CN116744967A - 包括糖基古菌醇和免疫刺激剂的佐剂 - Google Patents
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Abstract
本文提供了佐剂组合物，其包括糖基古菌醇、以及选自Toll样受体(TLR)激动剂和皂苷的至少一种免疫刺激剂。糖基古菌醇和/或免疫刺激剂可以作为药学上可接受的盐存在。佐剂组合物可以与抗原一起包括在免疫原性组合物(诸如疫苗组合物)中，所述免疫原性组合物可以用于在受试者中诱导免疫应答。还提供了免疫原性组合物在受试者中诱导免疫应答特别是包括细胞介导的应答和体液应答的免疫应答的用途。
Description
技术领域
本申请总体上涉及免疫学领域，并且更特别地涉及用于免疫原性组合物诸如疫苗的佐剂。
背景技术
疫苗是提高对特定疾病免疫力的生物制剂。它们经常用在人类和动物的预防中，以防止由细菌、病毒和寄生生物引起的传染病。也正在研究将疫苗用于其他治疗应用，诸如癌症治疗。
疫苗中使用的抗原可以包括各种剂，诸如杀死的病原生物、活的但经过改造或减毒的病原生物、编码蛋白质的核酸、纯化或重组的蛋白质或其片段。通常还需要添加佐剂来增强宿主对抗原的免疫应答，并且在一些情况下减缓抗原从注射部位的释放。佐剂是可以增强对疫苗的应答的物质，并且可以以许多不同的方式起作用，诸如提供仓库效应(depoteffect)或诱导免疫刺激。
已研究了多种各样的用于疫苗的佐剂。目前批准用于人类疫苗的佐剂包括铝盐，诸如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝钾(明矾)；CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)；水包油乳剂(诸如MF59和AS03)、AS04(3’-O-脱酰基单磷酰脂质A(MPL)加铝盐)和AS01(MPL和皂苷QS-21配制在脂质体中)，其中，铝盐是最常用的。
古细菌脂质体(archaeosome)是脂质囊泡(脂质体)，其典型地由醚连接的类异戊二烯植烷基核的全极性脂质或半合成糖脂组成，具有各种糖基头基和氨基头基，其具有强佐剂和免疫刺激特性。一种古细菌脂质体制剂包括共价连接到古菌的核心部分的游离sn-1羟基主链的硫酸化二糖基团(SLA；6’-硫酸根-β-D-Galp-(1,4)-β-D-Glcp-(1,1)-古菌醇)(参见McCluskie等人，2017，Akache等人，2018，以及WO 2016/004512；其各自内容以它们的整体通过引用并入本文)。McCluskie等人(2017)、Akache等人(2018)和WO 2016/004512已经表明，单独的包括SLA的古细菌脂质体或与不带电荷的糖脂(例如乳糖基古菌醇，LA)混合的包括SLA的古细菌脂质体诱导对包埋抗原的强烈的抗原特异性IgG和CD8 T细胞应答，并诱导许多细胞因子/趋化因子包括IL-6、G-CSF、KC和MIP-2的表达。Jia等人(2019,2020)、Akache等人(2019)、Agbayani等人(2020)和Stark等人(2019)也表明，包括SLA的古细菌脂质体在简单地与抗原混合，以及在包埋制剂中时，可以诱导强烈的抗原特异性免疫应答。
佐剂可以增强并经常重定向对疫苗抗原的免疫应答，或者替代地为抗原(仓库)提供载体效应，以在注射部位或邻近淋巴结处保留更长时间。主要免疫应答机制是诱导中和抗体(体液应答)和产生T细胞(细胞介导的应答)，包括CD4+辅助细胞(Th)和CD8+细胞毒性(细胞毒性T淋巴细胞)应答。疫苗的成功取决于它引起强烈和/或持久且适当的免疫应答的能力。不同的佐剂引起不同的免疫应答。例如，铝盐引起强烈的体液应答，但只有微弱的细胞介导的应答。铝盐不能引起治疗慢性病毒感染和癌症所需的强烈的细胞介导的免疫应答。
对能够快速诱导强烈、有效且持久免疫应答的佐剂有显著需求。
发明内容
根据第一方面，提供了一种佐剂组合物，其包含：
糖基古菌醇(glycoarchaeol)或其药学上可接受的盐，以及选自Toll样受体(TLR)激动剂或其药学上可接受的盐和皂苷或其药学上可接受的盐的至少一种免疫刺激剂。
在实施方式中，糖基古菌醇包括古菌醇(archaeol)核心部分。
在实施方式中，糖基古菌醇是带电荷的类异戊二烯糖脂，其包括通过β键键共价连接到古菌醇核心部分的甘油主链的游离sn-1羟基基团的硫酸化糖类基团。
在实施方式中，古菌醇核心部分是2,3-双((3,7,11)-3,7,11,15-四甲基十六烷基)氧基)丙-1-醇。
在实施方式中，硫酸化糖类基团是硫酸化二糖或硫酸化三糖。在实施方式中，硫酸化糖类基团是6′-硫酸根-β-D-Galp-(1,4)-β-D-Glcp。
在实施方式中，糖基古菌醇是2,3双[(3,7,11)-3,7,11,15-四甲基十六烷基氧基]丙-1-基4-O-(6-O-磺基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(2,3bis[(3,7,11)-3,7,11,15-tetramethylhexadecyloxy]propan-1-yl
4-O-(6-O-sulfo-β-D-galactopyranosyl)-β-D-glucopyranoside)。
在实施方式中，糖基古菌醇具有式I:
其中n是0或1；
R和R’独立地是氢或羟基；并且
Y是氢或硫酸根基团，并且至少一个Y是硫酸根基团。
在实施方式中，糖基古菌醇具有结构：
在本文所述佐剂组合物的实施方式中，糖基古菌醇的药学上可接受的盐是钠盐、钙盐或镁盐。
在本文所述佐剂组合物的实施方式中，糖基古菌醇或其药学上可接受的盐包括在古细菌脂质体内。在实施方式中，古细菌脂质体进一步包括至少一种附加脂质。在实施方式中，至少一种附加脂质是带中性电荷或不带电荷的糖脂。在进一步的实施方式中，至少一种附加脂质是乳糖基古菌醇、鼠李糖基-乳糖基古菌醇、三葡糖基古菌醇或其任意两种或多种的组合。在实施方式中，糖基古菌醇或其药学上可接受的盐与至少一种附加脂质的摩尔％比率为99.9999:0.0001至30:70。在实施方式中，糖基古菌醇或其药学上可接受的盐与至少一种附加脂质的摩尔％比率为约50:50。
在本文所述佐剂组合物的实施方式中，至少一种免疫刺激剂或其药学上可接受的盐包括TLR4激动剂、TLR3激动剂、TLR9激动剂或其任意两种或多种的组合。在实施方式中，TLR3激动剂是聚肌苷:聚胞苷酸聚(I:C)。在实施方式中，TLR4激动剂是单磷酰脂质A(MPLA)。在实施方式中，TLR9激动剂是寡核苷酸。在进一步的实施方式中，寡核苷酸包括一个或多个CpG基序。
在本文所述佐剂组合物的实施方式中，至少一种免疫刺激剂包括皂苷或其药学上可接受的盐。在实施方式中，皂苷或其药学上可接受的盐包括三萜糖苷。
在本文所述佐剂组合物的实施方式中，至少一种免疫刺激剂包括QS-21。
在本文所述佐剂组合物的实施方式中，糖基古菌醇或其药学上可接受的盐与至少一种免疫刺激剂或其药学上可接受的盐的质量比为100:1至100:50。
进一步的方面是包括抗原和本文所述佐剂组合物的免疫原性组合物。在实施方式中，抗原是肽、蛋白质或病毒样颗粒。在实施方式中，免疫原性组合物进一步包括药学上可接受的载体。在实施方式中，免疫原性组合物是疫苗组合物。在实施方式中，免疫原性组合物通过混合糖基古菌醇或其药学上可接受的盐、至少一种免疫刺激剂和抗原来制备。在实施方式中，免疫原性组合物用于肠胃外施用或粘膜施用。在进一步的实施方式中，免疫原性组合物用于肌内施用。
在实施方式中，免疫原性组合物在施用至受试者时引起细胞介导的应答和体液应答。在实施方式中，体液应答包括IgG应答。在实施方式中，细胞介导的应答包括CD4+应答、CD8+应答、细胞毒性应答和至少一种细胞因子的产生中的至少一者。在进一步的实施方式中，至少一种细胞因子包括IFN-γ。
另一个方面是本文所述的免疫原性组合物用于在受试者中诱导免疫应答。在实施方式中，免疫应答包括细胞介导的应答和体液应答。在实施方式中，体液应答包括IgG应答。在实施方式中，细胞介导的应答包括CD4+应答、CD8+应答、细胞毒性应答和至少一种细胞因子的产生中的至少一者。在进一步的实施方式中，至少一种细胞因子包括IFN-γ。
另一个方面是一种在受试者中诱导免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的免疫原性组合物。在实施方式中，免疫应答包括细胞介导的应答和体液应答。在实施方式中，体液应答包括IgG应答。在实施方式中，细胞介导的应答包括CD4+应答、CD8+应答、细胞毒性应答和至少一种细胞因子的产生中的至少一者。在进一步的实施方式中，至少一种细胞因子包括IFN-γ。在实施方式中，免疫原性组合物通过肠胃外或粘膜施用给予受试者。在进一步的实施方式中，免疫原性组合物通过肌内施用给予受试者。
另一个方面是一种制备免疫原性组合物的方法，该方法包括将抗原与本文所述的佐剂组合物组合。
附图说明
图1示出了不同佐剂和佐剂组合的体内CTL活性。通过用来自卵清蛋白(OVA)的CD8表位肽脉冲来自初次接受试验的小鼠的CFSE标记的脾细胞来形成靶细胞，然后将其转移到免疫小鼠。在第二天(第28天：通过肌内途径第二次免疫后7天)，收集脾细胞并通过流式细胞术测定靶细胞的水平。分组数据表示为平均值+SEM(n＝10只/组)。
图2示出了通过IFN-γ分泌(CD8+T细胞)测定的OVA特异性细胞应答。在第28天(第二次免疫后7天)收集用单独(无)的OVA抗原或者与SLA古细菌脂质体、其他佐剂(聚(I:C)、Resiquimod(R848)、CpG、MPLA、QS-21、Pam3CSK4)或SLA和其他佐剂的组合一起配制的OVA抗原免疫的小鼠的脾细胞，并在用CD8表位肽刺激时通过IFN-γELISpot分析所述脾细胞。分组数据表示为平均值+SEM(n＝10只/组)。
图3示出了通过IFN-γ分泌(CD4+T细胞)测定的卵清蛋白(OVA)特异性细胞应答。在第28天(第二次免疫后7天)收集用单独(无)的OVA抗原或者与SLA古细菌脂质体、其他佐剂(聚(I:C)、Resiquimod(R848)、CpG、MPLA、QS-21、Pam3CSK4)或SLA和其他佐剂的组合一起配制的OVA抗原免疫的小鼠的脾细胞，并在用OVA CD4表位肽刺激时通过IFN-γELISpot分析所述脾细胞。分组数据表示为平均值+SEM(n＝10只/组)。
图4示出了小鼠中的抗原特异性抗体滴度。在第28天(通过肌内途径第二次免疫后7天)收集用单独(无)的OVA抗原或者与SLA古细菌脂质体、其他佐剂(聚(I:C)、Resiquimod(R848)、CpG、MPLA、QS-21、Pam3CSK4)或SLA和其他佐剂的组合一起配制的OVA抗原免疫的小鼠的血清，并通过ELISA分析血清的抗原特异性IgG抗体。分组数据表示为几何平均滴度+95％置信区间(n＝10只/组)。
图5示出了小鼠中的抗原特异性抗体亚类IgG2c的滴度。在第28天(第二次免疫后7天)收集用单独(无)的OVA抗原或者与SLA古细菌脂质体、其他佐剂(聚(I:C)、Resiquimod(R848)、CpG、MPLA、QS-21、Pam3CSK4)或SLA与其他佐剂的组合一起配制的OVA抗原免疫的小鼠的血清，并通过ELISA分析血清的抗原特异性IgG2c抗体。分组数据表示为几何平均滴度+95％置信区间(n＝10只/组)。
图6示出了体内CTL活性。在第0天和第21天用单独的乙型肝炎表面抗原HBsAg或者与SLA古细菌脂质体、聚(I:C)或SLA+聚(I:C)的组合一起配制的乙型肝炎表面抗原HBsAg免疫小鼠。通过用来自HbsAg的CD8表位肽脉冲来自初次接受试验的小鼠的CFSE标记的脾细胞来制备靶细胞。在第27天和第二天(第28天：第二次免疫后7天)，将靶细胞转移到免疫小鼠，收集脾细胞并通过流式细胞术测定靶细胞的％杀死。分组数据表示为平均值+SEM(n＝5只/组)。
图7示出了加强前小鼠中的抗原特异性抗体滴度。用单独的HBsAg抗原或者与SLA古细菌脂质体、聚(I:C)、CpG或SLA和聚(I:C)或CpG的组合一起配制的HBsAg抗原免疫小鼠。在单剂量后第20天收集血清，并通过ELISA分析血清的抗原特异性IgG抗体。分组数据表示为几何平均滴度+95％置信区间(n＝5只/组)。
图8示出了加强后小鼠中的抗原特异性抗体滴度。在第0&21天，用单独的HBsAg抗原或与SLA古细菌脂质体、其他佐剂(聚(I:C)和CpG)或SLA和其他佐剂的组合一起配制的HBsAg抗原免疫小鼠。在第28天(通过肌内途径第二次免疫后7天)收集血清，并通过ELISA测量血清的抗原特异性IgG抗体的水平。分组数据表示为几何平均滴度+95％置信区间(n＝5只/组)。
图9示出了通过IFN-γELISpot分析的OVA特异性细胞应答。在第28天(第三次免疫后7天)收集用单独的OVA长肽或者与SLA古细菌脂质体、聚(I:C)或SLA+聚(I:C)的组合一起配制的OVA长肽免疫的小鼠的脾细胞，并在用OVA CD8(顶部)或CD4(底部)表位肽刺激时通过IFN-γELISpot分析所述脾细胞。分组数据表示为平均值+SEM(n＝5只/组)。
图10示出了通过IFN-γELISpot分析的肿瘤相关联的抗原特异性细胞应答。在第28天(第三次免疫后7天)收集用单独的覆盖CD8表位形式Tryp1、PMEL和Trp2的3种长肽或者与SLA古细菌脂质体、聚(I:C)或SLA+聚(I:C)一起配制的覆盖CD8表位形式Tryp1、PMEL和Trp2的3种长肽免疫的小鼠的脾细胞，并在用CD8表位肽刺激时通过IFN-γELISpot分析所述脾细胞。分组数据表示为平均值+SEM(n＝5只/组)。
图11示出了在B16-OVA肿瘤模型中接种OVA合成长肽(SLP)疫苗制剂的小鼠的存活。
图12示出了在第0天皮下注射了5×105个B16-OVA细胞并在第3、10和17天在有或没有佐剂的情况下用OVA SLP(30μg)肌内免疫的单个C57BL/6小鼠(n＝10只/组)中B16-OVA肿瘤生长的动力学。
图13示出了通过ELISpot测定法确定的SARS-CoV-2刺突特异性细胞应答。在第0天和第21天，用单独的1μg的SARS-CoV-2刺突蛋白(SmT1)或者与SLA、CpG和聚(I:C)(单独或组合地)一起的1μg的SARS-CoV-2刺突蛋白(SmT1)对C57BL/6小鼠进行肌内免疫。在第28天收获脾细胞，并且当单独用刺突肽池或培养基刺激时，通过IFN-γ+ELISpot(n＝10只/组)分析脾细胞。
图14示出了通过细胞内细胞因子染色(ICCS)确定的SARS-CoV-2刺突特异性CD4+和CD8+细胞应答。在第0天和第21天，用单独的1μg的重组SARS-CoV-2刺突蛋白(SmT1)或者与SLA、CpG和聚(I:C)(单独或组合地)一起的1μg的重组SARS-CoV-2刺突蛋白(SmT1)对C57BL/6小鼠进行肌内免疫。在第28天收获脾细胞，并且当通过单独的刺突肽池或培养基刺激时通过ICCS(n＝5只/组)分析脾细胞。
图15示出了仓鼠中SARS-CoV-2刺突特异性抗体滴度。在第0±21天，用单独的3μg的SmT1或者与SLA、CpG或SLA+CpG一起的3μg的SmT1对叙利亚黄金仓鼠进行肌内免疫。在第21天(上部图)和第34天(下部图)收集血清，并通过ELISA测量抗原特异性IgG抗体的水平。分组数据表示为几何平均滴度+95％置信区间(n＝6只/组)。
具体实施方式
定义
如本文所用，以下术语可以具有下文赋予它们的含义，除非另有明确规定。然而，应当理解，本领域普通技术人员已知或理解的其他含义也是可能的，并且在本公开的范围内。在冲突的情况下，本公开包括定义将起到控制作用。此外，本文提供的材料、方法和示例仅是例示性的，并且不意在限制。
在提供数值范围的情况下，应理解，除非上下文另有明确规定，否则该范围的上限与下限之间的每个中间值至下限的单位的十分之一，以及该所述范围内的任何其他所述值或中间值，均包含在说明书中。从任何下限到任何上限的范围是可预期的。
如本文所用的术语“约”可以用于考虑本领域普通技术人员将预期的实验误差、测量误差和变化。例如，“约”可以表示参考的指示值的正或负10％或者正或负5％。
如在本文中所用，单数形式“一/一个(a)”、“一/一个(an)”和“该/所述(the)”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。
如本文所用的短语“和/或”应理解为表示这样结合的要素的“任一者或两者”，即，在一些情况下联合存在而在其他情况下分离存在的要素。用“和/或”列出的多个要素应该以相同的方式解释，即这样结合的要素的“一个或多个”。除了由“和/或”从句具体指明的要素之外，还可以任选地存在其他要素，无论要素与具体指明的那些要素相关或不相关。
说明书和权利要求书中使用的“或”应理解为与上文定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即包括许多或一系列要素以及任选地，附加的未列出的项目中的至少一者，但也包括一者以上。只有明确相反指明的术语，诸如“……的仅一者”或“……的只有一者”或当在权利要求中使用时，“由……组成”将指包括许多或一系列要素中的只有一个要素。一般而言，如本文所用的术语“或”在前面带有排他性术语(诸如“任一者”、“……的一者”、“……的仅一者”或“……的只有一者”)时仅应被解释为表示排他性选择(即，“一者或另一者，但不是两者”)。
如本文所用，所有过渡短语，诸如“包括/包含(comprising)”、“包括/包含(including)”、“携带”、“具有”、“包含/含有(containing)”、“涉及(involving)”、“持有”、“由……组成”等，应理解为开放式的，即表示包括但不限于。只有过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别是封闭或半封闭的过渡短语。
如本文所用，短语“至少一者/至少一个/至少一种”或“一个或多个/一种或多种”在提及一个或多个要素列表时，应理解为选自要素列表中的任何一个或多个要素的至少一个要素，但不一定包括要素列表中具体列出的每个要素中的至少一者，也不排除要素列表中要素的任何组合。这个定义还允许除了在短语“至少一者/至少一个/至少一种”所指的要素列表中具体指明的要素之外，要素可以任选地存在，无论与具体指明的那些要素相关或不相关。
如本文所用，术语“佐剂”指的是增加和/或定向对抗原的特异性免疫应答的试剂。
如本文所用，术语“免疫刺激剂”指的是当引入受试者体内时刺激免疫应答的试剂。
如本文所用，术语“糖基古菌醇”指的是包括糖部分和选自古菌醇核心部分和复合古菌醇(caldarchaeol)核心部分的核心脂质部分的糖脂。糖部分可以是单糖部分或寡糖部分，诸如二糖、三糖或其他多糖。糖分子手性中心处的立体化学可以是R构型或S构型或其任意组合。古菌醇核心部分是通常在古菌中发现的二醚脂质结构，其包括连接到甘油分子的sn-2和sn-3位置的两个植烷基链(sn-2,3-二植烷基甘油二醚)。古菌醇核心部分的手性中心处的立体化学可以是R构型或S构型或其任意组合。为古菌醇核心部分的二聚体的复合古菌醇核心部分是通常在古菌中发现的四醚脂质结构，其包括由两条植烷基链连接的甘油分子(sn-2,3-二二植烷基甘油四醚)。如本文所用，术语“古菌醇核心部分”和“复合古菌醇核心部分”包括天然、半合成和合成来源的脂质结构。在糖基古菌醇中，核心脂质部分通过甘油的sn-1位处的醚键与糖部分结合。
术语“Toll样受体(TLR)激动剂”指的是靶向一种或多种Toll样受体(TLR)的激动剂。TLR是跨膜模式识别受体家族，其感知病原体或内源性损伤信号，并启动先天和适应性免疫应答。在人类中已知有10种功能性TLR(TLR 1-10)，但是在其他生物中已知有另外的TLR。例如，小鼠有12种TLR(TLR1-9和TLR 11-13)。
皂苷是包括具有一个或多个糖链的三萜或类固醇苷元的一组分子。皂苷主要在植物中发现，但它们可以由其他生物(诸如海星和海参)产生。如本文所用，术语“皂苷”包括天然来源的皂苷、合成皂苷和皂苷衍生物；包括半合成皂苷衍生物，诸如Moses等人(2014)中描述的那些。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指的是所公开化合物的衍生物，其中，母体化合物通过形成其酸盐或碱盐而进行改造。药学上可接受的盐的示例包括但不限于碱性残基(诸如胺)的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基(诸如羧酸)的碱盐或有机盐；等等。药学上可接受的盐包括例如由无毒无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐或季铵盐。例如，此类常规的无毒盐包括衍生自无机酸的那些，所述无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等等；以及由有机酸制备的盐，所述有机酸诸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸、羟乙磺酸等等。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指的是与药物施用相容的载体。本领域已知的药学上可接受的载体包括但不限于无菌水、盐水、葡萄糖和缓冲溶液。药学上可接受的载体可以包括助剂，所述助剂包括但不限于稀释剂、稳定剂(例如糖和氨基酸)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂、粘度增强添加剂、着色剂等等。
如本文所用，术语“疫苗组合物”指的是在药学上可接受的载体中包含至少一种抗原或免疫原、或包含编码至少一种抗原或免疫原的核酸分子的组合物，其用于在受试者中诱导针对抗原或免疫原的免疫应答，用于在受试者中提高针对疾病和/或感染的免疫力。抗原和免疫原的常见示例包括蛋白质、肽和多糖。一些抗原包括与蛋白质、肽和/或多糖组合的脂质和/或核酸。
如本文所用，术语“肽”指的是包括通过肽键共价连接的两个或多个氨基酸的多肽。术语“肽”典型地用于指包括2至50个氨基酸的短多肽，尽管“肽”也可以用于指较长的多肽。类似地，“多肽”可以具有任何长度，只要它包括至少两个氨基酸。
如本文所用，术语“蛋白质”指的是包括一个或多个多肽的生物分子。典型地，术语“蛋白质”用于描述长度大于50个氨基酸的多肽，尽管该术语也可以用于描述包括50个或更少氨基酸的多肽。蛋白质可以具有一级结构、二级结构、三级结构和/或四级结构。此外，蛋白质可以包括官能团，诸如脂质、碳水化合物、磷酸基团、甲基、S-亚硝酰基和N-乙酰基。
如本文所用，术语“病毒样颗粒”(VLP)指的是通过来自病毒的结构(例如包膜和/或衣壳)蛋白的自组装、不掺入病毒的遗传物质形成的非感染性颗粒。
如本文所用，“肠胃外施用”指的是非口服施用，典型地通过注入或输注。肠胃外施用的示例包括皮下施用、腹膜内施用、静脉内施用、皮内施用和肌内施用。
如本文所用，“粘膜施用”指的是对粘膜施用，以允许跨粘膜递送。粘膜施用的示例包括鼻腔施用、直肠施用、阴道施用、眼部施用、舌下施用、颊施用和口腔施用。
如本文所用，术语“细胞介导的应答”指的是特征在于特异性T细胞的扩增群体的免疫应答，其在存在识别抗原的情况下，局部产生细胞因子。“细胞介导的应答”可以可互换地称为“细胞介导的免疫”(CMI)或“细胞介导的免疫应答”。细胞介导的免疫通常包括产生细胞因子的CD4 T细胞。细胞介导的应答可以包括CD4+应答、CD8+应答和细胞毒性应答中的至少一者。如本文所用，术语“CD8+应答”和“细胞毒性应答”不同于Th1/Th2免疫应答，其中CD8 T细胞代表T细胞的特定亚组，其主要作用是直接杀死受感染细胞和癌细胞。相反，Th1/Th2平衡特异性地表明CD4 T细胞炎症特征。例如，由CD4细胞产生IFN-g表明Th1应答。虽然CD4 T细胞的亚组可以具有细胞毒性活性，但是大多数CD4 T细胞作为辅助细胞发挥作用，其不直接杀死被鉴定为外来的细胞，而是帮助确定免疫系统如何应答。
如本文所用，术语“体液应答”指的是由细胞外液中发现的大分子(诸如分泌型抗体、补体蛋白和某些抗微生物肽)介导的免疫应答。抗体(其可以可互换地称为免疫球蛋白)是由活化的B细胞分泌的抗原结合蛋白。“体液应答”可以可互换地称为“体液免疫”、“体液免疫应答”或“抗体介导的免疫”。
如本文所用，术语“受试者”指的是动物，其包括人类和非人类动物。非人类受试者的示例包括但不限于宠物、家畜和用于抗体生产和/或疫苗研发的动物。用于抗体生产和/或疫苗研发的动物的示例包括但不限于啮齿动物、兔子、雪貂、非人灵长类动物、猪、羊和牛。
说明
提供了佐剂组合物，其包括：糖基古菌醇或其药学上可接受的盐，以及选自Toll样受体(TLR)激动剂或其药学上可接受的盐和皂苷或其药学上可接受的盐的至少一种免疫刺激剂。糖基古菌醇中的核心脂质部分可以通过化学合成获得，或者从古细菌(archaebacterium)(诸如但不限于盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarum))的极性脂质获得。在实施方式中，糖醛醇包括古菌醇核心部分。在实施方式中，糖基古菌醇可以是合成的糖基古菌醇、或天然存在的糖基古菌醇的半合成衍生物。产生合成古菌醇的方法在本领域是已知的，例如由Aoki和Poulter(1985)所展示的。在一些实施方式中，糖基古菌醇可以是如第10,647,737号美国专利中所述的硫酸化糖基古菌醇。
在一些实施方式中，糖基古菌醇带负电荷，且包括加到糖基古菌醇的糖类基团上的一个或多个硫酸根部分。古菌醇对苛刻的合成条件非常稳定，因为它典型地有至饱和的类异戊二烯链的稳定的醚键。结果是硫酸化糖脂，其易于水合形成能够包埋化合物诸如但不限于蛋白质和肽的稳定的结构，用于增强对共同施用的抗原的免疫应答。然而，增强免疫应答可能不需要包埋化合物。将硫酸化糖脂与抗原掺混可以导致增强的对抗原的免疫应答。硫酸化糖类基团将包括至少一个硫酸化部分。在某些非限制性实施方式中，至少一个硫酸根部分可以位于末端单糖部分的6’位置。在实施方式中，硫酸化糖类基团包括仅一个硫酸根部分。
硫酸化糖基可以包括一个或多个单糖部分，其包括甘露糖(Man)部分、葡萄糖(Glc)部分、鼠李糖(Rha)部分或半乳糖(Gal)部分或其两种或多种的任意组合。在进一步的实施方式中，硫酸化糖类基团可以是硫酸化寡糖基团，诸如硫酸化二糖或三糖基团。在实施方式中，硫酸化寡糖基可以是硫酸化乳糖基基团，或更具体地，6’-S-乳糖基基团。在其他实施方式中，硫酸化乳糖基基团是6’-硫酸根-β-D-Galp-(1,4)-β-D-Glcp。
核心脂质部分可以为古菌醇核心部分或复合古菌醇核心部分。在实施方式中，古菌醇部分是2,3-双(((3,7,11)-3,7,11,15-四甲基十六烷基)氧基)丙-1-醇。
在另一个实施方式中，糖基古菌醇是带电荷的类异戊二烯糖脂，其包括通过β键共价连接到古菌醇核心部分的甘油主链的游离sn-1羟基基团的硫酸化糖类基团。在实施方式中，糖基古菌醇是2,3双[(3,7,11)-3,7,11,15-四甲基十六烷基氧基]丙-1-基4-O-(6-O-磺基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷。
在进一步的实施方式中，免疫原性组合物包括选自Toll样受体(TLR)激动剂或其药学上可接受的盐和皂苷或其药学上可接受的盐的至少一种免疫刺激剂，以及下式(式I)的糖基古菌醇或其药学上可接受的盐：
其中n是0或1；R和R’独立地是氢或羟基；并且Y是氢或硫酸根基团，并且至少一个Y是硫酸根基团。卷曲键表示糖原子处的R或S立体化学，并且包括立体化学的所有可能组合。
在由式I化合物定义的糖基古菌醇的实施方式中，n是0，并且R是OH。在该实施方式中，硫酸化糖基可以包括甘露糖(Man)部分、葡萄糖(Glc)部分或半乳糖(Gal)部分；或者选自甘露糖部分、葡萄糖部分和半乳糖部分的两种不同部分的任意组合。
在又进一步的实施方式中，糖基古菌醇可以是以下化合物中的一者：6’-硫酸根-α-D-Manp-(1,6)-β-D-Galp-(1,4)-β-D-Glcp-(1,1)-古菌醇、6’-硫酸根-β-D-Glcp-(1,6)-β-D-Galp-(1,4)-β-D-Glcp-(1,1)-古菌醇、或6’-硫酸根-β-D-Galp-(1,4)-β-D-Glcp-(1,6)-β-D-Glcp-(1,1)-古菌醇。
在实施方式中，糖基古菌醇是钠(2R)-2,3-双[(3R,7R,11R)-3,7,11,15-四甲基十六烷基氧基]丙-1-基-4-O-(6-O-磺基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷，并具有结构：
本文所述的糖基古菌醇可以作为药学上可接受的盐存在。药学上可接受的盐可以是与药物施用相容的任何盐。本领域技术人员将知晓许多药学上相容的盐，并且它们包括，例如，钾盐、钙盐、铝盐、钠盐、锌盐和锂盐。在实施方式中，药学上可接受的盐是钠盐、钙盐或镁盐；尽管可以使用任何已知的药学上相容的和活性的盐。
在一些实施方式中，糖基古菌醇与至少一种免疫刺激剂的质量比为100:1至100:50。例如，质量比可以是100:1至100:50、100:10至100:50、100:30至100:50、100:40至100:50、100:1至100:40、100:1至100:30、100:1至100:20、或100:20至100:40；或者前述范围内的任何范围或子范围。
在一些实施方式中，糖基古菌醇包括在古细菌脂质体中。古细菌脂质体是一种脂质体(脂质囊泡)，其包括对古细菌结构域独特的一种或多种醚脂质。古细菌脂质体可以由天然古菌膜糖脂和/或合成或半合成糖脂或糖脂类似物制成。古菌型糖脂典型地由古菌醇(二醚)和/或复合古菌醇(四醚)核心结构组成，其中规则地分支且通常完全饱和的植烷基链(长度为20-40个碳)通过醚键附接到甘油主链的sn-2,3碳(Benvegnu等人，2009)。
在一些实施方式中，古细菌脂质体进一步包括至少一种附加脂质。在实施方式中，至少一种附加脂质是中性或不带电荷的糖脂。在实施方式中，至少一种附加脂质是乳糖基古菌醇、鼠李糖基乳糖基古菌醇、三葡糖基古菌醇或其任意两种或多种的组合。在实施方式中，糖基古菌醇与至少一种附加脂质的mol％比率为99.9999:0.0001至30:70。例如，糖基古菌醇与至少一种附加脂质的mol％比率可以为99.9999:0.0001至30:70、90:10至30:70、80:20至30:70、70:30至30:70、60:40至30:70、50:50至30:70、40:60至30:70、35:65至30:70、55:45至45:55，或60:40至40:60。mol％比率也可以为这些范围内的任何范围或子范围。在实施方式中，糖基古菌醇与至少一种附加脂质的mol％比率为约50:50。
在进一步的实施方式中，可以将古细菌脂质体配制成具有约-20mV至约-70mV的表面电荷。作为示例，古细菌脂质体可以包括mol％比率为100:0至30:70或约50:50的6’-硫酸根乳糖基古菌醇和不带电荷的乳糖基古菌醇，在这种情况下，古细菌脂质体的表面电荷可以优选为约-25至约-45mV。
在特定实施方式中，古细菌脂质体可以具有介于约50nm与约350nm之间的平均直径。
在实施方式中，至少一种免疫刺激剂包括TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR9激动剂或其任意两种或多种的组合。TLR3激动剂的示例包括病毒衍生的双链或单链RNA和合成RNA寡核糖核苷酸(ORN)(诸如聚肌苷-聚胞苷酸(聚(I:C)))。TLR4激动剂的示例包括脂多糖(LPS)及其衍生物单磷酰脂质A(MPLA)以及合成激动剂(诸如吡喃葡萄糖脂佐剂(GLA))。TLR9激动剂的示例包括微生物和病毒寡核苷酸以及包括未甲基化的CpG基序(CpG ODN)的合成寡核苷酸。TLR3激动剂可以是聚(I:C)或聚(I:C)衍生物，诸如聚-IC12U或聚-ICLC/>例如如Martins等人(2014)所述；TLR4激动剂可以是单磷酰脂质A(MPLA)；并且TLR9激动剂可以是寡核苷酸，其可以包括一个或多个CpG基序。
在实施方式中，至少一种免疫刺激剂包括皂苷。本领域已知多种皂苷，例如在Moses等人(2014)和Hickie等人(2011)中描述的。在实施方式中，皂苷是三萜糖苷，也称为三萜皂苷。在实施方式中，至少一种免疫刺激剂包括QS-21或QS-21的活性成分。QS-21是皂荚树(Quillaja saponaria)提取物的一部分，其包括可溶性三萜糖苷的混合物(Rajupathi等人，2011)。
进一步提供了免疫原性组合物，其包括如本文所述的佐剂组合物以及抗原。抗原的非限制性示例包括：类毒素；化学品；感染剂，诸如细菌、病毒或真菌(其可以是减毒的或杀死的)；蛋白质；肽；多糖以及共轭分子。免疫原性组合物可以是疫苗组合物。
免疫原性组合物可以进一步包括药学上可接受的载体。药学上可接受的载体的非限制性示例包括水、盐水、葡萄糖和缓冲溶液。药学上可接受的载体也可以包括附加剂，例如，辅助剂，诸如稀释剂、稳定剂、防腐剂、润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂、粘度增强添加剂和着色剂。
在实施方式中，通过掺混至少一种免疫刺激剂和抗原来制备免疫原性组合物。
本文所述的免疫原性组合物可以通过本领域技术人员理解的任何合适的方式施用。免疫原性组合物的常用递送方法的非限制性示例包括口服施用、皮下施用、肌内施用、皮内施用和鼻内施用。在实施方式中，免疫原性组合物通过肠胃外或粘膜施用来递送。在进一步的实施方式中，免疫原性组合物通过肌内施用来递送。
本文所述的免疫原性组合物在施用受试者时可以引起细胞介导的应答和体液应答二者。如本领域技术人员所理解的，各种细胞介导的应答和体液应答是可能的。例如，哺乳动物有五种抗体类型(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)，并且不同类型的抗体可以响应不同的抗原而产生。类似地，细胞介导的免疫应答可以包括1型应答、2型应答和/或3型应答；其中的每一个涉及不同的细胞类型和细胞因子(Annunziato等人，2015)。在实施方式中，体液应答包括IgG应答。在实施方式中，细胞介导的应答包括CD4+应答、CD8+应答、细胞毒性应答和至少一种细胞因子的产生中的至少一者。在实施方式中，细胞因子包括IFN-γ。
本文所述的免疫原性组合物可以用于在受试者中诱导免疫应答。进一步提供了如本文所述的免疫原性组合物在受试者中诱导免疫应答的用途。还提供了在受试者中诱导免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的免疫原性组合物。从用途或方法产生的免疫应答可以如本文所述。
还提供了制备免疫原性组合物的方法，该方法包括将本文所述的佐剂组合物与抗原组合。
实施例
以下非限制性实施例例示了本公开的方面：
实施例1佐剂-抗原组合的制备
硫酸化乳糖基古菌醇(SLA；6’-硫酸根-β-D-Galp-(1,4)-β-D-Glcp-(1,1)-古菌醇)如前所述进行合成(Whitfield等人，2010)，以及古细菌脂质体如前所述进行制备(Jia等人，2019)。简而言之，将30mg的SLA脂质溶解在氯仿/甲醇中；在N2气体下温和加热除去溶剂后形成薄膜。施加真空以确保完全除去痕量溶剂。为了制备预先形成的SLA古细菌脂质体，首先在700μL的不含蛋白质抗原的Milli-Q水中水合干脂质。脂质分散体在40℃至50℃摇动2-3小时，直到完全悬浮。接下来，在40℃下，在超声波水浴(Fisher Scientific，加拿大安大略省渥太华)中进行短暂的超声处理达至60分钟，直到获得期望的粒径(介于100nm和200nm之间)。加入大致300μL的10x PBS(Millipore Sigma Canada，安大略省奥克维尔)以平衡渗透压并达到pH＝7.4。预先形成的空SLA古细菌脂质体以浓度为30-40mg/mL储存在4℃，直到使用。
所有toll样受体激动剂(即CpG、MPLA、Pam3CSK4、聚(I:C)和Resiquimod(R848))均购自InvivoGen(美国加利福尼亚州总部)。QS-21购自Desert King(美国加利福尼亚州圣地亚哥)。根据制造商的说明制备储备溶液，CpG、MPLA、Pam3CSK4、R848和QS-21为1mg/mL，并且聚(I:C)为3-10mg/mL。
卵清蛋白(OVA；VI型，Sigma-Aldrich，美国圣路易斯密苏里州)和重组HBsAg(HBsAg；亚型adw；Fitzgerald Industries International,美国马萨诸塞州阿克顿)的抗原储备溶液以1mg/mL的浓度制备。OVA(氨基酸253-277:LEQLESIINFEKLTEWTSSNVMEER,SEQID NO:1)、Tryp1(氨基酸447-470:VTNTEMFVTAPDNLGYMYEVQWPG,SEQ ID NO:2)、PMEL(氨基酸17-41:ALLAVGALEGPRNQDWLGVPRQLVT,SEQ ID NO:3)和Trp2(氨基酸172-196:TQPQIANCSVYDFFVWLHYYSVRDT,SEQ ID NO:4)长肽由德国柏林的JPT PeptideTechnologies GmbH合成。基于它们的溶解度曲线，OVA、Tryp1、PMEL和Trp2肽分别以4.4mg/mL溶于PBS/0.1M NaOH，10mg/mL溶于PBS，8mg/mL溶于水和40mg/mL溶于DMSO。
包括单一佐剂(SLA、CpG、聚(I:C)、MPLA、R848、Pam3CSK4或QS-21)的疫苗组合物如先前针对SLA描述的(Jia等人，2019)或根据制造商针对其他佐剂的说明来制备。
使用卵清蛋白(OVA)作为抗原，通过首先将空的预先形成的SLA古细菌脂质体与附加佐剂(聚(I:C)、CpG、MPLA、R848、Pam3CSK4或QS-21)混合并短暂涡旋来制备组合佐剂制剂。此后，加入OVA抗原溶液并短暂涡旋。加入PBS缓冲液以达到免疫所需的浓度。每种成分的最终剂量浓度如表1所示。使用HBsAg作为抗原，通过首先将空的预先形成的SLA古细菌脂质体与聚(I:C)或者CpG混合并短暂涡旋来制备组合佐剂制剂。此后，加入HBsAg抗原溶液并短暂涡旋。向掺混物中加入PBS缓冲液，得到免疫所需的制剂。每种成分的最终剂量浓度如表2所示。
使用长肽(LP)作为抗原，通过首先混合所需体积的PBS载体和佐剂(空的预先形成的SLA古细菌脂质体和/或聚(I:C))并短暂涡旋来制备组合佐剂制剂。此后，加入OVA长肽或者Tryp1、PMEL和Trp2长肽的组合，并短暂涡旋。每种成分的最终剂量浓度如表3所示。
表1：使用OVA蛋白作为抗原的疫苗组合物
表2：使用HBsAg(病毒样颗粒)作为抗原的疫苗组合物
表3：使用长肽(LP)作为抗原的疫苗组合物
实施例2：测试体内CTL活性
在第0和21天用OVA或HBsAg制剂免疫小鼠，其中，在第28天(第二次接种后7天)收集脾脏用于体内细胞溶解活性的测量。如前所述(Barber等人，2003)，对免疫小鼠的体内细胞溶解活性进行计算。制备来自同系未免疫小鼠的供体脾细胞悬液。将细胞分成两份等分试样。将一份等分试样与适当的CTL特异性肽(10μM；用于OVA实验的SIINFEKL，SEQ ID NO:6和用于HBsAg实验的IPQSLDSWWTSL，SEQ ID NO:5；JPT Peptide Technologies GmbH)在R10培养基中孵育。孵育30分钟后，用低浓度的CFSE(0.25μM；Thermo Fisher Scientific)和第二份肽脉冲等分试样用10XCFSE(2.5μM)染色。将两份细胞等分试样以1:1混合，并注入(每只小鼠20×106个细胞)到先前的免疫受体小鼠。在供体细胞转移后～20至22h时，从受体中取出脾脏，制备单细胞悬液，并在BD FortessaTM流式细胞仪(Becton Dickenson)上通过流式细胞仪分析细胞。根据Barber等人(2003)中提供的方程计算肽脉冲靶的体内裂解百分比。对于OVA免疫的动物，SLA+聚(I:C)或SLA+CpG的组合导致SIINFEKL(SEQ ID NO:6)标记的细胞的>80％杀死，而用每种佐剂单独(即SLA、聚(I:C)或CpG)观察到的杀死<50％(图1)。当SLA与MPLA或QS-21组合时，也看到一些相加效应，但是活性(～50％)不如SLA与聚(I:C)或CpG组合时看到的高。在OVA免疫的动物中，与SLA单独用作佐剂相比，SLA与R848或Pam3CSK4组合用作佐剂组合物未导致CTL活性增加。当用HBsAg-佐剂制剂免疫动物并注入用HBsAg CD8表位IPQSLDSWWTSL(SEQ ID NO:5)标记的细胞时，进一步证实了SLA和聚(I:C)在细胞溶解活性方面的协同作用。在接受用SLA+聚(I:C)佐剂化的HBsAg的小鼠中观察到50％杀死，而在用包含具有单独的SLA或聚(I:C)的抗原的制剂免疫的小鼠中观察到<10％杀死(图6)。
实施例3：通过ELISpot测定法检测IFN-γ分泌
通过ELISpot测定法对抗原特异性IFN-γ分泌细胞进行计算。简而言之，将脾细胞(最终细胞密度为4×105/孔)加入到涂有抗IFN-γ抗体(Mabtech Inc.，美国俄亥俄州辛辛那提市)的96孔ELISpot板中，并且在适当的抗原特异性刺激剂存在下(浓度为2μg/mL)，在37℃，5％CO2孵育20小时。对于OVA蛋白免疫的动物，将CD8 T细胞表位OVA257-264:SIINFEKL(SEQ ID NO:6)或CD4 T细胞表位OVA323-339:ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO:7)肽用作刺激剂。对于OVA长肽免疫的动物，用对应于包含在长肽序列中的CD8 T细胞表位OVA257-264:SIINFEKL(SEQ ID NO:6)或CD4 T细胞表位OVA266-277:TEWTSSNVMEER(SEQ ID NO:8)的肽来刺激细胞。同时，用包含在以下长肽中每一者内的单个CD8表位来刺激Tryp1/PMEL/Trp2长肽免疫的动物:Tryp1455-463:TAPDNLGYM(SEQ ID NO:9),PMEL25-33:EGPRNQDWL(SEQ ID NO:10)和Trp2180-188:SVYDFFVWL(SEQ ID NO:11)。所有肽均由JPT Peptide TechnologiesGmbH合成。细胞也在没有任何刺激剂的情况下孵育，以测量背景应答。然后根据制造商的说明孵育、洗涤并显色板。AEC底物(Becton Dickenson，美国新泽西州富兰克林湖)用于可视化斑点。使用自动ELISpot读板仪(BIOSYS，美国佛罗里达州迈阿密市)计数斑点。在用OVA全蛋白免疫的动物中，当小鼠分别接受包含SLA+聚(I:C)和SLA+CpG的制剂时，观察到平均208和143个IFNγ+SIINFEKL(SEQ ID NO:6)特异性斑点形成的细胞(SFC)/106个脾细胞(图2)。所有其他制剂(包含单一佐剂或SLA与R848、MPLA、QS-21或Pam3CSK4的组合)具有类似低水平的SIINFEKL(SEQ ID NO:6)-特异性细胞(即<30IFNγ+SFC/106个脾细胞)。当测量与OVACD4表位反应的SFC时，观察到类似的趋势，其中，只有用含有SLA+聚(I:C)或SLA+CpG的OVA制剂免疫的小鼠具有可检测的应答(图3)。使用长肽抗原进一步证实了SLA+聚(I:C)佐剂组合增强CD8 T细胞应答的能力。这些由以已知CD8表位为中心的24-25个氨基酸组成的长肽，单独配制或与SLA、聚(I:C)或SLA+聚(I:C)一起配制，并在第0天、第7天和第21天施用至动物。如上，收集脾脏并通过ELISpot对抗原特异性细胞进行分析。含有单一佐剂或不含佐剂的OVA长肽制剂诱导对SIINFEKL(SEQ ID NO:6)CD8表位反应的平均0-260个IFNγ+SFC/106个脾细胞，而在用SLA+聚(I:C)-佐剂制剂免疫的小鼠中，它们至少高6倍(即1597个IFNγ+SFC/106个脾细胞)(图9)。当用CD4表位(TEWTSSNVMEER，SEQ ID NO:8)肽刺激脾细胞时，观察到类似的趋势。用含有从自身抗原Tryp1、PMEL和Trp2鉴定的3种表位的长肽制剂免疫单独的小鼠。如用OVA长肽，疫苗组合物中SLA+聚(I:C)的组合比任何一个单独的佐剂诱导了更高数量的IFNγ+CD8 T细胞(图10)。
实施例4：测定IgG产生
小鼠血清中抗OVA或抗HBsAg抗体(Ab)的水平通过使用96孔高结合ELISA板(Thermo Fisher Scientific，美国马塞诸塞州沃尔瑟姆)的ELISA进行定量，所述板在室温(RT)用100μL的10μg/mL OVA(Sigma-Aldrich,美国密苏里州圣路易斯)的PBS或1μg/mLHBsAg(Fitzgerald Industries International)的16mM碳酸钠/34mM碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)(Sigma-Aldrich)包被过夜。用PBS/0.05％(PBS-T；Sigma-Aldrich)洗涤板五次，并且然后在37℃用200μL 10％胎牛血清(Thermo Fisher Scientific)的PBS或碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液分别对OVA和HBsAg封闭1小时。用PBS-T洗涤板五次后，加入100μL体积的具有10％胎牛血清的PBS-T中的3.162倍系列稀释的样本，并在37℃孵育1小时。用PBS/0.05％/>20(Sigma-Aldrich)洗涤五次后，在37℃加入100μL的山羊抗小鼠IgG或IgG2c-HRP(1:4000，Southern Biotech，美国亚拉巴马州伯明翰市)1小时。用PBS-T洗涤五次后，加入100μL/孔的稀释在0.05M柠檬酸盐缓冲液(pH 5.0)中的底物邻苯二胺二盐酸盐(OPD，Sigma-Aldrich)。板在黑暗中在室温显色30分钟。用50μL/孔的4N H2SO4终止反应。在450nm处用分光光度法检测结合的IgG抗体。血清中IgG的滴度定义为导致吸光度值(OD450)为0.2的稀释度，并使用/>软件(ID Business Solutions，英国吉尔福德市)来计算。在OVA免疫的小鼠中，与单独的包含SLA或聚(I:C)的制剂相比，接受具有SLA+聚(I:C)佐剂的制剂的动物的抗OVA IgG滴度高＞2倍(图4)。与单一佐剂制剂相比，在用SLA+CpG或SLA+Pam3CSK4免疫的动物中也观察到抗OVA IgG滴度的不太明显的增加，而SLA与MPLA的组合与单独的MPLA相比导致滴度的降低。当观察IgG2c亚型时，在疫苗组合物中包括聚(I:C)和SLA导致IgG滴度为33,533，相对于在聚(I:C)和SLA-佐剂化制剂中分别为5420和100(检测限)(图5)。在一个(图7)或两个(图8)疫苗剂量后，在HBsAg免疫的小鼠中观察到类似的趋势。包含SLA+聚(I:C)或SLA+CpG的疫苗组合物诱导的抗HbsAg IgG滴度比仅使用单一佐剂时高1.5-3倍。
实施例5：OVA SLP疫苗制剂在治疗性B16-OVA肿瘤攻击模型中的抗肿瘤活性
为了评估SLA+聚(I:C)作为用于肿瘤学应用的合成长肽(SLP)疫苗中的佐剂组合的潜在益处，在侵袭性B16-OVA黑素瘤肿瘤模型中评估了各种疫苗制剂。
如实施例1中所述生成SLA古细菌脂质体。聚(I:C)购自InvivoGen(美国加利福尼亚州圣地亚哥)，并按照制造商的说明以浓度为3mg/mL制备，并在使用前储存在-20℃。OVASLP(氨基酸253–277:LEQLESIINFEKLTEWTSSNVMEER)由JPT Peptide Technologies GmbH(德国柏林)合成。根据其理论等电点4，将其溶解在浓度为4.4mg/mL的弱碱性溶液(PBS/0.1M NaOH)中，并在-20℃下储存直至使用。
从Charles River Laboratories(加拿大魁北克省圣康斯坦)获得6-8周龄雌性C57BL/6小鼠。在免疫当天，通过首先混合所需体积的PBS载体和佐剂(空的预先形成的SLA古细菌脂质体和/或聚(I:C))并短暂涡旋来制备疫苗制剂。此后，加入OVA SLP并短暂涡旋。注入制剂中SLA、聚(I:C)和OVA长肽的最终浓度分别为20、1和0.6mg/mL。小鼠(n＝5-10只/组)通过肌内(i.m.)注入(50μL)到左侧胫骨前肌(T.A.)肌肉中进行免疫。佐剂(1mg SLA；50μg聚(I:C))和抗原(30μg肽)剂量水平基于我们实验室以前进行研究的数据。
治疗性肿瘤攻击模型(Challenge Model)：B16F0-OVA(表达质粒衍生的全长OVA)细胞(工程化以表达卵清蛋白的B16黑素瘤细胞)从Edith Lord博士(美国纽约州罗切斯特市罗切斯特大学)获得，并在R10培养基(含有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素/链霉素、1％谷氨酰胺和55μM 2-巯基乙醇的RPMI(均来自Thermo Fisher Scientific))中培养。通过将5×105个B16-OVA细胞以100μL的体积皮下(s.c.)注入到C57BL/6小鼠的下背部区域来诱导实体瘤(n＝10只/组)。在第3天、第10天和第17天，用有或没有佐剂的OVA SLP(30μg)对小鼠进行肌内免疫。单独的佐剂对照组接受SLA+聚(I:C)，没有OVA SLP，以确定由佐剂激活的先天免疫系统对肿瘤生长的任何潜在影响。从第8天开始，使用Digimatic数字卡尺(Mitutoyo500196，美国伊利诺斯州奥罗拉市)每周测量2-3次肿瘤大小(宽度和长度)的完全垂直测量。肿瘤体积的近似值，以mm3表示，通过长×宽×宽/2相乘来计算。贯穿整个研究持续期间，对动物进行监测。当小鼠达到以下人道终点之一时，对其实施安乐死:(1)肿瘤体积超过2000mm3，(2)溃疡出血肿瘤，以及(3)小鼠显示出临床疾病的体征(例如，毛皮起皱、很少活动、弯腰驼背、眼睛紧闭、非常虚弱)。由于这是治疗性肿瘤模型，所以只有在最终疫苗剂量前的任何时间点具有可测量的肿瘤(>100mm3)的小鼠才包括在分析中。结果如图11和表4所示。OVA SLP+SLA+聚(I:C)相对于OVA SLP+聚(I:C)的差异的统计学显著性：通过Mantel-Cox检验，*p<0.05。接受载体、单独的OVA SLP或OVA SLP+SLA的小鼠组之间的存活没有显著差异(平均存活21-23天)。
同时，非常温和的增长(中位存活为26.5天；p<0.05相对于单独的载体组)是在施用SLA+聚(I:C)(不含任何抗原)后观察到的。用佐剂对照的肿瘤生长延迟与先前的研究一致，这些研究表明，在类B16黑素瘤模型中，单独施用的聚(I:C)可激活天然杀伤细胞并抑制肿瘤生长[Miyake等人，2009]，而SLA已被显示具有内在的免疫刺激效果[Akach等人，2018]。在接受显示生成最强细胞溶解活性的两种制剂(即OVA SLP+聚(I:C)和OVA SLP+SLA+聚(I:C))中的任一者的动物中，中位存活进一步延长(中位存活分别为30天和38天)。
当直接测量肿瘤生长时，进一步证实了这些制剂的活性，其中，在接受OVA SLP与SLA+聚(I:C)组合的小鼠中观察到最慢的肿瘤生长(图12)。使用SLA+聚(I:C)作为与OVASLP的组合佐剂比用单独佐剂(即SLA+聚(I:C)而无SLP；p<0.01)或OVA SLP与聚(I:C)或SLA的组合(p<0.05)二者其一获得显著更长的存活(图11)。这些结果表明SLA+聚(I:C)佐剂组合诱导强烈的CD8+功能性T细胞的能力转化为在强健(vigorous)的鼠肿瘤模型中较慢的肿瘤生长和延长的存活。
表4：B16-OVA攻击的小鼠的中位存活。
实施例6：SARS-CoV-2刺突蛋白抗原SmT1与基于TLR激动剂的佐剂或SLA/TLR激动剂组合的免疫原性的比较
在第0天和第21天用单独的1μg的抵抗素三聚化刺突抗原(SmT1)(Akache等人，2021)或者以SLA、CpG、聚(I:C)、SLA+CpG或SLA+聚(I:C)一起佐剂化的1μg的抵抗素三聚化刺突抗原(SmT1)免疫小鼠(n＝10只/组)。选择1μg抗原的次最佳剂量，以更好地允许检测佐剂之间的潜在协同作用。在第28天收集的脾细胞通过IFN-γELISpot和细胞内细胞因子染色(ICCS)进行评估，以表征这些疫苗制剂诱导的抗原特异性细胞应答。尽管通过ELISpot测量，所有佐剂诱导的细胞应答水平显著高于单独抗原制剂(图13)，但是组合佐剂制剂诱导的IFN-γ+SFC水平最高，其中，用SLA+CpG和SLA+聚(I:C)佐剂化的SmT1分别诱导平均2,308和868个IFN-γ+SFC/106个脾细胞。用SLA+CpG佐剂化的制剂免疫的小鼠中的水平显著高于所有其他组中看到的(p<0.05)。ICCS用于描述IFN-γ+细胞是CD4+细胞亚型还是CD8+T细胞亚型。虽然在所有组中都可以看到IFN-γ+CD8+T细胞，但在佐剂化的组与未佐剂化的SmT1对照组之间没有统计学显著差异(图14)。相反，用SLA+CpG或SLA+聚(I:C)佐剂化的SmT1治疗的小鼠比与用未佐剂化的SmT1或用SLA、CpG或聚(I:C)佐剂化的SmT1免疫的那些小鼠相比，具有显著更高水平的IFN-γ+CD4+T细胞。各组之间的层次结构(hierarchy)反映了ELISpot结果，其中，SLA+CpG佐剂化的制剂诱导平均27,938个IFN-γ+细胞/106个CD4+T细胞。
实施例7：在仓鼠模型中用SLA、CpG或SLA+CpG佐剂化的基于SmT1的疫苗制剂的免疫原性
在第0±21天，用单独的3μg的SmT1或者与SLA、CpG或SLA+CpG一起的3μg的SmT1肌内免疫叙利亚黄金仓鼠(n＝6只/组)。在第21天(图15，上部图)和第34天(病毒攻击前1天)(图15，下部图)收集血清，并通过ELISA分析以确定抗体滴度。分组数据表示为几何平均值+95％置信区间。在第0天，在任何组中都没有检测到抗原特异性抗体(数据未示出)，在第21天和第34天，单独用载体或佐剂免疫的对照组也是如此(图15)。在单一疫苗剂量后，在单独用抗原免疫的所有仓鼠中观察到抗棘突IgG滴度，GMT(下限和上限95％CI)为150(37和605)(图15，上部图)。佐剂制剂诱导的抗原特异性抗体滴度显著高于单独抗原(P<0.0001)。在第34天，在第21天接受加强免疫的组中滴度增加了～5倍，而在仅在第0天免疫的组中几乎没有变化。尽管一些组仅接受单一初始疫苗剂量，但是在用佐剂化的制剂免疫的所有组中，滴度仍显著高于单独抗原组(p<0.0001；图15，下部图)。用SLA或SLA+CpG佐剂化的SmT1的仅初始疫苗方案分别诱导了6,050和26,801的GMT。在接受初始/加强方案的组中，SLA+CpG佐剂化的制剂比单一佐剂制剂诱导了显著更高的滴度：GMT为127，989，相对于用SLA或CpG佐剂化的SmT1的22,629–27,430(p<0.01)。
通过例示根据本公开实施方式的特定实施例，提供了前述实施例，以允许更好地理解本公开。所附权利要求不应限于实施例中提供的具体细节。而是，考虑到本领域的公知常识，它们应该被给予与说明书和附图的总教导相一致的最广泛的解释。
表5：序列
| 名称 | 序列 | 说明 |
| SEQ ID NO:1 | LEQLESIINFEKLTEWTSSNVMEER | OVA253-277 |
| SEQ ID NO:2 | VTNTEMFVTAPDNLGYMYEVQWPG | Tryp1447-470 |
| SEQ ID NO:3 | ALLAVGALEGPRNQDWLGVPRQLVT | PMEL17-41 |
| SEQ ID NO:4 | TQPQIANCSVYDFFVWLHYYSVRDT | Trp2172-196 |
| SEQ ID NO:5 | IPQSLDSWWTSL | HbsAg CD8表位 |
| SEQ ID NO:6 | SIINFEKL | CD8 T细胞表位OVA257-264 |
| SEQ ID NO:7 | ISQAVHAAHAEINEAGR | CD4 T细胞表位OVA323-339 |
| SEQ ID NO:8 | TEWTSSNVMEER | CD4 T细胞表位OVA266-277 |
| SEQ ID NO:9 | TAPDNLGYM | Tryp1455-463 |
| SEQ ID NO:10 | EGPRNQDWL | PMEL25-33 |
| SEQ ID NO:11 | SVYDFFVWL | Trp2180-188 |
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Leu Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp
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Thr Ser Ser Asn Val Met Glu Glu Arg
20 25
<210> 2
<211> 24
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 2
Val Thr Asn Thr Glu Met Phe Val Thr Ala Pro Asp Asn Leu Gly Tyr
1 5 10 15
Met Tyr Glu Val Gln Trp Pro Gly
20
<210> 3
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 3
Ala Leu Leu Ala Val Gly Ala Leu Glu Gly Pro Arg Asn Gln Asp Trp
1 5 10 15
Leu Gly Val Pro Arg Gln Leu Val Thr
20 25
<210> 4
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 4
Thr Gln Pro Gln Ile Ala Asn Cys Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp
1 5 10 15
Leu His Tyr Tyr Ser Val Arg Asp Thr
20 25
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 5
Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu
1 5 10
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 原鸡
<400> 6
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 原鸡
<400> 7
Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 原鸡
<400> 8
Thr Glu Trp Thr Ser Ser Asn Val Met Glu Glu Arg
1 5 10
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 9
Thr Ala Pro Asp Asn Leu Gly Tyr Met
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 10
Glu Gly Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 11
Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu
1 5
Claims (46)
1.一种佐剂组合物，其包括：
糖基古菌醇或其药学上可接受的盐，以及
选自Toll样受体(TLR)激动剂或其药学上可接受的盐和皂苷或其药学上可接受的盐的至少一种免疫刺激剂。
2.根据权利要求1所述的佐剂组合物，其中糖基古菌醇包括古菌醇核心部分。
3.根据权利要求1所述的佐剂组合物，其中糖基古菌醇是带电荷的类异戊二烯糖脂，其包括通过β键共价连接到古菌醇核心部分的甘油主链的游离sn-1羟基基团的硫酸化糖类基团。
4.根据权利要求3所述的佐剂组合物，其中古菌醇核心部分是2,3-双((3,7,11)-3,7,11,15-四甲基十六烷基)氧基)丙-1-醇。
5.根据权利要求3或4所述的佐剂组合物，其中硫酸化糖类基团是硫酸化二糖或硫酸化三糖。
6.根据权利要求5所述的佐剂组合物，其中硫酸化糖类基团是6’-硫酸根-β-D-Galp-(1,4)-β-D-Glcp。
7.根据权利要求1所述的佐剂组合物，其中糖基古菌醇是2,3双[(3,7,11)-3,7,11,15-四甲基十六烷基氧基]丙-1-基4-O-(6-O-磺基-β-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃葡萄糖苷。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的佐剂组合物，其中糖基古菌醇具有式I：
其中n是0或1；
R和R’独立地是氢或羟基；以及
Y是氢或硫酸根基团，并且至少一个Y是硫酸根基团。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的佐剂组合物，其中糖基古菌醇具有结构：
10.根据权利要求1至8中任一项所述的佐剂组合物，其中糖基古菌醇的药学上可接受的盐是钠盐、钙盐或镁盐。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的佐剂组合物，其中糖基古菌醇或其药学上可接受的盐包括在古细菌脂质体内。
12.根据权利要求11所述的佐剂组合物，其中古细菌脂质体进一步包括至少一种附加脂质。
13.根据权利要求12所述的佐剂组合物，其中至少一种附加脂质是带中性电荷或不带电荷的糖脂。
14.根据权利要求13所述的佐剂组合物，其中至少一种附加脂质是乳糖基古菌醇、鼠李糖基-乳糖基古菌醇、三葡糖基古菌醇或其任意两种或多种的组合。
15.根据权利要求8至14中任一项所述的佐剂组合物，其中糖基古菌醇或其药学上可接受的盐与至少一种附加脂质的摩尔％比率为99.9999:0.0001至30:70。
16.根据权利要求15所述的佐剂组合物，其中糖基古菌醇或其药学上可接受的盐与至少一种附加脂质的摩尔％比率为约50:50。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的佐剂组合物，其中至少一种免疫刺激剂或其药学上可接受的盐包括TLR4激动剂、TLR3激动剂、TLR9激动剂或其任意两种或多种的组合。
18.根据权利要求17所述的佐剂组合物，其中TLR3激动剂是聚(I:C)。
19.根据权利要求17所述的佐剂组合物，其中TLR4激动剂是单磷酰脂质A(MPLA)。
20.根据权利要求17所述的佐剂组合物，其中TLR9激动剂是寡核苷酸。
21.根据权利要求20所述的佐剂组合物，其中寡核苷酸包括一个或多个CpG基序。
22.根据权利要求1至16中任一项所述的佐剂组合物，其中至少一种免疫刺激剂包括所述皂苷或其药学上可接受的盐。
23.根据权利要求22所述的佐剂组合物，其中皂苷或其药学上可接受的盐包括三萜糖苷。
24.根据权利要求1至16中任一项所述的佐剂组合物，其中至少一种免疫刺激剂包括QS-21。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的佐剂组合物，其中糖基古菌醇或其药学上可接受的盐与至少一种免疫刺激剂或其药学上可接受的盐的质量比为100:1至100:50。
26.一种免疫原性组合物，其包括抗原和根据权利要求1至25中任一项所述的佐剂组合物。
27.根据权利要求26所述的免疫原性组合物，其中抗原是肽、蛋白质或病毒样颗粒。
28.根据权利要求26或27所述的免疫原性组合物，进一步包括药学上可接受的载体。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的免疫原性组合物，其为疫苗组合物。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的免疫原性组合物，其通过掺混糖基古菌醇或其药学上可接受的盐、至少一种免疫刺激剂和抗原来制备。
31.根据权利要求26至30中任一项所述的免疫原性组合物，其用于肠胃外或粘膜施用。
32.根据权利要求26至31中任一项所述的免疫原性组合物，其中免疫原性组合物在施用至受试者时引起细胞介导的应答和体液应答。
33.根据权利要求32所述的免疫原性组合物，其中体液应答包括IgG应答。
34.根据权利要求32或33所述的免疫原性组合物，其中细胞介导的应答包括CD4+应答、CD8+应答、细胞毒性应答和至少一种细胞因子的产生中的至少一者。
35.根据权利要求34所述的免疫原性组合物，其中至少一种细胞因子包括IFN-γ。
36.根据权利要求26至31中任一项所述的免疫原性组合物，用于在受试者中诱发免疫应答。
37.根据权利要求36所述的免疫原性组合物，其中免疫应答包括细胞介导的应答和体液应答。
38.根据权利要求37所述的免疫原性组合物，其中体液应答包括IgG应答。
39.根据权利要求37或38所述的免疫原性组合物，其中细胞介导的应答包括CD4+应答、CD8+应答、细胞毒性应答和至少一种细胞因子的产生中的至少一者。
40.根据权利要求39所述的免疫原性组合物，其中至少一种细胞因子包括IFN-γ。
41.一种在受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求26至40中任一项所述的免疫原性组合物。
42.根据权利要求41所述的方法，其中免疫应答包括细胞介导的应答和体液应答。
43.根据权利要求42所述的方法，其中体液应答包括IgG应答。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中细胞介导的应答包括CD4+应答、CD8+应答、细胞毒性应答和至少一种细胞因子的产生中的至少一者。
45.根据权利要求44所述的方法，其中至少一种细胞因子包括IFN-γ。
46.一种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括将抗原与根据权利要求1至25中任一项所述的佐剂组合物进行组合。
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