CN116830946A - 一种有机肥与生物熏蒸结合防治黄瓜枯萎病的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种有机肥与生物熏蒸结合防治黄瓜枯萎病的方法，属于农业病害防治技术领域，包括以下步骤：S1.制备灭菌土：将试验用土过筛，然后高温灭菌，获得灭菌土；S2.制备病土：将尖孢镰刀菌接种到PDA液体培养基中，滤去菌丝后配制成配制成的孢子悬浮液，接种于灭菌土中制成病土；S3.熏蒸处理：将大黄油菜幼苗期的叶片刈割洗净冷冻保存，切成小段后与有机肥及灭菌土按比例混匀，放入花盆中，用保鲜膜封严，进行生物熏蒸。解决了解决现有技术中由于尖孢镰刀菌引发的枯萎病危害瓜类产量，化学防治枯萎病和倒茬嫁接成本高、隐患大而导致的防治枯萎病效果不理想的问题。有效解决了生物防治和化学防治的矛盾。
Description
技术领域
本发明涉及农业病害防治领域，具体涉及一种有机肥与生物熏蒸结合防治黄瓜枯萎病的方法。
背景技术
由尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)引发的枯萎病已成为危害瓜类产量和品质制约瓜类产业进一步发展的严重障碍，瓜类产量每年因此损失15％-30％。
目前生产上对其防治仍以化学防治为主，但长期大量不科学使用化学农药极易造成病原菌抗药性的产生，导致防效降低，为了达到防治效果，人们往往会不断提高用药量，最终形成防效不佳超量用药的恶性循环，造成的农药残留，严重污染土壤和地下水，危害人畜健康。采用化学防治枯萎病效果不理想的同时也增加了生产成本，残留的农药还给生态环境和食品安全带来隐患；倒茬嫁接虽常用于防控但增添了技术困难和劳动成本。
因而通过测定黄瓜植株的发病情况、生长指标、生理指标及种植土壤的酶活性，获得能够高效控制黄瓜枯萎病且有效提高黄瓜植株生长的植物与有机肥最佳配比混合物，为防治黄瓜枯萎病的复合生物有机肥的研发提供理论基础和技术支持，为黄瓜生产可持续发展提供新思路和新方法，对保障广大人民群众的食品安全具有重要的现实意义。
发明内容
为此，本发明提供一种有机肥与生物熏蒸结合防治黄瓜枯萎病的方法，以解决现有技术中由于尖孢镰刀菌引发的枯萎病危害瓜类产量，化学防治枯萎病和倒茬嫁接成本高隐患大而导致的防治枯萎病效果不理想的问题。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
根据本发明提供的一种有机肥与生物熏蒸结合防治黄瓜枯萎病的方法，包括以下步骤：
S1.制备灭菌土：将试验用土过筛，然后高温灭菌，获得灭菌土；
S2.制备病土：将尖孢镰刀菌接种到PDA液体培养基中，滤去菌丝后配制成配制成的孢子悬浮液，接种于灭菌土中制成病土；
S3.熏蒸处理：将大黄油菜幼苗期的叶片刈割洗净冷冻保存，切成小段后与有机肥及灭菌土按比例混匀，放入花盆中，用保鲜膜封严，进行生物熏蒸；
S4.移植幼苗：将S3的花盆去膜，再把提前育好的黄瓜幼苗移栽到各处理的花盆中；
S5：测定的项目及方法；
所述试验用土为借助智能化翻抛机系统对发酵菌剂借助粪污堆肥发酵30-40d堆制而成，有机质含量为20-33％，总氮1-2.12％，磷1.05-1.83％，钾0.8-2.01％。
进一步地，所述S1中过筛孔径为3-6mm，高温灭菌温度为150-180℃。
进一步地，所述S2中具体步骤包括：
将所述尖孢镰刀菌接种到PDA液体培养基中，且将接种后的PDA液体培养基于25-30℃、120-150r/min培养5d，用4层无菌纱布滤去菌丝，并用无菌水配制成2-4×106cfu/mL的孢子悬浮液，按照50mL/kg接种于灭菌土中制成病土，病土放置7d后使用。
进一步地，所述S3中具体步骤包括：将大黄油菜幼苗期的叶片刈割洗净于-80℃冷冻保存，使用时切成1cm小段，将其单独或与有机肥及灭菌土按比例混匀，放入花盆中，用保鲜膜覆盖封严。
进一步地，所述S4具体步骤包括：将S3制备的植物熏蒸土壤熏蒸18-21d后去膜，再把提前育好的黄瓜幼苗移栽到各处理的花盆中，所述黄瓜幼苗选用2叶1心的幼苗。
进一步地，测定项目包括：黄瓜发病情况调查、黄瓜生长指标的测定和黄瓜生理指标的测定。
进一步地，所述黄瓜发病情况调查为调查黄瓜在移栽后第20d发病情况，计算发病率和防治效果。
进一步地，所述黄瓜生长指标的测定包括黄瓜植株生长指标分别在移栽后20d与30d测量。
进一步地，所述黄瓜生理指标的测定包括:叶绿素含量测定、丙二醛(MDA)含量测定、过氧化氢酶(CAT)活性测定、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定和过氧化物酶(POD)活性测定。
进一步地，所述试验用土中磷以P2O5计，钾以K2O计。
本发明具有如下优点：
本申请中通过有机肥与生物熏蒸结合防治黄瓜枯萎病，能有效解决生物防治和化学防治的矛盾，由于尖孢镰刀菌引发的枯萎病危害瓜类产量，化学防治枯萎病和倒茬嫁接成本高隐患大而导致的防治枯萎病效果不理想的问题。本申请中植物的筛选为功能性复合有机肥的开发及植物源药剂的研发提供了基础，也为黄瓜枯萎病的生物防治开劈了新途径，保证了生态安全和人体健康，是非常好的病害防治措施。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明提供的不同处理下黄瓜幼苗的发病情况观察对比图；
图2为本发明提供的不同处理对黄瓜移栽后20d生长的影响观察对比图；
图3为本发明提供的不同处理对黄瓜叶绿素含量的影响分析图；
图4为本发明提供的不同处理对黄瓜叶片丙二醛含量和防御酶活性的影响分析图；
图5为本发明提供的不同处理对土壤酶活性的影响分析图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
一、试验材料
1.病原菌：尖孢镰刀菌由内蒙古农业大学园艺与植物保护学院植物病理实验室提供。
2.试验用土：取自内蒙古农业大学教学农场。有机肥为本团队自主研发的发酵菌剂借助智能化翻抛机系统对粪污堆肥发酵30-40d堆制而成，有机质含量为33％。总氮2.12％，磷(以P2O5计)1.83％，钾(以K2O计)2.01％。
3.黄瓜种子：津春4号，购自天津科润农业科技股份有限公司。
4.试剂及仪器：
仪器：恒温培养箱(宁波海曙赛福实验仪器厂生产)、超高速冷冻离心机(H1-16KR)、酶标仪(赛默飞酶标仪Thermo)、紫外分光光度仪(日立U-2910)、电子天平(Sartorius2004MP)、超低温冷冻柜(YC-260L)。
试剂：三氯醋酸、硫代巴比妥酸(TBA)、磷酸缓冲液、甲硫氨酸(Met)、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、核黄素、(购自国药集团化学试剂有限公司)，考马斯亮蓝(Sigma公司)，L-苯丙氨酸、巯基乙醇(Sigma公司)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、EDTA-Na2(Macklin公司)，5-磺基水杨酸二水合物、单宁酸、N-苯甲酰-L-酪氨酸乙酯、N-α-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐、99％没食子酸、N-苯基硫脲、核黄素、愈创木酚均购自国药集团化学试剂有限公司。
土壤脲酶(S-UE)微量法测试盒、土壤蔗糖酶(S-SC)微量法测试盒、土壤过氧化氢酶(S-CAT)微量法测试盒、土壤碱性磷酸酶(S-AKP/ALP)微量法测试盒均购自上海优选生物科技有限公司。
5.数据分析：数据处理使用SPSS25.0和Microsoft Office Excel 2020软件统计。通过SPSS处理数据，计算毒力回归方程(y＝a+bx)、EC50以及相关系数。
二、试验方法
1.制备灭菌土：试验用土过孔径3mm筛后，于烘箱中180℃高温灭菌，获得灭菌土。
2.制备病土：将尖孢镰刀菌接种到PDA液体培养基中，于25℃、150r/min培养5d。用4层无菌纱布滤去菌丝，并用无菌水配制成4×106cfu/mL的孢子悬浮液，按照50mL/kg接种于灭菌土中制成病土，病土放置7d后使用。
3.熏蒸处理：将大黄油菜幼苗期的叶片刈割洗净于-80℃冷冻保存，使用时切成1cm小段，将其单独或与有机肥及灭菌土按比例混匀，放入花盆中，用保鲜膜覆盖封严。
4.移植幼苗：将植物熏蒸土壤在生物熏蒸21d后去膜，再把提前育好的黄瓜幼苗(2叶1心)移栽到各处理的花盆中。
实施例1
1.试验设计
试验共设置7个处理，每个处理种植8盆，每盆含2kg试验用土，7个试验处理设计如下：
处理Ⅰ：灭菌土；
处理Ⅱ：接种尖孢镰刀菌菌液的灭菌土；
处理Ⅲ：接种尖孢镰刀菌菌液的灭菌土+有机肥(40g)；
处理Ⅳ：接种尖孢镰刀菌菌液的灭菌土+大黄油菜(40g)；
处理Ⅴ：接种尖孢镰刀菌菌液的灭菌土+有机肥(40g)+大黄油菜(40g)(大黄油菜与有机肥1:1)。
处理VI：接种尖孢镰刀菌菌液的灭菌土+有机肥(40g)+油菜(80g)(大黄油菜与有机肥2∶1)。
处理VII：接种尖孢镰刀菌菌液的灭菌土+有机肥(40g)+油菜(120g)(大黄油菜与有机肥3∶1)。
2.调查黄瓜在移栽后第20d发病情况，计算发病率和防治效果。
发病率＝发病株数/总株数×100％。黄瓜苗期枯萎病分级标准见表1。
病情指数计算参照宗兆锋等的计算方法。
表1黄瓜枯萎病病情分级标准
| 病级 | 植株 |
| 0 | 植株无症状 |
| 1 | 真叶、子叶黄化面积或枯萎面积不超过总面积的50％ |
| 2 | 真叶、子叶黄化面积或枯萎面积超过总面积的50％ |
| 3 | 叶片枯萎或枯死，仅生长点存活 |
| 4 | 植株枯死 |
2.黄瓜生长指标的测定
黄瓜植株生长指标分别在移栽后20d与30d测量。植株茎基部到生长点之间的垂直距离计为株高；用游标卡尺测植株子叶节下1cm处的直径计为茎粗。叶面积采用直尺测量叶长(叶柄的叶片端至叶尖的长度)和叶宽(叶片上部肩宽最宽处的长度)，利用公式y＝0.743x(x为叶长×叶宽)计算叶面积y，其中0.743为叶面积的校正系数。
3.黄瓜生理指标的测定：
3.1叶绿素含量测定：
采用乙醇提取法，分别于苗期和开花期测定。将丙酮和无水乙醇按2∶1的比例配置，充分混匀，在试管中加入10ml混合液，把被测黄瓜叶片剪成宽度为1mm左右的细条。准确称取0.2g样品放入试管中，把放有样品的试管置于室温避光处，浸泡提取，直至观察到叶片绿色完全褪去为止。然后将叶绿素提取液置1cm厚比色皿中，用2:1混合液作对照，在663nm和645nm处读取叶绿素OD值，再由公式计算叶绿素含量。
式中V为提取液体积；W为叶片鲜重。
3.2丙二醛(MDA)含量测定：
取0.5g黄瓜叶片，加入5mL5％的TCA溶液研磨，研磨液在3000r/min离心10min，取上清液2mL，加入2mL0.67％的TBA溶液，将溶液混合后于沸水浴中静置30min，待冷却后3000r/min第二次离心15min，取上清液，于450nm、532nm和600nm处读取OD值，并按照公式计算出MDA含量。
公式：丙二醛含量＝6.45×(A532-A600)-0.56×A450
按照公式计算出丙二醛(MDA)含量。
3.3过氧化氢酶(CAT)活性测定：
采用紫外吸收法，称取0.5g黄瓜叶片于研钵中，加入5mLpH7.0，0.05mol/L的PBS冰浴碾磨，在4℃，15000r/min离心15min，上清液即为酶液。取10mL具塞试管，加入1mLpH7.0的Tris-Hcl缓冲液，0.1mL酶液，1.7mL蒸馏水，于25℃水浴加热3min后，加入0.2mL、0.2mol/LH2O2溶液，然后于240nm处读取OD值，每隔30s读数一次，共测3min。失活酶液为作空白对照。
式中，Vt为酶提取液总体积(mL)；Vs为测定时取酶液的体积(mL)；FW为样品鲜重(g)。
3.4超氧化物歧化酶(SOD)活性测定：
采用NBT光还原法。称取1g叶片样品，加适量pH7.8、0.05mol/L的磷酸缓冲液，在冰浴中研磨并最终定容到10mL，在4℃、10000r/min条件下离心20min，取上清液作为酶液。在避光环境下于试管中加入1.5mL磷酸缓冲液，0.3mL的Met溶液、0.3mL的NBT溶液、0.3mL的核黄素溶液及0.25mL的蒸馏水，然后加入酶液0.1mL，反应20min，在波长560nm处测定吸光度。
式中，A为对照管OD值；As为样品测定管OD值；Vt为样品提取液总体积(mL)；Vs为测定时取粗酶液量(mL)；t为显色反应光照时间(min)；FW为样品鲜重(g)。
3.5过氧化物酶(POD)活性测定：
采用愈创木酚法，称取0.5g黄瓜叶片，加少量石英砂、碳酸钙和适量蒸馏水冰浴研磨，于4℃，5000r/min离心15min，上清液即为待测酶液。取1mL酶液，1mL0.1％的愈创木酚，6.9mL蒸馏水，摇匀，加入1mL0.18％的过氧化氢，摇匀，准确反应10min，加0.2mL5％的偏磷酸终止反应，于470nm处读取OD值。
式中，A为测定管四邻甲氧基苯酚含量(mg)；A0为对照管四邻甲氧基苯酚含量(mg)；Vt为酶液总体积(mL)；W为样品鲜重(g)；Vs为测定时取酶液的量(mL)；t为反应时间(min)。
3.6苯丙氨酸(PAL)活性测定：
采用苯丙氨酸比色法，取黄瓜叶片1g于研钵中，加入少量提取介质、石英砂，冰浴碾磨，用提取介质定容到10mL，充分混匀，纱布过滤，滤液离心，离心机参数设置为4℃，10000r/min，15min，上清液即为待测液。在试管中加入1mL0.02mol/L的L-苯丙氨酸，2mLpH8.8的硼酸缓冲液，1mL酶液，总体积4mL，摇匀后30℃水浴保温1h，然后加入0.2mL6mol/LHCl终止反应，于290nm处读取OD值，以蒸馏水为空白对照。
式中，Vt为酶液总体积(mL)；W为样品鲜重(g)；Vs测定时取酶液的量(mL)；v为反应液总体积(mL)，t为反应时间(h)。
3.7多酚氧化酶(PPO)活性测定：
称取0.5g黄瓜叶片于研钵中，加入pH6.5，0.05mol/L的磷酸缓冲液5mL冰浴碾磨，离心机参数设置为4℃，5000r/min离心15min，上清液即为酶液。取0.5mL酶液加入1.5mLPBS，然后加入1.5mL0.1mol/L邻苯二酚，37℃水浴10min，最后加入3mL20％三氯乙酸终止反应，于525nm处读取OD值。
式中，ΔA525为反应时间内OD值的变化；V为酶液总体积(mL)；W为样品鲜重(g)；Vt为测定时酶液用量；t为反应时间(min)。
3.8黄瓜根际土壤酶活性的测定：
土壤脲酶(S-UE)活性：使用土壤脲酶(S-UE)微量法测试盒测定，结果以土样中每天每克产生1mgNH3-N表示，单位：mg/d/g。
土壤蔗糖酶(S-SC)活性：使用土壤蔗糖酶(S-SC)微量法测试盒测定，结果以土样中每天每克产生1mg还原糖表示，单位：mg/d/g。
土壤过氧化氢酶(S-CAT)使用土壤过氧化氢酶(S-CAT)微量法测试盒测定，结果以土样中每天每克产生1mgH2O2表示，单位：mg/d/g。
土壤碱性磷酸酶(S-AKP/ALP)活性：使用土壤碱性磷酸酶(S-AKP/ALP)微量法测试盒测定，结果以土样中每天每克产生1mg酚表示，单位：mg/d/g。
4.结果与分析
4.1生物熏蒸与有机肥联合应用对黄瓜枯萎病的防效：
表2为生物熏蒸与有机肥联合应用对黄瓜枯萎病的防效，结果显示，处理Ⅵ和处理Ⅶ对黄瓜枯萎病防治效果显著大于其他处理。单独施用有机肥的处理Ⅲ较处理Ⅱ发病率降低了8.34％，病情指数降低5.21，防治效果为13.69％。单独应用大黄油菜熏蒸的处理Ⅳ与处理Ⅱ相比发病率降低了14.59％，病情指数降低11.98，防治效果可达31.74％，可见单独施用大黄油菜熏蒸处理防治尖孢镰刀菌的效果优于单独施用有机肥。各处理下黄瓜的发病情况见图1，施用有机肥和大黄油菜熏蒸均可降低黄瓜枯萎病的发生，大黄油菜与有机肥联合应用的效果较单独应用效果更佳，大黄油菜与有机肥按照3:1复配的处理Ⅶ，抑菌作用最强，与处理Ⅱ相比发病率降低了29.17％，病情指数降低23.96，对黄瓜枯萎病的防效达到62.89％。
表2生物熏蒸与有机肥联合应用对黄瓜枯萎病的防治效果
4.2生物熏蒸与有机肥联合应用对黄瓜移栽20d后生长指标的影响：
不同处理对黄瓜移栽后20d生长指标的影响见表3，结果显示，黄瓜移栽20d后，处理Ⅶ的株高、茎粗和叶面积均大于其他处理，处理Ⅶ的株高比处理Ⅱ显著增长了50.92％，茎粗显著增加了37.95％，叶面积显著增加了29.46％。黄瓜株高和叶面积两个生长指标中，均显示处理Ⅶ>处理Ⅵ>处理Ⅴ，且三者间存在显著性差异。处理Ⅳ的株高和茎粗均显著大于处理Ⅱ，叶面积略大于处理Ⅱ，但二者间没有显著性差异。处理Ⅲ仅有茎粗高于处理Ⅱ，株高和叶面积与茎粗无显著性差异。图2为不同处理对黄瓜移栽后20d生长的影响，可以直观地看出几个处理间的生长差异。
表3不同处理对黄瓜移栽后20d生长指标的影响
4.3生物熏蒸与有机肥联合应用对黄瓜移栽30d后生长指标的影响：
由表4可知，移栽后30d，处理Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ的株高、茎粗、叶面积三项指标高于其他处理。尤以处理Ⅶ的株高、茎粗和叶面积3项指标中均为最优，其次是处理Ⅵ，处理Ⅴ稍逊于前两个处理。处理Ⅱ的3项生长状况最差，除株高稍高于处理Ⅲ外，株高、茎粗和叶面积均显著低于其他处理。
表4不同处理对黄瓜移栽后30d生长指标的影响
4.4生物熏蒸与有机肥联合应用对黄瓜叶片叶绿素含量的影响：
叶绿素含量是反映作物光合作用的一个重要指标。其含量在一定范围内直接影响植物光合作用的强弱。图3为不同处理对黄瓜叶绿素含量的影响，由图3可知，处理Ⅶ苗期和开花期叶绿素含量显著高于处理Ⅱ，苗期的叶绿素含量为0.67mg/g，开花期的叶绿素含量为1.11mg/g，分别是处理Ⅱ的2.09倍和1.68倍，但与处理Ⅰ无显著性差异。苗期处理Ⅶ叶绿素含量显著大于处理Ⅴ，与处理Ⅵ无显著性差异。处理Ⅳ和处理Ⅴ叶绿素含量相等，处理Ⅱ和处理Ⅲ叶绿素含量相等。开花期处理Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的叶绿素含量无显著性差异，均显著大于处理Ⅱ和处理Ⅲ。证明大黄油菜与有机肥配施用有效提高了发病植株的叶绿素含量。
4.5生物熏蒸与有机肥联合应用对黄瓜叶片丙二醛含量和防御酶活性的影响：
图4为不同处理对黄瓜植株丙二醛含量和防御酶活性的影响。图4中A为不同处理下的丙二醛(MDA)含量，处理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的MDA含量显著高于其他处理，其中处理Ⅱ的MDA含量最高，为41.35nmol/g。处理Ⅰ的MDA含量最低，为27.99nmol/g。处理Ⅶ的MDA含量为28.35nmol/g，显著低于处理Ⅱ，与处理Ⅰ无显著性差异。可见有机肥与大黄油菜生物熏蒸结合可显著降低丙二醛含量，可以抵消植株受到病原菌侵染后对细胞膜的破坏。图4中B、C、D、E、F分别为不同处理下过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)5种植物体重要防御酶活性，这些酶的活性可作为植物抗逆和抗病能力的生理指标，往往与植物抗病性呈正相关。处理Ⅶ的CAT和SOD酶活性显著高于处理Ⅰ，POD、PAL和PPO三种酶活性与处理Ⅰ无显著性差异。处理Ⅶ和处理Ⅰ的5种防御酶活性均显著大于处理Ⅱ(P<0.05)。其他5种处理的5种酶活性由大到小的顺序依次为处理Ⅵ>处理Ⅴ>处理Ⅳ>处理Ⅲ>处理Ⅱ。由此可见，有机肥与大黄油菜单独或联合应用均可不同程度的降低发病黄瓜植株的MDA含量，提高黄瓜体内防御酶活性，尤以大黄油菜与有机肥3:1处理效果最佳。
4.6生物熏蒸与有机肥联合应用对黄瓜根际土壤酶活性的影响：
图5为不同处理对黄瓜根际土壤酶活性的影响。由图5可知，处理Ⅵ和处理Ⅶ显著提高(P<0.05)了脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶和磷酸酶4种土壤酶的活性，其中处理Ⅶ最大程度的增加了4种土壤酶活性，土壤脲酶活性是处理Ⅰ的2.15倍，是处理Ⅱ的2.71倍；蔗糖酶活性是处理Ⅰ的1.56倍，是处理Ⅱ的2.80倍；过氧化氢酶是处理Ⅰ的1.96倍，是处理Ⅱ的2.2倍；磷酸酶是处理Ⅰ的1.4倍，是处理Ⅱ的1.94倍。处理Ⅵ的土壤蔗糖酶、过氧化氢酶和土壤磷酸酶活性与处理Ⅶ无显著性差异，但显著高于其他5种处理(P<0.05)；脲酶活性显著低于处理Ⅶ，但显著高于其他5种处理(P<0.05)。
总结：
国内应用生物熏蒸主要集中于对土传病原真菌、线虫的影响以及熏蒸材料选择等方面。芸薹属植物的组织中含有大量的硫代葡萄糖苷，硫代葡萄糖苷在防治土传病害方面具有独特的优势。很多研究报道，多种芸薹属植物作为绿肥，可以有效防治镰刀菌、立枯丝核菌、线虫等引起的蔬菜土传病害。本申请所选用的芸薹属植物大黄油菜与有机肥配比联合应用，显著降低了黄瓜枯萎病的发病指数、发病率，且对黄瓜的生长具有显著促进作用。
植物受到病原菌侵染或遭受其他逆境胁迫时，细胞内的自由基就会失衡而导致自由基积累，产生丙二醛(MDA)等产物。MDA是膜脂过氧化的标志之一，直接反映了细胞脂质过氧化的程度，与植物的抗病性呈负相关。所以，MDA值越高，代表膜系统受损伤的程度就越大。在本实施例中，从不同处理对黄瓜叶片抗氧化指标的影响可以看出，大黄油菜与有机肥3:1配比的处理Ⅶ显著(P<0.05)降低了黄瓜叶片的丙二醛含量，说明有机肥与大黄油菜联合应用可以有效降低病原菌破坏叶片导致细胞膜受损，进而增加抗病能力。
植物在正常情况下，体内的保护酶系统处于平衡状态，而受病原物侵染后酶活性大大改变。在本申请中，大黄油菜与有机肥3:1配比的处理Ⅶ显著提高了黄瓜体内防御酶活性，可有效防治尖孢镰刀菌引起的黄瓜枯萎病，促进植物组织修复和生长。
土壤酶参与土壤的物质循环和土壤中重要的生化反应过程。土壤脲酶可直接参与土壤中含氮有机化合物的转化，能够反映土壤氮素的供应水平，与土壤生态环境中的氮素循环有着密不可分的关系。土壤蔗糖酶的酶促作用产物与土壤中有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度密切相关，是评价土壤肥力的重要指标。过氧化氢酶是一种分解多余过氧化氢，从而避免过氧化物在土壤中积累和对植物机体造成伤害的酶类。土壤磷酸酶在土壤有效磷的积累上具有重要作用，是评价土壤磷素生物转化方向和强度的指标。本实施例结果表明处理Ⅵ和处理Ⅶ显著提高了4种土壤酶活性，对改善土壤环境，加强营养物质转化，减少有毒有害物质的积累，提高土壤活力，促进黄瓜生长发育具有重要作用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种有机肥与生物熏蒸结合防治黄瓜枯萎病的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.制备灭菌土：将试验用土过筛，然后高温灭菌，获得灭菌土；
S2.制备病土：将尖孢镰刀菌接种到PDA液体培养基中，滤去菌丝后配制成配制成的孢子悬浮液，接种于灭菌土中制成病土；
S3.熏蒸处理：将大黄油菜幼苗期的叶片刈割洗净冷冻保存，切成小段后与有机肥及灭菌土按比例混匀，放入花盆中，用保鲜膜封严，进行生物熏蒸；
S4.移植幼苗：将S3的花盆去膜，再把提前育好的黄瓜幼苗移栽到各处理的花盆中；
S5：测定的项目及方法；
所述试验用土为借助智能化翻抛机系统对发酵菌剂借助粪污堆肥发酵30-40d堆制而成，有机质含量为20-33％，总氮1-2.12％，磷1.05-1.83％，钾0.8-2.01％。
2.根据权利要求1所述的有机肥与生物熏蒸结合防治黄瓜枯萎病的方法，其特征在于，所述S1中过筛孔径为3-6mm，高温灭菌温度为150-180℃。
3.根据权利要求1所述的有机肥与生物熏蒸结合防治黄瓜枯萎病的方法，其特征在于，所述S2中具体步骤包括：
将所述尖孢镰刀菌接种到PDA液体培养基中，且将接种后的PDA液体培养基于25-30℃、120-150r/min培养5d，用4层无菌纱布滤去菌丝，并用无菌水配制成2-4×106cfu/mL的孢子悬浮液，按照50mL/kg接种于灭菌土中制成病土，病土放置7d后使用。
4.根据权利要求1所述的有机肥与生物熏蒸结合防治黄瓜枯萎病的方法，其特征在于，所述S3中具体步骤包括：将大黄油菜幼苗期的叶片刈割洗净于-80℃冷冻保存，使用时切成1cm小段，将其单独或与有机肥及灭菌土按比例混匀，放入花盆中，用保鲜膜覆盖封严。
5.根据权利要求1所述的有机肥与生物熏蒸结合防治黄瓜枯萎病的方法，其特征在于，所述S4具体步骤包括：将S3制备的植物熏蒸土壤熏蒸18-21d后去膜，再把提前育好的黄瓜幼苗移栽到各处理的花盆中，所述黄瓜幼苗选用2叶1心的幼苗。
6.根据权利要求1所述的有机肥与生物熏蒸结合防治黄瓜枯萎病的方法，其特征在于，测定项目包括：黄瓜发病情况调查、黄瓜生长指标的测定和黄瓜生理指标的测定。
7.根据权利要求6所述的有机肥与生物熏蒸结合防治黄瓜枯萎病的方法，其特征在于，所述黄瓜发病情况调查为调查黄瓜在移栽后第20d发病情况，计算发病率和防治效果。
8.根据权利要求6所述的有机肥与生物熏蒸结合防治黄瓜枯萎病的方法，其特征在于，所述黄瓜生长指标的测定包括黄瓜植株生长指标分别在移栽后20d与30d测量。
9.根据权利要求6所述的有机肥与生物熏蒸结合防治黄瓜枯萎病的方法，其特征在于，所述黄瓜生理指标的测定包括:叶绿素含量测定、丙二醛(MDA)含量测定、过氧化氢酶(CAT)活性测定、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定和过氧化物酶(POD)活性测定。
10.根据权利要求1所述的有机肥与生物熏蒸结合防治黄瓜枯萎病的方法，其特征在于，所述试验用土中磷以P2O5计，钾以K2O计。
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