CN116726106B - 一种组合物在制备降低非感染性心肌炎发生风险产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种组合物在制备预防非感染性心肌炎产品中的应用，所述组合物包括170重量份三七超微粉、75重量份黄芪提取物、55重量份丹参提取物、30重量份的银杏叶提取物、30重量份葛根提取物、20重量份余甘子提取物、20重量份玉竹提取物。本发明的组合物一方面通过同时降低血浆和心脏组织中的炎症水平，另一方面通过抑制心肌细胞凋亡，最终实现有效预防非感染性心肌炎。

Description

一种组合物在制备降低非感染性心肌炎发生风险产品中的 应用

技术领域

本发明属于中药领域，涉及一种组合物在制备降低非感染性心肌炎发生风险产品中的应用。

背景技术

心肌炎是指心肌的局限性或弥漫性的炎性病变为主要表现的疾病，根据已确定的Dallas标准，心肌内浸润的组织学证据为心肌炎性细胞浸润，并伴有邻近的心肌细胞变性和坏死。心肌炎临床表现各异，主要取决于病变的广泛程度和严重程度，可表现为发热、咳嗽、腹泻等症状。心肌炎的已知病因有很多种，按照病因可分为感染性心肌炎和非感染性心肌炎。其中，非感染性心肌炎的致病因素主要包括药物、毒物、放射、结缔组织病、血管炎、巨细胞心肌炎、结节病等。但是，现有技术中大部分产品都是用于预防或治疗感染性心肌炎的，极少是针对非感染性心肌炎的。

鉴于此，开发一种能够有效降低非感染性心肌炎发生风险的产品，成为本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种组合物在制备降低非感染性心肌炎发生风险产品中的应用，本发明采用的技术方案如下：

一种组合物在制备降低非感染性心肌炎发生风险产品中的应用，所述组合物包括170重量份三七超微粉、75重量份黄芪提取物、55重量份丹参提取物、30重量份的银杏叶提取物、30重量份葛根提取物、20重量份余甘子提取物、20重量份玉竹提取物。

进一步的，所述降低非感染性心肌炎发生风险包括降低血浆的炎症水平。

进一步的，所述降低非感染性心肌炎发生风险包括降低血浆的IL-6炎症水平。

进一步的，所述降低非感染性心肌炎发生风险包括降低心脏组织中的炎症水平。

进一步的，所述降低非感染性心肌炎发生风险包括降低心脏组织中IL-1β的炎症水平。

进一步的，所述降低非感染性心肌炎发生风险包括降低心脏组织中Ccl2的炎症水平。

进一步的，所述降低非感染性心肌炎发生风险包括抑制心肌细胞凋亡。

进一步的，所述非感染性心肌炎的致病因素为药物。

进一步的，所述组合物由下述方法制得

步骤一、将所述三七超微粉碎后过筛，得到200~500目的三七超微粉；

步骤二、将所述黄芪、所述丹参、所述银杏叶、所述葛根、所述余甘子、所述玉竹除杂，分别加乙醇浸泡、煎煮提取、过滤、减压浓缩、干燥、粉碎、过筛，得到200~500目的黄芪提取物、丹参提取物、银杏叶提取物、葛根提取物、余甘子提取物、玉竹提取物；其中，煎煮提取时间为1~3小时；

步骤三、按照所述用量将所述三七超微粉、所述黄芪提取物、所述丹参提取物、所述银杏叶提取物、所述葛根提取物、所述余甘子提取物、所述玉竹提取物混合均匀，得到所述组合物。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明的组合物一方面通过同时降低血浆和心脏组织中的炎症水平，另一方面通过抑制心肌细胞凋亡，最终实现有效降低非感染性心肌炎发生风险。

附图说明

图1为本发明实施例1臻通集组小黑鼠给予臻通集组合物时间轴示意图；

图2为本发明实施例1各组小黑鼠血浆中IL-6含量示意图；

图3为本发明实施例1各组小黑鼠心脏组织中IL-1β含量示意图；

图4为本发明实施例1各组小黑鼠心脏组织中Ccl2含量示意图；

图5为本发明实施例1各组小黑鼠心脏组织的HE染色示意图；

图6为本发明实施例1各组小黑鼠心脏组织的Tunel染色示意图。

具体实施方式

下面结合具体附图及实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明的进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明内容对本发明做出的一些非本质的改进和调整仍属本发明的保护范围。

实施例中所用原料均为常规市购原料。实施例所用仪器均为常规市购仪器。

本发明所述组合物及其制备方法在中国专利CN103948791A实施例3中已公开，并在本发明中称为臻通集。本发明所述臻通集来源为常规市售产品，购自石家庄御芝林医药有限公司，生产批号为2200700802，规格为24g(0.4g*60粒) ，为胶囊剂，生产厂家为河北御芝林药业有限公司。

需要说明的是，由于HE染色和Tunel染色示意图在彩色图片下更能观察到心脏组织情况，故申请人将彩色的说明书附图以其他证明文件的形式提交，其与说明书附图完全一致，区别仅在于为彩色图片。

实施例

（一）实验方法

动物实验及取材：取50只C57小黑鼠，随机分为5组，每组10只，分别为空白组、模型组、臻通集低剂量组、臻通集中剂量组、臻通集高剂量组。实验流程参考图1，在实验的第一天开始就给予臻通集组合物，连续给予4天。在实验的第二天开始造模，需要说明的是，本实施例中造模采用的是异丙肾上腺素（后称ISO）。其中，臻通集低剂量组每日灌胃一次臻通集组合物，每次喂食量以小黑鼠体重180mg/kg为准，臻通集中剂量组每日灌胃一次臻通集组合物，每次喂食量以小黑鼠体重360mg/kg为准；臻通集高剂量组每日灌胃一次臻通集组合物，每次喂食量以小黑鼠体重720mg/kg为准；空白组与模型组灌胃给予生理盐水，灌胃量以小黑鼠体重0.1ml/10g为准，连续灌胃4天。在实验第2天，模型组与臻通集各剂量组均通过腹腔注射异丙肾上腺素，连续注射3天，注射量以小黑鼠体重为准，具体为200mg/kg；空白组通过腹腔注射生理盐水，连续注射3天。在实验第5天，各组小黑鼠眼球取血后脱颈处死并摘取心脏组织，心脏组织于4℃冰箱冷藏暂存。

（二）各组小黑鼠血浆中炎症因子检测

检测指标一：血浆炎性因子IL-6的含量

检测方法：

将各组小黑鼠的眼球血离心后取血浆，按照IL-6的ELISA试剂盒操作方法进行检测，检测结果如图2所示。

检测结果：

图2中，Ctrl组为空白组，0组为模型组，180组为臻通集低剂量组，360组为臻通集中剂量组，720组为臻通集高剂量组。分析图2的结果可知，与空白组相比，经ISO造模后，模型组的血浆中IL-6水平明显升高，IL-6作为一种炎症因子，该指标的升高表示模型组的小黑鼠体内出现了炎症状态。与模型组相比，在造模前就开始分别给予低剂量、中剂量和高剂量臻通集的三个组别，其IL-6水平显著降低，且接近于空白组的IL-6水平。由此可知，本发明的组合物能够有效降低小黑鼠的血浆炎症水平，进而降低小黑鼠非感染性心肌炎发生风险。

检测指标二：各组小黑鼠心脏组织中IL-1β、Ccl2的含量检测

检测方法：

前述已提及，心脏于4℃冰箱冷藏暂存。每组小黑鼠均随机取5只心脏，提取心脏中的总RNA，并通过qRT-PCR检测心脏组织中IL-1β、Ccl2的含量。具体检测方法按照试剂盒说明书，包括提取心脏组织中总RNA、合成cDNA、进行qRT-PCR分析。其中，引物序列见表1。将GAPDH作为IL-1β、Ccl2的内参，采用2^-ΔΔCT法计算IL-1β、Ccl2中mRNA的相对表达量。检测结果如图3、图4所示。

表1 GAPDH、IL-1β、Ccl2的引物序列

基因	序列（5’-3’）
		GAPDH	F:CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG
GAPDH	R:GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT
		IL-1β	F:GAACAACAAAAATGCCTCGTGC
IL-1β	R:GACAAACCGCTTTTCCATCTTCT
		Ccl2	R:GACAAACCGCTTTTCCATCTTCT
Ccl2	R:ACATCCCAGGGGTAGAAC

检测结果：

图3和图4中，Ctrl组为空白组，0组为模型组，180组为臻通集低剂量组，360组为臻通集中剂量组，720组为臻通集高剂量组。分析图3和图4的结果可知，与空白组相比，经ISO造模后，模型组小黑鼠心脏组织中IL-1β、Ccl2明显升高。需要说明的是，IL-1β作为一种关键的促炎细胞因子，可以参与多种自身免疫性炎症反应并促进组织细胞的凋亡；CCL2 可促进炎性细胞浸润，能够吸引、激活单核细胞和巨噬细胞，心脏组织中该两项指标的升高表明心脏已经出现明显的炎症。与模型组相比，在造模前就开始分别给予低剂量、中剂量和高剂量臻通集的三个组别，其IL-1β、Ccl2水平显著降低，且接近于空白组的IL-1β、Ccl2水平。由此可知，本发明的组合物能够有效降低小黑鼠的心脏组织炎症水平，进而降低小黑鼠非感染性心肌炎发生风险。

检测指标三：各组小黑鼠心脏组织HE染色检测

检测方法：

步骤一，在检测心脏组织中IL-1β、Ccl2的含量时，每组小黑鼠均随机取5只小黑鼠的心脏，每组均剩余5只小黑鼠的心脏。将剩余的小黑鼠心脏全部取出，在磷酸盐缓冲液(PBS)中清洗，将心脏中残余的血排除；

步骤二，将心脏从PBS中取出，彻底吸干PBS，将心脏从中间位置以水平面切开，放入10％多聚甲醛中固定；

步骤三，取出小鼠心脏，将心脏在中间位置以水平面切开，流水冲4h去除多聚甲醛后，按照75%、85%、90%、95%、100%酒精、二甲苯的顺序依次脱水1h，之后放入新鲜融化的蜡液中，于60℃的烤箱中浸蜡3h，取出并包埋蜡块；

步骤四，将切片机调至4μm/次，切取完整的心脏组织后，将切片转移至载玻片上，于60℃烤片1h后，将载玻片放置拨片收藏盒于常温保存备用，每份组织留存2张片子，用于后续Tunel荧光染色检测；

步骤五，染色过程：常规脱蜡至水后，苏木素染核10min，清水震洗3次，盐酸酒精分化10s，清水震洗3次，伊红染色30s，清水震洗1次，按照封片流程进行封片；

步骤六：置于显微镜下观察小鼠心肌组织病理变化情况，并拍照记录。结果如图5所示。

检测结果：

图5中，Ctrl组为空白组，0组为模型组，180组为臻通集低剂量组，360组为臻通集中剂量组，720组为臻通集高剂量组。分析图5的结果可知，与空白组相比，经ISO造模后，模型组小黑鼠的心脏组织中出现了明显的炎性细胞浸润，具体位置如图5中箭头所示。这意味着心脏炎性细胞的异常增加。与模型组相比，在造模前就开始分别给予低剂量、中剂量和高剂量臻通集的三个组别，其炎性细胞浸润显著减少，且臻通集中剂量组与高剂量组恢复至与空白组较为相近的状态。该结果与前述Ccl2指标趋势相同。由此可知，本发明的组合物能够有效抑制非感染性心肌炎小黑鼠的心脏炎性细胞异常增加，降低其心脏组织炎症水平。

检测指标四：各组小黑鼠心脏组织Tunel荧光染色检测

检测方法：

取检测指标三步骤四中保存的石蜡切片并进行脱蜡处理，加100μL浓度为20μg/ml的蛋白酶K溶液，室温孵育10min，PBS洗5min后固定5min，PBS浸洗5min，加入100μL的平衡缓冲液，室温静置5min；平衡时进行标记，将核苷酸混合物在冰上解冻，配制足量的rTdT孵育缓冲液，每个切片需要50μL。将此孵育缓冲液加到切片组织处，覆盖一个塑料薄膜。切片放在湿盒中于37℃暗处孵育1h（50μL孵育缓冲液：45μL平衡缓冲液+5μL核苷酸混合物+1μLrTdT酶，配好后避光4℃放置）；标记好的切片从37℃中取出，移除塑料薄膜，在柠檬酸钠缓冲液中室温浸泡15min。PBS洗3次，每次5min；封片后利用荧光显微镜观察荧光。紫外光激发DAPI染的细胞核为蓝色，凋亡的细胞被蓝光激发呈现为绿色。切片4℃避光保存。于荧光显微镜下观察小鼠心肌细胞凋亡情况，并拍照记录，结果如图6所示。

检测结果：

图6中，Ctrl组为空白组，0组为模型组，180组为臻通集低剂量组，360组为臻通集中剂量组，720组为臻通集高剂量组。分析图6的结果可知，与空白组相比，经ISO造模后，模型组小黑鼠心肌细胞凋亡明显增加（具体可通过图6中绿色荧光强度反应）。炎症的发生往往与组织坏死有关，高剂量的异丙肾上腺素会造成心脏细胞坏死，进而产生大量炎症因子。与模型组相比，在造模前就开始分别给予低剂量、中剂量和高剂量臻通集的三个组别，其心肌细胞凋亡显著降低，且给予臻通集高剂量的组别，心肌细胞恢复至空白组相近的状态。由此可知，本发明的组合物能够有效抑制非感染性心肌炎小黑鼠的心肌细胞凋亡。

Claims (9)

1.一种组合物在制备降低非感染性心肌炎发生风险产品中的应用，其特征在于：所述组合物由170重量份三七超微粉、75重量份黄芪提取物、55重量份丹参提取物、30重量份的银杏叶提取物、30重量份葛根提取物、20重量份余甘子提取物、20重量份玉竹提取物组成。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述降低非感染性心肌炎发生风险包括降低血浆的炎症水平。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述降低非感染性心肌炎发生风险包括降低血浆的IL-6炎症水平。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述降低非感染性心肌炎发生风险包括降低心脏组织中的炎症水平。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述降低非感染性心肌炎发生风险包括降低心脏组织中IL-1β的炎症水平。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述降低非感染性心肌炎发生风险包括降低心脏组织中Ccl2的炎症水平。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述降低非感染性心肌炎发生风险包括抑制心肌细胞凋亡。

8.根据权利要求1~7任一所述的应用，其特征在于：所述非感染性心肌炎的致病因素为药物。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述组合物由下述方法制得

步骤一、将所述三七粉碎后过筛，得到200~500目的三七超微粉；

步骤二、将所述黄芪、所述丹参、所述银杏叶、所述葛根、所述余甘子、所述玉竹除杂，分别加乙醇浸泡、煎煮提取、过滤、减压浓缩、干燥、粉碎、过筛，得到200~500目的黄芪提取物、丹参提取物、银杏叶提取物、葛根提取物、余甘子提取物、玉竹提取物；其中，煎煮提取时间为1~3小时；

步骤三、按照所述用量将所述三七超微粉、所述黄芪提取物、所述丹参提取物、所述银杏叶提取物、所述葛根提取物、所述余甘子提取物、所述玉竹提取物混合均匀，得到所述组合物。