CN116804217A - 一种基于数字微流控芯片的单细胞三组学共建库方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于数字微流控芯片的单细胞三组学共建库方法，基于采用lift‑off工艺制成的数字微流控芯片进行。本发明首次实现基于数字微流控技术的单细胞染色质可及性、DNA甲基化与转录组联合测序，具有自动化程度高、低成本、高数据质量的优势，解决了现有单组学分析方法单细胞捕获困难、细胞质‑细胞核分离困难、操作繁琐、易污染、成本高昂的难题。
Description
技术领域
本发明属于数字微流控技术领域，具体涉及一种基于数字微流控芯片的单细胞三组学共建库方法。
背景技术
单细胞测序技术是鉴定细胞身份、确定细胞状态的有效手段。目前，用于单细胞转录组、单细胞DNA甲基化、单细胞染色质状态分析的单组学分析方法均促进了人们对细胞更深层次的理解。然而细胞内的调控机制是复杂的，不同层面的信息并不是相互独立起作用的，单个层面的信息有限。想要深入理解机体健康维持和疾病发生的机理，本实施例必须进行单细胞多组学测序，用以研究单细胞表观修饰之间的微弱相互作用及其对基因表达的影响。
由于DNA甲基化、染色质可及性等都是DNA分子上的信息，基因表达是RNA分析信息，通过物理分离细胞质和细胞核，或用polyT尾的磁珠调取走RNA的方式，已经有不少方法实现了单细胞的转录组与DNA甲基化、转录组与染色质可及性的联合分析。通过联合ATAC与亚硫酸盐测序，几个方法实现了DNA甲基化与染色质可及性的联合分析。NOMe-seq巧妙利用GpC甲基化转移酶对染色质开放区域添加GC甲基化的方式，将染色质可及性检测也转变为甲基化检测，为探索单个细胞的不同层的表观基因组信息提供了机会。scNMT和scNOMeRe在NOMe-seq的基础上实现了单细胞的三组学分析。然而，现有平台方法均在EP管中挑取单细胞，这一过程耗时耗力且对细胞损伤极大，过长的操作时间往往导致细胞RNA降解，进行影响转录组数据分析的准确性。其次，EP管中很难实现单个细胞的细胞核与细胞质的分离，往往采用离心的方式，留少部分底部液体认为是细胞核，上清部分液体认为是细胞质，这一方式实际上减少了细胞质基因数检出情况，且很容易误吸走细胞核。此外，EP管中的反应试剂消耗大、易污染。发展一种灵活挑取单细胞、实现核质分离且低成本的单细胞多组学分析方法将极大促进单细胞测序领域的研究。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种基于数字微流控芯片的单细胞三组学共建库方法。
本发明的技术方案如下：
一种基于数字微流控芯片的单细胞三组学共建库方法，
该数字微流控芯片采用lift-off工艺制成，具有至少一单细胞分离反应单元，该单细胞分离反应单元具有一第一储液区、第二储液区和一混合反应区域，且该数字微流控芯片的相互平行上极板和下极板之间的间隙为60-180μm；
第一储液区具有第一储液电极，
第二储液区具有第二储液电极，
混合反应区设有多个混合反应电极和一用于捕获单细胞且直径为50-300μm的亲水位点，
第一储液区和通过若干第一输送电极连通混合反应区，第二储液区和通过若干第二输送电极连通混合反应区，通过第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合而形成的液滴的体积小于通过第二储液电极和最接近混合反应区的第二输送电极的通断电配合而形成的液滴的体积；
具体包括如下步骤：
(1)将细胞悬液置于第一储液区内，通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合，产生细胞悬液液滴，接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该细胞悬液液滴转移至上述亲水位点，使细胞悬液液滴中仅有一个细胞正对下方亲水部，断电静置使该细胞在重力的作用下自然沉降至亲水位点，此时给周围的混合反应电极通电以拖走整个细胞悬液液滴，亲水位点将留有含单个细胞的液滴；
(2)清除第一储液区内的液体，将细胞膜裂解液置于第一储液区内，通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合，产生细胞膜裂解液液滴，接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该细胞膜裂解液液滴转移至上述亲水位点，冰上孵育对细胞膜进行裂解而保持细胞核膜完整，此时给周围的的混合反应电极通电以缓慢转移细胞质部分的液体，亲水位点将留有含单个细胞核的液滴，从而实现细胞核和细胞质的分离；
(3)清除第一储液区内的液体，将第一逆转录试剂置于第一储液区内，通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合，产生第一逆转录液滴，将第二逆转录试剂置于第二储液区内，通过第二储液区的第二储液电极和最接近混合反应区的第二输送电极的通断电配合，产生第二逆转录液滴，接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合以及该第二输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将第一逆转录液滴和第二逆转录液滴转移至与上述细胞质部分的液体混合，对细胞质中的RNA进行逆转录，获得细胞质逆转录产物；
(4)将cDNA扩增试剂置于第二储液区内，通过第二储液区的第二储液电极和最接近混合反应区的第二输送电极的通断电配合，产生cDNA扩增液滴，接着通过该第二输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该cDNA扩增液滴转移并与细胞质逆转录产物混合，进行cDNA扩增反应，获得细胞质cDNA扩增产物；然后对该细胞质cDNA产物依次进行片段化和纯化后，进行PCR扩增并添加测序接头，进行illumina二代测序；
(5)清除第一储液区内的液体，将GpC甲基转移酶液置于第一储液区内，通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合，产生GpC甲基转移酶液滴，接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该GpC甲基转移酶液滴转移至上述亲水位点，与上述含单个细胞核的液滴混合，对细胞核中的开放染色质的GC位点进行甲基化标记；
(6)清除第一储液区内的液体，将细胞核裂解液置于第一储液区内，通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合，产生细胞核裂解液液滴，接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该细胞核裂解液液滴转移至上述亲水位点，与其上的液体混匀，对细胞核进行裂解；
(7)清除第一储液区内的液体，将亚硫酸氢盐转化试剂置于第一储液区内，通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合，产生亚硫酸氢盐转化液滴，接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该亚硫酸氢盐转化液滴转移至上述亲水位点，与其上的液体混匀，进行亚硫酸氢盐转化反应；
(8)在步骤(7)所得的物料进行纯化后，进行若干轮线性扩增和测序接头添加，然后进行PCR扩增、片段化选择，最后进行illumina二代测序。
在本发明的一个优选实施方案中，所述细胞膜裂解液的配方如下表所示：
| 名称 | 用量μL |
| 2％triton | 1 |
| 40U/μL RI(1.25U/μL) | 0.5 |
| 20× | 0.5 |
| 水 | 8 |
| 总体积 | 10μL |
。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第一逆转录试剂的配方如下表所示：
| 名称 | 体积μL |
| F68(0.5％) | 0.2 |
| oligo-dT(10μM) | 0.5 |
| dNTPs(10mM) | 0.5 |
| RI(40U/μL) | 0.6 |
| 总体积 | 1.8 |
所述第二逆转录试剂的配方如下表所示：
| 名称 | 体积μL | 终浓度 |
| RI | 0.35 | |
| 20×F68 | 0.14 | 0.05％ |
| 甜菜碱(5M) | 0.14 | 0.125M |
| MgCl2(100mM) | 0.14 | 2.5mM |
| DTT(100mM) | 0.25 | 5mM |
| FirstStrand buffer(5×) | 0.94 | 1× |
| TSO(50μM) | 0.14 | 2.5μM |
| SS II RTase(200U/μL) | 0.9 | 5U |
| 总体积 | 3 | - |
。
进一步优选的，所述逆转录反应的程序如下表所示：
在本发明的一个优选实施方案中，所述cDNA扩增试剂的配方如下表所示：
| 名称 | 体积μL | 终浓度 |
| 20×F68 | 0.1 | 0.05％ |
| dNTPs(10mM) | 0.12 | 0.3mM |
| ISPCR(10μM) | 0.1 | 0.236μM |
| Fidelity buffer(5×) | 0.85 | 1× |
| KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase(1U/μL) | 0.83 | 0.064U |
| 总体积 | 2 | - |
。
进一步优选的，所述cDNA扩增反应的程序如下表所示：
| 循环 | 变性 | 退火 | 延伸 | 保持 |
| 1 | 98℃3min | - | - | - |
| 25 | 98℃20s | 67℃15s | 72℃6min | - |
| 1 | - | - | 72℃5min | - |
| - | - | - | 4℃ |
。
在本发明的一个优选实施方案中，所述GpC甲基转移酶液的配方如下表所示：
进一步优选的，所述对细胞核进行裂解的条件为：37℃60min，65℃25min。
在本发明的一个优选实施方案中，所述细胞核裂解液的配方如下表所示：
| 名称 | 用量μL | 终浓度 |
| RLT | 3.8 | |
| 20×F68 | 0.2 | 1× |
。
在本发明的一个优选实施方案中，所述液滴为微纳升级液滴。
本发明的有益效果是：
1、本发明首次实现基于数字微流控技术的单细胞染色质可及性、DNA甲基化与转录组联合测序，具有自动化程度高、低成本、高数据质量的优势，解决了现有单组学分析方法单细胞捕获困难、细胞质-细胞核分离困难、操作繁琐、易污染、成本高昂的难题。
2、本发明基于含有亲水位点的数字微流控芯片捕获单细胞，可高效、无损、用户友好的实现单细胞捕获，减少细胞捕获过程中的RNA降解，数据上体现为单细胞基因检出数高。
3、本发明基于含有亲水位点的数字微流控芯片进行细胞核与细胞质的分离，可高效将细胞核保留在亲水位点，顺利转移细胞质，数据上体现为样本制备成功率高。
4、本发明基于封闭的数字微流控系统的单细胞多组学测序文库构建，显著降低样品被外部环境污染的风险，数据上体现为单细胞样本比对率高。
5、本发明基于表面疏水的数字微流控芯片进行文库构建，减少文库构建过程中样品损失，数据上体现为单细胞样本CpG位点检出数高。
6、本发明基于微纳升反应体积的数字微流控芯片进行文库构建，提高反应效率的同时降低成本，数据上体现为单细胞GpC位点甲基化修饰效率高。
附图说明
图1为本发明实施例1中的的数字微流控芯片CAD设计俯视图。
图2为本发明实施例1中的电路控制系统两种模式图。
图3为使用本发明实施例1的数字微流控芯片进行液滴生成的液滴均一性表征结果图。
图4为使用本发明实施例1的数字微流控芯片进行液滴混匀的液滴混合效率结果图。
图5为本发明实施例2中单细胞分离的流程图。
图6为本发明实施例2的实验结果图之一，图中显示实施例2中获得的转录组文库的数据与单转录组文库具有一致的比对率和基因检出数。
图7为本发明实施例2中的实验结果图之二，图中显示实施例2中获得的DNA甲基化文库的比对率与基因各区域的甲基化水平也均与单甲基化数据一致。
图8为本发明实施例2中的实验结果图之三，图中显示实施例2中获得的染色质可及性文库可准确识别典型的染色质开放区域——DNase I酶超敏感位点。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
本实施例中，数字微流控芯片利用掩膜曝光、湿法刻蚀和lift-off工艺等光刻技术制成；具体的，该数字微流控芯片由上极板和下极板两部分组成，下极板包括基底、电极层、介质层和局部亲水化的疏水层，上极板为疏水化的地电极，上下极板平行相对，被间隙层相隔；
具备亲水位点的疏水层是由局部剥离技术形成的具有局部亲水化位点的疏水层，其经对准可在指定电极中央形成亲水位点，通过亲水结构的粘附作用捕获单细胞，不同实施例中亲水位点可以为不同形状，例如圆形、方形、半月形等，本发明实施例中优选为圆形；
下极板包含接触电极和驱动电极，如图1，1为接触电极，2为引线，3为驱动电极(分为下文的第一储液电极、第二储液电极、混合反应电极、第一输送电极、第二输送电极和)，接触电极与驱动电极通过引线一一对应连接，控制液滴的生成、分裂、融合和混匀；
从具体区域分布来看，本实施例的数字微流控芯片具有二单细胞分离反应单元，该单细胞分离反应单元具有一第一储液区、第二储液区和一混合反应区域；
第一储液区具有第一储液电极，
第二储液区具有第二储液电极，
混合反应区设有十五个混合反应电极和一用于捕获单细胞且直径为50-300μm的亲水位点，
第一储液区和通过三第一输送电极连通混合反应区，第二储液区和通过三第二输送电极连通混合反应区，通过第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合而形成的液滴的体积小于通过第二储液电极和最接近混合反应区的第二输送电极的通断电配合而形成的液滴的体积。
该数字微流控芯片的用于掩膜曝光的掩模版使用AutoCAD软件绘制而成，具体如图1所示，利用两个掩模版上的十字印记对齐亲水位点模板和电极层，随后在疏水层加工过程中在反应阵列中间的两个电极上方留下的亲水位点，方便后续使用数字微流控芯片高效地捕获单个细胞。
本实施例中数字微流控芯片的具体制作方法。
本实施例还包括成像系统和电路控制系统
成像系统位于数字微流控芯片正上方，用于获取所述成像区域内亲水位点处的图像信息。在细胞悬液液滴到达亲水位点后，分别进行明场、荧光场连续两次图像识别后，从而实现对单细胞捕获成功与否的判断；
电路控制系统通过控制驱动电极通断电，控制液滴的驱动，包含实时控制和分步控制两种模式，如图2，实时控制模式与分步控制模式分别控制液滴的逐步和连续运动。
本实施例的数字微流控制作工艺参见Ruan et al.,Sci.Adv.2020；6:eabd6454；Anal.Chem.2020,92,8599-8606进行，具体如下：
下极板的制作：
(a)下极板玻璃基底使用磁控溅射方法蒸镀300nm厚铬层，通过湿法刻蚀形成具有特定结构的铬电极阵列；
(b)介质层的材料为具有高介电常数、厚度均匀、抗击穿能力强的绝缘材料，本实施例中使用光刻胶通过旋涂的方式形成；
(c)疏水层的材料一般为特氟龙，本实施例中使用聚四氟乙烯PTFE水分散液通过局部剥离和套刻技术在指定电极中心形成局部亲水化的位点形成。
上极板的制作：
(a)上极板基底为任意绝缘透明材料，如玻璃；
(b)接地导电层材料选择透光率高、可见性好的材料，如ITO等，通过沉积形成；
(c)上极板疏水材料一般与下极板疏水材料一致，一般为Teflon，本实施例中使用聚四氟乙烯PTFE水分散液通过旋涂退火工艺形成。
上下极板之间填充2cSt硅油，防止液滴挥发同时辅助液滴驱动。
为了保证反应试剂在芯片上的良好驱动，在液滴中加入特定表面活性剂用以防止生物黏附。
优选的，疏水层中亲水位点的形状包括圆形、方形、半月形等，大小可由电极大小决定。一般的，用于捕获的亲水位点可以是50-300μm直径的圆形，例如100μm、150μm、200μm、250μm、300μm；且可根据反应体系设计反应体积大小，上下极板之间用一定厚度的胶带隔开，例如：60μm、120μm、180μm。一般的，电极大小越大时，需要上下极板间间距越大越好驱动液滴；此外，利用亲水位点进行单细胞捕获，单细胞捕获效率与细胞浓度和细胞沉降时间相关。例如细胞浓度为10^3个/μL、10^4个/μL、10^5个/μL等，细胞沉降时间为10s、15s、20s、25s等。
由于单细胞测序文库构建中各反应步骤反应体积严格成比例，液滴生成均一性及液滴混合效率影响建库平台稳定性，如图3、图4分别展示本实施例的微流控芯片的液滴生成均一性和液滴混合效率。
实施例2
一种基于实施例1的数字微流控芯片的单细胞三组学共建库方法，包括如下步骤：
(1)将细胞悬液(内含K562细胞，直径为20-30μm)置于第一储液区内，通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合，产生细胞悬液液滴，接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该细胞悬液液滴转移至上述亲水位点，使细胞悬液液滴中仅有一个细胞正对下方亲水部，断电静置使该细胞在重力的作用下自然沉降至亲水位点，此时给周围的混合反应电极通电以拖走整个细胞悬液液滴，亲水位点将留有含单个细胞的液滴(如图5所示)；
(2)清除第一储液区内的液体，将细胞膜裂解液置于第一储液区内，通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合，产生细胞膜裂解液液滴，接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该细胞膜裂解液液滴转移至上述亲水位点，冰上孵育对细胞膜进行裂解而保持细胞核膜完整，此时给周围的的混合反应电极通电以缓慢转移细胞质部分的液体，亲水位点将留有含单个细胞核的液滴，从而实现细胞核和细胞质的分离；
该细胞膜裂解液的配方如下表所示：
| 名称 | 用量μL |
| 2％triton | 1 |
| 40U/μL RI(1.25U/μL) | 0.5 |
| 20× | 0.5 |
| 水 | 8 |
| 总体积 | 10μL |
(3)清除第一储液区内的液体，将第一逆转录试剂置于第一储液区内，通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合，产生第一逆转录液滴，将第二逆转录试剂置于第二储液区内，通过第二储液区的第二储液电极和最接近混合反应区的第二输送电极的通断电配合，产生第二逆转录液滴，接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合以及该第二输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将第一逆转录液滴和第二逆转录液滴转移至与上述细胞质部分的液体混合，对细胞质中的RNA进行逆转录，获得细胞质逆转录产物；
第一逆转录试剂的配方如下表所示：
| 名称 | 体积μL |
| F68(0.5％) | 0.2 |
| oligo-dT(10μM) | 0.5 |
| dNTPs(10mM) | 0.5 |
| RI(40U/μL) | 0.6 |
| 总体积 | 1.8 |
第二逆转录试剂的配方如下表所示：
逆转录反应的程序如下表所示：
| 循环 | 温度(℃) | 时间 |
| 1 | 42 | 90min |
| 10 | 50 | 2min |
| 42 | 2min | |
| 1 | 70 | 15min |
| 4 | —— |
(4)将cDNA扩增试剂置于第二储液区内，通过第二储液区的第二储液电极和最接近混合反应区的第二输送电极的通断电配合，产生cDNA扩增液滴，接着通过该第二输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该cDNA扩增液滴转移并与细胞质逆转录产物混合，进行cDNA扩增反应，获得细胞质cDNA扩增产物；然后对该细胞质cDNA产物依次进行1xAMpure XP磁珠纯化和Tn5转座酶片段化后，进行PCR扩增并添加测序接头，进行illumina二代测序；
cDNA扩增试剂的配方如下表所示：
cDNA扩增反应的程序如下表所示：
| 循环 | 变性 | 退火 | 延伸 | 保持 |
| 1 | 98℃3min | - | - | - |
| 25 | 98℃20s | 67℃15s | 72℃6min | - |
| 1 | - | - | 72℃5min | - |
| - | - | - | 4℃ |
(5)清除第一储液区内的液体，将GpC甲基转移酶液置于第一储液区内，通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合，产生GpC甲基转移酶液滴，接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该GpC甲基转移酶液滴转移至上述亲水位点，与上述含单个细胞核的液滴混合，对细胞核中的开放染色质的GC位点进行甲基化标记；
GpC甲基转移酶液的配方如下表所示：
(6)清除第一储液区内的液体，将细胞核裂解液置于第一储液区内，通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合，产生细胞核裂解液液滴，接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该细胞核裂解液液滴转移至上述亲水位点，与其上的液体混匀，对细胞核进行裂解(37℃60min，65℃25min)；
细胞核裂解液的配方如下表所示：
| 名称 | 用量μL | 终浓度 |
| RLT | 3.8 | |
| 20×F68 | 0.2 | 1× |
(7)清除第一储液区内的液体，将亚硫酸氢盐转化试剂置于第一储液区内，通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合，产生亚硫酸氢盐转化液滴，接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该亚硫酸氢盐转化液滴转移至上述亲水位点，与其上的液体混匀，进行亚硫酸氢盐转化反应(亚硫酸氢盐为亚硫酸钠反应条件为98℃8min，64℃3.5h)；
(8)在步骤(7)所得的物料进行纯化后，进行五轮线性扩增和测序接头添加，然后进行PCR扩增、片段化选择，最后进行illumina二代测序。
依据以上步骤，本实施例获得不同K562细胞单细胞的转录组文库、DNA甲基化文库和染色质可及性文库。
作为对比，以被视为单细胞转录组文库构建金标准的smart-seq2方法构建了单细胞单转录组文库，与本实施例的获得的转录组数据进行比较。如图6所示，本实施例所得的转录组数据获得与samrt-seq2一致的高比对率和高基因检出率。本实施例平均可在单个细胞检测到13000个基因，充分展现了本实施例利用细胞质代替整个细胞进行基因表达分析的可行性。同样的，本实施例以被视为DNA甲基化文库构建金标准的scBS-seq方法构建了单细胞单甲基化组文库，与本实施例三组学平台的甲基化组数据进行比较。
如图7所示，本实施例获得的DNA甲基化文库数据具有比单甲基化更优异的比对率，这是因为GpC甲基转移酶的修饰有效减缓了亚硫酸盐文库构建过程中的碱基不平衡问题。此外，当本实施例将基因分成启动子、外显子、内含子等不同基因区域，本实施例与单甲基化组在各个基因区域呈现出一致的甲基化水平。以上数据展现了本实施例甲基化分析的准确性。
如图8所示，在染色质可及性分析部分，本实施例利用GpC甲基化信息成功识别出了DNaseI超灵敏位点这一典型的染色质开放区域。
综上，以上数据充分揭示了本实施例能够实现单细胞DNA甲基化、染色质可及性和转录组联合分析的可行性、准确性和优异性。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (10)
1.一种基于数字微流控芯片的单细胞三组学共建库方法，其特征在于：
该数字微流控芯片采用lift-off工艺制成，具有至少一单细胞分离反应单元，该单细胞分离反应单元具有一第一储液区、第二储液区和一混合反应区域，且该数字微流控芯片的相互平行上极板和下极板之间的间隙为60-180μm；
第一储液区具有第一储液电极，
第二储液区具有第二储液电极，
混合反应区设有多个混合反应电极和一用于捕获单细胞且直径为50-300μm的亲水位点，第一储液区和通过若干第一输送电极连通混合反应区，第二储液区和通过若干第二输送电极连通混合反应区，通过第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合而形成的液滴的体积小于通过第二储液电极和最接近混合反应区的第二输送电极的通断电配合而形成的液滴的体积；
具体包括如下步骤：
(1)将细胞悬液置于第一储液区内，通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合，产生细胞悬液液滴，接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该细胞悬液液滴转移至上述亲水位点，使细胞悬液液滴中仅有一个细胞正对下方亲水部，断电静置使该细胞在重力的作用下自然沉降至亲水位点，此时给周围的混合反应电极通电以拖走整个细胞悬液液滴，亲水位点将留有含单个细胞的液滴；
(2)清除第一储液区内的液体，将细胞膜裂解液置于第一储液区内，通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合，产生细胞膜裂解液液滴，接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该细胞膜裂解液液滴转移至上述亲水位点，冰上孵育对细胞膜进行裂解而保持细胞核膜完整，此时给周围的的混合反应电极通电以缓慢转移细胞质部分的液体，亲水位点将留有含单个细胞核的液滴，从而实现细胞核和细胞质的分离；
(3)清除第一储液区内的液体，将第一逆转录试剂置于第一储液区内，通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合，产生第一逆转录液滴，将第二逆转录试剂置于第二储液区内，通过第二储液区的第二储液电极和最接近混合反应区的第二输送电极的通断电配合，产生第二逆转录液滴，接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合以及该第二输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将第一逆转录液滴和第二逆转录液滴转移至与上述细胞质部分的液体混合，对细胞质中的RNA进行逆转录，获得细胞质逆转录产物；
(4)将cDNA扩增试剂置于第二储液区内，通过第二储液区的第二储液电极和最接近混合反应区的第二输送电极的通断电配合，产生cDNA扩增液滴，接着通过该第二输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该cDNA扩增液滴转移并与细胞质逆转录产物混合，进行cDNA扩增反应，获得细胞质cDNA扩增产物；然后对该细胞质cDNA产物依次进行片段化和纯化后，进行PCR扩增并添加测序接头，进行illumina二代测序；
(5)清除第一储液区内的液体，将GpC甲基转移酶液置于第一储液区内，通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合，产生GpC甲基转移酶液滴，接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该GpC甲基转移酶液滴转移至上述亲水位点，与上述含单个细胞核的液滴混合，对细胞核中的开放染色质的GC位点进行甲基化标记；
(6)清除第一储液区内的液体，将细胞核裂解液置于第一储液区内，通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合，产生细胞核裂解液液滴，接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该细胞核裂解液液滴转移至上述亲水位点，与其上的液体混匀，对细胞核进行裂解；
(7)清除第一储液区内的液体，将亚硫酸氢盐转化试剂置于第一储液区内，通过第一储液区的第一储液电极和最接近混合反应区的第一输送电极的通断电配合，产生亚硫酸氢盐转化液滴，接着通过该第一输送电极和多个混合反应电极的通断电配合，将该亚硫酸氢盐转化液滴转移至上述亲水位点，与其上的液体混匀，进行亚硫酸氢盐转化反应；
(8)在步骤(7)所得的物料进行纯化后，进行若干轮线性扩增和测序接头添加，然后进行PCR扩增、片段化选择，最后进行illumina二代测序。
2.如权利要求1所述的一种基于数字微流控芯片的单细胞三组学共建库方法，其特征在于：所述细胞膜裂解液的配方如下表所示：
。
3.如权利要求1所述的一种基于数字微流控芯片的单细胞三组学共建库方法，其特征在于：所述第一逆转录试剂的配方如下表所示：
所述第二逆转录试剂的配方如下表所示：
。
4.如权利要求3所述的一种基于数字微流控芯片的单细胞三组学共建库方法，其特征在于：所述逆转录反应的程序如下表所示：
5.如权利要求1所述的一种基于数字微流控芯片的单细胞三组学共建库方法，其特征在于：所述cDNA扩增试剂的配方如下表所示：
。
6.如权利要求5所述的一种基于数字微流控芯片的单细胞三组学共建库方法，其特征在于：所述cDNA扩增反应的程序如下表所示：
。
7.如权利要求1所述的一种基于数字微流控芯片的单细胞三组学共建库方法，其特征在于：所述GpC甲基转移酶液的配方如下表所示：
8.如权利要求7所述的一种基于数字微流控芯片的单细胞三组学共建库方法，其特征在于：所述对细胞核进行裂解的条件为：37℃60min，65℃25min。
9.如权利要求1所述的一种基于数字微流控芯片的单细胞三组学共建库方法，其特征在于：所述细胞核裂解液的配方如下表所示：
。
10.如权利要求1至9中任一权利要求所述的一种基于数字微流控芯片的单细胞三组学共建库方法，其特征在于：所述液滴为微纳升级液滴。
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