CN116751296A - 一种靶向人肿瘤坏死因子α的纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种靶向人肿瘤坏死因子α的纳米抗体及其应用。本发明使用重组的TNFα对条纹斑竹鲨进行免疫，外周血淋巴细胞总RNA反转录得到cDNA为模板扩增纳米抗体序列，最终分离获得4种纳米抗体，分别命名为aTNF‑6、aTNF‑9和aTNF‑15及aTNF‑21，4种纳米抗体具有不同的抗原互补决定区，SPR结果表明，四种纳米抗体均与人TNFα具有较高的亲和力，均可竞争性抑制TNFα与TNFR结合。本发明提供的纳米抗体有希望为体内TNFα过量表达治疗思路提供实验事实依据。

Description

一种靶向人肿瘤坏死因子α的纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种靶向人肿瘤坏死因子α的纳米抗体及其应用。
技术背景
肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor alpha，TNFα)是由巨噬细胞产生的一类炎症因子，是宿主防御的重要组成部分。机体在受到刺激或产生创伤时迅速释放大量肿瘤坏死因子，释放后TNFα在体内首先与细胞表面的肿瘤坏死因子受体(Tumor necrosisfactor receptor，TNFR)相结合，进而介导细胞内一系列生物学反应，如诱导细胞凋亡、激活NF-κB通路从而促进炎症相关蛋白的表达等，此细胞通路同时也介导拮抗细胞凋亡，所以体内正常的TNFα表达对机体的免疫调节具有重要意义，例如维持细胞稳态、抗感染等。但当肿瘤坏死因子持续分泌过量时则会导致免疫病理的产生，包括自身免疫性疾病和多种慢性炎症。
自身免疫性疾病(Autoimmune Diseases)是由于自身抗原免疫耐受缺失导致的一类慢性异质性疾病，可累及特定的靶器官或多个系统，不能正确识别抗原而导致攻击自身受体从而造成机体损害。自身免疫性疾病分为器官特异性自身免疫病和系统性自身免疫病，例如凸眼性甲状腺肿及重症肌无力、系统性红斑狼疮及类风湿性关节炎等。因此中和体内过量表达的TNFα是预防或治疗自身免疫性疾病的一种策略，通过拮抗结合过量浓度的TNFα，下调其与细胞表面受体结合浓度，从而减少与TNFα-TNFR介导病症相关症状，在一定程度上缓解自身免疫性疾病进程。
目前针对TNFα过表达所研发的治疗模式存在一定弊端，例如抗药性的产生，副作用明显等。能够靶向TNFα的生物小分子抑制剂是有望解决TNFα过表达的新途径。纳米抗体是存在于骆驼科和软骨鱼类体内的一种仅重链抗体，具有分子量小、结构简单、高特异性、高亲和力、便于与融合蛋白偶联及被标记物标记等优点，目前针对TNFα的纳米抗体尚无相关报导。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明的目的之一在于提供一种靶向人肿瘤坏死因子α的纳米抗体，所述纳米抗体为aTNF-6、aTNF-9、aTNF-15、aTNF-21中的任意一种，所述aTNF-6、aTNF-9、aTNF-15和aTNF-21均包含三个抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中：
所述aTNF-6的三个抗原互补决定区氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列同源性大于等于80％，优选为至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列；
所述aTNF-9的三个抗原互补决定区氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列同源性大于等于80％，优选为至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列；
所述aTNF-15的三个抗原互补决定区氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列同源性大于等于80％，优选为至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列；
所述aTNF-21的三个抗原互补决定区氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列同源性大于等于80％，优选为至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列。
上述同源性序列也包含与序列表所示序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列。
优选的，aTNF-6、aTNF-9、aTNF-15和aTNF-21的氨基酸序列分别如下：
aTNF-6的氨基酸序列：
aTNF-9的氨基酸序列：
aTNF-15的氨基酸序列：
aTNF-21的氨基酸序列：
上述纳米抗体的三个抗原互补决定区氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3分别如加粗画线部分所示，即：
aTNF-6的抗原互补决定区氨基酸序列：
CDR1:ILKGSSCALGSTHWY(SEQ ID NO:1)
CDR2:SDTKNTASKSF(SEQ ID NO:2)
CDR3:EAYTAGYCGGILYSYS(SEQ ID NO:3)
aTNF-9的三个抗原互补决定区氨基酸序列：
CDR1:VLRDSSCVLDSTDWY(SEQ ID NO:4)
CDR2:AETVNKASKSF(SEQ ID NO:5)
CDR3:KAYPDGRYCRSWGSYI(SEQ ID NO:6)
aTNF-15的三个抗原互补决定区氨基酸序列：
CDR1:VLRDSSCALDSTDWY(SEQ ID NO:7)
CDR2:AETVNKASKSL(SEQ ID NO:8)
CDR3:KVYPDGRYCRNWGSYI(SEQ ID NO:9)
aTNF-21的三个抗原互补决定区氨基酸序列：
CDR1:VLRDSSCVLDSTDWH(SEQ ID NO:10)
CDR2:AETVNKASKSF(SEQ ID NO:11)
CDR3:KAYPDGRYCRYWGSYI(SEQ ID NO:12)
本发明还提供一种靶向人肿瘤坏死因子α的抗体，其具有如上所述的aTNF-6、aTNF-9、aTNF-15、aTNF-21中的任意一种纳米抗体以及Fc结构域。
优选的，所述Fc结构域为人IgG1 Fc结构域，氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，编码所述氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
本发明还提供一种多核苷酸，其编码如上所述的纳米抗体aTNF-6、aTNF-9、aTNF-15或aTNF-21，或编码如上所述的具有Fc结构域的抗体；其中编码aTNF-6的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示，编码aTNF-9的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示，编码aTNF-15的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示，编码aTNF-21的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示。
本发明还提供一种包含如上所述的多核苷酸的表达载体，以及一种包含如前所述的表达载体的宿主细胞，优选的，所述宿主细胞是用于表达外源蛋白的宿主细胞，例如细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞。
本发明提供一种药物组合物，其含有如上所述的纳米抗体aTNF-6、aTNF-9、aTNF-15或aTNF-21，或含有如上所述的具有Fc结构域的抗体。
本发明提供的纳米抗体/抗体可用于制备治疗和/或诊断TNFα过表达导致的自身免疫性疾病。
本发明的有益效果在于：
1、本发明使用重组的TNFα对条纹斑竹鲨进行了4次免疫，然后分离出外周血淋巴细胞，并抽提细胞的总RNA，随后反转录为cDNA，将cDNA用作模板以扩增纳米抗体序列，最终分离获得了4种纳米抗体，分别命名为aTNF-6、aTNF-9和aTNF-15及aTNF-21。
该纳米抗体(VHH)来源于天然的鲨鱼重链抗体，其具有1)结构简单、分子量小，有利于表达和使用；2)方便在大肠杆菌和各种真核系统中高效大量表达；3)由于其只有一个结合位点，属于单域抗体，作为诊断试剂有更好的通透性、特异性和检测线性；4)便于与各种融合蛋白偶联或更容易被各种标记物标记；5)更易于制备双功能抗体，更有利于靶向药物开发和细胞靶点定向运输；6)作为药物开发，其对于人免疫原性小，不容易产生免疫排斥等优点。
2、本发明提供的4种纳米抗体具有不同的抗原互补决定区，将结合人TNFα的抗体用哺乳动物细胞(293F)表达和分泌，将抗体与人IgG1 Fc融合，克隆至哺乳动物表达载体pTT5中，将载体转染哺乳动物细胞293F，培养5天后收集上清。采用Protein A柱子对上清中的融合蛋白进行纯化，4种纳米抗体的产量均大于80mg/L。
表面等离子共振实验(SPR)结果表明，四种纳米抗体均与人TNFα具有较高的亲和力，竞争性酶联免疫吸附实验结果表明均可竞争性的抑制TNFα与肿瘤坏死因子受体(TNFR)结合。本发明提供的纳米抗体有希望为体内TNFα过量表达治疗思路提供实验事实依据。
附图说明
图1为特异性结合人TNFα的V-C1结构域的单克隆噬菌体的ELISA结果。
图2为筛选的4种纳米抗体的柱层析结果。
图3为纳米抗体Fc融合蛋白及纳米抗体的SDS-PAGE凝胶电泳结果；图中泳道M为Marker，泳道1、3、5、7依次为纳米抗体aTNF-6、aTNF-9、aTNF-15和aTNF-21的Fc融合蛋白，泳道2、4、6、8是切除Fc的aTNF-6、aTNF-9、aTNF-15和aTNF-21纳米抗体。
图4为通过竞争性ELISA对纳米抗体与TNFR对hTNFα的竞争结合亲和力分析结果，图4中A显示了TNFR浓度与OD450值关系，图4中B显示了4种纳米抗体的EC50值。
图5为SPR检测纳米抗体与人TNFα的结合亲和力结果，图中KD为解离平衡常数；Ka为动力学缔合率，Kd为动力学解离速率。
具体实施方式
为了便于理解，下面结合实施例对本发明的技术方案做出更为具体的说明：
实施例1
纯化人TNFα用于免疫
1)通过E-Coli，BL21-Codon Plus(DE3)-RIPL菌株(Stratagene)表达人TNFα蛋白，通过亲和色谱和体积排阻色谱纯化得到目的蛋白。初次免疫使用弗氏完全佐剂，后面两次用弗氏不完全佐剂。每次用200μg/次的抗原剂量，按照抗原与佐剂体积比1:1混合，随后尾鳍皮下注射免疫条纹斑竹鲨(Chiloscyllium plagiosum)4次，间隔3周。
2)在第16周，收集血液以分离淋巴细胞，并分析针对人TNFα抗原的免疫反应。
3)使用Omega Biotek的RNA提取试剂盒提取淋巴细胞总RNA，并去除基因组DNA。使用Takara的PrimeScriptTMII第一链cDNA合成试剂盒，将RNA反转录为cDNA。
4)纳米抗体噬菌体展示文库的构建：使用PCR以上述cDNA为模板扩增获得纳米抗体的编码序列。采用吉布森组装法(Gibson assembly)将扩增的纳米抗体序列克隆至噬菌粒pR2的NcoI和NotI位点中。得到的吉布森组装产物即为初始纳米抗体噬菌体文库。
5)使用BTX ECM 399电穿孔仪转化大肠杆菌TG1感受态细胞：将噬菌体pR2纳米抗体基因(吉布森组装产物)在0.1cm的电穿孔比色皿中转化至大肠杆菌TG1感受态细胞中。将电穿孔产物(500μL)重悬于20mL LB培养基中，并在37℃，220rpm下孵育60分钟。将细菌涂布在5个150mm补充有100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的TY(配方1L：16g胰蛋白胨、10g酵母提取物、5gNaCl)平板上以扩增噬菌体文库，在37℃下培养过夜。接下来，从平板上刮下转化菌落，与终浓度20％甘油旋涡充分混合，以1ml等分试样液氮速冻后在-80℃下保存，并计算噬菌体文库的大小(pfu/mL＝OD260×100×22.14×1010)。
6)纳米抗体噬菌体展示文库的扩增：为了扩增纳米抗体的噬菌体文库，将0.2ml冷冻的文库在冰上融化，稀释到200ml的TY培养基中，该培养基中添加了100μg/ml的氨苄青霉素和2％的葡萄糖，并在37℃下培养。接下来，将1×1012pfu的KM13辅助噬菌体(购自MRC分子生物学实验室)添加到培养物中，并在37℃(水浴)中孵育45分钟。通过高速离心分离细胞沉淀，并重悬于200ml的2×TY培养基中，该培养基中添加了0.1％葡萄糖、50μg/mL卡那霉素和100μg/ml氨苄青霉素。将细胞在25℃，220rpm下孵育20小时以扩增噬菌体文库。离心后，将聚乙二醇(PEG)添加到培养上清液中以沉淀噬菌体颗粒。将沉淀的噬菌体颗粒沉淀溶解在PBS中，并在25％甘油的存在下于-80℃于1mL等分试样中保存。
7)平移：将纯化的人TNFα用PBS稀释至终浓度0.1mg/ml，并包被到96孔免疫板ELISA(Nunc maxsorp板)的一孔中，并留出一孔ELISA板用作阴性对照。用PBS洗涤3次后，将300μl MPBS(含5％脱脂牛奶的PBS)加入ELISA板的每个孔中，并在室温下孵育3小时以封闭未结合的位点。接下来，将板用PBS洗涤3次，并将含有针对hTNFα的1×1011pfu(在100μlMPBS中稀释)噬菌体库添加至每个孔，在室温下孵育后一小时后，用PBST(含0.1％Tween 20的PBS)洗涤3次。通过使用终浓度为0.5mg/ml的胰蛋白酶在室温下孵育一小时，将展示特异性针对hTNFα纳米抗体的噬菌体洗脱。将10μL洗脱的噬菌体添加到1ml大肠杆菌TG1感受态细胞中，并在37℃(水浴)中孵育45分钟以进行感染，然后将细菌培养物铺在补充了100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的2×TY在37℃下孵育过夜。
8)单克隆噬菌体的制备：一轮淘选后，将48个单独的菌落挑入一个96孔圆底培养皿中，该培养皿中装有100μl的2×TY培养基，其中补充了100μg/ml的氨苄青霉素和2％的葡萄糖(w/v)。在37℃/180rpm持续孵育12个小时。接下来，将5μl该培养液接种至一个新的96孔圆底培养皿，该培养皿中装有200μl的2×TY培养基，其中补充了100μg/ml的氨苄青霉素和2％的葡萄糖(w/v)。将新鲜接种的板在37℃/250rpm下温育1.5小时，直到OD260为约0.5。将50μl包含4×108pfu KM13辅助噬菌体的2×TY培养基添加到平板的每个孔中，并在不摇动的情况下于37℃孵育45分钟以进行感染。感染后，弃去150μl上清液，并将剩余体积在3500g离心15分钟，弃去上清液，将细菌沉淀重悬于200ml的2×TY培养基中，该培养基中补充有100μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素和0.1％葡萄糖(w/v)，在25℃/250rpm下孵育过夜，最多20个小时。第二天，将培养物以3500g离心30分钟，然后将150μl上清液转移至新的96孔板中，并保存在4℃下，以备筛选纳米抗体。
9)噬菌体ELISA测试：用GFBE溶液将hTNFα稀释至0.1μg/mL，在Nunc96孔免疫板中每孔加入100μL，设立空白对照，4℃静置过夜。过夜包被的免疫板每孔加入260μL PBS洗2次，加入260μL MPBS室温封闭2h，封闭结束后每孔加入260μL PBS洗2次，分别取以上制备的单克隆phage 60μL与180μLMPBS混匀。各取100μL加入对照孔(先加)和包被抗原的孔(后加)中，置于桌面摇床上80rpm孵育1h。同时按照说明书用MPBS稀释HRP-anti M13抗体。孵育结束后，每孔加入260μL PBST洗4次，洗完加入100μL稀释的HRP-anti M13抗体，置于桌面摇床上以80rpm速度孵育1h，孵育完成后每孔加入100μLTMB显色，终止后用酶标仪测量OD450值，结果如图1所示。
10)将所有OD450nm值大于1的阳性克隆进行测序，引物序列为：5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACGA-3’(SEQ ID NO：23)，测序结果需反向互补。比对分析序列结果，排除重复克隆，最后确定4种对hTNFα蛋白特异的阳性噬菌体纳米抗体，分别命名为；aTNF-6(如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列)、aTNF-9(如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列)、aTNF-15(如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列)和aTNF-21(如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)，这4种纳米抗体具有与hTNFα结合的特定CDR区。
实施例2
纳米抗体-FC融合蛋白的表达和纯化
1)设计引导分泌的肽基因序列并将其融合到纳米抗体基因的N端，以保证表达后的分泌，将人IgG1 Fc融合到纳米抗体基因的C端，并将纳米抗体基因和人IgG1 Fc重新结合，然后克隆到哺乳动物表达载体pTT5中。
用聚乙烯亚胺(PEI)将构建载体转染到HEK293F(密度约2.5x 106细胞/ml)中，在FreestyleTM293表达培养基(购于永联生物)对转染后的哺乳动物细胞进行悬浮培养。将37℃ CO2培养箱(培养箱不宜过分干燥)摇床以150rpm的转速旋转，将哺乳动物细胞培养5天，然后通过2000rpm离心10分钟收集哺乳动物细胞培养物的上清液。用蛋白A柱纯化纳米抗体-FC融合蛋白，进行SDS-PAGE电泳分析，如图2所示，从上清液中获得了高纯度的纳米抗体-Fc融合蛋白。
2)将纯化的纳米抗体-FC融合蛋白进行TEV酶消化，以消化人IgG1 Fc的再结合位点，然后将混合物产物分别置于蛋白A柱和Ni柱中，没有FC产物的纳米体流经Protein A柱。分别用镍柱除去未消化的完全纳米抗体-Fc蛋白、Fc和TEV酶，收集流通液，浓缩，并进行SDS-PAGE电泳，如图3所示，在流通液中，得到高纯度的纳米抗体。
实施例3
纳米抗体与TNFR对hTNFα的竞争结合亲和力分析
将TNFα以2μg/mL的浓度包被至免疫板，4℃包被过夜。同时将TNFR蛋白按照说明书所示生物素化，以便于二抗结合。包被结束后洗板，每孔加入200μL PBS，甩掉后拍板至无明显液滴，重复3次，吸取200μL 5％的脱脂奶加入免疫板，室温封闭2h，将生物素化后的TNFR蛋白稀释至0.5μmol/L作为最大浓度，向低浓度3倍稀释，共稀释11个梯度。封闭结束后吸取稀释后的受体蛋白每孔加入100μL，对照孔加100μL脱脂奶，室温下孵育1h，结束后每孔加入260μL PBST溶液进行洗板，重复四次。洗板结束后将提前用5％的脱脂奶稀释好的二抗加入免疫板，每孔100μL，室温孵育1h，结束后每孔加入260μLPBST溶液进行洗板，重复四次，每孔加入100μL TMB显色液进行显色反应，5min后每孔加入50μL 1mol/L硫酸溶液进行终止，立即使用酶标仪测定OD450值。
根据TNFα与TNFR的ELISA结果，选定OD450值为1时的TNFR浓度作为竞争性ELISA实验中定量的值即为5nmol/L，选取抗体片段：aTNF-6、aTNF-9、aTNF-15、aTNF-21进行竞争性ELISA的实验，设定抗体最大浓度为2000nmol/L，向低浓度2倍稀释，共稀释10个梯度。将TNFα以2μg/mL的浓度包被至免疫板，4℃包被过夜，包被结束后洗板，每孔加入200μL PBS，甩掉后拍板至无明显液滴，重复3次，吸取200μL 5％的脱脂奶加入免疫板，室温封闭2h，将生物素化后的TNFR蛋白稀释至5nmol/L，封闭结束后吸取稀释后的抗体可变区蛋白和定量的TNFR竞争性的与TNFα结合，每孔加入100μL，阴性对照孔加100μL脱脂奶，阳性对照孔加100μL TNFR蛋白稀释液不加抗体，室温下孵育1h，结束后每孔加入260μL PBST溶液进行洗板，重复四次。洗板结束后将提前用5％的脱脂奶稀释好的二抗加入免疫板，每孔100μL，室温孵育1h，结束后每孔加入260μL PBST溶液进行洗板，重复四次，每孔加入100μL TMB显色液进行显色反应，5min后每孔加入50μL 1mol/L硫酸溶液进行终止，立即使用酶标仪测定OD450值。
图4显示四种纳米抗体均与hTNFα结合，并可以与天然受体TNFR竞争性的和hTNFα结合。图4中A显示了TNFR浓度与OD450值关系，图4中B结合结果显示，aTNF-6：EC50＝397.6nM；aTNF-9：EC50＝379.1nM；aTNF-15：EC50＝415.8nM；aTNF-21：EC50＝414.1nM。
实施例4
通过SRP表征纳米抗体与hTNFα蛋白之间的亲和力
材料：传感器芯片CM5，磷酸盐缓冲液加0.05％吐温20(0.05％TPBS)，乙酸盐，pH5.0，hTNFα，抗hTNFα纳米抗体蛋白(aTNF-6，aTNF-9，aTNF-15和aTNF-21)，乙醇胺-HCl封闭剂，10mM NaOH活化溶液，400mM MgCl2再生溶液。使用BiacoreTM T200系统(GEHealthcare)完成SPR实验分析，并使用0.05％TPBS作为样品缓冲液和运行缓冲液。所有分析温度均设置为25℃。使用胺偶联试剂盒pH 5.0进行hTNFα的固定化。
hTNFα固定在CM5芯片表面，纳米抗体作为流动相注入，当抗体流经芯片时，抗原与抗体特异性结合，导致芯片表面重量增加从而观察到分子间相互作用使用七个浓度(1000-15.875nM)的单循环动力学方法。通过从捕获试剂盒注入120s的再生溶液(400mM MgCl2)再生表面，以去除结合的纳米抗体。在每个纳米抗体中完成了纳米抗体+0.05％TPBS缓冲液注射+再生(空白循环)。首先从参考流通单元减去响应，然后减去空白周期的数据作为双重参考。通过使用BiacoreTMT200评估软件2.0选择了Kinetics方式拟合数据。
结果如图5所示，图5中A-D显示：aTNF-6的Ka(1/Ms)＝2.38E10+4，Kd(1/s)＝0.0018，KD(M)＝7.54E10-8；aTNF-9的Ka(1/Ms)＝1.09E10+5，Kd(1/s)＝0.0017，KD(M)＝1.55E10-8；aTNF-15的Ka(1/Ms)＝1.79E10+5，Kd(1/s)＝0.0018，KD(M)＝1.028E10-8；aTNF-21的Ka(1/Ms)＝2.04E10+5，Kd(1/s)＝0.0011，KD(M)＝5.21E10-9；制备的纳米抗体与TNFα结合的亲和力较高。
以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案，而并非对本发明的限制；尽管参照前述实施方式对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：凡在本发明创造的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种靶向人肿瘤坏死因子α的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体为aTNF-6、aTNF-9、aTNF-15、aTNF-21中的任意一种，所述aTNF-6、aTNF-9、aTNF-15和aTNF-21均包含三个抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中：
所述aTNF-6的三个抗原互补决定区氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；
所述aTNF-9的三个抗原互补决定区氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；
所述aTNF-15的三个抗原互补决定区氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；
所述aTNF-21的三个抗原互补决定区氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的一种靶向人肿瘤坏死因子α的纳米抗体，其特征在于，所述aTNF-6的三个抗原互补决定区氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；aTNF-9的三个抗原互补决定区氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示；aTNF-15的三个抗原互补决定区氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示；所述aTNF-21的三个抗原互补决定区氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。
3.如权利要求2所述的一种靶向人肿瘤坏死因子α的纳米抗体，其特征在于，所述aTNF-6的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，aTNF-9的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，aTNF-15的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，aTNF-21的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
4.一种靶向人肿瘤坏死因子α的抗体，其具有如权利要求1所述的aTNF-6、aTNF-9、aTNF-15、aTNF-21中的任意一种纳米抗体以及Fc结构域。
5.如权利要求4所述的抗体，其特征在于，所述Fc结构域为人IgG1 Fc结构域。
6.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-3任一项所述的纳米抗体，或编码如权利要求4-5任一项所述的抗体。
7.一种表达载体，其包含如权利要求6所述的多核苷酸。
8.一种宿主细胞，其包含如权利要求7所述的表达载体。
9.权利要求1-3任一项所述的纳米抗体在制备治疗和/或诊断TNFα过表达导致的自身免疫性疾病中的应用。
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