CN116814574A - 一种亚胺还原酶突变体、重组基因工程菌及其在(r)-2-甲基吡咯烷合成中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种亚胺还原酶突变体、重组基因工程菌及其在(R)‑2‑甲基吡咯烷合成中的应用。所述亚胺还原酶突变体以SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的野生型亚胺还原酶IR23为模板，第249位缬氨酸突变获得的突变体V249T，第249位缬氨酸和第224位色氨酸突变获得的突变体V249T/W224F。本发明通过半理性设计的分子改造方法，显著提高了亚胺还原酶催化环状亚胺2‑甲基吡咯啉生成相应环状胺的能力。突变体V249T/W224F催化2‑甲基吡咯啉时，底物转化率为93.3％，与野生型相比提高了49.8％。本发明有效提高了亚胺还原酶不对称合成手性胺的能力，对手性胺化合物的绿色催化合成具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于酶工程领域，具体涉及一种亚胺还原酶突变体、编码基因、含有这些编码基因的重组质粒和重组基因工程菌，以及它们在催化2-甲基吡咯啉合成(R)-2-甲基吡咯烷中的应用。
背景技术
手性胺结构作为化学物质的重要的结构砌块，广泛应用在制药行业、精细化工和农用化学品领域。据统计，手性胺结构存在于许多药物分子中，约有40％的药物的结构中带有至少一个手性胺结构。在200种小分子药物中，具有手性胺结构的药物占有40％，在农用化学品中手性胺官能团类化合物占20％。美国化学学会-绿色化学研究所制药圆桌会议提出手性胺类化合物的合成是当前制药工业面临的巨大挑战之一。由此可见，构建手性胺化合物的绿色高效合成工艺具有重要的意义。
手性胺化合物合成方法主要分为化学法和生物法。传统化学法使用手性过渡金属或有机小分子催化反应，催化剂包括铑、钴、钯、手性磷酸等。使用金属催化剂需要有效地步骤将其分离，增加了工业生产成本和难度。化学合成也面临着对映体选择性低、环境污染、反应条件苛刻等问题，因此工业上致力于开发可持续发展的催化方法。生物催化相较于化学法合成，具有立体选择性高、反应条件温和，对环境污染小，反应路线简单等优点，广泛应用于各种手性胺化合物的合成中。目前已有几种生物催化剂应用到手性胺的合成中，包括亚胺还原酶、转氨酶、胺脱氢酶等。其中有三类酶因具有催化手性胺合成的能力而受到广泛关注，第一类酶是转氨酶，ω-转氨酶能够催化醛、酮转化为手性胺化合物，实现氨基的不对称转移。转氨酶的工业应用面临着热力学平衡，底物谱较窄以及催化底物浓度较低等问题。另外，其催化氨基的转移只能生产伯胺类化合物，手性仲胺和手性叔胺类化合物需通过其他合成途径获得。第二类酶是胺脱氢酶，它能够催化前手性酮和氨的偶联，实现醛酮类底物的不对称还原胺化。与转氨酶类似的是，胺脱氢酶的产物也仅限于伯胺类化合物。近些年来，研究者发现亚胺还原酶可应用于手性胺的合成，不对称还原前手性亚胺生成手性胺，它是合成光学纯环状胺最有潜力的催化剂。亚胺还原酶也可以直接从前手性酮出发与合适的胺供体结合生成亚胺类化合物，再进行不对称还原生成手性胺，其能直接生成伯胺和仲胺的能力为手性胺的合成提供了新的途径。
亚胺还原酶是一类NADPH依赖型的氧化还原酶，对NADPH有严格的偏好性，可不对称催化前手性酮和亚胺还原为手性胺。因此，根据所催化的反应和底物类型可以分为两类，1)只能催化前手性亚胺还原的酶和2)催化酮的还原胺化和前手性亚胺还原的酶。第一类能够催化亚胺类底物的不对称还原，由于C＝N键键能低和亲电性导致C＝N键极易被亲核分子攻击，在水溶液中非环类亚胺物质非常不稳定，而环状亚胺相对稳定，因此亚胺还原酶被广泛应用到环亚胺的还原反应中。另一类亚胺还原酶能够催化前手性酮和合适的胺合成亚胺类底物，进而再催化亚胺类底物的不对称还原从而实现前手性酮的还原胺化。然而，现有的亚胺还原酶仍然存在手性胺生成能力较低的缺陷，无法满足当前手性胺绿色工业催化合成的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种手性胺生成能力提高的亚胺还原酶突变体、编码基因、重组质粒、重组基因工程菌及其在催化2-甲基吡咯啉合成相应手性胺中的应用，从而解决现有技术中亚胺还原酶仍然存在手性胺生成能力较低，无法满足当前手性胺绿色工业催化合成的需求的问题。
为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
根据本发明的第一方面，提供一种手性胺生成能力提高的亚胺还原酶突变体，包括以SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的野生型亚胺还原酶IR23为模板，发生如下突变形成的亚胺还原酶突变体：第249位缬氨酸突变为苏氨酸的亚胺还原酶突变体V249T，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；第249位缬氨酸突变为苏氨酸和第224位色氨酸突变为苯丙氨酸的亚胺还原酶突变体V249T/W224F，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
根据本发明的第二方面，提供了所述亚胺还原酶突变体的编码基因。
根据本发明的第三方面，提供了一种包含所述亚胺还原酶突变体的编码基因的重组载体。
根据本发明的第四方面，提供了一种由所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。所采用的宿主细胞可以为本领域的各种常规宿主细胞，作为优选，宿主细胞为大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。
根据本发明的第五方面，还提供了一种使用所述亚胺还原酶突变体催化2-甲基吡咯啉制备(R)-2-甲基吡咯烷的应用。
根据本发明的一个优选方案，所述应用包括：S1：培养所述重组基因工程菌，诱导表达，获得粗酶液或湿菌体或冻干菌粉；S2：向所述粗酶液或湿菌体或冻干菌粉中加入缓冲液，并加入含有2-甲基吡咯啉、NADP+、葡萄糖的母液，所有组分加入后充分混匀，放置到25～30℃摇床中进行反应，即可实现(R)-2-甲基吡咯烷的高效合成。
本发明首先选择了从产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)Tue57中克隆的亚胺还原酶IR23基因为模板，该亚胺还原酶IR23的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。以来源于Actinoalloteichus hymeniacidonis的亚胺还原酶晶体结构作为模板(PDB ID:7wnw)进行同源建模，并将底物对接进亚胺还原酶IR23模型中。通过分析底物-酶对接复合物构象，识别了IR23催化活性中心附近两个氨基酸，可能影响着手性胺的合成效率。因此，分别对这两个位点(第249位、第224位)进行饱和突变，并对正向单点突变体进行组合突变，并测定了突变体库催化2-甲基吡咯啉生成相应手性胺的情况。通过这些蛋白质工程策略，获得了多个亚胺还原酶手性胺生成能力提高的突变体，这些突变体的获得对手性胺化合物的催化合成意义重大。其中，突变体V249T催化2-甲基吡咯啉时，底物转化率为82.6％，与野生型相比提高了39.1％。突变体V249T/W224F催化2-甲基吡咯啉时，底物转化率为93.3％，与野生型相比提高了49.8％。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
1)本发明通过半理性设计对催化效率低的亚胺还原酶IR23进行分子改造，获得手性胺生成能力显著提高的突变体。最佳突变体的底物转化率从野生型的43.5％提高到93.3％，ee>99.9％。突变体的催化效率明显提升，实现了(R)-2-甲基吡咯烷的高效合成。
2)对亚胺还原酶的催化效率的提升使其能够应用于手性胺绿色工业催化合成，具有重要的应用价值。
综上所述，本发明对来源于Streptomyces viridochromogenes Tue57的亚胺还原酶进行分子改造，经过分析确定对手性胺产物生成起关键作用的氨基酸位点，进行饱和突变和组合突变后，构建得到一种对2-甲基吡咯啉催化能力提高的亚胺还原酶突变体，本发明对于调控亚胺还原酶的天然亚胺还原活性具有重要参考意义，也为手性胺化合物的合成提供了补充方案，对手性胺化合物的绿色催化合成具有重要意义。
附图说明
图1示出了亚胺还原酶IR23模型与底物的对接结构及关键突变残基V249、W224的空间位置分布。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步描述本发明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。如非特殊说明，实施例中所用的技术手段为本领域常规操作，或按照试剂盒及仪器设备厂商所建议的实验方法。实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
LB液体培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g溶解到1L去离子水中，用量筒量取50mL分装于250mL三角瓶中，封口膜包扎，使用121℃进行灭菌20min。
LB固体培养基：用量筒量取100mL LB液体培养基分装于250mL三角瓶中，每瓶加入1.5g琼脂糖，封口膜包扎，使用121℃进行灭菌20min。
实施例1突变位点的选取
由于亚胺还原酶IR23还没有解析出相应的晶体结构，因此，发明人通过SWISS-MODEL在线服务器(http://www.swissmodel.expasy.org/)进行同源建模。选择与目的蛋白IR23一致性最高的亚胺还原酶(PDB ID:7wnw来源于Actinoalloteichushymeniacidonis)作为模板。建模完成后，下载并优化得到的结构。之后把准备好的底物分子对接到模型中，对接结束后，根据复合物结合能、底物优势取向、催化关键基团之间的距离，筛选并保存理想的对接复合物。
通过对对接结构分析，发明人筛选出了亚胺还原酶IR23催化活性中心附近可能影响催化效率的两个关键残基：V249和W224。亚胺还原酶IR23模型与底物的对接结构及关键突变残基V249、W224的空间位置分布如图1所示。后续对这两个潜在位点进行饱和突变，对正向突变体进行联合突变，构建突变体文库。
实施例2亚胺还原酶突变体的构建
将带有pET-22b(+)-IR23重组质粒的大肠杆菌在LB液体培养基试管中培养10-12h，抽提质粒作为后续突变体构建的模板，突变所用的引物(SEQ ID NO.5-12)见表1。
表1突变体引物信息
PCR反应体系(20μL)如下：
PCR反应条件：
(1)95℃预变性设置5min
(2)95℃变性设置30s
(3)60℃退火设置30s
(4)72℃延伸设置1min 10s
(5)72℃终延伸设置10min
(6)4℃保温
(2)-(4)步骤设置35个循环。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证为阳性后，加入0.5μL限制性内切酶Dpn I，于37℃水浴2.5h除去模板。随后便可进行转化、挑菌、送测序。
实施例3亚胺还原酶突变体的诱导表达
取出含有5mL液体培养基的试管，加入0.1％体积的抗性，用移液枪吸取适量的菌液接种到抗性试管中，37℃过夜培养12小时。在装有50mL培养基中锥形瓶中加入0.1％体积的抗性，取出培养好的试管，用移液枪吸取500μL的菌液加到培养基中，放置于37℃摇床中培养2小时，待OD600值到0.6-0.8之间。在超净工作台中加入0.1％v/v的IPTG诱导剂进行诱导，放置于20℃摇床中，诱导约18-20小时。
诱导培养结束后进行收菌操作，倒入菌液的离心管添加去离子水配平，随后放入预冷好的4℃离心机中离心(8,000rpm，10min)。离心结束后倒掉上清，加入20mL 0.5％的NaCl溶液将菌体重新悬起来，配平后以刚才的条件再次离心。离心结束后尽可能的除去上清，随后放入-40℃冰箱中冷冻3h以上即可进行冷冻干燥。样品在真空冷冻干燥机中放置10h左右后取出，得到亚胺还原酶冻干菌粉。
实施例4突变体的筛选
以实施例3制备的亚胺还原酶冻干菌粉为催化剂，进行2-甲基吡咯啉为底物的转化反应，以筛选出手性胺生成能力提高的突变体。
按表2所示组成配制反应体系：先称取菌粉置于2mL离心管中，加入缓冲液使菌粉溶解，最后加入含有2-甲基吡咯啉(100mM)、NADP+(1mM)、葡萄糖(125mM)的母液，所有组分加入后充分混匀，每个反应做三个平行样。放置到30℃摇床中进行反应，反应时间2小时，待反应结束后加入50μL氢氧化钠溶液(10M)终止反应，使用离心机14,000rpm离心10min，反应液需要进行后续处理进行气相/液相检测。
表2
反应的转化率通过气相检测，取400μL终止后的反应液到新的2mL EP管中，加2倍体积的乙酸乙酯(带内标物)，涡旋15s充分萃取、14,000rpm离心10min，取上清有机相400μL到新的离心管中，加适量无水硫酸钠，14,000rpm离心10min，取上清液200μL至小管中进行气相检测。
气相检测条件如下：色谱柱DB-1701，内标物邻二甲苯(10mM)，进样量1μL，分流比2:1；升温程序50℃持续5min、升温速度25℃/min至190℃、升温速度100℃/min至240℃维持5min。
反应样品的ee值需要经过衍生进行液相检测。取1.5mL离心管，加入衍生体系，衍生体系如下(200μL)：0.8％(w/v)GITC(溶于乙腈)100μL，0.2％(v/v)三乙胺(溶于乙腈)50μL，已处理的样品50μL。配置好的衍生体系放置于40℃水浴锅中，衍生时间30min，待衍生结束后使用离心机14,000rpm离心10min，取上清50μL转移到液相小管中，进行HPLC液相检测。
液相检测条件：Extend C18色谱柱(5μm，4.6x 250mm)，流动相甲醇：水＝45:55，柱温30℃，流速0.8mL/min，进样量3μL，紫外吸收波长254nm。
以2-甲基吡咯啉为催化反应的底物，利用上述方法对构建的突变体库进行筛选分析，结果如表3所示，根据本发明获得的突变体的手性胺生成能力均比野生型高。从表中可以看出，单点突变体中V249T的底物转化率最高，达到了82.6％，相比野生型提高了39.1％。双点突变体中V249T/W224F底物转化率达到93.3％，相比野生型提高了49.8％。正向突变体V249S、V249T、V249Y、W224F、V249S/W224F、V249T/W224F和V249Y/W224F相比野生型对2-甲基吡咯啉的催化效率均有提高。
表3亚胺还原酶突变体催化手性胺生成情况(每次实验设置3个平行)
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围。本发明的上述实施例还可以做出各种变化，即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
Claims (8)
1.一种手性胺生成能力提高的亚胺还原酶突变体，其特征在于，包括以SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的野生型亚胺还原酶IR23为模板，发生如下突变形成的亚胺还原酶突变体：
第249位缬氨酸突变为苏氨酸的亚胺还原酶突变体V249T，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
第249位缬氨酸突变为苏氨酸和第224位色氨酸突变为苯丙氨酸的亚胺还原酶突变体V249T/W224F，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.一种编码如权利要求1所述的亚胺还原酶突变体的编码基因。
3.一种包含如权利要求2所述的编码基因的重组质粒。
4.一种含有如权利要求3所述的重组质粒的重组基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的重组基因工程菌，其特征在于，宿主细胞为大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。
6.一种亚胺还原酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)对权利要求4所述的重组基因工程菌进行培养，并诱导亚胺还原酶突变体表达；
2)从1)中得到的培养物中分离出如权利要求1所述的亚胺还原酶突变体。
7.一种如权利要求1所述的亚胺还原酶突变体在催化2-甲基吡咯啉合成(R)-2-甲基吡咯烷中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括：
S1：培养根据权利要求4所述的重组基因工程菌，诱导表达，获得粗酶液或湿菌体或冻干菌粉；
S2：向所述粗酶液或湿菌体或冻干菌粉中加入缓冲液，并加入含有2-甲基吡咯啉、NADP+、葡萄糖的母液，所有组分加入后充分混匀，放置到25～30℃摇床中进行反应，即可实现(R)-2-甲基吡咯烷的高效合成。
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