CN116732210A - 检测败血病相关病原体的组合物、试剂盒及用途 - Google Patents
检测败血病相关病原体的组合物、试剂盒及用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116732210A CN116732210A CN202310990954.0A CN202310990954A CN116732210A CN 116732210 A CN116732210 A CN 116732210A CN 202310990954 A CN202310990954 A CN 202310990954A CN 116732210 A CN116732210 A CN 116732210A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- composition
- detecting
- kit
- probe
- detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 47
- 244000052769 pathogen Species 0.000 title claims abstract description 28
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 title claims abstract description 16
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 title description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 37
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 35
- 241001134658 Streptococcus mitis Species 0.000 claims abstract description 30
- 241000588749 Klebsiella oxytoca Species 0.000 claims abstract description 26
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 51
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 9
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 8
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 10
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 9
- 238000007689 inspection Methods 0.000 abstract description 5
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 abstract description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 4
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- YZBQHRLRFGPBSL-RXMQYKEDSA-N carbapenem Chemical compound C1C=CN2C(=O)C[C@H]21 YZBQHRLRFGPBSL-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNDDWSAHNYBXKY-UHFFFAOYSA-N ATTO 425-2 Chemical compound CC1CC(C)(C)N(CCCC(O)=O)C2=C1C=C1C=C(C(=O)OCC)C(=O)OC1=C2 WNDDWSAHNYBXKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 101100378273 Brachyspira hyodysenteriae acpP gene Proteins 0.000 description 1
- 241001478240 Coccus Species 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 101000801195 Homo sapiens TLE family member 5 Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 206010061259 Klebsiella infection Diseases 0.000 description 1
- 101100098690 Listeria monocytogenes serovar 1/2a (strain ATCC BAA-679 / EGD-e) hly gene Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000960363 Streptococcus infantis Species 0.000 description 1
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 1
- 208000033809 Suppuration Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- PFRQBZFETXBLTP-UHFFFAOYSA-N Vitamin K2 Natural products C1=CC=C2C(=O)C(CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 PFRQBZFETXBLTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010048629 Wound secretion Diseases 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- 230000036626 alertness Effects 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000369 enteropathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000688 enterotoxigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 210000005002 female reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 101150021605 hlyA gene Proteins 0.000 description 1
- 102000056245 human TLE5 Human genes 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 201000007119 infective endocarditis Diseases 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- DKHGMERMDICWDU-GHDNBGIDSA-N menaquinone-4 Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CCC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 DKHGMERMDICWDU-GHDNBGIDSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000008383 multiple organ dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000003300 oropharynx Anatomy 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 201000009890 sinusitis Diseases 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009974 thixotropic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 1
- 235000019143 vitamin K2 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011728 vitamin K2 Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/22—Klebsiella
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及败血病相关病原体的检测，更具体地，涉及缓症链球菌、产酸克雷伯菌和大肠埃希菌的检测。本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现缓症链球菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌的检测和区分，以便针对性的提供治疗策略。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到500拷贝/mL，特异性好，检测更为准确。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及败血病相关病原体的检测，更具体地，涉及缓症链球菌、产酸克雷伯菌和大肠埃希菌的检测。
背景技术
缓症链球菌群包括缓症链球菌（Streptococcus mitis，S. mitis）、口腔链球菌、婴儿链球菌、泛口腔链球菌、嵴链球菌等。缓症链球菌属于草绿色链球菌的一种，是人体正常菌群之一，主要分布于口咽部，也可见于皮肤、胃肠道以及女性生殖道。缓症链球菌为革兰氏阳性球菌，呈球形或椭圆形，在血清肉汤中形成短或长链，无芽孢、无动力，兼性厌氧，触酶阴性。缓症链球菌属于条件致病菌，可以引起一系列侵袭性疾病，尤其是在恶性肿瘤、化疗、中性粒细胞缺乏等免疫缺陷的患者中。缓症链球菌可致血流感染、感染性心内膜炎、脑膜炎、肺炎、牙源性感染、鼻窦炎等，也可引起脓肿性病变。缓症链球菌具有与粪肠球菌和屎肠球菌相同的编码庆大霉素耐药的基因结构，这种基因决定簇整合到染色体上，而不是质粒上。缓症链球菌的感染并非少见，其感染诱因和临床类型有多种，但常因培养误定为草绿色链球菌而漏诊。然而缓症链球菌比草绿色链球菌的耐药性发展更快，因此微生物室与临床医生应对该菌感染加强警觉性，提高诊断水平。
产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）为革兰氏阴性球杆菌，具荚膜、菌毛，无鞭毛，兼性厌氧，肠杆菌科克雷伯氏菌属的一个种，是一种重要的条件致病菌。该菌可定植于机体胃肠道、皮肤、呼吸道、鼻咽部以及土壤、水等多种周围环境中，某些菌株可产生耐热肠毒素，是重要的院内及社区感染病原菌。产酸克雷伯菌可引起人体的呼吸、血流、腹腔和中枢神经系统的感染。有研究表明，产酸克雷伯菌是小儿抗生素相关性出血性肠炎重要的病原菌。产酸克雷伯菌有较强的毒力，在免疫系统功能不完善或者低下的情况下感染该菌之后，细菌可通过不同途径进入血液循环并大量繁殖，所释放毒素则造成全身感染引起败血症，从而导致多脏器功能紊乱和衰竭，直至死亡。研究表明，产酸克雷伯菌感染具有明显的季节性差异，以夏秋季为高发病期。临床治疗过程中，为了应对该细菌感染，抗菌药物的大量不规范使用导致了多重耐药菌的出现和传播，尤其是产超广谱β内酰胺酶的耐药菌的出现给临床治疗带来严峻的挑战，近年来碳青霉烯药物耐药菌的产生和广泛流行尤为突出。有多项研究表明，碳青霉烯类药物耐药的产酸克雷伯菌已有世界多地散发或聚集性流行的报道。
大肠埃希菌（Escherichia coli）通常称为大肠杆菌，为革兰氏阴性杆菌，该菌是肠道自然定植的正常菌群，可有效抑制有害细菌的生长，对人的肠道有保护作用，还能为人体提供一定的营养物质，比如能够提供我们自身合成不了的维生素K2。但是离开肠道，大肠埃希菌的血清型能够引起人体或动物胃肠道感染，主要是由特定的菌毛抗原、致病性毒素等感染引起的，除胃肠道感染以外，还会引起尿道感染、关节炎、脑膜炎以及败血型感染等。根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类：肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠产毒性大肠杆菌（ETEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）、肠黏附性大肠杆菌（EAEC）。大肠杆菌的流行是存在一定的区域分布的，人的大肠埃希菌病的主要传染源是因为在胃肠道感染患者的粪便中有大量大肠埃希菌病原菌排至体外构成的。大肠埃希菌在人之间的传播途径多是通过粪-口这一传播途径，在一定的条件下可引起大肠杆菌病散发或流行。
上述缓症链球菌、产酸克雷伯菌和大肠埃希菌均可引起败血症，危及生命安全，因此早期诊断病原体并给予及时有效的抗感染治疗是改善预后的关键，能够大大降低发病率和病死率。然而，通过临床症状和常规的实验室检测很难鉴别确定所感染的细菌种类，而且目前细菌培养条件较苛刻，造成培养阳性率低，且多重混合感染的培养极为困难，这给感染患者及临床医生带来很大困扰。
因此，本领域需求一种产品能够简单、快速地检测上述病原体，以便针对性的提供治疗策略，并且灵敏度高，特异性好。
发明内容
有鉴于此，第一方面，本发明提供一种检测败血病相关病原体的组合物，包括：
如SEQ ID NO:1~3所示的检测缓症链球菌的上游引物、下游引物及探针；
如SEQ ID NO:4~6所示的检测产酸克雷伯菌的上游引物、下游引物及探针；以及，如SEQ ID NO:7~9所示的检测大肠埃希菌的上游引物、下游引物及探针。
本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实缓症链球菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌的检测和区分，以便针对性的提供治疗策略。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到500拷贝/mL，特异性好，检测更为准确。
进一步地，所述组合物包括检测内标的上游引物、下游引物及探针。
在一些具体的实施方案中，内标是人源内标基因。在一个具体的实施方案中，内标是Rnase P。
进一步地，本发明组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用ATTO425、Quasar705、FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
在一些具体的实施方案中，缓症链球菌探针的荧光报告基团为FAM；产酸克雷伯菌探针的荧光报告基团为HEX；大肠埃希菌探针的荧光报告基团为ROX。
进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。
本发明的组合物可以任意组合成检测对应3个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中。
举例来说，可以包括上述3对引物和探针中的任意3对，可以包括上述3对引物和探针中的任意2对，也可以包括上述3对引物和探针中的任意1对。
在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光PCR。
进一步地，探针的3’末端还具有非荧光淬灭剂。
进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如BHQ1或BHQ2。
在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为BHQ1。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。
进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。
第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测败血病相关病原体的试剂盒中的用途，其中，所述病原体为缓症链球菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌。
第三方面，本发明提供了一种检测败血病相关病原体的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
在一个具体的实施方案中，阴性质控品是DEPC H2O、生理盐水、内标基因中的至少一种。阳性质控品是缓症链球菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌的片段质粒或片段DNA中的至少一种。
进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸提取试剂，以及DNA聚合酶中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、dNTP、dUTP、尿嘧啶糖基化酶（UDG）、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
进一步地，所述DNA聚合酶的浓度为3U/反应~15U/反应，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括Taq酶、Mg2+、dNTP（U）s、引物、探针和PCR缓冲液。
常见的PCR缓冲液由Tris-HCl、MgCl2、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20µl ~ 200µl。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字PCR扩增体系，即可以直接用于数字PCR仪上进行扩增。
第四方面，提供了一种用于非诊断目的的检测败血病相关病原体的方法，所述方法包括以下步骤：
1）提取待测样本的核酸；
2）使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1）获得的核酸进行荧光定量PCR；
3）获得并分析结果。
在本发明中，用于检测的样本可以是血液、血浆等，但不限于此。还可以是肺泡灌洗液、痰液、穿刺组织、脓液、伤口分泌物等等。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
DNA预变性，温度为95℃，时间为1~3 min，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5~20秒，退火，温度为55℃~60℃，时间为10~60秒，30~50次循环，采集荧光。
在一个具体的实施方案中，提供了一种用于制备检测败血病相关病原体的组合物的用途，所述检测包括以下步骤：
1）提取待测样本的核酸；
2）使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1）获得的核酸进行荧光定量PCR；
3）获得并分析结果。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
DNA预变性，温度为95℃，时间为1~3 min，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5~20秒，退火，温度为55℃~60℃，时间为10~60秒，30~50次循环，采集荧光。
在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染上述病原体并罹患血流感染的信息。例如，该方法可以在检测培养物中（例如血液）需求检测是否有上述病原体。
附图说明
图1为本发明组合物检测结果图（分别为缓症链球菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌）；
图2为本发明组合物灵敏度结果图（缓症链球菌）；
图3为本发明组合物灵敏度结果图（产酸克雷伯菌）；
图4为本发明组合物灵敏度结果图（大肠埃希菌）；
图5为本发明组合物特异性结果图；
图6为本发明组合物的单靶点引物和对比例引物检测结果图（缓症链球菌）；
图7为本发明组合物的单靶点引物和对比例引物检测结果图（产酸克雷伯菌）；
图8为本发明组合物的单靶点引物和对比例引物检测结果图（大肠埃希菌）。
图9为所选缓症链球菌LTA-1和产酸克雷伯菌pheX-1/pheX-2组合基因扩增检测效果；
图10为所选产酸克雷伯菌pheX-1和大肠埃希菌hlyA-1/hlyA-2组合基因扩增检测效果；
图11为所选大肠埃希菌hlyA-1和缓症链球菌LTA-1/LTA-2组合基因扩增检测效果。
具体实施方式
下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、本发明所使用的引物及探针
本发明所使用的引物及探针如下表1所示。
表1
其中，缓症链球菌LTA探针的荧光报告基团为FAM；产酸克雷伯菌pheX探针的荧光报告基团为HEX；大肠埃希菌hlyA探针的荧光报告基团为ROX。
实施例2、检测病原体的方法
荧光PCR扩增反应液：含有PCR缓冲液、Taq酶、Mg2+、dNTP、引物、探针等。具体的反应体系如表2所示。
表2
其扩增反应程序如表3所示。
表3
结果分析与判断：
反应结束后自动保存结果，对检测靶标的扩增曲线分别进行分析。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线），点击Analyze进行分析，使各项参数符合下述“质量控制”中的要求，然后到Plate窗口下记录定性结果。
质量控制
阴性对照：FAM、ROX、HEX三个通道的曲线均无Ct值显示；
阳性对照：FAM、ROX、HEX三个通道的曲线Ct≤36；
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
阳性判断值
通过参考值的研究确定本试剂盒检测目标基因的Ct参考值为38。
根据上述的检测结果，判断结果如下表4所示：
表4
实施例3、本发明组合物测试样本的检测结果
将实施例1所示的引物和探针，按照实施例2的方法对缓症链球菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌，在宏石荧光定量PCR仪器上进行PCR检测，检测结果如图1所示，从图中可以看出，本发明组合物均能对各种病原体进行良好的检测。
实施例4、本发明组合物的灵敏度
使用本发明实施例1中的组合物，对各个靶标进行LOD（灵敏度）检测，以模拟临床样本，在宏石荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测。结果如图2~图4所示，表明对低至500拷贝/mL的样本各通道仍然能够准确检测出，表明本发明组合物的灵敏度为500拷贝/mL。
实施例5、本发明组合物的特异性
为了测试本发明实施例1中的组合物的空白特异性，以阴性对照为样本，按照上述操作步骤进行检测。结果如图5显示，各靶标通道均无非特异扩增，试剂盒的空白特异性好。
对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物和探针
由于碱基互补配对原则，引物和（或）探针之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性（保守性对检测的准确性至关重要），又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计。
因此，发明人还针对每一个靶标分别进行了扩增效果的比较，结果如图6~图8所示，此外还组成了不同的检测体系1~3（序列未示出），同样用于检测上述病原体，具体检测结果如图9~图11所示。
从图中可以看出，其余的引物和探针在单靶点的检测效果中其差距较小，但是放在联检的系统中，其扩增效果的差距明显比单靶点检测更大，这可能是由于联检系统互相的引物探针影响所致；具体地，如图7所示，针对产酸克雷伯菌分别设计的引物探针对pheX-1和pheX-2，两者的检测效果接近，但是，如图9，将pheX-1和pheX-2分别与缓症链球菌LTA-1混合进行扩增检测，检测结果pheX-1与LTA-1的组合显著优于pheX-2与LTA-1的组合物。因此，说明本发明的联检系统具有优越性。同样地，其余两个靶标的组合也能体现相似的检测结果。
Claims (10)
1.一种检测败血病相关病原体的组合物，包括：
如SEQ ID NO:1~3所示的检测缓症链球菌的上游引物、下游引物及探针；
如SEQ ID NO:4~6所示的检测产酸克雷伯菌的上游引物、下游引物及探针；以及
如SEQ ID NO:7~9所示的检测大肠埃希菌的上游引物、下游引物及探针。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括检测内标的上游引物、下游引物及探针。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，缓症链球菌探针的荧光报告基团为FAM；产酸克雷伯菌探针的荧光报告基团为HEX；大肠埃希菌探针的荧光报告基团为ROX。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的各成分以混合的形式存在。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的组合物在制备检测败血病相关病原体的试剂盒中的用途，其中，所述病原体为缓症链球菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌。
7.一种检测败血病相关病原体的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1~5中任一项所述的组合物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸提取试剂、DNA聚合酶、dNTP、dUTP、UDG酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
10.一种用于制备检测败血病相关病原体的组合物的用途，所述检测包括以下步骤：
1）提取待测样本的核酸；
2）使用如权利要求1~5中任一项所述的组合物或权利要求7~9中任一项所述的试剂盒对步骤1）获得的核酸进行荧光定量PCR；
3）获得并分析结果。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310990954.0A CN116732210B (zh) | 2023-08-08 | 2023-08-08 | 检测败血病相关病原体的组合物、试剂盒及用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310990954.0A CN116732210B (zh) | 2023-08-08 | 2023-08-08 | 检测败血病相关病原体的组合物、试剂盒及用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116732210A true CN116732210A (zh) | 2023-09-12 |
| CN116732210B CN116732210B (zh) | 2024-07-09 |
Family
ID=87901520
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310990954.0A Active CN116732210B (zh) | 2023-08-08 | 2023-08-08 | 检测败血病相关病原体的组合物、试剂盒及用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116732210B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999054502A1 (en) * | 1998-04-20 | 1999-10-28 | Academisch Ziekenhuis Groningen | Method for the rapid determination of bacteria |
| US20080138808A1 (en) * | 2003-09-11 | 2008-06-12 | Hall Thomas A | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
| CN110273012A (zh) * | 2018-03-13 | 2019-09-24 | 厦门大学 | 一种检测败血症病原体的方法 |
| CN115772518A (zh) * | 2022-07-11 | 2023-03-10 | 宁波海尔施基因科技股份有限公司 | 同时检测至少八种血流感染病原体的引物组合物及其应用 |
| CN116516038A (zh) * | 2023-06-28 | 2023-08-01 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 血流感染病原体联检并区分的组合物、试剂盒及用途 |
-
2023
- 2023-08-08 CN CN202310990954.0A patent/CN116732210B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999054502A1 (en) * | 1998-04-20 | 1999-10-28 | Academisch Ziekenhuis Groningen | Method for the rapid determination of bacteria |
| US20080138808A1 (en) * | 2003-09-11 | 2008-06-12 | Hall Thomas A | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
| CN110273012A (zh) * | 2018-03-13 | 2019-09-24 | 厦门大学 | 一种检测败血症病原体的方法 |
| CN115772518A (zh) * | 2022-07-11 | 2023-03-10 | 宁波海尔施基因科技股份有限公司 | 同时检测至少八种血流感染病原体的引物组合物及其应用 |
| CN116516038A (zh) * | 2023-06-28 | 2023-08-01 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 血流感染病原体联检并区分的组合物、试剂盒及用途 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DIJUN ZHANG等: "Developing a multiplex PCR-based assay kit for bloodstream infection by analyzing genomic big data", 《J CLIN LAB ANAL.》, vol. 36, pages 1 - 16 * |
| LUTZ ERIC LEHMANN等: "A multiplex real-time PCR assay for rapid detection and diVerentiation of 25 bacterial and fungal pathogens from whole blood samples", 《MED MICROBIOL IMMUNOL》, vol. 197, pages 313, XP019630543 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116732210B (zh) | 2024-07-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Elucidation of Proteus mirabilis as a key bacterium in Crohn’s disease inflammation | |
| Gurjar et al. | Real-time multiplex PCR assay for rapid detection and toxintyping of Clostridium perfringens toxin producing strains in feces of dairy cattle | |
| CN110129458B (zh) | 一种检测艰难梭菌菌属基因及毒素基因的多重荧光pcr试剂盒和方法 | |
| Kimura et al. | Rapid and reliable loop-mediated isothermal amplification method for detecting Streptococcus agalactiae | |
| EP2982764A1 (en) | Identification of vaginal bacteria | |
| US20110287428A1 (en) | Neisseria gonorrhoeae detection | |
| CN114457174B (zh) | 一种检测尿道病原体感染的多重荧光定量探针法pcr试剂盒 | |
| CN116516038B (zh) | 血流感染病原体联检并区分的组合物、试剂盒及用途 | |
| CN118006812A (zh) | 检测阴道炎相关病原体的组合物、试剂盒及用途 | |
| WO2024159852A1 (zh) | 细菌性阴道炎病原体检测的组合物、试剂盒及其用途 | |
| CN116732210B (zh) | 检测败血病相关病原体的组合物、试剂盒及用途 | |
| CN110468223B (zh) | 基于dUTP/UNG法的肺炎支原体和鲍特菌属核酸检测的引物、探针、试剂盒及方法 | |
| Kukla et al. | Improved laboratory diagnostics of Streptococcus pneumoniae in respiratory tract samples through qPCR | |
| CN114480689A (zh) | 检测肺炎链球菌的rpa方法、其专用引物和探针及用途 | |
| JP2013188181A (ja) | 淋菌の検出方法および検出試薬 | |
| CN115976240B (zh) | 脓毒血症病原体检测的组合物、试剂盒、方法及其用途 | |
| CN116875716A (zh) | 血流感染病原体联检并区分的组合物、试剂盒及用途 | |
| Datta et al. | Diagnosis and genotyping of Helicobacter pylori by polymerase chain reaction of bacterial DNA from gastric juice | |
| CN118581248A (zh) | 检测伤口感染相关病原体的组合物、试剂盒及其用途 | |
| CN117327812A (zh) | 检测阴道炎相关病原体的组合物、试剂盒及用途 | |
| CN117802254A (zh) | 检测败血症相关病原体的组合物、试剂盒及用途 | |
| CN118667980A (zh) | 检测感染性心内膜炎病原体的组合物、试剂盒及其用途 | |
| CN113025736B (zh) | 实时荧光pcr快速检测肺炎克雷伯菌亚胺培南耐药性的方法 | |
| CN117802253A (zh) | 检测感染相关病原体的组合物、试剂盒及用途 | |
| KR20100114971A (ko) | ＯｍｐＡ 유전자를 이용한 호흡기검체로부터 클라미도필라 뉴모니아, 클라미도필라 시타키의 동시확인을 위한 듀플렉스 ＰＣＲ 기법 및 이를 위한 ＰＣＲ 프라이머 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |