CN116785433A

CN116785433A - 一种光热-光动力驱动no释放协同阳离子杀菌材料及其应用

Info

Publication number: CN116785433A
Application number: CN202311033687.4A
Authority: CN
Inventors: 王军; 周宝龙; 王斌; 王静
Original assignee: Weifang Medical University
Current assignee: Weifang Medical University
Priority date: 2023-08-17
Filing date: 2023-08-17
Publication date: 2023-09-22
Anticipated expiration: 2043-08-17
Also published as: CN116785433B

Abstract

本发明公开了一种光热‑光动力驱动NO释放协同阳离子杀菌材料及其应用，属于生物医药技术领域。本发明将氟硼二吡咯化合物（Bodipy）和三氨基胍盐酸盐经脱水缩合反应得到多孔聚合物BG‑POP；将多孔聚合物与硝普钠共同加入水中混合，得到光热‑光动力驱动NO释放协同阳离子杀菌材料BG‑SNP。本发明制备得到的功能材料BG‑SNP，具有的光热活性、光动力活性、阳离子杀菌和气体NO协同杀菌，四合一治疗作用，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭率最高可达99.5%，杀菌效果好、生物相容性好、溶血率低。

Description

一种光热-光动力驱动NO释放协同阳离子杀菌材料及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种光热-光动力驱动NO释放协同阳离子杀菌材料及其应用。

背景技术

以高发病率和高致死率为特征的病原性细菌感染仍然是一个突出且不断增长的全球性健康问题，每年导致全球数百万人死亡，并随着细菌耐药性的出现而进一步加剧。耐药菌株，尤其是多药耐药的"超级细菌"，主要来源于化学合成抗生素的过度使用或误用，对生态平衡造成严重威胁和无法控制的副作用。毫无疑问，迫切需要开发替代抗菌药物或新的抗菌方法来缓解或解决抗生素耐药性的风险。

以光动力力疗法（PDT）和光热疗法（PTT）为主的光疗法因其无创、高效的特点，在解决细菌耐药性问题上得到蓬勃发展。与其他疗法不同，PDT和PTT都是在光敏剂（PSs）存在下通过激光照射诱导产生，PTT通过局部热疗导致不可逆的细菌损伤甚至破坏，PDT通过产生活性氧（reactⅣeoxygenspecies，ROS）发挥杀菌作用。带正电荷的胍盐及其衍生物同时具有膜结合和穿膜能力，作为抗菌剂引起了广泛的研究关注。同时，内源性一氧化氮（NO）分子也作为气体抗菌剂具有强效的抗菌作用。然而，很多报道表明单一模式的治疗往往难以完全杀灭细菌，且易复发。为了获得理想的治疗效果，通常需要大剂量的药物进行较长时间治疗，这通常会对正常组织造成不必要的副作用。申请号为CN114940734A的专利公开了一种双阳离子共价有机骨架负载硝普钠复合物及其制备方法和应用，将三咪唑醛与吡啶胺合成具咪唑鎓阳离子和吡啶鎓阳离子的双阳离子多孔框架载体，对硝普钠进行负载制备了双阳离子COF@SNP复合物，实现光热、阳离子和NO三种方式共同抗菌。

为了提高治疗效果，新兴的多模式联合治疗策略作为抗菌治疗的新选择被广泛研究，该策略可以在较低治疗药物剂量下达到较高的治疗效果。此外，联合治疗不仅可以显著提高治疗的选择性，还可以显著缩短治疗时间，从而大大降低对正常组织的毒性。因此需要不断对杀菌平台进行设计，将多种杀菌方式整合，进一步提高杀菌效果、生物相容性并降低溶血率。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种光热-光动力驱动NO释放协同阳离子杀菌材料及其应用。本发明制备得到的功能材料BG-SNP，具有的光热活性、光动力活性、阳离子杀菌和气体NO协同杀菌，四合一治疗作用，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭率最高可达99.5%，杀菌效果好、生物相容性好、溶血率低。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种光热-光动力驱动NO释放协同阳离子杀菌材料，所述光热-光动力驱动NO释放协同阳离子杀菌材料由以下方法制备：

将氟硼二吡咯化合物（Bodipy）和三氨基胍盐酸盐经脱水缩合反应得到多孔聚合物BG-POP；将多孔聚合物与硝普钠共同加入水中混合，得到光热-光动力驱动NO释放协同阳离子杀菌材料BG-SNP；

所述氟硼二吡咯化合物的结构式如式I所示，

式I。

优选的，所述氟硼二吡咯化合物、三氨基胍盐酸盐和硝普钠的摩尔比为3：2：8。

优选的，所述脱水缩合反应为：

将氟硼二吡咯化合物和三氨基胍盐酸盐加入混合溶剂中进行溶剂热反应。

优选的，所述混合溶剂为1,4-二氧六环和水的混合液；所述1,4-二氧六环和水的体积比为2：0.6。

优选的，所述溶剂热反应的温度为120℃，所述溶剂热反应的时间为72h。

本发明的第二方面，提供光热-光动力驱动NO释放协同阳离子杀菌材料在制备抗菌药物中的应用。

优选的，所述抗菌药物用于杀灭致病细菌；所述致病细菌为大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。

本发明的有益效果：

（1）本发明的制备方法简单，只需进行溶剂热反应即可得到多孔载药平台，在常温搅拌下，即可载药成功，大大降低了制备成本。

（2）本发明制备的杀菌材料BG-SNP在激光照射下具有光热活性、光动力活性、阳离子杀菌和NO气体杀菌作用，经1.0W·cm^-2的638nm激光照射升温，局部升温产生活性氧，驱动SNP产生NO，协同带正电荷的阳离子，实现光热-光动力驱动NO释放协同阳离子杀菌的作用。

（3）本发明的杀菌材料对人体无毒副作用，可以用于体内杀菌；并且具有良好的生物相容性，溶血率未超过3%。

附图说明

图1是Bodipy的单体核磁图；

图2是三氨基胍类盐酸盐、Bodipy、BG-POP、SNP和BG-SNP的红外光谱图；

图3是BG-POP和BG-SNP的TEM图像和元素映射，其中（a）为BG-POP在200nm比例尺下的TEM图像；（b）为BG-POP在50nm比例尺下的TEM图；（c）为BG-POP在10nm比例尺下的TEM图；（d）为BG-SNP在200nm比例尺下的TEM图像；（e）为BG-SNP在50nm比例尺下的TEM图像；（f）为BG-SNP在10nm比例尺下的TEM图像；（g）为BG-SNP的元素映射；（h）~（o）为BG-SNP的C、N、B、F、Fe、Na、O和Cl元素映射；

图4是BG-POP和BG-SNP的X射线衍射（XRD）图谱；

图5是BG-SNP的多孔结构分析图，其中（a）为BG-SNP的N₂吸附/解吸曲线；（b）为BG-SNP的孔径分布情况；

图6是BG-SNP的光热性能图，其中（a）为不同浓度的BG-SNP水悬浮液在激光照射下的温度升高曲线；（b）为不同功率密度638nm激光照射下BG-POP水悬浮液（250μg/ml）的温升曲线；（c）为BG-SNP水悬浮液的相应红外热图像；（d）为BG-SNP水悬浮液在三个循环中的光热分布；（e）为用近红外激光（638nm，1W·cm^-2）处理BG-POP水悬浮液600秒，然后冷却得到的红外照片；（f）冷却阶段获得的线性时间数据与-lnθ的曲线图；

图7是NO释放标准曲线；

图8是NO释放曲线，其中（a）为BG-SNP（638nm,1W·cm^-2,1mg/mL）的可控NO释放曲线；（b）为BG-POP、BG-SNP和SNP在1.0W·cm^-2激光照射下的NO释放曲线；

图9是紫外吸收曲线；其中（a）为DPBF在638nm照射后的紫外吸收曲线；（b）为75μg/mL浓度的BG-SNP在638nm照射后的紫外吸收曲线；（c）为75μg/mL浓度的BG-SNP在638nm照射后的紫外吸收曲线；（d）为75μg/mL浓度的BG-SNP在638nm照射后的紫外吸收曲线；（e）为DPBF和不同浓度BG-SNP在光照条件下吸收衰减斜率的比较；（f）为BG-SNP在不同光照下DPBF混合后，DPBF在417nm处的紫外吸收变化；

图10是不同浓度BG-SNP体外抗菌实验，（a）为不同浓度处理的金黄色葡萄球菌的菌落图像；（b）为不同浓度处理后金黄色葡萄球菌的细菌活力值；（c）为不同浓度处理的大肠杆菌的菌落图像；（d）为不同浓度处理后大肠杆菌的细菌活力值；

图11是不同处理组的体外抗菌试验；其中（a）为不同处理后金黄葡萄球菌的菌落图像；（b）不同处理后金黄色葡萄球菌的细菌活力值；（c）为不同处理后大肠杆菌的菌落图像；（d）为不同处理后大肠杆菌的细菌活力值；

图12是不同处理的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌与PI/SYTO9（标尺=200um,照射时间=10min）孵育后的荧光图像；

图13不同处理后金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的透射电镜观察；比例尺为2μm；

图14是细胞活力实验，其中（a）为L929细胞的细胞活力实验，（b）为HL-7702细胞的细胞活力实验；

图15是溶血率实验；其中（a）是不同浓度BG-POP的溶血率，（b）是不同浓度BG-SNP的溶血率；

图16是肉眼观察PBS、SNP、BG-POP、BG-POP+激光、BG-SNP和BG-SNP+激光处理金黄色葡萄球菌感染伤口的愈合过程；

图17是体外试验治疗期间小鼠体重变化；

图18是金黄色葡萄球菌感染伤口经各组处理后第9天的苏木精和伊红（H&E）染色图，比例尺500μm；

图19是治疗9天后收集各组代表性主要脏器（包括心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色图像，比例尺为200nm；

图20是BODIPY的合成路线图；

图21是BG-POP的合成路线图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分介绍的，多模式的联合治疗不仅可以显著提高治疗的选择性，还可以显著缩短治疗时间，从而大大降低对正常组织的毒性。因此需要不断对杀菌平台进行设计，将多种杀菌方式整合，进一步提高杀菌效果、生物相容性并降低溶血率。

基于此，本发明的目的是提供一种光热-光动力驱动NO释放协同阳离子杀菌材料及其应用。本发明通过Bodipy的醛基和三氨基胍盐酸盐的胺基进行席夫碱反应，脱水缩合聚合得到多孔聚合物，然后通过常温搅拌载入硝普纳，得到抗菌材料。在638nm激光（1.0Wcm^-2）下照射10min，无论是大肠杆菌还是金黄色葡萄球菌，杀菌率均在99.5%以上，具有良好的杀菌效果。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例

（1）Bodipy的合成：在惰性气氛下，将新蒸馏的苯甲醛（2.1 mL, 20mmol）和2，4-二甲基吡咯（5 mL, 48 mmol, 2.4 equiv）溶于干燥的CH₂Cl₂（80 mL）中，然后加入3滴三氟乙酸（TFA），在24℃下搅拌12h。在反应混合物中加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌（DDQ）（5.54g, 20mmol）。5min后，依次向上述反应中加入三乙胺（20mL）和三氟化硼乙醚BF₃·OEt₂（20mL）。继续搅拌1h后淬灭。用CH₂Cl₂萃取3次。合并的有机层用盐水洗涤，Na₂SO₄干燥，真空浓缩。所得粗品经闪式柱层析（硅胶,正己烷:乙酸乙酯=10:1）纯化得到S1深红色固体。

在室温下，将化合物S1（100mg,0.22mmol）（15mL）加入到DMF（4mL）和POCl₃（4mL）的混合液中。室温搅拌2h后，用去离子水淬灭反应，用CH₂Cl₂萃取。合并的有机层用盐水洗涤，Na₂SO₄干燥，真空浓缩。所得粗品经闪式柱色谱（硅胶,正己烷:乙酸乙酯=5:1）纯化得到S2深红色固体，将化合物S2（100mg,0.20mmol）（15mL）加入到DMF（4mL）和POCl₃（4mL）的混合液中。室温搅拌2h后，用去离子水淬灭反应，用CH₂Cl₂萃取。合并的有机层用盐水洗涤，Na₂SO₄干燥，真空浓缩。粗品经闪式柱色谱（硅胶,正己烷:乙酸乙酯=5:1）纯化得到Bodipy，为深红色固体，合成路线见图20。¹HNMR（400MHz,CDCl3）：δ=10.06（s,2H），7.64~7.54（m,3H），7.35~7.28（m,2H），2.88（s,6H），1.71（s,6H）。

（2）BG-POP聚合物的制备：将BODIPY（101.824mg0.2mmol）和三氨基胍盐酸盐（28mg，0.2mmol）的混合物、二氧六环与水的混合溶剂（二氧六环与水的体积比2：0.6）2.6mL填充到Pyrex管中。在氮气保护下，反应体系超声脱气30min。然后将Pyrex管密封，在120℃下反应3天，得到BG-POP沉淀。产物分别用DCM、THF和丙酮彻底洗涤，90℃干燥过夜，得到BG-POP聚合物，合成路线见图21。

（3）将1mg的BG - POP和8mg的SNP与2 mL H₂O在棕色瓶中混合，常温避光搅拌24 h后将混合溶液以8000rm的速度离心，除去上清液，得到黑色固体，然后用水洗涤固体三次、冷冻干燥24h得到BG-SNP。

表征：

（1）红外光谱的测定：利用红外光谱确定功能材料BG-SNP的结构，分别取3mg的单体三氨基胍盐酸盐、Bodipy、SNP、BG-POP和BG-SNP与干燥溴化钾粉末在研钵中充分研磨，然后放置压片模具中压制成透明无裂痕的模片，将压片放置于红外光谱扫描仪中在400-4500cm^-2范围内扫描36圈。

傅里叶变换红外光谱（FT-IR）用于验证BG-SNP聚合物的结构。从图2可以看出，除了1073、1172和1669cm^-1归属于Bodipy的特征振动带外，在1631cm^-1处还可以从FT-IR中清晰地观察到由反应单体之间的醛氨缩合形成的亚胺键（C=N）的特征峰。同时，TG的N-H伸缩振动（3208cm^-1）在BG-POP的FTIR中消失。由于带正电荷的BG-POP与带负电荷的亚硝基五草酸铁阴离子之间存在较强的静电作用，导致SNP（1943cm^-1处的N=O）的特征峰在BG-SNP中蓝移至1905cm^-1处。

（2）透射电镜TEM：将超声分解后的BG-SNP聚合物甲醇分散液滴加到铜网上，阴干后得到观察样本，将样本装至TEM中观察样本形貌并拍照，导出样本元素分析图及各种元素的原子含量表。图3（d）-图3（f）是BG-SNP的TEM形貌图，从高分辨TEM图，经过观察均匀分布的微孔。另外，图3（g）-图3（o）是元素mapping图，显示了BG-SNP各种元素的均匀分布。

（3）X射线光电子能谱的测定：图4对BG-SNP进行了X射线衍射（XRD）检测，结果显示功能材料只有一个宽泛峰，验证了上述高分辨TEM的结论。

（4）图5（a）是N₂吸附解吸曲线，BG-POP具有Ⅳ型等温线的特征，在吸附和脱附曲线的分支处具有明显的滞后环，表明介孔主导的孔结构，有利于SNP的负载。计算得到BG-POP的比表面积为27.1m²g^-1，负载硝普钠后比表面积降至19.3m²g^-1。同样，计算孔隙体积也从0.091下降到0.024m³g^-1。如图5（b）所示，BG-SNP的孔径分布曲线（PSD）比BG-POP宽得多。BG-POP的主孔分布在4.73nm处，包覆SNP后主孔分布向2.80nm偏移，表明SNP存在于介孔主导的孔道中。

（5）BG-SNP的光热性能：

绘制光热曲线：将不同浓度（50、100、150、200、250µgmL^-1）的BG-SNP水悬液分别加入到1.5mL的EP管中，用水作为空白对照组，将样品放置于热成像仪下并用638nm激光照射10min，记录其升温过程及温度成像。不同功率密度的功能材料升温曲线测试方法和上述类似，BG-SNP浓度为250μg/mL，将混悬液放置在热成像仪下，并用不同功率密度（0.5、0.8、1.0、1.5W·cm^-2）的638nm激光照射样品10min，记录其温度变化过程。另外，用加热/冷却循环评价BG-SNP的光热稳定性，用1.0W·cm^-2的638nm近红外激光照射1mL的BG-SNP（250µgmL^-1）水悬浮液，照射10min后关闭激光，待水悬浮液的稳定降到室温后再次打开激光，如此开启/关闭激光三次，记录材料三个周期的升温降温过程。

光热转换效率的计算：利用加热/冷却循环中降温过程来计算光热转换效率：

η= [hS（T_max-T_surr）-Q_Dis]/I（1-10^-A638）（公式1）

h：传热系数；

S：容器的表面积；

T_max：照射10min后的平衡温度；

T_surr：周围环境温度；

Q_Dis：指测试单元的散热；

I代表638nm激光功率（1W·cm^-2）；

A₆₃₈：FcMC水悬浮液溶液在638nm处的吸光度。hS的值是根据以下公式确定的：

hS=m_dC_d/_S（公式2）

m_d：水溶剂的质量（1g），

C_d：水溶剂的热容量（4.2J/g），

_S：指冷却时间的斜率与温度的负自然对数，有以下公式确定：

（公式3）

Ө：T_surr与T_max的比值，

t：最高温度降温到室温所用的时间。

BG-SNP的温度响应行为依赖于激光的浓度和功率。在1.0W激光照射下（图6（a）），温度随着时间的延长或浓度的增加而急剧升高。例如，在浓度为250ug/mL时，在360s内温度从27.5升高到59.2℃。作为空白对照组，纯水在相同实验条件下仅表现出可忽略不计的升温（0.8℃）。同样，从图6（b）中可以看出，温度也随着激光功率的增加而显著升高，在10 min（638nm，250ug/mL）以内的1.0W激光辐照下，温度甚至升高到74.5℃。从红外热成像记录（图6（c））中也可以直观地观察到优异的光热性能，从图中可以看出，随着时间的增加，热图像逐渐变亮。此外，循环测试证明了BG-SNP优异的光稳定性（图6（d）），在连续3次开/关循环后几乎没有温度波动。通过单个供热/制冷循环的温度变化趋势计算了BG-POP的光热转换效率（η）（图6（e））。由图可知，BG-SNP的η值为21.4%。

（6）一氧化氮释放的标准曲线测定：将试剂盒中1 M的NaNO₂稀释成浓度为6.25 µM、12.5 µM、25 µM、50 µM、100 µM 的稀溶液，将其分为三个平行组加入到96孔板中，然后依次将 50 μL Griess ReagentI 和 50 μL Griess Reagent II 加入到96孔板对应的孔中，避光孵育15min后，然后用全波长酶标仪测试混合物在 540nm 处的吸光度。以 NaNO₂的浓度为 X 轴，以吸光度为 Y 轴绘制标准曲线，见图7。

（7）一氧化氮释放测试

使用Griess试剂盒检测BG-SNP的NO释放。亚硝酸盐（NO^2-）由NO与Griess试剂（0.2%萘乙二胺二盐酸盐和2%磺胺和5%磷酸中）反应生成，可间接定量NO的释放，生成特征性红粉色的偶氮衍生物。将BG-SNP（2 mL，1mg/mL）水悬液添加到石英试管中，并使用808nm激光（1W cm^-2）照射设定时间。激光照射完成后，离心所得样品（18000 rpm，10min）以移除干扰NO检测的BG-SNP。吸取上清液50 μL，到96孔板，然后将50 μL Griess I和50 μL Griess II依次添加到对应的孔中，避光并孵育10min。将吸取完上清液的混合液超声成悬浮液，然后用808nm激光接着照射对应时间，重复上述操作。最后将96孔板放置全波长酶标仪中测量540nm处的吸光度。BG-SNP的开始/停止释放NO测试，操作跟上述类似，关闭激光后离心取上清液至96孔板中，然后超声混合液至混悬液，避光静止对应时间再离心取上清液至96孔板中，依次加入Griess I和II，避光孵育10min后测量其在540 nm处的吸光度。在638nm激光照射下，BG-SNP的NO含量随时间增加而增加，13min后趋于平缓。然而，与BG-SNP相比，裸SNP和BG-POP在相同实验条件下的NO释放量可忽略不计（图8（b））。此外，开关释放测试（图8（a））揭示了BG-SNP的可控NO释放能力。在激光照射下，NO迅速释放。但是，随着激光的关闭，释放迅速停止。它随着激光的开启而再次释放。该测试进一步验证了BG-SNP的激光控制气体释放能力，这对于实际应用是非常必要的。

（8）光动力力测试：为了验证BG-SNP产生单线活性氧的能力，以二苯基异苯并呋喃（DPBF）作为检测ROS的指示剂。配制5个不同浓度的样品（0、75、100、150ug/mL），在638nm激光照射6min，记录每1min的光谱。此外，对BG-SNP的稳定性也进行了研究。首先用W=1.0W·cm^-2的638nm激光照射四个浓度为150ug/mL的样品。将样品分别照射0、3、5、7min，然后依次加入DPBF，在638nm，W=1.0w·cm^-2激光下照射6min。记录每1min的紫外吸收光谱。如图9所示，在638nm激光照射（1.0W·cm^-2）下，除DPBF变化不明显外（图9（a）），UV-Vis分光光度计采集的DPBF在417nm处的特征吸光度（图9（b）-图9（d））随着照射时间的延长而逐渐降低，表明BG-SNP具有突出的ROS生成能力。如图9（e）所示，随着BG-SNP浓度的增加，DPBF在417nm处的紫外吸收值迅速降低。当浓度达到150ug/mL时，DPBF在10min内下降了91.2%，表明BG-SNP在激光照射下能明显产生¹O₂。如图9（f）所示，随着光照时间的延长，DPBF在417nm处的紫外吸收逐渐降低，但吸收值的变化基本一致。结果表明BG-SNP具有光动力力稳定性。

试验例1：体外抗菌试验

（1）细菌培养：本试验采用了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌两种细菌，利用二代细菌（OD600=0.1）来完成以下实验。

实验中使用了革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌。通过从LB平板接种单个细菌菌落来繁殖二代细菌，将单个一代菌落悬浮于5 mL无菌液体LB培养基中，在恒温培养箱中37°C，110 rpm振荡12h。通过使用紫外分光光度计测量600 nm下的培养基吸光率来估计细菌数量（OD600=0.1等于10⁸CFU mL^-1）。

（1）平板计数法测定BG-SNP的抗菌活性：取100μL浓度为10⁸CFU mL^-1的菌液（大肠杆菌或金黄葡萄球菌）和50、100、150、200、250μL BG-SNP水悬液（1mg/mL）加入到2mL EP管中，加入无菌中性PBS，使每个EP管终体积为1mL，材料终浓度为50、100、150、200、250μg/mL，以1mL无菌中性PBS作为对照组；用638nm激光（1.0W·cm^-2）照射10min。最后取100μL菌悬液均匀涂布于固体培养基中，37℃培养24h，计算菌落数，并与对照平板上的菌落数进行比较，评价细菌的相对活性。

图10可知，与PBS组相比，在（638nm,1.0W·cm^-2）激光照射10min下，随着BG-SNP的增加，细菌的存活能力显著降低。随着BG-SNP浓度依次递增：50、100、150、200、250μg/mL，金黄色葡萄球菌的存活率由7.80±0.04%逐步降低至2.18±0.031%、1.11±0.14%、0.76±0.094%、0.31±0.091%。与此同时，在浓度250μg/mL时，BG-SNP对大肠杆菌和金黄葡萄球菌的抑菌率分别高达95.11±0.81%和98.89±0.14%，超过了大部分POP或COF基抗菌剂。

目前普遍认为具有外层细胞膜特异性保护作用的革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌更难被杀灭。由于带正电荷的BG-SNP与带负电荷的细菌之间的强相互作用，克服了革兰氏阴性菌难杀灭的问题。大肠杆菌在BG-SNP处理下的存活率为38.8±1.99%（50μg/mL）、14.36±1.24%（100μg/mL）、4.89±0.81%（150μg/mL）、1.14±0.029%（200μg/mL）；因此本发明的BG-SNP可以有效抑制革兰氏阴性菌大肠杆菌。

为了研究各因素对抑菌效果的影响，将细菌分别用（Ⅰ）PBS+激光、（Ⅱ）SNP+激光、（Ⅲ）BG-POP+激光、（Ⅳ）BG-SNP+激光、（Ⅴ）PBS、（Ⅵ）SNP、（Ⅶ）BG-POP、（Ⅷ）BG-SNP进行处理，样品浓度均为250μg/mL。根据图11可以看出，BG-SNP+激光的抑菌效果明显优于非光照组，说明BG-SNP能利用光能杀死细菌。同时，与裸SNP和PBS组相比，BG-POP处理的细菌对金黄葡萄球菌和大肠杆菌的杀菌活性分别为21.99±0.63%和27.04±3.42%。这一结果说明了阳离子在杀菌过程中的作用。与BG-POP+激光组相比，进一步联合PTT驱动的NO气体治疗的BG-SNP+激光组表现出更强的杀菌作用，几乎100%的细菌被杀灭。SNP+激光组对对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率分别仅为11.81%和7.23%；BG-POP+激光组对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率分别为83.32±0.23%和75.64±0.66%。因此，可以看出BG-SNP+激光组的多模态协同杀菌作用的优势。

试验例2：细菌活/死染色试验与细菌透射电镜

SYTO-9和PI用于区分活/死细菌。SYTO-9由于穿透所有细菌膜（完整和受损）而将细菌标记为绿色，而PI只能穿透受损的细胞膜，将细菌标记为红色。将PBS（空白对照组）、SNP、BG-POP、BG-SNP、PBS+激光、SNP+激光、BG-POP+激光、BG-SNP+激光八个组，以相同体积（除PBS外，其余组的浓度均为250µg/mL）分别与400µL大肠杆菌或金黄色葡萄球菌（10⁸CFUmL^-1）共培养12h，然后吸取100μL的细菌悬浮与20µLSYTO-9（1.0×10^-3M）和20µLPI（1.5×10^-3M）在37℃黑暗处理10min。染色结束后，吸取10μL置于载玻片表面。使用60倍放大的倒置荧光显微镜，观察染色的大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的图像。

采用绿色荧光核酸染料（SYTO-9）和红色荧光碘化物（PI）进行活/死染色实验，进一步阐述BG-SNP对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效果。图12给出了不同处理下大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的绿色（活菌）和红色（死菌）通道的融合荧光图像。可以明显看出，该结果与菌落计数法所得结果具有较好的一致性。BG-SNP+激光组的杀菌效果明显高于BG-SNP、BG-POP+激光、BG-POP、SNP+激光、SNP、PBS+激光和PBS组，几乎所有的细菌都被标记为红色。对于空白对照组，绝大多数大肠杆菌和金黄葡萄球菌均存活，且被绿色标记，与体外抑菌实验结果一致。裸露的SNP在有光或无光条件下均表现出强烈的绿色荧光，但激光照射后更多的细菌被染成红色。而未经光照处理的BG-POP（250µg/mL）的金黄葡萄球菌和大肠杆菌则表现出明显的红色荧光，这可归因于BG-POP中的阳离子破坏了细菌表面结构，导致细菌死亡。激光照射后，BG-POP+激光组的红色荧光增强，表明照射产生的光疗与阳离子协同作用，增强抗菌效果。在无激光条件下，BG-SNP组仍有较强的绿色荧光，而在BG-SNP+激光组中，所有细菌均被红色标记。这些结果进一步证明了四位一体抗菌策略的优越性。

将细菌分别与按照活/死染设置的八个组共培养12h之后，用2.50%戊二醛溶液固定细菌，经PBS洗涤之后包埋并封闭。而后依次用低浓度到高浓度的乙醇脱水，再用丙酮脱醇，最后经梯度渗透包埋，负染后即可放置TEM下观察

通过TEM直接观察了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表面的损伤情况。从图13可以看出，PBS组和PBS+激光组中的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有完整的表面形态，说明单独的激光对细菌没有破坏作用。然而，与体外抗菌实验的结果一致，其他组处理下的细菌表现出不同程度的细胞膜损伤。与无激光照射组相比，有激光照射组的细胞形态变化更为严重。其中，BG-SNP+激光组的细菌损伤最为显著，细胞膜发生崩溃，有分裂融合的趋势。

试验例3：细胞毒性试验与溶血试验

在96孔板中，以每孔5×10³个细胞的密度接种L929细胞（上海贤文生物科技有限公司）和HL-7702细胞（上海贤文生物科技有限公司），每孔100µL细胞，在周围的复孔中加入100µLPBS进行封液，防止细胞过度蒸发。孵育24h后，加入不同浓度的BG-SNP进行处理。染毒24h后，弃上清，每孔加入含10µLMTT（5mg/mL）溶液的培养液，加入等体积的PBS（pH=7.4）。4小时后，吸去上清，加入100µL的DMSO溶解MTT-甲酰胺晶体。5min后，在酶标仪上于490nm波长处测定吸光度。各组均重复3次。

如图14所示，除正常细胞（L929细胞和HL-7702细胞）与裸SNP（250μg/mL）孵育后细胞存活率低于80%外，BG-POP和BG-SNP孵育24h后的细胞存活率均在85%以上，揭示了BG-POP和BG-SNP在抗菌浓度（0~250μg/mL）时对人正常细胞的低毒性。

溶血实验：取BALB/c雌性小鼠获得新鲜血液。1500rpm离心20min收集红细胞（RBC），用PBS洗涤3次。将RBC（4%w/w）与（1000~125µg/mL）的SNP、BG-POP和BG-SNP以1/9（Ⅴ/Ⅴ）的比例在37℃孵育3h，以12000rpm离心20min。通过紫外可见光谱法在540nm处测定。蒸馏水作为阳性对照，PBS作为阴性对照。使用公式4计算材料的溶血率。

溶血率（%）=（As-An）/（Ap-An）×100%（公式4）

其中“As”是向红细胞悬液中加入BG-POP、SNP和BG-SNP在540nm处产生的吸光度值；An表示向红细胞（阴性对照）中加入PBS孵育，离心后吸取上清液的吸光度。Ap是指向红细胞（阳性对照）中加入蒸馏水后的吸光度。

图15的溶血实验表明BG-SNP具有良好的血液相容性，即使在500μg/mL的高浓度下，其溶血率也低于3%。

试验例4：体内抗菌实验

42只六周龄的雌性BALB/c小鼠（小鼠购于济南杰瑞康生物科技有限公司），随机分为7组，每组6只。麻醉后将小鼠背部剃毛，在小鼠背部制造d=5mm的伤口，用金黄色葡萄球菌（10⁴CFUmL^-1）预处理72小时。伤口感染后，在伤口表面滴加BG-POP和BG-SNP溶液。光照组照射（1.0W·cm^-2）10min，非光照组不照射。每日记录小鼠体重，并于第0、3、6、9天拍照记录创面愈合情况。

如图16所示，造模后第3天，各组小鼠创面均明显收缩。第6天时，小鼠创面均有不同程度的愈合，尤其是治疗组。治疗后第9天，光照组创面几乎完全愈合，明显优于非光照组。与第3天出现化脓的对照组和不光照组（PBS、SNP、BG-POP和BG-SNP）不同，BG-POP+激光和BG-SNP+激光处理的伤口呈现明显的恢复趋势。在第9天，BG-SNP+激光组的伤口愈合程度（伤口愈合程度=(S₀-S_n)/S₀；S₀为第0天的伤口面积；Sn为第n天的伤口面积）达到93.81±1.97%，远高于BG-POP+激光组和SNP组，进一步证实了四合一协同抗菌在加速开放性伤口愈合方面的显著作用。如图17所示，小鼠体重仅在伤口形成的前两天下降，其余时间小鼠体重稳步上升。通过苏木精-伊红（H&E）和Masson'strichrome染色评估治疗9天后的创面愈合情况（图18）。对伤口皮肤进行组织学分析，对照组和SNP组出现明显的结痂，而其他组均出现不同程度的愈合。与无激光组相比，联合激光组表现出更好的修复效果，肉芽组织和新生血管出现。BG-SNP+激光治疗后瘢痕明显变小甚至消失，出现明显的上皮组织，并伴有大量毛囊等皮肤附着物。同时，还可以清楚地观察到皮肤组织的厚上皮区，以及新生血管。说明BG-SNP中高浓度的NO在光热介导的NO释放后可能在一定程度上促进了伤口愈合。Masson三色染色结果与H&E染色结果一致，其中BG-SNP+激光处理组可见最明显的新生腺体和毛细血管。此外，小鼠各器官的H&E染色（图19）显示没有明显的组织学变化，包括炎症和主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的损伤。这些结果证明了BG-SNP在体内的超生物安全性。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种光热-光动力驱动NO释放协同阳离子杀菌材料，其特征在于，所述光热-光动力驱动NO释放协同阳离子杀菌材料由以下方法制备：

将氟硼二吡咯化合物和三氨基胍盐酸盐经脱水缩合反应得到多孔聚合物；将多孔聚合物与硝普钠共同加入水中混合，得到光热-光动力驱动NO释放协同阳离子杀菌材料；

所述氟硼二吡咯化合物的结构式如式I所示，

式I。

2.根据权利要求1所述的光热-光动力驱动NO释放协同阳离子杀菌材料，其特征在于，所述氟硼二吡咯化合物、三氨基胍盐酸盐和硝普钠的摩尔比为3：2：8。

3.根据权利要求1所述的光热-光动力驱动NO释放协同阳离子杀菌材料，其特征在于，所述脱水缩合反应为：

4.根据权利要求3所述的光热-光动力驱动NO释放协同阳离子杀菌材料，其特征在于，所述混合溶剂为1,4-二氧六环和水的混合液；所述1,4-二氧六环和水的体积比为2：0.6。

5.根据权利要求3所述的光热-光动力驱动NO释放协同阳离子杀菌材料，其特征在于，所述溶剂热反应的温度为120℃，所述溶剂热反应的时间为72h。

6.权利要求1~5任一项所述的光热-光动力驱动NO释放协同阳离子杀菌材料在制备抗菌药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗菌药物用于杀灭致病细菌；所述致病细菌为大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。