CN116790423A - 一株短乳杆菌及其在玉米或水稻秸秆微贮中的应用 - Google Patents
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Abstract
一株短乳杆菌及其在玉米或水稻秸秆微贮中的应用，本发明涉及一种乳杆菌及其应用。本发明解决了现有的玉米和水稻秸秆微贮菌剂定植能力差，纤维素木质素降解能力低的问题。本发明短乳杆菌R33，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO:M 20221362。所述菌株在玉米或水稻秸秆微贮中的应用。本发明的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33在玉米、水稻秸秆固态厌氧发酵条件下定植率较高；利用本发明短乳杆菌R33能显著降低玉米、水稻秸秆固体发酵2周后中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酸性洗涤木质素含量；同时还可以显著降低玉米、水稻秸秆固体发酵2周后的pH。利用本发明的菌株有效的改善了秸秆饲喂品质和消化率，实现秸秆饲料化的高效利用。
Description
技术领域
本发明涉及一种短乳杆菌及其在不同作物秸秆微贮应用。
背景技术
我国是农业大国，农作物秸秆种类繁多、产量巨大，年均产量约8.65亿t，其中以玉米和水稻秸秆为主，分别占秸秆总量的41.92％和23.23％，秸秆饲料化占比多年来在20％左右波动。秸秆饲料是支撑我国农区和农牧交错区肉牛和肉羊产业发展的重要粗饲料基础。但是，秸秆饲料利用中存在诸多限制因素，由于秸秆收获时高水分含量及露天贮存条件，导致秸秆霉变问题突出，另外秸秆粗纤维高、蛋白及消化率低也一直是制约秸秆饲料化的重要因素。因此，如何通过加工技术改善秸秆饲料品质和饲喂安全性是秸秆利用着重需解决的问题。秸秆微贮技术通过加入筛选的微生物菌剂，在密闭的厌氧条件下，促进秸秆纤维素，半纤维素和木质素的分解，改善秸秆的适口性，提高其消化率，微贮技术具有成本低、产生短链挥发酸、肽类等有利于反刍动物利用的营养优势，近年来微贮秸秆饲料化利用方式逐渐被国内外学者广泛关注。有效的菌剂是秸秆饲料微贮成功的关键，由于秸秆自身附着大量各种细菌和真菌微生物，因此添加菌剂安全性、竞争和定植能力及在厌氧发酵条件下对纤维素和木质素降解是高效秸秆微贮菌剂应具备的重要特征。因此，如何筛选高效安全微生物并有效应用于秸秆微贮是改善秸秆品质，实现秸秆饲料化高效利用的重要途径。
发明内容
本发明为了解决现有的玉米和水稻秸秆微贮菌剂定植能力差，纤维素木质素降解能力低的问题，提供了一株短乳杆菌及其在玉米和水稻秸秆微贮中的应用。
本发明一株短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 20221362。
所述短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33在玉米或水稻秸秆微贮中的应用。
具体的应用方法：将短乳杆菌R33菌液分别添加到玉米或水稻秸秆中，在温度为20～25℃的条件下发酵，完成玉米或水稻秸秆微贮；其中，秸秆中接种短乳杆菌有效接菌数为1×106cfu/g以上，所述的发酵是玉米或水稻秸秆固态发酵条件下进行厌氧发酵，发酵时间为2～3周，玉米和水稻秸秆的水分质量含量均为60％～70％。
本发明所述的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33在固体MRS培养基上菌落呈圆形、凸起、乳白色、不透明，菌落表面湿润，边缘整齐。革兰氏阳性菌，呈短杆状。短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33可生长于固体的MRS培养基。
本发明的有益效果：
本发明的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33在玉米、水稻秸秆固态厌氧发酵条件下定植率较高，在2周厌氧发酵后，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)在R33处理的玉米、水稻秸秆微生物组成占比达60.67％和78.45％，对照组玉米、水稻秸秆占比分别为23.83％和2.87％，短乳杆菌通过竞争定植成为秸秆微贮发酵的优势菌，同时抑制了有害菌梭菌增殖。
利用本发明短乳杆菌R33能显著降低玉米、水稻秸秆固体发酵2周后中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酸性洗涤木质素含量，R33菌液的添加使玉米秸秆中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酸性洗涤木质素含量分别降低了10.29％、8.96％和20.68％。R33菌液的添加使水稻秸秆中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酸性洗涤木质素含量分别降低8.27％、9.17％和39.17％。
利用短乳杆菌R33显著的降低了玉米、水稻秸秆固体发酵2周后的pH。即玉米秸秆pH对照组和短乳杆菌处理组分别为4.55和3.79，水稻秸秆pH对照组和短乳杆菌处理组分别为4.95和4.23。利用短乳杆菌R33有效的提高了玉米、水稻秸秆发酵产物中乳酸、乙酸和丙酸含量，抑制了丁酸的产生。
利用短乳杆菌R33显著提高了固体发酵2周后玉米、水稻秸秆的体外消化率，菌液处理玉米秸秆12、24、48和72小时体外干物质消化率分别提高28.42％、10.38％、5.78％和6.34；菌液处理水稻秸秆12、24、48和72小时体外干物质消化率分别提高50.76％、45.15％、23.05％和19.37％。
利用本发明的短乳杆菌R33能有效的改善了秸秆饲喂品质，用短乳杆菌R33微贮后的玉米或水稻秸秆即可进行饲喂，实现了秸秆饲料化的高效利用。
本发明短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为武汉大学，保藏日期为2022年9月1日，保藏编号为CCTCC NO:M20221362。
附图说明
图1为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33的菌落形态图；
图2具体实施方式一中短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33系统发育树；
图3为实施例1中短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33添加对玉米秸秆微生物组成的影响；
图4为实施例1短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33添加对水稻秸秆微生物组成的影响；
图5为实施例1不同剂量短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33添加对玉米秸秆微生物组成的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
具体实施方式一：本实施方式一株短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 20221362。
一、获得本实施方式的菌株方法为：
将5g燕麦草青贮放入250mL锥形瓶中，加入45mL无菌水，以120r/min的转速在30℃下恒温振荡30min，得到悬液；用灭菌后的枪头吸取1mL悬液进行10-1-10-9系列细胞浓度梯度稀释，分别取10-1、10-3、10-5、10-7、10-9浓度，5个梯度稀释液各取0.3mL于MRS分离培养基上，置于37℃恒温培养箱中倒置3天；待平板长出菌落后，根据菌落形态特征，用接种环挑取单个菌落接种于固体MRS培养基反复划线长出单一菌落。将初筛的菌种划线至固体MRS培养基中37℃培养24h后挑取少量菌，接种于50mL灭菌液体MRS培养基锥形瓶中进行菌种复壮。
经形态特征和分子鉴定(16s rDNA鉴定)为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，该菌株被命名为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33，获得时间为2021年7月28日，地点为：吉林省长春市中国科学院东北地理与农业生态研究所。
其中所述的MRS分离培养基：蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、吐温801mL、CH3COONa·3H2O 5g、(NH4)2HC6H5O7 2g、K2HPO4·3H2O 2g、MgSO4·7H2O0.58g、MnSO4·H2O 0.25g、琼脂粉18g，蒸馏水1L定容，121℃，灭菌30min。
所述的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33具体的形态特征和分子鉴定方法：
(1)短乳杆菌R33的形态特征：
本实施例筛选出的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33在固体MRS培养基上菌落呈圆形、凸起、乳白色、不透明，菌落表面湿润，边缘整齐。革兰氏阳性菌，呈短杆状，菌落形态图如图1所示。
(2)分子鉴定：
1)基因组DNA提取
将短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33菌株接种于液体MRS培养基中，37℃静置培养48h后获得菌悬液。将菌悬液离心，弃掉上清液后用无菌水洗涤再次离心，弃掉上清，获得纯净的菌体，然后按照基因组DNA纯化试剂盒(Promega)说明书对菌体进行基因组DNA提取。
2)16s rDNAPCR扩增
用细菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')扩增得到目的基因片段。PCR反应体系见表1。
表1 PCR反应体系
| 反应体系 | μL |
| PCR Mix | 21 |
| Primer F(5p) | 1 |
| Primer R(5p) | 1 |
| 模板(ng/ul) | 2 |
| 合计 | 25 |
反应条件为：96℃预变性5min；96℃20sec，62℃30sec，72℃30sec，循环数为35；最后72℃延伸10min，4℃保存。
3)PCR产物检测及纯化
3μL PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，观察条带性状。
PCR产物纯化按照GB/T 40171-2021《磁珠法DNA提取纯化试剂盒检测通则》中的磁珠纯化标准的操作流程操作。
将得到的测序序列与GenBank中的核酸数据进行BLAST(National CenterforBiotechnology Information[http://www.ncbi.nlm/nih.gov])同源性比对，结果显示，菌株R33与Lactobacillus brevis LB2H同源性为99.93％，用软件MOLECULAREVOLUTIONARYGENETIC ANALYSIS software(MEGA7.0)构建系统进化树，如图2所示，与Lactobacillusbrevis LB2H序列可构成稳定的进化分支，因此，将其命名为Lactobacillusbrevis R33。
具体实施方式二：具体实施方式一所述短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33在玉米和水稻秸秆微贮中的应用。
本实施方式具体的应用方法：将短乳杆菌R33菌液分别添加到玉米或水稻秸秆中，在温度为20～25℃的条件下发酵，完成玉米和水稻秸秆微贮；其中，秸秆中短乳杆菌有效接菌数为1×106cfu/g以上，所述的发酵是玉米和水稻秸秆固态发酵条件下进行，玉米秸秆和水稻秸秆的水分质量含量均控制在60％～70％，发酵条件为厌氧发酵，发酵时间为2～3周。
本实施方式中利用短乳杆菌R33微贮后的玉米或水稻秸秆即可进行饲喂。
实施例1：利本发明的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33对未灭菌玉米、水稻秸秆分别进行微贮，测定其对秸秆木质素和纤维素含量、发酵品质和消化率的影响。具体如下：
一、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33菌株的培养：
液体MRS培养基：蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、CH3COONa·3H2O 5g、(NH4)2HC6H5O7 2g、K2HPO4·3H2O 2g、MgSO4·7H2O 0.58g、MnSO4·H2O0.25g，蒸馏水1L定容，121℃，灭菌30min。
挑取纯化后的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33单菌落接种到液体MRS培养基中，37℃恒温摇床上200rpm/min培养48h后得到短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33菌液，备用；菌液浓度为1×109cfu/ml。
二、分别称取50g玉米秸秆和50g水稻的秸秆分别置于不同发酵袋中，向每个发酵袋中加入2.5ml步骤一的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33菌液和90mL蒸馏水(玉米秸秆R33菌液处理组、水稻秸秆R33菌液处理组)，设置对照组，对照组中仅添加90mL蒸馏水(玉米秸秆空白对照组、水稻秸秆空白对照组)，不加短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33菌液；保持玉米和水稻秸秆的水分含量均为62％～66％范围内，抽真空后密闭发酵袋，每组秸秆处理三个重复，2周之后称样品重量，测定菌液微贮对玉米和水稻秸秆化学组分影响。
结果显示：
短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33菌液发酵处理未灭菌玉米和水稻秸秆2周后，菌液处理组与空白对照组相比，玉米秸秆中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)和酸性洗涤木质素(ADL)含量分别降低10.29％、8.96％和20.68％；水稻秸秆中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酸性洗涤木质素含量分别降低8.27％％、9.17％和39.17％，如表2所示。
表2短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33对玉米和水稻秸秆营养组分的影响(干物质基础)
R33菌液发酵处理降低了玉米和水稻秸秆pH和氨态氮含量，提高了玉米秸秆乳酸、乙酸、丙酸和含量，提高了水稻秸秆乳酸和丙酸含量，抑制了丁酸的产生，如表3所示。
表3短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33对玉米和水稻秸秆发酵产物的影响(发酵样品)
R33菌液处理玉米秸秆12、24、48和72小时体外干物质消化率分别为32.04％、47.09％、53.95％和59.01％，对照组分别为24.95％、42.66％、51.00％和55.49％，菌液处理四个时间点体外消化率分别提高28.42％、10.38％、5.78％和6.34；菌液处理水稻秸秆12、24、48和72小时体外干物质消化率分别为31.33％、36.78％、49.48％和56.21％，对照组分别为20.78％、25.34％、40.21％和47.09％，菌液处理四个时间点体外消化率分别提高50.76％、45.15％、23.05％和19.37％，如表4所示。
表4短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33对玉米和水稻秸秆体外消化率的影响
R33菌液处理玉米和水稻秸秆，从门、属和种水平显著的改变了发酵秸秆的微生物组成，如图3和图4所示，图3是短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33添加对玉米秸秆微生物组成的影响(图中R33-1、R33-2、R33-3和CK-1、CK-2、CK-3分别为R33和空白对照处理的三个重复)；图4短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33添加对水稻秸秆微生物组成的影响(图中R33-1、R33-2、R33-3和CK-1、CK-2、CK-3分别为R33和空白对照处理的三个重复)。从图3和图4可以看出，在2周厌氧发酵后，乳酸菌属占比在R33菌液处理玉米和水稻秸秆微生物组成占比达61.73％和80.43％，对照组玉米和水稻秸秆占比分别为26.72％和7.50％，在种的水平，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)在R33处理的玉米和水稻秸秆微生物组成占比达60.67％和78.45％，短乳杆菌在对照组玉米和水稻秸秆占比分别为23.83％和2.87％。短乳杆菌R33通过竞争定植成为玉米和水稻秸秆微贮发酵的优势菌；同时抑制了有害菌梭菌增殖，R33处理的玉米和水稻秸秆梭菌纲基本未检出，玉米和水稻秸秆对照组梭菌纲占比分别为2.66％和4.98％。由此可见，本申请所述的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33能有竞争过土著菌，成为优势菌落，同时还可以抑制有害菌的增值，本申请的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33在玉米、水稻秸秆微贮中能更好的发挥作用。
三、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33接种量
第一组(1×107cfu/gR33菌液处理)：向含有50g玉米秸秆于发酵袋中，加入0.5ml短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33菌液，使得短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33菌液接种量为1×107cfu/g，同时加入90mL蒸馏水；
第二组(1×106cfu/gR33菌液处理)：向含有50g玉米秸秆于发酵袋中，加入0.05ml短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33菌液，使得短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33菌液接种量为1×106cfu/g，同时加入90mL蒸馏水；
第三组(CK空白组)：向含有50g玉米秸秆于发酵袋中，不接种短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)R33菌液，仅加入90mL蒸馏水。
每组实验均保持玉米秸秆的水分含量为62％～66％范围内，抽真空后密闭发酵袋，每组处理三个重复，2周后测定接菌量对微贮玉米秸秆微生物组成的影响。
不同浓度R33菌液处理玉米秸秆，从门、属和种水平显著的改变了发酵秸秆的微生物组成，在2周厌氧发酵后，对照组、1×106cfu/g和1×107cfu/g R33菌液处理玉米乳酸菌属在属水平占比分别为33.87％、55.01％和50.56％，在种水平占比分别为11.73％、51.97％和44.20％，1×106cfu/g短乳杆菌R33接种量通过竞争定植成为玉米秸秆微贮发酵的优势菌，结果如图5所示(图中106为1×106cfu/gR33菌液处理组、107为1×107cfu/gR33菌液处理组、CK为空白组)。
Claims (2)
1.一株短乳杆菌，其特征在于短乳杆菌(Lactobacillus brevis)R33，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 20221362。
2.如权利要求1所述的菌株在玉米或水稻秸秆微贮中的应用。
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