CN116829954A

CN116829954A - 预测女性受试者生育潜力的方法

Info

Publication number: CN116829954A
Application number: CN202180091422.2A
Authority: CN
Inventors: 马丁·布隆伯格-詹森
Original assignee: Rigshospitalet
Current assignee: Rigshospitalet
Priority date: 2020-12-08
Filing date: 2021-12-08
Publication date: 2023-09-29
Also published as: US20240094221A1; EP4260069A1; WO2022122104A1

Abstract

本发明涉及使用RANKL和OPG作为生物标志物来预测女性受试者的生育潜力的方法。本发明还涉及RANKL刺激剂、RANKL抑制剂和/或OPG抑制剂治疗女性不孕症的用途。

Description

预测女性受试者生育潜力的方法

发明技术领域

本发明涉及使用RANKL和OPG作为生物标志物来预测女性受试者的生育潜力的方法。本发明还涉及RANKL的刺激剂或抑制剂或OPG的抑制剂在治疗女性不孕症中的用途。

发明背景

不孕症是一种普遍的病况，其原因可能是女性、男性、两者兼而有之，或原因不明。12个月的无保护性交且未采取避孕措施且未受孕被定义为不孕。不孕症在整个历史上一直困扰着人类，但今天先进的辅助生殖技术已经帮助诊断不孕症并彻底改变了治疗。在女性中，有几个部位对于最佳女性生育潜力很重要。不利的子宫内膜环境会阻碍胚胎植入，如将宫内节育器放入子宫内膜腔进行避孕所证明。与不利植入环境的发展有关的其他因素是自身免疫因素，例如狼疮抗凝剂和整合素IIIβ。除了子宫内膜和子宫颈，子宫底的形状和功能，例如由于苗勒管融合发育不全和肌瘤可能会损害妊娠的植入或生长。显然，输卵管必须打开以允许受精，而且输卵管对于将卵母细胞扫入输卵管并在输卵管与精子受精也很重要。最重要的是，怀孕是排卵的直接证据。如果没有辅助生殖技术，不排卵的患者将无法怀孕。排卵功能需要整合许多正常运作的系统。正常的甲状腺功能、正常的胰岛素作用、正常的肾上腺功能，以及也许还有正常的大脑功能都是排卵需要的。

AMH或抗苗勒管激素用于评估女性的卵巢储备或卵子数量。AMH是一种由女性卵巢中的小卵泡细胞产生的激素，被用作卵母细胞数量的标志。

RANK/RANKL触发TRAF介导的激酶级联网络，促进破骨细胞分化。RANKL在成骨细胞上表达，其受体RANK在前破骨细胞上表达。RANKL表达受到多种因素的刺激，如IL-1、IL-6、IL-11、IL-17、TNF-α、维生素D、Ca²⁺、甲状旁腺、糖皮质激素、前列腺素E2和免疫抑制药物，并且受TGF-α下调。RANK/RANKL相互作用诱导多核成熟破骨细胞的分化和形成，引起骨吸收。第三种蛋白质，骨保护素(OPG)，由骨骼中的成纤维细胞产生，已知对破骨前分化过程发挥抑制作用。通过与RANKL(也称为骨保护素结合蛋白(OPGbp))结合，OPG抑制RANK/RANKL相互作用和随后的破骨细胞生成。因此，OPG是一种非常有效的抗再吸收剂。它还充当肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的诱饵受体，并通过阻断该配体和RANKL的凋亡作用来提高细胞存活率。OPG在小鼠中的过度表达导致严重的骨硬化症以及OPG-无效小鼠骨质疏松的事实证明了OPG的生理重要性。同样，缺乏RANK或RANKL会诱发小鼠骨硬化症。

EP 3 030 249 B1公开了一种使用RANKL抑制剂如地诺单抗(Denosumab)或OPG治疗男性不孕症的方法。EP 3 030 249 B1没有提及治疗女性不孕症，并且也没有提及使用RANKL激活剂治疗女性不孕症。

EP 3 244 911 B1公开了一种用于确定治疗提高男性生育力的可能效果的方法。EP 3 244 911 B1没有提及治疗女性不孕症，并且也没有提及使用RANKL激活剂治疗女性不孕症。

EP 2 567 236 B1涉及一种使用血清样本中的OPG水平作为生物标志物来预测雄性哺乳动物生育潜力的方法。EP 2 567 236 B1没有提及治疗女性不孕症，并且也没有提及使用RANKL激活剂治疗女性不孕症。

因此，用于预测女性生育潜力的改进方法将是有利的，并且尤其是治疗女性不孕症或提高女性生育潜力的更有效和/或可靠的方法将是有利的。

发明概述

在此，数据表明，RANKL信号系统存在于女性生殖器官中，通过对卵泡数量、卵泡成熟和子宫功能产生影响，对女性生殖功能很重要。测量生物体液中的RANKL可以帮助指导辅助生殖技术，如IVF和ICSI，选择体外受精后应转移回的卵母细胞。此外，通过使用RANKL刺激剂或抑制剂或OPG抑制剂来操纵卵巢和子宫中的RANKL信号系统可用于改善女性生殖功能。

与男性性腺相比，女性的RANKL系统不同。在睾丸中，RANKL和OPG都高表达。在卵巢中存在高OPG表达和低RANKL表达。这表明OPG是卵巢中RANKL活性的主要决定因素，而OPG和RANKL的变化都可能导致睾丸中活性的改变。因此，在大多数临床情况下，卵巢的任务是减少OPG或刺激RANKL，而在两性的生殖道中有相似的表达，而RANKL抑制似乎是有益的。因此，RANKL刺激剂或RANKL抑制剂的使用更依赖于生殖系统中的疾病。

因此，本发明基于这样的认识，即RANKL/OPG/RANK系统存在于雌性生殖系统中，并且RANKL和OPG水平可以指示雌性生育潜力(参见实施例1(小鼠数据)和实施例2-3(人类数据)。有趣的是，与先前报道的男性生殖系统相比，该系统的工作方式似乎相反，因为阻断男性的RANKL-RANK相互作用似乎可以提高男性的生育潜力，而正如此处报道的那样，促进RANKL-RANK相互作用似乎可以提高女性的生育潜力。然而，在患有特定疾病(例如诸如多囊卵巢综合征的许多卵泡异常成熟或由于子宫植入受损而导致反复流产)的女性中，短期RANKL抑制可能增加怀孕和活产的机会。

因此，本发明的一个目的涉及提供用于确定女性生育潜力的方法。

特别地，本发明的一个目的是提供一种提高女性生育潜力和/或治疗女性不孕症的方法。

因此，本发明的一个方面涉及一种用于预测女性受试者的生育潜力的方法，该方法包括

·测定女性受试者的卵泡液或血液样本中RANKL和/或OPG的水平；

·将所述水平与一个或多个相应参考水平进行比较；和

·在以下情况下预测所述受试者不太可能具有正常的生育潜力(低生育潜力)：

o所述RANKL水平低于所述相应参考水平；和/或

o所述OPG高于所述相应参考水平；

或者

·在以下情况下预测所述受试者可能具有正常的生育潜力：

o所述RANKL水平等于或高于所述相应参考水平；和/或

o所述OPG水平等于或低于所述相应参考水平。

本发明的另一个方面涉及一种监测女性受试者生育潜力发展的方法，该方法包括

·测定来自女性受试者的第一卵泡液或血液样本中RANKL和/或OPG的第一水平；

·测定来自女性受试者的相应第二样本中的第二水平的RANKL和/或OPG，其中第二样本是在比第一样本晚的时间点获得的；

·比较第一和第二样本中的相应水平；

其中

o与第一样本相比，第二样本中的RANKL水平较低表明生育潜力下降；和/或

o与第一样本相比，第二样本中的OPG水平更高，表明生育潜力下降；

o第一和第二样本中相同的RANKL和/或OPG水平表明生育潜力没有变化；和

o与第一样本相比，第二样本中的RANKL水平更高表明生育潜力提高；和/或

o与第一样本相比，第二样本中的OPG水平较低表明生育潜力提高。

本发明的又另一方面是提供用于治疗和/或改善和/或预防哺乳动物雌性不孕症和/或用于提高雌性生育潜力的化合物；

其中所述化合物是

-(卵巢)RANKL表达的刺激剂；

-RANKL的激动剂或诱导剂/激活剂，例如RANKL与RANK结合的诱导剂/激活剂；

-骨保护素(OPG)的拮抗剂或抑制剂；

-RANKL；和/或

-RANKL抑制剂，例如，抑制RANK与RANKL结合的抑制剂。

实施例4表明，充分表征的RANKL诱导剂PTH的施用对小鼠的生育力具有有益作用。

实施例5表明，充分表征的(子宫)RANKL表达的RANKL抑制剂OPG的施用对小鼠的生育力有有益作用，因为卵泡液中的OPG水平高100倍并且不受OPG处理的影响。因此，在一个实施方案中，该化合物用于治疗和/或改善健康和/或不育女性受试者的卵母细胞植入子宫；

其中所述化合物是子宫RANKL信号(例如OPG)的抑制剂，从而改善卵母细胞的植入并确保更健康的怀孕。如实施例5中所述，OPG治疗提高体内生育力，但不会改变卵巢重量，这可能是由于治疗前低血清和高卵泡液OPG。

本发明的再另一个方面是提供一种体外方法，用于确定卵子成功受精和/或导致成功怀孕(分娩)的机会，该方法包括

·在体外测定包含至少一个未受精卵，优选仅一个卵子，的样本中的RANKL和/或OPG水平；

·将所述水平与一个或多个相应参考水平进行比较；和

·在以下情况下预测所述一个或多个卵子不太可能成功受精和/或在受精后导致成功怀孕：

o所述RANKL水平低于所述相应参考水平；和/或

o所述OPG高于所述相应参考水平；

或

·在以下情况下预测所述一个或多个卵子可能成功受精和/或在受精后导致成功怀孕：

o所述RANKL水平等于或高于所述相应参考水平；和/或

o所述OPG水平等于或低于所述相应参考水平。

本发明的另一个方面涉及一种用于改善卵子成功受精和/或导致成功怀孕的变化的体外方法，该方法包括离体向未受精的卵子施用根据本发明的化合物。

在一个实施例中，所述化合物是

-(卵巢)RANKL表达的刺激剂；

-骨保护素(OPG)的拮抗剂或抑制剂；和/或

-RANKL；

-RANKL抑制剂，例如抑制RANK与RANKL结合的抑制剂。

附图简要说明

图1示出了野生型小鼠(n＝10)和RANKL缺陷小鼠(n＝13)的卵巢重量(以克为单位)。数据显示为平均值+平均标准误。

图2示出了野生型小鼠(n＝10)和RANKL缺陷小鼠(n＝13)的子宫重量。数据显示为平均值+平均标准误。

图3示出了野生型小鼠(n＝10)和RANKL缺陷小鼠(n＝13)的产仔数。数据显示为平均值+平均标准误。

图4示出了野生型小鼠(n＝35)和RANKL缺陷小鼠(n＝35)出生后早期死亡幼崽的平均数量。数据显示为平均值+平均标准误。

图5和6示出了人体组织样本的RT PCR分析结果。(图5)：测试的组织类型。(图6)基因的表达水平；不同组织样本中的RANKL-1、RANKL-2、RANK、OPG、NFKB、RELa和RELb。

图7示出了(A)RANKL和OPG(B)的稳定表达水平的配对数据，在同一位女性中测量了两次，来自两个连续的IVF/ICSI周期(配对T检验不显著)。(C)血清RANKL和卵泡RANKL的量，它们在同一范围内，但不相关。

图8示出了卵泡激素和血清激素的统计显著线性回归。(A)卵泡OPG和sRANKL之间的负相关，(B)卵泡sRANK和卵泡AMH之间的正相关，(C)卵泡OPG和AMH之间的负相关，(D)血清sRANKL和卵泡SHBG之间的负相关，(E)血清sRANKL和血清SHBG之间的负相关，(F)血清sRANKL和血清雌二醇之间的负相关。

图9示出了与年龄相关的卵泡或血清RANKL和OPG。(A-B)卵泡sRANKL随年龄下降，显示在线性回归(A)和分组分析(B)中，在各组的非参数比较中，Kruskal-Wallis，(C-D)卵泡OPG随年龄增加，显示在线性回归(C)和分组分析(D)中，(E-F)血清sRANKL随年龄下降，显示在线性回归(E)和分组分析(F)中。

图10示出了卵泡RANKL或OPG与卵泡数(A-B)之间的关联，卵泡sRANKL随女性自然成熟的卵泡数(左右卵巢总和)而增加，如线性回归(A)和分组分析(B)所示，在各组的非参数比较，Kruskal-Wallis，(C-D)卵泡OPG随着女性自然成熟的卵泡数量(左右卵巢的总和)而减少，显示在线性回归(C)和分组分析(D)中。

图11示出了健康女性和不育女性的比较。分组分析显示：(A)健康女性的卵泡sRANKL水平高于不育女性，(B)但卵泡OPG水平相当。

图12示出了与怀孕和分娩相关的RANKL水平。(A)分组分析显示，与早期自然流产的女性相比，在ICIS/IVF后怀孕并足月分娩的女性中血清sRANKL临界值较高，(B)分组分析显示，与早期自发性流产的女性相比，在ICIS/IVF后怀孕并通过超声波验证心跳将胎儿带至第七周的女性中血清sRANKL显著升高。

图13示出了SHBG和出生大小之间的线性回归。(A)示出随着受孕时母体卵泡SHBG水平的增加，出生体重下降和(B)出生长度下降。

图14示出了与WT雄性小鼠比较用或不用PTH治疗的生育力研究。(A)怀孕。(B)：幼崽总数。(C)：每名雌性的幼崽。

图15示出了小鼠与WT雄性小鼠相比，用或不用OPG治疗的生育力研究。(A)怀孕。右上角：幼崽总数。左下角：每只雌性幼崽。

图16示出了血清OPG和卵泡OPG之间的Spearmann相关性。

图17示出了与未妊娠的女性相比，在IVF后通过超声验证，获得妊娠的女性卵泡液1,25D3水平。

下面将更详细地描述本发明。

发明详述

定义

在更详细地讨论本发明之前，将首先定义以下术语和约定。

抗体

本发明的抗体包括多克隆抗体、单特异性多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、单链抗体和/或双特异性抗体，包括抗体片段。此类片段的示例包括Fab F(ab')、F(ab)'、Fv和sFv片段。抗体可通过全长抗体的酶促切割或通过重组DNA技术产生，例如表达含有编码抗体可变区的核酸序列的重组质粒。

多克隆抗体是来源于用抗原免疫的动物血清的异质抗体分子群。抗原是能够被抗体结合的分子或分子的一部分，其另外能够诱导动物产生能够结合该抗原的表位的抗体。抗原可具有一个或多个表位。上面提到的特异性反应是指抗原将以高度选择性的方式与其相应的抗体反应，而不是与可由其他抗原引起的大量其他抗体反应。

单克隆抗体(mAb)含有抗原特异的基本上同质的抗体群，该群含有基本上相似的表位结合位点。这样的抗体可以是任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何亚类。产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤可以在体外、原位或体内培养。体内或原位产生高效价是优选的生产方法。

用于制备单克隆抗体的合适方法的实例包括Kohler等人，Nature256,495-497(1975)的杂交瘤方法，以及Kozbor,J.Immunol.133,3001(1984)的人B细胞杂交瘤方法；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Harlow和Lane，Antibodies:ALaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)；其参考文献的内容通过引用全部并入本文。

用于产生单克隆抗体的特别优选的方法是XenoMouse，如Green,LL,J.Immunol.(1999),Vol.231,11-25描述的方法，带有OPGbp/RANKL肽，例如全长人RANKL蛋白。

通过竞争性抑制确定单克隆抗体特异性和亲和力的优选方法可见于Harlow等人，Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1988)，Colligan等人编，Current Protocols in Immunology,Greene Publishing Assoc和Wiley Interscience,N.Y.,(1992,1993)，和Muller,Meth.Enzymol.，92:589-601(1983)。

嵌合抗体是其中不同部分来源于不同动物物种的分子，例如具有来源于鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子。

如本文所用，术语“嵌合抗体”包括单价、二价或多价免疫球蛋白。单价嵌合抗体是由嵌合H链与嵌合L链通过二硫键结合而形成的二聚体(HL)。二价嵌合抗体是由两个HL二聚体通过至少一个二硫键结合而形成的四聚体(H2L2)。多价嵌合抗体也可以产生，例如，通过使用聚集的CH区(例如，来自IgM H链或[微]链)。

本发明的鼠和嵌合抗体、片段和区域可以包含单独的免疫球蛋白重链(H)和/或轻链(L)。

具有相同或不同可变区结合特异性的嵌合H链和L链的选择性结合剂，例如抗体、片段或衍生物，也可以根据已知的方法步骤，例如，通过适当结合各个多肽链来制备，根据Ausubel等人编，Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,N.Y.(1993),and Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1988)。这些参考文献的内容通过引用全部并入本文。使用这种方法，表达嵌合H链(或其衍生物)的宿主与表达嵌合L链(或其衍生物)的宿主分开培养，并且免疫球蛋白链被分别回收然后结合。或者，可以将宿主共培养，让链在培养基中自发结合，然后回收组装的免疫球蛋白、片段或衍生物。

抗原结合域

术语“抗原结合域”或“抗原结合区”或“片段或其衍生物”是指选择性结合剂(例如抗体分子)的一部分，其包含与抗原相互作用并赋予结合剂对抗原的特异性和亲和力。优选地，抗原结合区是人类来源的。在其他实施方案中，抗原结合区可以源自其他动物物种，特别是家畜和啮齿动物，例如兔、大鼠或仓鼠。

有效量

术语“有效量”和“治疗有效量”是指选择性结合剂的量，其对于支持一种或多种生物活性水平的可观察变化是有用的或必需的，其中所述变化可以是增加或减少。

表达水平

如本文所用，“表达水平”或“水平”是指给定样本中蛋白质的绝对或相对量。因此，表达水平是指样本中蛋白质的量。通常使用常规检测方法检测表达水平。

在另一个优选的实施方案中，表达水平是指精液样本中所讨论蛋白质的总蛋白质水平。

女性生育/女性生育潜力

不孕症是一种普遍的疾病，其原因可能是女性、男性、两者兼而有之，或原因不明。12个月的无保护性交且未采取避孕措施且未受孕被定义为不孕症。

女性受试者

提及“女性受试者”或“受试者”或“个体”包括人类或非人类哺乳动物物种，包括灵长类动物、家畜动物(例如绵羊、牛、猪、马、驴、山羊)、实验室试验动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠)和伴侣动物(例如狗、猫)。因此，本发明在人类医学以及家畜和兽医以及野生动物应用中具有应用性。在优选的实施方案中，哺乳动物是人。在特别优选的实施方案中，哺乳动物是女性。

OPG

骨保护素(OPG)，也称为破骨细胞生成抑制因子(OCIF)或肿瘤坏死因子受体超家族成员11B(TNFRSF11B)，是由TNFRSF11B基因编码的肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的细胞因子受体。

RANK

核因子κB(RANK)受体激活剂，也称为TRANCE受体或TNFRSF11A，是肿瘤坏死因子受体(TNFR)分子亚家族的成员。RANK是RANK配体(RANKL)的受体，是调节破骨细胞分化和激活的RANK/RANKL/OPG信号通路的一部分。它与骨重塑和修复、免疫细胞功能、淋巴结发育、热调节和乳腺发育有关。骨保护素(OPG)是RANK的诱饵受体，通过竞争RANKL来调节RANK信号通路的刺激。RANK的细胞质结构域结合TRAF 1、2、3、5和6，它们将信号传递给下游靶标，例如NF-κB和JNK。

RANKL

核因子受体激活因子kappa-B配体(RANKL)，也称为肿瘤坏死因子配体超家族成员11(TNFSF11)、TNF相关激活诱导细胞因子(TRANCE)、骨保护素配体(OPGL)和破骨细胞分化因子(ODF),是一种在人类中由TNFSF11基因编码的蛋白质。

RANKL被称为II型膜蛋白，是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的成员。已确定RANKL会影响免疫系统并控制骨再生和重塑。RANKL是一种凋亡调节基因，是骨保护素(OPG)的结合伴侣，骨保护素是受体RANK的配体，并通过改变Id4、Id2和细胞周期蛋白D1的蛋白质水平来控制细胞增殖。

RANKL在多种组织和器官中表达，包括：骨骼肌、胸腺、肝脏、结肠、小肠、肾上腺、成骨细胞、乳腺上皮细胞、前列腺和胰腺。多个器官中RANKL浓度水平的变化再次证实了RANKL在组织生长(特别是骨骼生长)和体内免疫功能中的重要性。

对人类睾丸和维生素D受体(VDR)敲除小鼠的研究表明，几种骨因子如Runx2、osterix和骨钙素在正常睾丸和睾丸癌中表达。这些因素之一是NF-κB配体(RANKL)的受体激活剂。RANKL系统是一种强大的骨吸收调节剂，由三个部分组成：RANKL，一种跨膜配体，在与邻近细胞上的受体RANK结合后激活NF-κB并调节细胞周期，即增殖、分化和凋亡。跨膜RANKL蛋白存在于骨细胞中，激活未成熟破骨细胞中的RANK，诱导破骨细胞生成，促进骨吸收。骨保护素(OPG)是一种内源性分泌型诱饵受体，结合RANKL并阻断其信号传导，从而阻止破骨细胞分化和激活。RANKL也可以在循环中发现，表明该蛋白质具有推定的内分泌功能。事实上，最近提出了RANKL的新骨骼外功能，包括调节葡萄糖稳态。

在本文中，术语“可溶性RANKL”或“sRANKL”是指RANKL的游离部分。sRANKL未结合到OPG。

参考水平

在本发明的上下文中，术语“参考水平”是指与数量相关的标准，其他值或特征可以与之比较。

参考水平可以是一名或多名健康受试者(具有正常女性生育潜力)的平均值，或者实际上也可以是一名或多名生育潜力降低的受试者的平均值。参考水平也可以来自在先前时间点获得的同一受试者的一个或多样本。同样，参考水平的确切水平取决于所需的灵敏度和特异性。临床医生可以决定这一点。在示例部分中，提供了RANKL和OPG的不同确定值。

风险评估

本发明人已成功开发出一种新方法来预测女性受试者不育的风险。为确定患者不育风险是否增加，必须确定截止值(参考水平)。该截止值可由实验室、医生或根据每位患者的具体情况确定。

可以使用多种方法确定截止水平，包括：多元统计检验(例如偏最小二乘判别分析(PLS-DA)、随机森林、支持向量机等)、百分位数、平均正负标准偏差)；中位数；成倍变化。

多变量判别分析和其他风险评估可以在免费或市售的计算机统计软件包(SAS、SPSS、Matlab、R等)或本领域技术人员已知的其他统计软件包或筛选软件上进行。

对于本领域技术人员显而易见的是，在上述任何实施方案中，改变风险截止水平可以改变每个受试者的判别分析的结果。

统计数据可以评估每个级别的重要性。应用于数据集的常用统计检验包括t检验、f检验或更高级的检验和比较数据的方法。使用这样的测试或方法能够确定两个或更多样本是否显著不同。

显著性可以通过本领域技术人员已知的标准统计方法来确定。

所选择的参考水平可能会根据测试所针对的哺乳动物/受试者而改变。

优选地，根据本发明的受试者是人类受试者，例如被认为有不育风险的男性受试者。

如果需要，可以改变所选择的参考水平以给出本领域已知的不同特异性或灵敏度。灵敏度和特异性是广泛使用的统计数据，用于描述和量化生物标志物或诊断测试的好坏程度和可靠性。灵敏度评估生物标志物或诊断测试在检测疾病方面的效果，而特异性评估个体(即对照、无病患者)被正确识别为没有风险的可能性。

几个术语与灵敏度和特异性的描述一起使用；真阳性(TP)、真阴性(TN)、假阴性(FN)和假阳性(FP)。如果证明患病患者存在某种疾病，则诊断测试的结果被认为是TP。如果个体(即对照、无病患者)不存在疾病，并且诊断测试证实没有疾病，则测试结果为TN。如果诊断测试表明没有这种疾病的个体存在疾病，则测试结果为FP。最后，如果诊断测试表明患有疾病的患者不存在疾病，则测试结果为FN。

灵敏度

如本文所用，灵敏度是指被正确识别为阳性的实际阳性比例的测量值——类似于诊断测试，即生育潜力低于正常水平的哺乳动物或人被确定为具有低于正常的生育潜力的百分比。

通常，测试的灵敏度可以描述为真阳性占目标病症总数的比例，即生育潜力低于正常水平。所有患有目标病症的患者都是(检测到的)真阳性(TP)和(未检测到的)假阴性(FN)的总和。

特异性

如本文所用，特异性是指正确鉴定的阴性比例的量度-即具有正常生育潜力的哺乳动物被鉴定为不具有低于正常生育潜力的百分比。理想的诊断测试是具有100％特异性的测试，即仅检测生育潜力低于正常水平的哺乳动物，因此没有假阳性结果，并且具有100％的灵敏度，即检测所有生育潜力低于正常水平的哺乳动物，因此没有假阴性结果。

对于任何测试，通常在每个度量之间进行权衡。例如，在制造测试故障的设置中，人们可能愿意冒险丢弃功能部件(低特异性)，以增加识别几乎所有故障部件的机会(高灵敏度)。这种权衡可以使用ROC曲线以图形方式表示。

选择灵敏度和特异性可以在检测方法中获得最佳结果。在确定区分具有低于正常生育潜力的哺乳动物的鉴别值时，本领域技术人员必须预先确定特异性水平。理想的诊断测试是具有100％特异性的测试，即仅检测生育潜力低于正常水平的哺乳动物，因此没有假阳性结果，以及100％灵敏度，即检测所有生育潜力低于正常水平的哺乳动物，因此没有假阴性结果。然而，由于生物多样性，如果不包括大量的假阴性结果，就不能期望任何方法具有100％的灵敏度。

所选择的特异性决定了给定研究/人群和给定机构可以接受的假阳性病例的百分比。通过降低特异性，实现了灵敏度的增加。一个例子是95％的特异性将导致5％的假阳性情况。例如，如果筛查人群的生育潜力低于正常水平的给定流行率为1％，那么95％的特异性意味着如果测试的灵敏度为100％，则5个人将接受进一步的身体检查以检测一(1)个低于正常水平的生育潜力。

正如本领域技术人员通常理解的那样，用于筛选生育潜力的方法是决策过程，因此所选择的特异性和敏感性取决于给定机构/临床人员认为什么是最佳结果。

缩略语

1.25OH2D3：维生素D的活性形式

FSH：促卵泡激素

IL-1：白细胞介素1

LH/hCG：促黄体激素/绒毛膜促性腺激素

PTH：甲状旁腺激素

PTHRP：甲状旁腺激素相关蛋白

SHBG：性激素结合球蛋白

TNF：肿瘤坏死因子

RANKL：核因子kappa-B的受体激活剂配体

OPG：骨保护素

RANK：核因子kappa-B受体激活剂

SIK：盐诱导激酶1-3

预测女性受试者的生育潜力

同样如上所述，本发明涉及鉴定RANKL/OPG/RANK系统存在于雌性生殖系统中，并且RANKL和OPG水平可以指示雌性生育潜力(参见实施例1(小鼠数据)和实施例2-3(人类数据)。因此，本发明的第一方面涉及一种用于预测女性受试者的生育潜力的方法，该方法包括

·将所述水平与一个或多个相应参考水平进行比较；和

ο所述RANKL水平低于所述相应参考水平；和/或

ο所述OPG高于所述相应参考水平；

或者

·在以下情况下预测所述受试者可能具有正常的生育潜力：

ο所述RANKL水平等于或高于所述相应参考水平；和/或

ο所述OPG水平等于或低于所述相应参考水平。

在本文中，术语“不太可能具有正常生育潜力”是指受试者具有低生育潜力甚至不育。

在一个实施方案中，确定RANKL的水平，优选sRANKL的水平。可以确定可溶性RANKL(sRANKL)。

RANKL水平可以不同的方式确定。因此，在一个实施方案中，水平是蛋白质水平，例如RANKL和/或OPG的蛋白质水平，例如可溶性RANKL。

如上所述，可以在不同的样本类型中确定RANKL和/或OPG。在一个实施方案中，测定卵泡液中的RANKL和/或OPG水平。在实施例3中，提供了来自人类卵泡液的数据。

在一个实施方案中，确定RANKL/OPG比率。在这种情况下，高比率(高于参考水平)将指示所述受试者可能具有正常的生育潜力，而低比率(低于或等于参考水平)将指示所述受试者可能具有低生育潜力。因此，不同标志物之间的比率提高了该方法的统计能力。

在又一个实施方案中，所述RANKL和/或OPG的测定是通过选自下组的方法在蛋白质水平上测定的：免疫组织化学、免疫细胞化学、FACS、ImageStream、Western Blotting、ELISA、Luminex、Multiplex、免疫印迹、TRF测定的方法、免疫层析横向流动测定、酶倍增免疫测定技术、RAST测试、放射免疫测定、免疫荧光和免疫干棒测定，例如横向流动测定。

在一个优选的实施方案中，所述测定通过ELISA、免疫细胞化学或横向流动测定法进行。

技术人员可以根据所需的特异性和灵敏度应用不同的参考水平。因此，在一个实施方案中，一个或多个参考水平选自下组：

-范围0.1-0.6pmol/l血清sRANKL，例如0.2-0.5pmol/l，或例如0.3-0.4pmol/l血清sRANKL

-高于0.2pmol/l的血清sRANKL，例如高于0.3pmol/l或高于0.4pmol/l的血清sRANKL；

-低于0.6pmol/l的血清sRANKL，例如低于0.5pmol/l，或低于0.4pmol/l，或低于0.3的血清sRANKL；

-范围1-6pmol/l的血清OPG，例如范围为2-5pmol/l，或例如范围为3-4pmol/l的血清OPG；

-高于1pmol/l血清OPG，例如高于2pmol/l血清OPG，例如高于3pmol/l血清OPG，例如高于4pmol/l血清OPG，或例如高于5pmol/l血清OPG；

-低于6pmol/l血清OPG，例如低于5pmol/l血清OPG，例如低于4pmol/l血清OPG，例如低于3pmol/l血清OPG，或例如低于2pmol/l血清OPG；

-范围0-2pmol/l卵泡sRANKL，例如0.1-2pmol/l卵泡sRANKL，例如0.5-2pmol/l卵泡sRANKL，例如0.2-1.8pmol/l卵泡sRANKL，例如0.5-1.5pmol/l卵泡sRANKL，或如0.8-1.3pmol/l卵泡sRANKL；

-高于0.01pmol/l卵泡sRANKL，例如高于0.03pmol/l卵泡sRANKL，例如高于0.1pmol/l卵泡sRANKL，例如高于0.5pmol/l卵泡sRANKL，或例如高于1pmol/l卵泡sRANKL，

-低于2pmol/l卵泡sRANKL，例如低于1.5pmol/l卵泡sRANKL，例如低于1pmol/l卵泡sRANKL，例如低于0.8pmol/l卵泡sRANKL，或例如低于0.5pmol/l卵泡sRANKL；

-范围100-1000pmol/l卵泡OPG，例如范围200-900pmol/l卵泡OPG，例如范围300-700pmol/l卵泡OPG或例如范围400-600pmol/l卵泡OPG；

-高于100pmol/l卵泡OPG，例如高于100pmol/l卵泡OPG，例如高于300pmol/l卵泡OPG，例如高于500pmol/l卵泡OPG，或例如高于700pmol/l卵泡OPG，

-低于1000pmol/l卵泡OPG，例如低于800pmol/l卵泡OPG，例如低于600pmol/l卵泡OPG，例如低于500pmol/l卵泡OPG，或例如低于300pmol/l卵泡OPG。

女性生育潜力可能取决于一个或多个不同的因素。因此，在一个实施方案中，女性生育潜力包括一种或多种选自以下的指标/因素：卵巢功能、卵巢卵泡数、成熟卵泡数、成熟卵泡的能力、女性活产的能力、流产风险降低、子宫内膜和子宫功能正常。

AMH是确定女性生育潜力时要评估的已知因素。当卵囊或卵泡发育时，卵细胞产生抗苗勒管激素(AMH)。女性血液中的AMH水平是目前衡量其卵巢储备质量的最佳指标之一。因此，在一个实施方案中，该方法进一步包括确定AMH的水平。

在另一方面，该方法还包括，如果预测所述受试者具有低生育潜力，则推荐所述受试者进行辅助生殖技术(ART)、体外受精(IVF)和胞浆内单精子注射(ICSI)，或推荐所述受试者(或开始对所述受试者)进行根据本发明的治疗。

另一方面，本发明涉及RANKL和/或OPG作为女性受试者生育潜力预测标志物的用途。

随着时间的推移监测生育潜力的发展

如上所述，使用本发明的方法，可以确定女性在给定时间点的生育潜力。然而，本发明的方法也可用于随着时间的推移监测生育潜力。因此，本发明的一个方面涉及一种用于监测女性受试者生育潜力发展的方法，该方法包括

·测定来自女性受试者的第一个卵泡液或血液样本中RANKL和/或OPG的第一水平；

·测定来自女性受试者的相应第二样本中的RANKL和/或OPG的第二水平，其中第二样本是在比第一样本晚的时间点获得的；

·比较第一和第二样本中的相应水平；

其中

ο与第一样本相比，第二样本中的RANKL水平较低，表明生育潜力下降；和/或

ο与第一样本相比，第二样本中的OPG水平更高，表明生育潜力下降；

ο第一和第二样本中相同的RANKL和/或OPG水平表明生育潜力没有变化；和

ο与第一样本相比，第二样本中的RANKL水平更高，表明生育潜力提高；和/或

ο与第一样本相比，第二样本中的OPG水平较低，表明生育潜力有所提高。

在优选实施方案中，至少在第一和第二样本中确定RANKL水平。

在又一个实施方案中，第一和第二样本是卵泡液和/或血清。在相关实施方案中，血液样本是全血样本、血清样本或血浆样本，优选血清样本。

能够监测提高女性生育潜力的治疗是否有效也可能是有利的。因此，在一个实施方案中，在第一和第二样本的取样之间进行了用于提高女性受试者的女性生育潜力的治疗。当然可以理解，随着时间的推移可能需要额外的样本以对女性进行持续监测。

在一个实施方案中，用于提高女性生育潜力的治疗选自包括或由以下组成的组：激素过度刺激与促性腺激素、hCG和辅助生殖技术例如IVF、ICSI和授精的组合。

在又一个实施方案中，用于提高女性生育潜力的治疗是根据本发明使用的化合物。

在又另一个实施方案中，用于提高女性生育潜力的治疗是改变生活方式，例如改变饮食，例如摄入维生素和矿物质、锻炼、减轻体重、戒烟或减少吸烟或其组合。

应当理解，根据本发明的女性受试者可以是人或动物，例如哺乳动物。因此，在本发明的一个实施方案中，哺乳动物选自人、猪、牛、瘤牛、驴、马、狗、猫、山羊和绵羊，优选人。

用于治疗和/或预防女性不孕症的化合物

如上所述，RANKL和OPG被认为是女性受试者生育潜力的生物标志物。因此，提高女性生育潜力的治疗方案也是本发明的一部分。应当理解，女性生育潜力的提高也可以是女性受试者不孕症的治疗。因此，本发明的又一个方面涉及用于治疗和/或改善和/或预防哺乳动物的雌性不孕症和/或用于提高雌性生育潜力的化合物；

其中所述化合物是

-(卵巢)RANKL表达的刺激剂；

-骨保护素(OPG)的拮抗剂或抑制剂；

-RANKL；和/或

-RANKL抑制剂，例如抑制RANK与RANKL结合的抑制剂。

在一个实施方案中，该化合物用于患有卵巢功能衰竭的女性，例如多囊卵巢综合征(女性可能有许多卵泡)。

在另一个实施方案中，该化合物用于患有多次流产和/或妊娠丢失的女性例如由于植入受损或早期流产导致的未怀孕(missed pregnancies)和/或多囊卵巢综合征。

在一个实施方案中，多次流产被认为是多于一次流产，例如多于2次或3次流产，例如2-10次流产，例如3-10次，例如4-10次或5-10次流产。

在本文中，术语“流产”被认为是在IVF或ICSI手术期间用受精卵母细胞移植3次或更多次后没有生化妊娠，例如受精卵母细胞移植3-10次，例如4-10次，例如5-10次没有怀孕迹象。

在不同的实施方案中，RANKL刺激剂(例如PTH)用于这样的女性，其患有

-原发性卵巢功能衰竭；和/或

-绝经前的高龄，(因此可能只剩下很少的卵母细胞)和/或

-AMH较低的女性。

在本文中，术语“原发性卵巢功能衰竭”或“原发性卵巢功能不全”(POI)应理解为女性的卵巢在40岁之前停止正常工作。许多女性在40岁左右自然会经历生育潜力下降。当她们过渡到更年期时，她们可能会开始月经不调。对于患有POI的女性，月经不规律和生育潜力下降在40岁之前就开始了。有时它可以早在青少年时期就开始了。POI不同于过早绝经。如果提前绝经，月经会在40岁之前停止。将无法再怀孕。原因可以是自然原因，也可以是疾病、手术、化疗或放疗。对于POI，一些女性仍然偶尔会有月经。他们甚至可能怀孕。在大多数POI案例中，原因不明。

在本文中，术语“未绝经的高龄”(只剩下很少的卵母细胞)应理解为35岁以上未绝经的女性，如40岁以上、45岁以上或50岁以上未绝经。

在本文中，术语“具有低AMH的女性”被认为是具有血清AMH水平低于25pmol/l，例如低于20pmol/l，例如低于10pmol/l，或例如低于5pmol/l的女性。

在另一个实施方案中，该化合物用于治疗女性卵泡过多的多囊卵巢综合征；

其中所述化合物是全身和/或卵泡RANKL信号通路(例如OPG)的抑制剂，从而减少卵泡的成熟。如实施例5所述，OPG处理可提高体内生育潜力，但不会改变卵巢重量。

在一个实施方案中，该化合物用于患有多次流产和/或妊娠丢失的女性例如由于植入受损或早期流产导致的未怀孕和/或多囊卵巢综合征；

其中该化合物是RANKL的抑制剂。

在另一个实施方案中，该女性患有原发性卵巢衰竭；和/或绝经前的高龄，和/或低AMH水平，

其中化合物是RANKL刺激剂，例如PTH。

如实施例部分所述，由于低水平的RANKL和/或高水平的OPG可能对女性生育潜力产生负面影响，因此上述化合物被认为能够提高女性受试者的生育潜力。

在一个实施方案中，所述化合物是卵巢RANKL表达的刺激剂。不同的化合物可以刺激/增强RANKL表达。因此，在一个相关的实施方案中，该化合物选自PTH、PTHRP、维生素d、25OHD、1.25OH2D3、24,25OH2D3、Etalpha、IL-1、TNF、FSH、LH、SIK抑制剂、YKL-05-099及其组合，优选化合物是PTH、PTHrP或SIK抑制剂。

在另一个实施方案中，化合物选自IL-1、IL-6、IL-11、IL-17、TNF-α、维生素D、Ca²⁺、甲状旁腺、糖皮质激素、前列腺素E2和免疫抑制药物。

这些化合物都是技术人员已知的，可以刺激/增强RANKL表达。

在又一个实施方案中，该化合物是RANKL的激动剂或诱导剂/激活剂，例如RANKL与RANK结合的诱导剂/激活剂。

在相关的实施方案中，化合物是LH/hCG或FSH。

在另一个实施方案中，该化合物是骨保护素(OPG)的拮抗剂或抑制剂，例如抑制OPG与RANKL结合的抗体(Nadine等人，Nature Communications第10卷，文章编号：5183(2019)/WO2018138297)或包含RANKL上OPG的结合位点的肽。通过抑制OPG与RANKL的结合，RANKL可以与RANK结合，RANK(不受理论的束缚)被认为对女性生育潜力很重要。

不受理论的束缚，以下考虑可以解释实施例4和5中呈现的体内小鼠数据。

Cyt-177-c(OPG-FC)

不受理论的束缚，Cyt-177-c(OPG-FC)被认为是通过抑制RANKL-RANK信号转导而成为RANKL的抑制剂。然而，OPG可能不会进入卵泡液并在那里发挥作用，因为卵泡液中的OPG水平比血清高100倍以上，并且不受OPG的影响。然而，OPG会阻断包括子宫在内的所有性腺外组织中的RANKL。RANKL抑制剂(以OPG为例)可对所有组织中的RANKL通路进行短期操作，但对器官重量没有影响，但会增加妊娠率、幼崽数量和产仔数以及血清AMH升高的趋势。这支持了抑制卵泡外的RANKL可以改善女性生殖功能并增加活产的可能性。对活产的影响很可能是由于对子宫内植入和存活的影响。另见实施例5。

因此，在一个实施方案中，根据本发明使用的化合物是RANKL抑制剂，例如抑制RANK与RANKL结合的抑制剂。因此，在一个实施方案中，使用的化合物是拮抗剂或抑制剂，例如抗体或抗原结合结构域(例如纳米抗体或类似物)，其调节RANKL和RANK之间的相互作用，特别是抗体或抗原结合结构域，其阻断RANKL和RANK之间的相互作用和/或抑制RANKL的至少一种活性。

在一个更具体的实施方案中，化合物是地诺单抗、Cyt-177-c(OPG-FC)或OPG。如实施例5中所述，OPG-FC已作为RANKL抑制剂的一个例子在小鼠中进行了测试，因为地诺单抗不与小鼠RANKL结合(地诺单抗对人RANKL具有特异性)。EP 3 030 249B1公开了一种使用RANKL-RANK抑制剂如地诺单抗或OPG治疗男性不孕症的方法。值得注意的是，地诺单抗是一种众所周知的抗体，它与人RANKL结合，从而抑制RANKL-RANK相互作用/信号通路。

因此，在一个实施方案中，使用的化合物是地诺单抗或对RANKL具有相同或相似结合亲和力的化合物，即生物仿制药，例如以单结构域抗体的形式，例如纳米抗体。

然而，存在其他已知的(小分子)RANKL抑制剂。因此，在一个实施方案中，RANKL抑制剂选自AS2676293、ABD328、ABD345、SPD-304和E09241及其活性片段和类似物。

·AS2676293在Nakai等人中有描述。(BoneResearch第7卷，文章编号：1(2019))

·ABD328和ABD345在Coste等人中有描述。(Ann Rheum Dis.2015年1月；74(1):220-6)。

·SPD-304和SPD-304的类似物在Rinotas等人中有描述。(J.Med.Chem.2020,63,20,12043–12059)。

·E09241在Han等人中有描述。(Front.Pharmacol.，2019年3月11日)。

在一个实施方案中，RANKL-RANK信号通路的抑制剂可用于治疗/改善女性不孕症，特别是在健康受试者中以及患有反复流产、植入失败、多囊卵巢综合征和/或子宫内膜异位症的女性受试者。

在本文中，术语“子宫内膜异位症”应理解为女性生殖系统疾病，其中类似于子宫内膜(通常覆盖子宫内部的组织层)中的细胞在子宫外生长。

PTH

不受理论的束缚，PTH可以增加RANKL的表达并抑制骨保护素(OPG)的分泌。游离OPG作为诱饵受体与RANKL竞争性结合，阻止RANKL与RANK相互作用，RANK是RANKL的受体。因此，RANKL与RANK的结合(通过减少可用于结合过量RANKL的OPG的量来促进)可能会刺激女性生育潜力。

如实施例4所示，通过注射充分表征的RANKL诱导剂PTH对RANKL信号通路的短操作对于正常小鼠的生育力具有有益影响。与介载体相比，PTH治疗使妊娠率增加一倍，幼崽数量和每只雌性暴露的幼崽数量增加，这表明PTH在繁殖前和繁殖过程中诱导RANKL有利于活产率。由于PTH治疗并不局限于生殖组织，因此理论上可以在许多组织中发挥作用。然而，卵巢重量的显著变化表明部分影响是直接在卵巢中介导的。

因此，在一个实施方案中，RANKL诱导剂如PTH可用于治疗/改善女性不孕症，特别是在健康受试者中以及患有原发性卵巢衰竭、低AMH水平和/或高龄的女性受试者(可能卵母细胞数量少)。

维生素D(维生素D3(胆钙化醇)

不受理论的束缚，维生素D被认为是通过增加RANKL的表达甚至可能通过降低OPG来刺激RANKL。

如实施例4中所述，与未怀孕的女性相比，在IVF后通过超声验证怀孕的女性卵泡液中的卵泡液1,25D3水平(另一种RANKL刺激剂)更高。

因此，在一个实施方案中，RANKL诱导剂如维生素D可用于治疗/改善女性不孕症，特别是在健康受试者中以及患有原发性卵巢衰竭、低AMH水平和/或高龄的女性受试者(可能卵母细胞数量少)。

雌激素/LH/hCG/FSH

这些化合物被认为抑制男性受试者的性腺RANKL，但刺激女性受试者的性腺RANKL。

结合OPG的抗体

结合OPG的抗体将阻止OPG抑制RANKL-RANK相互作用。

其他化合物也可能有用。因此，在又一个实施方案中，化合物选自由伊马替尼、性激素、小分子组成的组。

在一个实施方案中，化合物选自由多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体、单链抗体、双特异性抗体、纳米抗体和抗体组成的组，其中重链和轻链通过柔性接头、Fv分子、抗原结合片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂分子、全人抗体、人源化抗体和嵌合抗体或其片段或衍生物连接。

由于要获得的期望效果是提高RANKL的量和/或RANKL对RANK的活性，因此RANKL本身也可以被认为是一种有效的化合物。因此，在一个实施方案中，该化合物是RANKL或其活性衍生物或片段。活性片段应理解为能够结合RANK并启动与wt RANKL相同(或相似的效果)的片段。

实施例4中的PTH数据支持这一点。PTH是RANKL刺激剂。与实施例4中解释的类似，(活性)维生素D(1,25D3)也是RANKL刺激剂；卵泡液中1,25D3的浓度与女性使用IFF怀孕的机会相关。

在一个实施方案中，所述化合物以选自以下的剂量施用：

-1-100微克(mcg)PTH每日剂量，例如2-800mcg，例如2-80mcg，例如5-60mcg，例如10-50mcg，例如15-30mcg，或例如大约20微克(mcg)PTH每日剂量，优选每日一次；

-5-800PTHrP每日剂量，例如20-500PTHrP每日剂量，例如40-200PTHrP每日剂量，例如50-150PTHrP每日剂量，例如60-120PTHrP每日剂量或例如约80mcg PTHrP每日剂量，优选每日一次；

-75-1000IU的FSH、LH或hCG每日剂量，例如在100-800范围内，例如在200-800IU范围内，例如在300-700IU范围内，或例如在400-600IU范围内，优选每日一次；

-500-20000IU维生素D每日剂量，例如1000-10000IU，例如2000-8000IU，例如4000-6000IU或例如约5000IU维生素D每日剂量；和

-0.25-1.5mcg Etalpha每日剂量，优选每日一次。

为了仅在所需位置获得化合物的所需效果，可以优化给药途径。因此，在一个实施方案中，化合物通过宫内注射直接施用到卵巢或阴道内的卵泡液中。

总之，用卵泡RANKL信号通路刺激剂进行治疗可以通过使用如上所述的已知RANKL刺激剂或通过抑制OPG(次级将增加RANKL信号通路(也如上所述))可用于改善女性的生育潜力。特别是在ART(IVF和ICSI)期间，此时女性会经历过度刺激和卵母细胞收获，以通过增加活产机会和降低流产风险来确保改善ART的结果。

因此，在一个实施方案中，所述女性受试者正在经历ART和/或过度刺激，但是在收获卵母细胞之前。

在另一个实施方案中，使用的化合物用于增加活产的机会和/或降低流产的风险。

一种用于确定卵子成功受精和/或导致成功怀孕的变化的体外方法

如上所述，本发明的方法可用于确定女性受试者的生育潜力。然而，本发明也可以用于确定离体样本中单个卵子(或卵母细胞)(或几个卵子)的潜力。

当进行辅助生殖时，会过度刺激女性，并且会发育出不止一个卵泡。就在排卵前，所有的卵泡都用一根小针吸出以收集卵母细胞。在此过程中，卵母细胞周围的所有液体都被丢弃。因此，在一个方面，本发明涉及测量该卵泡液中的RANKL和/或OPG以鉴定最佳卵母细胞。如果一个卵母细胞的卵泡液中RANKL较高，则认为该卵母细胞比卵泡液中RANKL较低的另一个卵母细胞更有可能成为健康妊娠。因此，卵泡液中的RANKL和/或OPG水平用于指导受精后将哪个卵母细胞转移回女性体内并在体外培养为4细胞或胚泡。高RANKL表明卵母细胞质量好，因此怀孕机会高，而低OPG是相同的。

因此，本发明的一个方面涉及一种用于确定卵子成功受精和/或导致成功怀孕(分娩)的机会的体外方法，该方法包括

·在体外测定包含至少一个未受精卵(或卵母细胞)，优选仅一个卵(或卵母细胞)的样本中的RANKL和/或OPG水平；

·将所述水平与一个或多个相应参考水平进行比较；和

·在以下情况下，预测所述一个或多个卵子不太可能成功受精和/或在受精后导致成功怀孕：

ο所述RANKL水平低于所述相应参考水平；和/或

ο所述OPG高于所述相应参考水平；

或

·在以下情况下，预测所述一个或多个卵可能成功受精和/或在受精后导致成功怀孕：

ο所述RANKL水平等于或高于所述相应参考水平；和/或

ο所述OPG水平等于或低于所述相应参考水平。

如上所述，参考水平可以是从其他女性的样本中获得的一般参考水平，但它也可以是来自同一女性的样本，例如来自在同一时间点获得的其他卵子或卵母细胞。以这种方式，可以选择优选的卵子继续使用，因为所选卵子被认为是最有可能成功怀孕的卵子。

在一个实施方案中，预计卵子将通过辅助生殖技术(ART)受精，例如选自由体外受精(IVF)和胞浆内单精子注射(ICSI)组成的组。

在一个实施方案中，样本取自装有一个或多个卵子的培养基。

用于提高卵子成功受精和/或导致成功怀孕机会的体外方法

根据本发明使用的化合物也可以在体外用于改善卵子成功受精和/或导致成功怀孕(插入女性体内后)的变化。因此，本发明的另一个方面涉及一种用于改善卵子成功受精和/或导致成功怀孕的变化的体外方法，该方法包括离体向未受精卵子施用根据发明的化合物。

在一个实施方案中，所述化合物是

-(卵巢)RANKL表达的刺激剂；

-骨保护素(OPG)的拮抗剂或抑制剂；和/或

-RANKL；和/或

-RANKL抑制剂，例如抑制RANK与RANKL结合的抑制剂。

在又一个实施方案中，预期所述卵子通过辅助生殖技术(ART)受精，例如选自由体外受精(IVF)和胞浆内单精子注射(ICSI)组成的组。

在又一个实施方案中，化合物被施用于或包含在容纳卵子的培养基中。

本发明的其他方面

在一个方面，本发明涉及一种用于治疗受试者的女性不孕症或用于提高女性受试者的生育潜力的方法，所述方法包括施用治疗有效量的根据本发明的化合物。

在一个实施方案中，所述化合物是

-(卵巢)RANKL表达的刺激剂；

-骨保护素(OPG)的拮抗剂或抑制剂；和/或

-RANKL；和/或

-RANKL抑制剂，例如抑制RANK与RANKL结合的抑制剂。

应当注意，在本发明的一个方面的上下文中描述的实施方案和特征也适用于本发明的其他方面。

本申请中引用的所有专利和非专利参考文献均通过引用整体并入本文。

现在将在以下非限制性实施例中更详细地描述本发明。

实施例

卵巢功能和女性生殖道受黄体生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)控制下的颗粒细胞和卵泡膜细胞产生的性类固醇的强烈影响，而抗苗勒管激素(AMH)则由受促卵泡激素(FSH)刺激而生长的卵泡产生。

性腺和骨骼之间存在内分泌交联，因为性类固醇是骨骼功能的有效调节剂。骨特异性蛋白质例如骨钙素和维生素D已被提议用于刺激睾酮和配子发生。在这里，测试这些假定的“内分泌骨因子”中的一些是否可能在女性性腺中局部起作用并影响生殖功能。在以下研究中，“内分泌骨因子”以RANKL、RANK和OPG为代表。

实施例1–RANKL在体内的组织和细胞特异性功能

研究目的

确定体内RANKL缺陷的组织和细胞特异性功能。

材料与方法

获得Rankl^f1/fl小鼠(来自Jackson Laboratory的Cat#B6.129-Tnfsf11)。首先将Rankl^fl/fl与从Jackson实验室获得的VasaCre-Tg小鼠(Cat#B6.FVB-Tg(Ddx4-cre)1Dcas/KnwJ)杂交。通过将Rank^fl/fl小鼠与携带Rosa26-tdtomato-等位基因的小鼠杂交来验证Cre表达。随后的目标是生成具有生殖细胞特异性和整体RANKL缺陷的小鼠。然而，显示出VasaCre；Rankl^fl/fl幼崽具有RANKL的整体缺失，而不仅仅是在生殖细胞中。众所周知，雌性Vasa-Cre小鼠的后代将在整体范围内具有活跃的Cre，这也发生在10-15％的从父亲继承Cre的幼崽中。Vasa-Cre等位基因的存在与具有loxP侧位的(floxed)RANKL等位基因的基因分型之间的干扰使基因分型变得复杂。当对携带Vasa-Cre等位基因的小鼠进行基因分型(引物1+2)时，Rankl等位基因仅显示存在野生型等位基因。通过应用能够系统地显示RANKL缺失的新引物组，可以生成预期的基因型，这使得能够控制育种。使用表1中列出的引物。当具有loxP侧位的等位基因被删除时，引物2的结合位点丢失，因此引物1+2在纯合子无效小鼠中不会产生条带。在删除neo选择盒之前，使用引物4来检测原始目标等位基因。最可能的解释是Vasa-Cre在雄性生殖细胞中是活跃的，并且受精卵中保留了足够的Cre活性，导致发育中的后代中的RANKL缺失。因此，可能无法检测到具有loxP侧位的等位基因，因为它已经重组，尽管这不能解释为什么看到野生型条带。使用额外的引物组和具有loxP侧位的RANKL引物1+3为缺失的等位基因产生280bp的条带。如果这出现在Vasa-Cre阳性小鼠的尾部DNA中，则表明发生了种系缺失。当对从Jackson获得的Vasa-Cre雄性幼崽使用引物1+2或引物1+3时，它们是RANKL^wt/wt与雌性Rankl^f1/fl交配的，结果如下：使用具有loxP侧位的RANKL的1+2引物，显示野生型等位基因在108bp处的预期条带和具有loxP侧位的等位基因在251bp处的条带，但仅显示108bp片段的Vasa-Cre阳性幼崽除外。引物组1+3如预期所示，除了VasaCre阳性幼崽中的280bp条带外，所有幼崽中均无条带，这证明了整体缺失。为了验证这种整体RANKL缺失，用野生型和证明这些小鼠中存在缺失等位基因的Rankl^f1/fl小鼠繁殖小鼠，因为具有loxP侧位的RANKL的1+2在与野生型小鼠繁殖时显示杂合子，而在与Rankl^f1/fl繁殖时仅显示251bp条带。值得注意的是，在2％的具有父系遗传的Vasa-Cre后代的育种中，没有整体缺失，而是成为生殖细胞特异性的。引物组1+3能够检测到这一点，因为它没有显示缺失，因此在280bp处没有条带。通过将小鼠与Rosa26-tdtomato-小鼠杂交来验证Vasa-Cre活性，并得到来自不同器官的qPCR和WB的进一步支持。

表1用于基因分型RANKLSertoli缺陷和整体缺陷小鼠的引物

基因	引物名称	引物序列5’-3’	SEQ ID NO:
				Rankl(Tnfsf11)	Rankl-flox 1	CTGGGAGCGCAGGTTAAATA	1
Rankl(Tnfsf11)	Rankl-flox 2	GCCAATAATTAAAATACTGCAGGAAA	2
				Rankl(Tnfsf11)	Rankl-flox 3	CTCAGCTTCCAGAGGACTGC	3
Rankl(Tnfsf11)	Rankl-flox 4	GTGGGCTCTATGGCTTCTGA	4
				Vasa	VasaCre-1	CACGTGCAGCCGTTTAAGCCGCGT	5
Vasa	VasaCre-4	TTCCCATTCTAAACAACACCCTGAA	6
				Amh	AMHcre-1	CCTGGAAAATGCTTCTGTCCG	7
Amh	AMHcre-4	CAGGGTGTTATAAGCAATCCC	8

结果

为了确定体内RANKL抑制的组织和细胞特异性功能，创建了RANKL缺陷小鼠。将Rankl^fl/fl小鼠与DEAD-Box解旋酶4(Vasa)；Cre Tg小鼠杂交。Vasa；Cre Tg小鼠通常用于产生生殖细胞特异性损失。然而，当等位基因是从母亲那里遗传的，或者当高龄雄性被用于繁殖时，Cre活性是整体的。通过将突变小鼠与WT小鼠回交来进行基因分型并进一步验证。这是通过将RANKL缺陷系与仅在Vasa；Cre阳性小鼠中显示整体表达和在Amh；Cre阳性小鼠中的Sertoli细胞特异性活性的(在具有loxP侧位的小鼠中没有活性)Rosa报告小鼠进行杂交完成的。表型特征，包括Vasa；Cre模型中的牙齿萌出缺失、泌乳不足和骨量增加与整体RANKL敲除模型的表型预期一致(Khosla，S.Minireview：OPG/RANKL/RANKsystem.Endocrinology142,5050-5055(2001))。没有Cre活性的同窝小鼠(Rankl^fl/fl小鼠)用作对照小鼠。在16-17周龄时评估生殖表型。

与Rankl^f1/fl小鼠相比，整体RANKL缺陷小鼠的卵巢重量(以克为单位)往往较低，但在统计学上不显著(图1)。

与Rankl^fl/fl小鼠相比，RANKL缺陷小鼠的子宫重量显著更高(增加40％)(图2)。在组织学上，与对照小鼠相比，RANKL缺陷模型的卵巢中发现的卵泡较少(数据未示出)。具有整体RANKL缺陷的小鼠的窝产仔数也较低，并且即使它们具有正常基因型，也有更多的幼崽在出生后早期死亡(图3和4)。

结论

本研究表明RANKL系统存在于小鼠的雌性生殖器官中。此外，与对照组相比，发现全面抑制RANKL的小鼠卵巢重量增加，卵巢中的卵泡减少。此外，全面缺乏RANKL的小鼠雌性生育潜力降低，胎儿围产期死亡的风险增加。此外，对子宫的影响可能部分是直接影响，但也可能是由刺激子宫生长的卵巢功能障碍继发的内分泌变化引起的。这些数据表明RANKL活性和信号对于女性生育潜力和成功怀孕很重要。此外，通过系统地使用RANKL的遗传抑制，提供了对RANKL作为女性生殖功能的可修改调控子的相关性的见解。

总之，RANKL可能是女性生育潜力的生物标志物，因为RANKL活性对女性生育潜力很重要。

此外，这些数据还表明，通过增加女性受试者的RANKL和/或RANKL活性，可以提高该女性受试者的生育潜力。认为这种改善可以在体内进行，也可以在辅助生殖技术(例如IVF)期间在体外进行。

实施例2–RANKL、RANK和OPG在人卵巢中的表达

研究目的

比较不同人体组织样本中RANKL、RANK和OPG的表达水平。

材料和方法

材料是在当地伦理委员会批准后根据赫尔辛基宣言从丹麦Rigshospitalet病理学系获得的。成人卵巢样本取自因怀疑患有卵巢癌而进行的标本，并丢弃具有浸润性癌的标本。非恶性组织用于这些研究。进行了组织固定和制备、RNA和cDNA制备以及随后的qRT-PCR和蛋白质印迹分析。对所有组织进行RANKL、OPG和RANK免疫组织化学染色。简而言之，根据标准的间接过氧化物酶方法进行免疫组织化学(IHC)染色。所有实验均采用不含一抗的阴性对照染色进行。连续切片和免疫荧光三重染色用于检查RANKL、RANK和OPG的伴随表达，如前所述(Jorgensen,A.等人，Nodal Signaling Regulates Germ Cell Development andEstablishment of Seminiferous Cords in the Human Fetal Testis.Cell Rep.25,1924-1937(2018))。抗体稀释液和回收缓冲液的详细描述见下表。

抗体稀释液、回收缓冲液和详细信息：

对于IHC，抗原修复是通过微波处理或将切片放入压力锅中指定的修复缓冲液中进行的。柠檬酸盐缓冲液：10mM，pH 6.0；TEG缓冲液：10mM Tris，0.5mM EGTA，pH 9.0。*对于精子抗体sc-9073的染色，使用了1:100的TEG缓冲液。缩写：IF，免疫荧光；IHC，免疫组织化学；P.C.，高压锅、WB，蛋白质印迹。

结果

本研究表明，RANKL系统存在于人类的女性生殖器官中。

通过RT PCR对不同类型的女性人体组织样本进行的分析表明，人类卵巢中存在RANKL、RANK、OPG和下游信号NFKB、RELa和RELb的表达(图5和6)。这得到了RANKL、RANK和OPG蛋白表达的支持，这些蛋白在卵巢内衬的上皮细胞、颗粒细胞和卵母细胞周围的卵丘细胞中强烈表达(数据未示出)。

结论

在此，表明RANKL/RANK/OPG信号系统以及RANKL、RANK和OPG都在人类卵巢中表达，表明女性生殖功能的调节作用尚未得到认可。

实施例3–RANKL和OPG与女性生殖结果的关联

研究目的

测量人类女性卵母细胞周围血清和卵泡液中的RANKL和OPG，并将RANKL和OPG浓度与人类女性在自发或辅助生殖技术中的生殖结果相关联。

材料和方法

研究中的参与者是在丹麦生育诊所接受IUI、IVF或ICSI的不孕夫妇。夫妻双方均应年满18周岁，女性应在43周岁以下。使用供体授精的妇女也包括在内。

该研究是一项前瞻性、盲法、单中心队列研究。由于调查人员没有关于临床数据和治疗失败/成功的信息，所有样本的调查都将采用盲法。对所有参与者进行随访直至接受治疗后9个月，以评估活产、流产和畸形、妊娠期间或新生儿的疾病。

在被邀请参加研究之前，所有患者都将完成初次就诊和调查。

生化分析

使用Biomedica,Austria两种不同的ELISA测量血清和卵泡液中的RANKL和OPG。睾酮和雌二醇通过来自Coat-a-count的Access RIA，Siemens CV 6％和来自Pantex,SantaMonica,USA来测量，CV为13％。使用Immunotech,Beckman Coulter,USA，CV为11％的酶免疫测定法测量AMH，最后使用化学发光免疫测定法(Access，Beckman Coulter,USA)测量SHBG，CV为8％。

统计数据

所有数值变量的高斯分布均通过直方图中的分布和残差图进行评估，以确保执行回归模型的有效性。结果，当在线性回归中用作依赖时，卵泡OPG和卵泡RANKL通过自然对数转换，而血清RANKL未转换。以线性回归分析所有卵泡激素和血清激素。使用Mann-WhitneyU对未转换的数据比较各组的荷尔蒙水平。使用配对T检验分析来自同一位女性的配对数据。

将测得低于检测限的卵泡激素和血清激素在数值变量中设置为(LOD*0.5)。

当同时分析同一位女性的卵泡液和血清时，排除在抽吸当天之后和抽吸前16天以上获得的血清样本，因此排除了6个血清样本。

使用IBM PASW SPSS 25版进行统计分析，并在GraphPad prism7.02版中制作图表和插图。

该研究共包括289名女性。139名女性只进行了一轮ART，其余女性进行了两到六次试验。

总共进行了544次ART试验，其中341轮IUI、88轮IVF和115轮ICSI。

获得了54例妊娠(通过尿液和/或血清hCG的增加来评估)，其中46例在妊娠第7周显示心跳(通过超声评估)，最终37名健康儿童出生(一对双胞胎)。两名婴儿分别在孕周35+5和36+4轻度早产。从117名不同女性的176次抽吸中收集了卵泡液，并测量了165样本中的RANKL和172样本中的OPG。收集了来自74名不同女性的88份血清样本，并测量了78份样本中的RANKL。

在收集卵泡液的177名女性中，有20名女性总体上和生殖健康，只有男性精液质量下降，其余157名女性患有各种不同的妇科疾病，其中不孕症不明，最常见的是无排卵、PCOS和子宫内膜异位症。五名女性承认吸烟，参见基线表以了解更多特征。

Women女性follicularfluid卵泡液serum血清age年龄

Estradiol雌二醇testosterone睾酮mean平均值range范围

结果

血清和卵泡液中的RANKL和OPG

RANKL和OPG在卵泡液中是可测量的，RANKL在血清中也是可测量的。10名女性的卵泡RANKL水平低于检测限，而所有血清RANKL水平均高于检测限。在同一位女性的两个不同IVF/ICSI周期中重复测量时，卵泡RANKL和OPG均稳定(图7A和7B)。卵泡和血清RANKL不相关(图7C)。卵泡RANKL与卵泡OPG呈负相关(b-0.004，p＝1.0x10^-9，图8A)并与AMH显著相关(b0.008，p＝2x10^-6，图8B)，但与其他激素无关。OPG与AMH呈负相关(b-0.005，2.1x10^-4，图8C)，但与其他激素无关。血清RANKL与卵泡RANKL或卵泡OPG无关。然而，血清RANKL与卵泡SHBG负相关(b-0.005，p＝0.042，图8D)，与血清SHBG负相关(b-0.001，p＝0.001，图8E)并与血清雌二醇负相关(b-1.6x10^-5，p＝0.003，图8F)。

RANKL、OPG和临床结果

卵泡RANKL进一步与女性年龄呈负相关(b-0.13，p＝2.6x10^-4，图9A-B)，其中卵泡OPG与年龄呈正相关(b 0.084，p＝0.002，图9C-D)。RANKL和OPG都与BMI无关，但是只有116名女性的BMI信息。

与卵泡RANKL一样，血清RANKL也与年龄呈负相关(b-0.010，p＝0.046，图9E-F)。

在激素刺激之前，女性自然成熟的卵泡数量与卵泡RANKL显著相关(b 16.6，p＝2x10^-6，图10A-B)并与卵泡OPG负相关(b-0.015，p＝0.002，图10C-D)，但与血清RANKL无关。

将诊断为不孕症的女性与那些妇科健康但配偶不育的女性进行比较，表明健康女性的卵泡RANKL水平显著更高(p＝0.008，Man-Whitney U)，但卵泡OPG水平和剩余卵泡激素和血清激素水平相当(图11A-B)。

在导致活产的ICSI和IVF后获得的临床妊娠显示，与那些怀孕但有早期自然流产的妇女相比，分娩的妇女具有临界显著更高的血清RANKL(p＝0.054Man-Whitney U，图12A)。这表明高RANKL与成功的妊娠结局相关，而不仅仅是妊娠。此外，在IVF或ICSI后怀孕并进展到第七周且胎儿心跳呈阳性的女性，经超声检查证实，其血清RANKL显著高于那些怀孕但未进展到第七周的女性(p＝0.012Man-Whitney U，图12B)。卵泡以及RANKL、OPG和所有其他激素的血清水平在这些女性群体之间没有差异。

与卵泡激素相关的儿童评估结果(出生体重、出生身长和胎龄)显示与RANKL或OPG无关。然而，确实发现卵泡SHBG与出生体重(b-6.5，p＝0.001，图13A)和出生身长(b-0.035，p＝3.1x10-4，图13B)之间存在强烈的负相关。ICSI/IVF中使用的方案类型不会改变sRANKL或OPG的血清水平或卵泡水平。

结论

RANKL在女性生殖道和卵泡中局部产生，高RANKL与更高数量的卵泡和血清AMH定义的生育力增加相关。低卵泡水平的RANKL与生殖问题和不孕有关，而在患有多囊卵巢综合征的女性中发现了非常高的RANKL。

能够测量接受ART的女性卵泡液中的RANKL和OPG。从一个抽吸周期到下一个抽吸周期，RANKL和OPG都显示出随时间稳定。RANKL的血清和卵泡水平在同一范围内，但卵泡RANKL总体上低于血清水平，它达到了更高的最大值，并且在少数女性中也低于检测限。sRANKL的血清水平略高于其他队列(Sarink等人，Cancer Epidemiol BiomarkersPrev.2019Oct；28(10):1746-1754)，这可以用当前队列中较年轻的年龄来解释。

卵泡液中的OPG水平大约是女性血清OPG水平的25倍)。

尽管sRANKL的血清和卵泡水平在同一范围内，但发现两者之间没有相关性，这表明卵泡液中的sRANKL水平受到局部且严格的调节，而不仅仅是血清水平的反映。

发现该女性的年龄与她的血清和卵泡RANKL水平呈反比关系。卵泡OPG水平随着年龄的增长而增加，反映了其他人报告的女性血清OPG的发现(Sarkink等人，CancerEpidemiol Biomarkers Prev.2019Oct；28(10):1746-1754)。我们没有找到链接sRANKL的血清和/或卵泡水平与BMI之间的关系。我们发现女性自然成熟的卵泡数量与其卵泡RANKL水平之间存在有趣的联系。我们进一步示出了卵泡sRANKL和卵泡AMH之间的线性关系。AMH由卵巢腔前卵泡和小腔卵泡中的颗粒细胞产生，因此反映了成熟卵泡的数量。

此外，我们发现生殖健康女性的卵泡sRANKL水平高于不育女性，但所有其他卵泡激素和血清激素(包括AMH)的水平相当。这可能表明卵泡sRANKL水平是更敏感的生殖健康标志物。

如果在受孕时全身血清RANKL水平较高，在IVF/ICSI期间怀孕的女性实际上确实有更好的机会在第7周将孩子带到视觉心跳并进一步分娩，而不会自然流产。如实施例1中所述，小鼠中RANKL表达受损导致基质细胞功能障碍和胎儿丢失。因此，低RANKL活性可能与流产风险增加有关。这表明在ART之前和期间刺激RANKL的产生可能会提高自然怀孕的机会。

局部与全身RANKL水平似乎在女性生殖周期的不同时间点发挥作用。

实施例4-小鼠体内研究-PTH

研究目的

根据本发明，为了在小鼠体内测定以PTH为例的RANKL诱导剂对雌性生育力的影响。

材料和方法

研究设计：

将十二(12)只雌性C57BL/6小鼠分配到两个治疗组(n＝6，n＝6)并根据表1给予测试物品。在研究第7天，每个治疗组的所有雌性+3只雄性C57BL/6小鼠将分配到生育力研究。在生育力研究中，2只雌性将与1只雄性成对饲养5天。在这5天中，每天至少一次观察所有雌性是否有阴道塞。在生育力研究期间(第7至11天)，将根据表1继续给予测试物品。将记录每只雌性是否存在阴道塞、明显怀孕和产仔数。生育力研究结束时将处死雌性和同窝幼崽，并测定幼崽的体重。

剂量溶液的给药：

测试物品腹腔注射(i.p.)(第1组)或介载体i.p.(第2组)给药，每周进行2次，为期12天。

Gr.1：6只小鼠，i.p.每周给药2次，持续12天

Gr.2：6只小鼠，i.p.每周给药2次，持续12天

表1：给药

Gr.No.	Mice(n)	测试物品1(ID)	剂量	途径，剂量/周
					1	6	PTH	5μg/kg	i.p.,5
2	66	介载体	n.a.	i.p.,2

采血：

将在研究第12天从研究中的所有雌性小鼠身上采集一份血样。将通过舌下静脉穿刺抽取血样。

终止：

来自生育力研究的雌性小鼠将在名义上的研究第12天终止。十二(12)只小鼠在生下幼崽后将被安乐死。

结果

健康小鼠注射OPG：

短期PTH治疗对卵巢重量有很小但显著的影响，表明对卵巢功能有影响p<0.05)(数据未示出)。此外，与介载体处理的小鼠相比，PTH增加了妊娠率(图14A)、幼崽数量(图14B)和每只雌性幼崽的数量(图14C)。

此外，与未怀孕的女性相比，在IVF后通过超声验证怀孕的女性卵泡液中的卵泡液1,25D3水平(另一种RANKL刺激剂)更高(图17)。

结论

通过注射充分表征的RANKL诱导剂PTH对RANKL信号通路的短操作对于正常小鼠的生育潜力产生了有益影响。与介载体相比，PTH治疗使妊娠率增加一倍，幼崽数量和每只雌性暴露的幼崽数量增加，这表明PTH在繁殖前和繁殖过程中诱导RANKL有利于活产率。由于PTH治疗并不局限于生殖组织，因此理论上可以在许多组织中发挥作用。然而，卵巢重量的显著变化表明部分影响是直接在卵巢中介导的。

上述数据得到了研究的支持，该研究表明，与未怀孕的女性相比，在IVF后通过超声验证怀孕的女性卵泡液中的卵泡液1,25D3水平(另一种RANKL刺激剂)更高。

实施例5-小鼠体内研究-OPG

研究目的

根据本发明，为了在小鼠体内确定以OPG为例的全身性RANKL抑制剂对雌性生育力的影响。

材料和方法

研究设计：

二十八(28)只雌性C57BL/6小鼠将被分配到2个治疗组(n＝12，n＝16)并根据表1给予测试物品。在研究第7天，每个治疗组的6只雌性+6只雄性C57BL/6小鼠将被分配到生育力研究中。在生育力研究中，2只雌性小鼠与1只雄性小鼠成对饲养5天。在这5天中，每天至少一次观察所有雌性是否有阴道塞。在生育力研究期间(第7至11天)，将根据表1继续给予测试物品。将记录每只雌性是否存在阴道塞、明显怀孕和产仔数。生育力研究结束时将处死雌性和同窝幼崽，并测定幼崽的体重。未参加生育力研究的剩余雌性小鼠(n＝6和10)将按照表2中的指示给药并在第12天终止。在第12天终止时，将分离来自所有未交配雌性的组织并称重(卵巢(x2)、输卵管(x2)、子宫、肾脏(x2)、胫骨(x2))。除了组织样本外，还将提供研究中所有雌性小鼠的血清样本(也是第12天)。

剂量溶液的给药：

Gr.1：

12只小鼠，i.p.每周给药2次，持续7天

1a：6只小鼠，i.p.每周给药2次，持续5天

1b：6只小鼠，i.p.每周给药2次，持续5天，生育臂

Gr.2：

12只小鼠，i.p.每周给药2次，持续7天

2a：10只小鼠，i.p.每周给药2次，持续5天

2b：6只小鼠，i.p.每周给药2次，持续5天，生育臂

表2：给药

Gr.No.	小鼠(n)	测试物品1(ID)	剂量	途径，剂量/周
					1	12	OPG(cyt-177-c)	1mg/kg	i.p.,2
2	16	介载体	n.a.	i.p.,2

采血：

组织取样和组织保存：

未参加生育力研究的雌性将在第12天被安乐死。将从每只小鼠中自由解剖以下组织并称重：卵巢(x2)、输卵管(x2)、子宫、肾脏(x2)、胫骨(x2)。适用于卵巢、输卵管和肾脏：每只小鼠冷冻保存一个，福尔马林固定保存一个。

终止：

来自非交配研究组的雌性小鼠和来自生育力研究的12只雄性小鼠将在名义上的研究第12天处死。十二(12)只小鼠将在产仔后被安乐死，且不迟于研究第42天。幼崽将在出生后称重并安乐死。

结果

健康小鼠注射OPG：

短期OPG治疗对器官大小没有影响(数据未示出)，但增加了妊娠率(图15A)、幼崽总数(图15B)和窝产仔数(图15C)且没有卵巢问题，这种影响可能是通过输卵管和子宫介导的，在那里RANKL抑制可能导致幼崽植入率增加和存活率提高，如产仔数更高所示。OPG治疗小鼠的血清AMH水平没有统计学显著影响，但有趋势表明RANKL是卵泡成熟的强大调节剂。

结论

知晓了OPG不会进入卵泡液并在那里发挥作用，因为卵泡液中的OPG水平比血清高>100倍并且不受OPG的影响(图16)。然而，OPG会阻断包括子宫在内的所有性腺外组织中的RANKL。

RANKL抑制剂OPG对所有组织中RANKL通路的短期操作对于器官重量没有影响，但会增加怀孕、幼崽数量和产仔数以及血清AMH增加的趋势，这支持了卵泡外的RANKL抑制可能会改善女性生殖功能并增加活产的可能性。对活产的影响很可能是由于对子宫内植入和存活的影响。

SEQUENCE LISTING

<110> 里格舒斯匹塔里特医院

<120> 预测女性受试者生育潜力的方法

<130> 1689-057.23P8

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 1

ctgggagcgc aggttaaata 20

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 2

gccaataatt aaaatactgc aggaaa 26

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 3

ctcagcttcc agaggactgc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 4

gtgggctcta tggcttctga 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 5

cacgtgcagc cgtttaagcc gcgt 24

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 6

ttcccattct aaacaacacc ctgaa 25

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 7

cctggaaaat gcttctgtcc g 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 8

cagggtgtta taagcaatcc c 21

Claims

1.一种预测女性受试者的生育潜力的方法，所述方法包括

·将所述水平与一个或多个相应参考水平进行比较；和

·在以下情况下预测所述受试者不太可能具有正常的生育潜力：

o所述RANKL水平低于所述相应参考水平；和/或

o所述OPG高于所述相应参考水平；

或者

·在以下情况下预测所述受试者可能具有正常的生育潜力：

o所述RANKL水平等于或高于所述相应参考水平；和/或

o所述OPG水平等于或低于所述相应参考水平。

2.根据权利要求1所述的方法，其中测定RANKL的水平，优选可溶性RANKL(sRANKL)的水平。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述水平是蛋白质水平，例如RANKL的蛋白质水平，例如可溶性RANKL。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中测定卵泡液中的RANKL和/或OPG水平。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一个或多个参考水平选自由以下组成的组：

-范围1-6pmol/l的血清OPG，例如范围2-5pmol/l，或例如范围3-4pmol/l的血清OPG；

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述女性生育潜力包括选自由卵巢功能、卵巢卵泡数、成熟卵泡数、成熟卵泡的能力、女性活产的能力，流产风险降低，子宫内膜和子宫功能正常组成的一项或多项指标。

7.RANKL和/或OPG作为女性受试者生育潜力的预测标志物的应用。

8.一种监测女性受试者生育潜力发展的方法，所述方法包括：

·测定来自女性受试者的第二样本中的第二个水平的RANKL和/或OPG，其中第二样本是在比第一样本晚的时间点获得的；

·比较第一和第二样本中的相应水平；

其中

o与第一样本相比，第二样本中的RANKL水平较低，表明生育潜力下降；和/或

o第一和第二样本中RANKL和/或OPG水平相同，表明生育潜力没有变化；和

o与第一样本相比，第二样本中的RANKL水平更高，表明生育潜力提高；和/或

o与第一样本相比，第二样本中的OPG水平较低，表明生育潜力提高。

9.根据权利要求8所述的方法，其中至少测定第一和第二样本中的RANKL水平。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中第一和第二样本是卵泡液和/或血清。

11.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其中在第一和第二样本的取样之间进行了用于提高女性受试者的女性生育潜力的治疗。

12.根据权利要求12所述的方法，其中提高女性生育潜力的治疗选自由包括激素过度刺激与促性腺激素、hCG和辅助生殖技术如IVF、ICSI和授精的组合组成的组。

13.根据权利要求12所述的方法，其中用于提高女性生育潜力的治疗是根据权利要求16-25中任一项使用的化合物。

14.根据权利要求12所述的方法，其中提高女性生育潜力的治疗是改变生活方式，例如改变饮食，例如摄入维生素和矿物质、锻炼、减轻体重、戒烟或减少吸烟或其组合。

15.一种化合物的用途，用于治疗和/或改善和/或预防哺乳动物的雌性不孕症和/或用于提高雌性生育潜力；

其中所述化合物是

-RANKL表达的刺激剂，例如PTH；

-骨保护素(OPG)的拮抗剂或抑制剂；

-RANKL；和/或

-RANKL抑制剂，例如OPG。

16.根据权利要求16所述的化合物的用途，其中所述化合物是卵巢RANKL表达的刺激剂。

17.根据权利要求16或17所述的化合物的用途，其中所述化合物选自PTH、PTHRP、维生素D、25OHD、1.25OH2D3、24,25OH2D3、Etalpha、IL-1、TNF、FSH、LH及其组合，优选化合物是PTH。

18.根据权利要求16或17的化合物的用途，其中所述化合物是PTH。

19.根据权利要求16所述的化合物的用途，其中所述化合物是RANKL的激动剂或诱导剂/激活剂，例如RANKL与RANK结合的诱导剂/激活剂。

20.根据权利要求16或20所述的化合物的用途，其中所述化合物是LH/hCG或FSH。

21.根据权利要求16所述的化合物的用途，其中所述化合物是骨保护素(OPG)的拮抗剂或抑制剂，例如抑制OPG与RANKL结合的抗体或包含RANKL上OPG结合位点的肽。

22.根据权利要求16所述的化合物的用途，其中所述化合物选自多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体、单链抗体、双特异性抗体、纳米抗体、其中重链和轻链通过柔性接头连接的抗体、Fv分子、抗原结合片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂分子、全人抗体、人源化抗体和嵌合抗体或其片段或衍生物。

23.根据权利要求16所述的化合物的用途，其为RANKL。

24.根据权利要求16所述的化合物的用途，其是RANKL抑制剂的抑制剂，例如抑制RANK与RANKL结合的抑制剂。

25.根据权利要求16或25所述的化合物的用途，其中所述化合物选自由地诺单抗、Cyt-177-c(OPG-FC)、OPG、AS2676293、ABD328、ABD345、SPD-304和E09241及其活性片段和类似物组成的组。

26.根据权利要求16所述的化合物的用途，其中所述化合物以选自以下的剂量给药：

-1-200微克(mcg)PTH每日剂量，例如2-100mcg，例如5-80mcg，例如10-50mcg，例如15-30mcg，或例如大约20微克(mcg)PTH每日剂量，优选每日一次；

-500-50000IU维生素D每日剂量，例如1000-10000IU，例如2000-8000IU，例如4000-6000IU或例如约5000IU维生素D每日剂量；和

-0.25-1.5mcg Etalpha每日剂量，优选每日一次。

27.根据权利要求16-27中任一项所述的化合物的用途，其中所述化合物通过宫内注射直接施用到卵巢或阴道内的卵泡液中。

28.根据权利要求16-28中任一项所述的化合物的用途，其中所述化合物用于治疗和/或改善卵母细胞植入子宫。

29.根据权利要求16-28中任一项所述的化合物的用途，其中所述化合物用于健康女性。

30.根据权利要求16-28中任一项所述的化合物的用途，其中所述化合物用于不育女性受试者。

31.根据权利要求16所述的化合物的用途，其中所述化合物用于治疗多囊卵巢综合征，优选地，其中所述化合物是RANKL抑制剂，例如抑制RANK与RANKL结合的抑制剂。

32.根据权利要求16所述的化合物的用途，其中所述化合物用于患有多次流产和/或例如由于植入受损或早期流产导致的未怀孕和/或多囊卵巢综合征和/或子宫内膜异位症；

其中所述化合物是RANKL的抑制剂。

33.根据权利要求16所述的化合物的用途，其中所述女性患有原发性卵巢衰竭；和/或绝经前的高龄，和/或低AMH水平，

其中所述化合物是RANKL刺激剂，例如PTH。

34.一种用于测定卵子成功受精和/或导致成功怀孕(分娩)机会的体外方法，所述方法包括

·在体外测定包含至少一个未受精卵，优选仅一个卵子的样本中的RANKL和/或OPG水平；

·将所述水平与一个或多个相应参考水平进行比较；和

o所述RANKL水平低于所述相应参考水平；和/或

o所述OPG高于所述相应参考水平；

或者

·在以下情况下预测所述一个或多个卵可能成功受精和/或在受精后导致成功怀孕：

o所述RANKL水平等于或高于所述相应参考水平；和/或

o所述OPG水平等于或低于所述相应参考水平。

35.根据权利要求35所述的方法，其中所述卵子预期通过辅助生殖技术(ART)受精，例如选自由体外受精(IVF)和胞浆内单精子注射(ICSI)组成的组。

36.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述样本取自含有一个或多个卵子的培养基。

37.一种改善卵子成功受精和/或导致成功怀孕的变化的体外方法，所述方法包括离体向未受精卵施用根据权利要求16的化合物。

38.根据权利要求38所述的体外方法，其中预期/准备通过辅助生殖技术(ART)使所述卵子受精，例如选自由体外受精(IVF)和胞浆内单精子注射(ICSI)组成的组。

39.根据权利要求38或39所述的体外方法，其中将所述化合物施用至或包含在容纳卵子的培养基中。