CN116814646A - GmSAUR蛋白在控制植物光周期中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种GmSAUR蛋白在控制植物光周期中的应用，属于植物育种技术领域。为了提供一种植物提前开花的育种方法。本发明提供GmSAUR蛋白在控制植物光周期中的应用，所述GmSAUR蛋白的序列如SEQ ID NO.5所示。向大豆品种东农50中导入重组质粒pB7WG2‑GmSAUR，经筛选得到T2代转GmSAUR基因大豆的阳性植株。与大豆品种东农50相比，T2代转GmSAUR基因大豆在长、短日照条件下植株提前开花。蛋白质GmSAUR在调控植物开花时间和光周期中具有重要的理论意义和实用价值，具有广阔的农业应用前景及巨大的生态效益。
Description
技术领域
本发明属于植物育种技术领域，具体涉及GmSAUR蛋白在控制植物光周期中的应用。
背景技术
大豆是典型的短日照作物(short day plant，SDP)，对光周期反应非常敏感，这一特性降低了大豆品种的适应性，从而限制大豆的种植范围。大豆的开花时间和成熟期是重要的农艺性状，控制着大豆的产量、品质和适应性，开花又是一个极其复杂的过程，大豆通过响应多种内源激素和环境信号从营养生长转变为生殖生长。而大豆生育期性状的改良一直是研究的热点问题，早熟是对大豆育种的普遍要求。利用分子生物技术，了解与大豆开花和成熟相关基因的调控模式，进而调节大豆的开花时间，这对提高大豆产量和品质以及培育适应不同纬度的大豆品种奠定基础。因此，对光周期调控大豆开花途径的研究及挖掘控制大豆开花与成熟的光周期新基因尤为重要，培育早熟的大豆新品种，使大豆向高纬度地区的推进具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种植物提前开花的育种方法。
本发明提供一种GmSAUR蛋白在控制植物光周期中的应用，所述GmSAUR蛋白的序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明提供一种编码GmSAUR蛋白的基因在控制植物光周期中的应用。
进一步地限定，所述基因的序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
本发明提供一种含有上述的基因的重组载体在控制植物光周期中的应用。
本发明提供一种含有上述的基因的重组微生物细胞在控制植物光周期中的应用。
进一步地限定，所述控制光周期为提前开花。
进一步地限定，所述植物为双子叶或单子叶植物。
进一步地限定，所述植物为大豆。
本发明提供一种育种提前开花大豆的方法，所述方法的具体步骤如下：
(1)扩增SEQ ID NO.4所示的基因序列，将基因序列插入到表达载体；
(2)将步骤(1)获得的载体导入到农杆菌中，利用农杆菌转入到大豆中得到转基因大豆；
(3)鉴定步骤(2)获得的转基因大豆得到阳性转基因大豆。
进一步地限定，在步骤(1)中，扩增SEQ ID NO.4所示的基因序列的引物序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
有益效果：向大豆品种东农50中导入重组质粒pB7WG2-GmSAUR，经筛选得到T2代转GmSAUR基因大豆的阳性植株。与大豆品种东农50相比，T2代转GmSAUR基因大豆在长、短日照下植株均提前开花。由此可见，蛋白质GmSAUR在调控植物开花时间和光周期中具有重要的理论意义和实用价值，具有广阔的农业应用前景及巨大的生态效益。
附图说明
图1为重组质粒pB7WG2-GmSAUR的构建图谱。
图2为GmSAUR基因全长的克隆，其中，M是D2000 DNAmarker，1、2均为GmSAUR基因全长。
图3为重组质粒pB7WG2 GmSAUR的大肠杆菌菌液PCR鉴定，D2000 DNA marker，1 6是pB7WG2 GmSAUR阳性转化子，7是阳性对照，9是阴性对照。
图4为重组质粒pB7WG2 GmSAUR的农杆菌菌液PCR鉴定，D2000 DNAmarker，1 8是pB7WG2 GmSAUR阳性转化子，9是阳性对照，10是阴性对照。
图5采用免疫胶体金试纸条检测T2代转GmSAUR基因大豆的检测结果，其中，WT是大豆品种东农50，GmSAUR ox-1、GmSAUR-ox-2、GmSAUR-ox-7为T2代转GmSAUR基因大豆。
图6为草铵膦涂抹鉴定T2代转GmSAUR基因大豆。
图7为T2代转GmSAUR基因大豆的分子鉴定。
图8为长日照条件下植株表型比较。
图9为长日照条件下花序比较。
图10为短日照条件下植株表型比较。
图11为短日照条件下花序比较。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
大豆品种东农42记载于如下文献中：陈立君.不同播期对大豆东农42产质量性状动态变化规律研究[J].中国农学通报，2009，25(03):122-127。在下文中，大豆品种东农42简称为东农42。大豆品种东农50记载于如下文献中：Yu JIN，Juanjuan QU，Guangming REN，Lei DONG.Effects of Transgenic DREB Soybean Dongnong50 on the DiversityofSoil Ammonia-oxidizing Bacteria[J].Agricultural Science&Technology.2013，14(7):988-992.在下文中，大豆品种东农50简称为东农50。
根癌农杆菌LBA4404记载于如下文献中：陈中健，刘兵，王宏斌，王金发，刘良.水稻重复序列RRD3缺失体介导gusA在水稻愈伤组织中的表达[J].热带亚热带植物学报，2003(02):127-131.
pENTRY-FLAG载体相关信息：Yang X,Li X,Shan J,Li Y,Zhang Y,Wang Y,Li W,Zhao L.Overexpression of GmGAMYB Accelerates the Transition to Flowering andIncreases Plant Height in Soybean.Front Plant Sci.2021May 10；12:667242.
pB7WG2载体为invitrogen公司的产品。
实施例1.含GmSAUR基因的载体构建
1、蛋白质GmSAUR的全长编码基因(GmSAUR基因)的克隆
(1)采用CTAB法提取生长30天的东农42幼苗的叶片的DNA。
(2)以步骤1获得的东农42的DNA为模板，采用5’-TGGAGCTCGGTACCCCCAAATGTCTTCACTAATCTAT-3’(序列如SEQ ID NO.1所示)和5’-GATCCTGGGATCCCCGACAGCTCATTCAAGTGAGCGGTA-3’(序列如SEQ ID NO.2所示)组成的引物对进行PCR扩增，得到约1563bp的双链DNA分子。
PCR反应程序为：98℃，2min，98℃，10sec，55℃，15sec，72℃，1min，38个循环；72℃5min。
将步骤2得到的双链DNA分子进行测序。测序结果表明，步骤2得到的双链DNA分子(GmSAUR基因)的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
2、重组质粒(no 35s)pB7WG2-GmSAUR的构建
重组质粒(no 35s)pB7WG2-GmSAUR的构建过程图谱见图1。
(1)按步骤1方法提取东农42幼苗的叶片的DNA，进行PCR扩增，回收约1563bp的DNA片段如图2(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)。
SEQ ID NO.4：ccaaatgtct tcactaatct atgttagtct cctacagtgt gagatttattgtcaattcaa gcaacatgtt atacgttgga agacctcttc actgcaagga attgtgaggc cacccatgggatgatcatat ccaaactctt cctccgcttg attcaacaag tcctggaatg aaggttggtt catgtatgatacgggaatca caaaccgctt cattttctcc ccgacataga ctgcaagata gccttttggc gcatccaccgcatttgatgc ctttctgata ccaggtaaac gaaaacccat tgttgtattg atttgagaag agaatttcttaagaaaagtg ttgagaattt tgaatgcttt gggatgtgaa tgatttgtgt tggtgctaaa tgcttgctgccatgaatata tatatagaaa agcatatgta agaaaacatc ggctgtatga attaatggtg aaggagagctacgagataag ataaatggga ccaacttaga gacaagggca tatggtgctg tcttgaggac tttcccaagaattaagataa tactatccca gcttatcgag tgaaggctaa cagatttccc caacatttta gaaaccacatacgaagaaaa aaaaatcaaa gtggatcatg ttgacaatta ctaattaaag ggggcagaga caataaacttaatgcgtgga aataaattgt aggctgctgt cggtgagaat atttcgtaca taaaaaatgt ggttcatagtactttatgat catgtattca gtattggttt tcttcttact tccaaaaact tattcagagc tgtcaatctggtcggcttaa ggtttactgg ttgctatcgg tcacatggta gatatattta tcaaaataat tgtcagcttacaatgatttg aagaagcatg tgagatgtct taagcatatc caccattgga ttagccatac cacgatgcctgaacaaacat taggttgtca ggtgggtaat ttggtggcca ctaactcaga aggtgaggta cgtatgcactcctattgaac ttcctattcc ttgaaagaga cctctgagac aataccatgt gatcctttct ccctcagtagaccccatcat ggcccactgt gcagttggat tgcagaggtc ctagacatta tatatacaca atttctagggtttccaagca acacaagtca tcccattcct gaagtatcag aactcaaaaa tttcttccgc atacgacttctttgatatca gtataatact tgttgtgtgg agcaacagaa aataatgggt tttcgcatag caggtattgttaggcggact tcgttttata caacccaagc agcctccaag agggttgacg taccaaaagg ctatgctgcagtctatgttg gagataagat gagacggttc acaattccag tatcatactt gaacgaacct tcatttcaagaattactcag tcaagcagaa gaagaattcg gatacgatca tccaatgggt ggtcttacaa taccatgcaaagaagaggag ttcctaaacg ttaccgctca cttgaatgag ctg；
(2)将回收的DNA片段重组到经Sma I限制性内切酶酶切后的线性pENTRY-FLAG载体(invitrogen公司的产品)进行In-Fusion无缝连接反应，得到重组质粒pENTRY-FLAG-GmSAUR。
(3)完成步骤(2)后，将重组质粒pENTRY-FLAG-GmSAUR和去35s启动子的pB7WG2载体进行LR反应，反应如表1所示，导入大肠杆菌DH5α中，得到(no 35s)pB7WG2-GmSAUR重组阳性转化子见图3。
表1LR反应体系
| 反应体系 | 体积(μL) |
| 含有目的片段的质粒(100-150ng) | 1μL |
| 目的载体(20-50ng) | 1μL |
| LR clonaseTM enzyme | 1μL |
| TE butter，pH 8.0 | 3μL |
将重组质粒(no 35s)pB7WG2-GmSAUR进行测序。测序结果表明，重组质粒(no35s)pB7WG2-GmSAUR中含有序列表中SEQ ID NO.4所示的DNA分子。SEQ ID NO.3是GmSAUR的编码区，SEQ ID NO.4是编码区加上启动子得到的整个基因。
SEQ ID NO.3:
atgggttttc gcatagcagg tattgttagg cggacttcgt tttatacaac ccaagcagcctccaagaggg ttgacgtacc aaaaggctat gctgcagtct atgttggaga taagatgaga cggttcacaattccagtatc atacttgaac gaaccttcat ttcaagaatt actcagtcaa gcagaagaag aattcggatacgatcatcca atgggtggtc ttacaatacc atgcaaagaa gaggagttcc taaacgttac cgctcacttgaatgagctg。
实施例2.转GmSAUR基因大豆的获得及鉴定
1、将实施例1获得的重组质粒(no 35s)pB7WG2-GmSAUR导入根癌农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌，命名为LBA4404/(no 35s)pB7WG2-GmSAUR见图4。
2、T0代转GmSAUR基因大豆的获得
采用农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化法(记载于如下文献中Olhoft P M，Donovan CM，Somers D A.Soybean(Glycine max)transformation using maturecotyledonary node explants[J].Methodsin Molecular Biology，2006，343(12)：385)，将步骤1获得的LBA4404/(no35s)pB7WG2-GmSAUR转至大豆品种东农50中，获得T0代转GmSAUR基因大豆。具体步骤如下：
(1)取大豆品种东农50的种子，先用氯气灭菌16h，然后无菌水浸泡12h，得到吸涨的大豆。
(2)完成步骤(1)后，取吸涨的大豆，去皮，将2个子叶分开，用刀片在子叶节附近轻划出伤口，然后将其放入农杆菌重悬液中侵染30min。
农杆菌重悬液的制备方法如下：取步骤二获得的重组农杆菌的单克隆，加入20mLYEP液体培养基，28℃、200rpm震荡培养，得到OD600nm值为0.5左右的菌液1；将菌液1接种至200mL YEP液体培养基，28℃、200rpm震荡培养，得到OD600nm值为1.6-2.0的菌液2；取菌液2，室温、5000rpm离心10min，收集沉淀；取沉淀，用液体浸染培养基重悬，得到OD600nm值为0.8的农杆菌重悬液。
液体浸染培养基的溶质及其浓度为0.321g/L B5培养基(Gamborg B-5BasalMedium)，30g/L蔗糖，3.9g/L MES，1.67mg/L 6-BA，0.25mg/L GA3和0.04g/L AS；溶剂为水；pH值为5.4。
(3)完成步骤(2)后，取大豆子叶，先用滤纸吸干重悬液，然后置于固体共培养培养基，25℃光照培养5天，光照培养时为白光，光照强度为250μmol m-2s-1。
固体共培养培养基的溶质及其浓度为0.321g/L B5培养基，30g/L蔗糖，3.9g/LMES，1.67mg/L 6-BA，0.25mg/L GA3，0.04g/L AS，0.4g/L L-Cys，0.15g/L DTT，0.5％(w/v)琼脂粉；溶剂为水；pH值为5.4。
(4)完成步骤(3)后，将大豆子叶转移至丛生芽诱导培养基，25℃、光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)28天。
丛生芽诱导培养基的溶质及其浓度为0.321g/L B5培养基，30g/L蔗糖，0.59g/LMES，1.67mg/L 6-BA，200mg/L Cef，200mg/L Tim，5mg/L草铵膦和0.75％(w/v)琼脂粉；溶剂为水；pH值为5.4。
(5)完成步骤(4)后，先从大豆子叶上切下丛生芽，然后将该丛生芽转移至丛生芽伸长培养基，25℃、光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)至丛生芽中再生的植株伸长至2cm。
丛生芽伸长培养基的溶质及其浓度为4.43g/L MS，30g/L蔗糖，0.59g/L MES，0.5mg/LGA3，1mg/L ZR，1mg/L Asp，0.1mg/L IAA，200mg/L Cef，200mg/L Tim，3mg/L草铵膦和0.75％(w/v)琼脂；溶剂为水；pH值为5.6。
(6)完成步骤(5)后，将丛生芽中再生的植株从基部切下，然后转移至生根培养基，25℃、光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)，得到T0代转GmSAUR基因大豆。
生根培养基的溶质及其浓度为0.321g/L B5培养基，20g/L蔗糖，3.9g/L MES，1mg/LIBA和0.8％(w/v)琼脂粉；溶剂为水；pH值为5.6。
3、转GmSAUR基因大豆的鉴定
待T0代转GmSAUR基因大豆成熟后采收，自交，获得T1代转GmSAUR基因大豆种子；在温室种植大豆，并通过下述方法鉴定阳性植株，自交繁殖T2代进行花期调查试验。
(1)分别取大豆品种东农50的植株和T2代转GmSAUR基因大豆的植株，采用免疫胶体金试纸条(EnviroLogix公司的产品)检测是否有Bar蛋白的表达(具体步骤参考免疫胶体金试纸条的说明书)。有Bar蛋白的表达即为转GmSAUR基因大豆。
部分检测结果图5(1：对照植株东农50；2：GmSAUR-ox-1号株系；3：GmSAUR-ox-2号株系；4：GmSAUR-ox-7号株系)。
(2)将大豆品种东农50和T2代转GmSAUR基因大豆的种子播种于温室中，当三出复叶完全展开后，通过在新鲜叶片上涂抹浓度为130mg/L的草铵膦溶液进行抗性鉴定。具有草铵膦抗性的植株即为T2代转GmSAUR基因大豆的阳性植株。
部分鉴定结果见图6(1：对照植株东农50；2：GmSAUR-ox-1号株系；3：GmSAUR-ox-2号株系；4：GmSAUR-ox-7号株系)。
经过上述步骤，鉴定出的3个T2代转GmSAUR基因大豆(GmSAUR-ox-1、GmSAUR-ox-2、GmSAUR-ox-7)的阳性植株株系将进行后续实验。
实施例3.表达GmSAUR蛋白
将实施例2获得的转GmSAUR基因大豆的阳性植株进行
1、蛋白的提取
称取新鲜转基因大豆叶片(约0.3g)，利用钢珠配合磨样器在液氮下打磨样品；频率20次/s，40s，打磨1 2次，将样品充分研磨。向样品粉末中加入300μL PBS buffer，充分振荡混匀，冰上静置10min后14000rpm，10min，加入2×Sample buffer；热水浴80℃，5min，充分裂解，可放80℃冰箱备用。
2、Western Blot检测方法
(1)SDS PAGE电泳
制备SDS PAGE倒入薄玻璃板中，再放入跑胶槽中，点样跑胶；将电压调至100V进行跑胶，待样品跑出上层胶后，将电压增加至150V，直至样品跑至下层面胶底部，即跑胶结束。
(2)转膜
先用1×Transfer buffer将大小与凝胶相同的滤纸、硝酸纤维素膜和薄泡沫浸湿；在转膜夹上，从黑色孔处依次放置薄泡沫、滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、滤纸、薄泡沫(放置过程中，注意及时处理气泡，防止气泡的产生)，最后将转膜夹夹好；将准备好的转膜夹放入转膜槽中，向转膜槽中加入1×Transfer buffer，放入冰袋，在低温的条件下进行转膜；在100V恒定电压条件下，转膜1h。
(3)丽春红染色
将膜放于1×TBST buffer中清洗一次；再将膜泡在丽春红染色溶液中，于水平摇床上，室温，50 60rpm，染色1min；染色结束后，用无菌水清洗硝酸纤维素膜3 4次，观察被染色的硝酸纤维膜以确定蛋白提取状况；并根据目的蛋白大小进行剪膜。
(4)封闭
将硝酸纤维素膜泡在Blocking buffer中，于水平摇床上；室温，50 55rpm，封闭1h。
(5)杂交
将Blocking Buffer倒掉，按照1:1000比例进行抗体稀释(A8592，Sigma公司产品)；加入杂交液，室温，水平摇床上孵育1h；30 40rpm。
(6)洗膜
结束杂交后，将膜放入1×TBST buffer中温育晃动洗膜10min，共3次。
(7)显影
用酒精擦拭化学发光成像仪(Amersham Imager 600)中的成像板，根据比例配置ECL显影液，现用现配；将配好的显影液用移液器均匀的滴在硝酸纤维素膜上，确保显影液均匀完全的将硝酸纤维膜覆盖，显色3 5min；然后通过化学发光成像仪观察Western Blot结果如图7所示，(顺序依次为：对照植株东农50，GmSAUR-ox-1号株系，GmSAUR-ox-2号株系，GmSAUR-ox-7号株系)，目的条带大小约为23KDa。
GmSAUR的氨基酸序列：
MGFRIAGIVRRTSFYTTQAASKRVDVPKGYAAVYVGDKMRRFTIPVSYLNEPSFQELL SQAEEEFGYDHPMGGLTIPCKEEEFLNVTAHLNEL。
实施例4.GmSAUR蛋白在控制植物光周期中的应用
将实施例2获得的GmSAUR ox 1、GmSAUR ox 2、GmSAUR ox 7三个转基因株系材料进行长短日照件下的培育，获得的株系相对于野生型大豆品种东农50提前开花。
利用以下实验验证实验效果：
表型分析：
播种待测大豆(大豆品种东农50、GmSAUR ox 1、GmSAUR ox 2、GmSAUR ox 7)，分别进行长日照培养(光培养(16h)和暗培养(8h)交替进行)，和短日照培养(光培养(8h)和暗培养(16h)交替进行)，光培养时为白光，光照强度为350μmolm2s1，观察并记录大豆开花时间。
表2和3分别为长、短日照下的花期数据(R1为始花期，R2为盛花期，R3为始荚期，R4为盛荚期，R5为始粒期，R6为鼓粒期，R7为成熟初期，R8为完熟期)。表2和3中，GmSAUR ox为GmSAUR ox 1、GmSAUR ox 2、GmSAUR ox 7的平均值。结果表明，在长短日照条件下，在大豆品种东农50中过表达GmSAUR基因开花时间提前四天左右。
上述结果表明，结果如图8为长日照下生殖生长状态，图9为长日照开花细节图，图10为短日照下生殖生长状态，图11为短日照开花细节图，在长短日照下，与大豆品种东农50相比，T2代转GmSAUR基因大豆的阳性植株早花，株高显著增加，此实验研究对大豆育种具有重要的理论和实践意义。
表2.长日照下的花期数据
表3.短日照下的花期数据
注：**表示P<0.01。
Claims (10)
1.GmSAUR蛋白在控制植物光周期中的应用，其特征在于，所述GmSAUR蛋白的序列如SEQID NO.5所示。
2.编码GmSAUR蛋白的基因在控制植物光周期中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述基因的序列如SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示。
4.含有权利要求2所述的基因的重组载体在控制植物光周期中的应用。
5.含有权利要求2所述的基因的重组微生物细胞在控制植物光周期中的应用。
6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述控制光周期为提前开花。
7.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为双子叶或单子叶植物。
8.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为大豆。
9.一种育种提前开花大豆的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
(1)扩增SEQ ID NO.4所示的基因序列，将基因序列插入到表达载体；
(2)将步骤(1)获得的载体导入到农杆菌中，利用农杆菌转入到大豆中得到转基因大豆；
(3)鉴定步骤(2)获得的转基因大豆得到阳性转基因大豆。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，扩增SEQ ID NO.4所示的基因序列的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
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