CN116808053A - 一种果胶寡糖纳米硒复合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种果胶寡糖纳米硒复合物及其制备方法和应用,将柑橘皮粉末加入水中,调节pH至酸性,添加果胶裂解酶,搅拌浸提酶解反应,并进一步加入碘化钾、抗坏血环酸和四价硒源,进行水浴反应之后,将所得反应液进行透析得到果胶寡糖纳米硒复合物溶液,再将其冷冻干燥成粉末状固体,即可得到果胶寡糖纳米硒复合物。本发明以果胶寡糖裂解液为稳定剂,制备的果胶寡糖纳米硒复合物具有粒径小、稳定性好、有较好的抗氧化能力。且方法操作简单便捷、条件温和、能耗低、污染小。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域,特别涉及一种果胶寡糖纳米硒复合物及其制备方法和应用。
背景技术
硒是动物和人体必需的微量营养元素之一,对维持机体的正常生命活动至关重要,硒的缺乏可诱导或加具骨骼肌、心肌坏死、免疫功能下降和肿瘤疾病等,它也具有延缓衰老、预防肿瘤、调节免疫等功能,特别对心血管疾病、肿瘤、糖尿病等有较好的辅助防治作用。但目前所用硒源的有效剂量和毒性剂量之间范围极窄,极大的限制了它们的实际应用。
纳米硒(SeNPs)是具有纳米尺寸特征的单质硒,具有良好的生物利用度和更好的安全性,并展现出抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、抗菌、胃粘膜保护、肝保护等多种功效。然而,纳米硒具有较高的表面能,因此裸露的纳米硒很不稳定,不但形貌和尺寸难以控制,而且容易自发聚集成团,失去生物活性。将多糖类作为载体,利用天然多糖的复杂结构、大的比表面积和可电离的官能团,还有良好的生物相容性和生物降解性降低纳米硒的表面能来提高纳米硒的稳定性和功能性。
果胶寡糖是由2~20个α-1,4-D-半乳糖醛酸残基构成的一类功能性低聚糖,其侧链包含半乳糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖等。具有良好的生理活性,例如抑制尿路致病微生物生长,促进人类结肠腺癌细胞凋亡,抗肥胖、抗毒性、抗感染、抗菌和抗氧化作用。果胶寡糖可以通过酸水解、氧化法和化学合成法等化学法制备得到,也可以通过酶作用于特定原料制备得到。相比于化学法,酶降解法具有选择性好、副反应少和操作方便等优势。桔皮果渣是一种常见的农废资源,其果胶质量分数虽然高达20%,但因其含水率和酸度较高,极易造成微生物迅速繁殖,如不及时处理,不仅容易造成严重的环境污染,也会产生大量的资源浪费。
发明内容
针对现有技术存在的上述技术问题,本发明的目的在于提供一种果胶寡糖纳米硒复合物及其制备方法和应用,本发明利用果胶寡糖包埋制备纳米硒,具备其制备过程简单快捷可操作性强,制备而成的纳米硒粒径小,平均粒径可达78.5nm,在4℃环境下储存28天粒径无明显变化且不会产生沉淀,果胶寡糖纳米硒复合物与果胶寡糖相比较其抗氧化能力得到了大幅度的提高,解决了纳米硒不稳定,容易自发聚集成团、沉淀,导致生物活性和生物利用度降低的问题。
本发明采用的技术方案如下:
.一种果胶寡糖纳米硒复合物的制备方法,包括以下步骤:
(1)柑橘果胶寡糖裂解液酶的制备
将柑橘皮粉末按照1:15~25(优选1:20)的质量比加入水中,调节pH至酸性,加热至40-50℃,添加果胶裂解酶,于恒温磁力搅拌器中100-500rpm(优选450rpm)搅拌浸提酶解反应,反应结束后立即煮沸灭酶活,冷却至常温后,离心除去底层橘皮果渣沉淀,上清液过滤,滤液在加热条件下减压浓缩至上清液体积的10-30%得到柑橘果胶寡糖裂解液;
(2)果胶寡糖纳米硒复合物的制备
向步骤(1)柑橘果胶寡糖裂解液中加入碘化钾、抗坏血环酸和四价硒源形成混合液,进行水浴反应,将所得反应液进行透析得到果胶寡糖纳米硒复合物溶液,再将其冷冻干燥成粉末状固体,即可得到果胶寡糖纳米硒复合物。
进一步地,步骤(1)中调节pH至4.0-5.0,优选为4.5,反应温度为40-50℃,优选为45℃,酶解时间是1~8h。
进一步地,步骤(2)中柑橘果胶寡糖裂解液的折光度为1~3D,优选为2.5D,步骤(2)形成的混合液中抗坏血环酸浓度为0.01~0.05mol/L,碘化钾的摩尔浓度是0.005~0.02mol/L,优选为0.01mol/L。
进一步地,步骤(2)中进行反应的温度为40-50℃,优选为45℃,反应时间是3~5h,优选为4h。
进一步地,步骤(2)中,透析过程中包括将反应液转移到2500-3500Da透析袋中,透析温度控制在2~6℃且避光的环境下,持续透析40h~50h。
进一步地,步骤(2)中,果胶寡糖纳米硒复合物溶液放置在-15~-25℃冰箱内预冻10-15h,然后将预冻的果胶寡糖纳米硒复合物用冷冻干燥机于-45~-55℃进行冷冻干燥30-40h,真空度为0.09MPa以上。
本发明提供的一种果胶寡糖纳米硒复合物在制备抗氧化药物中的应用。
果胶裂解酶(反式消去酶)是通过反式消去作用裂解果胶聚合体的一种果胶酶,裂解酶在C-4位置上断开糖苷键,同时从C-5处消去一个H原子从而产生一个不饱和产物。果胶裂解酶(PL)作为果胶解聚酶的一种,可通过催化果胶半乳糖醛酸残基的C-4和C-5发生氢的反式消去反应来完成糖苷键裂解,产生不饱和果胶低聚糖(UPO),其富含的不饱和双键对低聚糖产物的生物活性具有显著影响。
与现有技术相比,本发明的有益效果主要体现在:
1、该果胶寡糖纳米硒复合物的制备方法,通过果胶寡糖纳米硒复合物的制备方法以抗坏血环酸为还原剂,果胶寡糖为稳定剂,其制备过程简单快捷可操作性强,制备而成的纳米硒粒径小,平均粒径可达78.5nm,在4℃环境下储存28天粒径无明显变化且不会产生沉淀,有效的提高了生物利用度。
2、该果胶寡糖纳米硒复合物的制备方法,通过果胶寡糖纳米硒复合物与果胶寡糖、亚硒酸钠相比较其抗氧化能力得到了大幅度的提高,进一步提高了整体效果。
附图说明
图1为实施例1中酶解时间对果胶寡糖纳米硒复合物粒径的影响图。
图2为实施例1中抗坏血酸溶液浓度对果胶寡糖纳米硒复合物粒径的影响图。
图3为实施例1中果胶寡糖裂解液折光度对果胶寡糖纳米硒复合物粒径的影响图。
图4为实施例2中果胶寡糖纳米硒复合物在4℃环境下存放28天的粒径变化示意图。
图5实施例2中为果胶寡糖纳米硒复合物及纳米硒(未添加果胶寡糖)存放28天的对比图。图5中(左:0天、右:28天)。
图6为实施例3中果胶寡糖纳米硒复合物清除DPPH自由基能力比较图。
图7为实施例3中果胶寡糖纳米硒复合物清除ABTS自由基能力比较图。
图8为实施例3中果胶寡糖纳米硒复合物清除超氧阴离子自由基能力比较图。
图9为实施例3中果胶寡糖纳米硒复合物还原能力比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,但本发明的保护范围并不限于此。
本发明实施例中果胶为低脂柑橘果胶,具体由巧继国际贸易(上海)有限公司购入,产地美国。
本发明常温是指25-30℃。
本发明所述果胶裂解酶购自夏盛(北京)生物科技开发有限公司,其形态是液态,酶活为600U/mL。
实施例1:单因素对果胶寡糖纳米硒复合物粒径的影响
根据反应条件以果胶寡糖纳米硒复合物粒径为参考指标进行单因素试验,分别研究酶解时间(0h,2h,4h,6h,8h)、抗坏血酸溶液浓度(0.01mol,0.015mol,0.02mol,0.025mol,0.03mol)和果胶寡糖裂解液折光度(1,1.5,2,2.5,3D)这三个因素对胶寡糖纳米硒复合物粒径的影响。
一种果胶寡糖纳米硒复合物的制备方法,包括以下步骤:
1)柑橘皮的预处理
将新鲜柑橘皮经沸水煮沸10min灭原酶活后,再用流动的清水漂洗3次,以除去部分橘皮色素。将处理后的橘皮原料于60℃恒温干燥箱中烘干至恒重,再经中草药粉碎机打碎至粉末,过40目筛,获得预处理后的柑橘皮粉末,备用。
2)酶解方法
取10g预处理后柑橘皮粉末,按料液质量比为1:20加入水,按柑橘皮粉水溶液体积的2%(v/v)加入果胶裂解酶,调节pH为4.5,在45℃下于恒温磁力搅拌器中300rpm搅拌浸提酶解反应,酶解反应不同时间。反应结束后立即煮沸灭酶活,冷却至常温后,将果胶浸提液于4℃,10000rpm条件下离心10min,除去底层桔皮果渣沉淀,上清液经200目筛网过滤后,通过减压旋转蒸发(温度60℃,真空度5000Pa)调整所得果胶寡糖裂解液折光度为1,1.5,2,2.5或3D。
3)向步骤2)柑橘果胶寡糖裂解液中加入碘化钾、抗坏血环酸和亚硒酸钠形成混合液,在恒温水浴锅中进行反应,45℃水浴反应4h,将所得反应液进行透析(反应液转移到3000Da透析袋中,透析温度控制在4℃且避光的环境下,持续透析45h)得到果胶寡糖纳米硒复合物溶液,果胶寡糖纳米硒复合物溶液放置在-20℃冰箱内预冻12h,然后将预冻的果胶寡糖纳米硒复合物用冷冻干燥机于-50℃下进行冷冻干燥36h,真空度为0.09MPa以上,即可得到果胶寡糖纳米硒复合物。
1、酶解时间对果胶寡糖纳米硒复合物粒径的影响
按照上述果胶寡糖纳米硒复合物的制备方法,按柑橘皮粉水溶液体积的2%(v/v)加入果胶裂解酶,45℃水浴反应,对于酶解反应进行不同酶解时间(0h,2h,4h,6h,8h),通过减压旋转蒸发调整所得果胶寡糖裂解液折光度为2D,加入碘化钾、抗坏血环酸和亚硒酸钠的终浓度分别是多少0.01mol/L、0.02mol/L、0.01mol/L,最终得到的果胶寡糖纳米硒复合物用双纳米电位粒度仪对其粒径进行表征,如图1所示当酶解时间为4h时,纳米硒复合物的粒径最小。
2、抗坏血酸溶液浓度对果胶寡糖纳米硒复合物粒径的影响
按照上述果胶寡糖纳米硒复合物的制备方法,按柑橘皮粉水溶液体积的2%(v/v)加入果胶裂解酶,45℃水浴反应,对于酶解反应进行酶解时间4h,通过减压旋转蒸发调整所得果胶寡糖裂解液折光度为2D,加入碘化钾和亚硒酸钠的终浓度分别是多少0.01mol/L、0.01mol/L,利用不同浓度(0.01mol/L,0.015mol/L,0.02mol/L,0.025mol/L,0.03mol/L)的抗坏血酸制备果胶寡糖纳米硒复合物,对最终得到的产品用双纳米电位粒度仪对其粒径进行表征,如图2所示当抗坏血酸溶液浓度为0.025mol/L时,纳米硒复合物的粒径最小。
5、果胶寡糖裂解液折光度对果胶寡糖纳米硒复合物粒径的影响
按照上述果胶寡糖纳米硒复合物的制备方法,通过减压旋转蒸发(温度60℃,真空度5000Pa)调整不同折光度(1,1.5,2,2.5,3D)果胶寡糖裂解液,加入碘化钾、抗坏血环酸和四价硒源的终浓度分别是多少0.01mol/L、0.02mol/L、0.01mol/L,45℃水浴反应4h,最终得到的果胶寡糖纳米硒复合物用双纳米电位粒度仪对其粒径进行表征,如图3所示当果胶寡糖裂解液折光度为2.5时,纳米硒复合物的粒径最小。
实施例2:正交实验
根据实施例1的果胶寡糖纳米硒复合物的制备实验,以A:酶解时间、B:抗坏血酸浓度、C:果胶寡糖裂解液折光度为反应变量,粒径为观测指标,进行三因素三水平正交实验,设计表1为正交实验水平因素表,正交试验结果见表2。
表1正交实验设计表
水平 | A/h | B/mol/L | C/D |
1 | 3.0 | 0.02 | 2.0 |
2 | 4.0 | 0.025 | 2.5 |
3 | 5.0 | 0.03 | 3.0 |
A:酶解时间;B:抗坏血酸浓度;C:果胶寡糖裂解液折光度
表2正交实验结果表
①酶解时间;②抗坏血酸浓度;③果胶寡糖裂解液折光度
通过正交实验,探究酶解时间、抗坏血酸溶液浓度和果胶寡糖裂解液折光度这三个因素对胶寡糖纳米硒复合物粒径的影响,从而获得最佳反应条件。经验证试验得到最佳条件为酶解时间4h,抗坏血酸浓度0.02mol,果胶寡糖裂解液折光度2.5的条件下,胶寡糖纳米硒复合物的粒径最小,为78.5nm。
根据正交实验,可以看出在酶解时间3-5h、抗坏血酸浓度0.02-0.03mol/L以及果胶寡糖裂解液折光度2~3D的条件下,胶寡糖纳米硒复合物的粒径在78.5-91.5nm范围内,取得不错的技术效果。
实施例3:储藏稳定性
将实施例2水平2条件下制备好的果胶寡糖纳米硒复合物放置于4℃的环境中储存,每隔7天利用双纳米电位粒度仪表征其粒径,从图4可看出,粒径并无明显变化。图5为果胶寡糖纳米硒复合物在4℃环境下储存0天和28天的对比图,由图5可知果胶寡糖纳米硒复合物溶液稳定、透明,而对照组的纳米硒(无果胶寡糖裂解液)在反应完成后已经完全沉淀在底部,结果表明果胶寡糖对纳米硒的稳定起着至关重要的作用,与现有研究中黄精多糖和壳聚糖包埋的纳米硒的储藏稳定性研究结果相似。
但是黄精多糖要从黄精中提取,它的原料来源途径少且比较贵。壳聚糖大多数是利用化学法脱乙酰基从虾、蟹的甲壳中提取,对环境污染较为严重,直接购买的成本也较高,在包埋纳米硒时需要用到醋酸,添加量不多但刺激性较大,均存在明显的不足之处。与之相比,本发明使用果胶寡糖包裹纳米硒,使柑橘深加工后的副产物得到充分的利用,消除废渣堆放腐烂对环境造成的破坏,从而促进可持续发展和保护环境,且用酶法提取选择性好、副反应少和操作方便,绿色无污染。生成的果胶寡糖具备的不饱和双键本身就存在抗氧化功能,可以参与亚硒酸钠的还原,在包埋时也会起到一定的辅助抗氧化作用。
实施例4:抗氧化活性测定
1、DPPH自由基清除活性
将样品配置成500mg/mL的储备液,稀释成50、100、200、300、400、500ug/mL的检测液,在10mL的比色管中分别加入2mL样品与4mL 0.2mM新鲜制备的OPPH乙醇溶液充分混合,剧烈摇动后在30℃水浴中静置反应30min。无水乙醇做空白,在517nm出测吸光度。每个样品平行测量三次,并计算平均清除率。清除率的计算方法如下:
其中Ac表示用蒸馏水代替样品组在517nm下的吸光度,As表示样品吸光度,Ab表示用乙醇代替DPPH乙醇溶液组在517nm下的吸光度。
图6为不同浓度样品对DPPH自由基清除率的比较图。当果胶寡糖纳米硒复合物浓度达到500ug/mL时,清除率达到11%,这表明果胶寡糖纳米硒复合物对DPPH自由基具有一定的清除能力,且远高于同浓度的果胶寡糖。
2、ABTS自由基清除活性
将用去离子水配置的2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(7mM)与K2S2O8(2.45mM)等体积混合,然后在黑暗中培养12h,获得ABTS工作溶液。测量前,用无水乙醇稀释ABTS工作溶液,使其在734nm处的吸光度为0.70±0.02。用去离子水将样品配置成500mg/mL的储备液,稀释成50、100、200、300、400、500ug/mL的检测液,在10mL的比色管中分别加入2mL不同浓度的样品溶液,与4mL稀释后的ABTS工作液在黑暗中反应6min,无水乙醇做空白,在734nm处测吸光度。每个样品平行测量三次,并计算平均清除率。清除率的计算方法如下:
其中Ac表示用蒸馏水代替样品组在734nm下的吸光度,As表示样品吸光度,Ab表示用乙醇代替ABTS乙醇溶液组在517nm下的吸光度。
图7为不同浓度样品对ABTS自由基清除率的比较图。如图所示果胶寡糖纳米硒复合物及果胶寡糖的ABTS自由基清除能力随着样品浓度的增加而增加。当果胶寡糖纳米硒复合物浓度达到500ug/mL时,清除率可高达21%,这表明果胶寡糖纳米硒复合物对ABTS自由基具有清除能力,且远高于同浓度的果胶寡糖。
3、超氧阴离子自由基清除活性
将样品用去离子水配置成500mg/mL的储备液,稀释成50、100、200、300、400、500ug/mL的样品检测液,在10mL的比色管中分别加入5mL(0.05mol/L)pH8.2的Tris-HCl缓冲液,置于25℃水浴中预热20min,然后加入样品检测液2mL,再加入在25℃水浴中预热20min的3mmol/L邻苯三酚溶液0.3mL,混匀后在25℃水浴中反应5min,立即用100uL4 mo1/LHCl终止反应,并在325nm处测定吸光度。每个样品平行测量三次,并计算平均清除率。清除率的计算方法如下:
其中Ac表示用蒸馏水代替样品组在325nm下的吸光度,As表示样品吸光度,Ab表示用水代替邻苯三酚溶液组在325nm下的吸光度。
图8为不同浓度样品对超氧阴离子自由基清除率的比较图。果胶寡糖纳米硒复合物对清除超氧阴离子自由基存在一定的剂量关系,且果胶寡糖纳米硒复合物的清除超氧阴离子自由基能力远大果胶寡糖。
4、还原力实验
将样品用去离子水配置成500mg/mL的储备液,稀释成50、100、200、300、400、500ug/mL的样品检测液,在10mL的离心管中分别加入pH6.6的磷酸盐缓冲液2.5mL,不同浓度的样品检测液2.5mL和1%的铁氰化钾溶液2.5mL,混合均匀后,置于50℃水浴中温育20min,然后迅速冷却,再加入10%的三氯乙酸2.5mL,混匀后,在3000r/min的条件下离心分离10min后,取上清液2.5mL于10mL的比色管中,再加入蒸馏水22.5mL和0.1%的三氯化铁0.5mL,混匀后,放置10min,在700nm处测定吸光度,吸光值越高,还原力越强,每个样品平行测量三次。
图9为不同浓度样品的还原力比较图。当果胶寡糖纳米硒复合物浓度达到500ug/mL时还原力可达0.3,且远高于同浓度的果胶寡糖。
图6-9中的果胶寡糖纳米硒复合物,是按照实施例2水平2条件下制备而成。
需要特别说明的是,在本发明记载的组分、配比及工艺参数范围内,具体选择其他的组分、配比或者取值,均可以实现本发明记载的技术效果,故不再一一将其列出。
本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举,本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。
Claims (8)
1.一种果胶寡糖纳米硒复合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)柑橘果胶寡糖裂解液酶的制备
将柑橘皮粉末按照1:15~25的质量比加入水中,调节pH至酸性,加热至40-50℃,添加果胶裂解酶,于恒温磁力搅拌器中100-500rpm搅拌浸提酶解反应,反应结束后立即煮沸灭酶活,冷却至常温后,离心除去底层橘皮果渣沉淀,上清液过滤,滤液在加热下减压浓缩,得到柑橘果胶寡糖裂解液;
(2)果胶寡糖纳米硒复合物的制备
向步骤(1)柑橘果胶寡糖裂解液中加入碘化钾、抗坏血环酸和四价硒源形成混合液,在恒温水浴锅中进行反应,将所得反应液进行透析得到果胶寡糖纳米硒复合物溶液,再将其冷冻干燥成粉末状固体,即可得到果胶寡糖纳米硒复合物。
2.如权利要求1所述的一种果胶寡糖纳米硒复合物的制备方法,其特征在于,步骤(1)中调节pH至4.0-5.0,优选为4.5,反应温度为40-50℃,优选为45℃,酶解时间是1~8h。
3.如权利要求1所述的一种果胶寡糖纳米硒复合物的制备方法,其特征在于,步骤(2)中柑橘果胶寡糖裂解液的折光度为1~3D,优选为2.5D,步骤(2)形成的混合液中抗坏血环酸浓度为0.01~0.05 mol/L,碘化钾的摩尔浓度是0.005~0.02mol/L,优选为0.01mol/L。
4.如权利要求1所述的一种果胶寡糖纳米硒复合物的制备方法,其特征在于,步骤(2)中进行反应的温度为40-50℃,优选为45℃,反应时间是3~5h,优选为4h。
5.如权利要求1所述的一种果胶寡糖纳米硒复合物的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,透析过程中包括将反应液转移到2500-3500Da透析袋中,透析温度控制在2~6℃且避光的环境下,持续透析40h~50h。
6.如权利要求1所述的一种果胶寡糖纳米硒复合物的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,果胶寡糖纳米硒复合物溶液放置在-15~ -25℃冰箱内预冻10-15h,然后将预冻的果胶寡糖纳米硒复合物用冷冻干燥机于-45~ -55℃进行冷冻干燥30-40h,真空度为0.09MPa以上。
7.如权利要求1~6任一所述方法制备的一种果胶寡糖纳米硒复合物。
8.如权利要求7所述的一种果胶寡糖纳米硒复合物在制备抗氧化药物中的应用。
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