CN116769608A - 一株金龟子绿僵菌及绿僵菌颗粒剂的制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物菌剂技术领域，具体涉及一种金龟子绿僵菌以及颗粒剂及其制备方法和应用。本发明提供的一株金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)NMMa198，所述金龟子绿僵菌NMMa198的保藏编号为CGMCCNo.40148。施用本发明提供的金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)NMMa198的活性物质制备的金龟子绿僵菌颗粒剂防治沙葱萤叶甲，10d后高剂量应用组的防控效果可达80％以上，金龟子绿僵菌颗粒剂还具有促进沙葱及其他牧草生长的作用。可见，本发明的金龟子绿僵菌颗粒剂在草原牧草害虫防治中具有良好的应用前景。

Description

一株金龟子绿僵菌及绿僵菌颗粒剂的制备和应用
技术领域
本发明属于微生物菌剂技术领域，具体涉及一株金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)NMMa198及其绿僵菌颗粒剂的制备和应用。
背景技术
沙葱萤叶甲是一种在土中生活，危害沙葱、多根葱、野韭等百合科葱属植物茎叶的草原重要害虫。这种害虫在温度过高、过低时多躲藏于草场牛粪或石块下，每年4月下旬至5月底为幼虫暴食期，严重危害沙葱等草场植物，萤叶甲害虫发生严重时，草场植物被扫劫一空，严重影响草原生态和畜牧业生产健康发展。
目前，对沙葱萤叶甲的防治主要以化学药剂为主，例如辛硫磷等能够快速有效的杀灭沙葱萤叶甲。化学药剂具有速效性好的优点。但是，长期大量使用化学农药存在以下危害或隐患：第一，在对害虫进行杀伤毒害的同时，对害虫的“天敌”、传粉昆虫、鸟类等益虫益鸟也有杀伤作用，破坏自然界的生态平衡。第二，大量使用化学农药，使农药在环境中逐渐积累，尤其是在土壤和水体中，产生农药污染环境问题。第三，化学农药被牧草吸收、进入动物体内，经过生物富集浓缩，使其毒性更大，这就不仅使得害虫的天敌更易受到毒害作用，而且可能通过食物链威胁人类健康；并且，即使不考虑生物富集作用，农药残留也会直接影响食品安全，影响农作物的生产和贸易。第四，长期大量使用化学农药，容易使害虫产生抗药性，不仅影响害虫防治效果，而且会陷入为了保障防治效果不断增加化学农药使用剂量的恶性循环。目前，防止农药污染已成为当前世界上很多国家关切的重点，化学农药滥用相比于虫害会产生更为严重和深远的危害。
采用微生物进行害虫生物防治已经在许多农林地区较为广泛使用，虽然现有技术中已经报道了黄绿绿僵菌与杀虫剂联合用于防治萤叶甲，如现有技术(参见“绿僵菌与3种杀虫剂混用对沙葱萤叶甲的协同作用”，常静，农药学学报，20141212)中的绿僵菌为黄绿绿僵菌，茚虫威与黄绿绿僵菌混用增效作用最强，黄绿绿僵菌与化学药剂共同施用，仍然存在上述的破坏自然界的生态平衡、农药污染环境、威胁人类健康、抗性增强的缺陷，而单独使用绿僵菌时LT50值为12.94d，可见单一应用黄绿绿僵菌的沙葱萤叶甲防治效果并不太理想。现有技术中还没有高效杀虫真菌用于防治沙葱萤叶甲的报道。
发明内容
本发明的目的提供一株金龟子绿僵菌NMMa198及其金龟子绿僵菌制剂，利用本发明提供的金龟子绿僵菌NMMa198制备的金龟子绿僵菌制剂防治沙葱萤叶甲的效果好。
为了解决上述技术问题，提供了以下技术方案：
本发明提供了一株金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)NMMa198，所述金龟子绿僵菌NMMa198的保藏编号为CGMCCNo.40148。
本发明提供了一种金龟子绿僵菌制剂，所述金龟子绿僵菌制剂的活性成分包括上述技术方案所述的金龟子绿僵菌NMMa198的分生孢子和/或NMMa198的微菌核。
优选的，所述金龟子绿僵菌制剂中的分生孢子个数大于等于1.0×109个分生孢子/g；所述金龟子绿僵菌制剂中的微菌核个数大于等于1.0×107个微菌核/g。
优选的，所述金龟子绿僵菌NMMa198分生孢子的制备方法包括如下步骤：
对金龟子绿僵菌NMMa198分生孢子进行液相发酵培养得到液体种子液，将所述液体种子液接种到固体发酵物料进行固体发酵培养后分离得到分生孢子粉；
所述液体种子液与固体发酵物料的体积质量比为1L:10Kg；
所述液相发酵培养的温度为26～28℃，转速为200～250rpm，时间为56～72h；所述固体发酵培养的温度为25～27℃，固体发酵时间为10～15d。
优选的，所述金龟子绿僵菌NMMa198微菌核的制备方法包括如下步骤：
对金龟子绿僵菌NMMa198进行平板培养得到分生孢子，将所得分生孢子接种于微菌核诱导培养液进行诱导发酵培养得到含有微菌核的发酵产物；
接种于微菌核诱导培养液的分生孢子悬液的孢子浓度为1×108～1×109个孢子/mL；所述诱导发酵培养的温度为25～28℃，诱导发酵培养的转速为200～250rpm，所述诱导发酵培养的时间为5～7d；
所述平板培养的温度为26～28℃，平板培养时间为7～14d。
优选的，所述金龟子绿僵菌制剂的剂型包括颗粒剂、粉剂或可湿性粉剂；
所述颗粒剂包括孢子型绿僵菌颗粒剂或微菌核型绿僵菌颗粒剂；
按质量份计，所述分生孢子型绿僵菌颗粒剂包括如下组分：1～6份金龟子绿僵菌NMMa198分生孢子粉、3～5份助剂和90～94份发酵基质；
按质量份计，所述微菌核型绿僵菌颗粒剂包括如下组分：10～20份金龟子绿僵菌NMMa198微菌核母粉、3～5份助剂和75～85份基质；所述基质包括发酵基质和/或载体基质；
所述金龟子绿僵菌NMMa198微菌核母粉为含有金龟子绿僵菌NMMa198微菌核的发酵产物与载体基质的混合物；
所述发酵基质包括提取金龟子绿僵菌NMMa198分生孢子后剩余的固体发酵物料；所述载体基质包括硅藻土、高岭土、凹凸棒土和陶土中的一种或几种。
优选的，所述助剂包括腐植酸钾和/或黄原胶。
本发明提供了上述技术方案所述金龟子绿僵菌NMMa198或上述技术方案所述金龟子绿僵菌制剂在防治牧草害虫中的应用。
优选的，所述牧草害虫包括沙葱萤叶甲、牧草叶甲、跳甲和蛴螬中的一种或多种。
优选的，所述应用方式包括将所述绿僵菌颗粒剂与分散剂均匀混合后撒施，所述混合时金龟子绿僵菌颗粒剂与分散剂的质量比为1:10～1:20，所述分散剂包括有机肥或细土。
本发明的有益效果：本发明提供的一株金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)NMMa198，所述金龟子绿僵菌NMMa198的保藏编号为CGMCCNo.40148，所述金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)NMMa198的杀虫活性成分为发酵产物分生孢子或微菌核，能够防治沙葱萤叶甲、草原牧草叶甲。实施例结果表明：应用本发明提供的一株金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)NMMa198的活性成分制备的绿僵菌颗粒剂对沙葱萤叶甲有较好的防治效果，施用本发明提供的金龟子绿僵菌颗粒剂10d后防控效果可达到85％以上，金龟子绿僵菌颗粒剂还具有明显的促进沙葱及其他牧草生长的作用。可见，本发明的金龟子绿僵菌颗粒剂在草原害虫防治中具有良好的应用前景。
生物保藏说明
金龟子绿僵菌NMMa198(Metarhiziumanisopliae)于2022年3月18日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCulture CollectionCenter，CGMCC)，保藏号为：CGMCCNo.40148，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中金龟子绿僵菌NMMa198的僵虫形态图。
具体实施方式
本发明提供了一株金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)NMMa198，所述金龟子绿僵菌NMMa198的保藏编号为CGMCCNo.40148。
在本发明中，所述金龟子绿僵菌NMMa198的ITS序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述金龟子绿僵菌NMMa198优选从萤叶甲僵虫中分离得到，所述金龟子绿僵菌NMMa198具有液固两相发酵生产效率高、产孢量大的优点。本发明所述金龟子绿僵菌NMMa198主要感染鞘翅目害虫，除了感染沙葱萤叶甲外，还可以侵染跳甲、蛴螬等多种鞘翅目害虫。
本发明所述金龟子绿僵菌NMMa198产孢后初期菌落黄绿色，绒毛状，后期转变为绿色，菌落的基质色素为黄褐色，孢子色泽为黄绿色，菌丝形态为白色有分枝分隔，分生孢子长椭圆形，两端钝圆，孢子的直径和长度分别为(4.3～5.2)μm×(10.9～12.6)μm。
本发明提供了一种金龟子绿僵菌制剂，所述金龟子绿僵菌制剂的活性成分包括所述金龟子绿僵菌为上述技术方案所述的金龟子绿僵菌NMMa198的分生孢子和/或NMMa198的微菌核。
本发明所述金龟子绿僵菌制剂中的分生孢子个数优选大于等于1.0×109个分生孢子/g；所述金龟子绿僵菌制剂中的微菌核个数优选大于等于1.0×107个微菌核/g。
本发明优选所述金龟子绿僵菌制剂的剂型包括颗粒剂、粉剂或可湿性粉剂。本发明创造性地利用金龟子绿僵菌NMMa198孢子和/或金龟子绿僵菌NMMa198微菌核制备的金龟子绿僵菌颗粒剂，能够有效的控制沙葱萤叶甲及多种草原甲虫危害。本发明制备的金龟子绿僵菌颗粒剂具有抗逆性强、存储期长的优点。
当本发明所述金龟子绿僵菌制剂优选为颗粒剂时，本发明所述颗粒剂优选包括孢子型绿僵菌颗粒剂或微菌核型绿僵菌颗粒剂。
按质量份计，本发明所述孢子型绿僵菌颗粒剂优选包括如下组分：1～6份金龟子绿僵菌NMMa198分生孢子粉、3～5份助剂和90～94份基质。
本发明所述金龟子绿僵菌NMMa198分生孢子的制备方法优选包括如下步骤：对金龟子绿僵菌NMMa198分生孢子进行液相发酵培养得到液体种子液，将所述液体种子液接种于固体发酵物料进行固体发酵培养后分离得到分生孢子粉。
在进行液相发酵培养之前，本发明优选对金龟子绿僵菌NMMa198菌种进行平板培养活化得到分生孢子。所述平板培养时，本发明优选将金龟子绿僵菌NMMa198划线接种于固体1/4SDAY平板上。
在本发明中，所述固体1/4SDAY培养基的组成已在制备金龟子绿僵菌NMMa198微菌核方案中论述，在此不再赘述。
在本发明中，所述平板1/4SDAY培养基的pH优选为5.0～7.5，进一步优选pH为6.0～7.0，更优选pH为6.5。
在本发明中，所述1/4SDAY平板培养的时间优选为7～14d，进一步优选为12.5～13.5d，更优选为13d。所述发酵温度优选为26～28℃，进一步优选为26～27℃，更优选为26℃。本发明所述发酵培养优选为恒温培养。本发明所述发酵培养优选为暗培养，在培养箱中进行。在发酵培养时中，本发明优选培养基表面产生大量分生孢子后停止发酵(见优选发酵时间)停止培养，在无菌条件下刮取成熟的金龟子绿僵菌NMMa198分生孢子作为生产菌种。
本发明优选利用无菌水将所述金龟子绿僵菌NMMa198分生孢子配制成分生孢子悬液，所述分生孢子悬液的孢子含量优选为1×108～1×109个孢子/mL，配制分生孢子悬液时本发明优选在无菌水中添加吐温-80，所述吐温-80的添加量为无菌水的0.1％(V:V)。
获得金龟子绿僵菌NMMa198分生孢子悬液后，本发明优选利用绿僵菌NMMa198分生孢子悬液进行液相发酵培养获得液体种子液。在本发明中，液相发酵培养基优选为改良的SDY液体培养基，所述改良的SDY液体培养基配制时以蒸馏水为溶剂，优选的包括以下质量浓度的组分：蔗糖10～30g/L，酵母浸膏1.5～4.5g/L和蛋白胨1～3g/L，进一步优选为蔗糖10～20g/L，酵母浸膏1.5～3.5g/L和蛋白胨1～2g/L，更优选为蔗糖10g/L，酵母浸膏1.5g/L和蛋白胨2g/L。在本发明中，所述液相发酵培养基的pH优选为5.0～7.5，进一步优选为6.0～7.0，更优选为6.5。
在本发明中，所述液相发酵培养的时间优选为56～72h，进一步优选为60～72h，更优选为72h。所述液相发酵温度优选为26～28℃，进一步优选为26.5～27.5℃，更优选为27℃。本发明所述液相发酵培养的转速优选为200～250rpm，进一步优选为220～250rpm，更优选为240rpm。
本发明所述液相发酵培养时优选利用1L的三角瓶，每个1L的三角瓶中装液体培养基200mL，三角瓶的液体培养基的装料量为20％。本发明所述液相发酵培养优选在摇床上进行。在液相发酵过程中，本发明优选产生大量菌丝及孢子后停止发酵(见优选液相发酵培养时间)，得到金龟子绿僵菌NMMa198液体种子液。本发明所述液体种子液是菌丝与孢子的混合体。
获得金龟子绿僵菌NMMa198液体种子液后，本发明优选采用麦麸或大米作为发酵物料对所述种子液进行固体发酵培养获得孢子粉，发酵物料更优选为大米。该菌株在发酵物料上生长迅速，产孢量大，不易感杂，具有其他菌株不可比拟的优良生产性能。本发明所述金龟子绿僵菌NMMa198菌株的孢子粉收率为1.5～2.0％。
本发明对所述发酵物料的麦麸或大米的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。本发明所述发酵物料麦麸或大米即为发酵基质。
在本发明中，所述大米发酵物料的制备方法优选为：按照大米和水的体积比优选为2:1的比例，利用水浸泡大米2h后进行高温灭菌。本发明优选将大米发酵物料装入聚乙烯发酵袋中扎紧袋口后进行高温灭菌。在本发明中，每个聚乙烯发酵袋优选装入吸水后的大米500g，本发明所述聚乙烯发酵袋的规格优选为50cm×40cm。本发明所述高温灭菌的条件优选为121℃，30min。
所述固体发酵培养时，本发明优选将金龟子绿僵菌NMMa198液体种子液接种于灭菌后的大米发酵物料混匀后进行固体发酵培养。本发明所述绿僵菌NMMa198液体种子液与大米的体积质量比优选为1L:10kg。本发明对所述混匀的方式没有特殊限定，采用常规的无菌操作方式混匀即可。
在本发明中，所述固体发酵培养的温度优选为25～27℃，进一步优选为25.5～26.5℃，更优选为26℃；时间优选为10～15d，进一步优选为11～15d，更优选为15d。在本发明中，所述固体发酵培养的相对湿度优选为80～90％，进一步优选为82～88％，更优选为85％。
本发明所述固体发酵培养优选在培养架上进行，金龟子绿僵菌NMMa198液体种子液与大米混匀后将发酵袋单层放于培养架上静置发酵。
在固体发酵培养中，本发明优选发酵15d(基质上长满绿色孢子粉)后停止发酵，得到金龟子绿僵菌NMMa198分生孢子。
本发明优选收集绿僵菌NMMa198分生孢子于室温吹风干燥后过筛得到分生孢子干粉。所述过筛优选为100～200目振荡筛。在本发明中，所述金龟子绿僵菌NMMa198培养物进行吹风干燥的时间优选为2～3d。本发明优选利用血球计数板计数法统计分生孢子的含孢量，本发明生产的分生孢子粉的含孢量为300亿/g。本发明所述绿僵菌NMMa198分生孢子也可以通过旋风分离机分离。
本发明提供的孢子型绿僵菌颗粒剂包括3～5份助剂，优选为3.5～5份，更优选为4～5份。本发明所述助剂优选包括腐植酸钾和/或黄原胶，本发明所述腐植酸钾和黄原胶的pH值<8.0。本发明中添加腐植酸钾能够为绿僵菌孢子提供营养物质，延长分生孢子的在野外的存活期；本发明中的黄原胶可以提高分生孢子在虫体或植物表面的附着力，有利于活性成分附着于牧草和害虫体表。添加助剂有利于金龟子绿僵菌NMMa198微菌核和分生孢子的环境生存及发挥抗逆作用，确保了金龟子绿僵菌颗粒剂的杀虫活性。
本发明对所述腐植酸钾优化为矿源黄腐酸，pH优化为8以下；黄原胶的来源没有特殊限定，采用常规的市售产品即可。
以助剂的质量份为基准，本发明提供的分生孢子型绿僵菌颗粒剂包括1～6份金龟子绿僵菌NMMa198分生孢子，更优选为4份；
以助剂的质量份为基准，本发明提供的孢子型绿僵菌颗粒剂包括90～94份发酵基质，更优选为91份。在本发明中，所述孢子型绿僵菌颗粒剂中的基质优选包括发酵基质；所述发酵基质优选为提取金龟子绿僵菌NMMa198分生孢子后剩余的固体发酵物料，所述发酵物料优选包括麦麸或大米。本发明所述发酵后基质作为颗粒剂成分能够使金龟子绿僵菌NMMa198施用后在野外的活性维持更长的时间。
本发明提供的微菌核型绿僵菌颗粒剂，按质量份计，所述微菌核型绿僵菌颗粒剂优选包括如下组分：10～20份金龟子绿僵菌NMMa198微菌核母粉、3～5份助剂和75～85份基质。
在本发明中，所述金龟子绿僵菌NMMa198微菌核的发酵方法优选包括如下步骤：
对金龟子绿僵菌NMMa198进行平板培养得到的分生孢子，将所得分生孢子接种于微菌核诱导培养液发酵培养得到含有微菌核的发酵产物。
在本发明中，所述平板培养时绿僵菌NMMa198优选接种于固体1/4SDAY或固体SDAY培养基上进行平板培养。本发明所述固体SDAY培养基配制时以蒸馏水为溶剂，优选的包括以下质量浓度的组分：蔗糖5～30g/L，酵母粉5～20g/L，蛋白胨5～20g/L和琼脂粉20g/L；更优选为蔗糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L和琼脂粉20g/L。在本发明中，所述固体SDAY培养基的pH优选为5.0～7.5，进一步优选为6.0～7.0，更优选为6.5。本发明所述固体1/4SDAY培养基配制时以蒸馏水为溶剂，优选的包括以下质量浓度的组分：蔗糖10g/L，酵母浸膏2.0g/L，蛋白胨2g/L和琼脂20g/L。在本发明中，所述固体1/4SDAY培养基的pH优选为5.0～7.5，进一步优选为6.0～7.0，更优选为6.5。
在本发明中，所述平板培养的时间优选为7～14d，进一步优选为12.5～14.0d，更优选为13d。在本发明中，所述平板培养温度优选为26～28℃，进一步优选为26～27℃，更优选为26℃。本发明所述平板培养优选为恒温培养。本发明所述平板培养优选为暗培养在培养箱内进行。在本发明所述平板培养中，待培养基表面出现大量绿色分生孢子后停止培养(见优选发酵时间)，得到绿僵菌NMMa198分生孢子。
平板培养后，得到金龟子绿僵菌NMMa198分生孢子。本发明优选将所述金龟子绿僵菌NMMa198分生孢子制备成分生孢子悬液接种于微菌核诱导培养液进行发酵培养得到微菌核。本发明所述分生孢子悬液中孢子浓度优选为1×108～1×109个孢子/mL。本发明所述分生孢子悬液优选利用无菌水配制。本发明所述无菌水中添加吐温-80，优选的所述吐温-80的添加量为无菌水体积的0.1％。本发明所述发酵培养的接种方式优选为倾倒法。
在本发明中，所述微菌核诱导培养液优选为蔗糖、酵母粉、蛋白胨和无机盐组成，所述微菌核诱导培养液配制时优选以蒸馏水为溶剂，优选包括以下质量浓度的组分：10～40g/L蔗糖，5～20g/L酵母粉，5～20g/L蛋白胨，3～6g/LKH2PO4，0.5～1.0g/LCaCl2·2H2O，0.3～1.0g/LMg2SO4·7H2O，0.01～0.05g/LZnSO4·7H2O，0.05～0.2g/LFeSO4·7H2O，0.01～0.06g/LCoCl2·6H2O和0.01～0.05g/LMnSO4·H2O；更优选为包括：蔗糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，4g/LKH2PO4，0.6g/LCaCl2·2H2O，0.5g/LMg2SO4·7H2O，0.02g/LZnSO4·7H2O，0.1g/LFeSO4·7H2O，0.03g/LCoCl2·6H2O和0.02g/LMnSO4·H2O。在本发明中，所述微菌核诱导培养液的pH优选为5.0～7.5，进一步优选为6.0～7.0，更优选为6.5。
本发明优选将所述金龟子绿僵菌NMMa198分生孢子制备成分生孢子悬液接种于微菌核诱导培养液进行发酵培养得到含有微菌核的发酵产物。本发明所述将分生孢子接种于微菌核诱导培养液进行发酵培养时，分生孢子悬液与微菌核诱导培养液的体积比优选为1L：10L。本发明中，接种于微菌核诱导培养液进行发酵培养的时间优选为5～7d，进一步优选为5～6d，更优选为5d；发酵培养的温度优选为25～28℃，进一步优选为25.5～26.5℃，更优选为26℃；发酵培养的转速优选为200～250rpm，进一步优选为220～240rpm，更优选为230rpm。
本发明制备微菌核的发酵培养优选包括小试发酵培养或中试发酵培养。本发明制备微菌核的小试发酵培养优选利用1L的三角瓶完成，每个1L的三角瓶中装微菌核诱导培养液200mL，三角瓶的装料量为三角瓶体积的20％，所述小试发酵培养优选在摇床上进行。本发明制备微菌核的中试发酵培养优选利用30L液体发酵罐完成，液体发酵罐的装料量为液体发酵罐体积的80％。本发明所述中试发酵培养和小试发酵培养的发酵参数相同，发酵参数在上文已经论述，在此不再赘述。
得到含有微菌核的发酵产物后，本发明优选将含有含有微菌核的发酵产物与载体基质混合后干燥得到微菌核母粉；本发明所述载体基质优选包括硅藻土、高岭土、凹凸棒土和陶土中的一种或几种，更优选为硅藻土，本发明所述混合时含有微菌核的发酵产物与载体基质的体积比优选为1：(1～3)，更优选为1:2。
本发明提供的微菌核型绿僵菌颗粒剂优选包括3～5份助剂，进一步优选为3.5～5份，更优选为4～5份。本发明所述助剂的参数同孢子型绿僵菌颗粒剂中助剂的参数，在此不再赘述。添加助剂有利于金龟子绿僵菌NMMa198微菌核的环境生存及发挥抗逆作用，确保了金龟子绿僵菌颗粒剂的杀虫活性。
以助剂的质量份为基准，本发明提供的金龟子绿僵菌微菌核颗粒剂包括10～20份金龟子绿僵菌NMMa198微菌核母粉，更优选为15份；
以助剂的质量份为基准，本发明提供的金龟子绿僵菌微菌核颗粒剂包括75～90份基质，优选为80～85份，更优选为81份。
在本发明中，所述微菌核型绿僵菌颗粒剂中的基质优选包括发酵基质和/或载体基质，进一步优选为载体基质或发酵基质，更优选为发酵基质；所述载体基质包括硅藻土、高岭土、凹凸棒土和陶土中的一种或几种，更优选为硅藻土。本发明所述发酵基质优选为提取金龟子绿僵菌NMMa198分生孢子后剩余的固体发酵物料；本发明初始发酵物料优选包括麦麸或大米。
本发明所述金龟子绿僵菌NMMa198采用液体发酵方式产生微菌核作为活性成分。与分生孢子相比，微菌核具有更好的抗逆境能力，能够在干旱、强紫外线环境下长久保存活力。
在本发明中，所述金龟子绿僵菌NMMa198活性物质(分生孢子或微菌核)、助剂和基质的质量份之和优选为100份。
本发明所述金龟子绿僵菌颗粒剂的制备技术方案优选为将所述金龟子绿僵菌NMMa198活性成分与助剂混合后，再与基质混合得到金龟子绿僵菌制剂。本发明对所述混合方式没有特殊限定，采用常规的方式即可。
本发明还提供了上述技术方案所述金龟子绿僵菌NMMa198或上述技术方案所述金龟子绿僵菌制剂在防治牧草害虫中的应用。
本发明所述牧草害虫包括靶标害虫沙葱萤叶甲、牧草叶甲、跳甲和蛴螬中的一种或多种，本发明所述牧草叶甲指能危害牧草的一类叶甲的总称。
本发明所述应用方式包括将所述绿僵菌颗粒剂与分散剂均匀混合后撒施，所述混合时金龟子绿僵菌颗粒剂与分散剂的质量比为1:10～1:20，所述分散剂包括有机肥或细土；所述混合时金龟子绿僵菌颗粒剂与分散剂的质量比优选为1:10～1:20，进一步优选为1:12～1:17，更优选为1:15。在本发明中，所述分散剂的pH值小于8。本发明所述分散剂的作用为使金龟子绿僵菌颗粒剂使用时撒播均匀：金龟子绿僵菌颗粒剂量少，直接施用不易撒均匀。
本发明中的金龟子绿僵菌颗粒剂施用时未添加任何化学药剂，仅单独使用金龟子绿僵菌颗粒剂。金龟子绿僵菌颗粒剂施药处理10d后，防效即达到化学药剂高效氯氰菊酯及常用生物制剂苦参碱水平，相对防效达到80％以上。而且有着持续控制作用。
本发明所述撒施优选利用机动喷粉机完成，本发明对所述施用器械的来源和产品型号没有特殊限定，采用常规产品即可。本发明根据施用器械选择金龟子绿僵菌颗粒剂与分散剂的混合方式，保证将推荐用量金龟子绿僵菌颗粒剂均匀施入草场即可。
本发明对所述作为分散剂的有机肥没有特殊限定，任意的有机肥产品都可以，只要pH值小于8即可。本发明实施例中，所述有机肥优选为牛羊粪有机肥料。本发明所述细土或有机肥粒径应低于1.0mm以利于喷粉机喷出。本发明对所述细土的来源没有特殊限定，采用常规的细土即可。
采用本发明的金龟子绿僵菌颗粒剂进行杀虫，能够不用或少用化学农药，降低草原农药污染。本发明的金龟子绿僵菌颗粒剂还具有促进牧草生长的作用，提高牧草品质和单位面积草量。
本发明的金龟子绿僵菌颗粒剂可以单独用于沙葱萤叶甲的防控；但是，不排除还可以与其它生物或化学药物组合使用，如与苦参碱、甲维盐和高效氯氰菊酯粉剂按适当比例减量混用，可以增加杀虫谱，加快对害虫的击倒速度。参与混合的其他杀虫剂或生化制剂应该为非水剂且其pH值小于8.0。
本发明的金龟子绿僵菌分生孢子及微菌核，也可以根据产品需求制成各种剂型，例如粉剂或可湿性粉剂等，只要添加相应的辅助成分即可，在此不作具体限定。
本发明的金龟子绿僵菌颗粒剂不仅能够杀灭沙葱萤叶甲，还对除萤叶甲之外的其他牧草叶甲有感染致病作用，同时还能够对牧草根系生长具有促进作用，具有恢复草原植被的生态作用。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1沙葱萤叶甲高效侵染菌株-金龟子绿僵菌NMMa198的分离鉴定
(1)萤叶甲僵虫绿僵菌菌株分离：
在无菌的条件下，用接种针蘸取萤叶甲僵虫表面的孢子粉，点接种在直径为90mm的1/4SDAY(蔗糖10g/L，酵母浸膏2.0g/L，蛋白胨2g/L，琼脂20g/L)平板培养基上，或者用灭菌的镊子夹取产孢的僵虫轻轻在培养基上振动几下使孢子掉落(抖落法)。将培养基放入26℃恒温培养箱中黑暗培养3d；3d后，夹取培养基上具有绿僵菌典型特征菌落的边缘菌块转移到新的90mm的1/4SDAY平板培养基上再放入26℃恒温培养箱中黑暗培养3d；3d后，夹取培养基上具有绿僵菌典型特征菌落的边缘菌块转移到新的90mm的1/4SDAY平板培养基上再放入26℃恒温培养箱中黑暗培养3d，重复操作3次，即可得到纯化的绿僵菌菌株。
将纯化的绿僵菌菌株接种到PDA(马铃薯200g/L、蔗糖20g/L、琼脂粉20g/L；pH值6.0～6.5)固体培养基上，26℃～28℃，黑暗培养15d后测量菌落直径。在菌落边缘嵌入5×5mm的灭菌盖玻片，同上条件继续培养一周，取下盖玻片制片后，显微镜检查，观察待测菌株的菌丝体、产孢梗和分生孢子的形态，并测定其大小，见表1。将纯化的分生孢子接种在1/4SDAY斜面培养基上，在26℃恒温培养箱中黑暗培养2周，待产生绿色分生孢子后分别进行菌落的1/4SDAY斜面4℃冰箱短期保存和/或加入20％甘油在20℃冷冻长期保存。
表1金龟子绿僵菌形态特征鉴定结果
(2)菌种培养性状特征鉴定
PDA培养基上菌落初期长出白色茸毛状菌丝，产孢时黄绿色至深绿色，在菌落长出成丛的分生孢子堆。分生孢子梗单生或聚集或紧密排列，帚状分枝或轮生体。后期培养物菌落呈干燥壳状。在PDA培养基上在温度为25℃条件下7d菌株菌落可长到直径2.5～3.0cm；在35℃时菌落生长速度变慢，15d菌落直径为2.4cm。取菌落插片染色镜检可见菌丝具分枝分隔，粗1.4～2.1μm。瓶梗型产孢细胞，大小幅度为(5.6～7.9)μm×(1.7～2.8)μm；从瓶梗顶端产生向基成熟的分生孢子链；孢子链连接点倾斜度小；分生孢子单细胞，长椭圆形，两端钝圆，孢子的直径和长度分别为(4.3～5.2)μm×(10.9～12.6)μm。分生孢子有时亦单生于菌丝分枝孢梗末端，将这个菌编号为NMMa198。NMMa198侵染沙葱萤叶甲产生的僵虫形态图见图1。
(3)绿僵菌菌株核糖体基因分子测序
将NMMa198在1/4SDY液体培养基(蔗糖10g/L，酵母浸膏2.0g/L和蛋白胨2g/L)摇瓶培养72h(250rpm，26℃)，用四层灭菌滤布收集菌丝或菌体，液氮研磨成粉末后，采用DNA试剂盒提取菌株的总DNA，通过菌株总DNA扩增、克隆转化、测定金龟子绿僵菌菌株的ITS1-5.8SrDNA-ITS2的特征序列，由生物公司进行双向脱氧法测序。扩增引物为真菌ITS序列的通用引物TW815’-gtttccgtagctgaacctgc-3’(SEQ ID No.2)和AB28:5’-atatgcttaagttcagcgggt-3’(SEQ ID No.3)。扩增的ITS序列和16SrDNA将所测得序列与NCBI数据库中已知序列进行Blast比对，寻找同源性高于为98％，E值为0.0视为同一种。
所测得金龟子绿僵菌NMMa198的ITS的核苷酸序列如下(SEQ ID No.1)所示：TTTTATGCTTTAATTCAGCGGGTAGTCCTACCTGATTCGAGGTCAACT ATAAAAAGTTGGGGGTTTTTACGGCAGTGGACCGCGCCGGGCTCCTGTTGCGAGTGTTTTACTACTGCGCAGAGGAGGGCCACGGCGAGACCGCCAATCAATTTAAGGGACGGCTGTGCTGGAAAACCAGCCTCGCCGATCCCCAACACCAAGTCCACAGGGGACTTGAGGGGCGTAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGACGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTTTTTTAACCACTCAGAAGATACTTATTAAAAAATTCAGAAGGTTTGGGTCCCCGGCGGGCGCGAAGTCCCGCCGAAGCAACAATGAAAGGTATAATTCACAGGGGTTGGGAGTTGGATAACTCGGTAATGATCCCTCCGCAGGTTCACTAAACGGAAACA。
(4)菌种鉴定结论：
金龟子緑僵菌菌株NMMa198在1/4SDAY培养基上菌落初期白色，背面可见黄褐色色素，后期产孢后呈暗绿色，分生孢子聚集成堆等特征与相近种黄绿绿僵菌(Metarhiziumflavoviride)分生孢子近球形或宽梭形区别明显；菌株最适生长温度：25-30℃；适合培养基：马铃薯葡萄糖培养基(PDA)。综合培养性状及形态特征以及ITS1-5.8-ITS2rDNA分子克隆测序比对结果，鉴定该菌株为金龟子绿僵菌Metarhiziumanisopliae，菌株保藏编号为CGMCCNo.40148，命名为NMMa198。有效成分主要存在形态：分生孢子，微菌核；生物活性：广谱杀虫；菌株贮存温度：4℃。
实施例2金龟子绿僵菌NMMa198对沙葱萤叶甲的生物活性测定
对金龟子绿僵菌NMMa198的杀虫活性进行测定，具体过程如下：金龟子绿僵菌NMMa198菌株在1/4SDAY培养基上培养获得成熟分生孢子，培养温度为28℃，培养时间为14d。于无菌水中加入吐温-80，吐温-80的添加体积为无菌水体积的0.1％，获得0.1％吐温80无菌水溶液，利用0.1％吐温80溶液将分生孢子制备成含有1×107个孢子/mL的孢子悬浮液。
采用微量加样器对大小一致的沙葱萤叶甲的3龄幼虫进行点滴处理，处理一：每头点滴10μL孢子悬浮液，设置3个平行处理，每个平行处理10头试虫重复。处理二：每头点滴5μL孢子悬浮液，设置3个平行处理，每个平行处理10头试虫重复。处理三：每头点滴15μL孢子悬浮液，设置3个平行处理，每个平行处理10头试虫重复。
沙葱萤叶甲接种孢子悬浮液后在室温25℃，湿度50～60％的条件下饲养，以不含分生孢子的0.1％吐温80溶液为空白对照。
接种后的虫子按常规方法饲养，每天观察虫子生长状态，连续观察10d，统计死亡数量并将其移除。
根据如下公式计算实施例2的校正死亡率，见表2。
累计死亡率(％)＝10d累计死虫数/绿僵菌接种虫数*100
校正死亡率(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)×100％
表2沙葱萤叶甲绿僵菌NMMa198生物活性测定
实施例3、金龟子绿僵菌NMMa198分生孢子的液固两相发酵
改良的SDY液体培养基组成为：蔗糖10g/L，酵母浸膏1.5g/L和蛋白胨2g/L。
1.液相发酵(接种体培养)
将金龟子绿僵菌NMMa198菌株接种于固体1/4SDAY培养基上，在26℃恒温培养箱中黑暗培养2周。在无菌条件下，刮取成熟的分生孢子，在体积浓度为0.1％的吐温-80无菌水中配制成1×108～1×109个孢子/mL的悬液，取20mL孢子悬液接种于装有200mL改良的SDY液体培养基的三角瓶中，三角瓶的体积为1L。接种后的三角瓶在温度为27℃，转速为250rpm，振荡培养72h后，获得金龟子绿僵菌NMMa198液体种子液。
2.固体发酵
初始固体发酵物料为大米，按照大米与水的体积比为2:1的比例混合后浸泡2h吸水。吸水后的大米按照每袋500g的装填量装入规格为50cm×40cm的聚乙烯发酵袋中，用线绳扎紧袋口，装入灭菌锅，于121℃下，灭菌30min。灭菌后的大米自然冷却后在超净工作台上按照10Kg:1L的接种比例将步骤1所得液体种子菌液接入灭菌后的大米中，发酵袋封口并将菌液与大米搓揉混匀后单层放于培养架上，在温度为25～27℃，相对湿度为80～90％的条件下静置发酵培养15d。15d后将上述发酵培养物收集，于室内吹风干燥，再用150目的振荡筛收集分生孢子粉。
收集的分生孢子粉按如下公式计算孢子收率：孢子收率＝(分生孢子干重)/(固体发酵物料干重)×100％，绿僵菌NMMa198菌株的孢子收率为1.8％。
称取0.1g干孢子粉用0.5％吐温-80溶液5mL悬浮搅拌分散混匀后，以血球计数板计数法，统计NMMa198菌株每克孢子粉的分生孢子数。本实施例所得分生孢子粉的分生孢子含量为400亿/g。
3金龟子绿僵菌分生孢子颗粒剂制备
金龟子绿僵菌分生孢子颗粒剂按照如下组分及质量份进行配制：实施例3所得金龟子绿僵菌分生孢子粉4g，助剂矿源黄腐酸2g和黄原胶3g，提取分生孢子后的固体发酵物料91g，将金龟子绿僵菌分生孢子连同助剂和发酵基质经混合机混匀后制成金龟子绿僵菌分生孢子颗粒剂，其中有效杀虫活性成分NMMa198分生孢子含量≥10亿孢子/g。
实施例4金龟子绿僵菌微菌核诱导发酵培养及微菌核颗粒剂制备
1金龟子绿僵菌微菌核诱导发酵培养
将绿僵菌NMMa198菌株接种于固体1/4SDAY培养基上，在26℃恒温培养箱中黑暗培养2周。在无菌条件下，刮取成熟的分生孢子，在体积浓度为0.1％的吐温-80无菌水中配制成1×108～1×109个孢子/mL的悬液，按照孢子悬液：微菌核诱导培养液体积比为1：10的比例，将孢子悬液接种到装有200mL诱导培养液的三角瓶中进行振荡培养。所用微菌核诱导培养液的组分质量浓度为(g/L)：蔗糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，4g/LKH2PO4，0.6g/LCaCl2·2H2O，0.5g/LMg2SO4·7H2O，0.02g/LZnSO4·7H2O，0.1g/LFeSO4·7H2O，0.03g/LCoCl2·6H2O，0.02g/LMnSO4·H2O，培养基的pH为6.5。三角瓶的体积为1L(即三角瓶中发酵液的装液量为20％)。在温度为26℃，转速为250rpm的条件下振荡培养5d后获得含有金龟子绿僵菌微菌核(微菌核与少量菌丝体混合物)的发酵液。微菌核收率为培养液的50％(微菌核收率为微菌核湿重与发酵液的体积比)。按1:2(V:V)的比例加入市售200目硅藻土(基质)，吹风晾干即为微菌核母粉。
2金龟子绿僵菌微菌核颗粒剂制备
金龟子绿僵菌微菌核颗粒剂按照如下组分及质量进行配制：步骤1所得金龟子绿僵菌微菌核母粉15g，加上助剂矿源黄腐酸2g、黄原胶2g，实施例3提取分生孢子后剩余的固体发酵物料81g。将金龟子绿僵菌微菌核连同助剂和发酵基质经混合机混匀后制成金龟子绿僵菌微菌核颗粒剂，其中有效杀虫活性成分NMMa198微菌核含量≥0.1亿微菌核/g。
实施例5金龟子绿僵菌分生孢子颗粒剂对沙葱萤叶甲的防治试验
利用实施例3所得金龟子绿僵菌分生孢子颗粒剂进行草原沙葱萤叶甲防治，试验地点为内蒙古自治区锡林浩特市，具体方法如下：
1.材料与方法
试验设计：在内蒙古锡林郭勒草原沙葱萤叶甲中等严重程度发生区随机选择15个10m×10m的试验小区，每个试验小区间隔50m以上，防止试验小区间互相干扰，所有试验小区间的牧草生长及土壤条件保持基本一致。
在试验小区安排本发明金龟子绿僵菌分生孢子颗粒剂三个不同施用量药剂组、质量浓度为0.3％苦参碱水剂对照组和空白对照组共5个处理，每个处理3次重复平行实验，共15个试验小区。将金龟子绿僵菌分生孢子颗粒剂加入有机肥至25kg混合均匀后用于撒施，有机肥酸碱度pH值低于8。
处理一：上述金龟子绿僵菌颗粒剂1kg/亩与有机肥混合均匀后撒施；
处理二：上述金龟子绿僵菌颗粒剂2.5kg/亩与有机肥混合均匀后撒施；
处理三：上述金龟子绿僵菌颗粒剂5kg/亩与牛羊粪有机肥混合均匀撒施；
处理四：0.3％苦参碱水剂15mL加水至300mL超低量喷雾，作为常规杀虫剂对照组；
处理五：空白CK，只撒施有机肥25kg，作为空白对照组。
试验调查：草原施药处理前及处理后5d、7d、10d各调查一次，共调查3次，调查每个小区害虫数量，同时观察记录沙葱及其他牧草生长情况。根据以下公式计算相对防治效果。
虫口减退率(％)＝(药前虫口基数-药后虫口数)/(药前虫口基数)×100
相对防治效果(％)＝(防治区虫口减退率-空白对照区虫口减退率)/(1-空白对照虫口减退率)×100
孢子型金龟子绿僵菌颗粒剂不同用量实验组、对照组和空白组处理后5d、7d、10d沙葱萤叶甲数量调查统计结果如表3所示。
表3不同剂量金龟子绿僵菌分生孢子颗粒剂防控沙葱萤叶甲防效统计表(2022.5.10～5.20)
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注：M代表代表平均值，1代表平行实验1、2代表平行实验2、3代表平行实验3，相对防效代表药后10d与空白对照区计算出的相对防效值。
2.结果与分析
根据表3可知，在沙葱萤叶甲发生中等严重区域，对照药剂苦参碱水剂能迅速杀死害虫，降低田间虫口数量，在第10d虫口减退率可达86.79％，但到10d时虫口有恢复上升趋势。金龟子绿僵菌颗粒剂不同用量处理后，前期防效较低于苦参碱，但施药处理7d后，防效迅速提升，其中实验组2施用2.5kg/亩金龟子绿僵菌颗粒剂和实验组3施用5kg/亩金龟子绿僵菌颗粒剂对沙葱萤叶甲的控制效果最佳，防治后7d虫口减退率分别达到67.36％和73.58％；金龟子绿僵菌颗粒剂施药处理10d后，防效即达到苦参碱药剂防治水平，相对防效超过80％。由此看出，苦参碱处理和金龟子绿僵菌颗粒剂2.5kg/亩和5kg/亩处理均能有效防控沙葱萤叶甲，而金龟子绿僵菌颗粒剂处理在后期可对沙葱萤叶甲起到良好的持续控制效果。从田间调查情况看，金龟子绿僵菌颗粒剂还具有明显的促进沙葱及其他牧草生长的作用。说明金龟子绿僵菌颗粒剂可以用于沙葱萤叶甲的绿色防控，考虑到成本因素，推荐金龟子绿僵菌颗粒剂施用量优选为2kg～4.0kg/亩，更优选为2.5kg/亩。
实施例6金龟子绿僵菌微菌核颗粒剂对沙葱萤叶甲的防治试验
利用实施例4所得金龟子绿僵菌微菌核颗粒剂进行草原沙葱萤叶甲防治，具体的试验地点为内蒙古自治区锡林浩特市，具体方法如下：
试验方法：在内蒙古草原沙葱萤叶甲中等严重程度发生区随机选择15个10×10m的试验小区，每个试验小区间隔50m以上，防止试验小区间互相干扰，所有试验小区间的牧草生长及土壤条件尽可能一致。
在试验小区安排本发明金龟子绿僵菌微菌核颗粒剂三个不同施用量药剂组、化学药剂对照组和空白对照组共5个处理，每个处理3次重复平行实验，共15个试验小区。将金龟子绿僵菌微菌核颗粒剂加入有机肥至25kg混合均匀后采用机动喷粉机喷撒，有机肥酸碱度pH值低于8。
处理一：上述金龟子绿僵菌颗粒剂1kg/亩与有机肥混合均匀后喷撒；
处理二：上述金龟子绿僵菌颗粒剂2.5kg/亩与有机肥混合均匀后喷撒；
处理三：上述金龟子绿僵菌颗粒剂5kg/亩与牛羊粪有机肥混合均匀喷撒；
处理四：4.5％高效氯氰菊酯12mL加水至300mL超低量喷雾，作为化学药剂对照组；
处理五：空白CK，只撒施有机肥25kg，作为空白对照组。
试验调查：草原施药处理前及处理后5d、7d、10d、15d各调查一次，共调查5次，调查每个小区害虫数量，同时观察记录沙葱及其他牧草生长情况。根据以下公式计算相对防治效果。
虫口减退率(％)＝(药前虫口基数-药后虫口数)/(药前虫口基数)×100；
相对防效(％)＝(药后虫口减退率-空白对照虫口减退率)/(1-空白对照虫口减退率)×100。
金龟子绿僵菌微菌核颗粒剂不同用量实验组、对照组和空白组处理后5d、7d、10d、15d沙葱萤叶甲数量调查统计结果如表4所示。
表4金龟子绿僵菌微菌核颗粒剂防治沙葱萤叶甲示范试验防效统计表(2022.5.10～5.25)
注：M代表代表平均值，1代表平行实验1、2代表平行实验2、3代表平行实验3，相对防效代表药后15d与空白对照区计算出的相对防效值。
根据表4可知，在沙葱萤叶甲发生中等严重区域，对照药剂高效氯氰菊酯能迅速杀死害虫，降低田间虫口数量，但施药10d后虫口有恢复上升趋势。金龟子绿僵菌微菌核颗粒剂杀虫效果较慢，处理后5d后虫口减退率30％左右，远低于对照化学农药高效氯氰菊酯；但施药处理7d后，金龟子绿僵菌微菌核颗粒剂防效持续提升，到第10d时，低剂量组虫口减退率达到55％以上，高剂量组超过80％；到第15d，2.5公斤和5公斤剂量颗粒剂虫口减退率均在80％以上，相对防效超过对照的化学药剂高效氯氰菊酯。由此看出，对照化学药剂处理和金龟子绿僵菌微菌核颗粒剂2.5kg/亩和5kg/亩处理均能有效防控沙葱萤叶甲，而金龟子绿僵菌颗粒剂处理在后期可对沙葱萤叶甲起到良好的持续控制效果。
从田间调查情况看，金龟子绿僵菌微菌核颗粒剂还具有明显的促进沙葱及其他牧草生长的作用。说明金龟子绿僵菌颗粒剂可以用于沙葱萤叶甲的绿色防控，考虑到成本因素，推荐金龟子绿僵菌颗粒剂施用量优选为2kg～4.0kg/亩，更优选为2.5kg/亩。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一株金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)NMMa198，其特征在于，所述金龟子绿僵菌NMMa198的保藏编号为CGMCCNo.40148。
2.一种金龟子绿僵菌制剂，其特征在于，所述金龟子绿僵菌制剂的活性成分包括权利要求1所述的金龟子绿僵菌NMMa198的分生孢子和/或NMMa198的微菌核。
3.根据权利要求2所述的金龟子绿僵菌制剂，其特征在于，所述金龟子绿僵菌制剂中的分生孢子个数大于等于1.0×109个分生孢子/g；所述金龟子绿僵菌制剂中的微菌核个数大于等于1.0×107个微菌核/g。
4.根据权利要求2或3所述的金龟子绿僵菌制剂，其特征在于，所述金龟子绿僵菌NMMa198分生孢子的制备方法包括如下步骤：
对金龟子绿僵菌NMMa198分生孢子进行液相发酵培养得到液体种子液，将所述液体种子液接种到固体发酵物料进行固体发酵培养后分离得到分生孢子粉；
所述液体种子液与固体发酵物料的体积质量比为1L:10Kg；
所述液相发酵培养的温度为26～28℃，转速为200～250rpm，时间为56～72h；所述固体发酵培养的温度为25～27℃，固体发酵时间为10～15d。
5.根据权利要求2或3所述的金龟子绿僵菌制剂，其特征在于，所述金龟子绿僵菌NMMa198微菌核的制备方法包括如下步骤：
对金龟子绿僵菌NMMa198进行平板培养得到分生孢子，将所得分生孢子接种于微菌核诱导培养液进行诱导发酵培养得到含有微菌核的发酵产物；
接种于微菌核诱导培养液的分生孢子悬液的孢子浓度为1×108～1×109个孢子/mL；所述诱导发酵培养的温度为25～28℃，诱导发酵培养的转速为200～250rpm，所述诱导发酵培养的时间为5～7d；
所述平板培养的温度为26～28℃，平板培养时间为7～14d。
6.根据权利要求2～5所述的金龟子绿僵菌制剂，其特征在于，所述金龟子绿僵菌制剂的剂型包括颗粒剂、粉剂或可湿性粉剂；
当所述剂型为颗粒剂且所述金龟子绿僵菌制剂的活性成分为金龟子绿僵菌NMMa198的分生孢子时，所述金龟子绿僵菌制剂为孢子型绿僵菌颗粒剂；
按质量份计，所述分生孢子型绿僵菌颗粒剂包括如下组分：1～6份金龟子绿僵菌NMMa198分生孢子粉、3～5份助剂和90～94份发酵基质；
当所述剂型为颗粒剂且所述金龟子绿僵菌制剂的活性成分为金龟子绿僵菌NMMa198的微菌核时，所述金龟子绿僵菌制剂为微菌核型绿僵菌颗粒剂；
按质量份计，所述微菌核型绿僵菌颗粒剂包括如下组分：10～20份金龟子绿僵菌NMMa198微菌核母粉、3～5份助剂和75～85份基质；所述基质包括发酵基质和/或载体基质；
所述金龟子绿僵菌NMMa198微菌核母粉为含有金龟子绿僵菌NMMa198微菌核的发酵产物与载体基质的混合物；
所述发酵基质包括提取金龟子绿僵菌NMMa198分生孢子后剩余的固体发酵物料；
所述载体基质包括硅藻土、高岭土、凹凸棒土和陶土中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的金龟子绿僵菌制剂，其特征在于，所述助剂包括腐植酸钾和/或黄原胶。
8.权利要求1所述金龟子绿僵菌NMMa198或权利要求2～7任意一项所述金龟子绿僵菌制剂在防治牧草害虫中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述牧草害虫包括沙葱萤叶甲、牧草叶甲、跳甲和蛴螬中的一种或多种。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用方式包括将所述绿僵菌颗粒剂与分散剂均匀混合后撒施，所述混合时金龟子绿僵菌颗粒剂与分散剂的质量比为1:10～1:20，所述分散剂包括有机肥或细土。
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