CN116848146A - 可溶性碱性磷酸酶构建体和包含编码可溶性碱性磷酸酶构建体的多核苷酸的表达载体 - Google Patents
可溶性碱性磷酸酶构建体和包含编码可溶性碱性磷酸酶构建体的多核苷酸的表达载体 Download PDFInfo
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Abstract
本公开涉及多肽，如包括碱性磷酸酶和骨靶向部分的多肽。还公开了表达载体，如慢病毒表达载体，所述表达载体包含编码多肽的核苷酸序列。还公开了通过以下治疗低磷酸酯酶症或治疗、减轻或预防低磷酸酯酶症的一种或多种症状的方法：向需要治疗的受试者施用所公开的多肽或转导以表达所述所公开的多肽中的任何多肽的宿主细胞。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年9月3日提交的美国临时专利申请第63/074,418号的提交日的权益，所述美国临时专利申请的公开内容特此通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开涉及多肽，并且具体地涉及靶向骨组织的多肽。还公开了表达载体，如慢病毒表达载体，包含一个或多个编码多肽的核苷酸序列。在一些实施例中，多肽可用于治疗低磷酸酯酶症或用于治疗、减轻或预防需要治疗的受试者的低磷酸酯酶症的一种或多种症状。
背景技术
钙化和骨化水平的异常导致一系列疾病，如婴儿广泛性动脉钙化(GACI)、特发性婴儿动脉钙化(IIAC)、弹性纤维假黄瘤(PXE)、后纵韧带骨化(OPLL)、内侧壁血管钙化(MWVC)、常染色体隐性低磷佝偻病2型(ARHR2)、终末期肾病(ESRD)、慢性肾病-骨/矿物质紊乱(CKD-MBD)、X连锁低磷血症(XLH)、年龄相关骨量减少、钙性尿毒症性小动脉病(CUA)和低磷性佝偻病。
低磷酸酯酶症(HPP)是一种罕见的遗传性骨骼疾病，最严重的疾病形式的发病率为每100,000名新生儿中就有1人。所述病症是由编码组织非特异性碱性磷酸酶(TNSALP)的基因发生功能丧失突变引起的。HPP患者表现出一系列显著的症状，从牙齿脱落或软骨病(佝偻病)到子宫内几乎完全没有骨矿化。许多患有HPP的患者表现出骨骼畸形、身材矮小、肌肉和骨骼疼痛、行动不便和牙齿过早脱落的特性。围产期发病或婴儿期发病的HPP的特征还可以在于存在佝偻病性胸部畸形、维生素B6依赖性癫痫发作和发育停滞。特别是，在小于六个月大时出现的HPP由于呼吸功能不全通常是致命的，其中一岁时的存活率低。
发明内容
本公开的第一方面是一种多肽，其包括式(I)：
[A]v-[B]-[C]w-[R]q-([D]x-[E]y)z， (I)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括编码碱性磷酸酶的氨基酸；
C包括编码GPI锚的氨基酸序列；
R是-(Mo(Fc)Np)-，其中M和N各自独立地包含1至6个氨基酸，其中Fc是Fc结构域，并且o和p各自独立地是0、1或2；
D包括具有4至6个氨基酸的氨基酸序列，或者是F(G)tF，其中每个F是相同的氨基酸，G是具有3、4或5个氨基酸的氨基酸序列，并且t是范围为2至5的整数；
E包括具有1至8个氨基酸的氨基酸序列；
q是0或1；
v是0或1；
w是0或1；
x是0或范围为1至6的整数；
y是0或范围为1至16的整数；并且
z是0或范围为1至6的整数。
在一些实施例中，多肽有在如骨中形成羟基磷灰石晶体的催化能力。在一些实施例中，多肽能够催化无机焦磷酸盐的裂解。
在一些实施例中，q是零。在一些实施例中，q是零并且x是一或更多。
在一些实施例中，B包括与SEQ ID NO：11具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，B包括与SEQ ID NO：11具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，B包括SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
在一些实施例中，组[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，组[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，组[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少96％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，组[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，组[A]v-[B]-[C]w包括与SEQID NO：10具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，组[A]v-[B]-[C]w包括具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
在一些实施例中，A包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，A包括具有SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个的氨基酸序列。在一些实施例中，v是1并且w是0。在一些实施例中，z是0。在一些实施例中，x是0。在一些实施例中，多肽与SEQ ID NO：2中的任何一个具有至少95％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包括SEQ ID NO：2。
在一些实施例中，E包括至多两个氨基酸。在一些实施例中，E包括1个氨基酸。在一些实施例中，E包括天冬氨酸。在一些实施例中，E包括天冬氨酸，并且y的范围介于8与12之间。在一些实施例中，E包括天冬氨酸，y的范围介于8与12之间，并且v是1并且w是0。在一些实施例中，E包括天冬氨酸，y的范围介于8与12之间，并且v是0。在一些实施例中，E包括天冬氨酸，y的范围介于8与12之间，并且y是10。在一些实施例中，多肽与SEQ ID NO：3具有至少95％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包括SEQ ID NO：3。
在一些实施例中，D包括至多5个氨基酸(例如，D可以是-G-G-G-G-S-，如本文所描述的)。在一些实施例中，所述至多5个氨基酸中的至少三个连续的氨基酸相同。在一些实施例中，所述至少三个连续的氨基酸各自是甘氨酸。在一些实施例中，所述至少三个连续的氨基酸各自是甘氨酸，并且x是范围为1至3的整数。在一些实施例中，所述至少三个连续的氨基酸各自是甘氨酸，并且x是2。在一些实施例中，所述至少三个连续的氨基酸各自是甘氨酸，并且y是范围介于4与8之间的整数。在一些实施例中，所述至少三个连续的氨基酸各自是甘氨酸，并且y介于5与7之间。在一些实施例中，y是6。
在一些实施例中，E包括3个氨基酸。在一些实施例中，所述三个氨基酸中的至少2个连续的氨基酸相同。在一些实施例中，所述3个氨基酸中的两个连续的氨基酸各自是丝氨酸。在一些实施例中，E包括-asp-ser-ser-。在一些实施例中，式(I)的多肽与SEQ ID NO：6具有至少95％的序列同一性。在一些实施例中，式(I)的多肽包括SEQ ID NO：6。
在一些实施例中，E包括1个或2个氨基酸。在一些实施例中，E包括1个氨基酸。在一些实施例中，E包括单个天冬氨酸。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y介于8与12之间。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y是10。在一些实施例中，式(I)的多肽与SEQ ID NO：4具有至少95％的序列同一性。在一些实施例中，式(I)的多肽与SEQ ID NO：4具有至少97％的序列同一性。在一些实施例中，式(I)的多肽与SEQ ID NO：4具有至少99％的序列同一性。在一些实施例中，式(I)的多肽包括SEQ ID NO：4。
在一些实施例中，E包括2至8个氨基酸。在一些实施例中，E包括2至6个氨基酸。在一些实施例中，E包括2至4个氨基酸。在一些实施例中，E包括3个氨基酸。在一些实施例中，E组中的所述3个氨基酸中的至少2个连续的氨基酸相同。在一些实施例中，y的范围为4至8。在一些实施例中，y的范围为5至7。在一些实施例中，y是6。在一些实施例中，E包括-asp-ser-ser-。在一些实施例中，v是1并且w是0。
在一些实施例中，式(I)的多肽与SEQ ID NO：5具有至少80％的序列同一性。在一些实施例中，式(I)的多肽与SEQ ID NO：5具有至少85％的序列同一性。在一些实施例中，式(I)的多肽与SEQ ID NO：5具有至少90％的序列同一性。在一些实施例中，式(I)的多肽与SEQ ID NO：5具有至少95％的序列同一性。在一些实施例中，式(I)的多肽与SEQ ID NO：5具有至少96％的序列同一性。在一些实施例中，式(I)的多肽与SEQ ID NO：5具有至少97％的序列同一性。在一些实施例中，式(I)的多肽与SEQ ID NO：5具有至少98％的序列同一性。在一些实施例中，式(I)的多肽与SEQ ID NO：5具有至少99％的序列同一性。在一些实施例中，式(I)的多肽包括SEQ ID NO：5。
在一些实施例中，式(I)的多肽与SEQ ID NO：44-54、68、105和116-125中的任何一个具有至少80％的序列同一性。在一些实施例中，式(I)的多肽与SEQ ID NO：44-54、105和116-125中的任何一个具有至少85％的序列同一性。在一些实施例中，式(I)的多肽与SEQID NO：44-54、68、105和116-125中的任何一个具有至少90％的序列同一性。在一些实施例中，式(I)的多肽与SEQ ID NO：44-54、68、105和116-125中的任何一个具有至少95％的序列同一性。在一些实施例中，式(I)的多肽与SEQ ID NO：44-54、68、105和116-125中的任何一个具有至少96％的序列同一性。在一些实施例中，式(I)的多肽与SEQ ID NO：SEQ ID NO：44-54、68、105和116-125中的任何一个具有至少97％的序列同一性。在一些实施例中，式(I)的多肽与SEQ ID NO：44-54、105和116-125中的任何一个具有至少98％的序列同一性。在一些实施例中，式(I)的多肽与SEQ ID NO：SEQ ID NO：44-54、68、105和116-125中的任何一个具有至少99％的序列同一性。在一些实施例中，式(I)的多肽包括SEQ ID SEQ ID NO：44-54、68、105和116-125中的任何一个。
在一些实施例中，编码GPI锚的氨基酸序列与SEQ ID NO：13具有至少95％的序列同一性。在一些实施例中，编码GPI锚的氨基酸序列具有SEQ ID NO：14。在一些实施例中，式(I)的多肽与SEQ ID NO：8具有至少95％的序列同一性。在一些实施例中，式(I)的多肽与SEQ ID NO：8具有至少97％的序列同一性。在一些实施例中，式(I)的多肽与SEQ ID NO：8具有至少99％的序列同一性。在一些实施例中，多肽包括SEQ ID NO：8。
在一些实施例中，v是1，w是1，并且编码GPI锚的氨基酸序列与SEQ ID NO：13具有至少95％的序列同一性。在一些实施例中，v是1，w是1，并且编码GPI锚的氨基酸序列与SEQID NO：13具有至少97％的序列同一性。在一些实施例中，v是1，w是1，并且编码GPI锚的氨基酸序列与SEQ ID NO：13具有至少99％的序列同一性。在一些实施例中，v是1，w是1，并且编码GPI锚的氨基酸序列具有SEQ ID NO：14。在一些实施例中，v是1，w是1，并且式(I)的多肽与SEQ ID NO：7具有至少95％的序列同一性。在一些实施例中，v是1，w是1，并且式(I)的多肽包括SEQ ID NO：7。
本公开的第二方面是慢病毒载体，其包含编码具有式(I)的多肽的核酸序列：
[A]v-[B]-[C]w-[R]q-([D]x-[E]y)z， (I)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括编码碱性磷酸酶的氨基酸；
C包括编码GPI锚的氨基酸序列；
R是-(Mo(Fc)Np)-，其中M和N各自独立地包含1至6个氨基酸，其中Fc是Fc结构域，并且o和p各自独立地是0、1或2；
D包括具有4至6个氨基酸的氨基酸序列，或者是F(G)tF，其中每个F是相同的氨基酸，G是具有3、4或5个氨基酸的氨基酸序列，并且t是范围为2至5的整数；
E包括具有1至8个氨基酸的氨基酸序列；
q是0或1；
v是0或1；
w是0或1；
x是0或范围为1至6的整数；
y是0或范围为1至16的整数；并且
z是0或范围为1至6的整数。
具有式(I)的多肽的具体实例在本文中被引用并且在上文关于本公开的第一方面进行了描述。在一些实施例中，多肽不包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列或不包括由SEQ IDNO：107的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
在一些实施例中，编码多肽的核酸序列与启动子可操作地连接。在一些实施例中，所述启动子选自由以下组成的组：EF1A、MND、CD11b、CD68LPP、EF1a1、EFS和UbC。在一些实施例中，慢病毒载体进一步包括UCOE启动子元件。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少95％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少96％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少97％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少95％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少98％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ IDNO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少99％同一性。在一些实施例中，所述启动子包括SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个。在一些实施例中，慢病毒载体进一步包括绝缘子。在一些实施例中，慢病毒载体进一步包括一个或多个基质附着区。在一些实施例中，慢病毒载体进一步包括WPRE元件。在一些实施例中，慢病毒载体不包含WPRE元件。
在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少96％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少97％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少98％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒病毒载体包括具有SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个的核苷酸序列。
本公开的第三方面是一种宿主细胞群体，其用表达载体转导，其中所述表达载体包含编码多肽的核酸序列，所述多肽具有式(I)：
[A]v-[B]-[C]w-[R]q-([D]x-[E]y)z， (I)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括编码碱性磷酸酶的氨基酸；
C包括编码GPI锚的氨基酸序列；
R是-(Mo(Fc)Np)-，其中M和N各自独立地包含1至6个氨基酸，其中Fc是Fc结构域，并且o和p各自独立地是0、1或2；
D包括具有4至6个氨基酸的氨基酸序列，或者是F(G)tF，其中每个F是相同的氨基酸，G是具有3、4或5个氨基酸的氨基酸序列，并且t是范围为2至5的整数；
E包括具有1至8个氨基酸的氨基酸序列；
q是0或1；
v是0或1；
w是0或1；
x是0或范围为1至6的整数；
y是0或范围为1至16的整数；并且
z是0或范围为1至6的整数。
具有式(I)的多肽的具体实例在本文中被引用并且在上文关于本公开的第一方面进行了描述。在一些实施例中，多肽不包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列或不包括由SEQ IDNO：107的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述表达载体是逆转录病毒载体。在一些实施例中，所述表达载体是慢病毒载体。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少96％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少97％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少98％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒病毒载体包括具有SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个的核苷酸序列。
在一些实施例中，宿主细胞是造血干细胞。在一些实施例中，宿主细胞是间充质细胞。在一些实施例中，宿主细胞是骨髓细胞。在一些实施例中，宿主细胞是肝细胞。在一些实施例中，宿主细胞是内皮细胞。在一些实施例中，宿主细胞被离体转导。在一些实施例中，宿主细胞在体内被转导。
在一些实施例中，经转导的宿主细胞表达具有式(I)的多肽。在一些实施例中，可以向需要治疗的哺乳动物受试者施用经转导的宿主细胞。
本公开的第四方面是一种转导宿主细胞群体的方法，所述方法包括：获得宿主细胞群体；以及使所获得的宿主细胞群体与表达载体接触，所述表达载体包含编码多肽的核酸序列，所述多肽具有式(I)：
[A]v-[B]-[C]w-[R]q-([D]x-[E]y)z， (I)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括编码碱性磷酸酶的氨基酸；
C包括编码GPI锚的氨基酸序列；
R是-(Mo(Fc)Np)-，其中M和N各自独立地包含1至6个氨基酸，其中Fc是Fc结构域，并且o和p各自独立地是0、1或2；
D包括具有4至6个氨基酸的氨基酸序列，或者是F(G)tF，其中每个F是相同的氨基酸，G是具有3、4或5个氨基酸的氨基酸序列，并且t是范围为2至5的整数；
E包括具有1至8个氨基酸的氨基酸序列；
q是0或1；
v是0或1；
w是0或1；
x是0或范围为1至6的整数；
y是0或范围为1至16的整数；并且
z是0或范围为1至6的整数。
在一些实施例中，转导离体发生。
在一些实施例中，转导发生在体内。
具有式(I)的多肽的具体实例在本文中被引用并且在上文关于本公开的第一方面进行了描述。在一些实施例中，多肽不包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列或不包括由SEQ IDNO：107的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述表达载体是逆转录病毒载体。在一些实施例中，所述表达载体是慢病毒载体。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少96％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少97％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少98％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒病毒载体包括具有SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个的核苷酸序列。
本公开的第五方面是一种药物组合物，其包括经修饰的宿主细胞群体，其中所述经修饰的宿主细胞群体表达多肽，所述多肽具有式(I)：
[A]v-[B]-[C]w-[R]q-([D]x-[E]y)z， (I)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括编码碱性磷酸酶的氨基酸；
C包括编码GPI锚的氨基酸序列；
R是-(Mo(Fc)Np)-，其中M和N各自独立地包含1至6个氨基酸，其中Fc是Fc结构域，并且o和p各自独立地是0、1或2；
D包括具有4至6个氨基酸的氨基酸序列，或者是F(G)tF，其中每个F是相同的氨基酸，G是具有3、4或5个氨基酸的氨基酸序列，并且t是范围为2至5的整数；
E包括具有1至8个氨基酸的氨基酸序列；
q是0或1；
v是0或1；
w是0或1；
x是0或范围为1至6的整数；
y是0或范围为1至16的整数；并且
z是0或范围为1至6的整数。
具有式(I)的多肽的具体实例在本文中被引用并且在上文关于本公开的第一方面进行了描述。在一些实施例中，多肽不包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列或不包括由SEQ IDNO：107的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施例中，宿主细胞被离体转导。在一些实施例中，宿主细胞在体内被转导。
本公开的第六方面是一种治疗哺乳动物受试者的方法，所述方法包括向所述哺乳动物受试者施用药学上有效量的经修饰的宿主细胞群体，其中所述经修饰的宿主细胞群体表达多肽，所述多肽具有式(I)：
[A]v-[B]-[C]w-[R]q-([D]x-[E]y)z， (I)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括编码碱性磷酸酶的氨基酸；
C包括编码GPI锚的氨基酸序列；
R是-(Mo(Fc)Np)-，其中M和N各自独立地包含1至6个氨基酸，其中Fc是Fc结构域，并且o和p各自独立地是0、1或2；
D包括具有4至6个氨基酸的氨基酸序列，或者是F(G)tF，其中每个F是相同的氨基酸，G是具有3、4或5个氨基酸的氨基酸序列，并且t是范围为2至5的整数；
E包括具有1至8个氨基酸的氨基酸序列；
q是0或1；
v是0或1；
w是0或1；
x是0或范围为1至6的整数；
y是0或范围为1至16的整数；并且
z是0或范围为1至6的整数。
具有式(I)的多肽的具体实例在本文中被引用并且在上文关于本公开的第一方面进行了描述。在一些实施例中，多肽不包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列或不包括由SEQ IDNO：107的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
在一些实施例中，哺乳动物受试者先前用、将用或同时用具有氨基酸序列的多肽治疗，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：1。
在一些实施例中，q是0。在一些实施例中，q是0并且其中E包括2至4个氨基酸。在一些实施例中，q是0并且其中E包括三个氨基酸。在一些实施例中，q是0并且其中E包括-D-S-S-。在一些实施例中，q是0，E包括-D-S-S-，并且x是0。
在一些实施例中，q是1。在一些实施例中，q是1并且其中E包括2至4个氨基酸。在一些实施例中，q是1并且其中E包括三个氨基酸。在一些实施例中，q是1并且其中E包括-D-S-S-。在一些实施例中，q是1，E包括-D-S-S-，并且x是0。
在一些实施例中，q是0。在一些实施例中，q是0，并且[D]x是[-G-G-G-G-S-]2。在一些实施例中，q是0，并且[D]x是[-G-G-G-G-S-]2，并且[E]y是[D]10。在一些实施例中，q是0，[D]x是[-G-G-G-G-S-]2，并且[E]y是[D]6。
在一些实施例中，q是1。在一些实施例中，q是1，并且[D]x是[-G-G-G-G-S-]2。在一些实施例中，q是1，并且[D]x是[-G-G-G-G-S-]2，并且[E]y是[D]10。在一些实施例中，q是1，[D]x是[-G-G-G-G-S-]2，并且[E]y是[D]6。
本公开的第七方面是一种多肽，其包括式(IA)：
[A]v-[B]-[C]w-[R]q-([D]x-[E]y)z， (1A)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括编码碱性磷酸酶的氨基酸；
C包括编码GPI锚的氨基酸序列；
R是-(Mo(Fc)Np)-，其中M和N各自独立地包含1至6个氨基酸，其中Fc是Fc结构域，并且o和p各自独立地是0、1或2；
D包括具有4至6个氨基酸的氨基酸序列，或者是F(G)tF，其中每个F是相同的氨基酸，G是具有3、4或5个氨基酸的氨基酸序列，并且t是范围为2至5的整数；
E包括具有1至8个氨基酸的氨基酸序列；
q是0或1；
v是0或1；
w是0或1；
x是0或范围为1至6的整数；
y是0或范围为1至16的整数；并且
z是0或范围为1至6的整数；
条件是所述式(1A)的多肽不具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或不包括由SEQ IDNO：107的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
在一些实施例中，多肽有在如骨中形成羟基磷灰石晶体的催化能力。在一些实施例中，多肽能够催化无机焦磷酸盐的裂解。
在一些实施例中，B包括与SEQ ID NO：11至少99％的序列同一性。在一些实施例中，B包括SEQ ID NO：11。
在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括SEQ ID NO：10。
在一些实施例中，A包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，A包括具有SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个的氨基酸序列。
在一些实施例中，R包括与SEQ ID NO：9至少99％的同一性。在一些实施例中，R包括SEQ ID NO：9。
在一些实施例中，o、p和q各自是1。在一些实施例中，M包括2个氨基酸；并且N包括两个氨基酸；并且M和N不同。在一些实施例中，M是-L-K-。在一些实施例中，N是-D-I-。在一些实施例中，E包括2至4个氨基酸。在一些实施例中，E包括3个氨基酸。在一些实施例中，所述3个氨基酸中的至少2个连续的氨基酸相同。在一些实施例中，E包括-D-S-S-。
在一些实施例中，q是0。
在一些实施例中，q是1。在一些实施例中，x是0。在一些实施例中，z是1。在一些实施例中，y的范围为4至8。在一些实施例中，y是6。
在一些实施例中，[E]y是[-D-S-S-]6。
在一些实施例中，[E]y是[-D-S-S-]6并且q是0。在一些实施例中，[E]y是[-D-S-S-]6，q是0并且x是0。
在一些实施例中，[E]y是[-D-S-S-]6并且q是1。在一些实施例中，[E]y是[-D-S-S-]6，q是1，并且x是0。在一些实施例中，[E]y是[-D-S-S-]6，q是1，并且Fc包括与SEQ ID NO：130至少97％的同一性。在一些实施例中，[E]y是[-D-S-S-]6，q是1，并且Fc包括与SEQ IDNO：130至少99％的同一性。在一些实施例中，[E]y是[-D-S-S-]6，q是1，并且Fc包括SEQ IDNO：130。
在一些实施例中，q是1，并且R包括与SEQ ID NO：9至少97％的同一性。在一些实施例中，q是1，并且R包括与SEQ ID NO：9至少99％的同一性。在一些实施例中，q是1，并且R包括SEQ ID NO：9。
在一些实施例中，[D]x是[-G-G-G-G-S-]2。在一些实施例中，[E]y是[D]10。在一些实施例中，[E]y是[D]6。在一些实施例中，[R]是-[L-K]-Fc-[D-I]-，并且Fc包括与SEQ ID NO：130至少97％的同一性。在一些实施例中，[R]是-[L-K]-Fc-[D-I]-，并且Fc包括与SEQ IDNO：130至少98％的同一性。在一些实施例中，[R]是-[L-K]-Fc-[D-I]-，并且Fc包括与SEQID NO：130至少99％的同一性。在一些实施例中，R包括SEQ ID NO：9。
在一些实施例中，所述多肽的氨基酸序列与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少90％的同一性。在一些实施例中，所述多肽的氨基酸序列与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少95％的同一性。在一些实施例中，所述多肽的氨基酸序列与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少96％的同一性。在一些实施例中，所述多肽的氨基酸序列与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少97％的同一性。在一些实施例中，所述多肽的氨基酸序列与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少98％的同一性。在一些实施例中，所述多肽的氨基酸序列与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少99％的同一性。在一些实施例中，所述多肽包括具有2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少90％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少95％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少96％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少97％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少98％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少99％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述多肽由具有SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个的核苷酸序列编码。
本公开的第八方面是一种慢病毒载体，其包含编码具有式(IA)的多肽(如本文所描述的具有式(IA)的多肽中的任何多肽)的核苷酸序列。在一些实施例中，编码具有式(IA)的多肽的核苷酸序列与启动子可操作地连接。在一些实施例中，所述启动子选自EF1A、MND、CD11b、CD68LP、EF1a1、EFS和UbC。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少95％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ IDNO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少96％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少97％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少95％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少98％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少99％同一性。在一些实施例中，所述启动子包括SEQID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个。
在一些实施例中，慢病毒载体进一步包括UCOE启动子元件。在一些实施例中，慢病毒载体进一步包括绝缘子。在一些实施例中，慢病毒载体进一步包括一个或多个支架/基质附着区。在一些实施例中，慢病毒载体进一步包括WPRE元件。在一些实施例中，慢病毒载体不包含编码WPRE元件的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少96％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少97％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少98％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒载体包括具有SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个的核苷酸序列。
本公开的第九方面是一种宿主细胞群体，其用编码具有式(IA)的多肽的表达载体转导，例如逆转录病毒载体、慢病毒载体等。在一些实施例中，编码具有式(IA)的多肽的核苷酸序列与启动子可操作地连接。在一些实施例中，经转导的宿主细胞群体表达具有式(IA)的多肽。在一些实施例中，所述启动子选自EF1A、MND、CD11b、CD68Lp、EF1a1、EFS和UbC。在一些实施例中，慢病毒载体进一步包括UCOE启动子元件。在一些实施例中，慢病毒载体进一步包括绝缘子。在一些实施例中，慢病毒载体进一步包括一个或多个支架/基质附着区。在一些实施例中，慢病毒载体进一步包括WPRE元件。在一些实施例中，慢病毒载体不包含编码WPRE元件的核苷酸序列。在一些实施例中，宿主细胞是自体的。在一些实施例中，宿主细胞是同种异体的。在一些实施例中，宿主细胞被离体转导。在一些实施例中，宿主细胞在体内被转导。
本公开的第十方面是一种治疗哺乳动物受试者例如人类受试者的方法，所述方法包括向所述哺乳动物受试者施用经转导的宿主细胞群体，经转导的宿主细胞群体表达具有式(IA)的多肽。本文描述了具有式(IA)的多肽的实例。在一些实施例中，所述式(IA)的多肽的氨基酸序列与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少97％的同一性。在一些实施例中，所述式(1A)的多肽的氨基酸序列与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少99％的同一性。在一些实施例中，所述式(IA)的多肽包括具有2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述式(IA)的多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少95％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述式(IA)的多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少97％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述式(IA)的多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少99％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述式(IA)的多肽由具有SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个的核苷酸序列编码。
在一些实施例中，宿主细胞是自体的。在一些实施例中，宿主细胞是同种异体的。在一些实施例中，哺乳动物受试者先前用、将用或同时用具有氨基酸序列的多肽治疗，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：1。
本公开的第十一方面是一种治疗哺乳动物受试者的低磷酸酯酶症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物受试者施用治疗有效量的经转导的宿主细胞群体，经转导的宿主细胞群体向哺乳动物受试者表达具有式(IA)的多肽。本文描述了具有式(IA)的多肽的实例。在一些实施例中，所述式(IA)的多肽的氨基酸序列与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少97％的同一性。在一些实施例中，所述式(IA)的多肽的氨基酸序列与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少99％的同一性。在一些实施例中，所述式(IA)的多肽包括具有2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述式(1A)的多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少95％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述式(IA)的多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少97％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述式(IA)的多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少99％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述式(IA)的多肽由具有SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个的核苷酸序列编码。
在一些实施例中，宿主细胞是自体的。在一些实施例中，宿主细胞是同种异体的。在一些实施例中，哺乳动物受试者先前用、将用或同时用具有氨基酸序列的多肽治疗，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：1。
本公开的第十二方面是一种治疗、减轻或预防哺乳动物受试者的低磷酸酯酶症的症状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物受试者施用治疗有效量的经转导的宿主细胞群体，经转导的宿主细胞群体向哺乳动物受试者表达具有式(IA)的多肽。本文描述了具有式(IA)的多肽的实例。在一些实施例中，所述式(IA)的多肽的氨基酸序列与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少97％的同一性。在一些实施例中，所述式(IA)的多肽的氨基酸序列与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少99％的同一性。在一些实施例中，所述式(1A)的多肽包括具有2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述式(1A)的多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少95％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述式(IA)的多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少97％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述式(IA)的多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少99％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述式(IA)的多肽由具有SEQID NO：106、108-115和131中的任何一个的核苷酸序列编码。
在一些实施例中，宿主细胞是自体的。在一些实施例中，宿主细胞是同种异体的。在一些实施例中，哺乳动物受试者先前用、将用或同时用具有氨基酸序列的多肽治疗，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：1。
本公开的第十三方面是一种多肽，其包括式(VB)：
([A]-[B])-[R]q-([E]y) (VB)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括编码碱性磷酸酶的氨基酸；
R是-(Mo(Fc)Np)-，其中M和N各自独立地包含1至6个氨基酸，其中Fc是Fc结构域，并且o和p各自独立地是0、1或2；
q是0或1；
E包括具有2至4个氨基酸的氨基酸序列；并且
y是范围为1至16的整数，
条件是当q是1并且当[E]仅包括天冬氨酸时，那么所述式(VB)的多肽不终止于具有十至十六个连续天冬氨酸残基的氨基酸序列。
在一些实施例中，多肽有在如骨中形成羟基磷灰石晶体的催化能力。在一些实施例中，多肽能够催化无机焦磷酸盐的裂解。
在一些实施例中，y是范围为4至8的整数。在一些实施例中，y是6。
在一些实施例中，q是0。
在一些实施例中，q是1。在一些实施例中，M包括2个氨基酸；并且其中N包括两个氨基酸；并且其中M和N不同。在一些实施例中，M是-L-K-。在一些实施例中，N是-D-I-。
在一些实施例中，E包括2至4个氨基酸。在一些实施例中，E包括3个氨基酸。在一些实施例中，所述3个氨基酸中的至少2个连续的氨基酸相同。在一些实施例中，E包括-D-S-S-。
在一些实施例中，B包括与SEQ ID NO：11至少99％的序列同一性。在一些实施例中，B包括SEQ ID NO：11。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括SEQ ID NO：10。
在一些实施例中，A包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，A包括具有SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个的氨基酸序列。
在一些实施例中，Fc包括与SEQ ID NO：130至少97％的同一性。在一些实施例中，Fc包括与SEQ ID NO：130至少98％的同一性。在一些实施例中，Fc包括与SEQ ID NO：130至少99％的同一性。在一些实施例中，Fc包括SEQ ID NO：130。在一些实施例中，R包括与SEQID NO：9至少97％的同一性。在一些实施例中，R包括与SEQ ID NO：9至少98％的同一性。在一些实施例中，R包括与SEQ ID NO：9至少99％的同一性。在一些实施例中，R包括SEQ IDNO：9。
本公开的第十四方面是一种慢病毒载体，其包含编码具有式(VB)的多肽的核苷酸序列。本文描述了具有式(VB)的多肽的实例。在一些实施例中，所述式(VB)的多肽的氨基酸序列与5、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少90％的同一性。在一些实施例中，所述式(VB)的多肽的氨基酸序列与5、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少95％的同一性。在一些实施例中，所述式(VB)的多肽的氨基酸序列与5、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少96％的同一性。在一些实施例中，所述式(VB)的多肽的氨基酸序列与5、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少97％的同一性。在一些实施例中，所述式(VB)的多肽的氨基酸序列与5、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少98％的同一性。在一些实施例中，所述式(VB)的多肽的氨基酸序列与5、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少99％的同一性。在一些实施例中，所述式(VB)的多肽包括具有5、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个的氨基酸序列。
在一些实施例中，具有式(VB)的多肽由与SEQ ID NO：111、115和131中的任何一个具有至少90％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，具有式(VB)的多肽由与SEQ IDNO：111、115和131中的任何一个具有至少95％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，具有式(VB)的多肽由与SEQ ID NO：111、115和131中的任何一个具有至少96％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，具有式(VB)的多肽由与SEQ ID NO：111、115和131中的任何一个具有至少97％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，具有式(VB)的多肽由与SEQ ID NO：111、115和131中的任何一个具有至少98％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，具有式(VB)的多肽由与SEQ ID NO：111、115和131中的任何一个具有至少99％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，具有式(VB)的多肽由具有SEQ ID NO：111、115和131中的任何一个的核苷酸序列编码。
在一些实施例中，编码具有式(VB)的多肽的核苷酸序列与启动子可操作地连接。在一些实施例中，所述启动子选自EF1A、MND、CD11b、CD68Lp、EF1a1、EFS和UbC。在一些实施例中，慢病毒载体进一步包括UCOE启动子元件。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少95％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少96％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少97％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少95％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少98％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ IDNO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少99％同一性。在一些实施例中，所述启动子包括SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个。
在一些实施例中，慢病毒载体进一步包括绝缘子。在一些实施例中，慢病毒载体进一步包括一个或多个支架/基质附着区。在一些实施例中，慢病毒载体进一步包括WPRE元件。在一些实施例中，慢病毒载体进一步包括WPRE元件。
本公开的第十五方面是一种治疗哺乳动物受试者例如人类受试者的方法，所述方法包括向所述哺乳动物受试者施用经转导的宿主细胞群体，经转导的宿主细胞群体表达具有式(VB)的多肽。本文描述了具有式(VB)的多肽的实例。在一些实施例中，所述式(VB)的多肽的氨基酸序列与5、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少97％的同一性。在一些实施例中，所述式(VB)的多肽的氨基酸序列与5、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少99％的同一性。在一些实施例中，所述式(VB)的多肽包括具有5、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个的氨基酸序列。在一些实施例中，宿主细胞是自体的。在一些实施例中，宿主细胞是同种异体的。在一些实施例中，哺乳动物受试者先前用、将用或同时用具有氨基酸序列的多肽治疗，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：1。
本公开的第十六方面是一种治疗哺乳动物受试者的低磷酸酯酶症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物受试者施用治疗有效量的经转导的宿主细胞群体，经转导的宿主细胞群体向哺乳动物受试者表达具有式(VB)的多肽。本文描述了具有式(VB)的多肽的实例。在一些实施例中，所述式(VB)的多肽的氨基酸序列与5、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少97％的同一性。在一些实施例中，所述式(VB)的多肽的氨基酸序列与5、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少99％的同一性。在一些实施例中，所述式(VB)的多肽包括具有5、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个的氨基酸序列。在一些实施例中，宿主细胞是自体的。在一些实施例中，宿主细胞是同种异体的。在一些实施例中，哺乳动物受试者先前用、将用或同时用具有氨基酸序列的多肽治疗，所述氨基酸序列具有SEQID NO：1。
本公开的第十七方面是一种治疗、减轻或预防哺乳动物受试者的低磷酸酯酶症的症状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物受试者施用治疗有效量的经转导的宿主细胞群体，经转导的宿主细胞群体向哺乳动物受试者表达具有式(VB)的多肽。本文描述了具有式(VB)的多肽的实例。在一些实施例中，所述式(VB)的多肽的氨基酸序列与5、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少97％的同一性。在一些实施例中，所述式(VB)的多肽的氨基酸序列与5、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少99％的同一性。在一些实施例中，所述式(VB)的多肽包括具有5、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个的氨基酸序列。在一些实施例中，宿主细胞是自体的。在一些实施例中，宿主细胞是同种异体的。在一些实施例中，哺乳动物受试者先前用、将用或同时用具有氨基酸序列的多肽治疗，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：1。
本公开的第十八方面是一种治疗表征为功能性碱性磷酸酶缺乏或量不足的与骨缺损相关的病状或疾病的方法，所述方法包括：施用治疗有效量的表达多肽的经转导的宿主细胞，所述多肽具有式(I)、(1A)、(IB)、(II)、(III)、(IV)、(VA)和(VB)中的任何一个(如本文所描述的)。在一些实施例中，所表达的多肽的氨基酸序列与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少97％的同一性。在一些实施例中，所表达的多肽的氨基酸序列与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少99％的同一性。在一些实施例中，所表达的多肽包括具有2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所表达的多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少95％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所表达的多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少97％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所表达的多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少99％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所表达的多肽由具有SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个的核苷酸序列编码。
在一些实施例中，宿主细胞用表达载体转导，例如逆转录病毒表达载体或慢病毒表达载体，其中表达载体包括编码多肽的核苷酸，所述多肽具有式(I)、(1A)、(IB)、(II)、(III)、(IV)、(VA)和(VB)中的任何一个(如本文所描述的)。在一些实施例中，编码具有式(I)、(IA)、(IB)、(II)、(III)、(IV)、(VA)和(VB)中的任何一个的多肽的核苷酸序列与启动子可操作地连接。在一些实施例中，所述启动子选自EF1A、MND、CD11b、CD68Lp、EF1a1、EFS和UbC。在一些实施例中，慢病毒载体进一步包括UCOE启动子元件。在一些实施例中，慢病毒载体进一步包括绝缘子。在一些实施例中，慢病毒载体进一步包括一个或多个支架/基质附着区。在一些实施例中，慢病毒载体进一步包括WPRE元件。在一些实施例中，慢病毒载体进一步包括WPRE元件。在一些实施例中，宿主细胞的转导离体发生。在一些实施例中，宿主细胞的转导发生在体内。在一些实施例中，宿主细胞是自体的。在一些实施例中，宿主细胞是同种异体的。在一些实施例中，哺乳动物受试者先前用、将用或同时用具有氨基酸序列的多肽治疗，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：1。
本公开的第十九方面是一种多肽，其包括式(I)：
[A]v-[B]-[C]w-[R]q-([D]x-[E]y)z， (IB)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括编码碱性磷酸酶的氨基酸；
C包括编码GPI锚的氨基酸序列；
R是-(Mo(Fc)Np)-，其中M和N各自独立地包含1至6个氨基酸，其中Fc是Fc结构域，并且o和p各自独立地是0、1或2；
D包括具有4至6个氨基酸的氨基酸序列，或者是F(G)tF，其中每个F是相同的氨基酸，G是具有3、4或5个氨基酸的氨基酸序列，并且t是范围为2至5的整数；
E包括具有1至8个氨基酸的氨基酸序列；
q是0或1；
v是0或1；
w是0或1；
x是0或范围为1至6的整数；
y是0或范围为1至16的整数；并且
z是0或范围为1至6的整数；
条件是当v是1，w是0，q是1，o是1，p是1，N是二氨基酸-D-I-，M是二氨基酸-L-K-，[B]包括SEQ ID NO：11，Fc包括SEQ ID NO：130，并且x是0时，那么[E]y不包括介于十与十六个之间的连续天冬氨酸残基。
在一些实施例中，E包括2至4个氨基酸。在一些实施例中，E包括3个氨基酸。在一些实施例中，所述3个氨基酸中的至少2个连续的氨基酸相同。在一些实施例中，E包括-D-S-S-。
在一些实施例中，q是0。
在一些实施例中，q是1。
在一些实施例中，x是0。在一些实施例中，z是1。在一些实施例中，y的范围为4至8。在一些实施例中，y是6。
在一些实施例中，[E]y是[-D-S-S-]6。
在一些实施例中，q是0，并且x是0。
在一些实施例中，q是1，并且[R]是-[L-K]-Fc-[D-I]-，并且其中Fc包括与SEQ IDNO：130至少97％的同一性。在一些实施例中，q是1，并且[R]是-[L-K]-Fc-[D-I]-，并且其中Fc包括与SEQ ID NO：130至少98％的同一性。在一些实施例中，q是1，并且[R]是-[L-K]-Fc-[D-I]-，并且其中Fc包括与SEQ ID NO：130至少99％的同一性。在一些实施例中，[R]包括SEQ ID NO：9。
在一些实施例中，所述多肽的氨基酸序列与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少90％的同一性。在一些实施例中，所述多肽的氨基酸序列与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少95％的同一性。在一些实施例中，所述多肽的氨基酸序列与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少96％的同一性。在一些实施例中，所述多肽的氨基酸序列与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少97％的同一性。在一些实施例中，所述多肽的氨基酸序列与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少98％的同一性。在一些实施例中，所述多肽的氨基酸序列与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少99％的同一性。在一些实施例中，所述多肽包括具有2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少90％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少95％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少96％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少97％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少98％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少99％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述多肽由具有SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个的核苷酸序列编码。
本公开的第二十方面是一种表达载体，其包括编码多肽的核酸序列，所述多肽与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少90％同一性。在一些实施例中，所述多肽与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少91％同一性。在一些实施例中，所述多肽与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少92％同一性。在一些实施例中，所述多肽与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少93％同一性。在一些实施例中，所述多肽与SEQ IDNO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少94％同一性。在一些实施例中，所述多肽与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少95％同-性。在一些实施例中，所述多肽与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少96％同一性。在一些实施例中，所述多肽与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少97％同一性。在一些实施例中，所述多肽与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少98％同一性。在一些实施例中，所述多肽与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少99％同一性。在一些实施例中，所述多肽具有SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个。在一些实施例中，所述表达载体是逆转录病毒载体。在一些实施例中，所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。在一些实施例中，所述表达载体是AAV载体。
本公开的第二十一方面是一种分离的核苷酸序列，其与SEQ ID NO：111、115和131中的任何一个具有至少90％同一性(例如，91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性、100％同一性)。
本公开的第二十二方面是一种分离的核苷酸序列，其至少包括第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列包括与SEQ ID NO：115至少90％的同一性(例如，91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、95％同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性、100％同一性)；并且其中所述第二核苷酸序列编码信号肽。在一些实施例中，信号肽与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少95％同一性(例如，96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性、100％同一性)。
本公开的第二十三方面是一种慢病毒载体，其包括：(i)第一核苷酸序列，其与SEQID NO：115具有至少90％同一性(例如，95％同一性、97％同一性、99％同一性、100％同一性)；以及(ii)第二核苷酸序列，其编码信号肽。在一些实施例中，信号肽包括氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少95％同一性(例如，96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性、100％同一性)。在一些实施例中，慢病毒载体进一步包括编码启动子的第三核苷酸序列，如与第一核苷酸序列可操作地连接的启动子。在一些实施例中，所述启动子选自由以下组成的组：EF1A、MND、CD11b、CD68Lp、EF1a1、EFS和UbC。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少95％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少96％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少97％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少95％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少98％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少99％同一性。在一些实施例中，所述启动子包括SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个。
本公开的第二十四方面是一种宿主细胞群体，其用慢病毒载体转导，其中所述慢病毒载体包括第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列与SEQ ID NO：115具有至少90％同一性(例如，95％同一性、97％同一性、99％同一性、100％同一性)；以及第二核苷酸序列，其编码信号肽。在一些实施例中，信号肽包括氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少95％同一性(例如，96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性、100％同一性)。在一些实施例中，所述慢病毒载体进一步包括编码启动子的第三核苷酸序列。在一些实施例中，所述启动子选自由以下组成的组：EF1A、MND、CD11b、CD68Lp、EF1a1、EFS和UbC。在一些实施例中，宿主细胞被离体转导。在一些实施例中，宿主细胞在体内被转导。
本公开的第二十五方面是一种分离的核苷酸序列，其包括与SEQ ID NO：111至少97％的同一性(例如，98％同一性、99％同一性、100％同一性)。
本公开的第二十六方面是一种氨基酸序列，其与SEQ ID NO：75具有至少80％同一性(例如，90％同一性、95％同一性、97％同一性、99％同一性、100％同一性)。
本公开的第二十七方面是一种多肽，其至少包括第一部分和第二部分，其中所述第一部分包括与SEQ ID NO：4-8和44-54中的任何一个具有至少95％同一性(例如，96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性、100％同一性)的氨基酸序列；并且其中所述第二部分包括编码Fc结构域的氨基酸序列。在一些实施例中，编码所述Fc结构域的所述氨基酸序列包括与SEQ ID NO：130至少95％的同一性(例如，96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性、100％同一性)。
本公开的第二十八方面是一种分离的核苷酸序列，其包括与SEQ ID NO：72至少90％的同一性。在一些实施例中，所述分离的核苷酸序列包括与SEQ ID NO：72至少95％的同一性。在一些实施例中，所述分离的核苷酸序列包括与SEQ ID NO：72至少96％的同一性。在一些实施例中，所述分离的核苷酸序列包括与SEQ ID NO：72至少97％的同一性。在一些实施例中，所述分离的核苷酸序列包括与SEQ ID NO：72至少98％的同一性。在一些实施例中，所述分离的核苷酸序列包括与SEQ ID NO：72至少99％的同一性。
本公开的第二十九方面是一种分离的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO：72。
本公开的第三十方面是一种多肽，其包括与骨靶向部分偶联的碱性磷酸酶。在一些实施例中，所述骨靶向部分的核苷酸序列包括与SEQ ID NO：72至少90％的同一性(例如，91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、955同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性、100％同一性)。在一些实施例中，所述碱性磷酸酶包括与SEQ IDNO：11具有至少90％同一性(例如，91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、955同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性、100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施例中，碱性磷酸酶通过肽接头与骨靶向序列偶联。在一些实施例中，所述肽接头包括(GGGGS)n，并且其中n的范围为1至10。在一些实施例中，范围为2至8。在一些实施例中，n是2。在一些实施例中，多肽进一步包括Fc结构域。在一些实施例中，Fc结构域包括与SEQID NO：130至少95％的同一性(例如，96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性、100％同一性)。
本公开的第三十一方面是一种慢病毒载体，其包括第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码与骨靶向部分偶联的碱性磷酸酶，其中所述第一核苷酸序列与启动子可操作地连接。在一些实施例中，所述骨靶向部分的核苷酸序列包括与SEQ ID NO：72至少90％的同一性(例如，91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、955同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性、100％同一性)。在一些实施例中，所述碱性磷酸酶包括与SEQ ID NO：11具有至少90％同一性(例如，91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、955同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性、100％同一性)的氨基酸序列。在一些实施例中，所述启动子选自由以下组成的组：EF1A、MND、CD11b、CD68Lp、EF1a1、EFS和UbC。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少95％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少96％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少97％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少95％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少98％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少99％同一性。在一些实施例中，所述启动子包括SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个。
本公开的第三十二方面是一种宿主细胞，其用慢病毒载体转导，所述慢病毒载体包括第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码与骨靶向部分偶联的碱性磷酸酶，其中所述第一核苷酸序列与启动子可操作地连接。在一些实施例中，所述骨靶向部分的核苷酸序列包括与SEQ ID NO：72至少90％的同一性(例如，91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、955同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性、100％同一性)。在一些实施例中，所述碱性磷酸酶包括与SEQ ID NO：11至少90％的同一性(例如，91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、955同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性、100％同一性)。在一些实施例中，所述启动子选自由以下组成的组：EF1A、MND、CD11b、CD68Lp、EF1a1、EFS和UbC。在一些实施例中，宿主细胞被离体转导。在一些实施例中，宿主细胞在体内被转导。
本公开的第三十三方面是一种药物组合物，其包括多肽，其中所述多肽包括与骨靶向部分偶联的碱性磷酸酶。在一些实施例中，所述骨靶向部分的核苷酸序列包括与SEQID NO：72至少90％的同一性(例如，91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、955同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性、100％同一性)。在一些实施例中，所述碱性磷酸酶包括与SEQ ID NO：11至少90％的同一性(例如，91％同一性、92％同一性、93％同一性、94％同一性、955同一性、96％同一性、97％同一性、98％同一性、99％同一性、100％同一性)。在一些实施例中，所述药物组合物用于治疗需要治疗的哺乳动物的低磷酸酯酶症。在一些实施例中，所述药物组合物用于减轻或预防需要治疗的哺乳动物的低磷酸酯酶症的症状。
附图说明
为了获得对本公开的特征的整体理解，参考附图。在附图中，始终使用相同的附图标记来表示相同的元件。
图1示出了包括编码碱性磷酸酶的核酸序列的慢病毒载体的载体图，所述多肽包含分泌信号肽，但不包含GPI锚。在一些实施例中，多肽进一步包含接头、Fc结构域和具有十个天冬氨酸残基的肽。
图2示出了包括编码多肽的核酸序列(SEQ ID NO：2)的慢病毒载体的载体图。
图3示出了包括编码多肽的核酸序列(SEQ ID NO：3)的慢病毒载体的载体图。
图4示出了包括编码多肽的核酸序列(SEQ ID NO：4)的慢病毒载体的载体图。
图5示出了包括编码多肽的核酸序列(SEQ ID NO：5)的慢病毒载体的载体图。
图6示出了包括编码多肽的核酸序列(SEQ ID NO：6)的慢病毒载体的载体图。
图7示出了包括编码多肽的核酸序列(SEQ ID NO：7)的慢病毒载体的载体图。
图8示出了包括编码多肽的核酸序列(SEQ ID NO：8)的慢病毒载体的载体图。
图9示出了包括编码多肽的核酸序列的慢病毒载体的载体图，所述多肽包含组织非特异性碱性磷酸酶，并且所述多肽包含分泌信号肽和GPI锚。
图10通过分析MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴化物)并入到活细胞中，提供了在存在各种浓度的sTNSALP-(DSS)6RMP005化合物的情况下表明细胞增殖和活力的数据。简言之，将铺板的细胞与约0.25mg/ml MTT溶液在约37℃一起温育约3小时。温育后，将沉淀物溶解于DMSO中。在酶标仪中使用560nm波长进行分光光度测量。数据示出即使在最高浓度(10U/ml)下，RMP005对细胞也没有毒性作用。
图11提供了由sTNSALP-(DSS)6(RMP-005)(右小图)诱导的矿化的可视化。为了记录潜在的矿化抑制/挽救，在分化培养基(包含抗坏血酸(AA)和磷酸盐来源(β-甘油磷酸盐；βGP))中启动细胞培养。在第4天，将0.1、0.5和1.0单位/毫升的各种浓度的sTNSALP-(DSS)6(RMP-005)添加到含有或不含浓度为约2.5μM的矿化抑制剂焦磷酸四钠(PPi)的培养基中，持续剩余的培养期(10天)。矿物质通过冯库萨染色(von Kossa staining)可视化。左小图中提供了矿化的定量，其中将沉积到细胞外基质(ECM)中的不溶性钙首先用约0.5M HCl溶解，并且使用可商购获得的钙测定试剂盒在上清液(波长为约595nm)中进行分光光度法定量。即使在最低浓度(约0.1U/ml)下，RMP005化合物也能挽救PPi诱导的细胞矿化抑制。剂量范围对沉积钙浓度的效果示出在约1.0U/mL下矿化完全恢复。
图12比较了化合物“RMP-002”(SEQ ID NO：2)和RMP-005(SEQ ID NO：5)的体外羟基磷灰石(HA)结合。未标记的sTNSALP(RMP-002)和标记的sTNSALP-(DSS)6(“RMP005”)进行下拉测定(通过矿物质去除上清液(HA))，如下所示：在20mM Tris(pH 7.4)；150mM NaCl中制备羟基磷灰石晶体溶液(伯克利(Berkeley)，5μM)(HA)，并且允许在室温下轻轻搅拌平衡过夜。第二天，将“RMP002”和“RMP005”在不同浓度0.5、1.0、5.0、10.0和15.0μg/ml下与或不与0.3mg HA一起温育，并且允许在室温下在振荡器上结合一小时。将试管以约10,000xg向下旋转约5分钟，并且使用上清液测量每个样品的碱性磷酸酶水平。一种标准比色法，其中碱性磷酸酶用作标准品并且对硝基苯磷酸盐用作磷酸酶底物，在通过碱性磷酸酶去磷酸化时变为黄色，并且在405nm波长下测量。结果示出标记的“RMP-005”与其未标记的对应物(“RMP002”)相比有很强的优先结合。
图13展示了用具有野生型和IgG2G分泌信号肽的DNA构建体转染的293细胞上清液中分泌的TNALP活性。图13展示了具有IgG2H分泌信号肽的构建体的分泌的TNALP活性是具有包含EF1a启动子和MND启动子的原始分泌信号肽(参见SEQ ID NO：12)的两个构建体的分泌的TNALP活性的6倍以上。
图14展示了所有测试物品的药代动力学数据，以μg/mL表示(SEQ ID NO：1-8)。
图15提供了RMP-001RMP-005RMP-006和RMP-008(分别对应于SEQ ID NO：1、5、6和8)的PK曲线比较，每一个都在本文中描述。
图16提供了RMP-001、RMP-004和RMP-007(分别对应于SEQ ID NO：1、4和7)的PK曲线比较，每一个都在本文中描述。
图17提供了测试物品中的每个测试物品(SEQ ID NO：1-8)的Cmax值(Tmax＝5分钟)。
图18示出了所有测试物品(SEQ ID NO：1-8)外推到无穷大的AUC。
图19示出了各种测试物品(SEQ ID NO：1-8)的消除半衰期。
图20A示出了RMP-100(FG12w.MND.kz.IgKVIII.TNALPco(mut-miR362a).Fc.(DSS)6.WPRE)(SEQ ID NO：74)的载体图。特别地，此载体包含：(1)无绝缘子的慢病毒载体骨架(HIV-1序列)；(2)驱动TNALP mRNA表达的启动子/增强子元件；(3)促进mRNA稳定性和有效翻译的5UTR序列和翻译起始序列；(4)促进TNALP的有效加工和分泌的人Ig K轻链V-III区信号肽和其接头；(5)用于实现有效翻译、稳定性和酶促活性的密码子优化的TNALP编码序列；(6)用于在血浆中保留分泌的蛋白质的IgG1 Fc融合配偶体和其接头；(7)用于将酶促活性有效靶向骨的骨标签；以及(8)用于实现mRNA稳定性的3′UTR序列。
图20B提供了自灭活慢病毒载体构建体LVV-RMP100(用于批号v1026)的示意图。FG12w.MND.kz.IgKVIII-sTNALPco(mut-miR362a).Fc.(DSS)6.WPRE(SEQ ID NO：74)，如历史上确定的。RRE：Rev应答元件；cPPT/CTS：中心聚嘌呤痕量；hIgKVIII：人Ig κ轻链V-III区信号肽；sTNALPco(mut-miR362a)：GPI-无锚分泌形式的组织非特异性碱性磷酸酶含有miR362T mut-A；Fc：)用于保留血浆中的分泌蛋白的IgG1 Fc融合配偶体和其接头；(DSS)6：骨表面结合肽；WPRE：土拨鼠转录后调控元件；bGH-poly(A)信号：牛生长激素聚腺苷酸化信号。
图21A和21B展示了来自一系列不同载体的分泌的TNALP的活性(即，EF1a-RMP5(SEQ ID NO：19)、EF1a-IgG2H-RMP5(SEQ ID NO：55)、EF1a-SEAP-RMP5(SEQ ID NO：65)、EF1a-aLA-RMP5(SEQ ID NO：64)、EF1a-hCD33-RMP5(SEQ ID NO：58)、EF1a-Secrecon-RMP5(SEQ ID NO：60)、EF1a-Secrecon-AA-RMP5(SEQ ID NO：61)、EF1a-mIgKVIII-AA-RMP5(SEQID NO：62)和EF1a-hIgKVIII-AA-RMP5(SEQ ID NO：57))。
图22A展示了293T细胞每载体拷贝数(VCN)分泌的TNALP活性(其中TNALP是从用EF1a-RMP5(SEQ ID NO：19)或EF1a-IgG2H-RMP5(SEQ ID NO：55)转导的细胞分泌的)。
图22A展示了Jurkat细胞每VCN分泌的TNALP活性(其中TNALP是从用EF1a-RMP5(SEQ ID NO：19)或EF1a-IgG2H-RMP5(SEQ ID NO：55)转导的细胞分泌的)。
图23A展示了EF1a-IgG2H-RMP5(SEQ ID NO：55)、EF1a-IgG2H-RMP5-miR362-A(SEQID NO：81)和EF1a-IgG2H-RMP5-miR362-B(SEQ ID NO：82)之间的比对。
图23B展示了从用载体转染的293T细胞分泌的TNALP活性，所述载体具有EF1a-IgG2H-RMP5(SEQ ID NO：55)、EF1a-IgG2H-RMP5-miR362-A(SEQ ID NO：81)和EF1a-IgG2H-RMP5-miR362-B(SEQ ID NO：82)。
图23C展示了从用EF1a-IgG2H-RMP5(SEQ ID NO：55)或EF1a-IgG2H-RMP5-miR362-A(SEQ ID NO：81)转染的293T细胞分泌的TNALP活性。
图24比较了从FG12-SD400i-MND-IgKVIII-AA-RMP5-miR362A-Fc-(DSS)6(SEQ IDNO：84)分泌的TNALP水平与从FG12-SD400i-MND-Kozak-IgKVIII-AA-RMP5-miR362A-Fc-(DSS)6(SEQ ID NO：85)分泌的TNALP水平。
图25A比较了一系列载体的测量载体滴度，所述载体包含EF1a-RMP5(SEQ ID NO：19)、EF1-IgG2H-RMP5(SEQ ID NO：55)、EF1a-IgG2H-RMP5-miR-A(SEQ ID NO：79)、1400-MND-IgG2H-RMP5(SEQ ID NO：86)、EF1-IgG2H-RMP5-Fc(SEQ ID NO：87)和EF1a-IgKVIII-RMP5(SEQ ID NO：57)。
图25B比较了HEK293细胞系中一系列载体每VCN测量的ALP活性，所述载体包含EF1a-RMP5(SEQ ID NO：19)、EF1-IgG2H-RMP5(SEQ ID NO：55)、EF1a-IgG2H-RMP5-miR-A(SEQ ID NO：79)、1400-MND-IgG2H-RMP5(SEQ ID NO：86)、EF1-IgG2H-RMP5-Fc(SEQ ID NO：87)和EF1a-IgKVIII-RMP5(SEQ ID NO：57)。
图25C和25D分别比较了Jurkat和K562细胞系中一系列载体每VCN测量的TNALP活性，所述载体包含EF1a-RMP5(SEQ ID NO：19)、EF1-IgG2H-RMP5(SEQ ID NO：55)、EF1a-IgG2H-RMP5-miR-A(SEQ ID NO：79)、I400-MND-IgG2H-RMP5(SEQ ID NO：86)、EF1-IgG2H-RMP5-Fc(SEQ ID NO：87)和EF1a-IgKVIII-RMP5(SEQ ID NO：57)。
图25A-25D展示了(i)IgG2H在转导的Jurkat和K562细胞中优于TNALP野生型分泌信号；(ii)在图25C和D所示的两种造血细胞系中具有400-bp绝缘子的MND启动子(I400-MND-IgG2H-RMP5-SEQ ID NO：86)优于EF1a启动子(EF1-IgG2H-RMP5-SEQ ID NO：55)；(iii)添加Fc融合配偶体对三种不同类型细胞系中TNALP分泌的影响最小，因为图25B中的ALP分泌在(EF1-IgG2H-RMP5-SEQ ID NO：55)和(EF1a-IgG2H-RMP5-Fc-SEQ ID NO：87)之间没有显著差异；(iv)在图25C和D所示的两种骨髓细胞系中miR362-A突变(EF1a-IgG2H-RMP5-miR-A-SEQ ID NO：79)表现优于原始构建体(EF1a-RMP5-SEQ ID NO：19)；并且(v)在图25B、C和D所示的所有三种不同类型的细胞系中IgKVIII(EF1a-IgKVIII-RMP5-SEQ ID NO：57)的TNALP分泌优于IgG2H(EF1-IgG2H-RMP5-SEQ ID NO：55)。
图26A比较了一系列载体的测量滴度，所述载体包含EF1a-IgG2H-RMP5(SEQ IDNO：55)、EF1-IgG2H-RMP5-Fc(SEQ ID NO：87)、EF1a-IgG2H-sTNALPwt-DSS6(SEQ ID NO：88)、EF1a-IgG2H-sTNALPwt-Fc-DSS6(SEQ ID NO：89)、I400-MND-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6(SEQ ID NO：84)和1400-MND-kozak-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6(SEQ ID NO：85)。包含400bp绝缘子、MND启动子、Kozak元件、IgKVIII分泌信号肽、miR362突变和Fc结构域(I400-MND-kozak-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6SEQ ID NO：85)的组合构建体具有与其余载体(SEQ ID NO：55、87、88、84、89)相当的滴度。
图26B比较了一系列载体每VCN测量的ALP，所述载体包含EF1a-IgG2H-RMP5(SEQID NO：55)、EF1-IgG2H-RMP5-Fc(SEQ ID NO：87)、EF1a-IgG2H-sTNALPwt-DSS6(SEQ ID NO：88)、EF1a-IgG2H-sTNALPwt-Fc-DSS6(SEQ ID NO：89)、1400-MND-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6(SEQ ID NO：84)和1400-MND-kozak-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6(SEQ ID NO：85)。包含400bp绝缘子、MND启动子、Kozak元件、IgKVIII分泌信号肽、miR362突变和Fc结构域(I400-MND-kozak-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6 SEQ ID NO：85)的组合构建体在所比较的所有载体(SEQ ID NO：55、87、88、84、89)中每VCN的ALP分泌最高，并且基于每VCN的ALP分泌，所述组合构建体的效力是载体EF1-IgG2H-RMP5-Fc(SEQ ID NO：87)的至多30倍。
图27展示了每VCN的TNALP分泌。结果指示在293t细胞和成人动员外周血CD34+造血干细胞中，包含400bp绝缘子、MND启动子、Kozak元件、IgKVIII分泌信号肽、miR362突变和Fc结构域(I400-MND-kozak-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6 SEQ ID NO：85)的组合构建体与I400-MND-IgG2H-RMP5-Fc构建体(SEQ ID NO：87)相比分泌相对增加。
图28比较了三种不同载体即，EF1a-IgG2H-RMP5-Fc(SEQ ID NO：87)、EF1a-IgG2H-sTNALPwt-Fc(SEQ ID NO：88)和i400-MND-kozak-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6(SEQ IDNO：85)在三种细胞系——Jurkat、HL60和THP-1中每VCN测量的TNALP分泌。
图29比较了四种不同载体和模拟物的每VCN测量的ALP活性，即，1.EF1a-IgG2H-RMP5-Fc(SEQ ID NO：87)、EF1a-IgG2H-sTNALPwt-Fc(SEQ ID NO：88)，并且图28比较了三种不同载体的每VCN测量的TNALP分泌，即，EF1a-IgG2H-RMP5-Fc(SEQ ID NO：87)、EF1a-IgG2H-sTNALPwt-Fc(SEQ ID NO：88)、I400-MND-kozak-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6(SEQ ID NO：87)和EF1a-kozak-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6(SEQ ID NO：90)。
图30A展示了HEK293中三种不同载体每VCN测量的ALP活性，即，LVV-RMP100v01(被称为EF1a-IgG2H-RMP5-Fc(SEQ ID NO：87)、LVV-RMP200 v02(被称为FG12-SD400i-MND-Kozak-IgKVIII-AA-RMP5-miR362-A-Fc-(DSS)6(SEQ ID NO：85)和LVV-RMP100v03(被称为EF1a-kozak-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6，SEQ ID NO：90)。结果示出在HEK293中，FG12-SD400i-MND-Kozak-IgKVIII-AA-RMP5-miR362-A-Fc-(DSS)6(SEQ ID NO：85)的效力分别是EF1a-IgG2H-RMP5-Fc(SEQ ID NO：87)的效力的约27倍并且是EF1a-kozak-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6(SEQ ID NO：90)的效力的10倍以上。图30B和30C分别展示了在一个健康供体来源的HSC中三种不同载体每VCN测量的ALP活性和VCN，即，EF1a-Kozak-IgKVIII-RMP5-miR362-A-Fc-Dss6(SEQ ID NO：90)、FG12-SD400i-MND-Kozak-IgKVIII-AA-RMP5-miR362-A-Fc-(DSS)6(SEQ ID NO：85)和MND-RMP100(被称为LVV-RMP100或MND-kozak-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6，SEQ ID NO：74)。图30B分别示出了在HSC中，FG12-SD400i-MND-Kozak-IgKVIII-AA-RMP5-miR362-A-Fc-(DSS)6(SEQ ID NO：85)的效力是MND-kozak-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6，SEQ ID NO：74的效力的约2倍并且是EF1a-kozak-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6，(SEQ ID NO：90)的效力的约8倍。图30C示出，在这3个载体的这批次转导中，转导的HSC具有介于4至10个之间的类似的VCN。
图31A和31B展示了用不同载体转导的HSC的集落形成，即，(i)I400-MND-RMP100(被称为i400-MND-kozak-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6，SEQ ID NO：85)；(ii)MND-RMP100(被称为MND-kozak-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6，SEQ ID NO：74)；以及(iii)EF1a-RMP100(被称为EF1a-kozak-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6，SEQ ID NO：90)。CFU数据表明，与模拟物HSC相比，在MOI为5至20下，用MND-400in-RMP100、EF1a-RMP100和MND-RMP100转导的HSC具有类似的集落形成能力。
图32A、32B、33C和33D展示了用不同载体转导的各种细胞系(32A-THP-1、32B-Jurkat、32C-HL-60和33D-Jurkat)的稳定性，即，(i)I400-MND-RMP100(被称为i400-MND-kozak-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6，SEQIDNO：85)；(ii)MND-RMP100(被称为MND-kozak-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6，SEQ ID NO：74)；以及(iii)EF1a-RMP100(被称为EF1a-kozak-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6，SEQ ID NO：90)。所有构建体在经转导的细胞系THP-1、HL-60和Jurkat中均表现出稳健的稳定性。
图33提供了FG12-CD11b-Kozak-IgKVIII-RMP5-miR362-A-Fc-Dss6(SEQ ID NO：91)的载体图。
具体实施方式
还应当理解，除非明确相反地指出，否则在本文要求保护的包含多于一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不一定限于叙述方法的步骤或动作的顺序。
本说明书中对“一个实施例”、“实施例”、“说明性实施例”等的引用表明，所描述实施例可以包含特定特征、结构或特性，但是并非每个实施例都一定可以包含或可以不包含所述特定特征、结构或特性。此外，这类词组未必是指相同实施例。此外，当结合实施例描述特定特征、结构或特性时，无论是否明确描述，都认为结合其它实施例影响此类特征、结构或特性处于本领域的技术人员的知识范围内。
如本文所使用的，除非上下文另外清楚地指出，否则单数术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述(the)”包含复数指代物。类似地，除非上下文另外清楚地指示，否则词语“或/或者(or)”旨在包含“和/以及(and)”。术语“包含”被定义为包含性的，使得“包含A或B”意指包含A、B或A和B。
如本文在说明书和权利要求中使用的，“或”应该理解为具有与如上定义的“和/或”相同的含义。例如，当分开列表中的项目时，“或”或“和/或”应该解释为包含性的，即包含至少一个，但也包含许多元素或元素列表的多于一个，以及任选地，另外未列出的项目。只有明确指出相反的术语，例如“仅一个”或“恰好一个”，或者，当在权利要求中使用时，“由…组成”指许多元素或元素列表的恰好一个元素。一般而言，当之前为排他性术语例如“任一”、“之一”、“仅一个”或“恰好一个”时，如本文使用的，术语“或”应该仅解释为指示排他性替代物(即“一个或另一个但不是两者”)。当在权利要求书中使用时，“主要由…组成”应当具有如在专利法领域中使用的普通含义。
如本文所使用的，术语“包括(comprising)”、“包含(including)”、“具有(having)”等可互换使用并且具有相同含义。类似地，“包括(comprises)”、“包含(includes)”、“具有(has)”等可互换使用并且具有相同的含义。具体地，所述术语中的每个术语被定义成与“包括”的通用美国专利法定义一致，并且因此应被解释为意指“至少以下”的开放术语，并且还应被解释为不排除另外的特征、限制、方面等。因此，例如，“具有组件a、b和c的装置”意指所述装置至少包含组件a、b和c。类似地，短语：“涉及步骤a、b和c的方法”意指所述方法至少包含步骤a、b和c。此外，虽然本文中可能以特定顺序概述了步骤和过程，但本领域技术人员将认识到顺序步骤和过程可以变化。
如本文在说明书和权利要求中使用的，提及一个或多个元素列表中的短语“至少一个”，应理解为意指选自元素列表中的任何一个或多个元素的至少一个元素，但不一定包含在元素列表内具体列出的每个和每一个元素中的至少一个，且不排除元素列表中的任何元素组合。此定义还允许除了在短语“至少一个”所指的元素列表内具体鉴定的元素之外，可以任选地存在无论与具体鉴定的那些元素相关还是不相关的元素。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等效地“A或B中的至少一个”或等效地“A和/或B中的至少一个”)在一个实施例中可以指代至少一个、任选地包含多于一个A，而不存在B(并且任选地包含除了B之外的元素)；在另一个实施例中可以指代至少一个、任选地包含多于一个B，而不存在A(并且任选地包含除了A之外的元素)；在又另一个实施例中可以指代至少一个、任选地包含多于一个A，以及至少一个、任选地包含多于一个B(并且任选地包含其它元素)；等。
如本文所使用的，术语“结构域”是指具有共同物理化学特征的分子或结构的一部分，如但不限于疏水性、极性、球状和螺旋结构域或特性。结合结构域的具体实例包含但不限于DNA结合结构域和ATP结合结构域。
如本文所使用的，术语“Fc”是指人IgG Fc结构域。如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4等IgG的亚型都被考虑用作Fc结构域。如本文所使用的，应用于核酸的术语“片段”是指较大核酸的子序列。核酸的“片段”的长度可以是至少约15个核苷酸；例如，至少约SO个核苷酸至约100个核苷酸；至少约100至约500个核苷酸；至少约500至约1000个核苷酸；至少约1000个核苷酸至约1500个核苷酸；约1500个核苷酸至约2500个核苷酸；或约2500个核苷酸(以及其间的任何整数值)。如本文所使用的，应用于蛋白质或肽的术语“片段”是指较大蛋白质或肽的子序列。蛋白质或肽的“片段”的长度可以是至少约20个氨基酸；例如，长度为至少约50个氨基酸；长度为至少约100个氨基酸；长度为至少约200个氨基酸；长度为至少约300个氨基酸；或长度为至少约400个氨基酸(以及其间的任何整数值)。
如本文所使用的，术语“造血细胞”或“造血干细胞”是指可见于血液和/或淋巴中的细胞类型。这些细胞类型包含骨髓细胞(红细胞、血小板、粒细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、单核细胞和巨噬细胞、肥大细胞)以及淋巴细胞(B细胞、各种类型的T细胞、NK细胞)。这些细胞通常来自骨髓中的造血干细胞。应当理解，某些造血细胞例如，巨噬细胞，可能存在于血管或淋巴系统之外的组织中。白细胞(例如，粒细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞和淋巴细胞)是造血细胞的子集。
如本文所使用的，术语“宿主细胞”是指易于用包括本公开的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。在一些实施例中，术语“宿主细胞”涵盖由于在复制期间发生的突变而与亲本细胞不相同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞可以包含包装细胞、生产细胞和用病毒载体感染的细胞。在特定实施例中，将用本公开的病毒载体感染的宿主细胞施用于需要疗法的受试者。在一些实施例中，宿主细胞被离体转导。在其它实施例中，宿主细胞在体内被转导。
如本文所使用的，术语“低磷酸酯酶症”和“HPP”是指一种罕见的遗传性骨骼疾病，例如由ALPL(碱性磷酸酶，肝脏/骨/肾脏)基因中的一个或多个功能丧失突变引起，所述基因编码组织-非特异性碱性磷酸酶(TNSALP)。HPP可以进一步表征为例如婴儿期HPP或围产期HPP(例如，良性围产期HPP或致死性围产期HPP)。例如，“婴儿期HPP”描述了约三岁或更小的患有HPP的患者，而“围产期HPP”描述了在出生前或刚出生后(例如，出生后一至四周)患有HPP的患者。HPP的发病年龄，如受试者表现出HPP症状时，也可以分类为例如，围产期发病的HPP和婴儿期发病的HPP。患有HPP的患者可能表现出HPP症状，包含不限于骨骼畸形、肌张力减退、行动障碍、步态障碍、骨畸形、关节痛、骨痛、骨折、肌肉无力、肌肉疼痛、佝偻病(例如，生长板软骨缺陷)、乳牙过早脱落、骨矿化不完全、血液和/或尿液中磷酸乙醇胺(PEA)、PPi、5′-磷酸吡哆醛(PLP)水平升高、矿化不足、佝偻病性肋骨、高钙尿症、身材矮小、HPP相关癫痫发作、体重增加不足、颅缝早闭和/或关节中焦磷酸钙二水合物晶体沉积(CPPD)，导致例如软骨钙质沉着病和过早死亡。HPP的症状还可以包含TBM和TBM的症状，如心肺呼吸骤停、气管切开术、心脏骤停、呼吸窘迫、痰液潴留、喘息、咳嗽、缺氧发作、发绀、心动过缓、快速性心律失常、颈部自发性过度伸展、呼气期延长、发育迟缓、胸骨收缩、胸骨下收缩、肋间收缩、间歇性或持续性呼吸困难以及复发性支气管炎或肺炎。
如本文所使用的，术语“慢病毒载体”是指用于用转基因转导宿主细胞的非复制载体，所述转基因包括顺式作用的慢病毒RNA或DNA序列，并且需要以反式提供的慢病毒蛋白(例如，Gag、Pol和/或Env)。慢病毒载体缺乏功能性Gag、Pol和Env蛋白的表达。慢病毒载体可以以RNA或DNA分子的形式存在，这取决于所述逆转录病毒载体的产生或发展阶段。
如本文所使用的，术语“核酸”是指如DNA或RNA等多核苷酸。核酸可以是单链的、部分或完全的、双链的，并且在一些情况下是部分或完全地三链的。核酸包含基因组DNA、cDNA、mRNA等。核酸可以从天然来源纯化，使用重组表达系统产生，并且任选地纯化、化学合成等。在适当的情况下，例如在化学合成分子的情况下，核酸可以包括核苷类似物，如具有化学修饰的碱基或糖、骨架修饰等的类似物。如本文所用的术语“核酸序列”可以指核酸材料本身并且不限于生物化学表征特定核酸的序列信息(即，选自五个碱基字母A、G、C、T或U中的连续字母)，例如DNA或RNA分子。除非另有说明，否则核酸序列的显示方向为5′至3′。术语“核酸片段”在本文中用于指作为较长核酸序列的一部分的核酸序列。
如本文所使用的，术语“可操作地连接”或“可操作地缔和”是指两个核酸之间的功能关系，其中序列中的一个序列的表达、活性、定位等由其它核酸受控、引导、调控、调节等。这两种核酸被称为可操作地连接或可操作地缔和或处于可操作的缔合中。“可操作地连接”或“可操作地缔和”还可以指两种多肽之间的关系，其中多肽中的一种多肽的表达由另一种多肽控制、引导、调控、调节等。例如，核酸的转录由可操作连接的启动子引导；核酸的转录后加工由可操作连接的加工序列引导；核酸的翻译由如翻译起始序列等可操作连接的翻译调控序列引导；核酸或多肽的转运、稳定性或定位由如分泌信号序列等可操作连接的转运或定位序列引导；并且多肽的翻译后加工由可操作连接的加工序列引导。通常，与第二核酸序列可操作地连接的第一核酸序列或与第二多肽可操作地连接的第一多肽直接或间接地共价连接到此类序列，但是任何有效的三维缔和是可接受的。本领域普通技术人员应当理解，多种核酸或多种多肽可以彼此可操作地连接或缔合。
如本文所使用的，术语“包装信号”、“包装序列”或“psi序列”是指足以引导将其序列包括包装信号的核酸包装到逆转录病毒颗粒中的任何核酸序列。所述术语包含天然存在的包装序列并且还包含其工程化变体。许多不同逆转录病毒(包含慢病毒)的包装信号是本领域已知的。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的赋形剂”、“载体”或“稀释剂”是指不改变与其一起施用的活性剂的治疗特性的药物组分。一种示例性药学上可接受的载体物质是生理盐水。例如，药学上可接受的载体可以包含氯化钠(例如，150mM氯化钠)和磷酸钠(例如，25mM磷酸钠)。其它生理上可接受的赋形剂、载体和稀释剂以及它们的调配物是本领域技术人员已知的并且描述于例如《雷明顿：药物科学与实践(Remington：The Science andPractice of Pharmacy)》(第22版)，Allen(2012)。例如，药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂可以包含磷酸氢二钠，七水合物；磷酸二氢钠，一水合物；以及pH介于7.2与7.6之间的氯化钠。
如本文所使用的，术语“药物组合物”意指含有如本文所描述的活性剂、与至少一种药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂一起配制的组合物。药物组合物可以在政府监管机构的批准下制造或销售，作为治疗或预防患者(例如，患有HPP的婴儿，如患有围产期发病的HPP的婴儿、或患有婴儿期发病的HPP的婴儿、或青少年发病的HPP、或患有儿童期发病的HPP的患者)疾病或事件的治疗方案的一部分。药物组合物可以被配制成例如用于皮下施用、静脉内施用(例如，作为不含颗粒栓塞的无菌溶液和适合静脉内使用的溶剂系统)、用于口服施用(例如，片剂、胶囊、囊片、囊形剂或糖浆)、或本文所描述的任何其它调配物，例如以单位剂量形式。
如本文所使用的，术语“多核苷酸”或“核酸”是指信使RNA(mRNA)、RNA、基因组RNA(gRNA)、正链RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))、基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)或DNA。多核苷酸包含单链多核苷酸和双链多核苷酸。在一些实施例中，本公开的多核苷酸包含与本文所描述的参考序列(参见例如序列表)中的任何参考序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多核苷酸或变体，通常其中所述变体保持参考序列的至少一种生物活性。在各个说明性实施例中，本公开部分考虑了病毒载体和转移质粒多核苷酸序列以及包括所述病毒载体和转移质粒多核苷酸序列的组合物。在特定实施例中，本公开提供了编码治疗性多肽的多核苷酸。
如本文所使用的，除非相反地规定，否则术语“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，并且根据常规含义使用，即，作为氨基酸序列。多肽不限于具体长度，例如，多肽可以包括全长蛋白序列或全长蛋白质的片段，并且可以包含多肽的转译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等以及本领域已知的天然存在的和非天然存在的其它修饰。在各个实施例中，本文所考虑的多肽包括蛋白质的N末端处的信号(或前导)序列，其共翻译或翻译后引导蛋白质的转移。多肽可以使用各种众所周知的重组和/或合成技术中的任何一种进行制备。在一些实施例中，本文考虑的多肽涵盖碱性磷酸酶、或具有如本文所公开的CAR的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。
多肽包含“多肽变体”。在一些实施例中，多肽变体与天然存在的多肽的不同之处可以在于一个或多个取代、缺失、添加和/或插入。此类变体可以是天然存在的或可以通过合成生成，例如通过修饰上述多肽序列中的一个或多个。例如，在特定实施例中，可以期望通过引入一个或多个取代、缺失、添加和/或插入来改善本文所公开的多肽例如，碱性磷酸酶多肽的结合亲和力和/或其它生物学特性。在一些实施例中，本公开的多肽包含与其具有至少约65％、70％、75％、85％、90％、95％、98％或99％的氨基酸同一性的多肽。
如本文所使用的，“预防(prevent)”和如“预防(prevented/preventing)”等类似词语指示用于预防、抑制或减少疾病或病状发生或复发的可能性。预防还是指延迟疾病或病状的发作或复发或者延迟疾病或病状的症状的发生或复发。如本文所使用的，“预防(prevention)”和类似词语还包含在疾病或病状发作或复发之前减少疾病或病状的强度、效果、症状和/或负担。
如本文所使用的，如本文所使用的，术语“启动子”是指确定RNA聚合酶转录起始位点的DNA序列。启动子序列包括被多肽即转录因子识别和结合的基序。所述转录因子结合后应募集RNA聚合酶II，优选地RNA聚合酶I、II或III，更优选地RNA聚合酶II或III，并且最优选地RNA聚合酶II。由此将启动与转录控制序列可操作地连接的核酸的表达。应当理解，根据待表达的核酸的类型，如本文所指的表达可以包括将DNA序列转录成RNA多核苷酸(适用于例如反义方法、RNAi方法或核酶方法)或可以包括将DNA序列转录成RNA多核苷酸，随后将所述RNA多核苷酸翻译成多肽(适用于例如基因表达和重组多肽产生方法)。为了控制核酸序列的表达，转录控制序列可以定位于紧邻待表达的核酸，即，在其5′端处与所述核酸物理连接。可替代地，所述转录控制序列可以定位成物理上接近。然而，在后一种情况下，必须定位序列以允许与待表达的核酸发生功能性相互作用。
如本文所使用的，术语“调控序列”或“调控元件”是指调控与其可操作连接的核酸序列的表达中的一个或多个步骤(特别是转录，但在一些情况下是其它事件，如剪接或其它加工)的核酸序列。所述术语包含启动子、增强子和其它转录控制元件，其引导或增强可操作地连接的核酸的转录。调控序列可以引导组成型表达(例如在培养物或生物体的典型生理条件下在大多数或所有细胞类型中的表达)、细胞类型特异性、谱系特异性或组织特异性表达和/或可调控(诱导型或抑制型)表达。例如，可以通过存在或添加如激素或其它小分子等诱导剂、通过升高温度等来诱导或抑制表达。适用于哺乳动物细胞的细胞类型、谱系或组织特异性启动子的非限制性实例包含淋巴特异性启动子(参见例如，Calame等人，《免疫学前沿(Adv.Immunol.)》43：235，1988)，如T细胞受体的启动子(参见例如，Winoto等人，《欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J.)》8：729，1989)和免疫球蛋白(参见例如，Bane rji等人，《细胞(Cell)》33：729，1983；Queen等人，《细胞》33：741，1983)以及神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；Byrne等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》86：5473，1989)。发育调控启动子包含hox启动子(参见例如，Kessel等人，《科学(Science)》249：374，1990)和甲胎蛋白启动子(Campes等人，《基因与发育(Genes Dev.)》3：537，1989)。一些调节元件可以抑制或降低地连接的核酸的表达。此类调控元件可以称为“负调控元件”。其活性可以通过暴露于诱导剂或抑制剂和/或通过改变环境条件而被诱导或抑制的调控元件在本文中称为“可调控”元件。
如本文所使用的，术语“sALP”和“可溶性碱性磷酸酶”指可溶性非膜结合ALP或可溶性非膜结合ALP的结构域或生物活性片段。
如本文所使用的，术语“信号肽”是指在多肽的N末端处引导多肽进入分泌途径(例如，细胞外空间)的短肽(约5至约30个氨基酸长)。在一些实施例中，信号肽通常在多肽分泌期间被切割。在一些实施例中，信号序列可以将多肽引导到细胞内区室或细胞器。在一些实施例中，信号序列可以通过与具有将多肽靶向细胞的特定区域的已知功能的肽的同源性或生物学活性来鉴定。
如本文所使用的，术语“受试者”是指任何动物受试者，包含实验室动物(例如，灵长类动物、大鼠、小鼠)、家畜(例如，牛、绵羊、山羊、猪、火鸡、鸡)、家庭宠物(例如，狗、猫、啮齿动物等)和人。
如本文所使用的，术语“治疗有效量”是指病毒或转导治疗细胞可以根据如以下等因素而变化：个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及干细胞和祖细胞在个体中引发期望应答的能力。在一些实施例中，治疗有效量也是其中治疗有益效果超过病毒或转导的治疗细胞的任何毒性或有害作用的量。在一些实施例中，术语“治疗有效量”包含有效地“治疗”受试者(例如，患者)的量。
如本文所使用的，术语“治疗(treatment或treating)”是指对疾病或病理状况的症状或病理的任何有益的或期望的效果并且甚至可以包含正在治疗的疾病或病状的一个或多个可测量标志物的最低限度的减少。在一些实施例中，治疗可以涉及任选地减少或改善疾病或病状的症状或者延迟疾病或病状的进展。“治疗”不一定指示完全根除或治愈疾病或病状或其相关症状。
如本文所使用的，术语“变体(variants或variant)”是指不同于参考核酸或多肽但保留其基本特性的核酸或多肽。通常，变体总体上非常类似，并且在许多区域中与参考核酸或多肽相同。因此，转录因子的“变体”形式总体上非常类似，并且能够结合DNA并激活基因转录。
如本文所使用的，术语“载体”是指能够转移或转运另一个核酸分子的核酸分子。在一些实施例中，所转移的核酸通常与载体核酸分子连接，例如插入载体核酸分子中。在一些实施例中，载体可以包含引导细胞中的自主复制的序列或可以包含足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。有用的载体包含例如，质粒(通常是DNA质粒，但也可以使用RNA质粒)、粘粒和病毒载体。如对于本领域技术人员显而易见的是，术语“病毒载体”广泛用于指代包含通常促进核酸分子的转移或整合到细胞的基因组中的病毒源性核酸元件的核酸分子(例如，质粒)或指代介导核酸转移的病毒颗粒。在一些实施例中，除了核酸之外，病毒颗粒还将典型地包含各种病毒组分并且有时还包含宿主细胞组分。特别地，术语“慢病毒载体”、“慢病毒表达载体”等可以用于指如本文所描述的本公开的慢病毒转移质粒和/或慢病毒颗粒。
多肽
在一些实施例中，本公开提供了一种多肽，其具有式(I)：
[A]v-[B]-[C]w-[R]q-([D]x-[E]y)z， (I)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括编码碱性磷酸酶的氨基酸；
C包括编码GPI锚的氨基酸序列；
R是-(Mo(Fc)Np)-，其中M和N各自独立地包含1至6个氨基酸，其中Fc是Fc结构域，并且o和p各自独立地是0、1或2；
D包括具有4至6个氨基酸的氨基酸序列，或者是F(G)tF，其中每个F是相同的氨基酸，G是具有3、4或5个氨基酸的氨基酸序列，并且t是范围为2至5的整数；
E包括具有1至8个氨基酸的氨基酸序列；
q是0或1；
v是0或1；
w是0或1；
x是0或范围为1至6的整数；
y是0或范围为1至16的整数；并且
z是0或范围为1至6的整数。
在一些实施例中，式(I)的多肽未与葡聚糖缀合。
在一些实施例中，式(I)的多肽有在骨中形成羟基磷灰石晶体的催化能力。
在一些实施例中，编码碱性磷酸酶(“[B]”)的氨基酸是组织非特异性碱性磷酸酶。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约85％的同一性。在其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约90％的同一性。在其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约91％的同一性。在其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约92％的同一性。在其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约93％的同一性。在其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约94％的同一性。
在又其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约95％的同一性。在另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约96％的同一性。在甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约97％的同一性。在又甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约98％的同一性。在又甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性。在又甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQID NO：11具有至少约99％的同一性并且q是0。在又甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性并且q是1。
在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11并且q是0。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11并且q是1。
在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，如包括一个或多个氨基酸取代的变体。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体具有单个氨基酸取代。例如，SEQ ID NO：11的变体可以包括C102S取代。通过另一个实例，SEQ ID NO：11的变体可以包括E434G取代。通过又另一个实例，SEQ IDNO：11的变体可以包括A321H取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ IDNO：11的变体，所述变体具有两个氨基酸取代。例如，SEQ ID NO：11的变体可以包括C102S取代、E434G取代或A321H取代中的任何两个，例如A321H取代和E434G取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体具有三个氨基酸取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体具有四个氨基酸取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体具有五个氨基酸取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体具有六个氨基酸取代。
在一些实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少90％的序列同一性。在其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少95％的序列同一性。在又其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少96％的序列同一性。在另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少97％的序列同一性。在又另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少98％的序列同一性。在甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少99％的序列同一性。在又甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQID NO：12。
在一些实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少90％的序列同一性。在其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少95％的序列同一性。在又其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少96％的序列同一性。在另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少97％的序列同一性。在又另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少98％的序列同一性。在甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少99％的序列同一性。在又甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：33-43中的任何一个。
在一些实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：13具有至少90％的序列同一性。在其它实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：13具有至少95％的序列同一性。在又其它实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：13具有至少96％的序列同一性。在另外的实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：13具有至少97％的序列同一性。在又另外的实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：13具有至少98％的序列同一性。在甚至另外的实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：13具有至少99％的序列同一性。在又甚至另外的实施例中，编码GPI锚的氨基酸包括SEQ ID NO：13。
在一些实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：14具有至少90％的序列同一性。在其它实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：14具有至少95％的序列同一性。在又其它实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：14具有至少96％的序列同一性。在另外的实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：14具有至少97％的序列同一性。在又另外的实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：14具有至少98％的序列同一性。在甚至另外的实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：14具有至少99％的序列同一性。在又甚至另外的实施例中，编码GPI锚的氨基酸包括SEQ ID NO：14。
在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，并且编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ IDNO：11具有至少约90％的同一性。在其它实施例中，v或w中的至少一个是0，并且编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约95％的同一性。在另外的实施例中，v或w中的至少一个是0，并且编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约96％的同一性。在甚至另外的实施例中，v或w中的至少一个是0，并且编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约97％的同一性。在又甚至另外的实施例中，v或w中的至少一个是0，并且编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约98％的同一性。在又甚至另外的实施例中，v或w中的至少一个是0，并且编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性。在其它实施例中，v或w中的至少一个是0，并且编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ IDNO：11。
在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约90％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约95％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约96％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约97％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约98％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12。
在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ IDNO：11，并且x+y＝8至12并且q是1。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少97％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括具有SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个的氨基酸序列。
在一些实施例中，v是1，并且w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约90％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v是1，并且w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约95％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v是1，并且w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约96％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v是1，并且w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约97％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v是1，并且w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约98％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v是1，并且w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v是1，并且w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v是1，并且w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQID NO：11，并且x+y＝8至12并且q是1。
在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约95％的同一性，x+y＝8至12，并且其中x和y均至少是1。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约97％的同一性，x+y＝8至12，并且其中x和y均至少是1。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性，x+y＝8至12，并且其中x和y均至少是1。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性，x+y＝8至12，其中x和y均至少是1；并且q是0。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性，x+y＝8至12，其中x和y均至少是1；并且q是1。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性，并且x+y＝8至12，其中x和y均至少是1；q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。
在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约90％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约95％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸具有SEQ ID NO：11，并且x+y＝4至8。
在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约90％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约95％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约96％的同一性，并且其中x+y＝4至8。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约97％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ IDNO：11具有至少约98％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝4至8。
在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，x+y＝4至8并且q是0。
在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，x+y＝4至8并且q是1。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，x+y＝4至8，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，x+y＝5至7，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，x+y＝6，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，x+y＝6，q是1；R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，x+y＝6，q是1；R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，x+y＝6，q是1；R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少97％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，x+y＝6，并且q是1；R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，x+y＝6，q是1；R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，x+y＝6，q是1；R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个。
在一些实施例中，v或w中的至少一个是0；q是1；[E]y是[DSS]6；并且编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0；q是1；[E]y是[DSS]6；并且编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11；并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个至少99％的同一性。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0；q是1；[E]y是[DSS]6；编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11；并且[A]包括SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个。
在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少96％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：10。
在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：27-32中的任何一个具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：27-32中的任何一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：27-32中的任何一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：27-32中的任何一个具有至少96％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：27-32中的任何一个具有至少97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：27-32中的任何一个具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：27-32中的任何一个具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：27-32中的任何一个。
在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少90％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少91％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少92％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ IDNO：130具有至少93％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少94％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少95％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少96％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少97％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少98％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少99％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域包括SEQ ID NO：130。在一些实施例中，Fc结构域包括SEQ ID NO：130并且y的范围为4至6。在一些实施例中，Fc结构域包括SEQ ID NO：130并且[E]y是[DSS]6。在一些实施例中，R包括SEQ ID NO：9并且[E]y是[DSS]6。
在一些实施例中，M包括一种或多种选自以下的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸和谷氨酸。在一些实施例中，M包括2个氨基酸。例如，M可以包括亮氨酸和赖氨酸。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸。通过另一个实例，M可以包括两个丙氨酸氨基酸。在其它实施例中，M包括三个氨基酸。
在一些实施例中，N包括一种或多种选自以下的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸和谷氨酸。在一些实施例中，N包括2个氨基酸(即，二氨基酸)。例如，N可以包括天冬氨酸和异亮氨酸。通过另一个实例，N可以包括两个丙氨酸氨基酸。在一些实施例中，N是天冬氨酸-异亮氨酸。在其它实施例中，N包括3个氨基酸。
在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少90％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少91％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少92％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少93％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少94％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少95％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少96％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少97％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少98％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ IDNO：130具有至少99％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc包括SEQ ID NO：130。
在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸并且N是天冬氨酸-异亮氨酸；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ IDNO：130具有至少90％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少91％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少92％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少93％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少94％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少95％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少96％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQID NO：130具有至少97％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少98％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少99％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸；N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc包括SEQ ID NO：130；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸；N是天冬氨酸-异亮氨酸；Fc包括SEQ ID NO：130；o、p和q各自是1；并且[A]与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少99％的同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸；N是天冬氨酸-异亮氨酸；Fc包括SEQ ID NO：130；o、p和q各自是1；并且[A]包括SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个。
在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸并且N是天冬氨酸-异亮氨酸；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少90％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少91％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少92％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少93％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少94％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少95％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少96％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少97％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少98％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少99％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc包括SEQ ID NO：130；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc包括SEQ ID NO：130；o、p、q和z各自是1；x是0；并且[A]与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少99％的同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc包括SEQ ID NO：130；o、p、q和z各自是1；x是0；并且[A]包括SEQID NO：12和33-43中的任何一个。
在一些实施例中，[R]包括与SEQ ID NO：9至少90％的同一性。在一些实施例中，[R]包括与SEQ ID NO：9至少95％的同一性。在一些实施例中，[R]包括与SEQ ID NO：9至少96％的同一性。在一些实施例中，[R]包括与SEQ ID NO：9至少97％的同一性。在一些实施例中，[R]包括与SEQ ID NO：9至少98％的同一性。在一些实施例中，[R]包括与SEQ ID NO：9至少99％的同一性。在一些实施例中，[R]包括SEQ ID NO：9。
在一些实施例中，D是包括四个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，所述四个氨基酸中的每个氨基酸相同。在其它实施例中，所述四个氨基酸中的三个氨基酸相同。在又其它实施例中，所述四个氨基酸中的两个氨基酸相同。在一些实施例中，所述四个氨基酸中的至少两个连续的氨基酸相同。在其它实施例中，所述四个氨基酸中的至少三个连续的氨基酸相同。在一些实施例中，所述四个氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸和谷氨酸。在一些实施例中，D包括4个氨基酸，并且x的范围为1至6。在一些实施例中，D包括4个氨基酸，并且x的范围为1至4。在一些实施例中，D包括4个氨基酸，并且x是1或2。在一些实施例中，D包括4个氨基酸，并且x是2。在一些实施例中，D包括4个氨基酸，并且x是1。在一些实施例中，D包括4个氨基酸，并且x是1或2并且q是0。在一些实施例中，D包括4个氨基酸，并且x是2并且q是0。在一些实施例中，D包括4个氨基酸，并且x是1并且q是0。在一些实施例中，D包括4个氨基酸，并且x是1并且q是1。
在一些实施例中，D是GGGS。在其它实施例中，D是GGSS。在又其它实施例中，D是GSSS。在另外的实施例中，D是GSGS。在一些实施例中，D是GGGS，并且x是范围为1至4的整数。在一些实施例中，D是GGGS，并且x是范围为1至3的整数。在一些实施例中，D是GGGS，并且x是1或2。在一些实施例中，D是GGGS，x是范围为1至4的整数，并且y是范围为1至8的整数。在一些实施例中，D是GGGS，x是范围为1至3的整数，并且y是范围为1至8的整数。在一些实施例中，D是GGGS，x是1或2，并且y是范围为1至8的整数。在一些实施例中，D是GGGS，x是1或2，并且y是范围为1至8的整数并且q是0。在一些实施例中，D是GGGS，x是1或2，y是范围为1至8的整数并且q是1。在一些实施例中，D是GGGS，x是1或2，y是范围为1至8的整数，q是1，并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。在一些实施例中，D是GGGS，x是2，y是范围为1至8的整数，q是1，并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。在一些实施例中，D是GGGS，z是1，x是2，y是范围为1至8的整数，q是1，并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。
在一些实施例中，D是包括五个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，所述五个氨基酸中的每个氨基酸相同。在一些实施例中，所述五个氨基酸中的四个氨基酸相同。在其它实施例中，所述五个氨基酸中的三个氨基酸相同。在其它实施例中，所述五个氨基酸中的两个氨基酸相同。在一些实施例中，所述五个氨基酸中的至少两个连续的氨基酸相同。在其它实施例中，所述五个氨基酸中的至少三个连续的氨基酸相同。在又其它实施例中，所述五个氨基酸中的至少四个连续的氨基酸相同。在一些实施例中，所述五个氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸和谷氨酸。在一些实施例中，D包括5个氨基酸，并且x的范围为1至6。在一些实施例中，D包括5个氨基酸，并且x的范围为1至4。在一些实施例中，D包括5个氨基酸，并且x是1或2。在一些实施例中，D包括5个氨基酸，并且x是1。在一些实施例中，D包括5个氨基酸，并且x是1并且q是0。在一些实施例中，D包括5个氨基酸，x是1并且q是1。在一些实施例中，D包括5个氨基酸，x是1并且q是1并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。
在一些实施例中，D是GGGGS。在其它实施例中，D是GGGSS。在又其它实施例中，D是GGSSS。在另外的实施例中，D是GGSGS。在甚至另外的实施例中，D是GGSGS。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且其中x是范围为1至4的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且其中x是范围为1至3的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且其中x是1或2。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且其中x是范围为1至4的整数，并且其中y是范围介于1与8之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且其中x是范围为1至3的整数，并且其中y是范围介于1与8之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且其中x是1或2，并且其中y是范围介于1与8之间的整数。
在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且其中x是范围为1至3的整数，E是-D-S-S-，并且其中y是范围介于1与8之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且其中x是1或2，E是-D-S-S-，并且其中y是范围介于1与8之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且其中x是范围为1至3的整数，E是天冬氨酸，并且其中y是范围介于8与12之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且其中x是1或2，E是天冬氨酸，并且其中y是10。在一些实施例中，D是GGGGS，并且其中x是1或2，E是天冬氨酸，并且其中y的范围为4至16。在一些实施例中，D是GGGGS，并且其中x是1或2，E是天冬氨酸，并且其中y的范围为8至12。在一些实施例中，D是GGGGS，并且其中x是1或2，E是天冬氨酸，并且其中y是10。在一些实施例中，D是GGGGS，并且其中x是1或2，E是天冬氨酸，并且其中y是10并且q是0。在一些实施例中，D是GGGGS，并且其中x是1或2，E是天冬氨酸，并且其中y是10并且q是1。在一些实施例中，D是GGGGS，并且其中x是1或2，E是天冬氨酸，并且其中y是10，并且q是1并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。
在一些实施例中，D是EAAAK。在一些实施例中，D是EAAAK，并且其中x是范围为2至5的整数。在其它实施例中，D是EAAAK，其中x是范围为1至4的整数。在又其它实施例中，D是EAAAK，其中x是范围为1至3的整数。在另外的实施例中，D是EAAAK，其中x是1或2。
在一些实施例中，D是F(G)tF，其中每个F是相同的氨基酸，G是具有3、4或5个氨基酸的氨基酸序列，并且t是范围为2至5的整数。在一些实施例中，每个F是丙氨酸。在一些实施例中，G是EAAAK。在一些实施例中，每个F是丙氨酸，G是EAAAK，并且t是2或3。在一些实施例中，每个F是丙氨酸，G是EAAAK，t是2或2，并且x是1或2。在一些实施例中，D是包括六个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，所述六个氨基酸中的每个氨基酸相同。在一些实施例中，所述六个氨基酸中的五个氨基酸相同。在一些实施例中，所述六个氨基酸中的四个氨基酸相同。在其它实施例中，所述六个氨基酸中的三个氨基酸相同。在又其它实施例中，所述六个氨基酸中的两个氨基酸相同。在一些实施例中，所述六个氨基酸中的至少两个连续的氨基酸相同。在其它实施例中，所述六个氨基酸中的至少三个连续的氨基酸相同。在又其它实施例中，所述六个氨基酸中的至少四个连续的氨基酸相同。在一些实施例中，所述六个氨基酸中的至少五个连续的氨基酸相同。在一些实施例中，所述六个氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸和谷氨酸。在一些实施例中，D包括6个氨基酸，并且x的范围为1至6。在一些实施例中，D包括6个氨基酸，并且x的范围为1至4。在一些实施例中，D包括6个氨基酸，并且x是1或2。在一些实施例中，D包括6个氨基酸，并且x是1。在一些实施例中，D包括6个氨基酸，并且x是1或2并且q是0。在一些实施例中，D包括6个氨基酸，并且x是1并且q是0。在一些实施例中，D包括6个氨基酸，并且x是1并且q是1。在一些实施例中，D包括6个氨基酸，并且x是1并且q是1并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。
在一些实施例中，E包括1个氨基酸。在一些实施例中，所述1个氨基酸选自天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸、酪氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、色氨酸、脯氨酸、精氨酸、谷氨酰胺。在其它实施例中，所述1个氨基酸选自天冬氨酸和丝氨酸。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y的范围为4至16。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y的范围为2至12。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y的范围为2至10。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y的范围为4至12。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y是10。
在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为4至12。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y是10。在一些实施例中，E是天冬氨酸，v+w是1，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是天冬氨酸，v+w是1，并且y的范围为4至12。在一些实施例中，E是天冬氨酸，v+w是1，并且y是10。在一些实施例中，E是天冬氨酸，v+w是1，x是0，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是天冬氨酸，v+w是1，x是0，并且y的范围为4至12。在一些实施例中，E是天冬氨酸，v+w是1，x是0，并且y是10。在一些实施例中，E是天冬氨酸，v+w是1，x是0，并且y是10并且q是1。
在一些实施例中，E包括2个氨基酸。在一些实施例中，所述2个氨基酸选自天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸、酪氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、色氨酸、脯氨酸、精氨酸、谷氨酰胺。在其它实施例中，所述2个氨基酸选自天冬氨酸和丝氨酸。在一些实施例中，E是-D-S-。在其它实施例中，E是-D-D-。在一些实施例中，E包括2个氨基酸，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E包括2个氨基酸，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E包括2个氨基酸，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E包括2个氨基酸，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E包括2个氨基酸，并且y的范围为1至6。在一些实施例中，E包括2个氨基酸，并且y的范围为1至4。在一些实施例中，E包括2个氨基酸，并且y是1或2。在一些实施例中，E包括2个氨基酸，并且y的范围为2至12。在一些实施例中，E包括2个氨基酸，并且y的范围为2至10。在一些实施例中，E包括2个氨基酸，并且y的范围为2至8。在一些实施例中，E包括2个氨基酸，并且y的范围为2至8并且q是0。
在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，并且y是10。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，v+w是1，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，y的范围为1至12。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，v+w是1，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，v+w是1，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，v+w是1，x是0，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，v+w是1，x是0，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，v+w是1，x是0，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，v+w是1，x是0，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，v+w是1，x是0，y的范围为1至8，并且z是1。
在一些实施例中，E包括3个氨基酸。在一些实施例中，所述3个氨基酸选自天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸、酪氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、色氨酸、脯氨酸、精氨酸、谷氨酰胺。在其它实施例中，所述3个氨基酸选自天冬氨酸和丝氨酸。在一些实施例中，E是-D-S-。在其它实施例中，E是-D-D-S-。在其它实施例中，E是-D-D-D。在其它实施例中，E是-D-S-S-。
在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为2至12。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为2至10。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为2至8。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至6。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为3至6。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为3至6并且q是0。
在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y是6，即，[E]y是[-DSS-]6。在其它实施例中，E是-D-S-S-，并且y是6并且z是1。在一些实施例中，E是-D-S-S-，y是6并且q是0。在其它实施例中，E是-D-S-S-，y是6，z是1，并且q是0。在其它实施例中，E是-D-S-S-，y是6，z是1，q是0，并且x是0。在其它实施例中，E是-D-S-S-，y是6，z是1，q是0，并且x是2。
在一些实施例中，E是-D-S-S-，y是6并且q是1。在其它实施例中，E是-D-S-S-，y是6，z是1，并且q是1。在其它实施例中，E是-D-S-S-，y是6，z是1，x是0，并且q是1。在其它实施例中，E是-D-S-S-，y是6，z是1，x是2，并且q是1。
在一些实施例中，E是-D-S-S-，y是6，q是1，并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。在一些实施例中，E是-D-S-S-，y是6，q是1，R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少99％的同一性。在一些实施例中，E是-D-S-S-，y是6，q是1，R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有同一性。在一些实施例中，E是-D-S-S-，y是6，q是1，R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，[A]与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少99％的同一性；并且[B]包括与SEQ ID NO：11至少99％的同一性。在一些实施例中，E是-D-S-S-，y是6，q是1，R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，[A]与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少99％的同一性；并且[B]包括SEQ ID NO：11。
在一些实施例中，E包括4个氨基酸。在一些实施例中，所述4个氨基酸选自天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸、酪氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、色氨酸、脯氨酸、精氨酸、谷氨酰胺。在其它实施例中，所述4个氨基酸选自天冬氨酸和丝氨酸。在一些实施例中，E是-D-D-S-S-。在其它实施例中，E是-D-D-D-S-。在其它实施例中，E是-D-D-D-D-。在其它实施例中，E是-D-D-S-S-。在其它实施例中，E是-D-S-S-S-。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为1至6。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为1至4。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y是1或2。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为2至12。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为2至10。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为2至8。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为2至8并且q是0。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为2至8。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为2至8并且q是1。
在一些实施例中，E包括5个或更多个氨基酸。在一些实施例中，所述5个或更多个氨基酸选自天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸、酪氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、色氨酸、脯氨酸、精氨酸、谷氨酰胺。在其它实施例中，所述5个或更多个氨基酸选自天冬氨酸和丝氨酸。在其它实施例中，E包括5个氨基酸。例如，E可以是-D-D-S-S-D-或-D-D-S-S-D-。在其它实施例中，E包括6个氨基酸。例如，E可以是-D-D-S-S-D-D-。在其它实施例中，E包括7个氨基酸。例如，E可以是-S-D-D-S-S-D-D-。通过另一个实例，E可以是KRRTPVR。通过又另一个实例，E可以是KNFQSRS。通过另外的实例，E可以是KTYASMQ。在其它实施例中，E包括8个氨基酸。例如，E可以是-S-D-D-S-S-D-D-S-。通过另一个实例，E可以是KRRTPVRE。通过又另一个实例，E可以是KNFQSRSH。通过另外的实例，E可以是KTYASMQW。
在一些实施例中，q是0。在一些实施例中，q是0，并且x至少是1。在其它实施例中，q是0并且y至少是4。在其它实施例中，q是0并且y是6。
在一些实施例中，z是范围为1至6的整数。在其它实施例中，z是范围为1至4的整数。在又其它实施例中，z是范围为1至3的整数。在另外的实施例中，z是1或2。在甚至另外的实施例中，z是1。在甚至另外的实施例中，z是1；并且q是0并且y是6。在甚至另外的实施例中，z是1；并且q是1并且y是6。
在一些实施例中，q是0。在一些实施例中，q是0并且[E]y是[DSS]6。
在一些实施例中，本公开提供了一种多肽，其具有式(IA)：
[A]v-[B]-[C]w-[R]q-([D]x-[E]y)z， (IA)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括编码碱性磷酸酶的氨基酸；
C包括编码GPI锚的氨基酸序列；
R是-(Mo(Fc)Np)-，其中M和N各自独立地包含1至6个氨基酸，其中Fc是Fc结构域，并且o和p各自独立地是0、1或2；
D包括具有4至6个氨基酸的氨基酸序列，或者是F(G)tF，其中每个F是相同的氨基酸，G是具有3、4或5个氨基酸的氨基酸序列，并且t是范围为2至5的整数；
E包括具有1至8个氨基酸的氨基酸序列；
q是0或1；
v是0或1；
w是0或1；
x是0或范围为1至6的整数；
y是0或范围为1至16的整数；并且
z是0或范围为1至6的整数；
条件是所述式(IA)的多肽不具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或不包括由SEQ IDNO：107的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或条件是式(IA)多肽不是或阿司福酶α(Asfotase alfa)。
例如，在一些实施例中，式(IA)多肽具有与SEQ ID NO：1相比具有99％或更少同一性的氨基酸序列。通过另一个实例，在一些实施例中，式(IA)多肽具有与SEQ ID NO：1相比具有98％或更少同一性的氨基酸序列。通过另一个实例，在一些实施例中，式(IA)多肽具有与SEQ ID NO：1相比具有97％或更少同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，式(1A)多肽具有与SEQ ID NO：1相比具有96％或更少同一性的氨基酸序列。在其它实施例中，式(IA)多肽具有与SEQ ID NO：1相比具有95％或更少同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述式(IA)多肽由与SEQ ID NO：107具有小于99％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述式(IA)多肽由与SEQ ID NO：107具有小于98％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述式(1A)多肽由与SEQ ID NO：107具有小于97％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述式(IA)多肽由与SEQ ID NO：107具有小于96％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，所述式(IA)多肽由与SEQ ID NO：107具有小于95％同一性的核苷酸序列编码。
在一些实施例中，当v是1，w是0，q是1，o是1，p是1，N是二氨基酸-D-I-，M是二氨基酸-L-K-，[B]包括SEQ ID NO：11，Fc包括SEQ ID NO：130并且x是0时，那么[E]y不是D10-D16。在一些实施例中，当v是1，w是0，q是1，o是1，p是1，N是二氨基酸-D-I-，M是二氨基酸-L-K-，[B]包括SEQ ID NO：11，Fc包括SEQ ID NO：130并且x是0时，那么[E]y不包括十至十六个连续天冬氨酸残基。
在一些实施例中，式(IA)多肽未与葡聚糖缀合。
在一些实施例中，式(IA)多肽有在骨中形成羟基磷灰石晶体的催化能力。
在一些实施例中，编码碱性磷酸酶(“[B]”)的氨基酸是组织非特异性碱性磷酸酶。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约85％的同一性。在其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约90％的同一性。在其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约91％的同一性。在其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约92％的同一性。在其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约93％的同一性。在其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约94％的同一性。
在又其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约95％的同一性。在另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约96％的同一性。在甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约97％的同一性。在又甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约98％的同一性。在又甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性。在又甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQID NO：11具有至少约99％的同一性并且q是0。在又甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性并且q是1。
在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11并且q是0。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11并且q是1。
在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，如包括一个或多个氨基酸取代的变体。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体具有单个氨基酸取代。例如，SEQ ID NO：11的变体可以包括C102S取代。通过另一个实例，SEQ ID NO：11的变体可以包括E434G取代。通过又另一个实例，SEQ IDNO：11的变体可以包括A321H取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ IDNO：11的变体，所述变体具有两个氨基酸取代。例如，SEQ ID NO：11的变体可以包括C102S取代、E434G取代或A321H取代中的任何两个，例如A321H取代和E434G取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体具有三个氨基酸取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体具有四个氨基酸取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体具有五个氨基酸取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体具有六个氨基酸取代。
在一些实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少90％的序列同一性。在其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少95％的序列同一性。在又其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少96％的序列同一性。在另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少97％的序列同一性。在又另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少98％的序列同一性。在甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少99％的序列同一性。在又甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQID NO：12。在又甚至其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：12，并且其中[D]x是[-GGGGS-]2。在又甚至其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：12，并且其中[E]y是[-DSS-]6。在又甚至其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ IDNO：12；[E]y是[-DSS-]6，并且q是0。在又甚至其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：12；[E]y是[-DSS-]6，并且q是1。
在一些实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少90％的序列同一性。在其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少95％的序列同一性。在又其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少96％的序列同一性。在另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少97％的序列同一性。在又另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少98％的序列同一性。在甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少99％的序列同一性。在又甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：33-43中的任何一个。在又甚至其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：33-43中的任何一个，并且其中[E]y是[-DSS-]6。在又甚至其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：33-43中的任何一个，[E]y是[-DSS-]6，并且q是0。在又甚至其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：33-43中的任何一个，[E]y是[-DSS-]6，并且q是1。
在一些实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：13具有至少90％的序列同一性。在其它实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：13具有至少95％的序列同一性。在又其它实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：13具有至少96％的序列同一性。在另外的实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：13具有至少97％的序列同一性。在又另外的实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：13具有至少98％的序列同一性。在甚至另外的实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：13具有至少99％的序列同一性。在又甚至另外的实施例中，编码GPI锚的氨基酸包括SEQ ID NO：13。在又甚至其它实施例中，编码GPI锚的氨基酸包括SEQ ID NO：13，并且其中[E]y是[-DSS-]6。在又甚至其它实施例中，编码GPI锚的氨基酸包括SEQ ID NO：13；[E]y是[-DSS-]6，并且q是0。在又甚至其它实施例中，编码GPI锚的氨基酸包括SEQ ID NO：13；[E]y是[-DSS-]6，并且q是1。
在一些实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：14具有至少90％的序列同一性。在其它实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：14具有至少95％的序列同一性。在又其它实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：14具有至少96％的序列同一性。在另外的实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：14具有至少97％的序列同一性。在又另外的实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：14具有至少98％的序列同一性。在甚至另外的实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：14具有至少99％的序列同一性。在又甚至另外的实施例中，编码GPI锚的氨基酸包括SEQ ID NO：14。在又甚至其它实施例中，编码GPI锚的氨基酸包括SEQ ID NO：14，并且其中[E]y是[-DSS-]6。在又甚至其它实施例中，编码GPI锚的氨基酸包括SEQ ID NO：14；[E]y是[-DSS-]6，并且q是0。在又甚至其它实施例中，编码GPI锚的氨基酸包括SEQ ID NO：14；[E]y是[-DSS-]6，并且q是1。
在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，并且编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ IDNO：11具有至少约90％的同一性。在其它实施例中，v或w中的至少一个是0，并且编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约95％的同一性。在另外的实施例中，v或w中的至少一个是0，并且编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约96％的同一性。在甚至另外的实施例中，v或w中的至少一个是0，并且编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约97％的同一性。在又甚至另外的实施例中，v或w中的至少一个是0，并且编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约98％的同一性。在又甚至另外的实施例中，v或w中的至少一个是0，并且编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性。在其它实施例中，v或w中的至少一个是0，并且编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ IDNO：11。
在一些实施例中，v或w中的至少一个是0；q是0；并且编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0；q是0；[E]y是[DSS]6；并且编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11。
在一些实施例中，v或w中的至少一个是0；q是1；[E]y是[DSS]6；并且编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0；q是1；[E]y是[DSS]6；并且编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11；并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个至少99％的同一性。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0；q是1；[E]y是[DSS]6；编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11；并且[A]包括SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个。
在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约90％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约95％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约96％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约97％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约98％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12。
在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ IDNO：11，并且x+y＝8至12并且q是0。
在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ IDNO：11，并且x+y＝8至12并且q是1。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少97％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括具有SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个的氨基酸序列。
在一些实施例中，v是1，并且w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约90％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v是1，并且w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约95％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v是1，并且w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约96％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v是1，并且w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约97％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v是1，并且w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约98％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v是1，并且w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v是1，并且w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，v是1，并且w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQID NO：11，并且x+y＝8至12并且q是1。
在一些实施例中，v是1，并且w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12并且q是0。
在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约95％的同一性，x+y＝8至12，并且其中x和y均至少是1。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约97％的同一性，x+y＝8至12，并且其中x和y均至少是1。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性，x+y＝8至12，并且其中x和y均至少是1。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性，x+y＝8至12，其中x和y均至少是1；并且q是0。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性，x+y＝8至12，其中x和y均至少是1；并且q是1。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性，并且x+y＝8至12，其中x和y均至少是1；q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。
在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约90％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约95％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，v或w中的至少一个是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸具有SEQ ID NO：11，并且x+y＝4至8。
在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约90％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约95％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约96％的同一性，并且其中x+y＝4至8。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约97％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ IDNO：11具有至少约98％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝4至8。
在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，x+y＝4至8并且q是0。
在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，x+y＝4至8并且q是1。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，x+y＝4至8，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，x+y＝5至7，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，x+y＝6，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，x+y＝6，q是1；R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，x+y＝6，q是1；R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，x+y＝6，q是1；R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少97％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，x+y＝6，并且q是1；R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，x+y＝6，q是1；R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，v是1，w是0，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，x+y＝6，q是1；R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个。
在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少96％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：10。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少97％同一性的氨基酸序列；并且其中[E]y是[-DSS-]6。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少98％同一性的氨基酸序列；并且其中[E]y是[-DSS-]6。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少99％同一性的氨基酸序列；并且其中[E]y是[-DSS-]6。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：10；并且其中[E]y是[-DSS-]6。
在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：27-32中的任何一个具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：27-32中的任何一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：27-32中的任何一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：27-32中的任何一个具有至少96％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：27-32中的任何一个具有至少97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：27-32中的任何一个具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：27-32中的任何一个具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：27-32中的任何一个。
在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10和27-32中的任何一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中x+y为4至8。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10和27-32中的任何一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且其中x+y为4至8。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10和27-32中的任何一个具有至少96％序列同一性的氨基酸序列，并且其中x+y为4至8。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10和27-32中的任何一个具有至少97％序列同一性的氨基酸序列，并且其中x+y为4至8。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10和27-32中的任何一个具有至少98％序列同一性的氨基酸序列，并且其中x+y为4至8。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10和27-32中的任何一个具有至少99％序列同一性的氨基酸序列，并且其中x+y为4至8。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：10和27-32中的任何一个，并且其中x+y为4至8。
在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQ IDNO：10和27-32中的任何一个；其中x+y为4至8；并且其中q是0。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：10和27-32中的任何一个；其中x+y为4至8；并且其中q是0并且z是1。
在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQ IDNO：10和27-32中的任何一个；其中x+y为4至8；并且其中q是1。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：10和27-32中的任何一个；其中x+y为4至8；并且其中q是1并且z是1。
在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：27-32中的任何一个具有至少97％序列同一性的氨基酸序列；并且其中[E]y是[-DSS-]6。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：27-32中的任何一个具有至少98％序列同一性的氨基酸序列；并且其中[E]y是[-DSS-]6。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：27-32中的任何一个具有至少99％序列同一性的氨基酸序列；并且其中[E]y是[-DSS-]6。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：27-32中的任何一个，并且其中[E]y是[-DSS-]6。
在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10和27-32中的任何一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且其中x+y为8至12。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10和27-32中的任何一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且其中x+y为8至12。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10和27-32中的任何一个具有至少96％序列同一性的氨基酸序列，并且其中x+y为8至12。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10和27-32中的任何一个具有至少97％序列同一性的氨基酸序列，并且其中x+y为8至12。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10和27-32中的任何一个具有至少98％序列同一性的氨基酸序列，并且其中x+y为8至12。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10和27-32中的任何一个具有至少99％序列同一性的氨基酸序列，并且其中x+y为8至12。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：10和27-32中的任何一个，并且其中x+y为8至12。
在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQ IDNO：10和27-32中的任何一个，其中x+y为8至12，并且其中q是0。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：10和27-32中的任何一个，其中x+y为8至12，并且其中q是0并且z是1。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：10和27-32中的任何一个，其中x+y为8至12，并且其中q是1。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：10和27-32中的任何一个，其中x+y为8至12，并且其中q是1并且z是1。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：10和27-32中的任何一个，其中x+y为8至12，其中q是1，z是1，并且[E]y是[-DSS-]6。在一些实施例中，[A]v-[B]-[C]w包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO：10和27-32中的任何一个，其中x+y为8至12，并且其中q是1，z是1，并且[E]y是[-D-]10。
在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少90％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少91％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少92％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ IDNO：130具有至少93％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少94％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少95％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少96％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少97％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少98％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少99％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域包括SEQ ID NO：130。在一些实施例中，Fc结构域包括SEQ ID NO：130并且y的范围为4至6。在一些实施例中，Fc结构域包括SEQ ID NO：130并且[E]y是[DSS]6。在一些实施例中，R包括SEQ ID NO：9并且[E]y是[DSS]6。
在一些实施例中，M包括一种或多种选自以下的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸和谷氨酸。在一些实施例中，M包括2个氨基酸。例如，M可以包括亮氨酸和赖氨酸。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸。通过另一个实例，M可以包括两个丙氨酸氨基酸。在其它实施例中，M包括三个氨基酸。
在一些实施例中，N包括一种或多种选自以下的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸和谷氨酸。在一些实施例中，N包括2个氨基酸(即，二氨基酸)。例如，N可以包括天冬氨酸和异亮氨酸。通过另一个实例，N可以包括两个丙氨酸氨基酸。在一些实施例中，N是天冬氨酸-异亮氨酸。在其它实施例中，N包括3个氨基酸。
在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少90％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少91％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少92％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少93％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少94％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少95％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少96％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少97％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少98％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ IDNO：130具有至少99％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc包括SEQ ID NO：130。
在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸并且N是天冬氨酸-异亮氨酸；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ IDNO：130具有至少90％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少91％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少92％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少93％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少94％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少95％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少96％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQID NO：130具有至少97％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少98％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少99％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸；N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc包括SEQ ID NO：130；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸；N是天冬氨酸-异亮氨酸；Fc包括SEQ ID NO：130；o、p和q各自是1；并且[A]与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少99％的同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸；N是天冬氨酸-异亮氨酸；Fc包括SEQ ID NO：130；o、p和q各自是1；并且[A]包括SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个。
在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸并且N是天冬氨酸-异亮氨酸；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少90％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少91％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少92％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少93％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少94％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少95％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少96％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少97％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少98％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少99％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc包括SEQ ID NO：130；o、p、q和z各自是1；并且x是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc包括SEQ ID NO：130；o、p、q和z各自是1；x是0；并且[A]与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少99％的同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc包括SEQ ID NO：130；o、p、q和z各自是1；x是0；并且[A]包括SEQID NO：12和33-43中的任何一个。
在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸并且N是天冬氨酸-异亮氨酸；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是4至8。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少90％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是4至8。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ IDNO：130具有至少91％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是4至8。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少92％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是4至8。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少93％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是4至8。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少94％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是4至8。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少95％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是4至8。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少96％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是4至8。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少97％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是4至8。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少98％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是4至8。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少99％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是4至8。
在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc包括SEQ ID NO：130；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是4至8。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc包括SEQ ID NO：130；o、p、q和z各自是1；x是0；y是4至8；并且v或w中的至少一个是0。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc包括SEQ ID NO：130；o、p、q和z各自是1；x是0；y是4至8；并且v或w中的至少一个是0；并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个至少99％的同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc包括SEQ ID NO：130；o、p、q和z各自是1；x是0；y是4至8；并且v或w中的至少一个是0；并且[A]包括SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个。
在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸并且N是天冬氨酸-异亮氨酸；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是6。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少90％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是6。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少91％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是6。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少92％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是6。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少93％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是6。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少94％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是6。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少95％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是6。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少96％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是6。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少97％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是6。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少98％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是6。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少99％的序列同一性；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是6。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc包括SEQ ID NO：130；o、p、q和z各自是1；x是0；并且y是6。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc包括SEQ ID NO：130；o、p、q和z各自是1；x是0；y是6；并且编码碱性磷酸酶的氨基酸包括与SEQ ID NO：11至少99％的同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc包括SEQ ID NO：130；o、p、q和z各自是1；x是0；y是6；并且编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc包括SEQ ID NO：130；o、p、q和z各自是1；x是0；y是6；并且编码碱性磷酸酶的氨基酸包括与SEQ ID NO：11相比一个或多个氨基酸取代。
在一些实施例中，D是包括四个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，所述四个氨基酸中的每个氨基酸相同。在其它实施例中，所述四个氨基酸中的三个氨基酸相同。在又其它实施例中，所述四个氨基酸中的两个氨基酸相同。在一些实施例中，所述四个氨基酸中的至少两个连续的氨基酸相同。在其它实施例中，所述四个氨基酸中的至少三个连续的氨基酸相同。在一些实施例中，所述四个氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸和谷氨酸。在一些实施例中，D包括4个氨基酸，并且x的范围为1至6。在一些实施例中，D包括4个氨基酸，并且x的范围为1至4。在一些实施例中，D包括4个氨基酸，并且x是1或2。在一些实施例中，D包括4个氨基酸，并且x是2。在一些实施例中，D包括4个氨基酸，并且x是1。在一些实施例中，D包括4个氨基酸，并且x是1或2并且q是0。在一些实施例中，D包括4个氨基酸，并且x是2并且q是0。在一些实施例中，D包括4个氨基酸，并且x是1并且q是0。在一些实施例中，D包括4个氨基酸，并且x是1并且q是1。
在一些实施例中，D是GGGS。在其它实施例中，D是GGSS。在又其它实施例中，D是GSSS。在另外的实施例中，D是GSGS。在一些实施例中，D是GGGS，并且x是范围为1至4的整数。在一些实施例中，D是GGGS，并且x是范围为1至3的整数。在一些实施例中，D是GGGS，并且x是1或2。在一些实施例中，D是GGGS，x是范围为1至4的整数，并且y是范围为1至8的整数。在一些实施例中，D是GGGS，x是范围为1至3的整数，并且y是范围为1至8的整数。在一些实施例中，D是GGGS，x是1或2，并且y是范围为1至8的整数。在一些实施例中，D是GGGS，x是1或2，并且y是范围为1至8的整数并且q是0。在一些实施例中，D是GGGS，x是1或2，y是范围为1至8的整数并且q是1。在一些实施例中，D是GGGS，x是1或2，y是范围为1至8的整数，q是1，并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。在一些实施例中，D是GGGS，x是2，y是范围为1至8的整数，q是1，并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。在一些实施例中，D是GGGS，z是1，x是2，y是范围为1至8的整数，q是1，并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。
在一些实施例中，D是GGGS或GGSS，并且其中x是范围为1至3的整数，E是-D-S-S-，并且其中y是范围介于1与8之间的整数。在一些实施例中，D是GGGS或GGSS，并且其中x是1或2，E是-D-S-S-，并且其中y是范围介于1与8之间的整数。在一些实施例中，D是GGGS或GGSS，并且其中x是范围为1至3的整数，E是天冬氨酸，并且其中y是范围介于8与12之间的整数。在一些实施例中，D是GGGS或GGSS，并且其中x是1或2，E是天冬氨酸，并且其中y是10。在一些实施例中，D是GGGS或GGSS，并且其中x是2，E是天冬氨酸，并且其中y是10。在一些实施例中，D是GGGS，并且其中x是2，E是天冬氨酸，并且其中y是范围为4至16的整数。在一些实施例中，D是GGGS，并且其中x是2，E是天冬氨酸，并且其中y是范围为4至12的整数。在一些实施例中，D是GGGS，并且其中x是2，E是天冬氨酸，并且其中y是10。在一些实施例中，D是GGGS，并且其中x是2，E是天冬氨酸，并且其中y是10并且q是0。在一些实施例中，D是GGGS，并且其中x是2，E是天冬氨酸，其中y是10并且q是1。在一些实施例中，D是GGGS，x是2，E是天冬氨酸，其中y是10，并且q是1并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。
在一些实施例中，D是包括五个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，所述五个氨基酸中的每个氨基酸相同。在一些实施例中，所述五个氨基酸中的四个氨基酸相同。在其它实施例中，所述五个氨基酸中的三个氨基酸相同。在其它实施例中，所述五个氨基酸中的两个氨基酸相同。在一些实施例中，所述五个氨基酸中的至少两个连续的氨基酸相同。在其它实施例中，所述五个氨基酸中的至少三个连续的氨基酸相同。在又其它实施例中，所述五个氨基酸中的至少四个连续的氨基酸相同。在一些实施例中，所述五个氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸和谷氨酸。在一些实施例中，D包括5个氨基酸，并且x的范围为1至6。在一些实施例中，D包括5个氨基酸，并且x的范围为1至4。在一些实施例中，D包括5个氨基酸，并且x是1或2。在一些实施例中，D包括5个氨基酸，并且x是1。在一些实施例中，D包括5个氨基酸，并且x是1并且q是0。在一些实施例中，D包括5个氨基酸，x是1并且q是1。在一些实施例中，D包括5个氨基酸，x是1并且q是1并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。
在一些实施例中，D是GGGGS。在其它实施例中，D是GGGSS。在又其它实施例中，D是GGSSS。在另外的实施例中，D是GGSGS。在甚至另外的实施例中，D是GGSGS。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且其中x是范围为1至4的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且其中x是范围为1至3的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且其中x是1或2。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且其中x是范围为1至4的整数，并且其中y是范围介于1与8之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且其中x是范围为1至3的整数，并且其中y是范围介于1与8之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且其中x是1或2，并且其中y是范围介于1与8之间的整数。
在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且其中x是范围为1至3的整数，E是-D-S-S-，并且其中y是范围介于1与8之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且其中x是1或2，E是-D-S-S-，并且其中y是范围介于1与8之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且其中x是范围为1至3的整数，E是天冬氨酸，并且其中y是范围介于8与12之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且其中x是1或2，E是天冬氨酸，并且其中y是10。在一些实施例中，D是GGGGS，并且其中x是1或2，E是天冬氨酸，并且其中y的范围为4至16。在一些实施例中，D是GGGGS，并且其中x是1或2，E是天冬氨酸，并且其中y的范围为8至12。在一些实施例中，D是GGGGS，并且其中x是1或2，E是天冬氨酸，并且其中y是10。在一些实施例中，D是GGGGS，并且其中x是1或2，E是天冬氨酸，并且其中y是10并且q是0。在一些实施例中，D是GGGGS，并且其中x是1或2，E是天冬氨酸，并且其中y是10并且q是1。在一些实施例中，D是GGGGS，并且其中x是1或2，E是天冬氨酸，并且其中y是10，并且q是1并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。
在一些实施例中，D是EAAAK。在一些实施例中，D是EAAAK，并且其中x是范围为2至5的整数。在其它实施例中，D是EAAAK，其中x是范围为1至4的整数。在又其它实施例中，D是EAAAK，其中x是范围为1至3的整数。在另外的实施例中，D是EAAAK，其中x是1或2。
在一些实施例中，D是F(G)tF，其中每个F是相同的氨基酸，G是具有3、4或5个氨基酸的氨基酸序列，并且t是范围为2至5的整数。在一些实施例中，每个F是丙氨酸。在一些实施例中，G是EAAAK。在一些实施例中，每个F是丙氨酸，G是EAAAK，并且t是2或3。在一些实施例中，每个F是丙氨酸，G是EAAAK，t是2或2，并且x是1或2。在一些实施例中，D是包括六个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，所述六个氨基酸中的每个氨基酸相同。在一些实施例中，所述六个氨基酸中的五个氨基酸相同。在一些实施例中，所述六个氨基酸中的四个氨基酸相同。在其它实施例中，所述六个氨基酸中的三个氨基酸相同。在又其它实施例中，所述六个氨基酸中的两个氨基酸相同。在一些实施例中，所述六个氨基酸中的至少两个连续的氨基酸相同。在其它实施例中，所述六个氨基酸中的至少三个连续的氨基酸相同。在又其它实施例中，所述六个氨基酸中的至少四个连续的氨基酸相同。在一些实施例中，所述六个氨基酸中的至少五个连续的氨基酸相同。在一些实施例中，所述六个氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸和谷氨酸。在一些实施例中，D包括6个氨基酸，并且x的范围为1至6。在一些实施例中，D包括6个氨基酸，并且x的范围为1至4。在一些实施例中，D包括6个氨基酸，并且x是1或2。在一些实施例中，D包括6个氨基酸，并且x是1。在一些实施例中，D包括6个氨基酸，并且x是1或2并且q是0。在一些实施例中，D包括6个氨基酸，并且x是1并且q是0。在一些实施例中，D包括6个氨基酸，并且x是1并且q是1。在一些实施例中，D包括6个氨基酸，并且x是1并且q是1并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。
在一些实施例中，D是GGGGGS。在其它实施例中，D是GGGGSS。在又其它实施例中，D是GGGSSS。在另外的实施例中，D是GGGSGS。在甚至另外的实施例中，D是GGSGGS。在又甚至另外的实施例中，D是GGGSGS。
在一些实施例中，D是R-GGGGS或R-GGGSS，其中R是选自以下的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸和谷氨酸，并且其中x是范围为1至4的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，其中R是选自以下的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸和谷氨酸，并且其中x是范围为1至3的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，其中R是选自以下的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸和谷氨酸，并且其中x是1或2。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，其中R是选自以下的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸和谷氨酸，并且其中x是范围为1至4的整数，并且其中y是范围介于1与8之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，其中R是选自以下的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸和谷氨酸，并且其中x是范围为1至3的整数，并且其中y是范围介于1与8之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，其中R是选自以下的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸和谷氨酸，并且其中x是1或2，并且其中y是范围介于1与8之间的整数。
在一些实施例中，D是R-GGGGS或R-GGGSS，其中R是选自以下的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸和谷氨酸，并且其中x是范围为1至3的整数，E是-D-S-S-，并且其中y是范围介于1与8之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，其中R是选自以下的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸和谷氨酸，并且其中x是1或2，E是-D-S-S-，并且其中y是范围介于1与8之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，其中R是选自以下的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸和谷氨酸，并且其中x是范围为1至3的整数，E是天冬氨酸，并且其中y是范围介于8与12之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，其中R是选自以下的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸和谷氨酸，并且其中x是1或2，E是天冬氨酸，并且其中y是10。
在一些实施例中，E包括1个氨基酸。在一些实施例中，所述1个氨基酸选自天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸、酪氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、色氨酸、脯氨酸、精氨酸、谷氨酰胺。在其它实施例中，所述1个氨基酸选自天冬氨酸和丝氨酸。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y的范围为4至16。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y的范围为2至12。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y的范围为2至10。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y的范围为4至12。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y是10。
在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为4至12。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y是10。在一些实施例中，E是天冬氨酸，v+w是1，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是天冬氨酸，v+w是1，并且y的范围为4至12。在一些实施例中，E是天冬氨酸，v+w是1，并且y是10。在一些实施例中，E是天冬氨酸，v+w是1，x是0，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是天冬氨酸，v+w是1，x是0，并且y的范围为4至12。在一些实施例中，E是天冬氨酸，v+w是1，x是0，并且y是10。在一些实施例中，E是天冬氨酸，v+w是1，x是0，并且y是10并且q是1。
在一些实施例中，E是天冬氨酸，v+w是1，x是0，并且y是10并且q是0。在一些实施例中，E是天冬氨酸，v+w是1，x是0，并且y大于16并且q是1。在一些实施例中，E是天冬氨酸，v+w是1，x是0，并且y小于10并且q是1。
在一些实施例中，E包括2个氨基酸。在一些实施例中，所述2个氨基酸选自天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸、酪氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、色氨酸、脯氨酸、精氨酸、谷氨酰胺。在其它实施例中，所述2个氨基酸选自天冬氨酸和丝氨酸。在一些实施例中，E是-D-S-。在其它实施例中，E是-D-D-。在一些实施例中，E包括2个氨基酸，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E包括2个氨基酸，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E包括2个氨基酸，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E包括2个氨基酸，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E包括2个氨基酸，并且y的范围为1至6。在一些实施例中，E包括2个氨基酸，并且y的范围为1至4。在一些实施例中，E包括2个氨基酸，并且y是1或2。在一些实施例中，E包括2个氨基酸，并且y的范围为2至12。在一些实施例中，E包括2个氨基酸，并且y的范围为2至10。在一些实施例中，E包括2个氨基酸，并且y的范围为2至8。在一些实施例中，E包括2个氨基酸，并且y的范围为2至8并且q是0。
在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，并且y是10。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，v+w是1，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，y的范围为1至12。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，v+w是1，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，v+w是1，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，v+w是1，x是0，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，v+w是1，x是0，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，v+w是1，x是0，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，v+w是1，x是0，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，v+w是1，x是0，y的范围为1至8，并且z是1。
在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，v+w是1，x是0，y的范围为1至8，并且q是0。在一些实施例中，E是-D-D-或-D-S-，v+w是1，x是0，y的范围为1至8，q是0，并且z是1。
在一些实施例中，E包括3个氨基酸。在一些实施例中，所述3个氨基酸选自天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸、酪氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、色氨酸、脯氨酸、精氨酸、谷氨酰胺。在其它实施例中，所述3个氨基酸选自天冬氨酸和丝氨酸。在一些实施例中，E是-D-S-S-。在其它实施例中，E是-D-D-S-。在其它实施例中，E是-D-D-D。在其它实施例中，E是-D-S-S-。
在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为2至12。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为2至10。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为2至8。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至6。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为3至6。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为3至6并且q是0。
在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y是6，即，[E]y是[-DSS-]6。在其它实施例中，E是-D-S-S-，并且y是6并且z是1。在一些实施例中，E是-D-S-S-，y是6并且q是0。在其它实施例中，E是-D-S-S-，y是6，z是1，并且q是0。在其它实施例中，E是-D-S-S-，y是6，z是1，q是0，并且x是0。在其它实施例中，E是-D-S-S-，y是6，z是1，q是0，并且x是2。
在一些实施例中，E是-D-S-S-，y是6并且q是1。在其它实施例中，E是-D-S-S-，y是6，z是1，并且q是1。在其它实施例中，E是-D-S-S-，y是6，z是1，x是0，并且q是1。在其它实施例中，E是-D-S-S-，y是6，z是1，x是2，并且q是1。
在一些实施例中，E是-D-S-S-，y是6，q是1，并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。在一些实施例中，E是-D-S-S-，y是6，q是1，R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少99％的同一性。在一些实施例中，E是-D-S-S-，y是6，q是1，R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有同一性。在一些实施例中，E是-D-S-S-，y是6，q是1，R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，[A]与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少99％的同一性；并且[B]包括与SEQ ID NO：11至少99％的同一性。在一些实施例中，E是-D-S-S-，y是6，q是1，R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，[A]与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少99％的同一性；并且[B]包括SEQ ID NO：11。
在一些实施例中，E是-D-S-S-，v+w是1，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是-D-S-S-，y的范围为1至12。在一些实施例中，E是-D-S-S-，v+w是1，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E是-D-S-S-，v+w是1，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E是-D-S-S-，v+w是1，并且y是6。在一些实施例中，E是-D-S-S-，v+w是1，x是0，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是-D-S-S-，v+w是1，x是0，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E是-D-S-S-，v+w是1，x是0，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E是-D-S-S-，v+w是1，x是0，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E是-D-S-S-，v+w是1，x是0，并且y是6。在一些实施例中，E是-D-S-S-，v+w是1，x是0，并且y是6并且q是0。在一些实施例中，E是-D-S-S-，v+w是1，x是0，并且y是6。在一些实施例中，E是-D-S-S-，v+w是1，x是0，并且y是6并且q是1。在一些实施例中，E是-D-S-S-，v+w是1，x是0，并且y是6。在一些实施例中，E是-D-S-S-，v+w是1，x是0，y是6，q是1，并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。在一些实施例中，E是-D-S-S-，v+w是1，x是0，y是6，q是1，R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少99％的同一性。在一些实施例中，E是-D-S-S-，v+w是1，x是0，y是6，q是1，R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个。在一些实施例中，多肽未与葡聚糖缀合。
在一些实施例中，E包括4个氨基酸。在一些实施例中，所述4个氨基酸选自天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸、酪氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、色氨酸、脯氨酸、精氨酸、谷氨酰胺。在其它实施例中，所述4个氨基酸选自天冬氨酸和丝氨酸。在一些实施例中，E是-D-D-S-S-。在其它实施例中，E是-D-D-D-S-。在其它实施例中，E是-D-D-D-D-。在其它实施例中，E是-D-D-S-S-。在其它实施例中，E是-D-S-S-S-。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为1至6。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为1至4。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y是1或2。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为2至12。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为2至10。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为2至8。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为2至8并且q是0。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为2至8。在一些实施例中，E包括4个氨基酸，并且y的范围为2至8并且q是1。
在一些实施例中，E是-D-D-S-S-，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是-D-D-S-S-，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E是-D-D-S-S-，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E是-D-D-S-S-，并且y是10。在一些实施例中，E是-D-D-S-S-，v+w是1，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是-D-D-S-S-，y的范围为1至12。在一些实施例中，E是-D-D-S-S-，v+w是1，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E是-D-D-S-S-，v+w是1，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E是-D-D-S-S-，v+w是1，x是0，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是-D-D-S-S-，v+w是1，x是0，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E是-D-D-S-S-，v+w是1，x是0，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E是-D-D-S-S-，v+w是1，x是0，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E是-D-D-S-S-，v+w是1，x是0，并且y的范围为1至8，并且q是0。在一些实施例中，E是-D-D-S-S-，v+w是1，x是0，并且y的范围为1至8并且q是1。
在一些实施例中，E包括5个或更多个氨基酸。在一些实施例中，所述5个或更多个氨基酸选自天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸、酪氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、色氨酸、脯氨酸、精氨酸、谷氨酰胺。在其它实施例中，所述5个或更多个氨基酸选自天冬氨酸和丝氨酸。在其它实施例中，E包括5个氨基酸。例如，E可以是-D-D-S-S-D-或-D-D-S-S-D-。在其它实施例中，E包括6个氨基酸。例如，E可以是-D-D-S-S-D-D-。在其它实施例中，E包括7个氨基酸。例如，E可以是-S-D-D-S-S-D-D-。通过另一个实例，E可以是KRRTPVR。通过又另一个实例，E可以是KNFQSRS。通过另外的实例，E可以是KTYASMQ。在其它实施例中，E包括8个氨基酸。例如，E可以是-S-D-D-S-S-D-D-S-。通过另一个实例，E可以是KRRTPVRE。通过又另一个实例，E可以是KNFQSRSH。通过另外的实例，E可以是KTYASMQW。
在一些实施例中，q是0。在一些实施例中，q是0，并且x至少是1。在其它实施例中，q是0并且y至少是4。在其它实施例中，q是0并且y是6。
在又其它实施例中，q是1并且y至少是4。在又其它实施例中，q是1并且y是6。在一些实施例中，q是1，y是6，并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。在一些实施例中，q是1，y是6，w是0，并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。在一些实施例中，q是1，y是6，w是0，x是0，并且R是(-[LK]-Fc[DI])。在一些实施例中，q是1，z是1，y是6，w是0，x是0，并且R是(-[LK]-Fc[DI]-)。在一些实施例中，q是1，z是1，y是6，w是0，x是0，并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，其中Fc包括与SEQ IDNO：11至少99％的同一性。在一些实施例中，q是1，z是1，y是6，w是0，x是0，并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，其中与SEQ ID NO：11相比Fc包括一个氨基酸取代。在一些实施例中，q是1，z是1，y是6，w是0，x是0，并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，其中Fc包括SEQ ID NO：11。在一些实施例中，q是1，z是1，y是6，w是0，x是0，并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，其中Fc包括SEQ ID NO：11；并且其中[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个至少99％的同一性。在一些实施例中，q是1，z是1，y是6，w是0，x是0，并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，其中Fc包括SEQ ID NO：11；并且其中[A]包括SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个。在一些实施例中，多肽与SEQ ID NO：1具有小于99％的同一性。在一些实施例中，多肽与SEQ IF NO：1具有小于98％的同一性。在一些实施例中，多肽未与葡聚糖缀合。
在一些实施例中，z是范围为1至6的整数。在其它实施例中，z是范围为1至4的整数。在又其它实施例中，z是范围为1至3的整数。在另外的实施例中，z是1或2。在甚至另外的实施例中，z是1。在甚至另外的实施例中，z是1；并且q是0并且y是6。在甚至另外的实施例中，z是1；并且q是1并且y是6。
在一些实施例中，本公开提供了一种多肽，其具有式(IB)：
[A]v-[B]-[C]w-[R]q-([D]x-[E]y)z， (IB)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括编码碱性磷酸酶的氨基酸；
C包括编码GPI锚的氨基酸序列；
R是-(Mo(Fc)Np)-，其中M和N各自独立地包含1至6个氨基酸，其中Fc是Fc结构域，并且o和p各自独立地是0、1或2；
D包括具有4至6个氨基酸的氨基酸序列，或者是F(G)tF，其中每个F是相同的氨基酸，G是具有3、4或5个氨基酸的氨基酸序列，并且t是范围为2至5的整数；
E包括具有1至8个氨基酸的氨基酸序列；
q是0或1；
v是0或1；
w是0或1；
x是0或范围为1至6的整数；
y是0或范围为1至16的整数；并且
z是0或范围为1至6的整数；
条件是当v是1，w是0，q是1，o是1，p是1，N是二氨基酸-D-I-，M是二氨基酸-L-K-，[B]包括SEQ ID NO：11，Fc包括SEQ ID NO：130并且x是0时，那么[E]y不包括十至十六个连续天冬氨酸残基。
在一些实施例中，式(IB)多肽未与葡聚糖缀合。
在一些实施例中，式(IB)多肽有在骨中形成羟基磷灰石晶体的催化能力。
在一些实施例中，本公开提供了一种多肽，其具有式(II)：
[A]-[B]-[C]-[R]q-([D]x-[E]y)， (II)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括编码碱性磷酸酶的氨基酸；
C包括编码GPI锚的氨基酸序列；
R是-(Mo(Fc)Np)-，其中M和N各自独立地包含1至6个氨基酸，其中Fc是Fc结构域，并且o和p各自独立地是0、1或2；
D包括具有4至6个氨基酸的氨基酸序列；
E包括具有1至8个氨基酸的氨基酸序列；
q是0或1；
x是0或范围为1至6的整数；并且
y是0或范围为1至16的整数。
在一些实施例中，式(II)多肽有在骨中形成羟基磷灰石晶体的催化能力。
在一些实施例中，E包括2至4个氨基酸。在一些实施例中，E包括至少两个不同的氨基酸。在一些实施例中，E包括至少两个不同的氨基酸，并且其中y的范围为4至8。
在一些实施例中，q是0。在一些实施例中，q是1，并且x至少是1。在一些实施例中，q是1，并且y至少是1。在一些实施例中，q是1，并且x和1均至少是1。
在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸是组织非特异性碱性磷酸酶。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约85％的同一性。在其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约90％的同一性。在又其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约95％的同一性。在另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约96％的同一性。在甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约97％的同一性。在又甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约98％的同一性。在又甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11。
在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体包括一个或多个氨基酸取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体具有单个氨基酸取代。例如，SEQ ID NO：11的变体可以包括C102S取代。通过另一个实例，SEQ ID NO：11的变体可以包括E434G取代。通过又另一个实例，SEQ IDNO：11的变体可以包括A321H取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ IDNO：11的变体，所述变体具有两个氨基酸取代。例如，SEQ ID NO：11的变体可以包括C102S取代、E434G取代或A321H取代中的任何两个，例如A321H取代和E434G取代。
在一些实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少90％的序列同一性。在其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少95％的序列同一性。在又其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少96％的序列同一性。在另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少97％的序列同一性。在又另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少98％的序列同一性。在甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少99％的序列同一性。在又甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQID NO：12。
在一些实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少90％的序列同一性。在其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少95％的序列同一性。在又其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少96％的序列同一性。在另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少97％的序列同一性。在又另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少98％的序列同一性。在甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少99％的序列同一性。在又甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：33-43中的任何一个。
在一些实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：13和14中的任何一个具有至少90％的序列同一性。在其它实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：13和14的任何一个具有至少95％的序列同一性。在又其它实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：13和14中的任何一个具有至少96％的序列同一性。在另外的实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：13和14具有至少97％的序列同一性。在又另外的实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：13和14中的任何一个具有至少98％的序列同一性。在甚至另外的实施例中，编码GPI锚的氨基酸与SEQ ID NO：13和14中的任何一个具有至少99％的序列同一性。在又甚至另外的实施例中，编码GPI锚的氨基酸包括SEQ ID NO：13和14中的任何一个。
在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约90％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约95％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ IDNO：11具有至少约96％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约97％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约98％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12。
在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12并且q是1。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQID NO：11，并且x+y＝8至12，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少97％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQID NO：11，并且x+y＝8至12，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12，q是1；并且R是(-[LK]-Fc-[DI]-)，并且[A]包括具有SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个的氨基酸序列。
在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约90％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约95％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ IDNO：11具有至少约96％的同一性，并且其中x+y＝4至8。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约97％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约98％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝4至8。
在一些实施例中，D是GGGGS。在其它实施例中，D是GGGSS。在又其它实施例中，D是GGSSS。在另外的实施例中，D是GGSGS。在甚至另外的实施例中，D是GGSGS。
在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且x是范围为1至4的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且x是范围为1至3的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且x是1或2。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且x是2。在一些实施例中，D是GGGGS，并且x是2。在一些实施例中，D是GGGGS，并且x是2并且q是0。
在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且x是范围为1至4的整数，并且y是范围介于4与12之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，x是范围为1至3的整数，并且y是范围介于4与12之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，x是1或2，并且y是范围介于4与12之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，x是1或2，并且y是范围介于4与12之间的整数并且q是0。
在一些实施例中，E包括1个氨基酸。在一些实施例中，所述1个氨基酸选自天冬氨酸和丝氨酸。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y的范围为4至16。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y的范围为4至12。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y的范围为6至12。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y的范围为8至10。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y是10。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y是10并且其中q是0。
在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为4至16。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为4至12。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为6至12。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y是10。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y是10并且q是0。
在一些实施例中，E包括3个氨基酸。在一些实施例中，所述3个氨基酸选自天冬氨酸和丝氨酸。在一些实施例中，E是-D-S-S-。在其它实施例中，E是-D-D-S-。在其它实施例中，E是-D-D-D-。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为4至8。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y是6。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为4至8。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y是6并且q是0。
在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为4至8。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y是6。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y是6并且q是0。
在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，x是范围为1至3的整数，E是-D-S-S-，并且y是范围介于1与8之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，x是1或2，E是-D-S-S-，并且y是范围介于1与8之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，x是1或2，E是-D-S-S-，并且y是范围介于4与8之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，x是1或2，E是-D-S-S-，并且y是6。在一些实施例中，D是GGGGS，x是1或2，E是-D-S-S-，并且y是6。在一些实施例中，D是GGGGS，x是1或2，E是-D-S-S-，并且y是6并且q是0。
在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，x是范围为1至3的整数，E是天冬氨酸，并且y是范围介于8与12之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，x是1或2，E是天冬氨酸，并且y是10。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，x是2，E是天冬氨酸，并且y是10。在一些实施例中，D是GGGGS，x是2，E是天冬氨酸，并且y是10。在一些实施例中，D是GGGGS，x是2，E是天冬氨酸，并且y是10并且q是0。
在一些实施例中，E是KRRTPVRE。在其它实施例中，E是KNFQSRSH。在又其它实施例中，E是KTYASMQW。
在一些实施例中，本公开提供了一种多肽，其具有式(III)：
([A]-[B])-([D]x-[E]y)z， (III)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括编码碱性磷酸酶的氨基酸；
D包括具有4至6个氨基酸的氨基酸序列；
E包括具有1至8个氨基酸的氨基酸序列；
x是0或范围为1至6的整数；
y是0或范围为1至16的整数；并且
z是范围为1至6的整数。
在一些实施例中，式(III)多肽有在骨中形成羟基磷灰石晶体的催化能力。
在一些实施例中，E包括2至4个氨基酸。在一些实施例中，E包括至少两个不同的氨基酸。
在一些实施例中，x+y至少为2，并且其中[D]和[E]包括不同的氨基酸序列。
在其它实施例中，x是0，并且[E]包括至少三个氨基酸。在其它实施例中，x是0，并且[E]包括三个氨基酸。在其它实施例中，x是0，[E]包括三个氨基酸，并且y的范围介于4与8之间。在其它实施例中，x是0，[E]包括三个氨基酸，并且y是6。
在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约90％的同一性。在又其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约95％的同一性。在另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约96％的同一性。在甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约97％的同一性。在又甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约98％的同一性。在又甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11。
在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体包括一个或多个氨基酸取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体具有单个氨基酸取代。例如，SEQ ID NO：11的变体可以包括C102S取代。通过另一个实例，SEQ ID NO：11的变体可以包括E434G取代。通过又另一个实例，SEQ IDNO：11的变体可以包括A321H取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ IDNO：11的变体，所述变体具有两个氨基酸取代。例如，SEQ ID NO：11的变体可以包括C102S取代、E434G取代或A321H取代中的任何两个，例如A321H取代和E434G取代。
在一些实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少95％的序列同一性。在又其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少96％的序列同一性。在另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少97％的序列同一性。在又另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少98％的序列同一性。在甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少99％的序列同一性。在又甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQID NO：12。
在一些实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少90％的序列同一性。在其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少95％的序列同一性。在又其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少96％的序列同一性。在另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少97％的序列同一性。在又另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少98％的序列同一性。在甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少99％的序列同一性。在又甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：33-43中的任何一个。
在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约90％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约95％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ IDNO：11具有至少约96％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约97％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约98％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝8至12。
在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约90％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约95％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ IDNO：11具有至少约96％的同一性，并且其中x+y＝4至8。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约97％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约98％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性，并且x+y＝4至8。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11，并且x+y＝4至8。
在一些实施例中，D是GGGGS。在其它实施例中，D是GGGSS。在又其它实施例中，D是GGSSS。在另外的实施例中，D是GGSGS。在甚至另外的实施例中，D是GGSGS。
在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且x是范围为1至4的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且x是范围为1至3的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且x是1或2。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且x是2。在一些实施例中，D是GGGGS，并且x是2。
在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，并且x是范围为1至4的整数，并且y是范围介于4与12之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，x是范围为1至3的整数，并且y是范围介于4与12之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，x是1或2，并且y是范围介于4与12之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，x是1或2，并且y是6。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，x是1或2，并且y是10。
在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y的范围为4至16。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y的范围为4至12。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y的范围为6至12。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y的范围为8至10。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y是10。
在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为4至16。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为4至12。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为6至12。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为8至10。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y是10。
在一些实施例中，E包括3个氨基酸。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为4至8。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y是6。
在一些实施例中，E是-D-S-S-。在其它实施例中，E是-D-D-S-。在又其它实施例中，E是-D-D-D-。
在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为4至8。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y是6。
在一些实施例中，E是KRRTPVRE。在其它实施例中，E是KNFQSRSH。在又其它实施例中，E是KTYASMQW。
在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，x是范围为1至3的整数，E是-D-S-S-，并且y是范围介于1与8之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，x是1或2，E是-D-S-S-，并且y是范围介于1与8之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，x是1或2，E是-D-S-S-，并且y是范围介于4与8之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，x是1或2，E是-D-S-S-，并且y是6。在一些实施例中，D是GGGGS，x是1或2，E是-D-S-S-，并且y是6。
在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，x是范围为1至3的整数，E是天冬氨酸，并且y是范围介于8与12之间的整数。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，x是1或2，E是天冬氨酸，并且y是10。在一些实施例中，D是GGGGS或GGGSS，x是2，E是天冬氨酸，并且y是10。在一些实施例中，D是GGGGS，x是2，E是天冬氨酸，并且y是10。
在一些实施例中，本公开提供了一种多肽，其具有式(IV)：
([A]-[B])-([E]y)， (IV)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括编码碱性磷酸酶的氨基酸；
E包括具有1至8个氨基酸的氨基酸序列；并且
y是0或范围为1至16的整数。
在一些实施例中，式(IV)多肽有在骨中形成羟基磷灰石晶体的催化能力。
在一些实施例中，E包括2至4个氨基酸。在一些实施例中，E包括至少两个不同的氨基酸。
在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约90％的同一性。在又其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约95％的同一性。在另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约96％的同一性。在甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约97％的同一性。在又甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约98％的同一性。在又甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11。
在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体包括一个或多个氨基酸取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体具有单个氨基酸取代。例如，SEQ ID NO：11的变体可以包括C102S取代。通过另一个实例，SEQ ID NO：11的变体可以包括E434G取代。通过又另一个实例，SEQ IDNO：11的变体可以包括A321H取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ IDNO：11的变体，所述变体具有两个氨基酸取代。例如，SEQ ID NO：11的变体可以包括C102S取代、E434G取代或A321H取代中的任何两个，例如A321H取代和E434G取代。
在一些实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少95％的序列同一性。在又其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少96％的序列同一性。在另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少97％的序列同一性。在又另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少98％的序列同一性。在甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少99％的序列同一性。在又甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQID NO：12。
在一些实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少90％的序列同一性。在其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少95％的序列同一性。在又其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少96％的序列同一性。在另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少97％的序列同一性。在又另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少98％的序列同一性。在甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少99％的序列同一性。在又甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：33-43中的任何一个。
在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y的范围为4至16。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y的范围为4至12。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y的范围为6至12。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y的范围为8至10。在一些实施例中，E包括1个氨基酸，并且y是10。
在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为4至16。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为4至12。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为6至12。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为8至10。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y是10。
在一些实施例中，E包括3个氨基酸。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为4至8。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y是6。
在一些实施例中，E是-D-S-S-。在其它实施例中，E是-D-D-S-。在其它实施例中，E是-D-D-D-。
在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为4至8。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y是6。
在一些实施例中，E包括KRRTPVRE。在其它实施例中，E包括KNFQSRSH。在又其它实施例中，E包括KTYASMQW。
在一些实施例中，本公开提供了一种多肽，其具有式(VA)：
[A]-[B]-[R]q-([E]y) (VA)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括编码碱性磷酸酶的氨基酸；
R是-(Mo(Fc)Np)-，其中M和N各自独立地包含1至6个氨基酸，其中Fc是Fc结构域，并且o和p各自独立地是0、1或2；
q是0或1；
E包括具有2至4个氨基酸的氨基酸序列；并且
y是范围为1至16的整数。
在一些实施例中，式(IV)多肽有在骨中形成羟基磷灰石晶体的催化能力。
在一些实施例中，y是范围为4至8的整数。在一些实施例中，y是6。在一些实施例中，y是范围为4至8的整数并且q是0。在一些实施例中，y是6并且q是0。在一些实施例中，y是范围为4至8的整数并且q是1。在一些实施例中，y是6并且q是1。
在一些实施例中，编码碱性磷酸酶(“[B]”)的氨基酸是组织非特异性碱性磷酸酶。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约85％的同一性。在其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约90％的同一性。在其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约91％的同一性。在其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约92％的同一性。在其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约93％的同一性。在其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约94％的同一性。
在又其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约95％的同一性。在另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约96％的同一性。在甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约97％的同一性。在又甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约98％的同一性。在又甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性。在又甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQID NO：11具有至少约99％的同一性并且q是0。在又甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性并且q是1。
在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，如包括一个或多个氨基酸取代的变体。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体具有单个氨基酸取代。例如，SEQ ID NO：11的变体可以包括C102S取代。通过另一个实例，SEQ ID NO：11的变体可以包括E434G取代。通过又另一个实例，SEQ IDNO：11的变体可以包括A321H取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ IDNO：11的变体，所述变体具有两个氨基酸取代。例如，SEQ ID NO：11的变体可以包括C102S取代、E434G取代或A321H取代中的任何两个，例如A321H取代和E434G取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体具有三个氨基酸取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体具有四个氨基酸取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体具有五个氨基酸取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体具有六个氨基酸取代。
在一些实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少90％的序列同一性。在其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少95％的序列同一性。在又其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少96％的序列同一性。在另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少97％的序列同一性。在又另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少98％的序列同一性。在甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少99％的序列同一性。在又甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQID NO：12。在又甚至其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：12，并且其中[D]x是[-GGGGS-]2。在又甚至其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：12，并且其中[E]y是[-DSS-]6。在又甚至其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ IDNO：12；[E]y是[-DSS-]6，并且q是0。在又甚至其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：12；[E]y是[-DSS-]6，并且q是1。
在一些实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少90％的序列同一性。在其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少95％的序列同一性。在又其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少96％的序列同一性。在另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少97％的序列同一性。在又另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少98％的序列同一性。在甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少99％的序列同一性。在又甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：33-43中的任何一个。在又甚至其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：33-43中的任何一个，并且其中[E]y是[-DSS-]6。在又甚至其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：33-43中的任何一个，[E]y是[-DSS-]6，并且q是0。在又甚至其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：33-43中的任何一个，[E]y是[-DSS-]6，并且q是1。
在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少90％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少91％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少92％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ IDNO：130具有至少93％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少94％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少95％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少96％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少97％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少98％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少99％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域包括SEQ ID NO：130。在一些实施例中，Fc结构域包括SEQ ID NO：130并且y的范围为4至6。在一些实施例中，Fc结构域包括SEQ ID NO：130并且[E]y是[DSS]6。在一些实施例中，R包括SEQ ID NO：9并且[E]y是[DSS]6。
在一些实施例中，M包括2个氨基酸。例如，M可以包括亮氨酸和赖氨酸。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸。通过另一个实例，M可以包括两个丙氨酸氨基酸。在其它实施例中，M包括三个氨基酸。
在一些实施例中，N包括2个氨基酸(即，二氨基酸)。例如，N可以包括天冬氨酸和异亮氨酸。通过另一个实例，N可以包括两个丙氨酸氨基酸。在一些实施例中，N是天冬氨酸-异亮氨酸。在其它实施例中，N包括3个氨基酸。
在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少90％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少91％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少92％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少93％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少94％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少95％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少96％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少97％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少98％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ IDNO：130具有至少99％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc包括SEQ ID NO：130。
在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸并且N是天冬氨酸-异亮氨酸；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ IDNO：130具有至少90％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少91％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少92％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少93％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少94％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少95％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少96％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQID NO：130具有至少97％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少98％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少99％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸；N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc包括SEQ ID NO：130；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸；N是天冬氨酸-异亮氨酸；Fc包括SEQ ID NO：130；o、p和q各自是1；并且[A]与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少99％的同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，N是天冬氨酸-异亮氨酸；Fc包括；o、p和q各自是1；并且[A]包括SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个。
在一些实施例中，E包括3个氨基酸。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为4至8。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y是6。
在一些实施例中，E是-D-S-S-。在其它实施例中，E是-D-D-S-。
在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为4至8。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y是6。
在一些实施例中，本公开提供了一种多肽，其具有式(VB)：
[A]-[B]-[R]q-([E]y) (VB)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括编码碱性磷酸酶的氨基酸；
R是-(Mo(Fc)Np)-，其中M和N各自独立地包含1至6个氨基酸，其中Fc是Fc结构域，并且o和p各自独立地是0、1或2；
q是0或1；
E包括具有2至4个氨基酸的氨基酸序列；并且
y是范围为1至16的整数，
条件是当q是1并且当[E]仅包括天冬氨酸时，那么所述式(V)多肽不包括具有十至十六个连续天冬氨酸残基的氨基酸序列；或条件是所述式(V)多肽不具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或不包括由SEQ ID NO：107的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或条件是所述式(V)多肽不是或阿司福酶α。
在一些实施例中，式(IV)多肽有在骨中形成羟基磷灰石晶体的催化能力。
在一些实施例中，y是范围为4至8的整数。在一些实施例中，y是6。在一些实施例中，y是范围为4至8的整数并且q是0。在一些实施例中，y是6并且q是0。在一些实施例中，y是范围为4至8的整数并且q是1。在一些实施例中，y是6并且q是1。
在一些实施例中，编码碱性磷酸酶(“[B]”)的氨基酸是组织非特异性碱性磷酸酶。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约85％的同一性。在其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约90％的同一性。在其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约91％的同一性。在其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约92％的同一性。在其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约93％的同一性。在其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约94％的同一性。
在又其它实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约95％的同一性。在另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约96％的同一性。在甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约97％的同一性。在又甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约98％的同一性。在又甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性。在又甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQID NO：11具有至少约99％的同一性并且q是0。在又甚至另外的实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少约99％的同一性并且q是1。
在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，如包括一个或多个氨基酸取代的变体。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体具有单个氨基酸取代。例如，SEQ ID NO：11的变体可以包括C102S取代。通过另一个实例，SEQ ID NO：11的变体可以包括E434G取代。通过又另一个实例，SEQ IDNO：11的变体可以包括A321H取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ IDNO：11的变体，所述变体具有两个氨基酸取代。例如，SEQ ID NO：11的变体可以包括C102S取代、E434G取代或A321H取代中的任何两个，例如A321H取代和E434G取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体具有三个氨基酸取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体具有四个氨基酸取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体具有五个氨基酸取代。在一些实施例中，编码碱性磷酸酶的氨基酸包括SEQ ID NO：11的变体，所述变体具有六个氨基酸取代。
在一些实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少90％的序列同一性。在其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少95％的序列同一性。在又其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少96％的序列同一性。在另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少97％的序列同一性。在又另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少98％的序列同一性。在甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：12具有至少99％的序列同一性。在又甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQID NO：12。在又甚至其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：12，并且其中[D]x是[-GGGGS-]2。在又甚至其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：12，并且其中[E]y是[-DSS-]6。在又甚至其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ IDNO：12；[E]y是[-DSS-]6，并且q是0。在又甚至其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：12；[E]y是[-DSS-]6，并且q是1。
在一些实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少90％的序列同一性。在其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少95％的序列同一性。在又其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少96％的序列同一性。在另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少97％的序列同一性。在又另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少98％的序列同一性。在甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸与SEQ ID NO：33-43中的任何一个具有至少99％的序列同一性。在又甚至另外的实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：33-43中的任何一个。在又甚至其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：33-43中的任何一个，并且其中[E]y是[-DSS-]6。在又甚至其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：33-43中的任何一个，[E]y是[-DSS-]6，并且q是0。在又甚至其它实施例中，编码分泌信号肽的氨基酸包括SEQ ID NO：33-43中的任何一个，[E]y是[-DSS-]6，并且q是1。
在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少90％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少91％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少92％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ IDNO：130具有至少93％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少94％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少95％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少96％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少97％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少98％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域与SEQ ID NO：130具有至少99％的序列同一性。在一些实施例中，Fc结构域包括SEQ ID NO：130。在一些实施例中，Fc结构域包括SEQ ID NO：130并且y的范围为4至6。在一些实施例中，Fc结构域包括SEQ ID NO：130并且[E]y是[DSS]6。在一些实施例中，R包括SEQ ID NO：9并且[E]y是[DSS]6。
在一些实施例中，M包括2个氨基酸。例如，M可以包括亮氨酸和赖氨酸。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸。通过另一个实例，M可以包括两个丙氨酸氨基酸。在其它实施例中，M包括三个氨基酸。
在一些实施例中，N包括2个氨基酸(即，二氨基酸)。例如，N可以包括天冬氨酸和异亮氨酸。通过另一个实例，N可以包括两个丙氨酸氨基酸。在一些实施例中，N是天冬氨酸-异亮氨酸。在其它实施例中，N包括3个氨基酸。
在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少90％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少91％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少92％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少93％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少94％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少95％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少96％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少97％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少98％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ IDNO：130具有至少99％的序列同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc包括SEQ ID NO：130。
在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸并且N是天冬氨酸-异亮氨酸；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ IDNO：130具有至少90％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少91％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少92％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少93％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少94％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少95％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少96％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQID NO：130具有至少97％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少98％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，并且N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc与SEQ ID NO：130具有至少99％的序列同一性；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸；N是天冬氨酸-异亮氨酸，并且Fc包括SEQ ID NO：130；并且o、p和q各自是1。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸；N是天冬氨酸-异亮氨酸；Fc包括SEQ ID NO：130；o、p和q各自是1；并且[A]与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少99％的同一性。在一些实施例中，M是亮氨酸-赖氨酸，N是天冬氨酸-异亮氨酸；Fc包括；o、p和q各自是1；并且[A]包括SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个。
在一些实施例中，E包括3个氨基酸。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y的范围为4至8。在一些实施例中，E包括3个氨基酸，并且y是6。
在一些实施例中，E是-D-S-S-。在其它实施例中，E是-D-D-S-。
在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为1至16。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为1至12。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为1至10。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y的范围为4至8。在一些实施例中，E是天冬氨酸，并且y的范围为1至8。在一些实施例中，E是-D-S-S-，并且y是6。
具有式(I)、(IA)、(IB)、(II)、(III)、(IV)、(VA)和(VB)(以下称为“式(I)-(V)”)中
任一者的多肽的实例
在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：2具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：2具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：2具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ IDNO：2具有至少97％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：2具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：2具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括SEQ ID NO：2。
在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：3具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：3具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：3具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：3具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ IDNO：3具有至少97％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：3具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：3具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括SEQ ID NO：3。
在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：4具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：4具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：4具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：4具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ IDNO：4具有至少97％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：4具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：4具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括SEQ ID NO：4。
在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：5具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：5具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：5具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：5具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ IDNO：5具有至少97％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：5具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：5具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括SEQ ID NO：5。
在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：6具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：6具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：6具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ IDNO：6具有至少97％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：6具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：6具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括SEQ ID NO：6。
在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：7具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：7具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：7具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：7具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ IDNO：7具有至少97％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：7具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：7具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括SEQ ID NO：7。
在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：8有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：8有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：8有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：8有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：8有至少97％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：8有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括与SEQ ID NO：8有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽包括SEQ ID NO：8。
在一些实施例中，本公开的多肽具有与SEQ ID NO：44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少85％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的多肽与SEQ ID NO：44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少90％的序列同一性。在一些实施例中，本公开的多肽具有与SEQ ID NO：44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的多肽具有与SEQ ID NO：44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少96％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的多肽具有与SEQ ID NO：44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的多肽具有与SEQ IDNO：44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少97％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的多肽具有与SEQ ID NO：44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少98％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的多肽具有与SEQID NO：44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的多肽包括SEQ ID NO：44-54、68、75、105和116-125中的任何一个。
在一些实施例中，本公开的多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少80％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，本公开的多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少85％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，本公开的多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少90％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，本公开的多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少91％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，本公开的多肽由与SEQID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少92％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，本公开的多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少93％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，本公开的多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少94％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，本公开的多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少95％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，本公开的多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少96％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，本公开的多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少97％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，本公开的多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少98％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，本公开的多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少99％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施例中，本公开的多肽由具有SEQ IDNO：106、108-115和131中的任何一个的核苷酸序列编码。
递送平台
本公开的另一方面是递送平台，例如非病毒载体和病毒载体。在一些实施例中，非病毒载体包含细菌质粒、小环DNA、小载体DNA、线性DNA、颗粒、纳米颗粒等。在一些实施例中，非病毒颗粒包含脂质体，例如美国专利第5,422,120号和PCT公开第WO 95/13796号、第WO 94/23697号和第WO 91/14445号中公开的那些，特别包含异泡脂质体颗粒，所述文献的公开内容通过引用整体并入本文。在一些实施例中，非病毒载体可以根据各种方法递送到细胞或受试者，所述各种方法包含但不限于注射、电穿孔、基因枪、超声穿孔、磁转染、流体动力递送或其它物理或化学递送方法。在一些实施例中，可以将治疗基因直接插入到质粒中，然后可以通过各种方式将此重组质粒引入到细胞中。例如，它可以作为裸DNA直接注射到靶向组织中。非病毒递送媒剂的其它非限制性实例描述于PCT公开第WO/2005/123142号、第WO/2012/017119号、第WO/1995/021195号、第WO/2012/017118号、第WO/2016/016358号、第WO/2006/122542号和第WO/2014/072929号中，所述公开的公开内容特此通过引用整体并入本文。
在一些实施例中，递送平台是编码多肽的病毒表达载体，如包括编码碱性磷酸酶或其变体用于表达的核酸序列的多肽。在一些实施例中，表达载体可以是逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、AAV载体等。
在一些实施例中，表达载体是慢病毒载体。慢病毒是逆转录病毒的子类。慢病毒类似于γ-逆转录病毒(γ-RV)，能够稳定地整合到靶细胞基因组中，从而持续表达所关注的基因。然而，与γ逆转录病毒相比，慢病毒还可以转导非分裂细胞，这导致它们被广泛用作基因转移载体。在一些实施例中，慢病毒基因组是单联的、线性的、二聚体的、正链单链RNA(ssRNA(+)″)，9.75kb，具有5′-帽和3′poly-A尾。在一些实施例中，慢病毒基因组侧接′和3′长末端重复序列(LTR)，所述长末端重复序列具有启动子/增强子活性并且对于全长慢病毒载体转录物的正确表达是必需的。在一些实施例中，LTR在逆转录和将载体整合到靶细胞基因组中也具有重要作用。在一些实施例中，在病毒进入细胞后，RNA基因组被逆转录成双链DNA，然后通过病毒整合酶将其插入到基因组的随机位置处。在一些实施例中，慢病毒(现在称为原病毒)保留在基因组中，并且在细胞分裂时传递给细胞的后代。
慢病毒物种的实例包含例如人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2(HIV-2)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。在一些实施例中，本公开的慢病毒载体可以基于任何慢病毒物种。在一些实施例中，慢病毒载体基于人免疫缺陷病毒(例如HIV-1或HIV-2)，最优选地HIV-1。
慢病毒载体通常通过包装细胞中的反式互补产生，所述包装细胞用含有载体基因组和包装构建体的质粒共转染，所述包装构建体仅编码慢病毒组装和功能所必需的蛋白质。在一些实施例中，可以通过消除HIV-1 LTR的内在启动子/增强子活性来生成自失活(SIN)慢病毒载体，这降低了位于载体整合位点附近的细胞编码序列异常表达的可能性(参见例如Vigna等人，《基因医学杂志(J.Gene Med.)》，2：308-316(2000)；Naldini等人，《科学》，272：263-267(1996)；以及Mátrai等人，《分子疗法(Molecular Therapy)》，18(3)：477-490(2010))。在一些实施例中，产生慢病毒载体的最常见程序是用慢病毒载体质粒和编码病毒Gag-Pol、Rev-Tat和包膜(Env)蛋白的三个包装构建体共转染细胞系(例如，293T人胚肾细胞)。
用于产生慢病毒载体的方法是本领域众所周知的，并且可以使用任何合适的此类方法来构建本公开的慢病毒载体。在一些实施例中，慢病毒载体通常是通过用若干种不同的质粒构建体共转染293T人胚胎肾细胞而产生的，所述质粒构建体分别含有病毒颗粒产生、感染和整合所需的慢病毒顺式作用序列和反式作用因子。慢病毒载体产生系统通常包含四种质粒。在一些实施例中，转移载体含有转基因，所述转基因在含有基因组RNA产生和包装所需的所有顺式作用序列的慢病毒骨架中递送。另外三个提供包装所需的反式作用因子，即，分别是Gag-Pol、Rev-Tat和包膜蛋白VSVG。当这四种质粒转染到293T人胚肾细胞时，病毒颗粒在上清液中积聚，并且病毒产物可以通过超速离心浓缩。慢病毒产生方案进一步描述于例如Tiscornia等人，《自然实验手册(Nature Protocols)》，1：241-245(2006)；Stevenson，M.，《微生物学和免疫学当前论题(Curr.Top.Microbiol.Immunol.)》，261：1-30(2002)；Cronin等人，《当代基因疗法(Curr.Gene Ther.)》，5：387-398(2005)；Sandrin等人，《微生物学和免疫学当前论题》，281：137-178(2003)；Zufferey，R.，《微生物学和免疫学当前论题》，261：107-121(2002)；Sinn等人，《基因疗法》，12：1089-1098(2005)；以及Saenz，D.T.和Poeschla，E.M.，《基因医学杂志》，6：S95-S104(2004)。用于产生慢病毒载体的其它方法是本领域已知的并且描述于例如美国专利申请公开2008/0254008和2010/0003746；以及Yang等人，《人类基因疗法方法(Hum Gene Ther.Methods)》，23(2)：73-83(2012)。
在一些实施例中，本公开提供了一种慢病毒载体，其包括编码式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)多肽中的任何一个或其变体或片段的核苷酸序列。
在一些实施例中，慢病毒载体包含编码多肽的核酸序列，其中所述多肽包括与SEQID NO：1-8、44-54、105和116-125中的任何一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，慢病毒载体包含编码多肽的核酸序列，其中所述多肽包括与SEQ ID NO：1-8、44-54、105和116-125中的任何一个具有至少91％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，慢病毒载体包含编码多肽的核酸序列，其中所述多肽包括与SEQ ID NO：1-8、44-54、105和116-125中的任何一个具有至少92％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，慢病毒载体包含编码多肽的核酸序列，其中所述多肽包括与SEQ ID NO：1-8、44-54、105和116-125中的任何一个具有至少93％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，慢病毒载体包含编码多肽的核酸序列，其中所述多肽包括与SEQ ID NO：1-8、44-54、105和116-125中的任何一个具有至少94％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，慢病毒载体包含编码多肽的核酸序列，其中所述多肽包括与SEQ ID NO：1-8、44-54、105和116-125中的任何一个具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，慢病毒载体包含编码多肽的核酸序列，其中所述多肽包括与SEQ ID NO：1-8、44-54、105和116-125中的任何一个具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，慢病毒载体包含编码多肽的核酸序列，所述多肽与SEQ ID NO：1-8、44-54、105和116-125中的任何一个具有至少97％同一性。在一些实施例中，慢病毒载体包含编码多肽的核酸序列，其中所述多肽包括与SEQ ID NO：1-8、44-54、105和116-125中的任何一个具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，慢病毒载体包含编码多肽的核酸序列，其中所述多肽包括与SEQ ID NO：1-8、44-54、105和116-125中的任何一个具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，慢病毒载体包含编码多肽的核酸序列，其中所述多肽包括具有SEQ ID NO：1-8、44-54、105和116-125中的任何一个的氨基酸序列。
在一些实施例中，慢病毒载体包含编码多肽的核酸序列，其中编码所述多肽的核酸序列与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少90％的同一性。在一些实施例中，慢病毒载体包含编码多肽的核酸序列，其中编码所述多肽的核酸序列与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少91％的同一性。在一些实施例中，慢病毒载体包含编码多肽的核酸序列，其中编码所述多肽的核酸序列与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少92％的同一性。在一些实施例中，慢病毒载体包含编码多肽的核酸序列，其中编码所述多肽的核酸序列与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少93％的同一性。在一些实施例中，慢病毒载体包含编码多肽的核酸序列，其中编码所述多肽的核酸序列与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少94％的同一性。在一些实施例中，慢病毒载体包含编码多肽的核酸序列，其中编码所述多肽的核酸序列与SEQ IDNO：106、108-115和131中的任何一个具有至少95％的同一性。在一些实施例中，慢病毒载体包含编码多肽的核酸序列，其中编码所述多肽的核酸序列与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少96％的同一性。在一些实施例中，慢病毒载体包含编码多肽的核酸序列，其中编码所述多肽的核酸序列与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少97％的同一性。在一些实施例中，慢病毒载体包含编码多肽的核酸序列，其中编码所述多肽的核酸序列与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少98％的同一性。在一些实施例中，慢病毒载体包含编码多肽的核酸序列，其中编码所述多肽的核酸序列与SEQID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少99％的同一性。在一些实施例中，慢病毒载体包含编码多肽的核酸序列，其中编码所述多肽的核酸序列包括SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个。
在一些实施例中，所述慢病毒表达载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少80％同一性的核酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒表达载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少85％同一性的核酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒表达载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒表达载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少91％同一性的核酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒表达载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少92％同一性的核酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒表达载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少93％同一性的核酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒表达载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少94％同一性的核酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒表达载体包括与SEQ IDNO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒表达载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少96％同一性的核酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒表达载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少97％同一性的核酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒表达载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少98％同一性的核酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒表达载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少99％同一性的核酸序列。在一些实施例中，所述慢病毒表达载体包括具有SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个的核酸序列。
启动子
本领域使用的任何启动子可以用于驱动本文所描述的表达载体内的一种或多种核酸序列的表达，例如以驱动编码多肽的核酸序列的表达。在一些实施例中，启动子是在哺乳动物细胞中有功能的启动子。高水平组成型启动子优选用于根据本公开的载体。此类启动子的实例包含但不限于逆转录病毒劳斯氏肉瘤病毒(RSN)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)[参见例如Boshart等人，《细胞》，41：521-530(1985)]、SN40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、与源自巨细胞病毒(CMN)立即早期(IE)启动子的增强子连接的β-活性启动子、酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1a启动子[英杰公司(Invitrogen)]。诱导型启动子受外源供应的化合物的调控，包含锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统[WO 98/10088]、蜕皮激素昆虫启动子[No等人，《美国国家科学院院刊》，93：3346-3351(1996)]、四环素抑制型系统[Gossen等人，《美国国家科学院院刊》，89：5547-5551(1992)]、四环素诱导型系统[Gossen等人，《科学》，268：1766-1769(1995)；还参见Harvey等人，《化学生物当前观点(Curr.Opin.Chem.Biol.)》，2：512-518(1998)]、RU486诱导型系统[Wang等人，《自然生物技术(Nat.Biotech.)》，15：239-243(1997)以及Wang等人，《基因疗法》，4：432-441(1997)]和雷帕霉素诱导型系统[Magari等人，《临床研究杂志(J Clin.Invest.)》，100：2865-2872(1997)]。在本公开中可能有用的其它类型的诱导型启动子是受特定生理状态例如温度、急性期、细胞的特定分化状态、或仅在复制细胞时调节的那些启动子。
适合在特定实施例中使用的说明性普遍存在的表达控制序列包含但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、病毒性猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)、莫洛尼氏鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR、单纯性疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子、来自牛痘病毒的H5、P7.5和P11启动子、短延伸因子1-α(EF1a-短)启动子、长延伸因子1-α(EF1α-长)启动子、早期生长应答1(EGR1)、铁蛋白H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、真核转译起始因子4A1(EIF4A1)、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)、热休克蛋白90kDaβ、成员1(HSP90B1)、热休克蛋白70kDa(HSP70)、β-驱动蛋白(3-KIN)、人ROSA 26基因座(Orions等人，《自然生物技术》25，1477-1482(2007))、泛素C启动子(UBC)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、β-肌动蛋白启动子和骨髓增生性肉瘤病毒增强子阴性对照区缺失的d1587rev引物结合位点取代的(MND)启动子(Challita等人，《病毒学杂志(J Virol.)》69(2)：748-55(1995))。
在一些实施例中，启动子可以选自巨细胞病毒(CMV)最小启动子，并且更优选地选自人CMV(hCMV)，如hCMV立即早期启动子衍生的最小启动子，如描述于例如Gossen和Bujard(《美国国家科学院院刊》，1992，89：5547-5551)。也可以使用经修饰的启动子，包含天然启动子的插入和缺失突变以及其组合或排列。经修饰的启动子的一个实例是“最小CMV启动子”，如Gossen和Bujard(《美国国家科学院院刊》，1992，89：5547-5551)所描述的。在任何情况下，通过取代本文所描述的最小CMV启动子，可以容易地测试任何启动子在本文所描述的四环素反应性表达系统中的有效性。
在一些实施例中，启动子是MND启动子。在一些实施例中，所述MND启动子与SEQ IDNO：66具有至少90％的同一性。在一些实施例中，所述MND启动子与SEQ ID NO：66具有至少95％的同一性。在一些实施例中，所述MND启动子与SEQ ID NO：66具有至少96％的同一性。在一些实施例中，所述MND启动子与SEQ ID NO：66具有至少97％的同一性。在一些实施例中，所述MND启动子与SEQ ID NO：66具有至少98％的同一性。在一些实施例中，所述MND启动子与SEQ ID NO：66具有至少99％的同一性。在一些实施例中，MND启动子包括SEQ ID NO：66。
在一些实施例中，启动子是EF1A启动子。在一些实施例中，EF1A启动子与SEQ IDNO：67和100中的任何一个具有至少90％同一性。在一些实施例中，EF1A启动子与SEQ IDNO：67和100中的任何一个具有至少95％同一性。在一些实施例中，EF1A启动子与SEQ IDNO：67和100中的任何一个具有至少96％同一性。在一些实施例中，EF1A启动子与SEQ IDNO：67和100中的任何一个具有至少97％同一性。在一些实施例中，EF1A启动子与SEQ IDNO：67和100中的任何一个具有至少98％同一性。在一些实施例中，EF1A启动子与SEQ IDNO：67和100中的任何一个具有至少99％同一性。在一些实施例中，EF1A启动子包括SEQ IDNO：67。在一些实施例中，EF1A启动子包括SEQ ID NO：100。
在一些实施例中，所述启动子是CD11b启动子。在一些实施例中，所述CD11b启动子与SEQ ID NO：96具有至少90％的同一性。在一些实施例中，所述CD11b启动子与SEQ ID NO：96具有至少95％的同一性。在一些实施例中，所述CD11b启动子与SEQ ID NO：96具有至少96％的同一性。在一些实施例中，所述CD11b启动子与SEQ ID NO：96具有至少97％的同一性。在一些实施例中，所述CD11b启动子与SEQ ID NO：96具有至少98％的同一性。在一些实施例中，所述CD11b启动子与SEQ ID NO：96具有至少99％的同一性。在一些实施例中，CD11b启动子具有SEQ ID NO：96。
在一些实施例中，所述启动子是EFS启动子。在一些实施例中，所述EFS启动子与SEQ ID NO：99具有至少90％的同一性。在一些实施例中，所述EFS启动子与SEQ ID NO：99具有至少95％的同一性。在一些实施例中，所述EFS启动子与SEQ ID NO：99具有至少96％的同一性。在一些实施例中，所述EFS启动子与SEQ ID NO：99具有至少97％的同一性。在一些实施例中，所述EFS启动子与SEQ ID NO：99具有至少98％的同一性。在一些实施例中，所述EFS启动子与SEQ ID NO：99具有至少99％的同一性。在一些实施例中，EFS启动子具有SEQ IDNO：99。
在一些实施例中，启动子是Ubc启动子。在一些实施例中，所述Ubc启动子与SEQ IDNO：101具有至少90％的同一性。在一些实施例中，所述Ubc启动子与SEQ ID NO：101具有至少95％的同一性。在一些实施例中，所述Ubc启动子与SEQ ID NO：101具有至少96％的同一性。在一些实施例中，所述Ubc启动子与SEQ ID NO：101具有至少97％的同一性。在一些实施例中，所述Ubc启动子与SEQ ID NO：101具有至少98％的同一性。在一些实施例中，所述Ubc启动子与SEQ ID NO：101具有至少99％的同一性。在一些实施例中，所述Ubc启动子具有SEQID NO：101。
在一些实施例中，所述启动子是CD68LPp启动子。在一些实施例中，所述CD68LPp启动子与SEQ ID NO：126具有至少90％的同一性。在一些实施例中，所述CD68LPp启动子与SEQID NO：126具有至少95％的同一性。在一些实施例中，所述CD68LPp启动子与SEQ ID NO：126具有至少96％的同一性。在一些实施例中，所述CD68LPp启动子与SEQ ID NO：126具有至少97％的同一性。在一些实施例中，所述CD68LPp启动子与SEQ ID NO：126具有至少98％的同一性。在一些实施例中，所述CD68LPp启动子与SEQ ID NO：126具有至少99％的同一性。在一些实施例中，所述CD68LPp启动子具有SEQ ID NO：99。
在一些实施例中，启动子是组织特异性启动子，其中组织特异性启动子用于实现期望的多核苷酸序列的细胞类型特异性、谱系特异性或组织特异性表达(例如，仅在细胞类型或组织的子集中或在特定发育阶段期间表达编码多肽的特定核酸)。组织特异性启动子的说明性实例包含但不限于：B29启动子(B细胞表达)、runt转录因子(CBFa2)启动子(干细胞特异性表达)、CD14启动子(单核细胞细胞表达)、CD43启动子(白细胞和血小板表达)、CD45启动子(造血细胞表达)、CD68启动子(巨噬细胞表达)、CYP4503A4启动子(肝细胞表达)、结蛋白启动子(肌肉表达)、弹性蛋白酶1启动子(胰腺腺泡细胞表达、内皮糖蛋白启动子(内皮细胞表达)、成纤维细胞特异性蛋白1启动子(FSP1)启动子(成纤维细胞细胞表达)、纤连蛋白启动子(成纤维细胞细胞表达)、fms相关酪氨酸激酶1(FLT1)启动子(内皮细胞表达)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子(星形细胞表达)、胰岛素启动子(胰腺β细胞表达)、整合素、α2b(ITGA2B)启动子(巨核细胞)、细胞间粘附分子2(ICAM-2)启动子(内皮细胞)、干扰素β(IFN-β)启动子(造血细胞)、角蛋白5启动子(角化细胞表达)、肌红蛋白(MB)启动子(肌肉表达)、成肌分化1(MYOD1)启动子(肌肉表达)、肾病蛋白启动子(足细胞表达)、骨γ-羧基谷氨酸蛋白2(OG-2)启动子(成骨细胞表达)、3-酮酸CoA转移酶2B(Oxct2B)启动子(单倍体-精子细胞表达)、表面活性蛋白B(SP-B)启动子(肺表达)、突触蛋白启动子(神经元表达)、威斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)蛋白(WASP)启动子(造血细胞表达)。
在一些实施例中，使用转基因的天然启动子。在一些实施例中，当期望基因的表达应模仿天然表达时，天然启动子可能是优选的。在一些实施例中，当基因的表达必须在时间上或发育上、或以组织特异性方式、或响应于特异性转录刺激调节时，可以使用天然启动子。在一些实施例中，还可以使用其它天然表达控制元件，如增强子元件、聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列来模仿天然表达。在一些实施例中，转基因产物或其它期望表达的产物与组织特异性启动子可操作地连接。例如，如果希望在骨骼肌中表达，那么应当使用在肌肉中有活性的启动子。这些启动子包含来自编码骨骼α-肌动蛋白、肌球蛋白轻链2A、肌营养不良蛋白、肌肉肌酸激酶的启动子、以及具有比天然存在的启动子更高活性的合成肌肉启动子[参见Li等人，《自然生物技术》，17：241-245(1999)]。众所周知，组织特异性启动子的实例用于肝脏[白蛋白，Miyatake等人《病毒学杂志》，71：5124-32(1997)；乙型肝炎病毒核心启动子，Sandig等人，《基因疗法》，3：1002-9(1996)；以及甲胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等人，《人类基因疗法(Hum.Gene Ther)》，7：1503-14(1996)]、骨[骨钙素，Stein等人，《分子生物学综述(Mol.Biol.Rep.)》，24：185-96(1997)；以及骨唾液蛋白，Chen等人，《骨与矿物研究杂志(J Bone Miner.Res.)》，11：654-64(1996)]、淋巴细胞[CD2，Hansal等人，《免疫学杂志(JImmunol)》，161：1063-8(1998)；免疫球蛋白重链；T细胞受体a链]、神经元[神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子，Andersen等人《细胞和分子神经生物学杂志(Cell.Mol.Neurobiol)》，13：503-15(1993)；神经丝轻链基因，Piccioli等人，1991，《美国国家科学院院刊》，88：5611-5(1991)；以及神经元特异性vgf基因，Piccioli等人，《神经元(Neuron)》15：373-84(1995)]等。
在一些实施例中，慢病毒载体包含与EF1A启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码具有式(I)-(V)中的任何一个的多肽。
在一些实施例中，慢病毒载体包含与EF1A启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少90％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与EF1A启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少91％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与EF1A启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少92％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与EF1A启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少93％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与EF1A启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ IDNO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少94％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与EF1A启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少95％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与EF1A启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少96％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与EF1A启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少97％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与EF1A启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少98％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与EF1A启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少99％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与EF1A启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码具有SEQID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个的多肽。
在一些实施例中，慢病毒载体包含与MND启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码具有式(I)-(V)中的任何一个的多肽。
在一些实施例中，慢病毒载体包含与MND启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少90％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与MND启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少91％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与MND启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少92％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与MND启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少93％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与MND启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少94％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与MND启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少95％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与MND启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少96％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与MND启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少97％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与MND启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少98％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与MND启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少99％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与MND启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码具有SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个的多肽。
在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD11b启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码具有式(I)-(V)中的任何一个的多肽。
在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD11b启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少90％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD11b启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少91％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD11b启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少92％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD11b启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少93％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD11b启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少94％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD11b启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少95％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD11b启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少96％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD11b启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少97％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD11b启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少98％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD11b启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少99％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD11b启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码具有SEQID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个的多肽。
在一些实施例中，慢病毒载体包含与EFS启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码具有式(I)-(V)中的任何一个的多肽。
在一些实施例中，慢病毒载体包含与EFS启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少90％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与EFS启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少91％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与EFS启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少92％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与EFS启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少93％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与EFS启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少94％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与EFS启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少95％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与EFS启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少96％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与EFS启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少97％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与EFS启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少98％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与EFS启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少99％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与EFS启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码具有SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个的多肽。
在一些实施例中，慢病毒载体包含与Ubc启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码具有式(I)-(V)中的任何一个的多肽。
在一些实施例中，慢病毒载体包含与Ubc启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少90％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与Ubc启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少91％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与Ubc启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少92％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与Ubc启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少93％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与Ubc启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少94％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与Ubc启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少95％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与Ubc启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少96％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与Ubc启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少97％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与Ubc启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少98％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与Ubc启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少99％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与Ubc启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码具有SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个的多肽。
在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD68LPp启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码具有式(I)-(V)中的任何一个的多肽。
在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD68LPp启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少90％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD68LPp启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少91％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD68LPp启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少92％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD68LPp启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ IDNO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少93％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD68LPp启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少94％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD68LPp启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少95％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD68LPp启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少96％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD68LPp启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少97％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD68LPp启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ IDNO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少98％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD68LPp启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码与SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少99％同一性的多肽。在一些实施例中，慢病毒载体包含与CD68LPp启动子可操作地连接的第一核酸序列，其中第一核酸序列编码具有SEQ ID NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个的多肽。
可以通过将增强子序列插入到载体中来增加转录。增强子通常是DNA的顺式作用元件，通常长约10至300bp，作用于启动子以增加其转录。现在已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)和真核细胞病毒。实例包含复制起点后侧的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可以在抗原特异性多核苷酸序列的5′或3′位置处剪接到载体中，但优选地位于启动子的5′位点处。
在一些实施例中，本公开的载体包含绝缘子元件，例如，cHS绝缘子。在一些实施例中，绝缘子具有与SEQ ID NO：127-129中的任何一个具有至少95％同一性的核苷酸测序。在一些实施例中，绝缘子具有与SEQ ID NO：127-129中的任何一个具有至少97％同一性的核苷酸测序。在一些实施例中，绝缘子具有与SEQ ID NO：127-129中的任何一个具有至少99％同一性的核苷酸测序。在一些实施例中，绝缘子具有核苷酸测序，所述核苷酸测序具有SEQID NO：127-129中的任何一个。
病毒颗粒的产生
本领域已知的多种方法中的任何方法可以用于产生感染性慢病毒颗粒，其基因组包括病毒载体基因组的RNA拷贝。在一种方法中，将病毒载体基因组引入到包装细胞系中，所述包装细胞系含有将从病毒载体基因组转录而来的病毒基因组RNA包装成病毒颗粒所需的所有组分。可替代地，除了一种或多种所关注的序列之外，病毒载体基因组可以包括一种或多种编码病毒组分的基因。然而，为了防止基因组在靶细胞中复制，复制所需的内源病毒基因通常将被去除并且单独提供在包装细胞系中。
通常，慢病毒载体颗粒由细胞系产生，所述细胞系用一种或多种质粒载体转染，所述质粒载体含有产生颗粒所需的组分。这些慢病毒载体颗粒通常不具有复制能力，即所述慢病毒载体颗粒只能进行一轮感染。大多数情况下，多种质粒载体被用于分离产生慢病毒载体颗粒的各种遗传组分，主要是为了减少重组事件的机会，否则重组事件可能会产生具有复制能力的病毒。然而，如果需要，可以使用具有所有慢病毒组分的单个质粒载体。作为使用多种质粒载体的系统的一个实例，用以下转染细胞系：至少一种含有病毒载体基因组的质粒(即，载体基因组质粒)，包含LTR、顺式作用包装序列和通常与异源启动子可操作地连接的所关注的序列；至少一种编码病毒酶促和结构组分的质粒(即，编码如Gag和Pol等组分的包装质粒)；以及至少一种编码虫媒病毒包膜糖蛋白的包膜质粒。如本文所描述和本领域已知的，另外的质粒可以用于增强逆转录病毒颗粒产生，例如Rev-表达质粒。病毒颗粒通过细胞膜出芽并且包括核心，所述核心包含含有所关注的序列的基因组和靶向树突状细胞的虫媒病毒包膜糖蛋白。当虫媒病毒糖蛋白是辛德比斯病毒(Sindbis virus)E2糖蛋白时，所述糖蛋白被工程化为与参考毒株HR相比与硫酸乙酰肝素的结合减少。
用质粒载体转染包装细胞可以通过众所周知的方法来进行，并且对使用的方法没有任何限制。许多非病毒递送系统是本领域已知的，包含例如电穿孔、包含脂质体的基于脂质的递送系统、“裸”DNA的递送和使用聚环糊精化合物的递送，如以下中所描述的那些：Schatzlein A.G.(2001，癌症基因疗法中的非病毒载体：原理和进展(Non-Viral Vectorsin Cancer Gene Therapy：Principles and Progresses).《抗癌药物(AnticancerDrugs)》，所述文献通过引用整体并入本文。通常使用阳离子脂质或盐处理方法，参见例如Graham等人(1973，《病毒学(Virol.)》52：456；Wigler等人；1979，《美国国家科学院院刊》76：1373-76)，前述中的每个均通过引用整体并入本文。最常用的是磷酸钙沉淀法。然而，也可以使用用于将载体引入到细胞中的其它方法，包含核显微注射和细菌原生质体融合。
包装细胞系提供了反式中所需的组分，包含病毒调控蛋白和结构蛋白，用于将病毒基因组RNA包装成慢病毒载体颗粒。包装细胞系可以是任何能够表达慢病毒蛋白并产生功能性慢病毒载体颗粒的细胞系。一些合适的包装细胞系包含293(ATCC CCL X)、293T、HeLa(ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL 183)、MDCK(ATCC CCL 34)、BHK(ATCC CCL-10)和Cf2Th(ATCC CRL 1430)细胞。包装细胞系可以稳定地表达必需的病毒蛋白。此类包装细胞系描述于例如美国专利第6,218,181号，所述美国专利通过引用整体并入本文。可替代地，可以用编码一种或多种必需病毒蛋白的核酸分子连同病毒载体基因组瞬时转染包装细胞系。收集所得病毒颗粒并且用于感染靶细胞。编码包膜糖蛋白的基因通常被克隆到表达载体中，如pcDNA3(美国加利福尼亚州的英杰公司)。真核细胞表达载体是本领域众所周知的并且可从许多商业来源获得。然后用编码所关注的序列(通常编码抗原)的病毒载体基因组、至少一个编码病毒包装组分的质粒和用于表达靶向分子的载体共转染如293T细胞等包装细胞。包膜在包装细胞的膜上表达并且并入到病毒载体中。
包括多核苷酸的组合物
本公开的另一方面涉及组合物，所述组合物包括具有式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)中的任何一个的多核苷酸或其变体或片段中的一种或多种。例如，组合物可以包括具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少90％的同一性(例如，91％的同一性、92％的同一性、93％的同一性、94％的同一性、95％的同一性、96％的同一性、97％的同一性、98％的同一性、99％的同一性)。在一些实施例中，所述组合物可以包括具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有SEQ IDNO：2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个。
在一些实施例中，组合物进一步包括生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。参见例如，《雷明顿氏药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)》(1990)宾夕法尼亚州伊斯顿市的马克出版公司(Mack Publishing Co.，Easton，Pa)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂可以包含对受试者无毒的那些。在一些实施例中，组合物或组合物的一种或多种组分是无菌的。可以例如通过过滤(例如，通过无菌过滤膜)或通过辐照(例如，通过γ辐照)来制备无菌组分。
合适的组合物包含可以含有抗氧化剂、缓冲液和抑菌剂的水性和非水性等渗无菌溶液以及可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。组合物可以存在于单位剂量或多剂量密封容器中，如安瓿和小瓶，并且可以在立即使用之前仅需要添加无菌液体载体，例如水的冷冻干燥(冻干)条件下储存。可以由无菌粉末、微粒和片剂制备临时溶液和悬浮液。优选地，所述载体是缓冲盐水溶液。在一些实施例中，慢病毒载体是组合物的一部分，所述组合物被配制成在施用前保护慢病毒载体免受损害。例如，所述组合物可以被调配成减少慢病毒载体在用于制备、储存或施用慢病毒载体的装置(如玻璃器皿、注射器或针)上的损耗。在一些实施例中，所述组合物可以被调配成降低慢病毒载体的光敏感性和/或温度敏感性。为此，组合物优选地包括药学上可接受的液体载体，如上述那些液体载体以及选自由以下组成的组的稳定剂：聚山梨醇酯80、L-精氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖以及其组合。使用此类组合物将延长慢病毒载体的保质期并促进其施用。用于含有慢病毒的组合物的调配物进一步描述于例如Ausubel等人，《生物过程国际杂志(Bioprocess Int.)》，10(2)：32-43(2012)；美国专利第7,575,924号和国际专利申请公开WO 2013/139300中。
包括式(I)、(II)、(III)、(IV)和(V)中的任何一个的一种或多种多肽的组合物可以以各种方式施用于人或其它对其组织有效的动物，如局部、口服、静脉内、肌肉内、腹膜内、鼻内、皮内、鞘内、皮下、眼内、通过吸入或通过栓剂。在一个实例中，将化合物皮下施用于受试者。在另一个实例中，将化合物静脉内施用于受试者。
包括表达载体的组合物
本公开的另一方面涉及包括一种或多种表达载体的组合物例如，与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的表达载体。在一些实施例中，本公开提供了一种组合物，其包括一种或多种本文所描述的表达载体和为此的载体(例如，药学上可接受的载体)。所述组合物期望地是生理学上可接受的(例如，药学上可接受的)组合物，其包括载体例如生理学上(例如药学上)可接受的载体以及慢病毒载体。可以在本公开的上下文内使用任何合适的载体，并且此类载体是本领域众所周知的，包含上文所描述的那些中的任何一种。
宿主细胞
本公开还涉及一种产生重组多肽的方法，所述方法包括：培养如本文所描述的分离的宿主细胞并且从宿主细胞中分离重组多肽。用于从培养的宿主细胞中分离多肽的技术可以是在从选择用于表达的宿主细胞中分离多肽时已知使用或常规修改的任何技术，并且对于普通技术人员而言是显而易见的。合适的宿主细胞是可以用外源性DNA转化或转染并且在培养物中生长的那些细胞类型，并且包含细菌、真菌细胞和培养的高等真核细胞(包含多细胞生物的培养细胞)，特别是培养的哺乳动物细胞。以下公开了用于操纵克隆的DNA分子并且将外源性DNA引入到各种宿主细胞中的技术：Sambrook和Russell，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)》(第3版，纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)，2001)以及Ausubel等人，《精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)》(第4版，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)，1999)。例如，本公开的重组多肽可以由细菌大肠杆菌细胞(Escherichia coli cell)表达。
培养的哺乳动物细胞可以是用于产生在本公开内使用的重组多肽的合适宿主。用于将外源性DNA引入到哺乳动物宿主细胞的方法包含磷酸钙介导的转染(Wigler等人，《细胞》14：725，1978；Corsaro和Pearson，《体细胞遗传学(Somatic Cell Genetics)》7：603，1981：Graham和Van der Eb，《病毒学》52：456，1973)、电穿孔(Neumann等人，《欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J.)》1：841-845，1982)、DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等人，同上)以及脂质体介导的转染(Hawley-Nelson等人，《焦点(Focus)》15：73，1993；Ciccarone等人，《焦点》15：80，1993)。例如，以下公开了在培养的哺乳动物细胞中产生重组多肽：Levinson等人，美国专利第4,713,339号；Hagen等人，美国专利第4,784,950号；Palmiter等人，美国专利第4,579,821号；以及Ringold，美国专利第4,656,134号。合适的哺乳动物宿主细胞的实例包含非洲绿猴肾细胞(Vero；ATCC CRL 1587)、人胚肾细胞(293-HEK；ATCC CRL 1573)、幼仓鼠肾细胞(BHK-21、BHK-570；ATCC CRL 8544、ATCC CRL 10314)、犬肾细胞(MDCK；ATCCCCL 34)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1；ATCC CCL61；CHO DG44；CHO DXB11(犹他州洛根的海克隆公司(Hyclone，Logan，Utah))；还参见例如Chasin等人，《体细胞和分子遗传学(Som.Cell.Molec.Genet.)》12：555，1986))、大鼠垂体细胞(GH1；ATCC CCL82)、HeLa S3细胞(ATCC CCL2.2)、大鼠肝癌细胞(H-4-II-E；ATCC CRL 1548)、SV40转化的猴肾细胞(COS-1；ATCC CRL 1650)和小鼠胚胎细胞(NIH-3T3；ATCC CRL 1658)。另外的合适的细胞系是本领域已知的并且可从公共储库获得如维吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，Va)。可以使用强转录启动子，如来自SV-40或巨细胞病毒的启动子。参见例如美国专利第4,956,288号。其它合适的启动子包含来自金属硫蛋白基因的启动子(美国专利第4,579,821号和第4,601,978号)和腺病毒主要晚期启动子。
本公开还提供了用表达载体中的任何一种表达载体(例如，慢病毒表达载体)或包括本文所描述的表达载体中的任何一种表达载体的组合物转导的宿主细胞(或宿主细胞群体)。例如，可以用根据本文所描述的实施例中的任何实施例的表达载体转导宿主细胞例如，与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的表达载体。在一些实施例中，用表达载体转导宿主细胞以表达本文所描述的多肽中的任何一种多肽例如，具有与SEQ IF NO：2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少90％的同一性(例如，91％的同一性、92％的同一性、93％的同一性、94％的同一性、95％的同一性、96％的同一性、97％的同一性、98％的同一性、99％的同一性)的氨基酸序列的多肽。
在一些实施例中，宿主细胞是可容易且可靠地生长、具有相当快的生长速率、具有良好表征的表达系统并且可以用本公开的慢病毒载体容易且有效地转化、转染或转导的宿主细胞。宿主细胞可以是本领域已知的任何合适的真核细胞，包含例如酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。在一些实施例中，哺乳动物细胞用于本公开。在一个实施例中，宿主细胞是用于产生慢病毒载体颗粒的包装细胞，包含例如293T细胞(ATCC号CRL-3216)和HT1080细胞(ATCC号CCL-121)。
在一些实施例中，宿主细胞是造血干细胞或由其产生或源自其的祖细胞(包含但不限于血液中的细胞，如粒细胞/中性粒细胞、淋巴细胞、红细胞、巨核细胞/血小板和单核细胞/巨噬细胞；HSPC来源的组织-常驻细胞，如树突细胞、库普弗细胞(Kupffer cell)、小胶质细胞和破骨细胞)。造血干细胞(HSC)是从中胚层成血管细胞发育而来的多能、自我更新的祖细胞。所有分化的血细胞(即，骨髓细胞、淋巴细胞、红细胞和血小板)都来自HSC。HSC可见于成人骨髓、外周血和脐带血中。在另一个实施例中，宿主细胞是表达CD34蛋白的细胞，也称为“CD34+”细胞。CD34是一种细胞表面糖蛋白，其作为细胞-细胞粘附因子发挥作用，并且还可以介导干细胞与骨髓细胞外基质或直接与基质细胞的附着。CD34是原始血液和骨髓来源的祖细胞尤其是HSC的标志物。
在一些实施例中，宿主细胞是间充质干细胞。间充质干细胞是存在于多种组织中的多能成体干细胞，包含脐带、骨髓和脂肪组织。间充质干细胞可以通过分裂自我更新，并且可以分化成多种组织，包含骨骼、软骨、肌肉和脂肪细胞以及结缔组织。
在一些实施例中，宿主细胞是骨髓细胞。在一些实施例中，宿主细胞是肝细胞。在一些实施例中，宿主细胞是内皮细胞。
本公开的方法可以用于基因疗法方法，用于治疗遗传性或后天性疾病。基因疗法的一般方法涉及将核酸引入到细胞中，使得由引入的遗传物质编码的一种或多种基因产物在细胞中产生以恢复或增强功能活性。有关基因疗法方法的综述，参见Anderson，W.F.(1992)《科学》256：808-813；Miller，A.D.(1992)《自然》357：455-460；Friedmann，T.(1989)《科学》244：1275-1281；以及Cournoyer，D.等人(1990)《生物技术新见(Curr.Opin.Biotech.)》1：196-208)。可以针对基因疗法目的进行修饰的细胞类型包含造血干细胞、成肌细胞、肝细胞、淋巴细胞、皮肤上皮细胞和气道上皮细胞。有关细胞类型、基因和基因疗法方法的进一步描述，参见例如Wilson，J.M等人(1988)《美国国家科学院院刊》85：3014-3018；Armentano，D.等人(1990)《美国国家科学院院刊》87：6141-6145；Wolff，J.A.等人(1990)《科学》247：1465-1468；Chowdhury，J.R.等人(1991)《科学》254：1802-1805；Ferry，N.等人(1991)《美国国家科学院院刊》88：8377-8381；Wilson，J.M.等人(1992)《生物化学杂志(J.Biol Chem.)》267：963-967；Quantin，B.等人(1992)《美国国家科学院院刊》89：2581-2584；Dai，Y.等人(1992)《美国国家科学院院刊》89：10892-10895；vanBeusechem，V.W.等人(1992)《美国国家科学院院刊》89：7640-7644；Rosenfeld，M.A.等人(1992)《细胞》68：143-155；Kay，M.A.等人(1992)《人类基因疗法》3：641-647；Cristiano，R.J.等人(1993)《美国国家科学院院刊》90：2122-2126；Hwu，P.等人(1993)《免疫学杂志》150：4104-4115；以及Herz，J.和Gerard，R.D.(1993)《美国国家科学院院刊》90：2812-2816。
治疗方法
本公开的另一方面涉及一种治疗有需要的哺乳动物例如人的低磷酸酯酶症的方法。本公开的另一方面涉及一种治疗、减轻或预防哺乳动物例如人的低磷酸酯酶症症状的方法。在一些实施例中，本公开涉及治疗表征为功能性碱性磷酸酶缺乏或量不足的与骨缺损相关的病状或疾病。
在一些实施例中，所述方法包括：(a)从哺乳动物采集造血干细胞；(b)用表达载体(例如，慢病毒表达载体)或包括表达载体的组合物转导造血干细胞；以及(c)将经转导的造血干细胞移植到哺乳动物体内。在一些实施例中，表达载体包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个的至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施例中，慢病毒载体包括编码多肽的核酸序列，如具有式(I)、(II)、(III)、(IV)和(V)的多肽中的任何多肽例如具有与SEQ IDS NO：1-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少90％的同一性(例如，91％的同一性、92％的同一性、93％的同一性、94％的同一性、95％的同一性、96％的同一性、97％的同一性、98％的同一性、99％的同一性)的氨基酸序列的多肽。
可以使用本领域已知的方法从哺乳动物例如人的骨髓、外周血或脐带血中采集造血干细胞，如描述于例如Wognum等人，《医学研究档案(Arch Med Res.)》，34(6)：461-75(2003)；Ng等人，《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》，506：13-21(2009)；Weissman和Shizuru，《血液(Blood)》，112(9)：3543-3553(2008)；Frisch和Calvi，《分子生物学中的骨骼发育和修复方法(Skeletal Development and Repair Methods in MolecularBiology)》，1130：315-324(2014)；以及美国专利第8,383,404号中的那些方法。例如，可以使用针头和注射器从骨盆的髂嵴处采集HSC。可替代地，可以通过向哺乳动物(或同种异体供体)注射如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等细胞因子从循环的外周血中分离HSC，这诱导细胞离开骨髓并在血管中循环。
在一些实施例中，采集的HSC可以是“自体的”或“同种异体的”。在一些实施例中，将自体HSC从哺乳动物中取出，储存(和任选地修饰)，并且返回到同一哺乳动物。在一些实施例中，将同种异体HSC从哺乳动物中取出、储存(和任选地修饰)，并且移植到基因类似但不相同的受体中。在一些实施例中，所述细胞对于哺乳动物而言是自体的。
可以通过“转染”、“转化”或“转导”将本公开的表达载体或包括表达载体的组合物引入到造血细胞中。如本文所使用的，术语“转染”、“转化”或“转导”是指通过使用物理或化学方法将一种或多种外源性多核苷酸引入到宿主细胞中。许多转染技术是本领域已知的并且包含例如磷酸钙DNA共沉淀(参见例如Murray E.J.(编辑)，《分子生物学方法》，第7卷，基因转移和表达方案(Gene Transfer and Expression Protocols)，胡玛纳出版社(HumanaPress)(1991))；DEAE-葡聚糖；电穿孔；阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进微粒轰击(Johnston，《自然》，346：776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人，《分子与细胞生物学(Mol.Cell Biol.)》，7：2031-2034(1987))。慢病毒载体通常在感染性颗粒在合适的包装细胞中生长后被引入到宿主细胞中。
HSC可以用表达载体离体、体内或体外转导，这取决于最终应用。在一些实施例中，HSC用表达载体或包括表达载体的组合物体外转导，随后将经转导的干细胞输注到哺乳动物中。在此实施例中，可以使用本领域众所周知的方法从人类患者中取出人类干细胞并且如上文所描述的进行转导。在一些实施例中，经转导的HSC然后被重新引入到同一(自体的)或不同的哺乳动物(同种异体的)中。在一些实施例中，HSC被离体转导。
在一些实施例中，本公开的方法包括将HSC移植到有需要的哺乳动物中。造血干细胞移植(HSCT)已成为许多患有某些先天性或后天性造血系统病症或化学敏感、放射敏感或免疫敏感恶性肿瘤患者的护理标准(参见例如Gratwohl等人，《美国医学会杂志(JAMA)》，303(16)：1617-1624(2010)；以及Copelan，E.A.，《新英格兰医学杂志(NEJM)》，354：1813-1826(2006))。从受试者分离干细胞、用治疗基因(例如，抗镰状人B-珠蛋白基因)对其所述干细胞转导并且将经修饰的干细胞返回受试者的方法是本领域众所周知的(参见如Pawliuk等人，《科学》，294(5550)：2368-2371(2001)；Tyndall等人，《骨髓移植(BoneMarrow Transplant)》，24(7)：729-34(1999)；以及Burt等人，《美国医学会杂志》，299(8)：925-36(2008))。可以用于本文所描述方法的用于将HSC移植到有需要的受试者中的其它方法包含那些用于例如骨髓移植或外周血干细胞移植的方法。
在一些实施例中，造血干细胞可以通过将包括慢病毒载体和为此的载体(例如药学上可接受的载体)的上述组合物直接注射到有需要的哺乳动物体内而用表达载体转导。在一些实施例中，包括表达载体的组合物可以使用标准施用技术(例如肠胃外施用)施用于哺乳动物。如本文所使用的，术语“肠胃外”包含静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。在一些实施例中，通过静脉内、腹膜内或皮下注射，使用外周全身递送将组合物施用于哺乳动物。
在一些实施例中，本公开的方法提供哺乳动物低磷酸酯酶症的治疗。如本文所使用的，术语“治疗(treatment、treating)”等是指获得期望药理学和/或生理学效果。在一些实施例中，所述效果是治疗性的，即，所述效果部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的不利症状。在一些实施例中，将“治疗有效量”的经转导的HSC或包括表达载体的组合物施用于需要治疗的受试者。“治疗有效量”是指以剂量计，并且持续所需的时间段，以实现所希望的治疗结果的有效的量。
在一些实施例中，治疗有效量可以根据如个体的疾病状态、年龄、性别和重量以及经转导的HSC和编码的蛋白质或其变体在个体中引发期望的应答的能力等因素而变化。例如，在一些实施例中，本公开的转导的HSC的治疗有效量是导致具有式(I)、(II)、(III)、(IV)或(V)中的任何一个的多肽或其变体或片段以改善或逆转人类低磷酸酯酶症的水平表达的量。
通过体外或体内方法递送到造血干细胞的慢病毒载体的剂量通常可以是例如在1至100范围内的感染复数(MOI)(例如1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100MOI，或由上述值中的任何两个值定义的范围)；然而低于或高于此示例性范围的剂量在本公开的范围内。
在一些实施例中，慢病毒载体颗粒的剂量为1×106TU、2×106TU、3×106TU、4×106TU、5×106TU、6×106TU、7×106TU、8×106TU、9×106、1×107TU、2×107TU、3×107TU、4×107TU、5×107TU、6×107TU、7′107TU、8×107TU、9×107TU、1×108TU、2×108TU、3×108TU、4×108TU、5×108TU、6×108TU、7×108TU、8×108TU、9×108TU或1×109TU。在一些实施例中，慢病毒载体颗粒的剂量为1×106TU至5×106TU、5×106TU至1×107TU、1×107TU至5×107TU、5×107TU至1×108TU、1×108TU至5×108TU或5×108TU至1×109TU。
在一些实施例中，药理学和/或生理学效果可以是预防性的，即，效果完全或部分预防疾病或其症状。在这方面，本公开提供了一种治疗方法，所述方法包括施用“预防有效量”的经转导的HSC或包括本文所描述的表达载体中的一种或多种表达载体的组合物。“预防有效量”是指以剂量计并且持续所需的时间段以实现期望的预防结果(例如，预防疾病发作)的有效量。
治疗或预防功效可以通过定期评估所治疗的患者来监测。对于数天或更长时间内的重复施用，根据病状，可以重复治疗直到出现疾病症状的期望抑制。在一些实施例中，可以通过单次团注施用组合物或通过多次团注施用组合物来递送期望剂量。
在一些实施例中，转导的HSC或包括本文所描述的表达载体中的一种或多种表达载体的组合物可以单独或与其它药物(例如，作为佐剂)组合提供给哺乳动物。例如，经转导的HSC或包括表达载体的组合物可以与其它药剂组合施用以治疗或预防低磷酸酯酶症。例如，可以将转导的HSC提供给需要治疗的受试者，并且其中受试者同时用重组碱性磷酸酶，如可从亚力兄制药公司(Alexion Pharmaceuticals，Inc)获得的阿司福酶α治疗。可替代地，经转导的HSC可以提供给需要治疗的受试者，并且其中受试者先前用重组碱性磷酸酶治疗或将来用碱性磷酸酶，如可从亚力兄制药公司获得的阿司福酶α治疗。
可替代地，经转导的HSC可以与减少或预防一种或多种与HSC移植相关的并发症的其它药剂组合施用。此类并发症包含例如感染、败血症、粘膜炎和移植物抗宿主病(GVHD)。在这方面，经转导的HSC可以与抗病毒剂、抗凝血剂(例如，去纤维蛋白多核苷酸)、熊去氧胆酸和/或皮质类固醇(例如，泼尼松(prednisone))组合使用。一些
在特定实施例中，患者在单个静脉内剂量中接受剂量为约1×105个细胞/kg、约5×105个细胞/kg、约1×106个细胞/kg、约2×106个细胞/kg、约3×106个细胞/kg、约4×106个细胞/kg、约5×106个细胞/kg、约6×106个细胞/kg、约7×106个细胞/kg、约8×106个细胞/kg、约9×106个细胞/kg、约1×107个细胞/kg、约5×107个细胞/kg、约1×108个细胞/kg或更多的转导的造血干细胞。在某些实施例中，患者接受剂量为约1×105个细胞/kg至约1×108个细胞/kg、约1×106个细胞/kg至约1×108个细胞/kg、约1×106个细胞/kg至约9×106个细胞/kg、约2×106个细胞/kg至约8×106个细胞/kg、约2×106个细胞/kg至约8×106个细胞/kg、约2×106个细胞/kg至约5×106个细胞/kg、约3×106个细胞/kg至约5×106个细胞/kg、约3×106个细胞/kg至约4×108个细胞/kg或任何中间剂量的细胞/kg的转导的造血干细胞。
可以使用本领域现有的方法用细胞因子刺激转导的细胞以进行扩增。在各个实施例中，根据需要在数天、数月或数年内向受试者施用1、2、3、4、5或更多个剂量以维持或增加疗法。
实例
实例1-具有SEQ ID NO：5的多肽的细胞矿化抑制/拯挽救实验
细胞培养——小鼠颅骨前成骨细胞MC3T3-E1细胞(亚克隆14)用于这些实验，因为所述细胞示出与细胞外基质产生和组装相关的稳健矿化，类似于体内骨。在没有适当地加工和组装细胞外基质的情况下，许多其它成骨细胞培养系统营养不良地矿化。
将培养物在补充有10％胎牛血清(FBS)(海克隆公司)、1％青霉素-链霉素和2mML-谷氨酰胺(吉博科公司(Gibco))的最低必需培养基(MEM)(吉博科公司)中在37℃下在5％CO2的加湿气氛下维持和培养。细胞以每cm250,000个细胞铺板，并且在粘附24小时(第0天)后通过添加以下来诱导分化成成熟的成骨细胞：50μg/ml抗坏血酸(AA)(西格玛公司(Sigma))以促进胶原蛋白分泌和组装以及10mM β-甘油磷酸盐(βGP)(西格玛公司)以促进矿化，从而提供有机磷酸盐来源。每48小时更换分化培养基。
细胞增殖(MTT)——在存在各种浓度的具有SEQ ID NO：5的多肽的情况下，通过分析MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴化物)(西格玛公司)并入到活细胞中来测试细胞增殖和活力。简言之，在37℃下，将96孔板中的铺板细胞与0.25mg/ml MTT溶液一起温育3小时。温育后，将沉淀物溶解于DMSO中。在酶标仪中使用562nm波长进行分光光度测量。
如通过MTT测定测量的，即使在最高浓度(10U/ml)下，具有SEQ ID NO：5的多肽对细胞也没有毒性作用。
为了记录潜在的矿化抑制/挽救，在分化培养基(包含AA和βGP)中启动细胞培养。在第4天，测试了到含有或不含浓度为2.5μM的矿化抑制剂焦磷酸四钠(PPi)的培养基的各种浓度的具有SEQ ID NO：5的多肽，即，0.1、0.3和1.0单位/毫升，持续剩余的培养期(10天)(参见图10)。
在第10天，矿物质通过冯库萨染色可视化。将细胞在37℃下用95％乙醇固定10分钟。用d.H2O将细胞水合后，将细胞与5％硝酸银溶液(西格玛公司)在37℃下温育一小时。将细胞用d.H2O洗涤并且在室温下暴露于强光下一小时。
通过轻微振荡，沉积到细胞外基质(ECM)中的不溶性钙首先在4℃下溶解于0.5MHCl中，持续1小时。在第10天使用钙测定试剂盒(积水诊断公司(Sekisui Diagnostics))通过比色法(波长595nm)测定上清液中的钙浓度(参见图11)。
具有SEQ ID NO：5的多肽即使在最低浓度(0.1U/ml)下也能挽救PPi诱导的细胞矿化抑制。剂量范围对沉积钙浓度的效果在1.0U/mL下示出最大效果。
胶原蛋白基质沉积通过天狼星红染色(直接红80，西格玛公司)进行定量，然后使用0.1N NaOH(飞世尔公司(Fisher))溶解染色剂。来自鼠尾的1型胶原蛋白(西格玛公司)被用作生成标准曲线的标准品。使用562nm波长进行分光光度测量。
实例2-具有SEQ ID NO：2和5的多肽的体外羟基磷灰石结合测定
具有SEQ ID NO：2的未标记的多肽和具有SEQ ID NO：5的标记的多肽进行下拉测定(通过矿物质去除上清液)，如下所示：在20mM Tris(pH 7.4)；150mM NaCl中制备羟基磷灰石晶体溶液(伯克利，5μM)(HA)，并且允许在室温下轻轻搅拌平衡过夜。第二天，具有SEQID NO：2的未标记的多肽和具有SEQ ID NO：5的标记的多肽在不同浓度0.5、1.0、5.0、10.0和15.0μg/ml下与或不与0.3mg HA一起温育，并且允许在室温下在振荡器上结合一小时。将试管以10,000xg向下旋转5分钟，并且使用上清液测量每个样品的碱性磷酸酶水平。一种标准比色法，其中碱性磷酸酶用作标准品(西格玛公司)并且对硝基苯磷酸盐(西格玛公司)用作磷酸酶底物，在通过碱性磷酸酶去磷酸化时变为黄色，并且在405nm波长下测量。图12中的结果示出具有SEQ ID NO：5的标记多肽优于其未标记的对应物的强优先结合。
实例3-具有SEQ ID No：19和55的DNA构建体的分泌的TNALP活性
细胞培养——将293T细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)(吉博科公司)、1％青霉素-链霉素和2mM L-谷氨酰胺(吉博科公司)的杜氏最低必需培养基(Dublbeco′s minimumessential medium，DMEM)(吉博科公司)中在37℃下在5％CO2的加湿气氛下维持和培养。转染前一天将4e6个293T细胞铺板在50mm细胞培养皿中。
用磷酸钙转染——使用磷酸钙试剂盒(克罗泰克公司(Clonetech))将具有SEQ IDNo：19、25和55的DNA构建体引入到培养的293细胞中。将来自不同构建体的0.5μg质粒DNA与2M钙溶液混合；然后用相同体积的HEPES缓冲盐水(HBS)对其进行涡旋。在将转染溶液应用于细胞培养之前温育10分钟。
分泌的TNALP活性测定——从转染的293细胞中取出1-10uL的上清液并放入96孔板中。一种标准比色法，其中碱性磷酸酶用作标准品(艾博抗公司(Abcam))并且对硝基苯磷酸盐(pNPP)(艾博抗公司)用作磷酸酶底物，在通过碱性磷酸酶去磷酸化时变为黄色，并且在酶标仪中在405nm波长下在37℃下测量20分钟。测试样品中的TNALP活性(U/L)是基于在pH 9.6和25℃(甘氨酸缓冲液)下每分钟水解一微摩尔pNPP计算的。
将具有SEQ ID No：19的EF1a启动子驱动的TNALP DNA构建体和具有SEQ ID No：55的具有IgG2H分泌信号肽的EF1a启动子驱动的TNALP DNA构建体转染到293t细胞中，然后对细胞培养物的上清液进行分泌的TNALP测定。图13中的结果示出，具有IgG2H分泌信号肽的构建体的分泌的TNALP活性是具有原始分泌信号肽的两个构建体的分泌的TNALP活性的6倍以上，所述原始分泌信号肽带有EF1a启动子和MND启动子。
实例4-药代动力学研究
引言
所述研究的目的是在对CD 1小鼠进行单次静脉注射后，确定和比较组织非特异性碱性磷酸酶(RMP-001至RMP-008，对应于SEQ ID NO：1-8)的8种可溶性重组形式(或构建体)的概况。在将重组慢病毒载体注射到低磷酸酯酶症(HPP)患者体内后，所述构建体将由转导细胞分泌，作为一种潜在的新型基因疗法。为了实现构建体的治疗活性，构建体必须从转导的细胞中分泌，并且以与靶组织功效相容的水平分布到骨和各种其它器官中，同时维持足够的全身安全性特性。据推测，全身暴露和骨分布应该与重复皮下注射阿司福酶α后发现的那些类似，所述阿司福酶α是目前已批准用于治疗围产期/婴儿期和青少年发病的HPP的酶替代疗法。因此，在此药代动力学研究中要建立的关键参数是全身暴露(通过曲线下面积测量)和每个构建体的半衰期，这两个参数将与那些阿司福酶α进行比较。任何将被迅速清除的构建体都将被取消未来开发计划的资格。因此，此药代动力学研究将作为第一筛选步骤，随后应进行生物分布研究，其中将评估每种化合物进入骨组织的功效。
研究计划
如下表所描述的，计划通过缓慢静脉团注(超过30至60秒)一次将测试和对照项目施用于小鼠组。
表1：研究设计.*对照动物单独施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在与给药有关的以下时间点收集一系列血液样品：5、15和30分钟以及2、12、24、48和72小时(给药后)。收集血清并分析ALP浓度和随后的药代动力学参数计算。采集血液样品后，将每只动物进行安乐死并丢弃而不进行进一步检查。
选择剂量水平，因为它接近于先前示出的在低磷酸酯酶症小鼠模型中对防止骨缺损具有良好耐受性和完全有效的每日剂量(Millan等人《骨与矿物研究杂志》2008，23：777-787.)。
在先前的药代动力学研究中，雄性CD-1小鼠以10mg/kg的剂量单次静脉内施用RMP-001具有良好的耐受性，并且没有导致明显的毒性迹象。在这项研究中，最高血清碱性磷酸酶(ALP)浓度通常会在给药后5分钟出现。
测试项目表格以预先调配的溶液形式提供，用于使用或稀释，并且分2批次接收。
表2：给药组
给药当天，将第1批次测试项目从冰箱中取出并且在室温下解冻；将第二批次测试项目从储存(2至8℃)中取出用于稀释或使用。将对照项目从储存(2至8℃)中取出并且用于稀释适当的测试项目。
完全解冻或从储存中取出后：
以2mg/mL的浓度接收到测试项目3时，将其用于第4组动物的给药。
通过添加适当体积的对照项目(PBS)稀释测试项目1、2、4、5、6、7和8，以达到每个剂量组2mg/mL的最终浓度。
将其余未使用的测试项目在2至8℃下冷藏。
在完全解冻和/或稀释后的3至4小时内施用用于第2至9组的给药调配物。
测试项目调配物的分析
达到的浓度分析
为验证调配物中测试项目的浓度(稀释至2mg/mL)，代表性样品(0.5mL，一式两份)取自旨在用于第1天给药的每个浓度的中间(第3组调配物除外，因为没有稀释)。
由于体积不足，未对接收到的第二批次未稀释测试项目(RMP-001、RMP-002、RMP-003、RMP-004、RMP-005、RMP-006、RMP-007、RMP-008)(分别对应于SEQ ID NO：1-8)进行分析。
将样品冷冻存储(≤-60℃)直到转移到ITR免疫学部门。调配物样品的分析由ITR使用分析UV A280方法进行。
如下表所示，通过布拉德福方法(Bradford method)测量的原始RMP-002、RMP-003、RMP-004、RMP-005、RMP-006、RMP-007和RMP-008的浓度平均是通过UV吸光度测量的浓度的大约2倍。
表3：调配物和储备溶液中的浓度值。
注意：准确度％＝(测量浓度/预期浓度)×100。
*由于体积不足，未收集样品用于剂量调配物分析
使用与用于临床样品的条件相同的条件，在日立(Hitachi)自动分析仪c311中测量所有测试物品的酶促活性。活性以国际单位(IU)测量。基于通过测量UV吸光度获得的浓度，然后计算以IU/mg为单位的比活性。结果呈现于下表4中。
表4：在ITR处测量的以IU表示的比活性。RMP-001(参考)是于2019年11月14日接收到的第一批次，并且一直冷冻直到2020年3月20日进行分析。RMP-001*是于2019年11月14日收到的批次，解冻，在4-8℃下保存直到分析，并且用作PK研究期间所有酶促测定的参考标准。RMP-001是于2020年3月2日接收到的批次，并且用于PK研究期间用于给动物给药的测试项目的调配。RMP-003没有可用的值，因为没有足够的材料用于分析。用于计算比活性的所有浓度值均通过280nm处的UV吸光度读数获得。
同质性分析
接收到的两个RMP-001样品已通过蛋白-A捕获和制备型尺寸排阻色谱法(SEC)从粗制CHO上清液培养物中纯化，并且在天然条件下通过SEC-HPLC进行分析。所述样品的纯度示出超过98％，没有受到聚集体的污染。RMP-002至RMP-008测试项目在C末端处含有His标签扩展，允许UCLA核心实验室在Ni-Sepharose柱上进行纯化。所述测试项目在还原和非还原条件下通过SDS-PAGE条件进行分析，但未提交给SEC-HPLC分析。由于SDS-PAGE的条件可能导致溶解粗制废培养上清液中存在的任何聚集体，目前尚不清楚从UCLA核心实验室接收到的测试项目是否可能被聚集体污染。确实已知重组可溶性组织非特异性ALP具有形成聚集体的趋势。
稳定性分析
调配物在研究中的使用和/或储存条件下的稳定性，包含用于覆盖给药时间段的足够室温稳定性和研究中使用的浓度，是根据先前使用这种酶的经验来估计的。应该通过使用如SEC-HPLC或比浊法等技术定期测量所有测试项目的比活性以及在自然条件下聚集体或片段的存在来执行更严格的稳定性测试方法。
测试和对照项目的施用
用连接到注射器的皮下注射针头，通过缓慢团注静脉注射(超过30至60秒)到尾静脉中来施用测试和对照项目一次。包含对照的每个剂量组的剂量体积为2.5mL/kg。基于每只动物最近的实际体重计算和调整施用于每只小鼠的实际体积。
在完全解冻和/或稀释后的3至4小时内，将第2至9组的给药调配物施用于所有相应的动物。
丢弃每次给药后剩余的测试和对照项目调配物。
生命期观察
临床观察
对于所有动物，在研究的所有阶段期间每天至少记录一次笼侧临床体征(健康不佳、行为改变等)，详细临床检查(DCE)日除外，在详细临床检查日笼侧临床体征被DCE替代。
作为健康状况评估的一部分，每只小鼠在到达时和第-1天进行一次DCE。
体重
根据健康状况部分记录所有动物的体重，然后在分组之前至少记录一次体重。还记录了第-1天所有动物的体重。
药代动力学
样品收集、处理和生物分析
在给药后第1天从3只小鼠/时间点(第1组除外，其中血液样品在一个时间点收集)收集一系列血液样品(大约0.5mL)，如下表5所示。
表5：药代动力学给药后样品收集设计
为此目的，每只动物都用异氟醚麻醉以收集血液样品并且通过心脏穿刺放血。
在最后一次采血后，每只动物都通过放血进行安乐死，并丢弃而不进行进一步检查。
收集后，将血清血液样品在室温下静置大约30分钟以凝结，然后将样品离心(在大约4℃下以2500rpm持续10分钟)，并且回收所得血清并冷冻存储(≤-60℃)在适当标记的试管中。在ITR处使用在ITR研究编号52086下认证的碱性磷酸酶(ALP)酶促测定分析血清样品。
在此研究中没有记录药代动力学时间点偏差。原始数据中记录了抽血的位置。
应在生物分析报告中确认测试项目在适合校准范围的浓度下在生物基质中的稳定性。这应包含从样品收集直到完成样品分析的持续时间以及研究中使用的储存条件。
非房室分析
在ITR处计算药代动力学参数。
使用软件对第1天获得的血清数据集中的ALP浓度进行非-房室分析。
默认使用以下配置进行分析。
采样方法：稀疏
AUC计算方法：线性梯形法与线性插值。
Lambda Z(λz)方法：λz的最佳拟合，对数回归
加权(λz计算)：统一
下表描述了药代动力学参数(包含每个参数的缩写和说明)：
结果
剂量调配物分析
在从对照(第1组)调配物收集的样品中的任何样品中均未检测到ALP。
由于体积不足，未从第4组-RMP-003收集剂量调配物样品。
对从第2组-RMP-001(2mg/mL)收集的剂量调配物样品的分析确定ALP浓度为标称浓度的93.7％，因此被认为可接受用于研究(在标称浓度的90％至110％的接受标准内)。
对从第3组至第7组-RMP-002 RMP-004、RMP-005、RMP-006、RMP-007和RMP-008-(全都为2mg/mL)收集的剂量调配物样品的分析确定ALP浓度范围为标称浓度的44.3％至59.8％，并且出乎意料地低于标称浓度的90％至110％的接受标准。
相关原始数据的查阅示出，这些出乎意料的结果和血清ALP浓度是由于UCLA核心实验室处对RMP-002至RMP-008浓度的初步估计与通过ITR处UV吸光度读数测量的测试物品浓度之间的差异所致。动物因此被施用各种剂量的测试项目，如下表6中汇总的。由于没有足够的材料用于UV吸光度测量，因此无法确定RMP-003的实际剂量。
表6：估计每组小鼠在研究开始时接受的实际剂量。
死亡率
在本研究过程中没有死亡率。
临床体征
没有可以归因于以5mg/kg的标称剂量水平静脉内施用8种形式的测试项目的临床体征。
体重
在处理前期间记录体重以评估一般健康状况，并且出于计算剂量体积的目的，在第-1天记录体重。处理前期间记录的体重在正常生物学范围内，并且表明动物适合在整个研究过程中使用。
PK曲线
给药后72小时内与所有8个测试项目的浓度变化相关的曲线示出于图14。
每个时间点和每个测试项目的值表示针对每个测试项目的比活性校正的实际浓度。它们计算如下。通过测定每个血液样品中的活性生成的原始数据(表示为Vmax)首先使用针对参考标准RMP-001*获得的校准曲线(Vmax与浓度)转换为浓度(μg/mL)，对于所述参考标准，比活性是已知的(315.3IU/mg)。然后使用每个测试项目的RMP-001*/RMP-00X比率针对比活性校正每个浓度值(参见表4)。结果表明，大多数PK曲线(RMP-004至RMP-008)彼此非常接近，并且明显位于RMP-001曲线下方。这是预期的，因为RMP-001是Fc融合构建体，其特征在于较低的清除率导致较高的全身暴露。值得注意的是，RMP-002和RMP-003显然是所述系列数据中的异常值。RMP-002是由两个不同实验室共享的化合物，并且可能提交给次优储存和运输条件，这可能解释了其低比活性。RMP-003的量低，并且不足以通过测量UV A280测定其真实浓度。因此没有对此化合物进行校正。如果RMP-003的浓度也被高估了2倍，就像所有其它测试项目一样，那么RMP-003的PK曲线retatedhttps：//www.nytimes.com/2020/08/20/health/covid-oleandrin-trump-mypillow.html也类似于没有Fc结构域的主要化合物组。
如图15所示，与(DSS)6标记的化合物(RMP-005、RMP-006和RMP-008)相关的所有PK曲线都非常类似。此外，将(GGGGS)2接头引入RMP-005(如在RMP-006中所做的那样)对PK曲线几乎没有影响。
都带有D10标签的RMP-004和RMP-007也可以得出相同的结论(参见图16)。
Cmax/Tmax
Cmax值也可以从上述PK数据中轻松提取，并且Tmax与最早的血液样品时间(给药后5分钟)一致。同一组之间的那些值存在相当大的差异，因为当注射的化合物通过分布到其它身体隔室中而迅速从中央隔室(血液)中移除时，仅在给药后5分钟必须进行停药。对于全身注射的药物，那些值意义不大。尽管如此，所述值仍示出于图17。
曲线下面积(外推到无穷大)
血浆药物浓度-时间曲线下面积(AUC)反映了施用一定剂量药物后身体实际暴露于药物的情况，并且以毫克*小时/升表示。曲线下面积取决于药物从体内的消除速率和施用剂量。身体消除的药物总量是通过将每个时间间隔内消除的量相加或积分来评估的，从时间零(药物施用时间)到无限时间。此总量对应于到达全身循环的施用剂量的分数。AUC与药物的清除率成反比。
校正由ITR计算的原始AUCinf值以考虑每个测试项目的比活性，并呈现于图18(蓝色条)中。此外，还引入了另一个校正步骤，以归一化针对5mg/Kg剂量(绿色条)的所有AUC数据。由于AUC通常与剂量成正比，因此需要进行此校正。所述校正应尽量减少由于最初对每组施用剂量的错误估计而导致的任何差异。每个测试项目AUC都有单个值。
由于数据收集使用了稀疏抽样方法，因此无法计算SE或置信区间。
必须谨慎解释与已接受RMP-002和RMP-003的组相关的数据，因为这些化合物出于前面解释的原因在整个PK研究中表现为异常值。有趣的是，测试项目RMP-004至RMP-008的所有AUC值都大约是RMP-001的AUC的20％至40％。
测试项目清除率
在Tmax之后，测试项目血清浓度在范围为6.11小时(RMP-004)至34.6小时(RMP-001)的估计t1/2处下降，参见图19中的数据。大多数测试项目(RMP-002至RMP-008)都在15至20小时范围内。RMP-004具有如此低的半衰期值的原因尚不清楚。
测试项目以3.37毫升/小时/千克(RMP-001)至23.6毫升/小时/千克(RMP-002)的平均速率被清除(Cl)。平均分布容积(Vz)的范围为168mL/kg(RMP-001)至515mL/kg(RMP-002)，表明所有测试项目在组织中的分布最小。所有上述清除率参数均无需校正，因为所述清除率参数的评估不依赖于浓度值。
结论
所述研究的目的是比较各种形式的骨靶向TNSALP与阿司福酶α(RMP-001)的PK参数。PK数据的良好收敛表明，非Fc版本的测试项目从血流中清除的速度比阿司福酶α更快，如所预期的。然而，半衰期和全身暴露仍保持在与有效的骨靶向药物递送策略相容的范围内。在这种策略中，与较大的Fc融合体相比，较小的分子应更容易进入骨骼的矿化部分，因为所述较小的分子预期更容易从毛细血管网络渗出到骨的矿化表面中。然而，这仍有待在生物分布研究中通过实验验证。
实例5-前导候选物选择
本文描述了前导候选物“FG12w.MND.kz.IgKVIII.TNALPco(mut-miR362a).Fc.(DSS)6.WPRE”(SEQ ID NO：74)的选择。
分泌信号肽的筛选
最初，基于分泌的TNALP活性筛选各种载体。所述载体筛选包含：EF1a-RMP5、EF1a-IgG2H-RMP5(SEQ ID NO：55)、EF1a-SEAP-RMP5(SEQ ID NO：65)、EF1a-aLA-RMP5(SEQ IDNO：64)、EF1a-hCD33-RMP5(SEQ ID NO：58)、EF1a-Secrecon-RMP5(SEQ ID NO：60)、EF1a-Secrecon-AA-RMP5(SEQ ID NO：61)、EF1a-mIgKVIII-AA-RMP5(SEQ ID NO：62)和EF1a-hIgKVIII-AA-RMP5(SEQ ID NO：57)。
在第0天使用磷酸钙方法用构建体(SEQ ID NO：19、55、65、64和66)转染每孔1e5个293T细胞。在第2天测量ALP活性。结果示出，与293转染中的内源性TNALP信号肽相比，IgG2H(MGWSCIILFLVATATGVHS)(SEQ ID NO：33)通过介导＞2X分泌的ALP活性而脱颖而出。在第二轮筛选中，在第0天使用磷酸钙方法用构建体(SEQ ID NO：19、55、65、60、61、62和57)转染每孔1e5个293T细胞。在第2天测量ALP活性。选择hIgKVIII(MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCAA)(SWEQ ID NO：35)作为前导分泌信号候选物，因为ALP分泌比IgG2H增加了约46％，并且与mIgKVIII相比其免疫原性风险相对较低。结果表明，工程化信号肽可以极大地提高所公开的慢病毒构建体的TNALP分泌。图21A和21B阐释了结果。
随后，将具有SEQ ID NO：19的EF1a启动子驱动的TNALP DNA构建体和具有SEQ IDNo：55的具有IgG2H分泌信号肽的EF1a启动子驱动的TNALP DNA构建体用于通过用其它3种质粒共转染293T人胚肾细胞来产生VSVG伪型慢病毒。采集慢病毒上清液以分别以4、16和64的稀释因子转导293和Jurkat细胞。在第14天采集上清液用于ALP活性测定，并且采集细胞沉淀用于ddPCR上的VCN分析。结果示出，IgG2H信号肽在293T细胞中介导ALP分泌从59.9U/L适度增加2倍至136.4U/L(图22A)，但在Jurkat细胞中从0.069U/L显著增加超过10倍至0.782U/L(图22B)。
这些结果表明，用工程化信号肽IgG2H替代野生型TNALP信号肽不仅可以增加人胚肾细胞中的TNALP分泌，还可以增加作为HSC衍生谱系代表的造血T细胞系中的TNALP分泌。
去除易感的骨髓系miRNA结合位点
接下来，去除来自RMP5的易感骨髓谱系miRNA结合位点。762-792bp之间的RMP5序列(本文所描述的)被认为易于被miRNA362-5p靶向，而Yang等人指出MiR-362-5p在造血淋巴和骨髓谱系中高度表达(Yang，P.、Ni，F.、Deng，Rq.等人MiR-362-5p通过下调GADD45α促进慢性粒细胞白血病的恶性(MiR-362-5p promotes the malignancy of chronicmyelocytic leukemia via down-regulation of GADD45α).《分子癌症(Mol Cancer)》14，190(2015))。为了消除造血淋巴和骨髓谱系中潜在的miR-362-5p沉默，通过在769与792bp之间切换RMP5中的密码子使用，产生了两个突变(miRNA362-A和miRNA362-B)。使用磷酸钙用3个质粒(分别为SEQ ID NO：19、81和82)转染293T细胞。转染后第3天采集上清液用于ALP活性测定(参见图23A)。突变体A在293细胞转染中示出与亲本构建体相当的TNALP分泌，而miR362-B由于TNALP分泌显著减少而被丢弃(图23B)。所述构建体(SEQ ID NO：81)进一步用于产生慢病毒载体。
采集慢病毒上清液以分别以4、16和64的稀释因子转导Jurkat和K562细胞。在第14天采集上清液用于ALP活性测定，并且采集细胞沉淀用于ddPCR上的VCN分析。所述构建体(SEQ ID NO：81)在两种具有miR-362-5p高表达的骨髓细胞系中优于原始构建体(SEQ IDNO：19)超过约60％。这些结果反映了通过去除一个或多个易感骨髓谱系-miRNA结合位点来提高所公开的构建体的效力的努力。
添加翻译起始序列以促进RMP5 mRNA的有效翻译
接下来，在第0天使用磷酸钙方法用构建体(SEQ ID NO：84和85)转染每孔1e5个293T细胞，并且在第2天测量ALP活性。结果示出添加Kozak序列使TNALP分泌增加约36％。这表明添加翻译起始序列可以促进RMP5 mRNA的有效翻译。
前导候选物的选择和资格
然后基于优化的载体设计选择前导候选物。六种具有不同启动子MND/EF1a和信号肽野生型、Gigha和IgKVIII的TNALP LVV构建体(SEQ ID No：19、55、57、79、86和87)用于通过用其它3种质粒共转染293T人胚肾细胞来产生VSVG伪型慢病毒。采集慢病毒上清液以分别以4、16和64的稀释因子转导293、K562和Jurkat细胞。然后在第14天采集上清液用于ALP活性测定，并且采集细胞沉淀用于ddPCR上的VCN分析。那些慢病毒具有类似的滴度，介于5e+6与1e+7IU/mL之间(图25A)。数据(图25B-25D)表明IgG2H在转导的Jurkat和K562中优于TNALP野生型分泌信号；并且具有400-bp绝缘子的MND启动子在两种造血细胞系中优于EF1a启动子。据信添加Fc融合配偶体对三种细胞系中的TNALP分泌影响最小。还发现miR362-A突变在两种骨髓细胞系中表现优于原始构建体；并且在所有三种细胞系中，来自IgKVIII的TNALP分泌优于IgG2H。由此实验，建议将MND启动子、IgKVIII、miR362突变和Fc的组合构建体作为前导构建体。
具有两个不同的启动子(MND或EF1a)、两个不同的信号肽(IgGH或IgKVIII)、非Fc融合或Fc融合的RMP5构建体的六个TNALP LVV构建体(SEQ ID No：55、84、85、87、88和89)用于通过用其它3种质粒共转染293T人胚肾细胞来产生VSVG伪型慢病毒。采集慢病毒上清液以分别以4、16和64的稀释因子转导293细胞。然后在第14天采集上清液用于ALP活性测定，并且采集细胞沉淀用于ddPCR上的VCN分析。那些慢病毒具有类似的滴度，介于5e+6与1e+7IU/mL之间(图26A)。图26B表明Fc融合构建体——EF1-IgG2H-RMP5-Fc(SEQ ID：87)的效力(ALP/VCN)仅比非Fc融合构建体——EF1a-IgG2H-RMP5(SEQ ID：55)的效力低约20％。考虑到在Fc融合版本的小鼠模型中未观察到毒性并且进一步考虑到Fc融合版本的循环时间是非Fc融合版本的循环时间的两倍以上(6.1对15-20小时)，据信将Fc包含到前导候选物中是值得的。数据表明，密码子优化的非Fc融合/Fc融合构建体(SEQ ID NO：55和87)的效力即使不优于cDNA非Fc融合/Fc融合构建体(SEQ ID NO：88和89)的效力，也是类似的。基于数据，据信添加Kozak会将效力提高约2倍。总体而言，在293T细胞中400bp绝缘子、MND启动子、Kozak元件、IgKVIII、miR362突变和Fc的最终组合构建体1400-MND-kozak-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6(SEQ ID：85)展示了效力是候选构建体EF1-IgG2H-RMP5-Fc(SEQ ID：87)的效力的约30倍。这表明有必要组合多种工程化方法来实现优异的效力。
两个TNALP LVV构建体(1400-MND-kozak-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6 SEQID：85和EF1a-IgG2H-RMP5-Fc SEQ ID：87)用于通过用其它3种质粒共转染293T人胚肾细胞来产生VSVG伪型慢病毒。采集慢病毒上清液并且通过TFF浓缩。将人类成人动员外周血CD34+造血干细胞解冻并且用SCF、113、TPO和Flt3预刺激过夜。然后通过在存在转导增强子dmPGE2和F108的情况下将载体添加到细胞中来进行转导。将经转导的细胞的培养基更新为补充有IL3和G-CSF的SFEMII，持续7天，并且从第8天至第14天更换为含有G-CSF的SFEM II。随后在第4、8和14天取出上清液进行ALP分析。在第14天对细胞沉淀进行VCN分析。结果表明，在第4天400inMND-RMP100的效力是I400-MND-IgG2H-RMP5-Fc的效力的4.9倍，在第8天是8.5倍，并且在第14天是10倍以上(参见图27)。结果证实了293T中的发现，并且400bp绝缘子、MND启动子、Kozak元件、IgKVIII、miR362突变和Fc的最终组合构建体1400-MND-kozak-IgKVIII-RMP5(miR-A)-Fc-DSS6 SEQ ID：85)不仅在293t中，更重要的是在靶细胞——成人动员外周血CD34+造血干细胞中显著增加了ALP分泌。
具有两个不同的启动子(MND或EF1a)、两个不同的信号肽(IgGH或IgKVIII)的五个TNALP LVV构建体(SEQ ID NO：55、88、85、74和89)用于通过用其它3种质粒共转染293T人胚肾细胞来产生VSVG伪型慢病毒。病毒上清液用于以约4、约16和约64的稀释因子转导Jurkat、HL-60和THP-1细胞。在第14天采集上清液用于ALP活性测定，并且采集细胞沉淀用于ddPCR上的VCN分析。结果(图28和29)展示了在Jurkat和HL-60细胞中，与EF1a启动子相比，MND启动子提供了增加的TNFAMP活性(每VCN)表达。
四种TNALP LVV构建体(SEQ ID NO：55、85、74和90)用于通过用三种其它质粒共转染293T人胚肾细胞来产生VSVG伪型慢病毒。采集慢病毒上清液并且通过TFF[0301]浓缩。病毒上清液用于以MOI＝0.1、0.2、0.5、1、2、5和10转导293T细胞，并且以MOI＝20转导人类成人CD34+造血干细胞。将人类成人动员外周血CD34+造血干细胞解冻并且用补充有SCF、I13、TPO、Flt3、UM171和SR1的SGSM无血清培养基预刺激过夜。然后通过在存在转导增强子dmPGE2和F108的情况下，通过将载体添加到细胞中以不同的MOI进行转导。将转导的细胞的培养基更新为补充有SCF、I13、TPO、Flt3、UM171和SR1的SFEMII，持续14天。在第8天去除上清液用于ALP分析，并且在第14天对细胞沉淀进行VCN分析。结果示出，在HSC中400inMND-RMP100的效力分别是MND-RMP100的效力的约2倍并且是EF1a-RMP100的效力的约8倍(参见图30A-30C)。
三种TNALP LVV构建体(SEQ ID NO：85、74和90)用于通过用三种其它质粒共转染293T人胚肾细胞来产生VSVG伪型慢病毒。采集慢病毒上清液并且通过TFF浓缩。将人类成人动员外周血CD34+造血干细胞解冻并且用SCF、I13、TPO和Flt3预刺激过夜。然后通过在存在转导增强子dmPGE2和F108的情况下，通过将载体添加到细胞中以不同的MOI进行转导。在读出集落之前，将经转导的HSC接种在Methocult纤维素中，持续14天。CFU数据表明，与模拟物HSC相比，在MOI为5至20下，用MND-400in-RMP100、EF1a-RMP100和MND-RMP100转导的HSC具有类似的集落形成能力。HSC中的所有构建体均未观察到明显毒性(参见图31A和31B)。
三种TNALP LVV构建体(SEQ ID NO：85、74和90)用于通过用三种其它质粒共转染293T人胚肾细胞来产生VSVG伪型慢病毒。采集慢病毒上清液并且用于以4、16和64的稀释因子转导THP-1、Jurkat和HLP-60。转导后，将经转导的细胞培养长达56天，并且分别在第14、28、42和56天收集细胞沉淀用于VCN分析。所有构建体在转导细胞系THP-1、HL-60和Jurkat中均表现出稳健的稳定性(参见图32A-32D)。
在本说明书中引用的和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物以全文引用的方式并入本文中。如果需要，可以修改实施例的各方面，以采用各种专利、申请和出版物的概念来提供又进一步的实施例。
本文公开了本公开的另外的实施例，包含某些另外的实施例的替代方案。在另外的实施例依赖于包含一个或多个替代方案的所参考的另外的实施例的情况下，所述从属的另外的实施例特此指代所参考的另外的实施例以及其描述的替代方案中的任何替代方案。
尽管已经参考多个说明性实施例描述了本公开，但是应该理解，本领域技术人员可以设计出许多其它修改和实施例，所述修改和实施例将落入本公开的原理的精神和范围内。更具体地，在不脱离本公开的精神的情况下，在前述公开、附图和所附权利要求的范围内，可以对主题组合布置的组成部分和/或布置进行合理的变化和修改。除了组成部分和/或布置的变化和修改之外，替代使用对于本领域技术人员来说也将是显而易见的。
另外的实施例1.一种多肽，其包括式(I)：
[A]v-[B]-[C]w-[R]q-([D]x-[E]y)z， (I)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括与SEQ ID NO：11具有至少90％序列同一性的氨基酸序列(例如，与SEQ IDNO：11至少约95％的序列同一性、与SEQ ID NO：11至少约96％的序列同一性、与SEQ ID NO：11至少约97％的序列同一性、与SEQ ID NO：11至少约98％的序列同一性、与SEQ ID NO：11至少约99％的序列同一性、或与SEQ ID NO：11100％的序列同一性)；
C包括编码GPI锚的氨基酸序列；
R是-(Mo(Fc)Np)-，其中M和N各自独立地包含1至6个氨基酸，其中Fc是Fc结构域，并且o和p各自独立地是0、1或2；
D包括具有4至6个氨基酸的氨基酸序列，或者是F(G)tF，其中每个F是相同的氨基酸，G是具有3、4或5个氨基酸的氨基酸序列，并且t是范围为2至5的整数；
E包括具有1至8个氨基酸的氨基酸序列；
q是0或1；
v是0或1；
w是0或1；
x是0或范围为1至6的整数；
y是0或范围为1至16的整数；并且
z是0或范围为1至6的整数。
另外的实施例2.根据另外的实施例1所述的多肽，其中[A]v-[B]-[C]w包括与SEQID NO：10具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
另外的实施例3.根据另外的实施例1所述的多肽，其中[A]v-[B]-[C]w包括具有SEQID NO：10的氨基酸序列。
另外的实施例4.根据另外的实施例1所述的多肽，其中A包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少95％同一性的氨基酸序列。
另外的实施例5.根据另外的实施例1所述的多肽，其中A包括具有SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个的氨基酸序列。
另外的实施例6.根据任何另外的实施例1所述的多肽，其中v是1并且w是0。可替代地，根据任何另外的实施例1所述的多肽，其中v是1，w是0，并且q是0。可替代地，根据任何另外的实施例1所述的多肽，其中v是1，w是0，q是0，并且z是1。可替代地，根据任何另外的实施例1所述的多肽，其中v是1，w是0，并且q是1。可替代地，根据任何另外的实施例1所述的多肽，其中v是1，w是0，q是1，并且z是1。
另外的实施例7.根据另外的实施例1和4至5中任一项所述的多肽，其中z是0。
另外的实施例8.根据另外的实施例1和4至6中任一项所述的多肽，其中x是0。
另外的实施例9.根据另外的实施例1所述的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO：2具有至少95％的序列同一性。
另外的实施例10.根据另外的实施例1所述的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO：2。
另外的实施例11.根据另外的实施例1、4和5中任一项所述的多肽，其中E包括至多两个氨基酸。
另外的实施例12.根据另外的实施例1、4和5中任一项所述的多肽，其中E包括1个氨基酸。
另外的实施例13.根据另外的实施例11和12中任一项所述的多肽，其中E包括天冬氨酸。
另外的实施例14.根据另外的实施例11至13中任一项所述的多肽，其中y的范围介于8与12之间。可替代地，根据另外的实施例11至13中任一项所述的多肽，其中y的范围介于8与12之间，并且q是0。可替代地，根据另外的实施例11至13中任一项所述的多肽，其中y的范围介于8与12之间，q是0，并且z是1。可替代地，根据另外的实施例11至13中任一项所述的多肽，其中y的范围介于8与12之间，并且q是1。可替代地，根据另外的实施例11至13中任一项所述的多肽，其中y的范围介于8与12之间，q是1，并且z是1。
另外的实施例15.根据另外的实施例11至14中任一项所述的多肽，其中v是1并且w是0。可替代地，根据另外的实施例11至14中任一项所述的多肽，其中v是1，w是0，并且q是0。可替代地，根据另外的实施例11至14中任一项所述的多肽，其中v是1，w是0，q是0，并且z是1。可替代地，根据另外的实施例11至14中任一项所述的多肽，其中v是1并且w是0，并且q是1。可替代地，根据另外的实施例11至14中任一项所述的多肽，其中v是1并且w是0，q是1，并且z是1。
另外的实施例16.根据另外的实施例11至15中任一项所述的多肽，其中x是0。
另外的实施例17.根据另外的实施例11至16中任一项所述的多肽，其中y是10。可替代地，根据另外的实施例11至16中任一项所述的多肽，其中y是10，并且q是0。可替代地，根据另外的实施例11至16中任一项所述的多肽，其中y是10，q是0，并且z是1。可替代地，根据另外的实施例11至16中任一项所述的多肽，其中y是10，并且q是1。可替代地，根据另外的实施例11至16中任一项所述的多肽，其中y是10，q是1，并且z是1。
另外的实施例18.根据另外的实施例1所述的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO：3具有至少95％的序列同一性。
另外的实施例19.根据另外的实施例1所述的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO：3。
另外的实施例20.根据另外的实施例1、4和5中任一项所述的多肽，其中D包括至多5个氨基酸。
另外的实施例21.根据另外的实施例20所述的多肽，其中所述至多5个氨基酸中的至少三个连续的氨基酸相同。可替代地，根据另外的实施例20所述的多肽，其中所述至多5个氨基酸中的至少四个连续的氨基酸相同。
另外的实施例22.根据另外的实施例21所述的多肽，其中所述至少三个连续的氨基酸各自是甘氨酸。可替代地，根据另外的实施例21所述的多肽，其中所述至少三个连续的氨基酸各自是甘氨酸，并且其中q是0。可替代地，根据另外的实施例21所述的多肽，其中所述至少三个连续的氨基酸各自是甘氨酸，并且其中q是1。
另外的实施例23.根据另外的实施例20至22中任一项所述的多肽，其中x是范围为1至3的整数。
另外的实施例24.根据另外的实施例20至22中任一项所述的多肽，其中x是2。
另外的实施例25.根据另外的实施例20至24中任一项所述的多肽，其中y是范围介于4与8之间的整数。
另外的实施例26.根据另外的实施例25所述的多肽，其中y介于5与7之间。
另外的实施例27.根据另外的实施例25至26中任一项所述的多肽，其中y是6。
另外的实施例28.根据另外的实施例20至27中任一项所述的多肽，其中E包括3个氨基酸。
另外的实施例29.根据另外的实施例28所述的多肽，其中所述三个氨基酸中的至少2个连续的氨基酸相同。
另外的实施例30.根据另外的实施例20至29中任一项所述的多肽，其中E包括-asp-ser-ser-。
另外的实施例31.根据另外的实施例1所述的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO：6具有至少95％的序列同一性。
另外的实施例32.根据另外的实施例1所述的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO：6。
另外的实施例33.根据另外的实施例20至24中任一项所述的多肽，其中y介于8与12之间。
另外的实施例34.根据另外的实施例20至24中任一项所述的多肽，其中y是10。
另外的实施例35.根据另外的实施例20至24和33至34中任一项所述的多肽，其中E包括1或2个氨基酸。
另外的实施例36.根据另外的实施例20至24和33至35中任一项所述的多肽，其中E包括1个氨基酸。
另外的实施例37.根据另外的实施例20至24和33至36中任一项所述的多肽，其中E仅包括天冬氨酸氨基酸。
另外的实施例38.根据另外的实施例1所述的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO：4具有至少95％的序列同一性。
另外的实施例39.根据另外的实施例1所述的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO：4。
另外的实施例40.根据另外的实施例1、4和5中任一项所述的多肽，其中E包括2至4个氨基酸。可替代地，根据另外的实施例1、4和5中任一项所述的多肽，其中E包括2至4个氨基酸，并且其中q是0。可替代地，根据另外的实施例1、4和5中任一项所述的多肽，其中E包括2至4个氨基酸，q是0，并且z是1。可替代地，根据另外的实施例1、4和5中任一项所述的多肽，其中E包括2至4个氨基酸，并且其中q是1。可替代地，根据另外的实施例1、4和5中任一项所述的多肽，其中E包括2至4个氨基酸，q是1，并且z是1。
另外的实施例41.根据另外的实施例40所述的多肽，其中E包括3个氨基酸。
另外的实施例42.根据另外的实施例40至41中任一项所述的多肽，其中所述3个氨基酸中的至少2个连续的氨基酸相同。
另外的实施例43.根据另外的实施例40至42中任一项所述的多肽，其中y的范围为3至8，优选地其中y的范围为4至8。
另外的实施例44.根据另外的实施例40至42中任一项所述的多肽，其中y的范围为5至7。
另外的实施例45.根据另外的实施例40至42中任一项所述的多肽，其中y是6。
另外的实施例46.根据另外的实施例40至45中任一项所述的多肽，其中E包括-asp-ser-ser-。
另外的实施例47.根据另外的实施例40至46中任一项所述的多肽，其中v是1并且w是0。
另外的实施例48.根据另外的实施例1所述的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO：5和44-54中的任何一个具有至少95％的序列同一性。
另外的实施例49.根据另外的实施例1所述的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO：5和44-54中的任何一个。
另外的实施例50.根据另外的实施例40至47中任一项所述的多肽，其中编码GPI锚的所述氨基酸序列与SEQ ID NO：13具有至少95％的序列同一性(例如，与SEQ ID NO：13至少96％的序列同一性、与SEQ ID NO：13至少97％的序列同一性、与SEQ ID NO：13至少98％的序列同一性、与SEQ ID NO：13至少99％的序列同一性或其中所述GPI锚包括SEQ ID NO：13)。
另外的实施例51.根据另外的实施例40至47中任一项所述的多肽，其中编码GPI锚的所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：14(例如，与SEQ ID NO：14至少96％的序列同一性、与SEQ ID NO：14至少97％的序列同一性、与SEQ ID NO：14至少98％的序列同一性、与SEQ IDNO：14至少99％的序列同一性或其中所述GPI锚包括SEQ ID NO：14)。
另外的实施例52.根据另外的实施例1所述的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO：8具有至少95％的序列同一性。
另外的实施例53.根据另外的实施例1所述的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO：8。
另外的实施例54.根据另外的实施例11至17中任一项所述的多肽，其中v是1并且w是1。
另外的实施例55.根据另外的实施例54所述的多肽，其中编码GPI锚的所述氨基酸序列与SEQ ID NO：13具有至少95％的序列同一性(例如，与SEQ ID NO：13至少96％的序列同一性、与SEQ ID NO：13至少97％的序列同一性、与SEQ ID NO：13至少98％的序列同一性、与SEQ ID NO：13至少99％的序列同一性或其中所述GPI锚包括SEQ ID NO：13)。
另外的实施例56.根据另外的实施例54所述的多肽，编码GPI锚的所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：14(例如，与SEQ ID NO：14至少96％的序列同一性、与SEQ ID NO：14至少97％的序列同一性、与SEQ ID NO：14至少98％的序列同一性、与SEQ ID NO：14至少99％的序列同一性或其中所述GPI锚包括SEQ ID NO：14)。
另外的实施例57.根据另外的实施例1所述的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO：7有至少95％的序列同一性。
另外的实施例58.根据另外的实施例1所述的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO：7。
另外的实施例59.一种慢病毒载体，其包含编码根据另外的实施例1至58中任一项所述的多肽的核酸序列。
另外的实施例60.根据另外的实施例59所述的慢病毒载体，其中编码所述多肽的所述核酸序列与启动子可操作地连接。
另外的实施例61.根据另外的实施例59至60中任一项所述的慢病毒载体，其中所述启动子选自由以下组成的组：EF1A、MND、CD11b、CD68LPp、EF1a1、EFS和UbC。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少95％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少96％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少97％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少95％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少98％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少99％同一性。在一些实施例中，所述启动子包括SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个。
另外的实施例62.根据另外的实施例59至61中任一项所述的慢病毒载体，其进一步包括UCOE启动子元件。
另外的实施例63.根据另外的实施例59至62中任一项所述的慢病毒载体，其进一步包括选自由以下组成的组的绝缘子：cHS 400bp绝缘子、工程化突变体cHS 400bp绝缘子——m3SD400in和m6SD400in。+-
另外的实施例64.根据另外的实施例59至63中任一项所述的慢病毒载体，其进一步包括一个或多个支架/基质附着区。
另外的实施例65.根据另外的实施例59至64中任一项所述的慢病毒载体，其进一步包括WPRE元件。可替代地，根据另外的实施例59至64中任一项所述的慢病毒载体，其进一步包括WPRE元件并且进一步包含RRE、cPPT/CTS和bGH-poly(A)信号。
另外的实施例66.根据另外的实施例59至64中任一项所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体不包含WPRE元件。可替代地，根据另外的实施例59至64中任一项所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体不包含WPRE元件，但包含RRE、cPPT/CTS和bGH-poly(A)信号。
另外的实施例67.根据另外的实施例59所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
另外的实施例68.根据另外的实施例59所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少95％序列同一性的核苷酸序列(例如，与SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少96％序列同一性；与SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97中的任何一个具有97％序列同一性)。
另外的实施例69.根据另外的实施例59所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少98％序列同一性的核苷酸序列。
另外的实施例70.根据另外的实施例59所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少99％序列同一性的核苷酸序列。
另外的实施例71.根据另外的实施例59所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒病毒载体包括具有SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个的核苷酸序列。
另外的实施例72.一种慢病毒载体，其包括与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
另外的实施例73.根据另外的实施例72所述的慢病毒载体，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少95％的序列同一性。
另外的实施例74.根据另外的实施例72所述的慢病毒载体，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少96％的序列同一性。
另外的实施例75.根据另外的实施例72所述的慢病毒载体，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少97％的序列同一性。
另外的实施例76.根据另外的实施例72所述的慢病毒载体，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少98％的序列同一性。
另外的实施例77.根据另外的实施例72所述的慢病毒载体，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少99％的序列同一性。
另外的实施例78.根据另外的实施例72所述的慢病毒载体，其中所述核苷酸序列包括SEQ ID NO：15-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个。
另外的实施例79.一种宿主细胞群体，其用根据另外的实施例59至78中任一项所述的任何慢病毒载体转导。
另外的实施例80.一种转导宿主细胞群体的方法，所述方法包括：获得宿主细胞群体；以及使所获得的宿主细胞群体与根据另外的实施例59至78任一项所述的慢病毒载体接触。
另外的实施例81.根据另外的实施例80所述的方法，其中转导离体发生。
另外的实施例82.一种药物组合物，其包括根据另外的实施例79所述的经转导的宿主细胞以及药学上可接受的赋形剂或载体。
另外的实施例83.一种治疗哺乳动物受试者的方法，所述方法包括向所述哺乳动物受试者施用治疗有效量的另外的实施例79的经转导的宿主细胞或根据另外的实施例82所述的药物组合物。
另外的实施例84.根据另外的实施例1至83中任一项所述的多肽，其中所述式(I)的多肽不具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或由SEQ ID NO：107的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或条件是所述式(I)的多肽不是或阿司福酶α。
另外的实施例85.根据另外的实施例1至83中任一项所述的多肽，其中当v是1，w是0，q是1，o是1，p是1，N是二氨基酸-D-I-，M是二氨基酸-L-K-，[B]包括SEQ ID NO：11，Fc包括，并且x是0时，那么[E]y不是D10-D16。
另外的实施例86.一种多肽，其包括式(I)：
[A]v-[B]-[C]w-[R]q-([D]x-[E]y)z， (I)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括与SEQ ID NO：11具有至少90％序列同一性的氨基酸序列(例如，与SEQ IDNO：11至少约95％的序列同一性、与SEQ ID NO：11至少约96％的序列同一性、与SEQ ID NO：11至少约97％的序列同一性、与SEQ ID NO：11至少约98％的序列同一性、与SEQ ID NO：11至少约99％的序列同一性、或与SEQ ID NO：11100％的序列同一性)；
C包括编码GPI锚的氨基酸序列；
R是-(Mo(Fc)Np)-，其中M和N各自独立地包含1至6个氨基酸，其中Fc是Fc结构域，并且o和p各自独立地是0、1或2；
D包括具有4至6个氨基酸的氨基酸序列，或者是F(G)tF，其中每个F是相同的氨基酸，G是具有3、4或5个氨基酸的氨基酸序列，并且t是范围为2至5的整数；
E包括具有1至8个氨基酸的氨基酸序列；
q是0或1；
v是0或1；
w是0或1；
x是0或范围为1至6的整数；
y是0或范围为1至16的整数；并且
z是0或范围为1至6的整数；
条件是所述式(I)的多肽未与如葡聚糖等糖分子缀合。
另外的实施例87.一种多肽，其包括式(I)：
[A]v-[B]-[C]w-[R]q-([D]x-[E]y)z， (I)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括与SEQ ID NO：11具有至少90％序列同一性的氨基酸序列(例如，与SEQ IDNO：11至少约95％的序列同一性、与SEQ ID NO：11至少约96％的序列同一性、与SEQ ID NO：11至少约97％的序列同一性、与SEQ ID NO：11至少约98％的序列同一性、与SEQ ID NO：11至少约99％的序列同一性、或与SEQ ID NO：11100％的序列同一性)；
C包括编码GPI锚的氨基酸序列；
R是-(Mo(Fc)Np)-，其中M和N各自独立地包含1至6个氨基酸，其中Fc是Fc结构域，并且o和p各自独立地是0、1或2；
D包括具有4至6个氨基酸的氨基酸序列，或者是F(G)tF，其中每个F是相同的氨基酸，G是具有3、4或5个氨基酸的氨基酸序列，并且t是范围为2至5的整数；
E包括具有1至8个氨基酸的氨基酸序列；
q是0或1；
v是0或1；
w是0或1；
x是0或范围为1至6的整数；
y是0或范围为1至16的整数；并且
z是0或范围为1至6的整数，
条件是具有式(I)的多肽不包括SEQ ID NO：1或其中具有式(I)的多肽与SEQ IDNO：1具有小于100％的序列同一性优选地与SEQ ID NO：1具有小于99％的序列同一性，更优选地与SEQ ID NO：1具有小于98％的序列同一性。
另外的实施例88.一种慢病毒载体，其包含编码根据另外的实施例84至87中任一项所述的多肽的核酸序列。
另外的实施例89.根据另外的实施例88所述的慢病毒载体，其中编码所述多肽的所述核酸序列与启动子可操作地连接。
另外的实施例90.根据另外的实施例88至89中任一项所述的慢病毒载体，其中所述启动子选自由以下组成的组：EF1A、MND、CD11b、CD68LP、EF1a1、EFS和UbC。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少95％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少96％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少97％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少95％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少98％同一性。在一些实施例中，所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少99％同一性。在一些实施例中，所述启动子包括SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个。
另外的实施例91.根据另外的实施例88至90中任一项所述的慢病毒载体，其进一步包括UCOE启动子元件。
另外的实施例92.根据另外的实施例88至91中任一项所述的慢病毒载体，其进一步包括绝缘子。
另外的实施例93.根据另外的实施例88至92中任一项所述的慢病毒载体，其进一步包括一个或多个支架/基质附着区。
另外的实施例94.根据另外的实施例88至93中任一项所述的慢病毒载体，其进一步包括WPRE元件。可替代地，根据另外的实施例59至64中任一项所述的慢病毒载体，其进一步包括WPRE元件并且进一步包含RRE、cPPT/CTS和bGH-poly(A)信号。
另外的实施例95.根据另外的实施例88至94中任一项所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体不包含WPRE元件。可替代地，根据另外的实施例88至94中任一项所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体不包含WPRE元件，但包含RRE、cPPT/CTS和bGH-poly(A)信号。
另外的实施例96.一种宿主细胞群体，其用根据另外的实施例88至95中任一项所述的任何慢病毒载体转导。
另外的实施例97.一种转导宿主细胞群体的方法，所述方法包括：获得宿主细胞群体；以及使所获得的宿主细胞群体与根据另外的实施例88至94中任一项所述的慢病毒载体接触。
另外的实施例98.根据另外的实施例97所述的方法，其中转导离体发生。
另外的实施例99.一种药物组合物，其包括根据另外的实施例97所述的经转导的宿主细胞以及药学上可接受的赋形剂或载体。
另外的实施例100.一种治疗哺乳动物受试者的方法，所述方法包括向所述哺乳动物受试者施用治疗有效量的另外的实施例97的经转导的宿主细胞或根据另外的实施例99所述的药物组合物。
另外的实施例101.一种多肽，其包括式(I)：
[A]v-[B]-[C]w-[R]q-([D]x-[E]y)z， (I)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括与SEQ ID NO：11具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
C包括编码GPI锚的氨基酸序列；
R是-(Mo(Fc)Np)-，其中M和N各自独立地包含1至6个氨基酸，其中Fc是Fc结构域，并且o和p各自独立地是0、1或2；
D包括具有4至6个氨基酸的氨基酸序列，或者是F(G)tF，其中每个F是相同的氨基酸，G是具有3、4或5个氨基酸的氨基酸序列，并且t是范围为2至5的整数；
E包括具有1至8个氨基酸的氨基酸序列；
q是0或1；
v是0或1；
w是0或1；
x是0或范围为1至6的整数；
y是0或范围为1至16的整数；并且
z是0或范围为1至6的整数。
另外的实施例102.根据另外的实施例101所述的多肽，其中[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
另外的实施例103.根据另外的实施例101所述的多肽，其中[A]v-[B]-[C]w包括具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
另外的实施例104.根据另外的实施例101所述的多肽，其中A包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少95％同一性的氨基酸序列。
另外的实施例105.根据另外的实施例101所述的多肽，其中A包括具有SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个的氨基酸序列。
另外的实施例106.根据另外的实施例104和105中任一项所述的多肽，其中v是1并且w是0。
另外的实施例107.根据另外的实施例104至106中任一项所述的多肽，其中z是0。
另外的实施例108.根据另外的实施例104至106中任一项所述的多肽，其中x是0。
另外的实施例109.根据另外的实施例101所述的多肽，其中所述多肽与SEQ IDNO：2有至少95％的序列同一性。
另外的实施例110.根据另外的实施例101所述的多肽，其中所述多肽包括SEQ IDNO：2。
另外的实施例111.根据另外的实施例101所述的多肽，其中E包括至多两个氨基酸。
另外的实施例112.根据另外的实施例101所述的多肽，其中E包括1个氨基酸。
另外的实施例113.根据另外的实施例111和112中任一项所述的多肽，其中E包括天冬氨酸。
另外的实施例114.根据另外的实施例111至113中任一项所述的多肽，其中y的范围介于8与12之间。
另外的实施例115.根据另外的实施例111至113中任一项所述的多肽，其中v是1并且w是0。
另外的实施例116.根据另外的实施例111至115中任一项所述的多肽，其中x是0。
另外的实施例117.根据另外的实施例111至113中任一项所述的多肽，其中y是10。
另外的实施例118.根据另外的实施例101所述的多肽，其中所述多肽与SEQ IDNO：3具有至少95％的序列同一性。
另外的实施例119.根据另外的实施例101所述的多肽，其中所述多肽包括SEQ IDNO：3。
另外的实施例120.根据另外的实施例101所述的多肽，D包括至多5个氨基酸。
另外的实施例121.根据另外的实施例120所述的多肽，其中所述至多5个氨基酸中的至少三个连续的氨基酸相同。
另外的实施例122.根据另外的实施例121所述的多肽，其中所述至少三个连续的氨基酸各自是甘氨酸。
另外的实施例123.根据另外的实施例120至122中任一项所述的多肽，其中x是范围为1至3的整数。
另外的实施例124.根据另外的实施例120至122中任一项所述的多肽，其中x是2。
另外的实施例125.根据另外的实施例120至124中任一项所述的多肽，其中y是范围介于4与8之间的整数。
另外的实施例126.根据另外的实施例120至124中任一项所述的多肽，其中y介于5与7之间。
另外的实施例127.根据另外的实施例121至124中任一项所述的多肽，其中y是6。
另外的实施例128.根据另外的实施例120至127中任一项所述的多肽，其中E包括3个氨基酸。
另外的实施例129.根据另外的实施例128所述的多肽，其中所述三个氨基酸中的至少2个连续的氨基酸相同。
另外的实施例130.根据另外的实施例120至129中任一项所述的多肽，其中E包括-asp-ser-ser-。
另外的实施全131.根据另外的实施例101所述的多肽，其中所述多肽与SEQ IDNO：6有至少95％的序列同一性。
另外的实施例132.根据另外的实施例101所述的多肽，其中所述多肽包括SEQ IDNO：6。
另外的实施例133.根据另外的实施例120至124中任一项所述的多肽，其中y介于8与12之间。
另外的实施例134.根据另外的实施例120至124中任一项所述的多肽，其中y是10。
另外的实施例135.根据另外的实施例120至124和133至134中任一项所述的多肽，其中E包括1或2个氨基酸。
另外的实施例136.根据另外的实施例120至124和133至135中任一项所述的多肽，其中E包括1个氨基酸。
另外的实施例137.根据另外的实施例120至124和133至136中任一项所述的多肽，其中E包括单个天冬氨酸氨基酸。
另外的实施例138.根据另外的实施例101所述的多肽，其中所述多肽与SEQ IDNO：4具有至少95％的序列同一性。
另外的实施例139.根据另外的实施例101所述的多肽，其中所述多肽包括SEQ IDNO：4。
另外的实施例140.根据另外的实施例101所述的多肽，其中E包括2至4个氨基酸。
另外的实施例141.根据另外的实施例140所述的多肽，其中E包括3个氨基酸。
另外的实施例142.根据另外的实施例140至141中任一项所述的多肽，其中所述3个氨基酸中的至少2个连续的氨基酸相同。
另外的实施例143.根据另外的实施例140至142中任一项所述的多肽，其中y的范围为4至8。
另外的实施例144.根据另外的实施例140至143中任一项所述的多肽，其中y的范围为5至7。
另外的实施例145.根据另外的实施例140至144中任一项所述的多肽，其中y是6。
另外的实施例146.根据另外的实施例140至145中任一项所述的多肽，其中E包括-asp-ser-ser-。
另外的实施例147.根据另外的实施例140至146中任一项所述的多肽，其中v是1并且w是0。
另外的实施例148.根据另外的实施例101所述的多肽，其中所述多肽与SEQ IDNO：5和44至54中的任何一个具有至少95％的序列同一性。
另外的实施例149.根据另外的实施例101所述的多肽，其中所述多肽包括SEQ IDNO：5和44-54中的任何一个。
另外的实施例150.根据另外的实施例140至147中任一项所述的多肽，其中编码GPI锚的所述氨基酸序列与SEQ ID NO：13具有至少95％的序列同一性。
另外的实施例151.根据另外的实施例140至147中任一项所述的多肽，其中编码GPI锚的所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：14。
另外的实施例152.根据另外的实施例101所述的多肽，其中所述多肽与SEQ IDNO：8有至少95％的序列同一性。
另外的实施例153.根据另外的实施例101所述的多肽，其中所述多肽包括SEQ IDNO：8。
另外的实施例154.根据另外的实施例111至114中任一项所述的多肽，其中v是1并且w是1。
另外的实施例155.根据另外的实施例154所述的多肽，其中编码GPI锚的所述氨基酸序列与SEQ ID NO：13具有至少95％的序列同一性。
另外的实施例156.根据另外的实施例154所述的多肽，编码GPI锚的所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：14。
另外的实施例157.根据另外的实施例101所述的多肽，其中所述多肽与SEQ IDNO：7有至少95％的序列同一性。
另外的实施例158.根据另外的实施例101所述的多肽，其中所述多肽包括SEQ IDNO：7。
另外的实施例159.根据另外的实施例101所述的多肽，其中R包括与SEQ ID NO：9至少99％的同一性。
另外的实施例160.根据另外的实施例101所述的多肽，其中R包括SEQ ID NO：9。
另外的实施例161.根据另外的实施例101所述的多肽，其中o、p和q各自是1。
另外的实施例162.根据另外的实施例161所述的多肽，其中M包括2个氨基酸；并且其中N包括两个氨基酸；并且其中M和N不同。
另外的实施例163.根据另外的实施例162所述的多肽，其中M是-L-K-。
另外的实施例164.根据另外的实施例162所述的多肽，其中N是-D-I-。
另外的实施例165.根据另外的实施例101所述的多肽，其中[R]是-[L-K]-Fc-[D-I]-，并且其中Fc包括与SEQ ID NO：130至少99％的同一性。
另外的实施例166.根据另外的实施例101所述的多肽，其中所述多肽不包括末端poly-Asp。
另外的实施例167.根据另外的实施例101所述的多肽，其中所述多肽不包括十个至十六个连续的天冬氨酸残基。
另外的实施例168.根据另外的实施例101所述的多肽，其中所述多肽不包括具有十个至十六个连续的天冬氨酸残基的末端poly-Asp。
另外的实施例169.根据另外的实施例101所述的多肽，其中所述多肽不GPI信号肽。
另外的实施例170.根据另外的实施例101所述的多肽，其中所述多肽包括十七个或更多个连续的天冬氨酸残基。
另外的实施例171.根据另外的实施例101所述的多肽，其中所述多肽包括具有十七个或更多个连续的天冬氨酸残基的末端poly-Asp，和任选地Fc结构域。
另外的实施例172.根据另外的实施例101所述的多肽，其中所述多肽包括十个至十六个连续的带负电荷的氨基酸，其中所述带负电荷的氨基酸不是天冬氨酸。
另外的实施例173.根据另外的实施例101所述的多肽，其中所述多肽包括十个至十六个连续的谷氨酸残基。
另外的实施例174.根据另外的实施例101所述的多肽，其中[E]包括至少两个不同的氨基酸。
另外的实施例175.一种表达载体，其包括编码根据另外的实施例101至175中任一项所述的多肽的核苷酸序列。
Claims (216)
1.一种多肽，其包括式(1A)：
[A]v-[B]-[C]w-[R]q-([D]x-[E]y)z， (IA)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括与SEQ ID NO：11具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
C包括编码GPI锚的氨基酸序列；
R是-(Mo(Fc)Np)-，其中M和N各自独立地包含1至6个氨基酸，其中Fc是Fc结构域，并且o和p各自独立地是0、1或2；
D包括具有4至6个氨基酸的氨基酸序列，或者是F(G)tF，其中每个F是相同的氨基酸，G是具有3、4或5个氨基酸的氨基酸序列，并且t是范围为2至5的整数；
E包括具有1至8个氨基酸的氨基酸序列；
q是0或1；
v是0或1；
w是0或1；
x是0或范围为1至6的整数；
y是0或范围为1至16的整数；并且
z是0或范围为1至6的整数；
条件是所述式(IA)的多肽不包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列或不包括由SEQ ID NO：107的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中B包括与SEQ ID NO：11至少99％的序列同一性。
3.根据权利要求1所述的多肽，其中B包括SEQ ID NO：11。
4.根据权利要求1所述的多肽，其中[A]v-[B]-[C]w包括与SEQ ID NO：10具有至少97％序列同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的多肽，其中[A]v-[B]-[C]w包括SEQ ID NO：10。
6.根据权利要求1所述的多肽，其中A包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少99％同一性的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的多肽，其中A包括具有SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽，其中R包括与SEQ ID NO：9至少99％的同一性。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽，其中R包括SEQ ID NO：9。
10.根据权利要求1所述的多肽，其中o、p和q各自是1。
11.根据权利要求1 0所述的多肽，其中M包括2个氨基酸；并且其中N包括两个氨基酸；并且其中M和N不同。
12.根据权利要求10至11中任一项所述的多肽，其中M是-L-K-。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的多肽，其中N是-D-I-。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的多肽，其中E包括2至4个氨基酸。
15.根据权利要求10至13中任一项所述的多肽，其中E包括3个氨基酸。
16.根据权利要求15所述的多肽，其中所述3个氨基酸中的至少2个连续的氨基酸相同。
17.根据权利要求10至13中任一项所述的多肽，其中E包括-D-S-S-。
18.根据权利要求1所述的多肽，其中q是0。
19.根据权利要求1所述的多肽，其中q是1。
20.根据权利要求19所述的多肽，其中x是0。
21.根据权利要求19至20中任一项所述的多肽，其中z是1。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的多肽，其中y的范围为4至8。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的多肽，其中y是6。
24.根据权利要求1所述的多肽，其中[E]y是[-D-S-S-]6。
25.根据权利要求24所述的多肽，其中q是0。
26.根据权利要求25所述的多肽，其中x是0。
27.根据权利要求24所述的多肽，其中q是1。
28.根据权利要求27所述的多肽，其中x是0。
29.根据权利要求27至28中任一项所述的多肽，其中Fc包括SEQ ID NO：130。
30.根据权利要求1所述的多肽，其中[D]x是[-G-G-G-G-S-]2。
31.根据权利要求30所述的多肽，其中[E]y是[D]10。
32.根据权利要求30所述的多肽，其中[E]y是[DSS]6。
33.根据权利要求30至32中任一项所述的多肽，其中[R]是-[L-K]-Fc-[D-I]-，并且其中Fc包括与SEQ ID NO：130至少99％的同一性。
34.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少97％的同一性。
35.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少99％的同一性。
36.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包括具有2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个的氨基酸序列。
37.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少95％同一性的核苷酸序列编码。
38.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少97％同一性的核苷酸序列编码。
39.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽由与SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个具有至少99％同一性的核苷酸序列编码。
40.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽由具有SEQ ID NO：106、108-115和131中的任何一个的核苷酸序列编码。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的多肽，其中所述多肽有在骨中形成羟基磷灰石晶体的催化能力。
42.一种多肽，其包括式(VB)：
[A]-[B]-[R]q-([E]y) (VB)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括编码碱性磷酸酶的氨基酸；
R是-(Mo(Fc)Np)-，其中M和N各自独立地包含1至6个氨基酸，其中Fc是Fc结构域，并且o和p各自独立地是0、1或2；
q是0或1；
E包括具有2至4个氨基酸的氨基酸序列；并且
y是范围为1至16的整数，
条件是当q是1并且当[E]仅包括天冬氨酸时，那么所述式(VB)的多肽不包括具有十至十六个连续天冬氨酸残基的氨基酸序列。
43.根据权利要求42所述的多肽，其中y是范围为4至8的整数。
44.根据权利要求42所述的多肽，其中y是6。
45.根据权利要求42至44中任一项所述的多肽，其中q是0。
46.根据权利要求42至44中任一项所述的多肽，其中q是1。
47.根据权利要求46所述的多肽，其中M包括2个氨基酸；并且其中N包括两个氨基酸；并且其中M和N不同。
48.根据权利要求47所述的多肽，其中M是-L-K-。
49.根据权利要求47所述的多肽，其中N是-D-I-。
50.根据权利要求42至44中任一项所述的多肽，其中E包括2至4个氨基酸。
51.根据权利要求42至44中任一项所述的多肽，其中E包括3个氨基酸。
52.根据权利要求51所述的多肽，其中所述3个氨基酸中的至少2个连续的氨基酸相同。
53.根据权利要求42至44中任一项所述的多肽，其中E包括-D-S-S-。
54.根据权利要求42至44中任一项所述的多肽，其中B包括与SEQ ID NO：11至少97％的序列同一性。
55.根据权利要求42至44中任一项所述的多肽，其中B包括与SEQ ID NO：11至少99％的序列同一性。
56.根据权利要求42至44中任一项所述的多肽，其中B包括SEQ ID NO：11。
57.根据权利要求42至44中任一项所述的多肽，其中A包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少97％同一性的氨基酸序列。
58.根据权利要求42至44中任一项所述的多肽，其中A包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少99％同一性的氨基酸序列。
59.根据权利要求42至44中任一项所述的多肽，其中A包括具有SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个的氨基酸序列。
60.根据权利要求42至44中任一项所述的多肽，其中Fc包括与SEQ ID NO：130至少99％的同一性。
61.根据权利要求42至44中任一项所述的多肽，其中R包括SEQ ID NO：9。
62.根据权利要求42所述的多肽，其中所述多肽包括与SEQ ID NO：5、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
63.根据权利要求42所述的多肽，其中所述多肽包括与SEQ ID NO：5、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少95％同一性的氨基酸序列。
64.根据权利要求42所述的多肽，其中所述多肽包括与SEQ ID NO：5、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少97％同一性的氨基酸序列。
65.根据权利要求42所述的多肽，其中所述多肽包括与SEQ ID NO：5、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少99％同一性的氨基酸序列。
66.根据权利要求42所述的多肽，其中所述多肽包括具有SEQ ID NO：5、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个的氨基酸序列。
67.根据权利要求42所述的多肽，其中所述多肽由与SEQ ID NO：111、115和131中的任何一个具有至少90％同一性的核苷酸序列编码。
68.根据权利要求42所述的多肽，其中所述多肽由与SEQ ID NO：111、115和131中的任何一个具有至少95％同一性的核苷酸序列编码。
69.根据权利要求42所述的多肽，其中所述多肽由包括SEQ ID NO：111、115和131中的任何一个的核苷酸序列编码。
70.根据权利要求42至69中任一项所述的多肽，其中所述多肽有在骨中形成羟基磷灰石晶体的催化能力。
71.一种慢病毒载体，其包括编码根据权利要求1至70中任一项所述的多肽的核酸序列。
72.根据权利要求71所述的慢病毒载体，其中编码所述多肽的所述核酸序列与启动子可操作地连接。
73.根据权利要求71至72中任一项所述的慢病毒载体，其中所述启动子选自由以下组成的组：EF1A、MND、CD11b、CD68Lp、EF1a1、EFS和UbC。
74.根据权利要求71至72所述的慢病毒载体，其进一步包括UCOE启动子元件。
75.根据权利要求71至72中任一项所述的慢病毒载体，其进一步包括绝缘子。
76.根据权利要求71至72中任一项所述的慢病毒载体，其进一步包括一个或多个支架/基质附着区。
77.根据权利要求71至72中任一项所述的慢病毒载体，其进一步包括WPRE元件。
78.根据权利要求71至72中任一项所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体不包含编码WPRE元件的核苷酸序列。
79.根据权利要求71所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
80.根据权利要求71所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
81.根据权利要求71所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少97％序列同一性的核苷酸序列。
82.根据权利要求71所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体包括与SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个具有至少99％序列同一性的核苷酸序列。
83.根据权利要求71所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体包括具有SEQ ID NO：16-26、55-65、74、81、82、84-95、97和98中的任何一个的核苷酸序列。
84.一种表达载体，其包括：与第一核酸序列可操作连接的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码根据权利要求1至70中任一项所述的多肽。
85.根据权利要求84所述的表达载体，其中所述第一表达控制序列选自由以下组成的组：EF1A、MND、CD11b、CD68Lp、EFS和UbC。
86.根据权利要求84所述的表达载体，其中所述第一表达控制序列包括与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少90％同一性的核苷酸序列。
87.根据权利要求84所述的表达载体，其中所述第一表达控制序列包括与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少95％同一性的核苷酸序列。
88.根据权利要求84所述的表达载体，其中所述第一表达控制序列包括具有SEQ IDNO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个的核苷酸序列。
89.一种宿主细胞群体，其用根据权利要求71至83中任一项所述的慢病毒载体或根据权利要求84至88中任一项所述的表达载体转导。
90.根据权利要求89所述的宿主细胞群体，其中所述宿主细胞是自体的。
91.根据权利要求89所述的宿主细胞群体，其中所述宿主细胞是同种异体的。
92.一种转导宿主细胞群体的方法，所述方法包括：获得宿主细胞群体；以及使所获得的宿主细胞群体与另外的实施例71至83中任一项的慢病毒载体或与根据权利要求84至88中任一项所述的表达载体接触。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述转导离体发生或发生在体内。
94.一种药物组合物，其包括权利要求89至91中任一项的经转导的宿主细胞以及药学上可接受的赋形剂或载体。
95.一种药物组合物，其包括根据权利要求1至70中任一项所述的多肽以及药学上可接受的赋形剂或载体。
96.一种药物组合物，其包括根据权利要求71至83中任一项所述的慢病毒载体或根据权利要求84至88中任一项所述的表达载体以及药学上可接受的赋形剂或载体。
97.一种治疗哺乳动物受试者的方法，所述方法包括向需要治疗的所述哺乳动物受试者施用治疗有效量的权利要求89至91中任一项的经转导的宿主细胞或根据权利要求94至96中任一项所述的药物组合物。
98.一种治疗哺乳动物的低磷酸酯酶症的方法，所述方法包括向需要治疗的哺乳动物受试者施用治疗有效量的权利要求89至91中任一项的经转导的宿主细胞或根据权利要求94至96中任一项所述的药物组合物。
99.一种治疗、减轻或预防哺乳动物的低磷酸酯酶症的症状的方法，所述方法包括向需要治疗的哺乳动物受试者施用治疗有效量的权利要求89至91中任一项的经转导的宿主细胞或根据权利要求94至96中任一项所述的药物组合物。
100.一种治疗表征为功能性碱性磷酸酶缺乏或量不足的与骨缺损相关的病状或疾病的方法，所述方法包括向需要治疗的哺乳动物受试者施用治疗有效量的权利要求89至91中任一项的经转导的宿主细胞或根据权利要求94至96中任一项所述的药物组合物。
101.一种多肽，其包括式(IB)：
[A]v-[B]-[C]w-[R]q-([D]x-[E]y)z， (IB)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括与SEQ ID NO：11具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
C包括编码GPI锚的氨基酸序列；
R是-(Mo(Fc)Np)-，其中M和N各自独立地包含1至6个氨基酸，其中Fc是Fc结构域，并且o和p各自独立地是0、1或2；
D包括具有4至6个氨基酸的氨基酸序列，或者是F(G)tF，其中每个F是相同的氨基酸，G是具有3、4或5个氨基酸的氨基酸序列，并且t是范围为2至5的整数；
E包括具有1至8个氨基酸的氨基酸序列；
q是0或1；
v是0或1；
w是0或1；
x是0或范围为1至6的整数；
y是0或范围为1至16的整数；并且
z是0或范围为1至6的整数；
条件是当v是1，w是0，q是1，o是1，p是1，N是二氨基酸-D-I-，M是二氨基酸-L-K-，[B]包括SEQ ID NO：11，Fc包括SEQ ID NO：130，并且x是0时，那么[E]y不是具有十至十六个连续天冬氨酸残基的氨基酸序列。
102.根据权利要求101所述的多肽，其中E包括2至4个氨基酸。
103.根据权利要求101至102中任一项所述的多肽，其中E包括3个氨基酸。
104.根据权利要求103所述的多肽，其中所述3个氨基酸中的至少2个连续的氨基酸相同。
105.根据权利要求101所述的多肽，其中E包括-D-S-S-。
106.根据权利要求105所述的多肽，其中q是0。
107.根据权利要求105所述的多肽，其中q是1。
108.根据权利要求106至107中任一项所述的多肽，其中x是0。
109.根据权利要求108所述的多肽，其中z是1。
110.根据权利要求105所述的多肽，其中y的范围为4至8。
111.根据权利要求105所述的多肽，其中y是6。
112.根据权利要求101所述的多肽，其中x是0并且[E]y是[-D-S-S-]6。
113.根据权利要求112所述的多肽，其中q是1并且R包括SEQ ID NO：9。
114.根据权利要求113所述的多肽，其中q是0并且[E]y是[-D-S-S-]6。
115.根据权利要求101所述的多肽，其中q是1。
116.根据权利要求115所述的多肽，其中[R]是-[L-K]-Fc-[D-I]-，并且其中Fc包括与SEQ ID NO：130至少99％的同一性。
117.根据权利要求115所述的多肽，其中[R]包括SEQ ID NO：9。
118.根据权利要求101所述的多肽，其中[D]x是[-G-G-G-G-S-]2。
119.根据权利要求118所述的多肽，其中[E]y是[D]10。
120.根据权利要求118所述的多肽，其中[E]y是[DSS]6。
121.根据权利要求118至120中任一项所述的多肽，其中[R]是-[L-K]-Fc-[D-I]-，并且其中Fc包括与SEQ ID NO：130至少99％的同一性。
122.一种表达载体，其包括编码多肽的核苷酸序列，所述多肽与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少90％的同一性。
123.根据权利要求122所述的表达载体，其中所述多肽与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少95％的同一性。
124.根据权利要求122所述的表达载体，其中所述多肽与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少97％的同一性。
125.根据权利要求122所述的表达载体，其中所述多肽与2-8、44-54、68、75、105和116-125中的任何一个具有至少99％的同一性。
126.根据权利要求122至125中任一项所述的表达载体，其中所述表达载体是逆转录病毒载体。
127.根据权利要求126所述的表达载体，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。
128.根据权利要求122至125中任一项所述的表达载体，其中所述表达载体是AAV载体。
129.根据权利要求122至125中任一项所述的表达载体，其中所述核苷酸序列与启动子可操作地连接。
130.根据权利要求129所述的表达载体，其中所述启动子选自由以下组成的组：EF1A、MND、CD11b、CD68Lp、EFS和UbC。
131.一种分离的核苷酸序列，其包括与SEQ ID NO：111、115和131中的任何一个至少90％的同一性。
132.根据权利要求131所述的分离的核苷酸序列，其中所述分离的核苷酸序列包括与SEQ ID NO：111、115和131至少95％的同一性。
133.根据权利要求131所述的分离的核苷酸序列，其中所述分离的核苷酸序列包括与SEQ ID NO：111、115和131至少97％的同一性。
134.根据权利要求131所述的分离的核苷酸序列，其中所述分离的核苷酸序列包括与SEQ ID NO：111、115和131至少99％的同一性。
135.根据权利要求131所述的分离的核苷酸序列，其中所述分离的核苷酸序列包括SEQID NO：111、115和131。
136.一种分离的核苷酸序列，其至少包括第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列与SEQ ID NO：115具有至少90％的同一性；并且其中所述第二核苷酸序列编码信号肽。
137.根据权利要求136所述的分离的核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列包括与SEQID NO：115至少95％的同一性。
138.根据权利要求136所述的分离的核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列包括与SEQID NO：115至少97％的同一性。
139.根据权利要求136所述的分离的核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列包括与SEQID NO：115至少99％的同一性。
140.根据权利要求136所述的分离的核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列包括SEQID NO：115。
141.根据权利要求136至140中任一项所述的分离的核苷酸序列，其中所述信号肽包括与SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个具有至少97％同一性的氨基酸序列。
142.根据权利要求136至140中任一项所述的分离的核苷酸序列，其中所述信号肽包括具有SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个的氨基酸序列。
143.一种慢病毒载体，其包括根据权利要求131至142中任一项所述的核苷酸序列。
144.根据权利要求143所述的慢病毒载体，其中所述核苷酸序列与启动子可操作地连接。
145.根据权利要求144所述的慢病毒载体，其中所述启动子选自由以下组成的组：EF1A、MND、CD11b、CD68Lp、EF1a1、EFS和UbC。
146.一种宿主细胞，其用根据权利要求143至145中任一项所述的慢病毒载体转导。
147.一种氨基酸序列，其与SEQ ID NO：75具有至少90％的同一性。
148.根据权利要求147所述的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO：75具有至少95％的同一性。
149.一种多肽，其至少包括第一部分和第二部分，其中所述第一部分包括与SEQ IDNO：4-8和44-54中的任何一个具有至少95％同一性的氨基酸序列；并且其中所述第二部分包括编码Fc结构域的氨基酸序列。
150.根据权利要求149所述的多肽，其中编码所述Fc结构域的所述氨基酸序列包括与SEQ ID NO：130至少98％的同一性。
151.根据权利要求149至150中任一项所述的多肽，其中编码所述Fc结构域的所述氨基酸序列包括与SEQ ID NO：4-8和44-54中的任何一个至少97％的同一性。
152.根据权利要求149至150中任一项所述的多肽，其中所述第一部分的所述氨基酸序列包括与SEQ ID NO：4-8和44-54中的任何一个至少99％的同一性。
153.根据权利要求149所述的多肽，其中所述第一部分的所述氨基酸序列包括与SEQID NO：4-8和44-54中的任何一个至少99％的同一性；并且其中编码所述Fc结构域的所述氨基酸序列包括与SEQ ID NO：130至少99％的同一性。
154.一种分离的核苷酸序列，其包括与SEQ ID NO：72至少95％的同一性。
155.根据权利要求154所述的分离的核苷酸序列，其中所述分离的核苷酸序列包括与SEQ ID NO：72至少97％的同一性。
156.根据权利要求154所述的分离的核苷酸序列，其中所述分离的核苷酸序列包括与SEQ ID NO：72至少99％的同一性。
157.一种分离的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO：72。
158.一种多肽，其包括与骨靶向部分偶联的碱性磷酸酶，其中所述骨靶向部分的核苷酸序列与SEQ ID NO：72具有至少95％的同一性。
159.根据权利要求158所述的多肽，其中所述骨靶向部分的所述核苷酸序列与SEQ IDNO：72具有至少97％的同一性。
160.根据权利要求158至159中任一项所述的多肽，其中所述碱性磷酸酶包括与SEQ IDNO：11具有至少99％同一性的氨基酸序列。
161.根据权利要求158至159中任一项所述的多肽，其中所述碱性磷酸酶包括具有SEQID NO：11的氨基酸序列。
162.根据权利要求158至159中任一项所述的多肽，其中所述碱性磷酸酶通过肽接头与所述骨靶向部分偶联。
163.根据权利要求162所述的多肽，其中所述肽接头包括(GGGGS)n，并且其中n的范围为1至10。
164.根据权利要求158至159中任一项所述的多肽，其中所述多肽进一步包括Fc结构域。
165.一种慢病毒载体，其包括编码根据权利要求158至164中任一项所述的多肽的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸与启动子可操作地连接。
166.根据权利要求165所述的慢病毒载体，其中所述启动子选自由以下组成的组：EF1A、MND、CD11b、CD68Lp、EF1a1、EFS和UbC。
167.一种宿主细胞，其用根据权利要求165至166中任一项所述的慢病毒载体转导。
168.一种药物组合物，其包括根据权利要求159至164中任一项所述的多肽或宿主细胞权利要求167。
169.一种治疗哺乳动物的低磷酸酯酶症的方法，所述方法包括向需要治疗的哺乳动物受试者施用治疗有效量的权利要求167的经转导的宿主细胞或根据权利要求168所述的药物组合物。
170.一种治疗、减轻或预防哺乳动物的低磷酸酯酶症的症状的方法，所述方法包括向需要治疗的哺乳动物受试者施用治疗有效量的权利要求167的经转导的宿主细胞或根据权利要求168所述的药物组合物。
171.一种多肽，其包括式(I)：
[A]v-[B]-[C]w-[R]q-([D]x-[E]y)z， (I)
其中
A包括编码分泌信号肽的氨基酸序列；
B包括与SEQ ID NO：11具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
C包括编码GPI锚的氨基酸序列；
R是-(Mo(Fc)Np)-，其中M和N各自独立地包含1至6个氨基酸，其中Fc是Fc结构域，并且o和p各自独立地是0、1或2；
D包括具有4至6个氨基酸的氨基酸序列，或者是F(G)tF，其中每个F是相同的氨基酸，G是具有3、4或5个氨基酸的氨基酸序列，并且t是范围为2至5的整数；
E包括具有1至8个氨基酸的氨基酸序列；
q是0或1；
v是0或1；
w是0或1；
x是0或范围为1至6的整数；
y是0或范围为1至16的整数；并且
z是0或范围为1至6的整数。
172.根据权利要求171所述的多肽，其中q是0。
173.根据权利要求172所述的多肽，其中B包括与SEQ ID NO：11至少99％的序列同一性。
174.根据权利要求172所述的多肽，其中B包括SEQ ID NO：11。
175.根据权利要求172所述的多肽，其中[A]v-[B]-[C]w包括SEQ ID NO：10。
176.根据权利要求172所述的多肽，其中A包括具有SEQ ID NO：12和33-43中的任何一个的氨基酸序列。
177.根据权利要求171所述的多肽，其中R包括与SEQ ID NO：9至少97％的同一性。
178.根据权利要求171所述的多肽，其中R包括与SEQ ID NO：9至少99％的同一性。
179.根据权利要求171所述的多肽，其中R包括SEQ ID NO：9。
180.根据权利要求171所述的多肽，其中o、p和q各自是1。
181.根据权利要求180所述的多肽，其中M包括2个氨基酸；并且其中N包括两个氨基酸；并且其中M和N不同。
182.根据权利要求180所述的多肽，其中M是-L-K-。
183.根据权利要求180所述的多肽，其中N是-D-I-。
184.根据权利要求180所述的多肽，其中E包括2至4个氨基酸。
185.根据权利要求180所述的多肽，其中E包括3个氨基酸。
186.根据权利要求185所述的多肽，其中所述3个氨基酸中的至少2个连续的氨基酸相同。
187.根据权利要求171所述的多肽，其中E包括-D-S-S-。
188.根据权利要求187所述的多肽，其中q是0。
189.根据权利要求188所述的多肽，其中x是0。
190.根据权利要求187所述的多肽，其中q是1。
191.根据权利要求190所述的多肽，其中x是0。
192.根据权利要求187至191中任一项所述的多肽，其中z是1。
193.根据权利要求187至191中任一项所述的多肽，其中y的范围为4至8。
194.根据权利要求187至191中任一项所述的多肽，其中y是6。
195.根据权利要求171所述的多肽，其中[E]y是[-D-S-S-]6。
196.根据权利要求171所述的多肽，其中[D]x是[-G-G-G-G-S-]2。
197.根据权利要求196所述的多肽，其中[E]y是[D]10。
198.根据权利要求196所述的多肽，其中[E]y是[DSS]6。
199.一种慢病毒载体，其包括编码根据权利要求171至198中任一项所述的多肽的第一核苷酸序列以及与所述第一核苷酸序列可操作地连接的启动子。
200.根据权利要求199所述的慢病毒载体，其中所述启动子选自由以下组成的组：EF1A、MND、CD11b、CD68Lp、EF1a1、EFS和UbC。
201.根据权利要求199所述的慢病毒载体，其中所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少95％的同一性。
202.根据权利要求199所述的慢病毒载体，其中所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少96％的同一性。
203.根据权利要求199所述的慢病毒载体，其中所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少97％的同一性。
204.根据权利要求199所述的慢病毒载体，其中所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少98％的同一性。
205.根据权利要求199所述的慢病毒载体，其中所述启动子与SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个具有至少99％的同一性。
206.根据权利要求199所述的慢病毒载体，其中所述启动子包括SEQ ID NO：66、67、96、99、100、101和126中的任何一个。
207.根据权利要求199至206中任一项所述的慢病毒载体，其进一步包括UCOE启动子元件。
208.根据权利要求199至206中任一项所述的慢病毒载体，其进一步包括绝缘子。
209.根据权利要求199至206中任一项所述的慢病毒载体，其进一步包括一个或多个支架/基质附着区。
210.根据权利要求199至206中任一项所述的慢病毒载体，其进一步包括WPRE元件。
211.一种多肽，其包括：包含与SEQ ID NO：11具有至少98％同一性的氨基酸序列的第一部分；包含编码Fc结构域的氨基酸序列的第二部分；以及包含骨靶向部分的第三部分，其中所述骨靶向部分的核苷酸序列与SEQ ID NO：72具有至少95％的同一性。
212.根据权利要求211所述的多肽，其中编码所述Fc结构域的所述氨基酸序列包括与SEQ ID NO：130至少98％的同一性。
213.根据权利要求211所述的多肽，其中所述骨靶向部分的所述核苷酸序列与SEQ IDNO：72具有至少97％的同一性。
214.根据权利要求211所述的多肽，其中所述骨靶向部分的所述核苷酸序列与SEQ IDNO：72具有至少98％的同一性。
215.根据权利要求211所述的多肽，其中所述骨靶向部分的所述核苷酸序列与SEQ IDNO：72具有至少99％的同一性。
216.根据权利要求211所述的多肽，其中所述骨靶向部分的所述核苷酸序列包括SEQID NO：72。
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Family Cites Families (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4579821A (en) | 1981-11-23 | 1986-04-01 | University Patents, Inc. | Control of DNA sequence transcription |
| US4656134A (en) | 1982-01-11 | 1987-04-07 | Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University | Gene amplification in eukaryotic cells |
| US4601978A (en) | 1982-11-24 | 1986-07-22 | The Regents Of The University Of California | Mammalian metallothionein promoter system |
| US4713339A (en) | 1983-01-19 | 1987-12-15 | Genentech, Inc. | Polycistronic expression vector construction |
| GR860984B (en) | 1985-04-17 | 1986-08-18 | Zymogenetics Inc | Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells |
| US4956288A (en) | 1988-04-22 | 1990-09-11 | Biogen, Inc. | Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA |
| US5422120A (en) | 1988-05-30 | 1995-06-06 | Depotech Corporation | Heterovesicular liposomes |
| NZ237464A (en) | 1990-03-21 | 1995-02-24 | Depotech Corp | Liposomes with at least two separate chambers encapsulating two separate biologically active substances |
| DK0695169T3 (da) | 1993-04-22 | 2003-03-17 | Skyepharma Inc | Multivesikulære liposomer med indkapslet cyclodextrin og farmakologisk aktive forbindelser samt fremgangsmåder til anvendelse af disse |
| PL314485A1 (en) | 1993-11-16 | 1996-09-16 | Depotech Corp | Bubbles with controllable release of active substances |
| IL112372A (en) | 1994-02-07 | 2001-08-26 | Res Dev Foundation | Non-viral vector for the delivery of genetic information to cells |
| CA2264482A1 (en) | 1996-09-06 | 1998-03-12 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing t7 polymerase |
| US6218181B1 (en) | 1998-03-18 | 2001-04-17 | The Salk Institute For Biological Studies | Retroviral packaging cell line |
| GB0024827D0 (en) * | 2000-10-10 | 2000-11-22 | Norwegian Inst Of Fisheries & | Product |
| US7575924B2 (en) | 2000-11-13 | 2009-08-18 | Research Development Foundation | Methods and compositions relating to improved lentiviral vectors and their applications |
| WO2005030040A2 (en) | 2003-09-26 | 2005-04-07 | The Regents Of The University Of Michigan | Hematopoietic stem cell identification and isolation |
| WO2005123142A1 (en) | 2004-06-10 | 2005-12-29 | Abraxis Bioscience, Inc. | A method using inorganic nanoparticles as non-viral vectors for gene therapy |
| EP1858332A4 (en) | 2005-02-16 | 2011-06-22 | Lentigen Corp | LENTIVIRUS VECTORS AND ITS USE |
| DE102005023993A1 (de) | 2005-05-20 | 2006-11-23 | TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer mbH | Nicht virales Vektorsystem zum Transport von Nukleinsäure in die Lunge |
| GB0702695D0 (en) | 2007-02-12 | 2007-03-21 | Ark Therapeutics Ltd | Production of vectors |
| PT2158319E (pt) * | 2007-05-11 | 2012-03-06 | Enobia Canada Ltd Partnership | Fosfatase alcalina dirigida ao osso, kits e métodos para a utilização da mesma |
| AU2008289461A1 (en) * | 2007-08-23 | 2009-02-26 | Intrexon Corporation | Methods and compositions for diagnosing disease |
| ES2374245B1 (es) | 2010-08-02 | 2012-12-26 | Universidad Castilla La Mancha | Vectores no virales para terapia génica. |
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