CN116726183A - 用于治疗与etbr激活相关的癌症的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本说明书提供了用于治疗ETBR相关癌症的组合物和方法。在某些方面，本说明书提供了递送系统，其用于ETBR拮抗剂、半胱天冬酶‑8抑制剂或其组合的至少一种、任选地包括ETAR拮抗剂、抗PD‑1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺或其组合的受控全身释放。所述组合物可用于治疗某些癌症，包括例如乳腺癌，恶性黑素瘤，鳞状细胞癌，胶质母细胞瘤以及其他癌症。此外，本说明书提供了递送系统，其用于可用于治疗已扩散至脑的癌症的ETBR拮抗剂、半胱天冬酶‑8抑制剂或其组合的至少一种、任选地包括ETAR拮抗剂、抗PD‑1抗体、bRAF中抑制剂、烟酰胺或其组合的至少一种的受控释放至中枢神经系统。

Description

用于治疗与ETBR激活相关的癌症的组合物和方法
本申请是申请号为201680054521.2的中国专利的分案申请。
相关申请/专利的交叉引用
本申请要求于2015年8月3日提交的标题为“COMPOSITIONS AND METHODS FORTREATING CANCERS ASSOCIATED WITH ETBR ACTIVATION”的美国临时申请系列号62/200,181的优先权，其全部内容为了所有目的通过引用整体并入本文。
通过引用并入
根据37C.F.R.§1.52(e)(5)，将包含在使用Patent-In 3.5和Checker4.4.0于2016年8月2日创建的大小为649B的名为1514985_101WO2_Sequence_Listing_ST25.txt的电子文件中的序列信息的全部内容通过引用并入本文。
背景
发明领域
本公开内容涉及用于治疗癌症的受控递送治疗系统，治疗癌症的方法以及诊断性筛选方法。具体而言，本文描述了用于施用针对癌症例如恶性黑素瘤、鳞状细胞癌、胶质母细胞瘤和其他类型的癌症的治疗的组合物和方法。
2.背景信息。
据估计，2015年将有超过160万新的癌症病例被诊断出来1。美国癌症协会估计，2015年将有252,310例新的黑素瘤病例被诊断出来2。黑素瘤死亡人数目前在美国为9,940人并且在全世界为超过65,000人1。
恶性黑素瘤是黑素细胞的癌变增殖，黑素细胞是表皮的色素产生细胞。目前的统计数据表明，在2015年，每40名美国白种人中就有一人会在其一生中发展黑素瘤1。据估计，在美国确诊的新发高级侵润性黑素瘤病例将有73,870人，目前五年存活率只有16.6％3。此外，对于转移性疾病患者，超过40％的患者在两年内会有脑部受累，其中位生存期仅为3-4个月7,8。
恶性黑素瘤的主要治疗方法是手术切除和辐射，一年内复发率为50％，并且可能存在放射后认知功能障碍9。厚度超过0.76mm的恶性黑素瘤具有显著转移风险。然而，目前的黑素瘤治疗仅适用于晚期疾病。例如，目前在美国和欧洲患有黑素瘤的约170万人中，目前只有20％或大约340,000人是治疗的候选人2。许多患者对分子靶向治疗或新的免疫治疗均无反应5,6。目前批准的药物的耐药性发展也很常见4。
内皮素B受体(ETBR)途径在黑素瘤的转移性扩散中起着重要作用，因此可作为潜在的治疗靶点。例如，目前的黑素瘤药物靶点RAF和MEK激酶被ETBR激活10。内皮素B受体是一种7跨膜G蛋白偶联受体(GPCR)。它在正常黑素细胞中以低水平表达，但在黑素瘤的发展和进展过程中被大量上调10。内皮素-1(ET-1)和内皮素-3(ET-3)是激活ETBR的配体。ET-1激活ETBR导致黑素瘤细胞增殖、转移并产生自身血液供应17,24。
鳞状细胞癌(SCC)可以影响皮肤、舌头和食道。鳞状细胞癌也与ETBR表达有关。例如，在鳞状细胞肿瘤中高水平的ETBR表达是不良预后的指标。ETBR和ETAR拮抗剂在临床前研究中已显示出治疗SCC的功效。因此，ETBR也是SCC的潜在治疗目标。
尽管包括黑素瘤和SCC在内的癌症治疗发展取得了进展，但有效治疗仍存在重大的未满足需求。然而，市场上目前没有靶向ETBR的黑素瘤药物。
概述
本说明书涉及包含用于治疗癌症的ETBR拮抗剂的治疗性组合物或制剂。特别地，如本文所述的制剂可用于治疗ETBR相关癌症，例如黑素瘤，转移性黑素瘤，鳞状细胞癌，胶质母细胞瘤或其组合。如本文所述，如本文所配制的ETBR拮抗剂对于治疗ETBR相关癌症是令人惊讶地有利的。
因此，在一方面，本说明书提供了包含有效量的ETBR拮抗剂和药学上可接受的载体的治疗性组合物或制剂。在某些实施方案中，治疗性组合物或制剂包含有效量的ETBR拮抗剂、半胱天冬酶-8抑制剂或其组合中的至少一种，和协同有效量的ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺或其组合中的至少一种，以及药学上可接受的载体。
因此，在另一方面，本说明书提供了治疗性组合物或制剂，其包含有效量的ETBR拮抗剂或半胱天冬酶-8抑制剂或其组合以及在生物相容性递送系统中的协同量的选自ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺或其组合的至少一种另外的药剂，以及药学上可接受的载体。
在本文所述的任何实施方案或方面中，抗PD1抗体是选自Nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab或本领域技术人员已知或变得已知的任何其他抗PD1抗体的至少一种药剂。
在本文所述的任何实施方案或方面中，bRAF抑制剂是选自达拉菲尼、索拉非尼、威罗菲尼或本领域技术人员已知或变得已知的任何其他bRAF抑制剂的至少一种药剂。
在本文所述的任何实施方案或方面中，ETBR拮抗剂是BQ788、BQ-017、A192621、其氘代或氟化类似物或其组合中的至少一种。
在本文所述的任何实施方案或方面中，ETAR拮抗剂是BQ123。
在本文所述的任何实施方案或方面中，半胱天冬酶-8抑制剂是具有Ac-AAVALLPAVLLAALAPIETD-CHO序列的肽。
在本文所述的任何实施方案或方面中，ETBR拮抗剂的剂量是约0.1μg至约5000μg(例如约100μg至约4000μg)和/或ETBR拮抗剂的浓度是组合物的约0.01μg/mL至约1000mg/mL(例如约0.1mg/mL至约5mg/mL)。
在本文所述的任何实施方案或方面中，ETAR拮抗剂的剂量是约0.1μg至约5000μg(例如约100μg至约4000μg)和/或ETAR拮抗剂的浓度是组合物的约0.01μg/mL至约1000mg/mL(例如约0.1mg/mL至约5mg/mL)。
在本文所述的任何实施方案或方面中，抗PD1抗体的剂量是约0.1μg至约5000μg(例如约100μg至约4000μg)和/或抗PD1抗体的浓度是组合物的约0.01μg/mL至约1000mg/mL(例如约0.1mg/mL至约5mg/mL)。
在本文所述的任何实施方案或方面中，bRAF抑制剂的剂量是约0.1μg至约5000μg(例如约100μg至约4000μg)和/或bRAF抑制剂的浓度为组合物的约0.01μg/mL至约1000mg/mL(例如约0.1mg/mL至约5mg/mL)。
在本文所述的任何实施方案或方面中，烟酰胺的剂量是约0.1μg至约5000μg(例如约100μg至约4000μg)和/或烟酰胺的浓度是组合物的约0.01μg/mL至约1000mg/mL(例如，约0.1mg/mL至约5mg/mL)。
在本文所述的任何实施方案或方面中，半胱天冬酶-8抑制剂的剂量是约0.1μg至约5000μg(例如约100μg至约4000μg或约1μg至约4000μg)和/或半胱天冬酶-8抑制剂的浓度是组合物的约0.01μg/mL至约1000mg/mL(例如约0.1mg/mL至约5mg/mL)。
在本文所述的任何实施方案或方面中，组合物还包含至少一种选自大豆油、二甲基亚砜(DMSO)、/>和Aegis HydrogelTM的赋形剂。例如，DMSO是约5％至约100％DMSO溶液。
在本文所述的任何方面或实施方案中，药学上可接受的载体选自固体脂质纳米颗粒，脂质体和生物相容性聚合物。例如，治疗性组合物或制剂可以包含具有内部体积的脂质体或纳米颗粒或其组合，所述内部体积包含ETBR拮抗剂或半胱天冬酶-8抑制剂或其组合，以及ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺或其组合中的至少一种。在某些实施方案中，所述制剂包含脂质体，所述脂质体包含中性脂质、碱性(具有净正电荷)脂质、酸性(具有净负电荷)脂质、胆固醇或其组合中的至少一种。在某些另外的实施方案中，脂质体还包含聚合物组分。在某些实施方案中，脂质体的内部体积至少部分是含水的，并且包含ETBR拮抗剂、半胱天冬酶-8抑制剂或其组合中的至少一种以及ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺或其组合中的至少一种。
在本文所述的任何方面或实施方案中，脂质体被配置为实现ETBR拮抗剂和/或半胱天冬酶-8抑制剂和/或ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺或其组合中的至少一种的受控释放。在某些实施方案中，脂质体被配置为实现ETBR拮抗剂的快速释放。在本文所述的任何实施方案或方面中，脂质体被配置或配制为实现ETBR拮抗剂和/或半胱天冬酶-8抑制剂和/或ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺或其组合中的至少一种的延长释放。在本文所述的任何实施方案或方面中，脂质体被配置为导致ETBR拮抗剂、半胱天冬酶-8抑制剂或其组合中的至少一种以及ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺或其组合中的至少一种的快速和延长释放。
在本文所述的任何实施方案或方面中，说明书提供了包含水凝胶的治疗性组合物或制剂，所述水凝胶包含生物相容性聚合物和有效量的ETBR拮抗剂。
在本文所述的任何方面或实施方案中，治疗性组合物或制剂包含有效量的RAF激酶拮抗剂、MEK拮抗剂或其组合中的至少一种。
在本文所述的任何方面或实施方案中，治疗性组合物或制剂包含有效量的至少一种另外的抗癌剂或化学治疗剂。
在另一方面，提供了控释皮下或肌内剂量制剂。该制剂包含活性成分的均匀分散体，所述活性成分包括：ETBR拮抗剂或半胱天冬酶-8抑制剂或其组合；和在生物相容性递送系统中的协同量的选自ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺或其组合的至少一种另外的药剂，其中在施用后，ETBR拮抗剂和另外的药剂从制剂缓慢和同时释放到体循环中。
在本文所述的任何方面或实施方案中，公开了以下的至少之一：(1)抗PD1抗体是选自以下的至少一种药剂：Nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab或本领域技术人员已知或变得已知的任何其他抗PD1抗体；(2)bRAF抑制剂是选自以下的至少一种药剂：达拉菲尼、索拉非尼、威罗菲尼或本领域技术人员已知或变得已知的任何其他bRAF抑制剂；(3)ETBR拮抗剂是BQ788、BQ-017、A192621、其氘化或氟化类似物或其组合中的至少一种；(4)ETAR拮抗剂是BQ123；或(5)半胱天冬酶-8抑制剂是具有Ac-AAVALLPAVLLAALAPIETD-CHO序列的肽。
在本文所述的任何方面或实施方案中，递送系统选自：(1)生物相容性聚合物，(2)脂质体制剂；(3)DMSO溶液，(4)和(5)固体脂质纳米颗粒制剂。
在本文所述的任何方面或实施方案中，生物相容性聚合物选自聚(丙交酯)，聚(乙交酯)，聚(丙交酯-共-乙交酯)，聚(乳酸)，聚(乙醇酸)，聚(乳酸-共-乙醇酸)，聚己内酯，聚碳酸酯，聚酯酰胺，聚酐，聚氨基酸，聚原酸酯，聚氰基丙烯酸酯，聚对二氧环己酮，聚亚烷基草酸酯，生物可降解的聚氨酯，其共混物和共聚物。
在本文所述的任何方面或实施方案中，脂质体制剂选自磷脂酰乙醇胺(PE)例如二棕榈酰基PE(DPPE)，部分不饱和的磷脂酰胆碱(PC)例如蛋PC(EPC)或SPC，完全不饱和的PC例如HSPC、PG、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)，部分不饱和的PG，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，胆固醇，DSPE-PEG2000。
在本文所述的任何方面或实施方案中，固体脂质纳米颗粒制剂选自甘油三酯(Compritol 888ATO和Dynasan 112)，巴西棕榈蜡，蜂蜡，鲸蜡醇，乳化蜡，胆固醇，胆固醇丁酸酯和聚乙二醇(PEG)衍生物。
在本文所述的任何方面或实施方案中，DMSO溶液是约5％至约100％DMSO。
又一方面，本说明书提供了用于治疗或改善受试者或患者(例如动物如人)的疾病、病症或症状的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量例如治疗有效量的如本文所述的治疗性组合物或制剂，其中所述组合物对于治疗或改善受试者的疾病或病症或其症状是有效的。在某些实施方案中，疾病或病症是ETBR相关的癌症。在其他实施方案中，ETBR相关癌症是乳腺癌、黑素瘤、鳞状细胞癌或其组合中的至少一种。
在本文所述的任何方面或实施方案中，ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和半胱天冬酶-8抑制剂中的至少一种的剂量是约100μg至约4000μg，ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和半胱天冬酶-8抑制剂中的至少一种的浓度是组合物的约0.1至约5.0mg/mL。
在本文所述的任何方面或实施方案中，ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和半胱天冬酶-8抑制剂中的至少一种的剂量是约0.1μg至约5000μg，ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和半胱天冬酶-8抑制剂中的至少一种的浓度是组合物的约0.01μg/mL至约1000mg/mL。
在本文所述的任何方面或实施方案中，ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和半胱天冬酶-8抑制剂中的至少一种的剂量是约0.1μg至约5000μg。
在本文所述的任何方面或实施方案中，ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和半胱天冬酶-8抑制剂中的至少一种的浓度是组合物的约0.01μg/mL至约1000mg/mL。
在本文所述的任何方面或实施方案中，所述制剂还包含选自和Aegis HydrogelTM的赋形剂。
另一方面，提供了一种治疗患者癌症的方法。该方法包括向有需要的患者施用本公开内容的组合物或制剂。
在本文所述的任何方面或实施方案中，组合物或制剂经鼻内或静脉内或颅内递送。
在一方面，提供了确定癌细胞对内皮素受体拮抗剂的敏感性的方法。该方法包括：确定癌细胞对内皮素受体拮抗剂的敏感性的方法，所述方法包括：a)提供来自患者的癌症组织样品；b)在特异性结合ET-1的抗体和/或特异性结合ET-3的抗体的存在下孵育组织样品；和c)检测与ET-1和/或ET-3结合的抗体的量，其中当ET-1和/或ET-3在癌症中活跃表达时，癌症对内皮素受体拮抗剂治疗敏感。
在本文所述的任何方面或实施方案中，在c)的检测之后，所述方法还包括d)施用有效量的内皮素受体拮抗剂或ETBR信号传导抑制剂(例如半胱天冬酶-8抑制剂)，例如，当癌症对内皮素受体拮抗剂治疗或ETBR信号传导抑制剂敏感时。
在本文所述的任何方面或实施方案中，检测与ET-1和/或ET-3结合的抗体的量用缀合至可检测标记的第二抗体进行。
在本文所述的任何方面或实施方案中，内皮素受体拮抗剂是选择性ETBR拮抗剂和/或选择性ETAR拮抗剂，例如BQ788和/或BQ123。在本文所述的任何方面或实施方案中，内皮素受体激动剂是BQ788、BQ-017、BQ788的氘化或氟化类似物、BQ-017的氘化或氟化类似物和/或BQ123。
另一方面，说明书提供了诊断个体中ETBR相关癌症的方法，包括：a)从受试者获得生物样品；b)使样品与能够检测ET-1核酸或多肽的试剂(例如，基于核酸的探针，或抗体或其片段)和/或能够检测ET-3核酸或多肽的试剂(例如，基于核酸的探针或抗体或其片段)接触；c)检测试剂与样品中ET-1和/或ET-3的结合；和d)将与受试者的ET-1和/或ET-3结合的试剂的量与对照进行比较，其中ET-1和/或ET-3的增加指示患有ETBR相关癌症的受试者，以及从而将受试者诊断为患有ETBR相关癌症。
在其他方面，说明书提供了选择用于患有ETBR相关癌症的受试者的适当治疗性治疗的方法，包括以下步骤：a)从受试者获得生物学样品；b)使样品与能够检测ET-1核酸或多肽的试剂(例如，基于核酸的探针，或抗体或其片段)和/或能够检测ET-3核酸或多肽的试剂(例如，基于核酸的探针或抗体或其片段)接触；c)检测试剂与样品中ET-1和/或ET-3的结合；d)将与受试者的ET-1结合的试剂的量与对照进行比较，其中增加的ET-1和/或ET-3指示患有ETBR相关癌症的受试者，从而诊断受试者患有ETBR相关癌症；和e)施用如本文所述的治疗性组合物。在某些实施方案中，该方法包括重复步骤a)-d)的步骤，由此确定受试者是否响应治疗。
在其他方面，本说明书提供了监测患有ETBR相关癌症的受试者中的治疗性治疗响应的方法，其包括以下步骤：a)提供诊断患有ETBR相关癌症的受试者；b)施用治疗癌症的治疗剂；c)在治疗性治疗后从受试者获得样品；d)使样品与能够检测ET-1核酸或多肽的试剂和/或能够检测ET-3核酸或多肽的试剂接触；e)检测试剂与样品中ET-1和/或ET-3的结合；和f)将与受试者的ET-1和/或ET-3结合的试剂的量与对照进行比较，从而评价治疗性治疗响应，其中ET-1和/或ET-3的水平升高指示少量或没有治疗响应，并且ET-1和/或ET-3水平降低指示阳性治疗响应。
在本文所述的任何方面或实施方案中，诊断方法包括施用治疗剂的额外步骤。在某些实施方案中，施用相同量的治疗剂。在另外的实施方案中，施用较高剂量。在其他实施方案中，所述方法包括改变治疗性治疗和/或治疗方案的步骤。在某些实施方案中，施用相同量的治疗剂。在另外的实施方案中，施用较高剂量。在其他实施方案中，所述方法包括改变治疗性治疗和/或治疗方案的步骤。在某些实施方案中，ETBR相关癌症是乳腺癌、黑素瘤、鳞状细胞癌、胶质母细胞瘤或其组合中的至少一种。
另一方面，提供了治疗ETBR相关性转移性脑癌的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开内容的组合物或制剂，其中所述组合物或制剂对于治疗或改善ETBR相关性转移性脑癌症状是有效的。
在本文所述的任何方面或实施方案中，ETBR相关性转移性脑癌是与转移性黑素瘤相关的脑癌，与转移性鳞状细胞癌相关的脑癌，胶质母细胞瘤或其组合。
一方面，提供了确定癌细胞对基于免疫的治疗的敏感性的方法。该方法包括：a)提供来自患有癌症的患者的癌细胞的组织样品；b)在结合ET-1的抗体和/或结合ET-3的抗体的存在下孵育组织样品；和c)检测与ET-1和/或ET-3结合的抗体的量，其中当ET-1和/或ET-3在肿瘤中活跃表达时，因此表明癌症不会响应基于免疫的治疗。
在本文所述的任何方面或实施方案中，检测与ET-1和/或ET-3结合的抗体的量用至少一种缀合至可检测标记的第二抗体进行。
在本文所述的任何方面或实施方案中，在c)的检测之后，所述方法还包括d)施用有效量的基于免疫的治疗，例如，当所述癌症对基于免疫的治疗有响应时。
在本文所述的任何方面或实施方案中，基于免疫的治疗选自免疫检查点抑制剂、癌症疫苗和嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗。
在本文所述的任何方面或实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。
前面的一般描述仅作为示例给出，并不旨在限制本公开内容和所附权利要求的范围。本领域普通技术人员根据本发明的权利要求书、说明书和实施例将认识到与本发明的组合物、方法和工艺相关的其他目的和优点。例如，可以以多种组合来利用本发明的各个方面和实施方案，本说明书明确涵盖所有这些组合。这些附加的优点、目的和实施方案明确地包括在本发明的范围内。在本文使用的用于阐明本发明的背景和在特定情况下提供关于实践的其他细节的出版物和其他材料通过引用并入本文。
附图的简要说明
并入说明书并形成说明书的一部分的附图示出了本发明的几个实施方案，并且与说明书一起用于解释本发明的原理。附图仅用于举例说明本发明的实施方案的目的，而不应被解释为限制本发明。从以下的详细描述结合示出本发明的说明性实施方案的附图中，本发明的其它目的、特征和优点将变得明显，其中：
图1：内皮素B受体(ETBR)细胞信号途径。ETBR是七跨膜G蛋白偶联受体(GPCR)。内皮素-1(ET-1)是ETBR的配体。ET-1与受体的结合导致许多下游激酶的激活，包括PTK，RAF，MEK，MAPK/ERK。
图2：对bRAF抑制剂的耐药性是由于ETBR上调引起的。ETBR的上调允许黑素瘤细胞绕过对MAPK/ERK激活的阻断。ETBR拮抗剂例如BQ788、A192621阻断ET-1结合。
图3：ET-1由晚期黑素瘤表达。ET-1是激活ETBR的配体，其导致黑素瘤细胞增殖、转移并产生它们自己的血液供应。组织切片来自用ET-1特异性标记染色的人类侵润性黑素瘤样本。照片显示黑素瘤对ET-1呈阳性。侵润性和转移性黑素瘤产生ET-1。
图4A和4B：BQ788抑制黑素瘤的生长和转移。BQ788(IC501.2nM，Ki＝17.8nM)是ETBR相关黑素瘤细胞生长的有效抑制剂。BQ788诱导黑素瘤肿瘤细胞凋亡。
图5A，5B，5C，5D和5E：ETBR拮抗剂抑制小鼠黑素瘤脑转移。使用小鼠黑素瘤模型以60mg/kg/天的剂量施用A192621(IC504.5nM，Ki＝8.8nM)。(A)A192621增加生存；(B-C)缩小脑黑素瘤转移；和(D-E)缩小CNS黑素瘤肿瘤。在该研究中，使用慢病毒载体在黑素瘤细胞系中过表达ETBR，所述细胞系进而用于在小鼠中植入异种移植物。
图6：ETBR拮抗剂BQ788与bRAF抑制剂达拉菲尼在小鼠中治疗脑黑素瘤异种移植物中协同作用。用荧光素酶标记的SKMEL28人黑素瘤细胞颅内接种裸鼠。使肿瘤生长1周，然后基于肿瘤的平均发光将小鼠随机分组(n＝8)。用100mg/Kg达拉菲尼每天PO或10ng达拉菲尼+BQ788鼻内TIW治疗小鼠。用BQ788+达拉菲尼联合治疗的小鼠比单独用达拉菲尼治疗的小鼠表现出脑黑素瘤异种移植物更大的生长抑制。
图7：BQ788在体内与达拉菲尼协同作用。将A375人黑素瘤细胞皮下植入Nu/J裸鼠的后腹侧，并使其生长至150mm3-200mm3，然后随机化并开始治疗。(1)赋形剂(n＝8)，(2)达拉菲尼每天100mg/Kg PO(n＝5)和(3)达拉菲尼+BQ788 600ng IP TIW(n＝5)。单独的达拉菲尼阻碍肿瘤生长。达拉菲尼联合BQ788导致第11天肿瘤缩小至基线以下(p<0.05)。
图8：BQ788在同基因小鼠黑素瘤模型中与抗PD1抗体协同作用。用B16F10小鼠黑素瘤细胞接种到C57Bl/6小鼠的后侧。一旦肿瘤可触知，将小鼠随机分为4组(n＝5)并如下处理：(1)载体，(2)BQ788，(3)抗PD1，或(4)抗PD1+BQ788。图中的数据反映了3次剂量的测试物品后的肿瘤生长，并证实了BQ788和抗PD1之间的协同作用。
图9：ETAR拮抗剂和烟酰胺减轻来自BQ788的体重减轻。在42天的时间内，以指定的递增剂量，将20％DMSO中的ETBR拮抗剂BQ788鼻内施用至六周龄无胸腺裸鼠。一组额外口服施用ETAR拮抗剂马西替坦，剂量为每日5mg/kg。这些小鼠的饮用水中补充了浓度为0.3mg/mL的B维生素烟酰胺。到本研究结束时，单独用BQ788处理的动物未能健康生长并且相对于基准体重经历5％的平均体重减轻。ETAR拮抗剂马西替坦与烟酰胺补充剂的共同施用减缓了这种体重减轻。在整个研究过程中，由此治疗的动物能够维持体重。ETAR拮抗剂和烟酰胺与ETBR拮抗剂的共同施用减轻了ETBR拮抗剂在施用用于治疗目的时的不利作用。
图10A，10B和10C。黑素细胞痣的内皮素-1(ET-1)免疫组织化学染色。(A)将浓度为1pg至250ng的ET-1和ET-3肽固定在膜上并使用抗ET-1单克隆抗体进行杂交。(B)代表性的复合型先天性黑素细胞痣。(C)具有严重细胞学异型性的代表性发育不良痣。两个样本周围环境中的散在的细胞对ET-1呈阳性(箭头)。这些样本中的黑素细胞对ET-1是阴性的。苏木精和伊红(H&E)染色切片显示在左图中。右图显示了样本的ET-1免疫组化染色。ET-1染红色。
图11A和11B。原位样本中黑素瘤的内皮素-1(ET-1)免疫组织化学染色。(A)原位样本中代表性的黑素瘤，其在皮肤浸润物中就ET-1阳性细胞而言是阴性的[苏木精和伊红(H&E)染色：左图，ET-1免疫组织化学(IHC)染色：右图]。(B)原位样本中代表性的黑素瘤，在皮肤浸润物中具有许多ET-1阳性细胞(用箭头表示)。H&E染色：左图，ET-1IHC：中图和下图(高放大倍数)。
图12A，12B，12C和12D。侵润性黑素瘤的内皮素-1(ET-1)免疫组织化学染色。(A，B)以低放大倍数(左图，中图)和高放大倍数(右图)显示了侵润性黑素瘤的两种不同样本。左图是苏木精和伊红(H&E)染色剂。中图和右图是免疫组织化学(IHC)染色。在皮肤浸润物中显示许多ET-1阳性细胞(短的蓝色箭头)以及ET-1阳性黑素瘤细胞(长的黑色箭头)。(C)H&E(左图)和ET-1(右图)染色的第三个样本的高放大倍数图。(D)侵润性黑素瘤细胞微环境中的ET-1阳性细胞表达巨噬细胞标志物CD68。显示了抗-ET-1(棕色)和抗-CD68(红色)抗体染色的代表性玻片。短的蓝色箭头表示只有CD68阳性的细胞。长的黑色箭头表示对ET-1和CD68均为阳性的细胞。
图13A和13B。侵润性黑素瘤的内皮素-1(ET-1)和HMB45免疫组织化学染色。(A)用ET-1(棕色)和HMB45(红色)双重染色并用天青蓝(左图)复染的侵润性黑素瘤样本。短的蓝色箭头表示HMB45阳性的细胞。长的黑色箭头表示对HMB45以及ET-1呈阳性的细胞。(B)单独的天青蓝复染。
图14A，14B，14C，14D和14E。在转移性黑素瘤和蓝痣中ET-1的表达。(A)用ET-1染色的转移性黑素瘤样本。(B)用黑素瘤肿瘤标志物HMB45染色的相同样本。(C)用苏木精和伊红染色的蓝痣。(D，E)就ET-1(红色生色团)染色的同一样本。短的蓝色箭头指向ET-1阳性巨噬细胞。长的黑色箭头指向蓝痣中的ET-1阴性黑素细胞。
详细描述
以下是提供用于帮助本领域技术人员实践本发明的详细描述。本领域的普通技术人员可以在不脱离本公开内容的精神或范围的情况下对本文描述的实施方案进行修改和变化。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、图和其他参考文献通过引用明确地整体并入本文。
本文描述的是涉及用于治疗癌症的试剂的惊人发现的组合物和方法。特别地，如本文所述的制剂可用于治疗ETBR相关癌症，例如黑素瘤，转移性黑素瘤，鳞状细胞癌，胶质母细胞瘤或其组合。如本文所述，如本文所配制的ETBR拮抗剂对于治疗ETBR相关癌症是令人惊讶地有利的。
本说明书提供了用于ETBR拮抗剂、半胱天冬酶-8抑制剂或其组合中的至少一种与ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺或其组合中的至少一种的共同施用(在大致同时施用的单一剂型或分开的剂型中)的治疗性组合物和方法。
还出人意料地发现，包含有效量的ETBR拮抗剂、半胱天冬酶-8抑制剂或其组合中的至少一种的组合物与有效量(例如协同有效量)的ETAR拮抗剂协同作用以增强ETBR拮抗剂的有益作用，同时使不利事件或副作用最小化。同样令人惊讶的是有效量(例如协同有效量)的烟酰胺有效地协同减少来自ETBR拮抗剂的不利事件或副作用，例如体重减轻。如本文所述的制剂可用于治疗患者中的癌症，例如黑素瘤，SCC，胶质母细胞瘤或两者。
此外，令人惊讶地发现，包含有效量的ETBR拮抗剂、半胱天冬酶-8抑制剂或其组合中的至少一种的组合物与有效量(例如协同有效量)的抗PD1抗体协同作用以增强ETBR拮抗剂的有益作用，同时使不良事件或副作用最小化。如本文所述的制剂可用于治疗患者中的癌症，例如黑素瘤，SCC，胶质母细胞瘤或两者。
另外，令人惊讶地发现，包含有效量的ETBR拮抗剂、半胱天冬酶-8抑制剂或其组合中的至少一种的组合物与有效量(例如协同有效量)的bRAF抑制剂协同作用以增强ETBR拮抗剂的有益作用。如本文所述的制剂可用于治疗患者中的癌症，例如黑素瘤，SCC，胶质母细胞瘤或两者。
此外，令人惊讶地发现，包含有效量的ETBR拮抗剂与有效量(例如协同有效量)的半胱天冬酶-8抑制剂组合的组合物协同作用以增强ETBR拮抗剂的有益作用。如本文所述的制剂可用于治疗患者中的癌症，例如黑素瘤，SCC，胶质母细胞瘤或两者。
如本文所述的优选组合物和/或制剂表现出协同作用，因为组合物和/或制剂实现以下至少一种：比通过单独施用组成成分获得的加和治疗效果更大的治疗效果(即更有效)，比通过单独施用较高剂量的组分成分所获得的治疗效果更大的治疗效果，相对于通过单独施用组成成分所观察到的实现相似或更大的治疗效果但不良事件或副作用减少(即，改善的治疗窗口)，或在较小剂量的一种或两种组成成分或其组合的情况下具有相似或更大的治疗效果。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。说明书中使用的术语仅用于描述特定实施方案，并不意图限制本发明。
在提供一定范围的值的情况下，应该理解的是，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间的每个中间值至下限单位的十分之一(例如在含有多个碳原子的基团的情况下，在这种情况下提供落入该范围内的每个碳原子数)，以及在所述范围内的任何其他规定值或中间值包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含在本发明内，较小范围内也包含在本发明内，受限于所述范围内的任何明确排除的范围。在所述范围包括一个或两个界限的情况下，排除这两个界限的范围也包括在本发明中。
以下术语用于描述本发明。在术语在本文中没有具体定义的情况下，该术语被给予本领域普通技术人员根据本上下文中其用于描述本发明的用途所认可的含义。
除非上下文清楚地指出相反，否则如本文和所附权利要求书中使用的冠词“一个”和“一种”在本文中用于指物品的语法对象的一个/种或多于一个/种(即至少一个/种)。举例来说，“一个元素”是指一个元素或多于一个元素。
如本文中在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应该被理解为是指如此结合的元素的“一个或两个”，即在一些情况下联合存在和在其他情况下分离地存在的元素。用“和/或”列出的多个元素应该以相同的方式解释，即如此连接的元素中的“一个或多个”。除了由“和/或”子句明确指出的元素之外，其他元素可以可选地存在，不管与具体指出的那些元素相关还是不相关。因此，作为非限制性示例，当与诸如“包括”的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的引用在一个实施方案中可以仅指代A(可选地包括除了B之外的元件)；在另一个实施方案中，仅指代B(可选地包括除A之外的元件)；在又一个实施方案中，指代A和B(可选地包括其他元件)；等等
如本文中在说明书和权利要求中所使用的，“或”应被理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当分开列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即包含多个元素或元素列表中的至少一个，但也包括多于一个，以及可选的其他未列出项目。只有明确指出相反，术语例如“仅一个”或“恰好一个”，或者当在权利要求中使用时，“由...组成”将指包括多个元素或元素列表中的恰好一个元素。一般而言，如本文使用的术语“或”应当仅在与排他性术语诸如“任一”、“其中之一”、“仅其中之一”或“恰好其中之一”一起使用时被解释为指示排他性选项(即“一个或另一个，但不是两个”)。
在权利要求以及以上说明书中，所有过渡性短语诸如“包含”，“包括”，“携带”，“具有”，“含有”，“牵涉”，“保有”，“构成”等应被理解为是开放式的，即意味着包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述，只有过渡性短语“由...组成”和“基本上由...组成”应分别是封闭式或半封闭式过渡性短语。
如本文中在说明书和权利要求书中所使用的，关于一个或多个元素的列表的短语“至少一个”应该理解为是指从元素列表中任何一个或多个元素中选择的至少一个元素，但不一定包括元素列表内具体列出的每个元素中的至少一个，并且不排除元素列表中元素的任何组合。该定义还允许在短语“至少一个”所指的元素列表内具体指出的元素之外的元素可以可选地存在，不管与具体指出的那些元素相关还是不相关。因此，作为非限制性示例，“A和B中的至少一个”(或者等同地，“A或B中的至少一个”，或者等效地“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可以指代至少一个，可选地包括多于一个A，而不存在B(并且可选地包括除了B之外的元素)；在另一个实施方案中，指代至少一个，可选地包括多于一个B，而不存在A(并且可选地包括除了A之外的元素)；在又一个实施方案中，指代至少一个，可选地包括多于一个A和至少一个，可选地包括多于一个B(并且可选地包括其他元素)；等等。
还应该理解的是，在本文描述的包括多于一个步骤或动作的某些方法中，该方法的步骤或动作的顺序不一定限于所描述的该方法的步骤或动作的顺序，除非上下文另有说明。
术语“共同施用”和“共施用”或“组合治疗”是指同时施用(同时施用两种或更多种治疗剂)和不同时间施用(施用一种或多种治疗剂的时间不同于施用另外的治疗剂的时间)，只要治疗剂在一定程度上同时存在于患者中，优选以有效量存在于患者中。在某些优选的方面，本文所述的一种或多种本发明化合物与至少一种另外的生物活性剂，特别是包括抗癌剂联合施用。在特别优选的方面，化合物的共同施用导致协同活性和/或治疗，包括抗癌活性。
除非另有说明，否则本文使用的术语“化合物”是指本文公开的任何具体化学化合物，并且包括互变异构体，区域异构体，几何异构体以及在适用的情况下包括其光学异构体(对映异构体)和其他立体异构体(非对映异构体)以及在适用的情况下其可药用盐和衍生物(包括前药形式)。在其使用的上下文中，术语化合物通常指单一化合物，但也可包括其他化合物，例如立体异构体，区域异构体和/或光学异构体(包括外消旋混合物)以及公开的化合物的特定对映异构体或对映异构体富集的混合物。在上下文中，该术语还涉及经修饰以促进化合物向活性部位的施用和递送的化合物的前药形式。注意到在描述本发明化合物时，描述了许多与其相关的取代基和变量等等。本领域普通技术人员应该理解，本文所述的分子是下文一般性描述的稳定化合物。当显示键时，在所示化合物的上下文中表示双键和单键两者。
在整个说明书中使用术语“患者”或“受试者”来描述向其提供了使用根据本发明的组合物的治疗(包括预防性治疗)的动物，优选人或家养动物。为了治疗对特定动物如人类患者特异的那些感染、病症或疾病状态，术语患者是指特定动物，包括家养动物例如狗或猫或农场动物例如马，牛，绵羊等。一般而言，在本发明中，术语患者是指人类患者，除非另外说明或从使用该术语的上下文暗示。
术语“有效”用于描述当在预期用途的上下文中使用时化合物、组合物或组分的量影响预期结果。术语“有效”包括在本申请中另外描述或使用的所有其他有效量或有效浓度术语。
内皮素B受体(ETBR)途径(图1)在黑素瘤的转移性扩散中起重要作用，因此是治疗干预的目标。内皮素B受体是7跨膜G蛋白偶联受体(GPCR)。它在正常黑素细胞中以非常低的水平表达，但在黑素瘤发展和进展期间表达上调10。目前的黑素瘤药物靶标RAF和MEK激酶被ETBR激活10。
内皮素-1(ET-1)(和内皮素-3，未显示)是激活ETBR的配体(图2)。ET-1激活ETBR导致黑素瘤细胞增殖、转移并产生自身血液供应17。我们的研究表明，大多数色素浸润性黑素瘤和转移性黑素瘤产生ET-1(图3)。
组合物
如本文所述的制剂可用于治疗患者的ETBR相关癌症。在某些实施方案中，癌症是乳腺癌，黑素瘤，SCC，胶质母细胞瘤或其组合中的至少一种。
一方面，本说明书提供了包含有效量的ETBR拮抗剂和药学上可接受的载体的治疗性组合物或制剂。
在某些实施方案中，治疗性组合物或制剂包含有效量的ETBR拮抗剂、半胱天冬酶-8抑制剂或其组合中的至少一种，和有效量(例如协同有效量)的至少一种另外的抗癌剂以及药学上可接受的载体。在某些另外的实施方案中，另外的抗癌剂选自ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺或其组合。
在某些实施方案中，治疗性组合物或制剂包含有效量(例如协同有效量)的ETBR拮抗剂、半胱天冬酶-8抑制剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺或其组合中的至少两种。
在某些实施方案中，ETBR拮抗剂选自BQ788，BQ-017，A192621及其组合，包括其类似物，衍生物，多晶型物，前药和盐，包括氘化和氟化类似物。例如，ETBR拮抗剂可以是BQ788的氘化或氟化类似物或BQ-017的氘化或氟化类似物。
BQ788((2R)-2-[[(2R)-2-氨基-3-(1-甲氧基羰基吲哚-3-基)丙酰基]-[(2S)-2-[[(2R，6S)-2,6-二甲基哌啶-1-羰基]氨基]-4,4-二甲基戊酰基]氨基]己酸酯或[N-顺式-2,6-二甲基哌啶基羰基-L-γ-甲基亮氨酰基-D-1-甲氧基羰基色氨酰基-D-正亮氨酸]，结构如下)是ETBR拮抗剂，其在临床前研究中显示出治疗恶性黑素瘤的功效(Okada,M；Nishikibe,M(Winter 2002)."BQ-788,a selective endothelin ET(B)receptorantagonist."Cardiovascular drug reviews 20(1):53–66，其通过引用并入本文)。BQ788可从例如MolPort(MolPort-019-939-166)商购获得。
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A192621((2R，3R，4S)-4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-1-[2-(2,6-二乙基苯胺基)-2-氧代乙基]-2-(4-丙氧基苯基)吡咯烷-3-羧酸或(2R-(2α，3β，4α)-4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-1-(2-(2,6-二乙基苯基)氨基)-2-氧代乙基)-2-(4-丙氧基苯基)-3-吡咯烷羧酸)是有效的ETBR拮抗剂。A192621可从例如ABI Chem(AC1NSJS8)商购获得。
然而，ETBR的生理作用是从循环中清除过量水平的内皮素-1(ET-1)。施用BQ788可防止ET-1清除并提高血清ET-1水平。由于其内皮素A受体(ETAR)的活化，升高的血清ET-1水平与各种不良反应有关(包括高血压，肺动脉高压和肾血管收缩)。因此，为了最小化ETAR激活的不希望的作用，在某些方面，本说明书提供了用于将ETBR拮抗剂与ETAR拮抗剂共同施用(在大致同时施用的单一剂型或单独剂型中)的治疗性组合物和方法。
在某些实施方案中，ETAR拮抗剂是BQ123。BQ123(2-[(3R，6R，9S，12R，15S)-6-(1H-吲哚-3-基甲基)-9-(2-甲基丙基)-2,5,8,11,14-五氧-12-丙-2-基-1,4,7,10,13-五氮杂双环[13.3.0]十八烷-3-基]乙酸或环(D-Trp-D-Asp-Pro-D-Val-Leu))是一种选择性ETAR拮抗剂。(Ishikawa et al.,(1992)."Cyclic pentapeptide endothelin antagonistswith high ETA selectivity.Potency-and solubility-enhancing modifications.”Journal of Medicinal Chemistry 35(11):1239–42，其通过引用并入本文)。BQ123可从例如ABI Chem(AC1L9EDH)商购获得。
还令人惊讶地发现，包含与有效量的ETAR拮抗剂组合的有效量的ETBR拮抗剂的组合物协同作用以增强ETBR拮抗剂的有益作用，同时使不利事件或副作用最小化。因此，另一方面，本说明书提供了包含与有效量的ETAR拮抗剂组合的有效量的ETBR拮抗剂以及药学上可接受的载体的治疗性组合物或制剂。在某些实施方案中，ETAR的有效量是协同有效量。在某些实施方案中，ETBR拮抗剂选自BQ788，A192621及其组合，包括其类似物，衍生物，多晶型物，前药和盐。
在某些实施方案中，ETAR拮抗剂是BQ123，包括其类似物，衍生物，多晶型物，前药和盐。
半胱天冬酶-8是ETBR的下游效应子。半胱天冬酶-8抑制剂阻断由于ETBR激活而引发的促进侵润和转移的分子事件。因此，半胱天冬酶-8抑制剂可以分类为半胱天冬酶-8拮抗剂或ETBR信号传导的拮抗剂/抑制剂。在本文所述的任何方面或实施方案中，具有Ac-AAVALLPAVLLAALAPIETD-CHO序列的半胱天冬酶-8抑制剂肽可从EMD Millipore(Billerica，MA 01821，USA)商购获得。
在本文所述的任何方面或实施方案中，治疗性组合物或制剂包含至少一种另外的抗癌剂。在本文所述的任何方面或实施方案中，另外的抗癌剂是另一种ETBR拮抗剂。
在某些实施方案中，治疗性组合物或制剂包含有效量的ETBR拮抗剂或半胱天冬酶-8抑制剂或其组合以及有效量的另外的ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂或它们的组合中的至少一种，以及药学上可接受的载体。在某些实施方案中，组合物包含协同有效量的另外的ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂或其组合中的至少一种。在具体的实施方案中，治疗性组合物或制剂还包含有效量(例如协同有效量)的另外的ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、bRAF抑制剂、烟酰胺或其组合中的至少一种。
另一方面，本说明书提供了治疗性组合物或制剂，其包含有效量的ETBR拮抗剂、半胱天冬酶-8抑制剂或其组合中的至少一种以及有效量的抗PD1抗体和药学上可接受的载体。在某些实施方案中，抗PD1抗体的有效量是协同有效量。在具体的实施方案中，治疗性组合物或制剂还包含有效量(例如协同有效量)的另外的ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、bRAF抑制剂、烟酰胺或其组合中的至少一种。
在本文所述的任何方面或实施方案中，抗PD1抗体是选自以下的至少一种药剂：Nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab或本领域技术人员已知或变得已知的任何其他抗PD1抗体。
另一方面，本说明书提供了治疗性组合物或制剂，其包含有效量的ETBR拮抗剂、半胱天冬酶-8抑制剂或其组合中的至少一种，以及有效量的bRAF抑制剂，和药学上可接受的载体。在某些实施方案中，bRAF抑制剂的有效量是协同有效量。在具体的实施方案中，治疗性组合物或制剂还包含有效量的另外的ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体或其组合中的至少一种。
在本文所述的任何方面或实施方案中，bRAF抑制剂是至少一种选自达拉菲尼、索拉非尼、威罗菲尼或本领域技术人员已知或变得已知的任何其他bRAF抑制剂的药剂。
在本文所述的任何方面或实施方案中，治疗性组合物或制剂包含有效或协同有效量的至少一种另外的抗癌剂。
在某些实施方案中，另外的癌症药物是RAF激酶拮抗剂，MEK拮抗剂或其组合。
在某些实施方案中，所述另外的抗癌剂选自伊匹单抗，威罗菲尼，达卡巴嗪，nivolumab，pembrolizumab，烟酰胺，白细胞介素-2，DEDN6526，Talimogenelaherparepvec，肿瘤浸润淋巴细胞，抗血管生成剂，阿霉素，喜树碱，卡铂，顺铂，柔红霉素，多柔比星，α、β或γ干扰素，伊立替康，多西他赛，紫杉醇，托泊替康，阿曲生坦，替唑生坦，波生坦，西他生坦，enrasentan，Ro468443，TBC10950，TBC10894，A192621，A308165，SB209670，SB17242，A182086，(s)-Lu302872，J-104132，TAK-044，萨拉福辛56c，IRL2500，RES7011，Aselacins A、B和C，Ro470203，Ro462005，磺胺甲恶唑，cochinmicin I、II和III，L749329，L571281，L754142，J104132，CGS27830，PD142893，PD143296，PD145065，PD156252，PD159020，PD160672，PD160874，TM-ET-1，IRL3630，Ro485695，L75037，LU224332，PD142893，LU302872，PD145065，Ro610612，SB217242及其组合。
在某些实施方案中，抗血管生成剂选自沙利度胺，马立马司他，COL-3，BMS275291，角鲨胺，2-ME，SU6668，新诺他司，Medi522，EMD121974，CAI，塞来昔布，白细胞介素-12，IM862，TNP470，阿瓦斯丁，格列卫，赫赛汀及其组合。
在本文所述的任何方面或实施方案中，治疗性组合物或制剂包含有效或协同有效量的烟酰胺。烟酰胺可减弱或减轻ETBR拮抗剂的肾血管收缩副作用。在一个具体的实施方案中，治疗性组合物或制剂包含有效量的ETBR拮抗剂(或半胱天冬酶-8抑制剂或ETBR拮抗剂和半胱天冬酶-8抑制剂)，有效或协同有效量的ETBR拮抗剂，有效量或协同有效量的烟酰胺，以及药学上可接受的载体。烟酰胺可减弱或减轻ETBR拮抗剂的肾血管收缩副作用。
在本文所述的任何方面或实施方案中，ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和半胱天冬酶-8抑制剂中的至少一种的剂量是约0.1μg至约5000μg。在本文所述的任何方面或实施方案中，ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和半胱天冬酶-8抑制剂中的至少一种的浓度是组合物的约0.01μg/mL至约1000mg/mL。
在本文所述的任何实施方案或方面中，ETBR拮抗剂的剂量是约100μg至约4000μg和/或ETBR拮抗剂的浓度是组合物的约0.1至约5.0mg/mL。
在本文所述的任何实施方案或方面中，ETAR拮抗剂的剂量是约100μg至约4000μg，和/或ETAR拮抗剂的浓度是组合物的约0.1至约5.0mg/mL。
在本文所述的任何实施方案或方面中，抗PD1抗体的剂量是约100μg至约4000μg和/或抗PD1抗体的浓度是组合物的约0.1至约5.0mg/mL。
在本文所述的任何实施方案或方面中，bRAF抑制剂的剂量是约100μg至约4000μg，和/或bRAF抑制剂的浓度是组合物的约0.1至约5.0mg/mL。
在本文所述的任何实施方案或方面中，烟酰胺的剂量是约100μg至约4000μg，和/或烟酰胺的浓度是组合物的约0.1至约5.0mg/mL。
在本文所述的任何实施方案或方面中，半胱天冬酶-8抑制剂的剂量是约1.0μg至约4000μg和/或半胱天冬酶-8抑制剂的浓度是组合物的约0.1至约5.0mg/mL。
例如，ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和半胱天冬酶-8抑制剂的浓度可独立地是组合物的约0.01μg/mL至约1000mg/mL，约0.01μg/mL至约750mg/mL，约0.01μg/mL至约500mg/mL，约0.01μg/mL至约300mg/mL，约0.01μg/mL至约150mg/mL，约0.01μg/mL至约100mg/mL，约0.01μg/mL至约50mg/mL，约0.01μg/mL至约25mg/mL，约0.01μg/mL至约10mg/mL，约0.01μg/mL至约1.0mg/mL，约0.01μg/mL至约0.1μg/mL，约0.1μg/mL至约750mg/mL，约0.1μg/mL至约500mg/mL，约0.1μg/mL至约300mg/mL，约0.1μg/mL至约150mg/mL，约0.1μg/mL至约100mg/mL，约0.1μg/mL至约50mg/mL，约0.1μg/mL至约25mg/mL，约0.1μg/mL至约10mg/mL，约0.1μg/mL至约1.0mg/mL，约1.0μg/mL至约750mg/mL，约1.0μg/mL至约500mg/mL，约1.0μg/mL至约300mg/mL，约1.0μg/mL至约150mg/mL，约1.0μg/mL至约100mg/mL，约1.0μg/mL至约50mg/mL，约1.0μg/mL至约25mg/mL，约1.0μg/mL至约10mg/mL，约10μg/mL至约750mg/mL，约10μg/mL至约500mg/mL，约10μg/mL至约300mg/mL，约10μg/mL至约150mg/mL，约10μg/mL至约100mg/mL，约10μg/mL至约50mg/mL，约10μg/mL至约25mg/mL，约25μg/mL至约750mg/mL，约25μg/mL至约500mg/mL，约25μg/mL至约300mg/mL，约25μg/mL至约150mg/mL，约25μg/mL至约100mg/mL，约25μg/mL至约50mg/mL，约50μg/mL至约750mg/mL，约50μg/mL至约500mg/mL，约50μg/mL至约300mg/mL，约50μg/mL至约150mg/mL，约50μg/mL至约100mg/mL，约100μg/mL至约750mg/mL，约100μg/mL至约500mg/mL，约100μg/mL至约300mg/mL，约100μg/mL至约150mg/mL，约150μg/mL至约750mg/mL，约150μg/mL至约500mg/mL，约150μg/mL至约300mg/mL，约300μg/mL至约750mg/mL，约300μg/mL至约500mg/mL或约500μg/mL至约750mg/mL。
例如，ETBR拮抗剂，ETAR拮抗剂，半胱天冬酶-8抑制剂，bRAF抑制剂，烟酰胺和抗PD1抗体的剂量可以独立地是约0.1μg至约5000μg，约0.1μg至约4500μg，约0.1μg至约4000μg，约0.1μg至约3500μg，约0.1μg至约3000μg，约0.1μg至约2500μg，约0.1μg至约2000μg，约0.1μg至约1500μg，约0.1μg至约1000μg，约0.1μg至约500μg，约1.0μg至约5000μg，约1.0μg至约4500μg，约1.0μg至约4000μg，约1.0μg至约3500μg，约1.0μg至约3000μg，约1.0μg至约2500μg，约1.0μg至约2000μg，约1.0μg至约1500μg，约1.0μg至约1000μg，约1.0μg至约500μg，约100μg至约5000μg，约100μg至约4500μg，约100μg至约4000μg，约100μg至约3500μg，约100μg至约3000μg，约100μg至约2500μg，约100μg至约2000μg，约100μg至约1500μg，约100μg至约1000μg，约100μg至约500μg，约250μg至约5000μg，约250μg至约4500μg，约250μg至约4000μg，约250μg至约3500μg，约250μg至约3000μg，约250μg至约2500μg，约250μg至约2000μg，约250μg至约1500μg，约250μg至约1000μg，约250μg至约500μg，约500μg至约5000μg，约500μg至约4500μg，约500μg至约4000μg，约500μg至约3500μg，约500μg至约3000μg，约500μg至约2500μg，约500μg至约2000μg，约500μg至约1500μg，约500μg至约1000μg，约750μg至约5000μg，约750μg至约4500μg，约750μg至约4000μg，约750μg至约3500μg，约750μg至约3000μg，约750μg至约2500μg，约750μg至约2000μg，约75μg至约1500μg，约750μg至约1000μg，约1500μg至约5000μg，约1500μg至约4500μg，约1500μg至约4000μg，约1500μg至约3500μg，约1500μg至约3000μg，约1500μg至约2500μg，约1500μg至约2000μg，约2000μg至约5000μg，约2000μg至约4500μg，约2000μg至约4000μg，约2000μg至约3500μg，约2000μg至约3000μg，约2000μg至约2500μg，约2500μg至约5000μg，约2500μg至约4500μg，约2500μg至约4000μg，约2500μg至约3500μg，约2500μg至约3000μg，约3000μg至约5000μg，约3000μg至约4500μg，约3500μg至约4000μg，约3500μg至约5000μg，约3500μg至约4500μg，约3500μg至约4000μg，约4000μg至约5000μg，约4000μg至约4500μg,或约4500μg至约5000μg。
在本文所述的任何实施方案或方面中，抗PD1抗体的剂量是约0.1mg/kg至约9.0mg/kg。例如，抗PD1抗体的剂量是约0.1mg/kg至约9.0mg/kg，约0.1mg/kg至约8.0mg/kg，约0.1mg/kg至约7.0mg/kg，约0.1mg/kg至约6.0mg/kg，约0.1mg/kg至约5.0mg/kg，约0.1mg/kg至约4.0mg/kg，约0.1mg/kg至约3.0mg/kg，约0.1mg/kg至约2.0mg/kg，约0.1mg/kg至约1.0mg/kg，约1.0mg/kg至约9.0mg/kg，约1.0mg/kg至约8.0mg/kg，约1.0mg/kg至约7.0mg/kg，约1.0mg/kg至约6.0mg/kg，约1.0mg/kg至约5.0mg/kg，约1.0mg/kg至约4.0mg/kg，约1.0mg/kg至约3.0mg/kg，约1.0mg/kg至约2.0mg/kg，约2.0mg/kg至约9.0mg/kg，约2.0mg/kg至约8.0mg/kg，约2.0mg/kg至约7.0mg/kg，约2.0mg/kg至约6.0mg/kg，约2.0mg/kg至约5.0mg/kg，约2.0mg/kg至约4.0mg/kg，约2.0mg/kg至约3.0mg/kg，约3.0mg/kg至约9.0mg/kg，约3.0mg/kg至约8.0mg/kg，约3.0mg/kg至约7.0mg/kg，约3.0mg/kg至约6.0mg/kg，约3.0mg/kg至约5.0mg/kg，约3.0mg/kg至约4.0mg/kg，约4.0mg/kg至约9.0mg/kg，约4.0mg/kg至约8.0mg/kg，约4.0mg/kg至约7.0mg/kg，约4.0mg/kg至约6.0mg/kg，约4.0mg/kg至约5.0mg/kg，约5.0mg/kg至约9.0mg/kg，约5.0mg/kg至约8.0mg/kg，约5.0mg/kg至约7.0mg/kg，约5.0mg/kg至约6.0mg/kg，约6.0mg/kg至约9.0mg/kg，约6.0mg/kg至约8.0mg/kg，约6.0mg/kg至约7.0mg/kg，约7.0mg/kg至约9.0mg/kg，约7.0mg/kg至约8.0mg/kg,或约8.0mg/kg至约9.0mg/kg。
在本文所述的任何实施方案或方面中，bRAF抑制剂的剂量是约1mg至约1500mg。例如，bRAF抑制剂的剂量是约1mg至约1500mg，约1mg至约1250mg，约1mg至约1000mg，约1mg至约750mg，约1mg至约500mg，约1mg至约250mg，约250mg至约1500mg，约250mg至约1250mg，约250mg至约1000mg，约250mg至约750mg，约250mg至约500mg，约500mg至约1500mg，约500mg至约1250mg，约500mg至约1000mg，约500mg至约750mg,约750mg至约1500mg，约750mg至约1250mg，约750mg至约1000mg，约1000mg至约1500mg，约1000mg至约1250mg,或约1250mg至约1500mg。
在本文所述的任何实施方案或方面中，烟酰胺的剂量是约1mg至约3000mg。例如，烟酰胺的剂量是约1mg至约3000mg，约1mg至约2750mg，约1mg至约2500mg，约1mg至约2250mg，约1mg至约2000mg，约1mg至约1750mg，约1mg至约1500mg，约1mg至约1250mg，约1mg至约1000mg，约1mg至约750mg，约1mg至约500mg，约1mg至约250mg，约250mg至约3000mg，约250mg至约2750mg，约250mg至约2500mg，约250mg至约2250mg，约250mg至约2000mg，约250mg至约1750mg，约250mg至约1500mg，约250mg至约1250mg，约250mg至约1000mg，约250mg至约750mg，约250mg至约500mg，约500mg至约3000mg，约500mg至约2750mg，约500mg至约2500mg，约500mg至约2250mg，约500mg至约2000mg，约500mg至约1750mg，约500mg至约1500mg，约500mg至约1250mg，约500mg至约1000mg，约500mg至约750mg，约750mg至约3000mg，约750mg至约2750mg，约750mg至约2500mg，约750mg至约2250mg，约750mg至约2000mg，约750mg至约1750mg，约750mg至约1500mg，约750mg至约1250mg，约750mg至约1000mg，约1000mg至约3000mg，约1000mg至约2750mg，约1000mg至约2500mg，约1000mg至约2250mg，约1000mg至约2000mg，约1000mg至约1750mg，约1000mg至约1500mg，约100mg至约1250mg，约1250mg至约3000mg，约1250mg至约2750mg，约1250mg至约2500mg，约1250mg至约2250mg，约1250mg至约2000mg，约1250mg至约1750mg，约1250mg至约1500mg，约1500mg至约3000mg，约1500mg至约2750mg，约1500mg至约2500mg，约1500mg至约2250mg，约1500mg至约2000mg，约1500mg至约1750mg，约1750mg至约3000mg，约1750mg至约2750mg，约1750mg至约2500mg，约1750mg至约2250mg，约1750mg至约2000mg,约2000mg至约3000mg，约2000mg至约2750mg，约2000mg至约2500mg，约2000mg至约2250mg，约2250mg至约3000mg，约2250mg至约2750mg，约2250mg至约2500mg，约2500mg至约3000mg，约2500mg至约2750mg,或约2750mg至约3000mg。
基于本说明书，所提供的示例性剂量范围可以被组合以便在使用常规方法共同施用时最大化或优化所观察到的协同作用，如上文所讨论的。
本文所述的药物组合物包含活性化合物与药学有效量的载体、添加剂或赋形剂的组合，并代表本公开的另一方面。在具体的实施方案中，赋形剂选自和Aegis HydrogelTM。在另一个实施方案中，组合物或制剂包含至少一种选自/>大豆油、二甲基亚砜(DMSO)、/>和Aegis HydrogelTM的赋形剂。例如，DMSO是包含约5％至约100％DMSO，约25％至约100％DMSO，约50％至约100％DMSO，约75％至约100％DMSO，约5％至约75％DMSO，约25％至约75％DMSO，约50％至约75％DMSO，约5％至约50％DMSO，约25％至约50％DMSO,或约5％至约25％DMSO的DMSO溶液。
如果适用，本公开内容包括包含药学上可接受的盐，特别是如本文所述的化合物的酸或碱加成盐的组合物。用于制备可用于此方面的前述基础化合物的药学上可接受的酸加成盐的酸是那些形成无毒酸加成盐，即含有药理学上可接受的阴离子的盐，例如盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，硝酸盐，硫酸盐，硫酸氢盐，磷酸盐，酸式磷酸盐，乙酸盐，乳酸盐，柠檬酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐，酒石酸氢盐，琥珀酸盐，马来酸盐，富马酸盐，葡糖酸盐，糖酸盐，苯甲酸盐，甲磺酸盐，乙磺酸盐，苯磺酸盐，对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐，1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3萘甲酸)]盐等等。
药学上可接受的碱加成盐也可用于生产根据本公开内容的化合物或衍生物的药学上可接受的盐形式。可以用作制备天然酸性的本发明化合物的药学上可接受的碱性盐的试剂的化学碱是与这些化合物形成无毒碱盐的那些。这样的无毒碱盐包括但不限于衍生自药理学上可接受的阳离子(例如碱金属阳离子(例如钾和钠)和碱土金属阳离子(例如钙，锌和镁))的盐，铵或水溶性胺加成盐例如N-甲基葡糖胺-(葡甲胺)，和低级链烷醇铵和药学上可接受的有机胺的其它碱盐等等。
根据本公开内容，本文所述的化合物可以通过口服、肠胃外或局部途径以单剂量或分开的剂量施用。活性化合物的施用可以是连续(静脉内滴注)施用到每天几次口服施用(例如Q.I.D.)，并且可以包括口服，局部，肠胃外，肌肉内，静脉内，皮下，透皮(其可以包括渗透促进剂)，口腔，舌下和栓剂施用，以及其他施用途径。肠溶包衣口服片剂也可用于增强来自口服施用途径的化合物的生物利用度。最有效的剂型将取决于所选特定药物的药代动力学以及患者疾病的严重程度。也可以使用根据本公开内容的化合物作为用于鼻内、气管内或肺部施用的喷雾剂、薄雾剂或气雾剂。因此本公开内容还涉及药物组合物，其包含有效量的如本文所述的化合物，其任选地与药学上可接受的载体、添加剂或赋形剂组合。根据本公开内容的化合物可以以立即释放、中间释放或持续释放或控制释放形式施用。持续或控制释放形式优选口服施用，但也以栓剂和经皮或其他局部形式施用。脂质体形式的肌内注射也可用于控制或维持化合物在注射部位的释放。
如本文所述的组合物可以使用一种或多种药学上可接受的载体以常规方式配制，并且还可以以控释制剂施用。可用于这些药物组合物中的药学上可接受的载体包括但不限于二甲基亚砜(DMSO)，作为载体的大豆油，离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血清白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质如硫酸丙醇胺，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶体二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。
本文所述的组合物可以口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、口腔、阴道或通过植入的储库施用。本文使用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。优选地，组合物口服、腹膜内或静脉内施用。
如本文所述的组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的载体和溶剂是水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂，同样的是天然药学上可接受的油如橄榄油、蓖麻油或大豆油，尤其是其聚氧乙烯化形式。这些油溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，例如Ph.Helv或类似的醇。
如本文所述的药物组合物可以以任何口服可接受的剂型口服施用，所述剂型包括但不限于胶囊，片剂，含水悬浮液或溶液。在口服片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂，如硬脂酸镁。对于以胶囊形式口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当使用水悬浮液用于口服时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，也可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。
或者，本文所述的药物组合物可以以用于直肠施用的栓剂形式施用。这些可以通过将试剂与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在室温下为固体但在直肠温度下为液体，因此将在直肠中融化以释放药物。这种材料包括可可脂，蜂蜡和聚乙二醇。
如本文所述的药物组合物也可以局部施用。容易为这些区域或器官中的每一个制备合适的局部制剂。用于下肠道的局部应用可以在直肠栓剂(参见上文)中或在合适的灌肠剂中进行。也可以使用局部可接受的透皮贴剂。
对于局部应用，可将药物组合物配制成含有悬浮或溶解于一种或多种载体中的活性组分的合适软膏。用于局部施用本发明化合物的载体包括但不限于矿物油，液体凡士林，DMSO，白凡士林，丙二醇，聚氧乙烯，聚氧丙烯化合物，乳化蜡和水。在本发明的某些优选方面，可以将化合物涂覆到待手术植入患者体内的支架上，以便抑制或减少患者支架中发生闭塞的可能性。
或者，可以将药物组合物配制成含有悬浮或溶解于一种或多种药学上可接受的载体中的活性组分的合适洗剂或霜剂。合适的载体包括但不限于矿物油，脱水山梨糖醇单硬脂酸酯，聚山梨酯60，鲸蜡酯蜡，鲸蜡硬脂醇，2-辛基十二烷醇，苯甲醇和水。
对于眼用，药物组合物可以在等渗，pH调节的无菌盐水中配制成微粉化悬浮液，或者优选以等渗，pH调节的无菌盐水中的溶液形式配制，或者含或不含防腐剂如苄基氯化铵。或者，对于眼用，药物组合物可以配制成软膏如凡士林。
如本文所述的药物组合物还可以通过鼻用气雾剂或吸入施用。根据本文所述的与药物制剂相关的技术制备这样的组合物，并且可以使用苯甲醇或其他合适的防腐剂、增强生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其他常规增溶剂或分散剂将其制备为盐水溶液。在某些实施方案中，本说明书提供了包含脂质体的制剂，其包含有效量(例如协同有效量)的ETBR拮抗剂或半胱天冬酶-8抑制剂中的至少一种或其组合，和/或有效量(例如，协同有效量)的ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺中的至少一种或它们的组合，其中所述脂质体制剂被配置为或适用于鼻内递送或舌下递送。在另一个实施方案中，脂质体还包含如上所述的另外的抗癌剂。
本文所述的药物组合物中可以与载体物质组合以产生单一剂型的化合物的量将根据所治疗的宿主和疾病、特定的施用模式而变化。优选地，组合物应该配制成含有约0.05毫克至约750毫克或更多，更优选约1毫克至约600毫克，甚至更优选约10毫克至约500毫克的活性成分，单独地或与至少一种根据本发明的其他化合物组合。
还应该理解的是，对于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于各种因素，包括所用具体化合物的活性，年龄，体重，一般健康状况，性别，饮食，施用时间，排泄率，药物组合，治疗医生的判断以及所治疗的特定疾病或病症的严重程度。
需要根据本文所述的方法使用化合物治疗的患者或受试者可以通过向患者(受试者)施用有效量的根据本发明的化合物来治疗，所述化合物包括药学上可接受的盐、其溶剂化物或多晶型物，任选地在药学上可接受的载体或稀释剂中，单独地或与本文另外指出的其它已知的红细胞生成刺激剂组合。
这些化合物可以以液体、乳膏、凝胶或固体形式、或通过气雾剂形式通过任何适当途径施用，例如口服，肠胃外，静脉内，皮内，皮下或局部施用，包括透皮施用。
活性化合物以足以向患者递送所需适应症的治疗有效量的量包含在药学上可接受的载体或稀释剂中，而不会在所治疗的患者中引起严重的毒性效应。用于所有本文提及的条件的活性化合物的优选剂量为每天约10ng/kg至300mg/kg，优选0.1至100mg/kg，更通常为0.5至约25mg/kg接受者体重/患者/天。在合适的载体中，典型的局部用量范围为0.01-5％wt/wt。
化合物以任何合适的单位剂型方便地施用，包括但不限于每单位剂型含有少于1mg，1mg至3000mg，优选5至500mg的活性成分。约25-250mg的口服剂量通常是方便的。
优选施用活性成分以达至约0.00001-30mM，优选约0.1-30μM的活性化合物的峰值血浆浓度。这可以例如通过静脉内注射活性成分的溶液或制剂(任选地在盐水或含水介质中)或作为活性成分的丸剂施用来实现。口服施用也适合于产生有效的血浆浓度的活性剂。
药物组合物中活性化合物的浓度将取决于药物的吸收、分布、失活和排泄速率以及本领域技术人员已知的其他因素。值得注意的是，剂量值也会随着要缓解的病症的严重程度而变化。应当进一步理解，对于任何特定受试者，应根据个体需要和施用或监督组合物施用的人员的专业判断随时间调整具体的剂量方案，并且本文所述的浓度范围是仅是示例性的，并不意图限制所要求保护的组合物的范围或实践。活性成分可以一次施用，或者可以分成许多较小的剂量以在不同的时间间隔施用。
口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载体。它们可以封装在明胶胶囊中或压制成片剂。为了口服治疗施用的目的，活性化合物或其前药衍生物可以与赋形剂混合并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。可以包括药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。
片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有任何以下成分或相似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素，黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖，分散剂如海藻酸，Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷，水杨酸甲酯或橙味调味剂。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料外，其还可以含有液体载体如脂肪油。另外，剂量单位形式可以含有各种其他改变剂量单位的物理形式的物质，例如糖、虫胶或肠溶剂的包衣。
活性化合物或其药学上可接受的盐可作为酏剂、悬浮液、糖浆、薄皮、口香糖等的组分施用。除了活性化合物之外，糖浆还可含有作为甜味剂的蔗糖和某些防腐剂、染料和着色剂和调味剂。
用于肠胃外、皮内、皮下或局部应用的溶液或混悬液可以包括以下组分：无菌稀释剂如注射用水，盐水溶液，固定油(例如大豆油)，聚乙二醇，甘油，丙烯乙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液如醋酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐，以及调节张力的试剂如氯化钠或葡萄糖。可将母体制剂封入安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
如果静脉内施用，优选的载体是生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在某些实施方案中，配置脂质体以实现治疗性组合物或制剂的控制释放。在某些实施方案中，脂质体被配置为实现治疗性组合物或制剂的快速释放。在其他实施方案中，配制或配制脂质体以实现治疗性组合物或制剂的延长释放。在其他实施方案中，脂质体被配置成导致治疗性组合物或制剂的快速释放和延长释放。
在某些实施方案中，配置脂质体以实现ETBR拮抗剂或半胱天冬酶-8抑制剂或其组合的控制释放。在某些实施方案中，配置脂质体以实现ETBR拮抗剂或半胱天冬酶-8抑制剂或其组合的快速释放。在其他实施方案中，配置或配制脂质体以实现ETBR拮抗剂或半胱天冬酶-8抑制剂或其组合的延长释放。在其他实施方案中，配置脂质体以导致ETBR拮抗剂或半胱天冬酶-8抑制剂或其组合的快速释放和延长释放。
在其他实施方案中，说明书提供了包含在生物相容性递送系统中的ETBR拮抗剂(例如BQ788、BQ-017、A192621、其氘化或氟化类似物或其组合)和ETAR拮抗剂(例如BQ123)的均匀分散体的控释皮下或肌内剂型，由此在施用后，ETBR和ETAR拮抗剂从制剂缓慢且同时释放到体循环中。
在某些实施方案中，控释递送系统组合物包含生物相容性聚合物。在某些实施方案中，活性化合物与保护化合物免于从身体快速消除的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、水凝胶、热敏水凝胶和微囊化递送系统。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯，丙烯酸酯，聚羧酸，聚酐，聚乙醇酸，胶原，聚原酸酯和聚乳酸。
在某些实施方案中，将如本文所述的治疗性组合物配制成控释递送系统，其包含选自聚(丙交酯)，聚(乙交酯)，聚(丙交酯-共-乙交酯)，聚聚(乳酸)，聚(乙醇酸)，聚(乳酸-共-乙醇酸)，聚己内酯，聚碳酸酯，聚酯酰胺，聚酐，聚氨基酸，聚原酸酯，聚氰基丙烯酸酯，聚对二氧环己酮，聚(亚烷基草酸酯)，可生物降解的聚氨酯，其共混物和共聚物。
脂质体混悬液也可以是药学上可接受的载体。这些可根据本领域技术人员已知的方法制备，例如，美国专利号4,522,811(其全部内容通过引用并入本文)。例如，脂质体制剂可以通过将适当的脂质(例如硬脂酰磷脂酰乙醇胺，硬脂酰磷脂酰胆碱，花生四烯酰磷脂酰胆碱和胆固醇)溶解在无机溶剂中，然后将其蒸发，留下干燥的脂质薄膜在容器的表面上。然后将活性化合物的水溶液引入容器中。然后手动旋转容器以从容器侧面释放脂质材料并分散脂质聚集体，从而形成脂质体混悬液。
在本文所述的任何方面或实施方案中，治疗性组合物或制剂包含具有内部体积的脂质体，所述内部体积包含ETBR拮抗剂或半胱天冬酶-8抑制剂或其组合，以及有效量的ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺或其组合中的至少一种。在某些实施方案中，脂质体包含中性脂质，碱性(具有净正电荷)脂质，酸性(具有净负电荷)脂质，胆固醇或其组合中的至少一种。在某些另外的实施方案中，脂质体还包含聚合物组分。在某些实施方案中，脂质体的内部体积是至少部分水性的，并且包含ETBR拮抗剂。
在某些实施方案中，说明书提供了在脂质体递送系统中的如本文所述的治疗性组合物，所述脂质体递送系统选自磷脂酰乙醇胺(PE)如二棕榈酰PE(DPPE)和部分不饱和磷脂酰胆碱(PC)的PC(EPC)或SPC，完全不饱和PC如HSPC，PG，磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)。一种优选的磷脂是部分不饱和的PG，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，胆固醇，DSPE-PEG2000。在某些实施方案中，脂质体递送系统是选自快速释放、延长释放、快速和延长释放、延迟释放及其组合的控释系统。在某些实施方案中，递送系统是
在另外的实施方案中，将如本文所述的治疗性组合物配制成固体脂质纳米颗粒制剂，其选自甘油三酯(Compritol 888ATO和Dynasan112)，巴西棕榈蜡，蜂蜡，鲸蜡醇，乳化蜡，胆固醇，丁酸胆固醇酯和聚(乙二醇)(PEG)衍生物，以及它们的组合。
另一方面，本说明书提供了治疗性组合物或制剂，其包含有效量的ETBR拮抗剂、半胱天冬酶-8抑制剂或其组合中的至少一种以及有效量的ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺或其组合中的至少一种，以及药学上可接受的载体。在某些实施方案中，ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和/或其组合的有效量是协同有效量。在具体的实施方案中，如上所述，治疗性组合物或制剂还包含有效量的至少一种另外的抗癌剂。
在本文所述的任何方面或实施方案中，抗PD1抗体是选自以下的至少一种药剂：Nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab或在本领域中已知或对于技术人员而言变得已知的任何其他抗PD1抗体。
另一方面，本说明书提供了治疗性组合物或制剂，其包含有效量的ETBR拮抗剂或半胱天冬酶-8抑制剂或其组合以及有效量的bRAF抑制剂和药学上可接受的载体。在某些实施方案中，bRAF抑制剂的有效量是协同有效量。在具体的实施方案中，治疗性组合物或制剂还包含有效量的另外的ETBR拮抗剂，ETAR拮抗剂，抗PD-1抗体或其组合中的至少一种。
在本文所述的任何方面或实施方案中，bRAF抑制剂是选自以下的至少一种药剂：达拉菲尼、索拉非尼、威罗菲尼或已知的或本领域技术人员已知的任何其他nRAF抑制剂。
另一方面，提供了控释皮下或肌内剂量制剂。该制剂包含活性成分的均匀分散体，所述活性成分包括：ETBR拮抗剂、半胱天冬酶-8抑制剂或其组合中的至少一种；和协同量的至少一种选自ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺或其组合的生物相容性递送系统中的另外的药剂，其中在施用后，ETBR拮抗剂和另外的药剂从制剂缓慢并同时释放到体循环中。
在本文所述的任何方面或实施方案中，至少一种：(1)抗PD1抗体是至少一种选自Nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab或本领域技术人员已知或变得已知的任何其他抗PD1抗体的药剂；(2)bRAF抑制剂是至少一种选自以下的药剂：达拉菲尼、索拉非尼、威罗菲尼或本领域技术人员已知或变得已知的任何其他bRAF抑制剂；(3)ETBR拮抗剂是BQ788、BQ-017、A192621、其氘化或氟化类似物或其组合中的至少一种；(4)ETAR拮抗剂是BQ123；或(5)半胱天冬酶-8抑制剂是具有Ac-AAVALLPAVLLAALAPIETD-CHO序列的肽。
在本文所述的任何方面或实施方案中，递送系统选自：(1)生物相容性聚合物，(2)脂质体制剂；(3)DMSO溶液，(4)和(5)固体脂质纳米颗粒制剂。
在本文所述的任何方面或实施方案中，生物相容性聚合物选自聚(丙交酯)，聚(乙交酯)，聚(丙交酯-共-乙交酯)，聚(乳酸)，聚(乙醇酸)，聚(乳酸-共-乙醇酸)，聚己内酯，聚碳酸酯，聚酯酰胺，聚酐，聚氨基酸，聚原酸酯，聚氰基丙烯酸酯，聚对二氧环己酮聚亚烷基草酸酯，生物可降解聚氨酯，其共混物和共聚物。
在本文所述的任何方面或实施方案中，脂质体制剂选自磷脂酰乙醇胺(PE)如二棕榈酰PE(DPPE)和部分不饱和磷脂酰胆碱(PC)，如蛋PC(EPC)或SPC，完全不饱和的PC例如HSPC、PG、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)，部分不饱和的PG，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，胆固醇，DSPE-PEG2000。
在本文所述的任何方面或实施方案中，固体脂质纳米颗粒制剂选自甘油三酯(Compritol 888 ATO和Dynasan 112)，巴西棕榈蜡，蜂蜡，鲸蜡醇，乳化蜡，胆固醇，胆固醇丁酸酯和聚乙二醇(PEG)衍生物。
治疗方法
内皮素如ET-1和ET-3对ETBR的激活导致促进黑素瘤侵润和转移的各种分子事件。虽然大多数黑素瘤表达ETBR，但其中的一个亚组也表达ETBR激活剂ET-1和/或ET-3。因此，这个亚组的存活、侵润潜能和转移潜能最有可能依赖于ETBR激活。因此，这个亚组的患者最有可能对ETBR阻断作出反应。此外，这个亚组的患者最不可能对基于免疫的治疗产生反应。如此，本公开内容涉及使用ET-1和/或ET-3表达的筛选测试作为ETBR抑制剂(例如BQ788、BQ-017、A192621、氘化或氟化其类似物或其组合)和/或半胱天冬酶-8抑制剂和/或ETAR抑制剂(如BQ123)施用的伴随诊断。
因此，在另一方面，本说明书提供了用于治疗或改善受试者或患者(例如动物如人)中的疾病、病症或症状的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量，例如治疗有效量或协同有效量的本文所述的治疗性组合物或制剂，其中所述组合物有效治疗或改善所述受试者的疾病或病症或其症状。在某些实施方案中，疾病或病症是对基于免疫的治疗不敏感的ETBR相关癌症或癌症。在其他实施方案中，ETBR相关癌症是乳腺癌、黑素瘤、鳞状细胞癌、胶质母细胞瘤或其组合中的至少一种。在本文所述的任何方面或实施方案中，基于免疫的治疗选自免疫检查点抑制剂(例如抗PD-1抗体)、癌症疫苗和嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗。
在某些实施方案中，本说明书提供了抑制患者中黑素瘤侵润和转移的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量，例如治疗有效量或协同有效量的如本文所述的治疗性组合物或制剂，其中所述组合物有效抑制黑素瘤侵润和转移。
在某些实施方案中，说明书提供了诱导黑素瘤细胞死亡(凋亡)的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量例如治疗有效量或协同有效量的如本文所述的治疗性组合物或制剂，其中所述组合物对于诱导黑素瘤细胞死亡是有效的。
在某些实施方案中，说明书提供了抑制患者体内黑素瘤肿瘤的血液供应的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量例如治疗有效量或协同有效量的如本文所述的治疗性组合物或制剂，其中所述组合物有效抑制黑素瘤肿瘤的血液供应。
在某些实施方案中，说明书提供了治疗ETBR相关癌症(包括ETBR相关性转移性脑癌)的方法，其包括向有需要的受试者鼻内施用有效量(例如治疗有效量或协同有效量)的本文所述的组合物或制剂，包括本文所述的脂质体制剂，其中所述组合物或制剂对治疗ETBR相关性转移性脑癌有效。在某些实施方案中，ETBR相关性转移性脑癌是转移性黑素瘤脑癌，转移性鳞状细胞癌，转移性乳腺癌，胶质母细胞瘤或其组合。
在某些实施方案中，说明书提供了治疗患者的黑素瘤脑转移的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量例如治疗有效量或协同有效量的本文所述的治疗性组合物或制剂，其中所述组合物对于治疗黑素瘤脑转移是有效的。
如本文所用，术语“治疗”、“医治”和“疗法”等是指向可以施用本发明化合物的患者提供有益效果的任何行为，包括治疗任何疾病状态或病症，其通过本发明化合物结合的蛋白质调节。上文阐述了可以使用根据本公开内容的化合物治疗的疾病状态或病症，包括癌症。
在另一个实施方案中，本公开内容涉及治疗有需要的人类患者的通过蛋白质调节的疾病状态或病症的方法，其中所述蛋白质的降解将在该患者中产生治疗效果，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的根据本公开内容的组合物或制剂，任选地与另一种生物活性剂组合。疾病状态或病症可以是由微生物原或其他外源性物质(例如病毒，细菌，真菌，原生动物或其他微生物)引起的疾病，或可以是由导致疾病状态和/或病症的蛋白质过表达和/或表达引起。
术语“疾病状态或病症”用于描述任何疾病状态或病症，其中蛋白质调节异常(即，患者中表达的蛋白质的量升高)并且其中患者中一种或多种蛋白质的降解可能为有需要的患者提供有益的治疗或缓解症状。在某些情况下，疾病状态或病症可被治愈。
术语“生物活性剂”用于描述与本发明化合物不同的试剂，其与本发明化合物组合用作具有生物活性的试剂以帮助实现预期治疗，抑制和/或使用本发明化合物的预防/预防。用于本文的优选的生物活性剂包括那些具有与使用或施用本发明化合物的药理学活性相似的药理活性的活性剂，并且包括例如抗癌剂。
术语“另外的抗癌剂”用于描述可以与根据本发明的化合物组合以治疗癌症的抗癌剂。这些药剂包括例如依维莫司，烟酰胺，trabectedin，abraxane，TLK 286，AV-299，DN-101，帕唑帕尼，GSK690693，RTA 744，ON 0910.Na，AZD 6244(ARRY-142886)，AMN-107，TKI-258，GSK461364，AZD 1152，enzastaurin，vandetanib，ARQ-197，MK-0457，MLN8054，PHA-739358，R-763，AT-9263，FLT-3抑制剂，VEGFR抑制剂，EGFR TK抑制剂，极光激酶抑制剂，PIK-1调节剂，Bcl-2抑制剂，HDAC抑制剂，c-MET抑制剂，PARP抑制剂，Cdk抑制剂，EGFR TK抑制剂，IGFR-TK抑制剂，抗HGF抗体，PI3激酶抑制剂，AKT抑制剂，mTORC1/2抑制剂，JAK/STAT抑制剂，检查点-1或2抑制剂，粘着斑激酶抑制剂，Map激酶激酶(mek)抑制剂，VEGF捕获抗体，培美曲塞，厄洛替尼，达沙替尼，尼罗替尼，decatanib，帕尼单抗，氨柔比星，oregovomab，Lep-etu，诺拉曲塞，azd2171，巴巴布林，ofatumumab，zanolimumab，edotecarin，粉防己碱，鲁替康，tesmilifene，奥利默森，ticilimumab，ipilimumab，棉酚，Bio 111，131-I-TM-601，ALT-110，BIO 140，CC 8490，西仑吉肽，吉马替康，IL13-PE38QQR，INO 1001，IPdR1 KRX-0402，荧光酮，LY317615，neuradiab，vitespan，Rta 744，Sdx 102，talampanel，阿曲生坦，Xr 311，罗米地辛，ADS-100380，舒尼替尼，5-氟尿嘧啶，伏立诺他，依托泊苷，吉西他滨，多柔比星，多柔比星脂质体，5'-脱氧-5-氟尿苷，长春新碱，替莫唑胺，ZK-304709，seliciclib；PD0325901，AZD-6244，卡培他滨，L-谷氨酸，N-[4-[2-(2-氨基-4,7-二氢-4-氧代-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰]-，二钠盐，七水合物，喜树碱，PEG-标记的伊立替康，他莫昔芬，柠檬酸托来米芬，阿那曲唑，依西美坦，来曲唑，DES(己烯雌酚)，雌二醇，雌激素，缀合雌激素，贝伐单抗，IMC-1C11，CHIR-258)；3-[5-(甲基磺酰基哌嗪二甲基)-吲哚基喹诺酮，vatalanib，AG-013736，AVE-0005，醋酸戈舍瑞林，醋酸亮丙瑞林，双羟萘酸曲普瑞林，醋酸甲羟孕酮，己酸羟孕酮，醋酸甲地孕酮，雷洛昔芬，比卡鲁胺，氟他胺，尼鲁米特，醋酸甲地孕酮，CP-724714；TAK-165，HKI-272，埃罗替尼，拉帕尼布，canertinib，ABX-EGF抗体，erbitux，EKB-569，PKI-166，GW-572016，Ionafarnib，BMS-214662，替比法尼；非那雄胺，NVP-LAQ824，辛二酰亚胺异羟肟酸，丙戊酸，曲古霉素A，FK-228，SU11248，索拉非尼，KRN951，氨鲁米特，阿恩沙克林，阿那格雷，L-天冬酰胺酶，卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)，疫苗，阿霉素，博来霉素，布舍瑞林，白消安，卡铂，卡莫司汀，苯丁酸氮芥，顺铂，克拉屈滨，氯膦酸盐，环丙氯地孕酮，阿糖胞苷，达卡巴嗪，更生霉素，柔红霉素，己烯雌酚，表柔比星，氟达拉滨，fludrocortisone，氟甲睾酮，氟他胺，格列卫，吉西他滨，羟基脲，去甲氧基柔红霉素，异环磷酰胺，伊马替尼，亮丙瑞林，左旋咪唑，洛莫司汀，氮芥，美法仑，6-巯基嘌呤，美司钠，甲氨喋呤，丝裂霉素，米托坦，米托蒽醌，尼鲁米特，奥曲肽，奥沙利铂，帕米膦酸盐，喷司他丁，普卡霉素，卟菲尔，丙卡巴肼，雷替曲塞，利妥昔单抗，链佐星，替尼泊苷，沙利度胺，硫鸟嘌呤，噻替派，维甲酸，长春地辛，13-顺式-视黄酸，苯丙氨酸芥末，尿嘧啶芥末，雌莫司汀，六甲蜜胺，氟尿苷，5-脱氧尿苷，阿拉伯糖苷，6-巯基嘌呤，脱氧柯福霉素，钙三醇，valrubicin，光辉霉素，长春碱，长春瑞滨，拓扑替康，razoxin，马立马司他，COL-3，neovastat，BMS-275291，角鲨胺，内皮抑素，SU5416，SU6668，EMD121974，白细胞介素-12，IM862，血管抑制素，vitaxin，屈洛昔芬，idoxyfene，螺内酯，finasteride，cimitidine，trastuzumab，denileukin diftitox，吉非替尼，bortezimib，紫杉醇，无cremophor紫杉醇，多西他赛，埃坡霉素B，BMS-247550，BMS-310705，屈洛昔芬，4-羟基他莫昔芬，哌多昔芬，ERA-923，arzoxifene，氟维司群，acolbifene，lasofoxifene，艾多昔芬，TSE-424，HMR-3339，ZK186619，topotecan，PTK787/ZK222584，VX-745，PD 184352，雷帕霉素，40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素，temsirolimus，AP-23573，RAD001，ABT-578，BC-210，LY294002，LY292223，LY292696，LY293684，LY293646，渥曼青霉素，ZM336372，L-779,450，PEG-非格司亭，达贝泊汀，促红细胞生成素，粒细胞集落刺激因子，唑来膦酸盐，泼尼松，西妥昔单抗，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，组氨瑞林，聚乙二醇化干扰素α-2a，干扰素α-2a，PEG化干扰素α-2b，阿糖胞苷，PEG-L-天冬酰胺酶，来那度胺，吉姆单抗，氢化可的松，白细胞介素-11，右雷佐生，阿仑单抗，全反式维甲酸，酮康唑，白细胞介素-2，甲地孕酮，免疫球蛋白，氮芥，甲基泼尼松龙，ibritgumomab tiuxetan，雄激素，地西他滨，六甲基三聚氰胺，贝沙罗汀，tositumomab，三氧化二砷，可的松，editronate，米托坦，环孢素，脂质体柔红霉素，Edwina-天冬酰胺酶，锶89，casopitant，netupitant，NK-1受体拮抗剂，帕洛诺司琼，阿瑞匹坦，苯海拉明，羟嗪，甲氧氯普胺，劳拉西泮，阿普唑仑，氟哌啶醇，氟哌利多，屈大麻酚，地塞米松，甲泼尼龙，丙氯拉嗪，格拉司琼，昂丹司琼，多拉司琼，托烷司琼，培非司亭，促红细胞生成素，依泊汀α，达贝泊汀α及其混合物。
术语“药学上可接受的盐”在整个说明书中用于在适用的情况下描述本文所述的一种或多种化合物的盐形式，其呈现为增加化合物在患者的胃肠道的胃液中的溶解度，以促进化合物的溶解和生物利用度。药学上可接受的盐包括衍生自药学上可接受的无机或有机碱和酸(如果适用的话)的盐。合适的盐包括衍生自碱金属如钾和钠、碱土金属如钙盐、镁盐和铵盐、以及药学领域众所周知的许多其它酸和碱的那些盐。钠盐和钾盐特别优选作为本发明的磷酸酯的中和盐。
术语“药学上可接受的衍生物”在整个说明书中用于描述任何药学上可接受的前药形式(例如酯，酰胺，其他前药基团)，其在施用至患者时直接或间接提供本发明的化合物或本发明的化合物的活性代谢物。
术语“治疗有效量”是指当施用于需要这种治疗的哺乳动物时足以实现如本文所定义的治疗的量。治疗有效量将根据所治疗的患者和疾病状态、患病的严重程度和施用方式而变化，并且可以由本领域普通技术人员常规确定。
本发明的治疗性组合物包含约1％至约95％的活性成分，单剂量形式的施用优选包含约20％至约90％的活性成分以及非单剂量的施用形式优选包含约5％至约20％的活性成分。单位剂量形式为例如包衣片剂，片剂，安瓿，小瓶，栓剂或胶囊剂。其他形式的施用例如是软膏，乳膏，糊剂，泡沫，酊剂，唇膏剂，滴剂，喷雾剂，分散剂等。实例是含有约0.05g至约1.0g活性成分的胶囊。
活性化合物以足以向患者递送所需适应症的治疗有效量的量包含在药学上可接受的载体或稀释剂中，而不会在所治疗的患者中引起严重的毒性效应。用于所有本文提及的条件的活性化合物的优选剂量为每天约10ng/kg至300mg/kg，优选0.1至100mg/kg，更通常为0.5至约25mg/kg接受者体重/患者/天。在合适的载体中，典型的局部用量范围为0.01-5％wt/wt。化合物以任何合适的单位剂型方便地施用，包括但不限于每单位剂型含有少于1mg，1mg至3000mg，优选5至500mg的活性成分。约25-250mg的口服剂量通常是方便的。优选施用活性成分以达至约0.00001-30mM，优选约0.1-30μM的活性化合物的峰值血浆浓度。
诊断方法
诊断方法提供疾病存在或不存在的指标。如本文所用的“诊断”及类似表达是指基于观察、测试或环境临床或其他评估受试者的状况用于基于的受试者的状况的临床或其他评估至少一个指标，例如疾病、病症或病况的体征或症状的存在鉴定具有疾病、病症或病况的受试者。在某些方面，使用本公开内容的方法的诊断包括结合本文提供的方法观察受试者的疾病、病症或病况的多个指标。
本文使用的“样品”是指从其环境中分离的生物材料(例如来自动物的血液或组织，细胞或来自组织培养物的条件培养基)并且被怀疑含有或已知含有感兴趣的诊断靶标，例如蛋白质，分析物，核酸等。样品也可以是组织或体液(例如血清或血浆)的部分纯化级分。参考样品或对照样品可以是来自不具有疾病或病症的供体的样品，包括来自受试者或来自相同受试者的液体或组织。参考样品或对照样品也可以来自未经处理的供体或未用活性剂处理的细胞培养物(例如，不处理或仅施用载体)。参考或对照样品也可以在细胞或受试者与待测试的药剂或治疗性干预物接触之前或在前瞻性研究开始之前的时间点采集。
另一方面，本说明书提供了用于诊断个体中的ETBR相关癌症的方法，其包括：a)从受试者获得生物样品；b)使样品与能够检测ET-1核酸或多肽的试剂(例如，基于核酸的探针，或抗体或其片段)和/或能够检测ET-3核酸或多肽的试剂(例如，基于核酸的探针或抗体或其片段)接触；c)检测试剂与样品中ET-1和/或ET-3的结合；和d)将与受试者的ET-1和/或ET-3结合的试剂的量与对照进行比较，其中ET-1和/或ET-3的增加指示患有ETBR相关癌症的受试者，以及从而将受试者诊断为患有ETBR相关癌症。在本文所述的任何方面或实施方案中，所述方法可以进一步包括e)施用如本文所述的治疗性组合物/制剂。
在其他方面，本说明书提供了选择用于患有ETBR相关癌症的受试者的适当治疗性治疗的方法，包括以下步骤：a)从受试者获得生物学样品；b)使样品与能够检测ET-1核酸或多肽的试剂(例如，基于核酸的探针，或抗体或其片段)和/或能够检测ET-3核酸或多肽的试剂(例如，基于核酸的探针或抗体或其片段)接触；c)检测试剂与样品中ET-1和/或ET-3的结合；d)将与受试者的ET-1和/或ET-3结合的试剂的量与对照进行比较，其中ET-1和/或ET-3的增加指示患有ETBR相关癌症的受试者，并由此诊断受试者患有ETBR相关癌症；和e)施用如本文所述的治疗性组合物。在某些实施方案中，该方法包括重复步骤a)-d)的步骤，由此确定受试者是否响应治疗。
在其他方面，本说明书提供了监测患有ETBR相关癌症的受试者中的治疗性治疗响应的方法，其包括以下步骤：a)提供诊断患有ETBR相关癌症的受试者；b)施用治疗癌症的治疗剂；c)在治疗性治疗后从受试者获得样品；d)使样品与能够检测ET-1核酸或多肽的试剂和/或能够检测ET-3核酸或多肽的试剂接触；e)检测试剂与样品中ET-1和/或ET-3的结合；和f)将与受试者的ET-1和/或ET-3结合的试剂的量与对照进行比较，从而评价治疗性治疗响应，其中ET-1和/或ET-3的水平升高指示少量或没有治疗响应，并且ET-1和/或ET-3水平降低指示阳性治疗响应。
在某些实施方案中，诊断方法包括施用治疗剂的额外步骤。在某些实施方案中，施用相同量的治疗剂。在另外的实施方案中，施用较高剂量。在其他实施方案中，所述方法包括改变治疗性治疗和/或治疗方案的步骤。在某些实施方案中，施用相同量的治疗剂。在另外的实施方案中，施用较高剂量。在其他实施方案中，所述方法包括改变治疗性治疗和/或治疗方案的步骤。在某些实施方案中，ETBR相关癌症是乳腺癌、黑素瘤、鳞状细胞癌、胶质母细胞瘤或其组合中的至少一种。
一方面，本说明书提供了测定癌细胞对内皮素受体拮抗剂的敏感性的方法。该方法包括：a)提供来自患者的癌症组织样品；b)在特异性结合ET-1的抗体和/或特异性结合ET-3的抗体存在下孵育组织样品；和c)检测与ET-1和/或ET-3结合的抗体的量，其中当ET-1和/或ET-3在癌症中活跃表达时，癌症对内皮素受体拮抗剂治疗敏感。
检测与ET-1和/或ET-3结合的抗体的量可以用与可检测标记缀合的至少一种第二抗体进行。也就是说，第二抗体与可检测标记偶联，以与结合ET-1的抗体、结合ET-3的抗体或结合ET-1的抗体和结合ET-3的抗体结合。此外，c)检测后的另一步骤可包括d)施用有效量的内皮素受体拮抗剂或ETBR信号传导抑制剂(例如半胱天冬酶-8抑制剂)。例如，施用至如本文所述的治疗性组合物/制剂。
另一方面，本说明书提供了测定癌细胞对内皮素受体拮抗剂的敏感性的方法，所述方法包括：提供来自患有癌症的患者的癌细胞的组织样品；将样品固定在福尔马林中，包埋在石蜡中，用切片机切割切片并将切片转移到适用于免疫组织化学的载玻片上；在存在检测ET-1的存在的抗体和/或检测ET-3的存在的抗体(例如抗ET-1抗体和抗ET-3抗体)、与结合ET-1和/或ET-3的抗体结合的至少一种第二抗体的情况下孵育载玻片，所述第二抗体与允许可视化结合的抗体复合物的分子缀合(例如，针对抗ET-1抗体的第二抗体和针对抗ET-3抗体的另外的第二抗体)，由此确定ET-1和/或ET-3在肿瘤中活跃表达，因此表明ET-1和ET-3与内皮素受体的结合的抑制将发挥治疗作用。
另一方面，提供了确定癌细胞对基于免疫的治疗的敏感性的方法，所述方法包括：a)提供来自患有癌症的患者的癌细胞的组织样品；b)在结合ET-1的抗体和/或结合ET-3的抗体的存在下孵育组织样品；和c)检测与ET-1和/或ET-3结合的抗体的量，其中当ET-1和/或ET-3在肿瘤中活跃表达时，因此表明癌症不会响应基于免疫的治疗。结合ET-1和/或ET-3的抗体的量可以用至少一种与可检测标记缀合的第二抗体进行。也就是说，第二抗体与可检测标记偶联，以与结合ET-1的抗体、结合ET-3的抗体或结合ET-1的抗体和结合ET-3的抗体结合。此外，c)的检测后的进一步步骤可以包括d)施用有效量的基于免疫的治疗。
基于免疫的治疗可以选自免疫检查点抑制剂(例如抗PD-1抗体)，癌症疫苗和嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗。
一方面，提供了确定癌细胞对基于免疫的治疗的敏感性的方法。该方法包括：a)提供来自患有癌症的患者的癌细胞的组织样品；b)将样品固定在福尔马林中，c)包埋在石蜡中，d)用切片机切割切片并将切片转移到适用于免疫组织化学的载玻片上；e)在存在检测ET-1的存在的抗体和/或检测ET-3的存在的抗体、与结合ET-1和/或ET-3的抗体结合的至少一种另外的第二抗体的情况下孵育载玻片，所述第二抗体与允许可视化结合的抗体复合物的分子缀合，由此确定ET-1和/或ET-3在肿瘤中活跃表达并因此表明癌症不会响应于基于免疫的治疗。
在以上方面中，核酸或抗体与诊断靶标例如ET-1核酸或蛋白质的结合的检测可以通过本领域公知的任何方法来检测。在实施方案中，检测包括使用报告系统如放射摄影或荧光标记或酶促反应的检测。酶反应可以通过酶，例如荧光素酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶来催化。在某些实施方案中，所述方法包括从样品分离抗体-抗原复合物，例如通过将抗原-抗体复合物结合到固体基质上。在某些实施方案中，抗体-抗原复合物在溶液中形成。在实施方案中，该测定是免疫测定。免疫测定包括但不限于使用诸如以下技术的竞争性和非竞争性测定系统：荧光素酶免疫沉淀系统(LIPS)，BIAcore分析，荧光激活细胞分选仪(FACS)分析，免疫荧光，免疫细胞化学，蛋白质印迹，放射免疫测定，酶联免疫吸附测定(ELISA)，“三明治”免疫测定，免疫沉淀测定，沉淀反应，凝胶扩散沉淀素反应，免疫扩散测定，凝集测定，补体结合测定，免疫放射测定，荧光免疫测定和蛋白A免疫测定。参见Ausubel等人编辑，1994,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley&Sons,Inc.,New York，其通过引用并入本我。
已经使用多种免疫测定法来检测蛋白质，包括免疫荧光测定法，蛋白质印迹法和ELISA法。(Bacon,等人,2003.J Infect Dis187:1187-99；Embers,等人,2007.ClinVaccine Immunol 14:931-6.；Liang,等人,1999.J Immunol 163:5566-73；和Liang,等人,1999.J Clin Microbiol 37:3990-6)。
在某些实施方案中，报告分子是可以直接或间接容易地检测、优选定量检测的多肽。报告多肽通常具有酶活性，荧光素酶活性，碱性磷酸酶活性，β-半乳糖苷酶活性，乙酰转移酶活性等，其中酶催化与底物的反应导致产物(例如光，其可以在特定波长的光下检测到，放射性等)的产生，使得可以在样品中确定报告肽的量，或者通过与对照样品相比作为相对量或作为绝对量。
试剂盒
另一方面，本说明书提供了一种试剂盒，其包含容器和用于执行本文所述的任何方法的试剂，或者包含如本文所述的治疗性组合物及其使用说明的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒包含容器和用于检测作为用内皮素受体拮抗剂治疗的候选者的患者的试剂，其中：所述试剂盒包含对ET-1特异性的抗体和/或对ET-3特异性的抗体；可与ET-1/ET-3抗体结合并与允许检测结合的抗体复合物的分子缀合的第二抗体；和合适的检测系统。
实施例
BQ788抑制黑素瘤生长和转移(图4A和4B)。BQ788是ETBR相关黑素瘤细胞生长的有效抑制剂(IC50为1.2nM，Ki＝17.8nM)。BQ788诱导黑素瘤肿瘤细胞凋亡。小鼠植入1×106个SKMEL28人黑素瘤细胞。建立肿瘤10天直至可触知，然后将120ng(～60μg/kg)BQ788溶于DMSO中，每周I.P.注射3次×6周。然后处死小鼠并收集肺并称重肿瘤。观察到肿瘤重量减少75％。从对照小鼠收获的肺样品(图4A)显示出多种转移，而用BQ788处理的小鼠收获的样品显示肺转移的清除率>95％(图4B)。
A192621抑制小鼠中的黑素瘤脑转移(图5A，5B，5C，5D和5E)。A192621显示4.5nM的IC50和Ki＝8.8nM。A192621使用小鼠黑素瘤模型以60mg/kg/天的剂量施用。(A)A192621增加生存；和(B-C-D-E)缩小脑黑素瘤转移。在该研究中，使用慢病毒载体在黑素瘤细胞系中过度表达ETBR，所述细胞系进而用于在小鼠中植入异种移植物。在该研究中，使用慢病毒载体在黑素瘤细胞系中过度表达ETBR，所述细胞系进而用于在小鼠中植入异种移植物。
BQ788和A192621与SC施用途径组合的低副作用特征将使得对晚期和早期阶段黑素瘤患者的治疗成为可能。
ETBR拮抗剂BQ788与bRAF抑制剂协同治疗小鼠脑黑素瘤异种移植物(图6)。用1×105个用荧光素酶标记的SKMEL28人黑素瘤细胞颅内接种裸鼠。允许肿瘤生长1周，然后基于肿瘤的平均发光将小鼠随机分组(n＝8)。每天用达拉菲尼100mg/Kg PO或达拉菲尼+BQ78810ng鼻内TIW治疗小鼠。对照小鼠用载体处理。在43天的时间内测量肿瘤发光。用BQ788+达拉菲尼联合治疗的小鼠表现出比单独用达拉菲尼治疗的脑黑素瘤异种移植物更大的生长抑制。
BQ788在体内与bRAF抑制剂协同作用(图7)。将A375人黑素瘤细胞(3×106)皮下植入Nu/J裸鼠的后腹侧，并使其生长至150mm3-200mm3，然后随机化并开始治疗。治疗组如下：(1)载体(n＝8)，达拉菲尼每天100mg/kg PO(n＝5)，(2)达拉菲尼+BQ788 600ng IP每周3次(n＝5)。虽然单独的达拉菲尼阻滞肿瘤生长，但在第11天时添加BQ788导致肿瘤收缩至基线以下(p<0.05)。
在同基因小鼠黑素瘤模型中BQ788与抗PD1抗体协同作用(图8)。将C57Bl/6小鼠用2×105个B16F10小鼠黑素瘤细胞接种到后侧。一旦肿瘤可触知，将小鼠随机分为4组(n＝5)并如下处理：(1)载体(10μl DMSO I.P.TIW，100μg同种型对照抗体I.P.TIW)，(2)BQ788(600ng BQ788 I.P.TIW，100μg同种型对照抗体I.P.TIW)，(3)抗PD1(10uL DMSO I.P.TIW，100ug小鼠抗PD1 I.P.TIW)或(4)抗PD1+ENB001(600ng BQ788 I.P.TIW，100ug小鼠抗PD1I.P.TIW))。图中的数据反映了3次剂量的测试对象后的肿瘤生长，并证实了BQ788和抗PD1之间的协同作用。
ETAR拮抗剂和烟酰胺减轻来自BQ788的体重减轻(图9)。在42天的时间内，以指定的递增剂量，在20％DMSO中鼻内施用ETBR拮抗剂BQ788至6周龄无胸腺裸鼠(每组n＝3)。一组另外口服ETAR拮抗剂马西替坦，剂量为每日5mg/kg。这些小鼠的饮用水中补充了浓度为0.3mg/mL的B维生素烟酰胺。到本研究结束时，单独用BQ788处理的动物未能健康生长并且相对于基准体重经历平均体重减轻5％。ETAR拮抗剂马西替坦与烟酰胺补充剂的共同施用减轻了这种体重减轻。在整个研究过程中，由此治疗的动物能够维持体重。ETAR拮抗剂和烟酰胺与ETBR拮抗剂的共同施用减轻了ETBR拮抗剂在用于治疗目的时的不利作用。
肿瘤微环境中的内皮素-1与黑素瘤侵润相关。
组织样品。从Dermatopathology Section,New York University School ofMedicine的存档室中获得福尔马林固定、石蜡包埋的、去识别的黑素细胞痣、原位黑素瘤、侵润性黑素瘤和蓝痣的人组织样本。表1描述了样本。样本没有存档超过2年的时间。与本研究相关的所有协议均获得机构审查委员会的批准。
免疫组织化学。在4μm厚的福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片上用以下抗体进行免疫组织化学(IHC)分析：小鼠抗人ET-1，克隆TR.ET.48.5(Affinity Bioreagents，Golden，Colorado，USA)；小鼠抗人CD68，克隆KP1(Dako，Carpinteria，California，USA)；和小鼠抗人黑素体，克隆HMB45(Ventana Medical Systems，Tucson，Arizona，USA)。使用由正常皮肤、黑素瘤、淋巴结和胸腺组成的3-mm组织宏阵列测定IHC染色条件。首先确定抗原复原要求，然后连续稀释抗体以确定最佳稀释度/浓度。对于双标记IHC染色和天青蓝B复染，我们优化了CD68和HMB45染色至ET-1抗原复原条件，然后使用ET-1-棕色和HMB45/CD68红色顺序标记方案。简言之，切片在二甲苯中脱蜡(换液三次)，通过分级醇(100％乙醇换液三次，95％乙醇换液三次)再水合，并用蒸馏水冲洗。在90％功率的1200W微波炉中在10mmol/l柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中进行热诱导表位复原。ET-1和CD68分别复原10分钟和5分钟。使切片冷却30分钟，然后用蒸馏水冲洗。除非另有说明，使用Ventana缓冲液和检测系统在NEXes平台(Ventana Medical Systems Tucson，Arizona，USA)上进行抗体孵育和检测。应用纯的CD68和黑素体(预稀释)，并在40℃孵育30分钟。ET-1在Dulbecco's PBS(LifeTechnologies Grand Island，New York，USA)中以1:800稀释并在室温下孵育过夜。使用iView生物素化山羊抗小鼠抗体检测所有三种抗体，然后应用链霉亲和素-碱性磷酸酶缀合物。该复合物用萘酚AS-MX磷酸酶和Fast Red复合物显现。载玻片在蒸馏水中洗涤，用苏木精复染，脱水并用永久性培养基固定。切片包括阳性(组织宏阵列)和阴性(PBS替代抗体)对照。使用正常皮肤样本优化染色以确定在对照样本中不产生背景染色的抗体的稀释度。在NEXes平台上依次进行ET-1/CD68和ET-1/黑素体双标记，首先检测过氧化物酶/3,3-二氨基联苯胺酶，随后进行碱性磷酸酶/Fast Red检测。简而言之，如上所述对ET-1和CD68进行抗原复原。过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性。如上所述将ET-1稀释并孵育过夜。用iView生物素化山羊抗小鼠抗体检测ET-1，随后应用链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物。对于被认为是ET-1染色阳性的样本，ET-1阳性巨噬细胞或黑素瘤细胞必须有清晰的焦点。ET-1染色的截止值是在给定人群中存在至少5％的细胞，并考虑到阳性细胞的如下百分比：+1，小于33％但大于5％；+2，大于33％但小于65％；+3，大于66％；和+3＝强；+2＝中等；+1＝弱；0＝无染色。该复合物用3,3二氨基联苯胺显色并用硫酸铜增强。然后如上所述将载玻片充分洗涤并用碱性磷酸酶/Fast Red标记CD68或黑素体。根据Kamino和Tam14的方法(没有改变)进行Azure b的复染。
ET-1，内皮素-1.
表1.组织和特征
统计分析。χ2检验用于检验分类比较中统计显著性的假设，当样本量对于χ2检验过小时，使用Fisher精确检验。使用双侧P值报告关联的统计显著性，P值小于0.05作为显著性的标准。使用优势比(OR)作为关联强度的量度，并以95％置信区间(CI)呈现。用SPSS 22版(SPSS Inc.，Chicago，Illinois，USA)进行统计计算。
抗ET-1抗体表现出对ET-3同种型的非常低的交叉反应性。先前的研究报道在转移性黑素瘤细胞中ET-1表达水平低，但ET异构体ET-315的表达水平升高。由于ET-1和ET-3密切相关，我们通过固定化ET-1和ET-3的斑点印迹分析测定了ET-1抗体的特异性(图10)。抗ET-1抗体仅发现与250ng ET-3有非常弱的交叉反应信号，250ng ET-3是该蛋白质的非常高的非生理学水平，在蛋白质的较低水平下未见交叉反应。因此ET-1抗体对ET-1具有高度特异性。
内皮素-1在黑素细胞和肿瘤微环境中的表达随着黑素瘤肿瘤进展的程度而增加。为了确定ET-1是否在色素性病变的微环境中表达，我们进行了黑素细胞痣和黑素瘤原位病变的IHC筛选。本研究分析了福尔马林固定、石蜡包埋的存档的人体组织样本(表1)。使用红色生色团进行碱性磷酸酶染色以允许区分黑色素(棕色)和ET-1的阳性信号(红色)。在26％的黑素细胞痣中，在病灶周皮肤浸润中检测到ET-1阳性细胞。然而，大多数测试样本没有显示或仅有罕见的ET-1阳性黑素细胞(图10B和10C)。黑素瘤原位病变是浅表性非侵润性黑素瘤。在这些病变中，44％在周皮肤浸润中显示ET-1阳性细胞，22％显示ET-1阳性黑素瘤细胞(图11)。
与黑素细胞痣和黑素瘤原位样本形成鲜明对比，大多数侵润性黑素瘤含有大量肿瘤微环境中ET-1表达阳性的细胞(图12A-12C)。另外，观察到ET-1强阳性的黑素瘤细胞巢。分析的23例侵润性黑素瘤中，74％总体上与肿瘤微环境中的多种ET-1阳性细胞相关。然而，100％的中度至高度色素沉着浸润性黑素瘤与ET-1阳性肿瘤微环境相关，相比之下色素减退沉着性黑素瘤为33％。由此证明了ET-1表达与黑素瘤侵润以及黑素瘤色素产生之间的相关性。ET-1阳性细胞在色素性病变的真皮微环境中的组织学特征表明它们可能是巨噬细胞来源的。因此，我们使用针对CD68(标准巨噬细胞标记物)的抗体进行了样本的IHC分析。用抗ET-1(棕色生色团)和抗CD68(红色生色团；图12D)双重染色与侵润性黑素瘤有关的皮肤浸润。图12中的短蓝色箭头表示单独表达CD68的细胞。这些细胞呈鲜红色/粉红色。图12中的黑色长箭头指示表达ET-1和CD68的细胞。这些细胞具有比单染细胞更深的棕红色调，因为分别存在代表ET-1和CD68表达的棕色和红色染色。这些结果表明肿瘤微环境中的ET-1阳性细胞是巨噬细胞来源的。
ET-1与黑素瘤肿瘤标志物HMB45在侵润性黑素瘤中的共定位。图13代表具有上皮样形态的大ET-1阳性细胞巢的侵润性黑素瘤样本。为了证实这些ET-1阳性细胞确实是黑素瘤细胞，就ET-1和HMB45(一种黑素瘤肿瘤标记物)染色样本，然后用将黑色素颗粒染成绿蓝色的天青蓝复染，以便于解释。如图13A所示，黑素瘤细胞簇内的散在细胞对ET-1(棕色生色团)以及HMB45(红色生色团)呈阳性。单独用天青蓝染色的相同样品显示没有来自黑色素的棕色色素(图13B)。因此，表达ET-1的细胞来源于黑素瘤细胞。
ET-1在转移性黑素瘤和蓝痣中的表达。对黑素瘤转移(图14，代表性图像)进行ET-1表达(红色生色团，图14A)和黑素瘤肿瘤标记HMB45(红色生色团，图14B)的表达染色。高度色素性转移性黑素瘤中，62％在黑素瘤细胞中显示ET-1表达，而色素沉着转移性黑素瘤为28％，再次表明ET-1表达与色素产生之间存在显著相关性。具有表达ET-1的细胞的转移性黑素瘤样本的总体百分比为43％，而侵润性黑素瘤为52％。这个发现的一个可能的原因是大多数被测试的转移样本都是色素减退的(57％)。然而，色素减退黑素瘤的真实发病率约为5％或更低；因此，这些病变在我们的研究中不成比例地呈现。由于ET-1在色素减退黑素瘤中的表达较低，转移性黑素瘤中ET-1表达的真实总发生率可能远高于我们在该研究中观察到的43％。
我们还分析了蓝痣的ET-1表达。蓝痣是黑色素细胞痣的一个特殊子集，其定位于深部真皮层，并被认为代表了在向表皮的胚胎移行过程中被中断的黑色素细胞增殖。18例蓝痣中有16例(89％)在皮肤浸润中含有大量ET-1阳性细胞(图14C-14E)。这些病灶内的ET-1阳性细胞表现出与巨噬细胞和黑素细胞一致的组织病理学特征，并且对CD68表达呈阳性(数据未显示)。如黑素细胞痣所观察到的，在蓝痣中的黑素细胞中未检测到ET-1表达或检测到极少的ET-1表达。
ET-1表达与侵润、色素沉着和黑素瘤进展显著相关。对于统计假设检验，确定每个活检样本的ET-1阳性、侵润性和色素沉着，并将其定义为分类变量，每个有两个类别。将ET-1阳性样本定义为表达ET-1的细胞大于5％，而阴性样本具有5％或更少。非侵润性病变包括原位黑色素细胞痣和黑素瘤，侵润性病变包括侵润性黑素瘤，以及在某些分析中可行的转移性黑素瘤。色素沉着类别是色素减退和色素沉着(包括中度至高度色素沉着)。我们首先确定浸润性样本中观察到的病灶周浸润中ET-1表达的增加是否与非侵润性样本相比具有统计学显著性。28个病灶中的9个(32.1％)非侵润性病变(痣和原位黑素瘤病灶合并)表现出ET-1阳性的病灶周浸润。测试的23例侵润性黑素瘤中有17例(73.9％)表现出ET-1阳性的病灶周浸润。侵润性组的阳性测试比例显著高于无侵润组[P<0.01，OR＝6.0(95％CI 1.8,20.3)]。该分析排除了转移性黑素瘤，因为在许多情况下，由于其质量大，活检仅捕获肿瘤组织并排除外周组织。蓝痣由于其不同的生物起源而被排除在该分析之外。接下来，我们分析了黑素细胞和黑素瘤细胞中ET-1表达的差异，比较侵润性和非侵润性样本。28例非侵润样本中有2例(7.1％)在黑素细胞中显示ET-1表达。相反，91例侵润性样本中有41例(45.1％)在黑素瘤细胞中表达ET-1(侵润性黑素瘤和转移性黑素瘤合并)。侵润组阳性检查比例显著高于非侵润组[P<0.01，OR 10.7(95％CI 2.4,48)]。因此，ET-1表达与侵润性之间的关联具有统计学意义。
接下来检查色素沉着和ET-1表达之间的相关性。这些分析排除了痣和黑素瘤原位病变，因为这些组没有低染色的亚组。中度到高度色素沉着的14例侵润性黑素瘤中14例(100％)在病灶周浸润中显示ET-1表达，而9例色素减退黑素瘤中3例(33％)表现出黑素瘤细胞的ET-1阳性。色素沉着组阳性测试的比例显著高于色素减退组(P<0.01，由于零个ET-1阴性强或中度色素沉着病变，故OR无限大)。就黑素瘤细胞的ET-1表达而言，14例中度至高度色素浸润性黑素瘤中的11例(79％)表现出ET-1阳性黑素瘤细胞。9例色素减退侵润性黑素瘤中的1例(11％)在黑素瘤细胞中表现出ET-1的表达15。阳性检测比例明显高于色素减退组[P<0.01，OR为29(95％CI 2.6,336)]。29例中度至强色素沉着转移性黑素瘤中的18例(62％)在黑素瘤细胞中表现ET-1表达，而39例色素减退转移性黑素瘤中有11例(28％)在黑素瘤细胞中显示ET-1表达。色素沉着组阳性检测比例显著高于色素减退组[P<0.01，OR为4.2(95％CI 1.5,11.6)]。总体而言，我们得出结论：在侵润性黑素瘤和转移性黑素瘤中ET-1表达与色素沉着之间存在统计学显著相关性。
接下来，我们分析了黑素瘤进展期间微环境中ET-1表达的增加是否具有统计学显著性。出于上述原因，从该分析中排除了转移性黑素瘤。在正常痣、黑素瘤原位病变和侵润性黑素瘤中，分别26％、44％和74％在病灶周浸润中表现出ET-1表达。因此，ET-1阳性的浸润细胞比例在疾病进展程度较高的情况下较高，且有统计学意义(P<0.01)。
讨论。这里呈现的数据提供了首次将肿瘤微环境中的ET-1与人类中的黑素瘤进展相关联的体内证据。虽然已有文献证明ET-1刺激黑素细胞和黑素瘤细胞引发已知促进黑素瘤侵润和转移的分子事件，但迄今为止所产生的所有数据均来自体外研究或来自小鼠的研究16,17,18,19,20。体内黑素细胞的微环境可以对其表型产生显著影响，显著改变其体外观察到的结果。本文证实肿瘤微环境中的ET-1表达与黑素瘤进展之间的强关联。在体内，可能的是黑素瘤细胞最初由巨噬细胞衍生的ET-1以旁分泌方式刺激，这会引起ET-1刺激对黑素瘤细胞产生的促侵润反应。这些反应包括E-钙粘蛋白21的下调，黑素瘤细胞粘附分子、CXCL1和CXCL8的上调21，基质金属蛋白酶的活化，SNAI1基因的活化21，和凋亡的抑制21。我们的研究结果进一步表明，高比例的侵润性和转移性黑素瘤细胞表达ET-1，并且因此可能通过ET-1以自分泌方式而不是旁分泌方式刺激。以前的研究也证实了侵润性黑素瘤的内皮素表达，但是该研究集中在黑素瘤细胞中的ET-3表达，并且没有研究肿瘤微环境中ET-1的表达15。我们推测巨噬细胞在肿瘤微环境中的ET-1表达通过由黑素瘤细胞和痣细胞发起的异常细胞因子网络发生。黑素瘤细胞分泌肿瘤坏死因子α(TNFα)，已知它可诱导巨噬细胞分泌ET-122 ,23。痣细胞也分泌TNFα，但水平低于黑素瘤细胞22。这些不同水平的TNFα表达可以解释与浸润性黑素瘤相关的皮肤浸润中观察到的比黑素细胞痣相关的浸润更强有力的ET-1表达。我们进一步推测ET-1在皮肤微环境中的表达可能在黑素瘤从原位到浸润阶段的进展中起关键作用。ET-1是用于黑素瘤细胞和黑素细胞的趋化和促迁移因子18,25。原位黑素瘤病变下面的真皮中巨噬细胞的ET-1表达可引发表皮黑素瘤细胞迁移进入下面的真皮。尽管通过皮肤浸润的ET-1表达可能足以用于局部黑素瘤侵润，但其可能不足以转移至远处部位。我们推测黑素瘤细胞获得内源性ET-1表达可能使他们逃脱真皮并转移到远处，与研究显示转移性黑素瘤患者血浆ET-1水平显著升高26相一致。因此，ET-1可能在黑素瘤中起自分泌生长因子的作用，就像它在各种其他癌症包括卵巢癌、前列腺癌和结肠癌27,28一样。
这些数据还表明，ET-1在蓝痣形成中起着病因学作用。由于ET-1对黑素细胞发挥趋化作用，局部浓度的ET-1分泌性巨噬细胞可以用于隔离真皮中的黑素细胞，导致蓝痣的发展。因为ET-1也是一种有效的黑素生成刺激剂，所以这可以解释蓝痣中以及许多侵润性和转移性黑素瘤中色素的显著沉积29。蓝痣中浸润巨噬细胞和黑素细胞的有力的ET-1表达表明，尽管仅在真皮微环境中的ET-1表达可能足以诱导侵润性表型，但不足以在黑素细胞中诱导恶性表型。然而，由于这些病变中ET-1阳性巨噬细胞的数量惊人，我们推测ET-1在蓝痣形成中起重要作用并有助于维持这些病变的真皮定位。
值得注意的是，尽管蓝痣中的黑素细胞很少以其组成性活性形式表达bRAF，但黑素细胞痣中80％的黑素细胞表达组成性活化的bRAF激酶30,31。如我们的研究所示，黑色素细胞痣的微环境很少表现出ET-1的表达。根据这些观察结果，暗示不表达组成性活化的bRAF的正常黑素细胞暴露于ET-1可能导致真皮定位而无恶变，如蓝痣中所见。然而，如果在微环境中另外暴露于ET-1，则表达组成型活性的bRAF和/或p16黑素瘤易感性基因突变的黑素细胞可能发展为侵润性恶性表型。那些也获得内源性ET-1或ET-3表达的侵润性黑素瘤细胞将显示转移表型。在黑素瘤细胞中观察到的ETB受体的上调几乎肯定是黑素瘤进展的先决条件，而无论bRAF表型如何32,33。在响应于bRAF抑制剂治疗的黑素瘤细胞中观察到的耐药性的快速发展是由于ETB受体的上调21。
数据表明，皮肤微环境中的ET-1表达与黑素瘤侵润强烈相关。然而，其中相关浸润是ET-1阳性的黑色素细胞痣和黑素瘤原位病变是罕见的。由于皮肤微环境中ET-1表达的发生率随着黑素瘤进展的程度而增加，所以真皮ET-1的存在可能是指示痣和黑素瘤原位病变进展至更高级病变的更大可能性的标志物。与这种可能性一致，ET-1阳性黑素瘤细胞在局部浸润性黑素瘤中的存在表现出进展为转移的更大可能性。总体而言，这些新发现暗示内皮素途径是治疗或预防黑素瘤侵润和转移的新靶点。
成年小鼠的重量范围是约10g至约32g(例如，约15g至约27g)。
剂量方案。基于本说明书，如上所述，当使用常规方法共同施用时，可以组合所提供的示例性剂量范围以最大化或优化观察到的协同效应。
治疗方案包括剂量制剂或组合物，其中所包含的每种活性成分(即ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺或半胱天冬酶-8抑制剂中的至少一种)为约100μg至约4000μg。剂量可以是缓释剂量，其中约50μg至约3000μg的每种活性成分是初始爆发剂量，而约50μg至约3000μg的每种活性成分是在2小时期间的持续释放。
例如，本公开内容的制剂或组合物的每种活性成分可以以以下剂量存在于任何剂量制剂(例如初始爆发剂量，缓释剂量等)中：约100μg至约4000μg，约100μg至约3750μg，约100μg至约3500μg，约100μg至约3250μg，约100μg至约3000μg，约100μg至约2750μg，约100μg至约2500μg，约100μg至约2250μg，约100μg至约2000μg，约100μg至约1750μg，约100μg至约1500μg，约100μg至约1250μg，约100μg至约1000μg，约100μg至约750μg，约100μg至约500μg，约250μg至约4000μg，约250μg至约3750μg，约250μg至约3500μg，约250μg至约3250μg，约250μg至约3000μg，约250μg至约2750μg，约250μg至约2500μg，约250μg至约2250μg，约250μg至约2000μg，约250μg至约1750μg，约250μg至约1500μg，约250μg至约1250μg，约250μg至约1000μg，约250μg至约750μg，约250μg至约500μg，约500μg至约4000μg，约500μg至约3750μg，约500μg至约3500μg，约500μg至约3250μg，约500μg至约3000μg，约500μg至约2750μg，约500μg至约2500μg，约500μg至约2250μg，约500μg至约2000μg，约500μg至约1750μg，约500μg至约1500μg，约500μg至约1250μg，约500μg至约1000μg，约500μg至约750μg，约750μg至约4000μg，约750μg至约3750μg，约750μg至约3500μg，约750μg至约3250μg，约750μg至约3000μg，约750μg至约2750μg，约750μg至约2500μg，约750μg至约2250μg，约750μg至约2000μg，约750μg至约1750μg，约750μg至约1500μg，约750μg至约1250μg，约750μg至约1000μg，约1000μg至约4000μg，约1000μg至约3750μg，约1000μg至约3500μg，约1000μg至约3250μg，约1000μg至约3000μg，约1000μg至约2750μg，约1000μg至约2500μg，约1000μg至约2250μg，约1000μg至约2000μg，约1000μg至约1750μg，约1000μg至约1500μg，约1000μg至约1250μg，约1250μg至约4000μg，约1250μg至约3750μg，约1250μg至约3500μg，约1250μg至约3250μg，约1250μg至约3000μg，约1250μg至约2750μg，约1250μg至约2500μg，约1250μg至约2250μg，约1250μg至约2000μg，约1250μg至约1750μg，约1250μg至约1500μg，约1500μg至约4000μg，约1500μg至约3750μg，约1500μg至约3500μg，约1500μg至约3250μg，约1500μg至约3000μg，约1500μg至约2750μg，约1500μg至约2500μg，约1500μg至约2250μg，约1500μg至约2000μg，约1500μg至约1750μg，约1750μg至约4000μg，约1750μg至约3750μg，约1750μg至约3500μg，约1750μg至约3250μg，约1750μg至约3000μg，约1750μg至约2750μg，约1750μg至约2500μg，约1750μg至约2250μg，约1750μg至约2000μg，约2000μg至约4000μg，约2000μg至约3750μg，约2000μg至约3500μg，约2000μg至约3250μg，约2000μg至约3000μg，约2000μg至约2750μg，约2000μg至约2500μg，约2000μg至约2250μg，约2250μg至约4000μg，约2250μg至约3750μg，约2250μg至约3500μg，约2250μg至约3250μg，约2250μg至约3000μg，约2250μg至约2750μg，约2250μg至约2500μg，约2500μg至约4000μg，约2500μg至约3750μg，约2500μg至约3500μg，约2500μg至约3250μg，约2500μg至约3000μg，约2500μg至约2750μg，约2750μg至约4000μg，约2750μg至约3750μg，约2750μg至约3500μg，约2750μg至约3250μg，约2750μg至约3000μg，约3000μg至约4000μg，约3000μg至约3750μg，约3000μg至约3500μg，约3000μg至约3250μg，约3250μg至约4000μg，约3250μg至约3750μg，约3250μg至约3500μg，约3500μg至约4000μg，约3500μg至约3750μg,或约3750μg至约4000μg。
本公开内容的制剂/组合物的每种活性成分可以存在于约0.1mg/mL至约5.0mg/mL的剂量制剂或组合物中(例如，相对于制剂/组合物约0.1mg/mL至约4.5mg/mL，约0.1mg/mL至约4.0mg/mL，约0.1mg/mL至约3.5mg/mL，约0.1mg/mL至约3.0mg/mL，约0.1mg/mL至约2.5mg/mL，约0.1mg/mL至约2.0mg/mL，约0.1mg/mL至约1.5mg/mL，约0.1mg/mL至约1.0mg/mL，约0.1mg/mL至约0.5mg/mL，约0.5mg/mL至约4.5mg/mL，约0.5mg/mL至约4.0mg/mL，约0.5mg/mL至约3.5mg/mL，约0.5mg/mL至约3.0mg/mL，约0.5mg/mL至约2.5mg/mL，约0.5mg/mL至约2.0mg/mL，约0.5mg/mL至约1.5mg/mL，约0.5mg/mL至约1.0mg/mL，约1.0mg/mL至约4.5mg/mL，约1.0mg/mL至约4.0mg/mL，约1.0mg/mL至约3.5mg/mL，约1.0mg/mL至约3.0mg/mL，约1.0mg/mL至约2.5mg/mL，约1.0mg/mL至约2.0mg/mL，约1.0mg/mL至约1.5mg/mL，约1.5mg/mL至约4.5mg/mL，约1.5mg/mL至约4.0mg/mL，约1.5mg/mL至约3.5mg/mL，约1.5mg/mL至约3.0mg/mL，约1.5mg/mL至约2.5mg/mL，约1.5mg/mL至约2.0mg/mL，约2.0mg/mL至约4.5mg/mL，约2.0mg/mL至约4.0mg/mL，约2.0mg/mL至约3.5mg/mL，约2.0mg/mL至约3.0mg/mL，约2.0mg/mL至约2.5mg/mL，约2.5mg/mL至约4.5mg/mL，约2.5mg/mL至约4.0mg/mL，约2.5mg/mL至约3.5mg/mL，约2.5mg/mL至约3.0mg/mL，约3.0mg/mL至约4.5mg/mL，约3.0mg/mL至约4.0mg/mL，约3.0mg/mL至约3.5mg/mL，约3.5mg/mL至约4.5mg/mL，约3.5mg/mL至约4.0mg/mL,或约3.5mg/mL至约4.5mg/mL)。
本公开内容的剂量制剂或组合物可以口服、舌下、肠胃外、鼻内、静脉内、皮内、皮下或局部施用。
本公开内容的示例性制剂。如上所述，本文所述的任何方面或实施方案可以是单组分油相制剂/组合物，其中每种活性成分可以是上述任何剂量或浓度。单组分油相可以是固定油，例如大豆油。例如，制剂或组合物可以包含1mL单组分油中的约0.1mg至约5.0mg的每种活性成分(即，单组分油中约0.5mg/mL、约1mg/mL或约1.5mg/mL的每种活性成分)。单组分油相制剂/组合物可以通过将每种活性成分(例如，约1mg至约50mg的每种活性成分)添加至约10mL的单组分油溶液来制备。
如上所述，本文所述的任何方面或实施方案可以是DMSO制剂/组合物，其中活性成分可以是上述任何剂量或浓度。该制剂/组合物可以包括DMSO溶液，其是约5％至约100％DMSO(例如，约10％至约100％，约20％至约100％，约30％至约100％，约40％至约100％，约50％至约100％，约60％至约100％，约70％至约100％，约80％至约100％，约90％至约100％，约30％至约95％，约45％至约95％，约75％至约95％，约30％至约90％，约45％至约90％，约75％至约90％，约30％至约85％，约45％至约85％,或约75％至约85％)。例如，制剂或组合物可以包含1mL DMSO中的约0.1mg至约5.0mg的每种活性成分(即，在DMSO中约0.5mg/mL，约1mg/mL或约1.5mg/mL的每种活性成分)。DMSO制剂/组合物可以通过将每种活性成分(例如，约1mg至约50mg的每种活性成分)添加至约10mL的DMSO溶液来制备。
本文所述的任何方面或实施方案可以是如上所述的制剂/组合物，其中制剂活性成分可以是上述任何剂量或浓度。例如，所述制剂或组合物可以包含1mL中的约0.1mg至约5.0mg的每种活性成分(即在/>中约0.5mg/mL，约1mg/mL或约1.5mg/mL的每种活性成分)。/>制剂/组合物可以通过将约1mg至约50mg的活性成分添加至约10mL的/>来制备。/>可根据美国专利号7,713,440制备或从Particle/>(Bethlehem，PA 18017-8920)购得。
如上所述，本文所述的任何方面或实施方案可以包括纳米颗粒，其中每种活性成分可以是上述任何剂量或浓度。例如，所述制剂或组合物可以包含约1mL纳米颗粒悬浮液(例如固体脂质纳米颗粒悬浮液)中的约0.1mg至约5.0mg的活性成分。如此，纳米颗粒制剂包含例如纳米颗粒悬浮液中的约0.5mg/mL，约1.0mg/mL或约1.5mg/mL的每种活性成分。纳米颗粒制剂/组合物可以通过将约1mg至约50mg的每种活性成分添加至240mg的脂质相中，并在9.75mL水相中乳化，从而形成约10mL总批量中的固体脂质纳米颗粒悬浮液(约2.5％固体)。纳米颗粒制剂/组合物可包含约2％至约8％(例如5.0％)的巴西棕榈，约0.5％至约3.5％(例如约2.0％)的大豆油，约85.0％至约97.0％(例如约92.0％)的水溶液，约0.5％至约1.5％(例如约1.0％)的聚山梨酯，和约0.1mg/mL至约5.0mg/mL(例如约0.1mg/mL至约5.0mg/mL)的活性成分。
具体实施方案
一方面，提供了治疗性组合物。包括：有效量的ETBR拮抗剂、半胱天冬酶-8抑制剂或其组合中的至少一种；协同有效量的ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺或其组合中的至少一种；和药学上可接受的载体。
在本文所述的任何实施方案或方面中，以下的至少一种：(1)抗PD1抗体是选自以下的至少一种药剂：Nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab或本领域技术人员已知或变得已知的任何其他抗PD1抗体；(2)bRAF抑制剂是选自以下的至少一种药剂：达拉菲尼、索拉非尼、威罗菲尼或本领域技术人员已知或变得已知的任何其他bRAF抑制剂；(3)ETBR拮抗剂是BQ788、BQ-017、A192621、其氘化或氟化类似物或其组合中的至少一种；(4)ETAR拮抗剂是BQ123；或(5)半胱天冬酶-8抑制剂是具有Ac-AAVALLPAVLLAALAPIETD-CHO序列的肽。
在本文所述的任何实施方案或方面中，(1)抗PD1抗体是选自以下的至少一种药剂：Nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab或本领域技术人员已知或变得已知的任何其他抗PD1抗体；(2)bRAF抑制剂是选自以下的至少一种药剂：达拉菲尼、索拉非尼、威罗菲尼或本领域技术人员已知或变得已知的任何其他bRAF抑制剂；(3)ETBR拮抗剂是BQ788、BQ-017、A192621、其氘化或氟化类似物或其组合中的至少一种；(4)ETAR拮抗剂是BQ123；或(5)半胱天冬酶-8抑制剂是具有Ac-AAVALLPAVLLAALAPIETD-CHO序列的肽。
在本文所述的任何实施方案或方面中，(1)抗PD1抗体是选自以下的至少一种药剂：Nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab或本领域技术人员已知或变得已知的任何其他抗PD1抗体；(2)bRAF抑制剂是选自以下的至少一种药剂：达拉菲尼、索拉非尼、威罗菲尼或本领域技术人员已知或变得已知的任何其他bRAF抑制剂；(3)ETBR拮抗剂是BQ788、BQ-017、A192621、其氘化或氟化类似物或其组合中的至少一种；(4)ETAR拮抗剂是BQ123；或(5)半胱天冬酶-8抑制剂是具有Ac-AAVALLPAVLLAALAPIETD-CHO序列的肽。
在本文所述的任何实施方案或方面中，抗PD1抗体是选自Nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab及其组合的至少一种药剂。
在本文所述的任何实施方案或方面中，bRAF抑制剂是选自达拉菲尼、索拉非尼、威罗菲尼和其组合的至少一种药剂。
在本文所述的任何实施方案或方面中，ETBR拮抗剂是BQ788、BQ-017、A192621、其氘化或氟化类似物或其组合中的至少一种。
在本文所述的任何实施方案或方面中，ETAR拮抗剂是BQ123。
在本文所述的任何实施方案或方面中，半胱天冬酶-8抑制剂是具有Ac-AAVALLPAVLLAALAPIETD-CHO序列的肽
在本文所述的任何实施方案或方面中，ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和半胱天冬酶-8抑制剂中的至少一种的剂量是约100μg至约4000μg和/或ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和半胱天冬酶-8抑制剂的至少一种的浓度为组合物的约0.1至约5.0mg/mL。
在本文所述的任何实施方案或方面中，ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和半胱天冬酶-8抑制剂中的至少一种的剂量是约0.1μg至约5000μg。
在本文所述的任何实施方案或方面中，ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和半胱天冬酶-8抑制剂中的至少一种的浓度是组合物的约0.01μg/mL至约1000mg/mL。
在本文所述的任何实施方案或方面中，组合物还包含至少一种选自大豆油，二甲基亚砜(DMSO)，/>和Aegis HydrogelTM的赋形剂。
在本文所述的任何实施方案或方面中，DMSO是约5％至约100％DMSO溶液。
在本文所述的任何实施方案或方面中，药学上可接受的载体选自固体脂质纳米颗粒，脂质体和生物相容性聚合物。
另一方面，提供了一种控释皮下或肌内剂量制剂。所述制剂包含活性成分的均匀分散体，所述活性成分包括：ETBR拮抗剂或半胱天冬酶-8抑制剂或其组合；和在生物相容性递送系统中的协同量的选自ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺或其组合的至少一种另外的药剂，其中在施用ETBR拮抗剂和另外的药剂从制剂缓慢和同时释放到体循环中。
在本文所述的任何实施方案或方面中，其中以下的至少一种：(1)抗PD1抗体是选自以下的至少一种药剂：Nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab或本领域技术人员已知或变得已知的任何其他抗PD1抗体；(2)bRAF抑制剂是选自以下的至少一种药剂：达拉菲尼、索拉非尼、威罗菲尼或本领域技术人员已知或变得已知的任何其他bRAF抑制剂；(3)ETBR拮抗剂是BQ788、BQ-017、A192621、其氘化或氟化类似物或其组合中的至少一种；(4)ETAR拮抗剂是BQ123；或(5)半胱天冬酶-8抑制剂是具有Ac-AAVALLPAVLLAALAPIETD-CHO序列的肽。
在本文所述的任何实施方案或方面中，以下的至少一种：(1)抗PD1抗体是选自以下的至少一种药剂：Nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab或本领域技术人员已知或变得已知的任何其他抗PD1抗体；(2)bRAF抑制剂是选自以下的至少一种药剂：达拉菲尼、索拉非尼、威罗菲尼或本领域技术人员已知或变得已知的任何其他bRAF抑制剂；(3)ETBR拮抗剂是BQ788、BQ-017、A192621、其氘化或氟化类似物或其组合中的至少一种；(4)ETAR拮抗剂是BQ123；或(5)半胱天冬酶-8抑制剂是具有Ac-AAVALLPAVLLAALAPIETD-CHO序列的肽。
在本文所述的任何实施方案或方面中，(1)抗PD1抗体是选自以下的至少一种药剂：Nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab或本领域技术人员已知或变得已知的任何其他抗PD1抗体；(2)bRAF抑制剂是选自以下的至少一种药剂：达拉菲尼、索拉非尼、威罗菲尼或本领域技术人员已知或变得已知的任何其他bRAF抑制剂；(3)ETBR拮抗剂是BQ788、BQ-017、A192621、其氘化或氟化类似物或其组合中的至少一种；(4)ETAR拮抗剂是BQ123；或(5)半胱天冬酶-8抑制剂是具有Ac-AAVALLPAVLLAALAPIETD-CHO序列的肽。
在本文所述的任何实施方案或方面中，(1)抗PD1抗体是选自以下的至少一种药剂：Nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab或本领域技术人员已知或变得已知的任何其他抗PD1抗体；(2)bRAF抑制剂是选自以下的至少一种药剂：达拉菲尼、索拉非尼、威罗菲尼或本领域技术人员已知或变得已知的任何其他bRAF抑制剂；(3)ETBR拮抗剂是BQ788、BQ-017、A192621、其氘化或氟化类似物或其组合中的至少一种；(4)ETAR拮抗剂是BQ123；或(5)半胱天冬酶-8抑制剂是具有Ac-AAVALLPAVLLAALAPIETD-CHO序列的肽。
在本文所述的任何实施方案或方面中，抗PD1抗体是选自Nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab及其组合的至少一种药剂。
在本文所述的任何实施方案或方面中，bRAF抑制剂是选自达拉菲尼、索拉非尼、威罗菲尼和其组合的至少一种药剂。
在本文所述的任何实施方案或方面中，ETBR拮抗剂是BQ788，A192621或其组合中的至少一种。
在本文所述的任何实施方案或方面中，ETAR拮抗剂是BQ123。
在本文所述的任何实施方案或方面中，半胱天冬酶-8抑制剂是具有Ac-AAVALLPAVLLAALAPIETD-CHO序列的肽
在本文所述的任何实施方案或方面中，递送系统选自：(1)选自以下的生物相容性聚合物：聚(丙交酯)，聚(乙交酯)，聚(丙交酯-共-乙交酯)，聚(乳酸)，聚(乙醇酸)，聚(乳酸-共-乙醇酸)，聚己内酯，聚碳酸酯，聚酯酰胺，聚酐，聚氨基酸，聚原酸酯，聚氰基丙烯酸酯，聚对二氧环己酮，聚亚烷基草酸酯，生物可降解的聚氨酯，其共混物和共聚物；(2)选自以下的脂质体制剂：磷脂酰乙醇胺(PE)例如二棕榈酰基PE(DPPE)，部分不饱和的磷脂酰胆碱(PC)例如蛋PC(EPC)或SPC，完全不饱和的PC例如HSPC、PG、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)，部分不饱和的PG，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，胆固醇，DSPE-PEG2000；(3)DMSO溶液；(4)(5)选自以下的固体脂质纳米颗粒制剂：甘油三酯(Compritol 888ATO和Dynasan 112)，巴西棕榈蜡，蜂蜡，鲸蜡醇，乳化蜡，胆固醇，胆固醇丁酸酯和聚乙二醇(PEG)衍生物。
在本文所述的任何实施方案或方面中，递送系统选自：(1)生物相容性聚合物；(2)脂质体制剂；(3)DMSO溶液；(4)和(5)固体脂质纳米颗粒制剂。
在本文所述的任何实施方案或方面中，生物相容性聚合物选自聚(丙交酯)，聚(乙交酯)，聚(丙交酯-共-乙交酯)，聚(乳酸)，聚(乙醇酸)，聚(乳酸-共-乙醇酸)，聚己内酯，聚碳酸酯，聚酯酰胺，聚酐，聚氨基酸，聚原酸酯，聚氰基丙烯酸酯，聚对二氧环己酮，聚亚烷基草酸酯，生物可降解的聚氨酯，其共混物和共聚物。
在本文所述的任何实施方案或方面中，脂质体制剂选自磷脂酰乙醇胺(PE)例如二棕榈酰基PE(DPPE)，部分不饱和的磷脂酰胆碱(PC)例如蛋PC(EPC)或SPC，完全不饱和的PC例如HSPC、PG、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)，部分不饱和的PG，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，胆固醇，DSPE-PEG2000。
在本文所述的任何实施方案或方面中，固体脂质纳米颗粒制剂选自甘油三酯(Compritol 888ATO和Dynasan 112)，巴西棕榈蜡，蜂蜡，鲸蜡醇，乳化蜡，胆固醇，胆固醇丁酸酯和聚乙二醇(PEG)衍生物。
在本文所述的任何实施方案或方面中，DMSO溶液是约5％至约100％DMSO。
在本文所述的任何实施方案或方面中，ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和半胱天冬酶-8抑制剂中的至少一种的剂量是约0.1μg至约5000μg，和/或ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和半胱天冬酶-8抑制剂中的至少一种的浓度是组合物的约0.01μg/mL至约1000mg/mL。
在本文所述的任何实施方案或方面中，ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和半胱天冬酶-8抑制剂中的至少一种的剂量是约0.1μg至约5000μg。
在本文所述的任何实施方案或方面中，ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和半胱天冬酶-8抑制剂中的至少一种的浓度是组合物的约0.01μg/mL至约1000mg/mL。
在本文所述的任何实施方案或方面中，ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和半胱天冬酶-8抑制剂中的至少一种的剂量是约100μg至约4000μg，和/或ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和半胱天冬酶-8抑制剂中的至少一种的浓度是组合物的约0.01μg/mL至约1000mg/mL。
在本文所述的任何实施方案或方面中，ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和半胱天冬酶-8抑制剂中的至少一种的剂量是约100μg至约4000μg。
在本文所述的任何实施方案或方面中，ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和半胱天冬酶-8抑制剂中的至少一种的浓度是组合物的约0.01μg/mL至约1000mg/mL。
在本文所述的任何实施方案或方面中，所述制剂还包含选自和Aegis HydrogelTM的赋形剂。
另一方面，提供了治疗患者癌症的方法。该方法包括向有需要的患者施用本公开内容的组合物。
在本文所述的任何实施方案或方面中，组合物或制剂经鼻内或静脉内或颅内递送。
另一方面，治疗患者癌症的方法包括向有需要的患者施用本公开内容的制剂。
另一方面，提供了本公开内容的组合物或本公开内容的制剂用于在患者中治疗癌症的方法中使用的用途。该用途包括将组合物或制剂施用至有需要的患者。
在本文所述的任何实施方案或方面中，组合物或制剂经鼻内或静脉内或颅内递送。
在又一方面，提供了测定癌细胞对内皮素受体拮抗剂的敏感性的方法。该方法包括：a)提供来自患者的癌症组织样品；b)在特异性结合ET-1的抗体和/或特异性结合ET-3的抗体的存在下孵育组织样品；和c)检测与ET-1和/或ET-3结合的抗体的量，其中当ET-1和/或ET-3在癌症中活跃表达时，癌症对内皮素受体拮抗剂治疗敏感。
在本文所述的任何实施方案或方面中，检测与ET-1和/或ET-3结合的抗体的量用缀合至可检测标记的第二抗体进行。
在本文所述的任何实施方案或方面中，在c)的检测之后，所述方法进一步包括：d)施用有效量的内皮素受体拮抗剂或ETBR信号传导抑制剂中的至少一种(例如半胱天冬酶-8抑制剂)。
在本文所述的任何实施方案或方面中，内皮素受体拮抗剂是选择性ETBR拮抗剂和/或选择性ETAR拮抗剂。
在本文所述的任何实施方案或方面中，内皮素受体拮抗剂是BQ788、BQ-017、BQ788的氘化或氟化类似物、BQ-017的氘化或氟化类似物和/或BQ123。
另一方面，提供了测定癌细胞对内皮素受体拮抗剂的敏感性的方法。该方法包括：a)提供来自患有癌症的患者的癌细胞的组织样品；b)将样品固定在福尔马林中，c)包埋在石蜡中，d)用切片机切割切片并将切片转移到适用于免疫组织化学的载玻片上；e)在存在检测ET-1的存在的抗体和/或检测ET-3的存在的抗体、与结合ET-1和/或ET-3的抗体结合并且与允许结合的抗体复合物可视化的分子缀合的至少一种第二抗体的情况下孵育载玻片，从而确定ET-1和/或ET-3在肿瘤中活跃表达并因此表明ET-1和ET-3与内皮素受体的结合的抑制将发挥治疗作用。
在本文所述的任何实施方案或方面中，内皮素受体拮抗剂是选择性ETBR拮抗剂和/或选择性ETAR拮抗剂。
在本文所述的任何实施方案或方面中，内皮素受体拮抗剂是BQ788、BQ-017、BQ788的氘化或氟化类似物、BQ-017的氘化或氟化类似物和/或BQ123。
一方面，提供了治疗ETBR相关性转移性脑癌的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求1的组合物，其中所述组合物对于治疗或改善ETBR相关性转移性脑癌的症状是有效的。
另一方面，提供了本公开内容的组合物或本公开内容的制剂用于在治疗ETBR相关性转移性脑癌的方法中使用的用途。该用途包括向有需要的受试者施用有效量的组合物或制剂，其中组合物对于治疗或改善ETBR相关性转移性脑癌的症状是有效的。
在本文所述的任何实施方案或方面中，ETBR相关性转移性脑癌是转移性黑素瘤相关的脑癌，转移性鳞状细胞癌相关的脑癌，胶质母细胞瘤或其组合。
在本文所述的任何实施方案或方面中，所述组合物或制剂是鼻内或舌下施用的。
另一方面，提供了治疗ETBR相关性转移性脑癌的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开内容的制剂，其中所述制剂对于治疗或改善ETBR相关性转移性脑癌的症状是有效的。
另一方面，提供了确定癌细胞对基于免疫的治疗的敏感性的方法。该方法包括：a)提供来自患有癌症的患者的癌细胞的组织样品；b)在结合ET-1的抗体和/或结合ET-3的抗体存在下孵育组织样品；和c)检测与ET-1和/或ET-3结合的抗体的量，其中当ET-1和/或ET-3在肿瘤中活跃表达时，因此表明癌症不会响应基于免疫的治疗。
在本文所述的任何实施方案或方面中，检测与ET-1和/或ET-3结合的抗体的量用至少一种缀合至可检测标记的第二抗体进行。
在本文所述的任何实施方案或方面中，在c)的检测后，所述方法还包括d)施用有效量的内皮素受体拮抗剂。
在本文所述的任何实施方案或方面中，基于免疫的治疗选自免疫检查点抑制剂，癌症疫苗和嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗。
在本文所述的任何实施方案或方面中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。
在又一方面，提供了确定癌细胞对基于免疫的治疗的敏感性的方法。该方法包括：a)提供来自患有癌症的患者的癌细胞的组织样品；b)将样品固定在福尔马林中，c)包埋在石蜡中，d)用切片机切割切片并将切片转移到适用于免疫组织化学的载玻片上；e)在存在检测ET-1的存在的抗体和/或检测ET-3的存在的抗体、与结合ET-1和/或ET-3的抗体结合并且与允许结合的抗体复合物可视化的分子缀合的至少一种第二抗体的情况下孵育载玻片，从而确定ET-1和/或ET-3在肿瘤中活跃表达并因此表明癌症不会响应基于免疫的治疗。
在本文所述的任何实施方案或方面中，基于免疫的治疗选自免疫检查点抑制剂，癌症疫苗和嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗。
在本文所述的任何实施方案或方面中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。
本申请通篇引用的所有参考文献、专利、未决专利申请和公开专利的内容在此明确地通过引用并入本文。
本领域技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定本文所述的本发明的具体实施方式的许多等同物。这样的等同物旨在由以下权利要求涵盖。可以理解的是，这里描述的详细示例和实施例仅作为示例给出，并且不被认为是对本发明的限制。对于本领域的技术人员将暗示对其的各种修改或改变，并且被包括在本申请的精神和范围内，并且被认为在所附权利要求的范围内。例如，可以改变成分的相对量以优化所需效果，可以添加附加成分，和/或可以用类似成分代替所述成分中的一种或多种成分。根据所附权利要求，与本发明的系统、方法和过程相关的其他有利特征和功能将变得明显。而且，本领域技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同物。这样的等同物旨在由以下权利要求涵盖。
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Claims (10)

1.治疗性组合物，其包含：
有效量的内皮素B受体(ETBR)拮抗剂、半胱天冬酶-8抑制剂或其组合中的至少一种；
协同有效量的内皮素A受体(ETAR)拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺或其组合中的至少一种；和
药学上可接受的载体。
2.权利要求1的组合物，其中所述抗PD1抗体是选自Nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab及其组合的至少一种药剂。
3.权利要求1或2的组合物，其中所述bRAF抑制剂是选自达拉菲尼、索拉非尼、威罗菲尼和其组合的至少一种药剂。
4.权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述ETBR拮抗剂是BQ788、BQ-017、A192621、其氘化或氟化类似物或其组合中的至少一种。
5.权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述ETAR拮抗剂是BQ123。
6.权利要求1-5中任一项的组合物，其中ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和半胱天冬酶-8抑制剂中的至少一种的剂量是约0.1μg至约5000μg，和/或ETBR拮抗剂、ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺和半胱天冬酶-8抑制剂的至少一种的浓度为组合物的约0.01μg/mL至约1000mg/mL。
7.权利要求1-6中任一项的组合物，其进一步包含选自大豆油、二甲基亚砜(DMSO)、/>和Aegis HydrogelTM的至少一种赋形剂。
8.权利要求1-7中任一项的组合物，其中所述药学上可接受的载体选自固体脂质纳米颗粒、脂质体和生物相容性聚合物。
9.一种控释皮下或肌内剂量制剂，其包含活性成分的均匀分散体，所述活性成分包括：
ETBR拮抗剂、半胱天冬酶-8抑制剂或其组合中的至少一种；和
在生物相容性递送系统中的协同量的选自ETAR拮抗剂、抗PD1抗体、bRAF抑制剂、烟酰胺或其组合的至少一种另外的药剂，
其中在施用后，ETBR拮抗剂和另外的药剂从制剂缓慢和同时释放到体循环中。
10.权利要求9的控释皮下或肌内剂量制剂，其中：
抗PD1抗体是选自Nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab及其组合的至少一种药剂；
bRAF抑制剂是选自达拉菲尼、索拉非尼、威罗菲尼及其组合的至少一种药剂；
ETBR拮抗剂是BQ788、BQ-017、A192621、其氘代或氟化类似物或其组合中的至少一种；
ETAR拮抗剂是BQ123；和
半胱天冬酶-8抑制剂是具有Ac-AAVALLPAVLLAALAPIETD-CHO序列的肽。
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