能亲和力方面无法区分两者。
本公开的诱饵MVP展示单一类型的病毒进入受体，诸如SARS-CoV-1/2的野生型ACE2和MERS冠状病毒的野生型DPP4。可以想得到，可以对此类诱饵MVP进行进一步修饰，以展示这样的突变的病毒进入受体：其对病毒包膜蛋白的亲和力提高，大小减小以便易于生产并且生理功能失活以避免对正常生理机能的不期望的影响。例如，ACE2具有处理血管紧张素所需的酶活性。因此，递送大量的功能性ACE2-MVP可能造成血管紧张素II水平的急剧下降和血管紧张素(1-5/7)的增加。因此，酶促失活的ACE2或DPP4可能展示在MVP上，以消除诱饵MVP的其他与抗病毒功能无关的功能。
许多病毒利用宿主细胞附着受体和进入受体以实现感染。例如，虽然ACE2对病毒感染是必不可少的，但是SARS CoV-2进入靶细胞也可能由TMPRSS2、DPP4和唾液酸促进。诱饵MVP通过在慢病毒颗粒上展示病毒诱饵受体(诸如ACE2和DPP4)来生成。以这种设计，诱饵MVP可以通过将ACE2展示载体与宿主细胞进入受体、附着受体和其他对病毒感染重要的分子的展示载体一起共同转染来修饰。可以对比率进行调整，使其中和潜力最大化，并且准确地重演典型的靶细胞膜。诱饵受体还可以展示在具有或不具有脂质包膜的其他类型的病毒上或合成纳米颗粒的表面上。除诱饵MVP之外，其他类型的多价颗粒可以通过单独或与诱饵受体一起展示刺突特异性抗体或其他设计的刺突结合蛋白来生成，以实现中和功能增强。最后，诱饵MVP可以在其表面上或在纳米颗粒内部配备额外的调控分子，以递送额外的货物，实现免疫调节、靶向降解和疫苗接种。
诱饵MVP策略能够预先开发抗病毒药：病毒性动物传染病(病毒性疾病在动物与人之间的传播)已经并且将继续是重大的公共卫生风险，具有流行病、地方病和大流行的可能性。然而，由于在病毒复制期间的突变率高，所以人类一直在开发有效的抗病毒治疗剂，以努力控制流感、冠状病毒和其他动物传染病性病毒的爆发。因为由于几乎所有的有包膜病毒和非包膜病毒都使用其多价表面包膜蛋白以实现附着和宿主细胞进入，我们的结果表明，诱饵MVP可以用作针对利用宿主细胞受体以实现细胞附着和进入的所有病毒的模块化抗病毒治疗剂。本公开的诱饵MVP策略提出了为任何具有动物传染病潜力的人和动物病毒先期开发模块化诱饵MVP的新颖方法。代替追寻针对快速演化中的病毒的难以捉摸的超级抗体，可以针对致病的人病毒和具有动物传染病潜力的动物病毒鉴别宿主细胞进入受体，并且可预先开发诱饵MVP治疗剂。这种方法将为对抗许多致病的人病毒(诸如流感、冠状病毒、肝炎病毒、登革病毒和HIV)提供重要的武器库。
实施例20：方法和材料
刺突假性分型病毒样颗粒的设计和产生：将编码SARS CoV-1、CoV-2和MERS冠状病毒刺突蛋白的密码子优化的合成DNA克隆到哺乳动物表达载体中，置于CMV启动子的控制下。针对改善的CoV-2尖峰表达和假性分型，还生成了表达含有细胞外刺突结构域与VSV-G跨膜和细胞溶质尾部的融合物的嵌合蛋白的构建体。使用针对相应的刺突蛋白和VSV-G标签的特异性抗体，通过蛋白质印迹，验证了转染到293T细胞之后刺突蛋白的表达。
为了产生刺突假性分型病毒样颗粒，使用聚乙烯亚胺(PEI)转染方案，将刺突表达构建体、psPAX2慢病毒包装载体和具有荧光素酶报道分子的慢病毒转移载体共同转染到293T细胞中。psPAX2是表达gag、pol、rev蛋白的第2代慢病毒载体包装载体。简单地说，在转染前16-24小时，将八百万个293T细胞接种到10cm板上，并培养过夜。细胞在转染时应达到约90％的汇合度。通过将30μg稀释的PEI溶液添加到含有1.25μg刺突表达构建体、5μgpsPAX2慢病毒包装载体和7.5μg慢病毒荧光素酶报道分子载体的DNA混合物中来制备转染混合物。将转染混合物在室温下孵育15分钟，然后添加到细胞中。在转染后5-6小时，将细胞培养基更换为含有0.1％丁酸钠的病毒生产培养基。在更换培养基后24小时和48小时两次收集冠状病毒假病毒体，通过PEG沉淀进行浓缩，并且通过凝胶过滤柱进一步纯化。
展示ACE2受体的诱饵多价颗粒(ACE2-MVP)的设计和产生：将编码ACE2胞外域的合成DNA与各种病毒展示锚定分子融合，并且在CMV启动子的控制下克隆到哺乳动物表达载体中。选择病毒包膜蛋白作为展示锚定分子，因为它们是病毒生物发生的不可或缺的一部分，并且高效地靶向病毒膜。生成了ACE2展示构建体，其表达ACE2胞外域与全长VSV-G的融合物、或与仅具有跨膜和细胞溶质结构域的截短VSV-G的融合物、或与缺失S1结构域的截短CoV-2刺突的融合物。将编码DPP4胞外域的合成DNA与来自麻疹病毒的HCΔ18跨膜结构域融合。
为了产生诱饵多价颗粒，使用聚乙烯亚胺(PEI)转染方案，将ACE2或DPP4展示构建体、psPAX2慢病毒包装载体和具有GFP报道分子的慢病毒转移载体共同转染到293T细胞中。简单地说，在转染前16-24小时，将八百万个293T细胞接种到10cm板上，并培养过夜。预计在转染时，细胞达到约90％的汇合度。通过将30μg稀释的PEI溶液添加到含有1.25μg ACE2或DPP4表达构建体、5μgpsPAX2慢病毒包装载体和7.5μg GFP报道分子载体的DNA混合物中来制备转染混合物。将转染混合物在室温下孵育15分钟，然后添加到细胞中。在转染后5-6小时，将细胞培养基更换为含有0.1％丁酸钠的病毒生产培养基。在更换培养基后24小时和48小时两次收集ACE2-MVP，通过PEG沉淀进行浓缩，并且通过凝胶过滤柱进一步纯化。
还可以在没有转移载体的情况下包装不具有病毒基因组的ACE2-MVP，而不损害ACE2-MVP产量和功能。针对将ACE2蛋白锚定到假慢病毒颗粒的膜，测试了若干病毒包膜蛋白，包括VSV-G(水疱性口炎病毒的糖蛋白)、HCΔ18(来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白的突变型式)和S2(SARS CoV-2刺突蛋白的融合结构域)。还测试了ACE2与全长VSVG和仅具有跨膜区和细胞溶质尾的截短VSV-G的融合物。
诱饵MVP的蛋白质印迹分析：融合蛋白在诱饵MVP上的表达经由纯化的颗粒的蛋白质印迹分析来确认。纯化的MVP的样品在4℃下用细胞裂解缓冲液(Cell Signaling)裂解10分钟，然后与NuPage LDS样品缓冲液混合，并且在95℃下煮沸5分钟。通过在还原和非还原条件下运行样品来确定寡聚化的差异。在还原条件下，将5％2-巯基乙醇添加到样品中，以使寡聚化的MVP-IC解离。然后将蛋白质样品在NuPAGE 4-12％ Bis-Tris凝胶上分离，并且转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜用具有Tween-20的TRIS缓冲盐水(TBST)和5％脱脂乳封闭1小时，然后用在5％牛奶中稀释的一抗孵育过夜。对于表达VSVG-标签的展示融合构建体，以1:2000稀释度使用抗VSV-G表位标签兔多克隆抗体。第二天，用1X TBST洗涤PVDF膜3次，并且以1:5000稀释度用山羊抗兔二抗(IRDye 680)在5％牛奶中染色60分钟。二次抗体染色后，再次用TBST洗涤PVDF膜3次，之后在Licor Odyssey扫描仪上成像。
替代地，根据制造商的方案，使用自动化的基于Simple Western size的蛋白质测定(Protein Simple)进行蛋白质印迹分析。除非另有提及，否则这里使用的所有试剂都来自Protein Simple。浓缩的样品如上所述进行裂解，然后在0.1X样品缓冲液中1:10稀释，以便在毛细管上加载。展示的融合蛋白表达水平使用相同的兔多克隆一抗以1:400稀释度和HRP缀合的抗兔二抗(Protein Simple)进行鉴别。使用Compass软件(Protein Simple)进行化学发光信号分析和绝对定量。
诱饵MVP的定量蛋白质印迹分析：进行定量蛋白质印迹分析以确定慢病毒颗粒上ACE2和DPP4的拷贝。使用P24 ELISA测定来确定ACE2-MVP的慢病毒颗粒浓度。将含有诱饵MVP样品(2-3x 108个颗粒，约20μg蛋白质)的样品与加载缓冲液混合，并且在100℃下煮沸5分钟。将蛋白质和它们对应的连续稀释的重组蛋白标准品在12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)上分离，并且转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将膜用具有Tween-20的磷酸盐缓冲盐水(PBST)和5％脱脂乳在室温下封闭2小时，随后用一级山羊抗人ACE2抗体在室温下孵育过夜。将膜在室温下与二抗(IRDye 680抗山羊二抗)一起孵育一小时，并且在LicorOdyssey扫描仪上量化。通过使用由对应的ACE2和DPP4重组蛋白生成的标准曲线来计算相应的诱饵MVP上的ACE2或DPP4蛋白的拷贝。
通过p24 ELISA的病毒样颗粒定量：使用HIV p24 SimpleStep ELISA试剂盒确定假性分型冠状病毒、流感病毒和诱饵多价颗粒的假病毒样品中的p24浓度。慢病毒假病毒颗粒的浓度是根据每个慢病毒颗粒含有大约2000个p24分子，或每皮克p24蛋白有1.25x 104个假病毒颗粒的假设推断出来的。
通过可调电阻脉冲传感量化诱饵MVP：通过可调电阻脉冲传感(TRPS，qNano，IZON)确定基于VLP或基于细胞外囊泡的诱饵MVP的大小和浓度。将纯化的假病毒集合用具有0.03％ Tween-20的0.2μm过滤的PBS稀释，之后进行qNano分析。然后使用NP200纳米孔在45.5mm的拉伸下确定MVP-IC的浓度和大小分布，并且使用在0.5与0.7V之间的施加电压实现通过纳米孔的130nA的稳定电流。对每个假病毒样品的测量在3、5和8毫巴的压力下进行，并且如果记录至少500个事件，颗粒率是线性的，并且均方根信号噪声维持低于10pA，则认为是有效的。然后使用在0.2μM过滤的PBS中从原始浓度7.3x 1011个颗粒/mL开始1:200稀释的CPC200(模式直径：200nm)(IZON)羧化聚苯乙烯珠，通过与标准化多压力校准进行比较，确定MVP浓度。使用IZON Control Suite 3.4软件对测量结果进行分析，以确定原始样品浓度。
在包膜颗粒上展示的蛋白质的特征：基于VLP或EV的诱饵MVP的浓度分别通过P24ELISA或可调电阻脉冲传感(TRPS，qNano)来测量。然后，通过定量蛋白质印迹分析确定包膜颗粒上展示的肽的拷贝。最后，通过非还原PAGE分析辨别了包膜颗粒上展示的肽的寡聚化模式。预计包膜颗粒以单体或三聚体构型在VLP和EV的表面上展示至少10个蛋白质分子拷贝。
冠状病毒假病毒感染的靶细胞：筛选了一大组细胞系，以鉴别被刺突假病毒体有效感染的靶细胞系。用饱和剂量的携带荧光素酶报道分子的冠状病毒刺突假病毒体感染候选靶细胞，并在感染后48小时测量受感染的细胞的荧光素酶活性。产生高于背景感染至少1,000倍的荧光素酶信号的靶细胞被认为是可感染的。测试的细胞系包括天然细胞系，诸如VERO、VERO E6、大组人肺癌细胞系和ACE2过表达细胞系。H1650细胞是MERS刺突病毒体的有效靶细胞(>10,000倍的荧光素酶信号增加)，293T/ACE2和H1573/ACE2细胞是CoV-2刺突病毒体的有效靶细胞(荧光素酶信号的10,000至100,000倍增加)，并且293T/ACE2和VERO E6是CoV-1刺突假病毒体的有效靶细胞(荧光素酶信号的1,000至10,000倍增加)。然后通过在相应的靶细胞系中滴定剂量依赖性感染，确定CoV-1、CoV-2和MERS刺突假病毒体的TCID50(百分之五十的组织培养感染剂量)。TCID50剂量被用于假病毒中和测定中，以确定诱饵MVP的抑制活性。
IC50假病毒中和测定：将相应的靶细胞以25,000个细胞/孔接种在96孔、平底、透明、经组织培养处理的板中，在补充有10％胎牛血清和1％青霉素链霉素的适当基础培养基中有6μg/mL聚凝胺。具有葡萄糖、HEPES缓冲液、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和丙酮酸钠的RPMI培养基用作H1573/ACE2细胞和H1650细胞的基础培养基，而293T生长培养基用作293T/17细胞的基础培养基。然后将假病毒以TCID50浓度与在9x 2倍连续稀释液中的滴定的诱饵抗病毒MVP一起添加到孔中，产生10点稀释曲线。在延迟的假病毒中和测定中，将假病毒以TCID50浓度添加到孔中，并且与细胞一起孵育60分钟，之后添加滴定的抗病毒MVP。然后将含有细胞、假病毒和诱饵MVP的板在800x g、25℃下离心60分钟，以使感染效率最大。感染后48小时，使用萤火虫荧光素酶裂解缓冲液裂解细胞，并且将裂解物转移到96孔白色测定板，然后经由GLOMAX多检测系统分析荧光素酶活性。然后将滴定的感染数据作图并且与4参数逻辑曲线拟合，以计算各种诱饵抗病毒MVP中和其相应的假病毒的半最大抑制浓度(IC50)。
采用SARS CoV-2病毒的斑点还原中和测试：使用补充有10％胎牛血清(FBS)和庆大霉素的DMEM培养基，将Vero E6细胞(ATCC:CRL-1586)以175,000个细胞/孔接种于24孔经组织培养处理的板中。然后将细胞在37℃下，于5％ CO2中孵育过夜，直到第二天达到80-100％的汇合度。第二天，将血清中的抗病毒MVP样品在56℃下热灭活30分钟，之后制备连续稀释液。所有稀释液都使用补充了2％ FBS和庆大霉素的DMEM(简称“稀释剂”)制成。抗病毒MVP连续稀释液(至总体积300μL)使用稀释剂制成，并且300μL空稀释剂用作病毒阳性对照。接下来，将含有SARS CoV-2(30PFU/孔)的300μL稀释剂添加到抗病毒MVP连续稀释液中，并且添加到仅有病毒的阳性对照中，最终体积为600μL。将抗病毒MVP和SARS CoV-2的混合物在37℃下、5.0％ CO2中培养60分钟，然后将连续稀释液和病毒阳性对照添加到细胞中。将细胞与混合物孵育1小时以实现感染，然后通过斑块测定确定每个连续稀释液的病毒滴度。将中和百分比数据作图，并且将4参数逻辑曲线与数据拟合，以确定各种中和活SARS CoV-2病毒的抗病毒MVP的50％斑块减少中和滴度(PRNT50)(GraphPad Prism 9.0.0)。
ACE2-MVP在仓鼠中的体内活病毒中和功效：每个队列中使用八只金仓鼠，雄性和雌性，6-8周龄。在研究开始前对动物进行称重。通过向每个鼻孔中IN施用50μL病毒接种物，用2.3x10^4PFU的USA-WA1/2020攻击动物。在感染后的不同时间点，通过鼻内递送用诱饵MVP治疗仓鼠。在研究期的期间，每天两次监测动物的COVID-19疾病的体征(皮毛起皱、驼背姿势、呼吸困难)。在研究期的期间每天测量一次体重。收集肺组织并取样以用于通过PRNT进行病毒载量测定。将组织在80℃下保存以用于组织学和通过qPCR或PRNT分析的病毒载量分析。
ACE-MVP在ACE2小鼠中的体内活病毒中和功效：每个队列中使用六只ACE2转基因小鼠，雄性和雌性，6-8周龄。在研究开始前对动物进行称重。通过向每个鼻孔中鼻内施用50μL病毒接种物，用2.3x104 PFU的USA-WA1/2020攻击动物。在感染后的不同时间点，通过鼻内递送用诱饵MVP治疗仓鼠。在研究期的和存活的期间，每天两次监测动物的COVID-19疾病的体征(皮毛起皱、驼背姿势、呼吸困难)和存活。在研究期的期间每天测量一次体重。收集肺组织并取样以用于通过PRNT进行病毒载量测定。将组织在80℃下保存以用于组织学和通过qPCR或PRNT分析的病毒载量分析。
虽然本文已经示出并描述了本公开的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，此类实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本公开内容的情况下，本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替换。应理解，在实施本公开时可以采用本文所述的本公开的实施方案的各种替代方案。旨在以所附权利要求书限定本公开的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同方案。
实施方案
以下非限制性实施方案提供了本发明的说明性实例，但不限制本发明的范围。
实施方案1.一种多价颗粒，其包含融合蛋白，所述融合蛋白包含结合病毒蛋白的哺乳动物多肽和跨膜多肽，其中所述融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约10个拷贝。
实施方案2.如实施方案1所述的多价颗粒，其中所述病毒蛋白来自SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV、呼吸道合胞病毒、HIV或其组合。
实施方案3.如实施方案1或2所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含对所述病毒蛋白具有结合特异性的受体。
实施方案4.如实施方案3所述的多价颗粒，其中所述受体包含病毒进入受体或病毒附着受体。
实施方案5.如实施方案3所述的多价颗粒，其中所述受体是病毒进入受体和病毒附着受体。
实施方案6.如实施方案3所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含所述受体的细胞外结构域。
实施方案7.如实施方案1或2所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含配体或分泌蛋白。
实施方案8.如实施方案1或2所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含ACE2、TRMPSS2、DPP4、CD4、CCR5、CXCR4、CD209或CLEC4M。
实施方案9.如实施方案1或2所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案10.如实施方案1或2所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案11.如实施方案1-10中任一项所述的多价颗粒，其中所述跨膜多肽将所述融合蛋白锚定到所述多价颗粒的双分子层。
实施方案12.如实施方案1-11中任一项所述的多价颗粒，其中所述跨膜多肽包含刺突糖蛋白跨膜区、哺乳动物膜蛋白、包膜蛋白、核衣壳蛋白或细胞跨膜蛋白。
实施方案13.如实施方案1-11中任一项所述的多价颗粒，其中所述跨膜多肽包含VSVG跨膜区、刺突蛋白S1跨膜区、刺突蛋白S2跨膜区、辛德毕斯病毒包膜(SINDBIS)蛋白、来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白、麻疹病毒融合(F)蛋白的包膜糖蛋白、RD114、BaEV、GP41或GP120。
实施方案14.如实施方案13所述的多价颗粒，其中所述VSVG跨膜区包含全长VSVG跨膜区或截短VSVG跨膜区。
实施方案15.如实施方案13所述的多价颗粒，其中所述跨膜多肽包含所述VSVG跨膜区和VSVG胞质尾区。
实施方案16.如实施方案1-11中任一项所述的多价颗粒，其中所述跨膜多肽包含与SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
实施方案17.如实施方案1-11中任一项所述的多价颗粒，其中所述跨膜多肽包含与SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
实施方案18.如实施方案1-17中任一项所述的多价颗粒，其中所述融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约50个拷贝。
实施方案19.如实施方案1-17中任一项所述的多价颗粒，其中所述融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约75个拷贝。
实施方案20.如实施方案1-17中任一项所述的多价颗粒，其中所述融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约100个拷贝。
实施方案21.如实施方案1-17中任一项所述的多价颗粒，其中所述融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约150个拷贝。
实施方案22.如实施方案1-17中任一项所述的多价颗粒，其中所述融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约200个拷贝。
实施方案23.如实施方案1所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含ACE2，并且所述跨膜多肽包含VSVG跨膜区。
实施方案24.如实施方案1所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含ACE2，并且所述跨膜多肽包含刺突蛋白S2跨膜区。
实施方案25.如实施方案1所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含ACE2，并且所述跨膜多肽包含包膜病毒的表面糖蛋白跨膜区。
实施方案26.如实施方案1所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含DPP4，并且所述跨膜多肽包含来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白。
实施方案27.如实施方案26所述的多价颗粒，其中所述来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白是所述来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白的变体。
实施方案28.如实施方案1-27中任一项所述的多价颗粒，其中所述多价颗粒还包含第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含结合所述病毒蛋白的第二哺乳动物多肽和第二跨膜多肽，其中所述第二融合蛋白在所述多价颗粒的所述表面上表达至少约10个拷贝。
实施方案29.如实施方案28所述的多价颗粒，其中所述第二哺乳动物多肽包含对所述病毒蛋白具有结合特异性的受体。
实施方案30.如实施方案29所述的多价颗粒，其中所述受体包含病毒进入受体或病毒附着受体。
实施方案31.如实施方案29所述的多价颗粒，其中所述受体是病毒进入受体和病毒附着受体。
实施方案32.如实施方案29所述的多价颗粒，其中所述第二哺乳动物多肽包含所述受体的细胞外结构域。
实施方案33.如实施方案28所述的多价颗粒，其中所述第二哺乳动物多肽包含配体或分泌蛋白。
实施方案34.如实施方案28所述的多价颗粒，其中所述第二哺乳动物多肽包含ACE2、TRMPSS2、DPP4、CD4、CCR5、CXCR4、CD209或CLEC4M。
实施方案35.如实施方案28所述的多价颗粒，其中所述第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案36.如实施方案28所述的多价颗粒，其中所述第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案37.如实施方案28-36中任一项所述的多价颗粒，其中所述第二跨膜多肽包含跨膜锚定蛋白。
实施方案38.如实施方案28-36中任一项所述的多价颗粒，其中所述第二跨膜多肽包含刺突糖蛋白跨膜区、哺乳动物膜蛋白、包膜蛋白、核衣壳蛋白或细胞跨膜蛋白。
实施方案39.如实施方案28-36中任一项所述的多价颗粒，其中所述第二跨膜多肽包含VSVG跨膜区、刺突蛋白S1跨膜区、刺突蛋白S2跨膜区、辛德毕斯病毒包膜(SINDBIS)蛋白、来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白、麻疹病毒融合(F)蛋白的包膜糖蛋白、RD114、BaEV、GP41或GP120。
实施方案40.如实施方案39所述的多价颗粒，其中所述VSVG跨膜区包含全长VSVG跨膜区或截短VSVG跨膜区。
实施方案41.如实施方案39所述的多价颗粒，其中所述跨膜多肽包含VSVG跨膜区和VSVG胞质尾区。
实施方案42.如实施方案28-36中任一项所述的多价颗粒，其中所述第二跨膜多肽包含与SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
实施方案43.如实施方案28-36中任一项所述的多价颗粒，其中所述第二跨膜多肽包含与SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
实施方案44.如实施方案28-43中任一项所述的多价颗粒，其中所述第二融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约50个拷贝。
实施方案45.如实施方案28-43中任一项所述的多价颗粒，其中所述第二融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约75个拷贝。
实施方案46.如实施方案28-43中任一项所述的多价颗粒，其中所述第二融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约100个拷贝。
实施方案47.如实施方案28-43中任一项所述的多价颗粒，其中所述第二融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约150个拷贝。
实施方案48.如实施方案28-43中任一项所述的多价颗粒，其中所述第二融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约200个拷贝。
实施方案49.如实施方案28所述的多价颗粒，其中所述第二哺乳动物多肽包含ACE2，并且所述第二跨膜多肽包含VSVG跨膜区。
实施方案50.如实施方案28所述的多价颗粒，其中所述第二哺乳动物多肽包含ACE2，并且所述第二跨膜多肽包含刺突蛋白S2跨膜区。
实施方案51.如实施方案28所述的多价颗粒，其中所述第二哺乳动物多肽包含ACE2，并且所述第二跨膜多肽包含包膜病毒的表面糖蛋白。
实施方案52.如实施方案28所述的多价颗粒，其中所述第二哺乳动物多肽包含DPP4，并且所述第二跨膜多肽包含来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白。
实施方案53.如实施方案52所述的多价颗粒，其中所述来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白是所述来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白的变体。
实施方案54.如实施方案28所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含病毒进入受体，并且所述第二哺乳动物多肽包含病毒附着受体。
实施方案55.如实施方案28所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含ACE2，所述跨膜多肽包含VSVG跨膜区、刺突蛋白S1跨膜区、刺突蛋白S2跨膜区或包膜病毒的表面糖蛋白，所述第二哺乳动物多肽包含硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，并且所述第二跨膜多肽包含VSVG跨膜区、刺突蛋白S1跨膜区、刺突蛋白S2跨膜区或包膜病毒的表面糖蛋白。
实施方案56.如实施方案28所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含CD4，并且所述第二哺乳动物肽包含CCR5、CXCR4或两者。
实施方案57.如实施方案1-56中任一项所述的多价颗粒，其中所述多价颗粒在中和测定中包含小于5皮摩尔(pM)的IC50。
实施方案58.如实施方案1-56中任一项所述的多价颗粒，其中所述多价颗粒在中和测定中包含小于2.5皮摩尔(pM)的IC50。
实施方案59.如实施方案1-56中任一项所述的多价颗粒，其中所述多价颗粒在中和测定中包含小于1皮摩尔(pM)的IC50。
实施方案60.如实施方案1-59中任一项所述的多价颗粒，其中所述多价颗粒不包含病毒遗传物质。
实施方案61.如实施方案1-60中任一项所述的多价颗粒，其中所述多价颗粒是合成的。
实施方案62.如实施方案1-60中任一项所述的多价颗粒，其中所述多价颗粒是重组的。
实施方案63.如实施方案1-60中任一项所述的多价颗粒，其中所述多价颗粒是病毒样颗粒。
实施方案64.如实施方案1-60中任一项所述的多价颗粒，其中所述多价颗粒是细胞外囊泡。
实施方案65.如实施方案1-60中任一项所述的多价颗粒，其中所述多价颗粒是外泌体。
实施方案66.如实施方案1-60中任一项所述的多价颗粒，其中所述多价颗粒是核外粒体。
实施方案67.如实施方案1-65中任一项所述的多价颗粒，其中所述融合蛋白还包含寡聚化结构域。
实施方案68.如实施方案66所述的多价颗粒，其中所述寡聚化结构域是二聚化结构域。
实施方案69.如实施方案68所述的多价颗粒，其中所述二聚化结构域包含亮氨酸拉链二聚化结构域。
实施方案70.如实施方案66所述的多价颗粒，其中所述寡聚化结构域是三聚化结构域。
实施方案71.如实施方案70所述的多价颗粒，其中所述三聚化结构域包含病毒表面蛋白的融合后寡聚化结构域。
实施方案72.如实施方案70所述的多价颗粒，其中所述三聚化结构域包含VSV-G蛋白的D4融合后三聚化结构域。
实施方案73.如实施方案70所述的多价颗粒，其中所述三聚化结构域包含登革E蛋白融合后三聚化结构域。
实施方案74.如实施方案70所述的多价颗粒，其中所述三聚化结构域包含foldon三聚化结构域。
实施方案75.如实施方案69所述的多价颗粒，其中所述三聚化结构域包含人α1(I)胶原的C-前导肽。
实施方案76.如实施方案66所述的多价颗粒，其中所述寡聚化结构域是四聚化结构域。
实施方案77.如实施方案75所述的多价颗粒，其中所述四聚化结构域包含流感神经氨酸酶干结构域。
实施方案78.如实施方案66所述的多价颗粒，其中所述寡聚化结构域包含与根据SEQ ID NO:5-18或28的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案79.如实施方案66-78中任一项所述的多价颗粒，其中当所述融合蛋白在所述多价颗粒的所述表面上表达时，所述寡聚化结构域在所述多价颗粒的外部。
实施方案80.如实施方案66-78中任一项所述的多价颗粒，其中当所述融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达时，所述寡聚化结构域在所述多价颗粒的外部并且与信号肽相邻。
实施方案81.如实施方案66-78中任一项所述的多价颗粒，其中当所述融合蛋白在所述多价颗粒的所述表面上表达时，所述寡聚化结构域在所述多价颗粒的内部。
实施方案82.如实施方案66-78中任一项所述的多价颗粒，其中当所述融合蛋白在所述多价颗粒的所述表面上表达时，所述寡聚化结构域在所述多价颗粒的内部并且与所述跨膜多肽相邻。
实施方案83.如实施方案66-82中任一项所述的多价颗粒，其中所述融合蛋白包含信号肽。
实施方案84.如实施方案66-82中任一项所述的多价颗粒，其中所述融合蛋白的结构域从N-末端到C-末端按以下顺序排列：
(a)信号肽、结合病毒表面蛋白的病毒进入受体的细胞外结构域、寡聚化结构域、跨膜多肽和细胞溶质结构域；
(b)信号肽、结合病毒表面蛋白的病毒进入受体的细胞外结构域、跨膜多肽、寡聚化结构域和细胞溶质结构域；或
(c)信号肽、寡聚化结构域、病毒进入受体的细胞外结构域、跨膜多肽和细胞溶质结构域。
实施方案85.一种组合物，其包含：第一核酸序列，其编码多价颗粒，所述多价颗粒包含融合蛋白，所述融合蛋白包含结合病毒蛋白的病毒进入受体的细胞外结构域和跨膜多肽，其中当所述多价颗粒被表达时，所述融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约10个拷贝；和赋形剂。
实施方案86.如实施方案85所述的组合物，其中所述病毒蛋白来自SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV、呼吸道合胞病毒、HIV或其组合。
实施方案87.如实施方案85或86所述的组合物，其还包含第二核酸序列，所述第二核酸序列编码一种或多种包装病毒蛋白。
实施方案88.如实施方案87所述的组合物，其中所述一种或多种包装病毒蛋白是慢病毒蛋白、逆转录病毒蛋白、腺病毒蛋白或其组合。
实施方案89.如实施方案87所述的组合物，其中所述一种或多种包装病毒蛋白包含gag、pol、pre、tat、rev或其组合。
实施方案90.如实施方案85-89中任一项所述的组合物，其还包含第三核酸序列，所述第三核酸序列编码复制无能病毒基因组、报道分子、治疗性分子或其组合。
实施方案91.如实施方案90所述的组合物，其中所述病毒基因组来源于水疱性口炎病毒、麻疹病毒、肝炎病毒、流感病毒或其组合。
实施方案92.如实施方案90所述的组合物，其中所述报道分子是荧光蛋白或荧光素酶。
实施方案93.如实施方案92所述的组合物，其中所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白。
实施方案94.如实施方案90所述的组合物，其中所述治疗性分子是免疫调节蛋白、细胞信号调节分子、增殖调节分子、细胞死亡调节分子或其组合。
实施方案95.如实施方案85-94中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物多肽包含对所述病毒蛋白具有结合特异性的受体。
实施方案96.如实施方案95所述的组合物，其中所述受体包含病毒进入受体或病毒附着受体。
实施方案97.如实施方案95所述的组合物，其中所述受体是病毒进入受体和病毒附着受体。
实施方案98.如实施方案95所述的组合物，其中所述哺乳动物多肽包含所述受体的细胞外结构域。
实施方案99.如实施方案85-94中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物多肽包含配体或分泌蛋白。
实施方案100.如实施方案85-94中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物多肽包含ACE2、TRMPSS2、DPP4、CD4、CCR5、CXCR4、CD209或CLEC4M。
实施方案101.如实施方案85-94中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案102.如实施方案85-94中任一项所述的组合物，其中所述哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案103.如实施方案85-102中任一项所述的组合物，其中所述跨膜多肽包含跨膜锚定蛋白。
实施方案104.如实施方案85-102中任一项所述的组合物，其中所述跨膜多肽包含刺突糖蛋白跨膜区、哺乳动物膜蛋白、包膜蛋白、核衣壳蛋白或细胞跨膜蛋白。
实施方案105.如实施方案85-102中任一项所述的组合物，其中所述跨膜多肽包含VSVG跨膜区、刺突蛋白S1跨膜区、刺突蛋白S2跨膜区、辛德毕斯病毒包膜(SINDBIS)蛋白、来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白、麻疹病毒融合(F)蛋白的包膜糖蛋白、RD114、BaEV、GP41或GP120。
实施方案106.如实施方案105所述的组合物，其中所述VSVG跨膜区包含全长VSVG跨膜区或截短VSVG跨膜区。
实施方案107.如实施方案105所述的组合物，其中所述跨膜多肽包含VSVG跨膜区和VSVG胞质尾区。
实施方案108.如实施方案85-102中任一项所述的组合物，其中所述跨膜多肽包含与SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
实施方案109.如实施方案85-102中任一项所述的组合物，其中所述跨膜多肽包含与SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
实施方案110.如实施方案1-65中任一项所述的组合物，其中所述融合蛋白还包含寡聚化结构域。
实施方案111.如实施方案66所述的组合物，其中所述寡聚化结构域是二聚化结构域。
实施方案112.如实施方案68所述的组合物，其中所述二聚化结构域包含亮氨酸拉链二聚化结构域。
实施方案113.如实施方案66所述的组合物，其中所述寡聚化结构域是三聚化结构域。
实施方案114.如实施方案70所述的组合物，其中所述三聚化结构域包含病毒表面蛋白的融合后寡聚化结构域。
实施方案115.如实施方案70所述的组合物，其中所述三聚化结构域包含VSV-G蛋白的D4融合后三聚化结构域。
实施方案116.如实施方案70所述的组合物，其中所述三聚化结构域包含登革E蛋白融合后三聚化结构域。
实施方案117.如实施方案70所述的组合物，其中所述三聚化结构域包含foldon三聚化结构域。
实施方案118.如实施方案69所述的组合物，其中所述三聚化结构域包含人α1(I)胶原的C-前导肽。
实施方案119.如实施方案66所述的组合物，其中所述寡聚化结构域是四聚化结构域。
实施方案120.如实施方案75所述的组合物，其中所述四聚化结构域包含流感神经氨酸酶干结构域。
实施方案121.如实施方案66所述的组合物，其中所述寡聚化结构域包含与根据SEQ ID NO:5-18或28的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案122.如实施方案66-78中任一项所述的组合物，其中当所述融合蛋白在所述多价颗粒的所述表面上表达时，所述寡聚化结构域在所述多价颗粒的外部。
实施方案123.如实施方案66-78中任一项所述的组合物，其中当所述融合蛋白在所述多价颗粒的所述表面上表达时，所述寡聚化结构域在所述多价颗粒的外部并且与信号肽相邻。
实施方案124.如实施方案66-78中任一项所述的组合物，其中当所述融合蛋白在所述多价颗粒的所述表面上表达时，所述寡聚化结构域在所述多价颗粒的内部。
实施方案125.如实施方案66-78中任一项所述的组合物，其中当所述融合蛋白在所述多价颗粒的所述表面上表达时，所述寡聚化结构域在所述多价颗粒的内部并且与所述跨膜多肽相邻。
实施方案126.如实施方案85-109中任一项所述的组合物，其中当所述融合蛋白被表达时，它在所述多价颗粒的表面上表达至少约50个拷贝。
实施方案127.如实施方案85-109中任一项所述的组合物，其中当所述融合蛋白被表达时，它在所述多价颗粒的表面上表达至少约75个拷贝。
实施方案128.如实施方案85-109中任一项所述的组合物，其中当所述融合蛋白被表达时，它在所述多价颗粒的表面上表达至少约100个拷贝。
实施方案129.如实施方案85-109中任一项所述的组合物，其中当所述融合蛋白被表达时，它在所述多价颗粒的表面上表达至少约150个拷贝。
实施方案130.如实施方案85-109中任一项所述的组合物，其中当所述融合蛋白被表达时，它在所述多价颗粒的表面上表达至少约200个拷贝。
实施方案131.如实施方案85所述的组合物，其中所述哺乳动物多肽包含ACE2，并且所述跨膜多肽包含VSVG跨膜区。
实施方案132.如实施方案85所述的组合物，其中所述哺乳动物多肽包含ACE2，并且所述跨膜多肽包含刺突蛋白S2跨膜区。
实施方案133.如实施方案85所述的组合物，其中所述哺乳动物多肽包含ACE2，并且所述跨膜多肽包含包膜病毒的表面糖蛋白。
实施方案134.如实施方案85所述的组合物，其中所述哺乳动物多肽包含DPP4，并且所述跨膜多肽包含来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白。
实施方案135.如实施方案118所述的组合物，其中所述来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白是所述来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白的变体。
实施方案136.如实施方案90-119中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含第四核酸序列，所述第四核酸序列编码第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含结合所述病毒蛋白的第二哺乳动物多肽和第二跨膜多肽，其中当所述第二融合蛋白被表达时，它在所述多价颗粒的所述表面上表达至少约10个拷贝。
实施方案137.如实施方案120所述的组合物，其中所述第二哺乳动物多肽包含对所述病毒蛋白具有结合特异性的受体。
实施方案138.如实施方案121所述的组合物，其中所述受体包含病毒进入受体或病毒附着受体。
实施方案139.如实施方案121所述的组合物，其中所述受体是病毒进入受体和病毒附着受体。
实施方案140.如实施方案121所述的组合物，其中所述第二哺乳动物多肽包含所述受体的细胞外结构域。
实施方案141.如实施方案120所述的组合物，其中所述第二哺乳动物多肽包含配体或分泌蛋白。
实施方案142.如实施方案120所述的组合物，其中所述第二哺乳动物多肽包含ACE2、TRMPSS2、DPP4、CD4、CCR5、CXCR4、CD209或CLEC4M。
实施方案143.如实施方案120所述的组合物，其中所述第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案144.如实施方案120所述的组合物，其中所述第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案145.如实施方案120-128中任一项所述的组合物，其中所述第二跨膜多肽包含跨膜锚定蛋白。
实施方案146.如实施方案120-128中任一项所述的组合物，其中所述第二跨膜多肽包含刺突糖蛋白跨膜区、哺乳动物膜蛋白、包膜蛋白、核衣壳蛋白或细胞跨膜蛋白。
实施方案147.如实施方案120-128中任一项所述的组合物，其中所述第二跨膜多肽包含VSVG跨膜区、刺突蛋白S1跨膜区、刺突蛋白S2跨膜区、辛德毕斯病毒包膜(SINDBIS)蛋白、来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白、麻疹病毒融合(F)蛋白的包膜糖蛋白、RD114、BaEV、GP41或GP120。
实施方案148.如实施方案131所述的组合物，其中所述VSVG跨膜区包含全长VSVG跨膜区或截短VSVG跨膜区。
实施方案149.如实施方案131所述的组合物，其中所述VSVG跨膜区包含VSVG跨膜区和VSVG胞质尾区。
实施方案150.如实施方案120-128中任一项所述的组合物，其中所述第二跨膜多肽包含与SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
实施方案151.如实施方案120-128中任一项所述的组合物，其中所述第二跨膜多肽包含与SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
实施方案152.如实施方案1-65中任一项所述的组合物，其中所述第二融合蛋白还包含寡聚化结构域。
实施方案153.如实施方案66所述的组合物，其中所述寡聚化结构域是二聚化结构域。
实施方案154.如实施方案68所述的组合物，其中所述二聚化结构域包含亮氨酸拉链二聚化结构域。
实施方案155.如实施方案66所述的组合物，其中所述寡聚化结构域是三聚化结构域。
实施方案156.如实施方案70所述的组合物，其中所述三聚化结构域包含病毒表面蛋白的融合后寡聚化结构域。
实施方案157.如实施方案70所述的组合物，其中所述三聚化结构域包含VSV-G蛋白的D4融合后三聚化结构域。
实施方案158.如实施方案70所述的组合物，其中所述三聚化结构域包含登革E蛋白融合后三聚化结构域。
实施方案159.如实施方案70所述的组合物，其中所述三聚化结构域包含foldon三聚化结构域。
实施方案160.如实施方案69所述的组合物，其中所述三聚化结构域包含人α1(I)胶原的C-前导肽。
实施方案161.如实施方案66所述的组合物，其中所述寡聚化结构域是四聚化结构域。
实施方案162.如实施方案75所述的组合物，其中所述四聚化结构域包含流感神经氨酸酶干结构域。
实施方案163.如实施方案66所述的组合物，其中所述寡聚化结构域包含与根据SEQ ID NO:5-18或28的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案164.如实施方案66-78中任一项所述的组合物，其中当所述第二融合蛋白在所述多价颗粒的所述表面上表达时，所述寡聚化结构域在所述多价颗粒的外部。
实施方案165.如实施方案66-78中任一项所述的组合物，其中当所述第二融合蛋白在所述多价颗粒的所述表面上表达时，所述寡聚化结构域在所述多价颗粒的外部并且与信号肽相邻。
实施方案166.如实施方案66-78中任一项所述的组合物，其中当所述第二融合蛋白在所述多价颗粒的所述表面上表达时，所述寡聚化结构域在所述多价颗粒的内部。
实施方案167.如实施方案66-78中任一项所述的组合物，其中当所述第二融合蛋白在所述多价颗粒的所述表面上表达时，所述寡聚化结构域在所述多价颗粒的内部并且与所述跨膜多肽相邻。
实施方案168.如实施方案120-135中任一项所述的组合物，其中当所述第二融合蛋白被表达时，它在所述多价颗粒的表面上表达至少约50个拷贝。
实施方案169.如实施方案120-135中任一项所述的组合物，其中当所述第二融合蛋白被表达时，它在所述多价颗粒的表面上表达至少约75个拷贝。
实施方案170.如实施方案120-135中任一项所述的组合物，其中当所述第二融合蛋白被表达时，它在所述多价颗粒的表面上表达至少约100个拷贝。
实施方案171.如实施方案120-135中任一项所述的组合物，其中当所述第二融合蛋白被表达时，它在所述多价颗粒的表面上表达至少约150个拷贝。
实施方案172.如实施方案120-135中任一项所述的组合物，其中当所述第二融合蛋白被表达时，它在所述多价颗粒的表面上表达至少约200个拷贝。
实施方案173.如实施方案120所述的组合物，其中所述第二哺乳动物多肽包含ACE2，并且所述第二跨膜多肽包含VSVG跨膜区。
实施方案174.如实施方案120所述的组合物，其中所述第二哺乳动物多肽包含ACE2，并且所述第二跨膜多肽包含刺突蛋白S2跨膜区。
实施方案175.如实施方案120所述的组合物，其中所述第二哺乳动物多肽包含ACE2，并且所述第二跨膜多肽包含包膜病毒的表面糖蛋白。
实施方案176.如实施方案120所述的组合物，其中所述第二哺乳动物多肽包含DPP4，并且所述第二跨膜多肽包含来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白。
实施方案177.如实施方案144所述的组合物，其中所述来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白是所述来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白的变体。
实施方案178.如实施方案120所述的组合物，其中所述哺乳动物多肽包含病毒进入受体，并且所述第二哺乳动物多肽包含病毒附着受体。
实施方案179.如实施方案120所述的组合物，其中所述哺乳动物多肽包含ACE2，所述跨膜多肽包含VSVG跨膜区、刺突蛋白S1跨膜区、刺突蛋白S2跨膜区或包膜病毒的表面糖蛋白，所述第二哺乳动物多肽包含硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，并且所述第二跨膜多肽包含VSVG跨膜区、刺突蛋白S1跨膜区、刺突蛋白S2跨膜区或包膜病毒的表面糖蛋白。
实施方案180.如实施方案120所述的组合物，其中所述哺乳动物多肽包含CD4，并且所述第二哺乳动物肽包含CCR5、CXCR4或两者。
实施方案181.如实施方案90所述的组合物，其中所述第一核酸序列、所述第二核酸序列和所述第三核酸序列在同一载体内。
实施方案182.如实施方案90所述的组合物，其中所述第一核酸序列、所述第二核酸序列和所述第三核酸序列在不同载体内。
实施方案183.如实施方案120所述的组合物，其中所述第一核酸序列、所述第二核酸序列、所述第三核酸序列和所述第四核酸序列在同一载体内。
实施方案184.如实施方案120所述的组合物，其中所述第一核酸序列、所述第二核酸序列、所述第三核酸序列和所述第四核酸序列在不同载体内。
实施方案185.如实施方案118所述的组合物，其中编码所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白的所述核酸序列以及所述第二核酸序列和所述第三核酸序列是mRNA。
实施方案186.如实施方案118所述的组合物，其中编码所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白的所述核酸序列以及所述第二核酸序列和所述第三核酸序列是DNA。
实施方案187.如实施方案149中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含载体，其中所述载体是慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
实施方案188.一种药物组合物，其包含如实施方案1-84中任一项所述的多价颗粒和药学上可接受的赋形剂。
实施方案189.一种治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括向所述对象施用如实施方案1-84中任一项所述的多价颗粒或如实施方案85-187中任一项所述的组合物。
实施方案190.如实施方案189所述的方法，其中所述多价颗粒静脉内施用。
实施方案191.如实施方案189所述的方法，其中所述多价颗粒通过吸入施用。
实施方案192.如实施方案189所述的方法，其中所述多价颗粒通过腹膜内注射施用。
实施方案193.如实施方案189所述的方法，其中所述多价颗粒通过皮下注射施用。
实施方案194.如实施方案189所述的方法，其中所述病毒感染包括SARS CoV-2、SARS CoV-1、MERS CoV的感染。
实施方案195.如实施方案189所述的方法，其中所述组合物静脉内施用。
实施方案196.如实施方案189所述的方法，其中所述组合物通过吸入施用。
实施方案197.如实施方案189所述的方法，其中所述组合物通过腹膜内注射施用。
实施方案198.如实施方案189所述的方法，其中所述组合物通过皮下注射施用。
实施方案199.如实施方案189所述的方法，其中所述组合物包含脂质体。
实施方案200.如实施方案189所述的方法，其中所述组合物包含腺相关病毒(AAV)。
实施方案201.如实施方案189所述的方法，其中所述组合物包含脂质纳米颗粒。
实施方案202.如实施方案189所述的方法，其中所述组合物包含聚合物。
实施方案203.如实施方案194所述的方法，其中所述SARS CoV-2、SARS CoV-1、MERS CoV在体内被所述多价颗粒或所述组合物有效地中和。
实施方案204.如实施方案189所述的方法，其中所述多价颗粒或所述组合物抑制所述病毒感染的呼吸道症状。
实施方案205.如实施方案189所述的方法，其中所述多价颗粒或所述组合物诱导针对所述病毒感染的不同毒株的强大免疫力。
实施方案206.如实施方案189所述的方法，其中所述病毒感染包括SARS CoV-2的感染，并且所述多价颗粒或所述组合物诱导针对SARS CoV-2的德尔塔变体的强大免疫力。
实施方案207.一种产生针对有需要的对象的病毒感染的免疫力的方法，所述方法包括向所述对象施用如实施方案1-84中任一项所述的多价颗粒或如实施方案85-187中任一项所述的组合物以及所述病毒感染的病毒。
实施方案208.如实施方案207所述的方法，其中所述多价颗粒静脉内施用。
实施方案209.如实施方案207所述的方法，其中所述多价颗粒通过吸入施用。
实施方案210.如实施方案207所述的方法，其中所述多价颗粒通过腹膜内注射施用。
实施方案211.如实施方案207所述的方法，其中所述多价颗粒通过皮下注射施用。
实施方案212.如实施方案207-211中任一项所述的方法，其中所述病毒感染包括SARS CoV-2、SARS CoV-1、MERS CoV的感染。
实施方案213.如实施方案207-212中任一项所述的方法，其中所述组合物静脉内施用。
实施方案214.如实施方案207-212中任一项所述的方法，其中所述组合物通过吸入施用。
实施方案215.如实施方案207-212中任一项所述的方法，其中所述组合物通过腹膜内注射施用。
实施方案216.如实施方案207-212中任一项所述的方法，其中所述组合物通过皮下注射施用。
实施方案217.如实施方案207-216中任一项所述的方法，其中所述组合物包含脂质体。
实施方案218.如实施方案207-217中任一项所述的方法，其中所述组合物包含腺相关病毒(AAV)。
实施方案219.如实施方案207-218中任一项所述的方法，其中所述组合物包含脂质纳米颗粒。
实施方案220.如实施方案207-219中任一项所述的方法，其中所述组合物包含聚合物。
实施方案221.如实施方案207-220中任一项所述的方法，其中所述SARS CoV-2、SARS CoV-1、MERS CoV在体内被所述多价颗粒或所述组合物有效地中和。
实施方案222.如实施方案207-221中任一项所述的方法，其中所述多价颗粒或所述组合物抑制所述病毒感染的呼吸道症状。
实施方案223.如实施方案207-222中任一项所述的方法，其中所述多价颗粒或所述组合物诱导针对所述病毒感染的不同毒株的强大免疫力。
实施方案224.如实施方案207-223中任一项所述的方法，其中所述病毒感染包括SARS CoV-2的感染，并且所述多价颗粒或所述组合物诱导针对SARS CoV-2的德尔塔变体的强大免疫力。
序列表
<110> 阿奇洛伊斯生物制药公司
<120> 多价颗粒组合物和使用方法
<130> 48295-701601
<140>
<141>
<150> 63/191,245
<151> 2021-05-20
<150> 63/108,105
<151> 2020-10-30
<160> 35
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 805
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
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<213> 智人
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<213> 印第安纳水泡病毒
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50 55 60
Tyr Ala Thr Val Thr Asp Ala Glu Ala Val Ile Val Gln Val Thr Pro
65 70 75 80
His His Val Leu Val Asp Glu Tyr Thr Gly Glu Trp Val Asp Ser Gln
85 90 95
Phe Ile Asn Gly Lys Cys Ser Asn Tyr Ile Cys Pro Thr Val His Asn
100 105 110
Ser Thr Thr Trp His Ser Asp Tyr Lys Val Lys Gly Leu Cys Asp Ser
115 120 125
Asn Leu
130
<210> 7
<211> 115
<212> PRT
<213> 印第安纳水泡病毒
<400> 7
Ile Gln Ala Asp Gly Trp Met Cys His Ala Ser Lys Trp Val Thr Thr
1 5 10 15
Cys Asp Phe Arg Trp Tyr Gly Pro Lys Tyr Ile Thr His Ser Ile Arg
20 25 30
Ser Phe Thr Pro Ser Val Glu Gln Cys Lys Glu Ser Ile Glu Gln Thr
35 40 45
Lys Gln Gly Thr Trp Leu Asn Pro Gly Phe Pro Pro Gln Ser Cys Gly
50 55 60
Tyr Ala Thr Val Thr Asp Ala Glu Ala Val Ile Val Gln Val Thr Pro
65 70 75 80
His His Val Leu Val Asp Glu Tyr Thr Gly Glu Trp Val Asp Ser Gln
85 90 95
Phe Ile Asn Gly Lys Cys Ser Asn Tyr Ile Cys Pro Thr Val His Asn
100 105 110
Ser Thr Thr
115
<210> 8
<211> 100
<212> PRT
<213> 印第安纳水泡病毒
<400> 8
Ile Gln Ala Asp Gly Trp Met Cys His Ala Ser Lys Trp Val Thr Thr
1 5 10 15
Cys Asp Phe Arg Trp Tyr Gly Pro Lys Tyr Ile Thr His Ser Ile Arg
20 25 30
Ser Phe Thr Pro Ser Val Glu Gln Cys Lys Glu Ser Ile Glu Gln Thr
35 40 45
Lys Gln Gly Thr Trp Leu Asn Pro Gly Phe Pro Pro Gln Ser Cys Gly
50 55 60
Tyr Ala Thr Val Thr Asp Ala Glu Ala Val Ile Val Gln Val Thr Pro
65 70 75 80
His His Val Leu Val Asp Glu Tyr Thr Gly Glu Trp Val Asp Ser Gln
85 90 95
Phe Ile Asn Gly
100
<210> 9
<211> 84
<212> PRT
<213> 印第安纳水泡病毒
<400> 9
Ile Gln Ala Asp Gly Trp Met Cys His Ala Ser Lys Trp Val Thr Thr
1 5 10 15
Cys Asp Phe Arg Trp Tyr Gly Pro Lys Tyr Ile Thr His Ser Ile Arg
20 25 30
Ser Phe Thr Pro Ser Val Glu Gln Cys Lys Glu Ser Ile Glu Gln Thr
35 40 45
Lys Gln Gly Thr Trp Leu Asn Pro Gly Phe Pro Pro Gln Ser Cys Gly
50 55 60
Tyr Ala Thr Val Thr Asp Ala Glu Ala Val Ile Val Gln Val Thr Pro
65 70 75 80
His His Val Leu
<210> 10
<211> 27
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述:
Foldon序列
<400> 10
Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys
1 5 10 15
Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
20 25
<210> 11
<211> 33
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述:
亮氨酸拉链V1序列
<400> 11
Arg Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Gln
1 5 10 15
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu
20 25 30
Arg
<210> 12
<211> 33
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述:
亮氨酸拉链V2序列
<400> 12
Arg Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn
1 5 10 15
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu
20 25 30
Arg
<210> 13
<211> 40
<212> PRT
<213> 流感病毒
<400> 13
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Ile Cys Leu Val
1 5 10 15
Val Gly Leu Ile Ser Leu Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile
20 25 30
Trp Ile Ser His Ser Ile Gln Thr
35 40
<210> 14
<211> 75
<212> PRT
<213> 流感病毒
<400> 14
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Ile Cys Met Val
1 5 10 15
Thr Gly Ile Val Ser Leu Met Leu Gln Ile Gly Asn Met Ile Ser Ile
20 25 30
Trp Val Ser His Ser Ile His Thr Gly Asn Gln His Gln Ser Glu Pro
35 40 45
Ile Ser Asn Thr Asn Phe Leu Thr Glu Lys Ala Val Ala Ser Val Lys
50 55 60
Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Ile Asn
65 70 75
<210> 15
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多肽
<400> 15
Lys Leu Cys Ile Glu Ala Lys Ile Ser Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg
1 5 10 15
Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala Thr Leu Val Glu Glu Gln Asp Thr Asn
20 25 30
Phe Val Cys Arg Arg Thr Phe Val Asp Arg Gly His Gly Asn Gly Cys
35 40 45
Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Leu Ile Thr Cys Ala Lys Phe Lys Cys
50 55 60
Val Thr Lys Leu
65
<210> 16
<211> 83
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多肽
<400> 16
Ile Glu Leu Leu Lys Thr Glu Val Thr Asn Pro Ala Val Leu Arg Lys
1 5 10 15
Leu Cys Ile Glu Ala Lys Ile Ser Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys
20 25 30
Pro Thr Gln Gly Glu Ala Thr Leu Val Glu Glu Gln Asp Thr Asn Phe
35 40 45
Val Cys Arg Arg Thr Phe Val Asp Arg Gly His Gly Asn Gly Cys Gly
50 55 60
Leu Phe Gly Lys Gly Ser Leu Ile Thr Cys Ala Lys Phe Lys Cys Val
65 70 75 80
Thr Lys Leu
<210> 17
<211> 83
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多肽
<400> 17
Lys Leu Cys Ile Glu Ala Lys Ile Ser Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg
1 5 10 15
Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala Thr Leu Val Glu Glu Gln Asp Thr Asn
20 25 30
Phe Val Cys Arg Arg Thr Phe Val Asp Arg Gly His Gly Asn Gly Cys
35 40 45
Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Leu Ile Thr Cys Ala Lys Phe Lys Cys
50 55 60
Val Thr Lys Leu Glu Gly Lys Ile Val Gln Tyr Glu Asn Leu Lys Tyr
65 70 75 80
Ser Val Ile
<210> 18
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多肽
<400> 18
Glu Ala Lys Ile Ser Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Gly Glu Ala Thr Leu Val Glu Glu Gln Asp Thr Asn Phe Val Cys Arg
20 25 30
Arg Thr Phe Val Asp Arg Gly His Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly
35 40 45
Lys Gly Ser Leu Ile Thr Cys Ala Lys Phe Lys
50 55
<210> 19
<211> 22
<212> PRT
<213> 印第安纳水泡病毒
<400> 19
Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu
1 5 10 15
Val Leu Arg Val Gly Ile
20
<210> 20
<211> 37
<212> PRT
<213> 印第安纳水泡病毒
<400> 20
Pro Ile Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser Ile
1 5 10 15
Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu Val
20 25 30
Leu Arg Val Gly Ile
35
<210> 21
<211> 53
<212> PRT
<213> 印第安纳水泡病毒
<400> 21
Asp Asp Glu Ser Leu Phe Phe Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys Asn Pro
1 5 10 15
Ile Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser Ile Ala
20 25 30
Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu Val Leu
35 40 45
Arg Val Gly Ile His
50
<210> 22
<211> 81
<212> PRT
<213> 印第安纳水泡病毒
<400> 22
Gly Met Leu Asp Ser Asp Leu His Leu Ser Ser Lys Ala Gln Val Phe
1 5 10 15
Glu His Pro His Ile Gln Asp Ala Ala Ser Gln Leu Pro Asp Asp Glu
20 25 30
Ser Leu Phe Phe Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys Asn Pro Ile Glu Leu
35 40 45
Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser Ile Ala Ser Phe Phe
50 55 60
Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu Val Leu Arg Val Gly
65 70 75 80
Ile
<210> 23
<211> 25
<212> PRT
<213> 印第安纳水泡病毒
<400> 23
His Leu Cys Ile Lys Leu Lys His Thr Lys Lys Arg Gln Ile Tyr Thr
1 5 10 15
Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
20 25
<210> 24
<211> 23
<212> PRT
<213> 流感病毒
<400> 24
Ile Ile Thr Ile Gly Ser Val Cys Met Thr Ile Gly Met Ala Asn Leu
1 5 10 15
Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile
20
<210> 25
<211> 23
<212> PRT
<213> 流感病毒
<400> 25
Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val Val Ser
1 5 10 15
Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp
20
<210> 26
<211> 52
<212> PRT
<213> 登革病毒
<400> 26
Ala Tyr Gly Val Leu Phe Ser Gly Val Ser Trp Thr Met Lys Ile Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ile Leu Leu Thr Trp Leu Gly Leu Asn Ser Arg Ser Thr Ser
20 25 30
Leu Ser Met Thr Cys Ile Ala Val Gly Met Val Thr Leu Tyr Leu Gly
35 40 45
Val Met Val Gln
50
<210> 27
<211> 21
<212> PRT
<213> 人免疫缺陷病毒
<400> 27
Phe Ile Met Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Ile Val Phe Ala
1 5 10 15
Val Leu Ser Ile Val
20
<210> 28
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多肽
<400> 28
Glu Thr Gly His His His His His His Ser Ala Asp Glu Pro Met Asp
1 5 10 15
Phe Lys Ile Asn Thr Asp Glu Ile Met Thr Ser Leu Lys Ser Val Asn
20 25 30
Gly Gln Ile Glu Ser Leu Ile Ser Pro Asp Gly Ser Arg Lys Asn Pro
35 40 45
Ala Arg Asn Cys Arg Asp Leu Lys Phe Cys His Pro Glu Leu Lys Ser
50 55 60
Gly Glu Tyr Trp Val Asp Pro Asn Gln Gly Cys Lys Leu Asp Ala Ile
65 70 75 80
Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu Thr Cys Ile Ser Ala Asn
85 90 95
Pro Leu Asn Val Pro Arg Lys His Trp Trp Thr Asp Ser Ser Ala Glu
100 105 110
Lys Lys His Val Trp Phe Gly Glu Ser Met Asp Gly Gly Phe Gln Phe
115 120 125
Ser Tyr Gly Asn Pro Glu Leu Pro Glu Asp Val Leu Asp Val Gln Leu
130 135 140
Ala Phe Leu Arg Leu Leu Ser Ser Arg Ala Ser Gln Gln Ile Thr Tyr
145 150 155 160
His Cys Lys Asn Ser Ile Ala Tyr Met Asp Gln Ala Ser Gly Asn Val
165 170 175
Lys Lys Ala Leu Lys Leu Met Gly Ser Asn Glu Gly Glu Phe Lys Ala
180 185 190
Glu Gly Asn Ser Lys Phe Thr Tyr Thr Val Leu Glu Asp Gly Cys Thr
195 200 205
Lys His Thr Gly Glu Trp Ser Lys Thr Val Phe Glu Tyr Arg Thr Arg
210 215 220
Lys Ala Val Arg Leu Pro Ile Val Asp Ile Ala Pro Tyr Asp Ile Gly
225 230 235 240
Gly Pro Asp Gln Glu Phe Gly Val Asp Val Gly Pro Val Cys Phe Leu
245 250 255
<210> 29
<211> 848
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多肽
<400> 29
Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala
1 5 10 15
Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe
20 25 30
Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp
35 40 45
Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn
50 55 60
Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala
65 70 75 80
Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln
85 90 95
Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys
100 105 110
Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser
115 120 125
Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu
130 135 140
Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu
145 150 155 160
Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu
165 170 175
Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg
180 185 190
Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu
195 200 205
Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu
210 215 220
Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu
225 230 235 240
His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile
245 250 255
Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly
260 265 270
Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys
275 280 285
Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala
290 295 300
Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu
305 310 315 320
Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro
325 330 335
Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly
340 345 350
Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp
355 360 365
Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala
370 375 380
Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe
385 390 395 400
His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys
405 410 415
His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn
420 425 430
Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly
435 440 445
Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe
450 455 460
Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met
465 470 475 480
Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe
500 505 510
Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala
515 520 525
Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile
530 535 540
Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu
545 550 555 560
Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala
565 570 575
Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe
580 585 590
Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr
595 600 605
Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu
610 615 620
Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met
625 630 635 640
Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu
645 650 655
Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val
660 665 670
Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro
675 680 685
Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile
690 695 700
Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn
705 710 715 720
Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln
725 730 735
Pro Pro Val Ser Ser Arg Gly Met Leu Asp Ser Asp Leu His Leu Ser
740 745 750
Ser Lys Ala Gln Val Phe Glu His Pro His Ile Gln Asp Ala Ala Ser
755 760 765
Gln Leu Pro Asp Asp Glu Ser Leu Phe Phe Gly Asp Thr Gly Leu Ser
770 775 780
Lys Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser
785 790 795 800
Ser Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe
805 810 815
Leu Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu Lys His Thr
820 825 830
Lys Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
835 840 845
<210> 30
<211> 1344
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多肽
<400> 30
Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala
1 5 10 15
Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe
20 25 30
Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp
35 40 45
Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn
50 55 60
Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala
65 70 75 80
Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln
85 90 95
Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys
100 105 110
Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser
115 120 125
Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu
130 135 140
Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu
145 150 155 160
Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu
165 170 175
Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg
180 185 190
Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu
195 200 205
Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu
210 215 220
Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu
225 230 235 240
His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile
245 250 255
Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly
260 265 270
Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys
275 280 285
Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala
290 295 300
Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu
305 310 315 320
Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro
325 330 335
Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly
340 345 350
Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp
355 360 365
Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala
370 375 380
Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe
385 390 395 400
His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys
405 410 415
His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn
420 425 430
Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly
435 440 445
Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe
450 455 460
Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met
465 470 475 480
Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe
500 505 510
Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala
515 520 525
Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile
530 535 540
Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu
545 550 555 560
Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala
565 570 575
Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe
580 585 590
Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr
595 600 605
Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu
610 615 620
Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met
625 630 635 640
Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu
645 650 655
Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val
660 665 670
Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro
675 680 685
Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile
690 695 700
Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn
705 710 715 720
Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln
725 730 735
Pro Pro Val Ser Asp Ile Gly Gly Gly Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile
740 745 750
Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser
755 760 765
Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr
770 775 780
Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met
785 790 795 800
Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr
805 810 815
Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val
820 825 830
Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile
835 840 845
Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln
850 855 860
Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp
865 870 875 880
Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln
885 890 895
Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala
900 905 910
Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu
915 920 925
Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser
930 935 940
Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met
945 950 955 960
Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu
965 970 975
Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly
980 985 990
Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu
995 1000 1005
Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val
1010 1015 1020
Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn
1025 1030 1035
Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile
1040 1045 1050
Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
1055 1060 1065
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
1070 1075 1080
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1085 1090 1095
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1100 1105 1110
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1115 1120 1125
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
1130 1135 1140
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
1145 1150 1155
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln
1160 1165 1170
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
1175 1180 1185
Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro
1190 1195 1200
Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
1205 1210 1215
His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1220 1225 1230
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
1235 1240 1245
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1250 1255 1260
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1265 1270 1275
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1280 1285 1290
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1295 1300 1305
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1310 1315 1320
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr Tyr Thr Asp Ile Glu
1325 1330 1335
Met Asn Arg Leu Gly Lys
1340
<210> 31
<211> 1355
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多肽
<400> 31
Met Gly Ser Arg Ile Val Ile Asn Arg Glu His Leu Met Ile Asp Arg
1 5 10 15
Pro Tyr Val Leu Leu Ala Val Leu Phe Val Met Phe Leu Ser Leu Ile
20 25 30
Gly Leu Leu Ala Ile Ala Gly Ile Arg Leu His Arg Ala Ala Ile Tyr
35 40 45
Thr Ala Glu Ile His Lys Ser Leu Ser Thr Asn Leu Asp Val Thr Asn
50 55 60
Ser Ile Glu His Gln Val Lys Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe Lys Ile
65 70 75 80
Ile Gly Asp Glu Val Gly Leu Arg Thr Pro Gln Arg Phe Thr Asp Leu
85 90 95
Val Lys Phe Ile Ser Asp Lys Ile Lys Phe Leu Asn Pro Asp Arg Glu
100 105 110
Tyr Asp Phe Arg Asp Leu Thr Trp Cys Ile Asn Pro Pro Glu Arg Ile
115 120 125
Lys Leu Asp Tyr Asp Gln Tyr Cys Ala Asp Val Ala Ala Glu Glu Leu
130 135 140
Met Asn Ala Leu Val Asn Ser Thr Leu Leu Glu Thr Arg Thr Thr Asn
145 150 155 160
Gln Phe Leu Ala Val Ser Lys Gly Asn Cys Ser Gly Pro Thr Thr Ile
165 170 175
Arg Gly Gln Phe Ser Asn Met Ser Leu Ser Leu Leu Asp Leu Tyr Leu
180 185 190
Gly Arg Gly Tyr Asn Val Ser Ser Ile Val Thr Met Thr Ser Gln Gly
195 200 205
Met Tyr Gly Gly Thr Tyr Leu Val Glu Lys Pro Asn Leu Ser Ser Lys
210 215 220
Arg Ser Glu Leu Ser Gln Leu Ser Met Tyr Arg Val Phe Glu Val Gly
225 230 235 240
Val Ile Arg Asn Pro Gly Leu Gly Ala Pro Val Phe His Met Thr Asn
245 250 255
Tyr Leu Glu Gln Pro Val Ser Asn Asp Leu Ser Asn Cys Met Val Ala
260 265 270
Leu Gly Glu Leu Lys Leu Ala Ala Leu Cys His Gly Glu Asp Ser Ile
275 280 285
Thr Ile Pro Tyr Gln Gly Ser Gly Lys Gly Val Ser Phe Gln Leu Val
290 295 300
Lys Leu Gly Val Trp Lys Ser Pro Thr Asp Met Gln Ser Trp Val Pro
305 310 315 320
Leu Ser Thr Asp Asp Pro Val Ile Asp Arg Leu Tyr Leu Ser Ser His
325 330 335
Arg Gly Val Ile Ala Asp Asn Gln Ala Lys Trp Ala Val Pro Thr Thr
340 345 350
Arg Thr Asp Asp Lys Leu Arg Met Glu Thr Cys Phe Gln Gln Ala Cys
355 360 365
Lys Gly Lys Ile Gln Ala Leu Cys Glu Asn Pro Glu Trp Ala Pro Leu
370 375 380
Lys Asp Asn Arg Ile Pro Ser Tyr Gly Val Leu Ser Val Asp Leu Ser
385 390 395 400
Leu Thr Val Glu Leu Lys Ile Lys Ile Ala Ser Gly Phe Gly Pro Leu
405 410 415
Ile Thr His Gly Ser Gly Met Asp Leu Tyr Lys Ser Asn His Asn Asn
420 425 430
Val Tyr Trp Leu Thr Ile Pro Pro Met Lys Asn Leu Ala Leu Gly Val
435 440 445
Ile Asn Thr Leu Glu Trp Ile Pro Arg Phe Lys Val Ser Pro Ala Leu
450 455 460
Phe Asn Val Pro Ile Lys Glu Ala Gly Gly Asp Cys His Ala Pro Thr
465 470 475 480
Tyr Leu Pro Ala Glu Val Asp Gly Asp Val Lys Leu Ser Ser Asn Leu
485 490 495
Val Ile Leu Pro Gly Gln Asp Leu Gln Tyr Val Leu Ala Thr Tyr Asp
500 505 510
Thr Ser Ala Val Glu His Ala Val Val Tyr Tyr Val Tyr Ser Pro Ser
515 520 525
Arg Ser Phe Ser Tyr Phe Tyr Pro Phe Arg Leu Pro Ile Lys Gly Val
530 535 540
Pro Ile Glu Leu Gln Val Glu Cys Phe Thr Trp Asp Gln Lys Leu Trp
545 550 555 560
Cys Arg His Phe Cys Val Leu Ala Asp Ser Glu Ser Gly Gly His Ile
565 570 575
Thr His Ser Gly Met Val Gly Met Gly Val Ser Cys Thr Val Thr Arg
580 585 590
Glu Gly Gly Gly Ser Lys Gly Thr Asp Asp Ala Thr Ala Asp Ser Arg
595 600 605
Lys Thr Tyr Thr Leu Thr Asp Tyr Leu Lys Asn Thr Tyr Arg Leu Lys
610 615 620
Leu Tyr Ser Leu Arg Trp Ile Ser Asp His Glu Tyr Leu Tyr Lys Gln
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Glu Asn Asn Ile Leu Val Phe Asn Ala Glu Tyr Gly Asn Ser Ser Val
645 650 655
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660 665 670
Tyr Ser Ile Ser Pro Asp Gly Gln Phe Ile Leu Leu Glu Tyr Asn Tyr
675 680 685
Val Lys Gln Trp Arg His Ser Tyr Thr Ala Ser Tyr Asp Ile Tyr Asp
690 695 700
Leu Asn Lys Arg Gln Leu Ile Thr Glu Glu Arg Ile Pro Asn Asn Thr
705 710 715 720
Gln Trp Val Thr Trp Ser Pro Val Gly His Lys Leu Ala Tyr Val Trp
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740 745 750
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785 790 795 800
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805 810 815
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820 825 830
Thr Val Lys Phe Phe Val Val Asn Thr Asp Ser Leu Ser Ser Val Thr
835 840 845
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850 855 860
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865 870 875 880
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885 890 895
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930 935 940
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945 950 955 960
Asp Cys Thr Phe Ile Thr Lys Gly Thr Trp Glu Val Ile Gly Ile Glu
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980 985 990
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Tyr Tyr Ser Val Ser Phe Ser Lys Glu Ala Lys Tyr Tyr Gln Leu
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1055 1060 1065
Asp Lys Met Leu Gln Asn Val Gln Met Pro Ser Lys Lys Leu Asp
1070 1075 1080
Phe Ile Ile Leu Asn Glu Thr Lys Phe Trp Tyr Gln Met Ile Leu
1085 1090 1095
Pro Pro His Phe Asp Lys Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Leu Asp
1100 1105 1110
Val Tyr Ala Gly Pro Cys Ser Gln Lys Ala Asp Thr Val Phe Arg
1115 1120 1125
Leu Asn Trp Ala Thr Tyr Leu Ala Ser Thr Glu Asn Ile Ile Val
1130 1135 1140
Ala Ser Phe Asp Gly Arg Gly Ser Gly Tyr Gln Gly Asp Lys Ile
1145 1150 1155
Met His Ala Ile Asn Arg Arg Leu Gly Thr Phe Glu Val Glu Asp
1160 1165 1170
Gln Ile Glu Ala Ala Arg Gln Phe Ser Lys Met Gly Phe Val Asp
1175 1180 1185
Asn Lys Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser Tyr Gly Gly Tyr Val
1190 1195 1200
Thr Ser Met Val Leu Gly Ser Gly Ser Gly Val Phe Lys Cys Gly
1205 1210 1215
Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Arg Trp Glu Tyr Tyr Asp Ser Val
1220 1225 1230
Tyr Thr Glu Arg Tyr Met Gly Leu Pro Thr Pro Glu Asp Asn Leu
1235 1240 1245
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1250 1255 1260
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1265 1270 1275
Val His Phe Gln Gln Ser Ala Gln Ile Ser Lys Ala Leu Val Asp
1280 1285 1290
Val Gly Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Thr Asp Glu Asp His
1295 1300 1305
Gly Ile Ala Ser Ser Thr Ala His Gln His Ile Tyr Thr His Met
1310 1315 1320
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1325 1330 1335
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1340 1345 1350
His Glu
1355
<210> 32
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多肽
<400> 32
Lys Gly Thr Asp Asp Ala Thr Ala Asp Ser Arg Lys Thr Tyr Thr Leu
1 5 10 15
Thr Asp Tyr Leu Lys Asn Thr Tyr Arg Leu Lys Leu Tyr Ser Leu Arg
20 25 30
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35 40 45
Val Phe Asn Ala Glu Tyr Gly Asn Ser Ser Val Phe Leu Glu Asn Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Gly Gln Phe Ile Leu Leu Glu Tyr Asn Tyr Val Lys Gln Trp Arg
85 90 95
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100 105 110
Leu Ile Thr Glu Glu Arg Ile Pro Asn Asn Thr Gln Trp Val Thr Trp
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Val Pro Tyr Pro Lys Ala Gly Ala Val Asn Pro Thr Val Lys Phe Phe
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245 250 255
Gln Ile Thr Ala Pro Ala Ser Met Leu Ile Gly Asp His Tyr Leu Cys
260 265 270
Asp Val Thr Trp Ala Thr Gln Glu Arg Ile Ser Leu Gln Trp Leu Arg
275 280 285
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290 295 300
Ser Gly Arg Trp Asn Cys Leu Val Ala Arg Gln His Ile Glu Met Ser
305 310 315 320
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325 330 335
Leu Asp Gly Asn Ser Phe Tyr Lys Ile Ile Ser Asn Glu Glu Gly Tyr
340 345 350
Arg His Ile Cys Tyr Phe Gln Ile Asp Lys Lys Asp Cys Thr Phe Ile
355 360 365
Thr Lys Gly Thr Trp Glu Val Ile Gly Ile Glu Ala Leu Thr Ser Asp
370 375 380
Tyr Leu Tyr Tyr Ile Ser Asn Glu Tyr Lys Gly Met Pro Gly Gly Arg
385 390 395 400
Asn Leu Tyr Lys Ile Gln Leu Ser Asp Tyr Thr Lys Val Thr Cys Leu
405 410 415
Ser Cys Glu Leu Asn Pro Glu Arg Cys Gln Tyr Tyr Ser Val Ser Phe
420 425 430
Ser Lys Glu Ala Lys Tyr Tyr Gln Leu Arg Cys Ser Gly Pro Gly Leu
435 440 445
Pro Leu Tyr Thr Leu His Ser Ser Val Asn Asp Lys Gly Leu Arg Val
450 455 460
Leu Glu Asp Asn Ser Ala Leu Asp Lys Met Leu Gln Asn Val Gln Met
465 470 475 480
Pro Ser Lys Lys Leu Asp Phe Ile Ile Leu Asn Glu Thr Lys Phe Trp
485 490 495
Tyr Gln Met Ile Leu Pro Pro His Phe Asp Lys Ser Lys Lys Tyr Pro
500 505 510
Leu Leu Leu Asp Val Tyr Ala Gly Pro Cys Ser Gln Lys Ala Asp Thr
515 520 525
Val Phe Arg Leu Asn Trp Ala Thr Tyr Leu Ala Ser Thr Glu Asn Ile
530 535 540
Ile Val Ala Ser Phe Asp Gly Arg Gly Ser Gly Tyr Gln Gly Asp Lys
545 550 555 560
Ile Met His Ala Ile Asn Arg Arg Leu Gly Thr Phe Glu Val Glu Asp
565 570 575
Gln Ile Glu Ala Ala Arg Gln Phe Ser Lys Met Gly Phe Val Asp Asn
580 585 590
Lys Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser Tyr Gly Gly Tyr Val Thr Ser
595 600 605
Met Val Leu Gly Ser Gly Ser Gly Val Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val
610 615 620
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625 630 635 640
Tyr Met Gly Leu Pro Thr Pro Glu Asp Asn Leu Asp His Tyr Arg Asn
645 650 655
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660 665 670
Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Gln Ser Ala
675 680 685
Gln Ile Ser Lys Ala Leu Val Asp Val Gly Val Asp Phe Gln Ala Met
690 695 700
Trp Tyr Thr Asp Glu Asp His Gly Ile Ala Ser Ser Thr Ala His Gln
705 710 715 720
His Ile Tyr Thr His Met Ser His Phe Ile Lys Gln Cys Phe Ser Leu
725 730 735
Pro
<210> 33
<211> 848
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多肽
<400> 33
Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala
1 5 10 15
Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe
20 25 30
Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp
35 40 45
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115 120 125
Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu
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210 215 220
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His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile
245 250 255
Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly
260 265 270
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275 280 285
Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala
290 295 300
Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu
305 310 315 320
Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro
325 330 335
Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly
340 345 350
Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp
355 360 365
Phe Leu Thr Ala His Ala Glu Met Gly Ala Ile Gln Tyr Asp Met Ala
370 375 380
Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe
385 390 395 400
His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys
405 410 415
His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met
465 470 475 480
Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe
500 505 510
Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala
515 520 525
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Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala
565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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705 710 715 720
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725 730 735
Pro Pro Val Ser Ser Arg Gly Met Leu Asp Ser Asp Leu His Leu Ser
740 745 750
Ser Lys Ala Gln Val Phe Glu His Pro His Ile Gln Asp Ala Ala Ser
755 760 765
Gln Leu Pro Asp Asp Glu Ser Leu Phe Phe Gly Asp Thr Gly Leu Ser
770 775 780
Lys Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser
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820 825 830
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835 840 845
<210> 34
<211> 978
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多肽
<400> 34
Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala
1 5 10 15
Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe
20 25 30
Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp
35 40 45
Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn
50 55 60
Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu
165 170 175
Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg
180 185 190
Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu
195 200 205
Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu
210 215 220
Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu
225 230 235 240
His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile
245 250 255
Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly
260 265 270
Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys
275 280 285
Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala
290 295 300
Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
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500 505 510
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Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile
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Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala
565 570 575
Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe
580 585 590
Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr
595 600 605
Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu
610 615 620
Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met
625 630 635 640
Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu
645 650 655
Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val
660 665 670
Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro
675 680 685
Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile
690 695 700
Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn
705 710 715 720
Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln
725 730 735
Pro Pro Val Ser Ser Arg Ile Gln Ala Asp Gly Trp Met Cys His Ala
740 745 750
Ser Lys Trp Val Thr Thr Cys Asp Phe Arg Trp Tyr Gly Pro Lys Tyr
755 760 765
Ile Thr His Ser Ile Arg Ser Phe Thr Pro Ser Val Glu Gln Cys Lys
770 775 780
Glu Ser Ile Glu Gln Thr Lys Gln Gly Thr Trp Leu Asn Pro Gly Phe
785 790 795 800
Pro Pro Gln Ser Cys Gly Tyr Ala Thr Val Thr Asp Ala Glu Ala Val
805 810 815
Ile Val Gln Val Thr Pro His His Val Leu Val Asp Glu Tyr Thr Gly
820 825 830
Glu Trp Val Asp Ser Gln Phe Ile Asn Gly Lys Cys Ser Asn Tyr Ile
835 840 845
Cys Pro Thr Val His Asn Ser Thr Thr Trp His Ser Asp Tyr Lys Val
850 855 860
Lys Gly Leu Cys Asp Ser Asn Leu Gly Met Leu Asp Ser Asp Leu His
865 870 875 880
Leu Ser Ser Lys Ala Gln Val Phe Glu His Pro His Ile Gln Asp Ala
885 890 895
Ala Ser Gln Leu Pro Asp Asp Glu Ser Leu Phe Phe Gly Asp Thr Gly
900 905 910
Leu Ser Lys Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp
915 920 925
Lys Ser Ser Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly
930 935 940
Leu Phe Leu Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu Lys
945 950 955 960
His Thr Lys Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu
965 970 975
Gly Lys
<210> 35
<211> 978
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成的
多肽
<400> 35
Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala
1 5 10 15
Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe
20 25 30
Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp
35 40 45
Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn
50 55 60
Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala
65 70 75 80
Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln
85 90 95
Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys
100 105 110
Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser
115 120 125
Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu
130 135 140
Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu
145 150 155 160
Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu
165 170 175
Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg
180 185 190
Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu
195 200 205
Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu
210 215 220
Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu
225 230 235 240
His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile
245 250 255
Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly
260 265 270
Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys
275 280 285
Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala
290 295 300
Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu
305 310 315 320
Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro
325 330 335
Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly
340 345 350
Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp
355 360 365
Phe Leu Thr Ala His Ala Glu Met Gly Ala Ile Gln Tyr Asp Met Ala
370 375 380
Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe
385 390 395 400
His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys
405 410 415
His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn
420 425 430
Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly
435 440 445
Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe
450 455 460
Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met
465 470 475 480
Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe
500 505 510
Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala
515 520 525
Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile
530 535 540
Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu
545 550 555 560
Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala
565 570 575
Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe
580 585 590
Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr
595 600 605
Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu
610 615 620
Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met
625 630 635 640
Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu
645 650 655
Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val
660 665 670
Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro
675 680 685
Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile
690 695 700
Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn
705 710 715 720
Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln
725 730 735
Pro Pro Val Ser Ser Arg Ile Gln Ala Asp Gly Trp Met Cys His Ala
740 745 750
Ser Lys Trp Val Thr Thr Cys Asp Phe Arg Trp Tyr Gly Pro Lys Tyr
755 760 765
Ile Thr His Ser Ile Arg Ser Phe Thr Pro Ser Val Glu Gln Cys Lys
770 775 780
Glu Ser Ile Glu Gln Thr Lys Gln Gly Thr Trp Leu Asn Pro Gly Phe
785 790 795 800
Pro Pro Gln Ser Cys Gly Tyr Ala Thr Val Thr Asp Ala Glu Ala Val
805 810 815
Ile Val Gln Val Thr Pro His His Val Leu Val Asp Glu Tyr Thr Gly
820 825 830
Glu Trp Val Asp Ser Gln Phe Ile Asn Gly Lys Cys Ser Asn Tyr Ile
835 840 845
Cys Pro Thr Val His Asn Ser Thr Thr Trp His Ser Asp Tyr Lys Val
850 855 860
Lys Gly Leu Cys Asp Ser Asn Leu Gly Met Leu Asp Ser Asp Leu His
865 870 875 880
Leu Ser Ser Lys Ala Gln Val Phe Glu His Pro His Ile Gln Asp Ala
885 890 895
Ala Ser Gln Leu Pro Asp Asp Glu Ser Leu Phe Phe Gly Asp Thr Gly
900 905 910
Leu Ser Lys Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp
915 920 925
Lys Ser Ser Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly
930 935 940
Leu Phe Leu Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu Lys
945 950 955 960
His Thr Lys Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu
965 970 975
Gly Lys

Claims (84)

1.一种多价颗粒，其包含融合蛋白，所述融合蛋白包含结合病毒蛋白的哺乳动物多肽和跨膜多肽，其中所述融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约10个拷贝。
2.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述病毒蛋白来自严重急性呼吸综合征冠状病毒1(SARS-CoV-1)、严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)、合胞病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)或其组合。
3.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含对所述病毒蛋白具有结合特异性的受体。
4.如权利要求2所述的多价颗粒，其中所述受体包含病毒进入受体或病毒附着受体。
5.如权利要求2所述的多价颗粒，其中所述受体是病毒进入受体和病毒附着受体。
6.如权利要求2所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含所述受体的细胞外结构域。
7.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含配体或分泌蛋白。
8.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含血管紧张素转换酶2(ACE2)、跨膜丝氨酸蛋白酶2(TRMPSS2)、二肽基肽酶4(DPP4)、分化群4(CD4)、C-C趋化因子受体5型(CCR5)、C-X-C趋化因子受体4型(CXCR4)、分化群209(CD209)或C型凝集素结构域家族4成员M(CLEC4M)。
9.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
10.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
11.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述跨膜多肽将所述融合蛋白锚定到所述多价颗粒的双分子层。
12.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述跨膜多肽包含刺突糖蛋白跨膜区、哺乳动物膜蛋白、包膜蛋白、核衣壳蛋白或细胞跨膜蛋白。
13.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述跨膜多肽包含水疱性口炎病毒G(VSVG)跨膜区、刺突蛋白S1、刺突蛋白S2、辛德毕斯病毒包膜(SINDBIS)蛋白、来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白、麻疹病毒融合(F)蛋白的包膜糖蛋白、RD114、狒狒内源性病毒(BaEV)、糖蛋白(GP41)或糖蛋白120(GP120)。
14.如权利要求12所述的多价颗粒，其中所述VSVG跨膜区包含全长VSVG跨膜区或截短VSVG跨膜区。
15.如权利要求12所述的多价颗粒，其中所述跨膜多肽包含所述VSVG跨膜区和VSVG胞质尾区。
16.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述跨膜多肽包含与SEQID NO:3中所示的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
17.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述跨膜多肽包含与SEQID NO:4中所示的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
18.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约50个拷贝。
19.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约75个拷贝。
20.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约100个拷贝。
21.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约150个拷贝。
22.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约200个拷贝。
23.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含ACE2，并且所述跨膜多肽包含VSVG跨膜区。
24.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含ACE2，并且所述跨膜多肽包含刺突蛋白S2跨膜区。
25.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含ACE2，并且所述跨膜多肽包含包膜病毒的表面糖蛋白跨膜区。
26.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含DPP4，并且所述跨膜多肽包含来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白。
27.如权利要求26所述的多价颗粒，其中所述来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白是所述来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白的变体。
28.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述多价颗粒还包含第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含结合所述病毒蛋白的第二哺乳动物多肽和第二跨膜多肽，其中所述第二融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约10个拷贝。
29.如权利要求28所述的多价颗粒，其中所述第二哺乳动物多肽包含对所述病毒蛋白具有结合特异性的受体。
30.如权利要求29所述的多价颗粒，其中所述受体包含病毒进入受体或病毒附着受体。
31.如权利要求29所述的多价颗粒，其中所述受体是病毒进入受体和病毒附着受体。
32.如权利要求29所述的多价颗粒，其中所述第二哺乳动物多肽包含所述受体的细胞外结构域。
33.如权利要求28所述的多价颗粒，其中所述第二哺乳动物多肽包含配体或分泌蛋白。
34.如权利要求28所述的多价颗粒，其中所述第二哺乳动物多肽包含ACE2、TRMPSS2、DPP4、CD4、CCR5、CXCR4、CD209或CLEC4M。
35.如权利要求28所述的多价颗粒，其中所述第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
36.如权利要求28所述的多价颗粒，其中所述第二哺乳动物多肽包含与根据SEQ IDNO:2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
37.如权利要求28所述的多价颗粒，其中所述第二跨膜多肽包含跨膜锚定蛋白。
38.如权利要求28所述的多价颗粒，其中所述第二跨膜多肽包含刺突糖蛋白跨膜区、哺乳动物膜蛋白、包膜蛋白、核衣壳蛋白或细胞跨膜蛋白。
39.如权利要求28所述的多价颗粒，其中所述第二跨膜多肽包含VSVG跨膜区、刺突蛋白S1跨膜区、刺突蛋白S2跨膜区、辛德毕斯病毒包膜(SINDBIS)蛋白、来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白、麻疹病毒融合(F)蛋白的包膜糖蛋白、RD114、BaEV、GP41或GP120。
40.如权利要求39所述的多价颗粒，其中所述VSVG跨膜区包含全长VSVG跨膜区或截短VSVG跨膜区。
41.如权利要求39所述的多价颗粒，其中所述跨膜多肽包含VSVG跨膜区和VSVG胞质尾区。
42.如权利要求28所述的多价颗粒，其中所述第二跨膜多肽包含与SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
43.如权利要求28所述的多价颗粒，其中所述第二跨膜多肽包含与SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
44.如权利要求28所述的多价颗粒，其中所述第二融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约50个拷贝。
45.如权利要求28所述的多价颗粒，其中所述第二融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约75个拷贝。
46.如权利要求28所述的多价颗粒，其中所述第二融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约100个拷贝。
47.如权利要求28所述的多价颗粒，其中所述第二融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约150个拷贝。
48.如权利要求28所述的多价颗粒，其中所述第二融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达至少约200个拷贝。
49.如权利要求28所述的多价颗粒，其中所述第二哺乳动物多肽包含ACE2，并且所述第二跨膜多肽包含VSVG跨膜区。
50.如权利要求28所述的多价颗粒，其中所述第二哺乳动物多肽包含ACE2，并且所述第二跨膜多肽包含刺突蛋白S2跨膜区。
51.如权利要求28所述的多价颗粒，其中所述第二哺乳动物多肽包含ACE2，并且所述第二跨膜多肽包含包膜病毒的表面糖蛋白。
52.如权利要求28所述的多价颗粒，其中所述第二哺乳动物多肽包含DPP4，并且所述第二跨膜多肽包含来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白。
53.如权利要求52所述的多价颗粒，其中所述来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白是所述来自麻疹病毒的血凝素包膜蛋白的变体。
54.如权利要求28所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含病毒进入受体，并且所述第二哺乳动物多肽包含病毒附着受体。
55.如权利要求28所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含ACE2，所述跨膜多肽包含VSVG跨膜区、刺突蛋白S1跨膜区、刺突蛋白S2跨膜区或包膜病毒的表面糖蛋白，所述第二哺乳动物多肽包含硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，并且所述第二跨膜多肽包含VSVG跨膜区、刺突蛋白S1跨膜区、刺突蛋白S2跨膜区或包膜病毒的表面糖蛋白。
56.如权利要求28所述的多价颗粒，其中所述哺乳动物多肽包含CD4，并且所述第二哺乳动物肽包含CCR5、CXCR4或两者。
57.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述多价颗粒在中和测定中包含小于5皮摩尔(pM)的IC50。
58.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述多价颗粒在中和测定中包含小于2.5皮摩尔(pM)的IC50。
59.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述多价颗粒在中和测定中包含小于1皮摩尔(pM)的IC50。
60.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述多价颗粒不包含病毒遗传物质。
61.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述多价颗粒是合成的。
62.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述多价颗粒是重组的。
63.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述多价颗粒是病毒样颗粒。
64.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述多价颗粒是细胞外囊泡。
65.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述多价颗粒是外泌体。
66.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述多价颗粒是核外粒体。
67.如权利要求1所述的多价颗粒，其中所述融合蛋白还包含寡聚化结构域。
68.如权利要求66所述的多价颗粒，其中所述寡聚化结构域是二聚化结构域。
69.如权利要求68所述的多价颗粒，其中所述二聚化结构域包含亮氨酸拉链二聚化结构域。
70.如权利要求66所述的多价颗粒，其中所述寡聚化结构域是三聚化结构域。
71.如权利要求70所述的多价颗粒，其中所述三聚化结构域包含病毒表面蛋白的融合后寡聚化结构域。
72.如权利要求70所述的多价颗粒，其中所述三聚化结构域包含VSV-G蛋白的D4融合后三聚化结构域。
73.如权利要求70所述的多价颗粒，其中所述三聚化结构域包含登革E蛋白融合后三聚化结构域。
74.如权利要求70所述的多价颗粒，其中所述三聚化结构域包含foldon三聚化结构域。
75.如权利要求69所述的多价颗粒，其中所述三聚化结构域包含人α1(I)胶原的C-前导肽。
76.如权利要求66所述的多价颗粒，其中所述寡聚化结构域是四聚化结构域。
77.如权利要求75所述的多价颗粒，其中所述四聚化结构域包含流感神经氨酸酶干结构域。
78.如权利要求66所述的多价颗粒，其中所述寡聚化结构域包含与根据SEQ ID NO:5-18或28的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
79.如权利要求66所述的多价颗粒，其中当所述融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达时，所述寡聚化结构域在所述多价颗粒的外部。
80.如权利要求66所述的多价颗粒，其中当所述融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达时，所述寡聚化结构域在所述多价颗粒的外部并且与信号肽相邻。
81.如权利要求66所述的多价颗粒，其中当所述融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达时，所述寡聚化结构域在所述多价颗粒的内部。
82.如权利要求66所述的多价颗粒，其中当所述融合蛋白在所述多价颗粒的表面上表达时，所述寡聚化结构域在所述多价颗粒的内部并且与所述跨膜多肽相邻。
83.如权利要求66所述的多价颗粒，其中所述融合蛋白包含信号肽。
84.如权利要求66所述的多价颗粒，其中所述融合蛋白的结构域从N-末端到C-末端按以下顺序排列：
(a)信号肽、结合病毒表面蛋白的病毒进入受体的细胞外结构域、寡聚化结构域、跨膜多肽和细胞溶质结构域；
(b)信号肽、结合病毒表面蛋白的病毒进入受体的细胞外结构域、跨膜多肽、寡聚化结构域和细胞溶质结构域；或
(c)信号肽、寡聚化结构域、病毒进入受体的细胞外结构域、跨膜多肽和细胞溶质结构域。
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