CN116726023A - 利格列汀在制备冠状病毒药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了利格列汀在制备冠状病毒药物中的应用，利格列汀用于制备冠状病毒预防药物和抑制入侵药物。本发明采用上述成分的利格列汀在制备冠状病毒药物中的应用，将利格列汀应用于制备冠状病毒预防药物和抑制入侵药物，安全、有效地抵抗冠状病毒入侵宿主细胞，且不影响宿主细胞活力。

Description

利格列汀在制备冠状病毒药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药应用技术领域，特别是涉及利格列汀在制备冠状病毒药物中的应用。
背景技术
冠状病毒因病毒包膜上的刺突向四周伸出呈冠状，就像日冕或花冠，因此而得名。冠状病毒在自然界分布很广泛,可以感染人,也可以感染动物。冠状病毒可能会随患者的飞沫、粪便或尿液等进行传播，当他人吸入了含病毒的飞沫，或用手摸了被病毒污染的物品后，再触摸自身黏膜，如揉眼睛、抠鼻孔、摸嘴巴等，就可能感染冠状病毒。病毒侵入人体后可引起上呼吸道感染、腹泻、胃肠炎等疾病。
全世界范围内爆发了由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)所引起的感染(COVID-19)，严重威胁了全球公共健康。瑞德西韦、氯喹等药物曾被寄予厚望，但其临床效果不理想，且会引起出现严重心脏不良事件而终止其用于新冠病毒感染的临床治疗。时至今日，临床上仍无安全、可靠的治疗药物。
随着研究的深入，科学家们发现SARS-CoV-2为包膜病毒，其刺突糖蛋白(Spike,S)主要与宿主细胞受体血管紧张素转化酶2(ACE2)结合，从而入侵宿主细胞，S蛋白主要包括S1和S2两个亚基，分别负责与宿主细胞的吸附与融合。因此，以S和ACE2等为靶点是发现新冠病毒入侵抑制剂的重要策略。
利格列汀(Linagliptin)是一种抗糖尿病药，CAS：668270-12-0，分子结构式为C25H28N8O2，分子质量为472.54，研究发现其具有调节自噬(PMID:32340263)、肝保护(PMID:32726558)、对抗Aβ神经毒性(PMID:34425652)等作用。目前，有一些关于利格列汀用于SARS-CoV-2感染住院糖尿病患者代谢调控(PMID:35017617；PMID:35002970)的报道，还有一篇计算预测药物研究发现利格列汀与SARS-CoV-2的Mpro具有结合抑制潜能(PMID:33430081)的报道，但尚未发现利格列汀抗冠状病毒入侵的实验研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供利格列汀在制备冠状病毒药物中的应用，将利格列汀应用于制备可抗冠状病毒入侵的药物，安全、有效地抵抗冠状病毒入侵宿主细胞，且不影响宿主细胞活力。
为实现上述目的，本发明提供了利格列汀在制备冠状病毒药物中的应用，利格列汀用于制备冠状病毒预防药物和抑制入侵药物。
优选的，所述冠状病毒为人类冠状病毒229E(HCoV-229E)、人类冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、人类冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、人类冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)、中东呼吸综合症冠状病毒(MERS-CoV)、重症急性呼吸综合症冠状病毒(SARS-CoV)、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)中的一种或多种。
优选的，所述新型冠状病毒包括原始株和变异株。
优选的，所述变异株为阿尔法变异株(Alpha)、贝塔变异株(Beta)、伽马变异毒株(Gamma)、德尔塔变异株(Delta)、厄普西隆变异株(Epsilon)、埃塔变异株(Eta)、艾欧塔变异株(lota)、卡帕变异株(Kappa)、奥密克戎变异株(Omicron)、泽塔变异株(Zeta)、缪变异株(Mu)、拉姆达变异株(Lambda)中的一种或多种。
优选的，所述利格列汀的结构式为
优选的，所述利格列汀在药物中的浓度为0.1nM-100μM。
优选的，所述利格列汀在药物中的浓度为1nM-10μM。
优选的，所述药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂、喷剂、滴丸或针剂冻干粉。
因此，本发明采用上述成分的利格列汀在制备冠状病毒药物中的应用，其有益效果为：
1、将利格列汀应用于制备冠状病毒预防药物和抑制入侵药物，安全、有效地抵抗冠状病毒入侵宿主细胞，且不影响宿主细胞活力，由此实现利格列汀在制备抗新型冠状病毒药物中的应用；
2、1nM-10μM浓度利格列汀安全无毒，对宿主细胞活力无影响。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1是利格列汀与新型冠状病毒原始株S蛋白结合示意图；
图2是利格列汀与新型冠状病毒原始株S蛋白结合A处放大图；
图3是利格列汀与新型冠状病毒Omicron株S蛋白结合示意图；
图4是利格列汀与新型冠状病毒Omicron株S蛋白结合B处放大图；
图5是利格列汀与ACE2蛋白结合示意图；
图6是新型冠状假病毒原始株(左)和新型冠状假病毒Omicron株(右)感染率组合图；
图7是利格列汀对宿主细胞细胞活力影响柱状图。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
通过下面的实施例可以更详细的解释本发明，公开本发明的目的旨在保护本发明范围内的一切变化和改进，本发明并不局限于下面的实施例。
实施例1
以新型冠状假病毒原始株S蛋白为靶点进行分子对接
S1、在蛋白质结构数据库(RCSB Protein Data Bank，RCSB PDB)
(https://www.rcsb.org)中下载新型冠状假病毒原始株S蛋白结构(PDB ID：7dzw)。
S2、在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)中下载利格列汀3D格式。
S3、利用Autodock软件对S蛋白模型添加氢原子和电荷，添加原子类型为AD4类型，设置好对接盒子后，进行分子对接。
如图1和图2所示，利用Autodock软件分析了利格列汀与新型冠状假病毒原始株S蛋白的结合情况，包括结合位置、结合能、结合化学键等。分子对接结果显示利格列汀与新型冠状假病毒原始株S蛋白具有较好的结合潜能，对接结果的结合能为-8.2kcal/mol，提示利格列汀与新型冠状假病毒原始株S蛋白具有明显的结合潜能。
实施例2
以新型冠状假病毒Omicron株S蛋白为靶点进行分子对接
S1、在蛋白质结构数据库(RCSB Protein Data Bank，RCSB PDB)
(https://www.rcsb.org)下载新型冠状假病毒Omicron株S蛋白结构(PDB ID：7tgw)。
S2、在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下载利格列汀3D格式。
S3、利用Autodock软件对S蛋白模型添加氢原子和电荷，添加原子类型为AD4类型，设置好对接盒子后，进行分子对接。
如图3和图4所示，利用Autodock软件分析了利格列汀与新型冠状假病毒Omicron株S蛋白的结合情况，包括结合位置、结合能、结合化学键等。分子对接结果显示利格列汀与新型冠状假病毒Omicron株S蛋白具有较好的结合潜能，对接结果的结合能为-8.8kcal/mol，提示利格列汀与新型冠状假病毒Omicron株S蛋白具有明显的结合潜能。
实施例3
以ACE2蛋白为靶点进行分子对接
S1、在蛋白质结构数据库(RCSB Protein Data Bank，RCSB PDB)
(https://www.rcsb.org)下载ACE2蛋白结构(PDB ID：1r42)。
S2、在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下载利格列汀3D格式。
S3、利用Autodock软件对ACE2蛋白模型添加氢原子和电荷，添加原子类型为AD4类型，设置好对接盒子后，进行分子对接。
如图5所示，利用Autodock软件分析了利格列汀与宿主细胞受体ACE2蛋白的结合情况，包括结合位置、结合能、结合化学键等。分子对接结果显示利格列汀与宿主细胞受体ACE2蛋白具有较好的结合潜能，对接结果的结合能为-8.8kcal/mol，提示利格列汀与宿主细胞受体ACE2蛋白具有明显的结合潜能。
实施例4
新型冠状假病毒体系的构建
本假病毒体系基于慢病毒三质粒包装体系，包括目的质粒(pHage-EF1α-Luciferase-BSD)、辅助质粒(pMD2.G)和(R8.74)，将pMD2.G质粒中包膜糖蛋白水疱性口炎病毒(VSV-G)用新冠病毒S蛋白替代，可形成模拟新冠病毒感染的假病毒。
S1、先将原始株、Omicron株S序列密码子优化，再去掉S蛋白尾部19个氨基酸，加上FLAG标签序列，将优化后带有FLAG标签的S片段插入pMD2.G辅助质粒载体，构建pMD2.G-原始S质粒和pMD2.G-Omicron S质粒。
S2、分别将pMD2.G-原始S质粒和pMD2.G-Omicron S质粒与目的质粒和辅助质粒共同转染至HEK293FT细胞，待48小时收集上清液，得到新型冠状假病毒原始株和新型冠状假病毒Omicron株，冻存后备用于感染宿主细胞。
实施例5
检测利格列汀抗新型冠状假病毒原始株入侵能力
S1、将稳定过表达人源ACE2的人类肺癌来源A549细胞以3x103个细胞/孔密度接种于96孔板，贴壁后，每孔孵育溶于DMSO的不同浓度利格列汀作为实验组，利格列汀的浓度范围在1nM-10μM范围内。每个实验组均设置有与实验组使用量相同的DMSO作为对照组，同时设置仅有与实验组使用量相同的DMSO的空白组。
10μM浓度利格列汀药物溶液的DMSO含量为同时设置DMSO对照组和空白组。DMSO对照组是指A549细胞培养于含/>浓度DMSO的培养基，空白组是指无A549细胞，仅有含浓度DMSO的培养基。
S2、12小时后将实验组的培养换为75ul不同浓度利格列汀和75ul实施例4中得到的新型冠状假病毒原始株的混合液，孵育48小时。
S3、使用萤火虫报告基因试剂盒测试萤火虫酶活性，在波长560nm处检测吸光度OD值，DMSO对照和每个药物浓度均有6个重复，并按照下述公式计算新型冠状假病毒原始株入侵宿主细胞的感染率。
感染率＝(利格列汀实验组OD值-空白组OD值)/(DMSO对照组OD值-空白组OD值)*100％。
如图6(左)所示，利格列汀在1nM-10μM范围内对新型冠状假病毒原始株入侵具有明显抑制作用，且有浓度依赖性。
1nM利格列汀可有效抑制17.59％新型冠状假病毒原始株的入侵；10nM利格列汀可有效抑制15.23％新型冠状假病毒原始株的入侵；100nM利格列汀可有效抑制28.56％新型冠状假病毒原始株的入侵；1μM利格列汀可有效抑制34.07％新型冠状假病毒原始株的入侵；10μM浓度利格列汀可有效抑制52.13％新型冠状假病毒原始株的入侵。
实施例6
检测利格列汀抗新型冠状假病毒Omicron株入侵能力
S1、将稳定过表达人源ACE2的人类肺癌来源A549细胞以3x103个细胞/孔密度接种于96孔板，贴壁后，每孔孵育溶于DMSO的不同浓度利格列汀作为实验组，利格列汀的浓度范围在1nM-10μM范围内。每个实验组均设置有与实验组使用量相同的DMSO作为对照组，同时设置仅有与实验组使用量相同的DMSO的空白组。
10μM浓度利格列汀药物溶液的DMSO含量为同时设置DMSO对照组和空白组。DMSO对照组是指A549细胞培养于含/>浓度DMSO的培养基，空白组是指无A549细胞，仅有含浓度DMSO的培养基。
S2、12小时后将实验组的培养换为75ul不同浓度利格列汀和75ul实施例4中得到的新型冠状假病毒Omicron株的混合液，孵育48小时。
S3、使用萤火虫报告基因试剂盒测试萤火虫酶活性，在波长560nm处检测吸光度OD值，DMSO对照和每个药物浓度均有4个重复，并按照下述公式计算新型冠状假病毒入侵宿主细胞的感染率。
感染率＝(利格列汀实验组OD值-空白组OD值)/(DMSO对照组OD值-空白组OD值)*100％。
如图6(右)所示，利格列汀在1nM-10μM范围内对新型冠状假病毒Omicron株入侵具有明显抑制作用，且有浓度依赖性。
1nM利格列汀可有效抑制14.98％新型冠状假病毒Omicron株的入侵；10nM利格列汀可有效抑制22.78％新型冠状假病毒Omicron株的入侵；100nM利格列汀可有效抑制29.73％新型冠状假病毒Omicron株的入侵；1μM利格列汀可有效抑制42.23％新型冠状假病毒Omicron株的入侵；10μM浓度利格列汀可有效抑制65.80％新型冠状假病毒Omicron株的入侵。
实施例7
MTT方法检测利格列汀对宿主细胞活力的影响
S1、将稳定过表达人源ACE2的人类肺癌来源A549细胞以3x103个细胞/孔密度接种于96孔板，在细胞培养箱内培养12小时。将培养基换为含有不同浓度溶于DMSO的利格列汀的培养基，利格列汀的浓度范围在1nM-10μM范围内。每个实验组均设置有与实验组使用量相同的DMSO作为对照组，并设置仅有与实验组使用量相同的DMSO的空白组，继续孵育72小时，DMSO对照组和实验组在每个药物浓度均有6个重复。
10μM浓度利格列汀药物溶液的DMSO含量为同时设置DMSO对照组和空白组。DMSO对照组是指A549细胞培养于含/>浓度DMSO的培养基，空白组是指无A549细胞，仅有含浓度DMSO的培养基。
S2、再向每孔加入20ul MTT溶液(5mg/ml)，继续培养4小时，吸走含有MTT溶液的培养基，加入100ul DMSO溶液，振荡15分钟，在酶标仪波长490nm处检测吸光度。并按照下述公式计算利格列汀对宿主细胞活力的影响。
细胞活力百分率＝(利格列汀实验组OD值-空白组OD值)/(DMSO对照组OD值-空白组OD值)*100％。
如图7所示，利格列汀在1nM-10μM范围内对宿主细胞活力均无影响，说明1nM-10μM有效浓度内，利格列汀无毒，不影响宿主细胞的生长。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.利格列汀在制备冠状病毒药物中的应用，其特征在于：利格列汀用于制备冠状病毒预防药物和抑制入侵药物。
2.根据权利要求1所述的利格列汀在制备冠状病毒药物中的应用，其特征在于：所述冠状病毒为人类冠状病毒229E、人类冠状病毒NL63、人类冠状病毒OC43、人类冠状病毒HKU1、中东呼吸综合症冠状病毒、重症急性呼吸综合症冠状病毒、新型冠状病毒中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的利格列汀在制备冠状病毒药物中的应用，其特征在于：所述新型冠状病毒包括原始株和变异株。
4.根据权利要求3所述的利格列汀在制备冠状病毒药物中的应用，其特征在于：所述变异株为阿尔法变异株、贝塔变异株、伽马变异毒株、德尔塔变异株、厄普西隆变异株、埃塔变异株、艾欧塔变异株、卡帕变异株、奥密克戎变异株、泽塔变异株、缪变异株、拉姆达变异株中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的利格列汀在制备冠状病毒药物中的应用，其特征在于：所述利格列汀的结构式为
6.根据权利要求1所述的利格列汀在制备冠状病毒药物中的应用，其特征在于：所述利格列汀在药物中的浓度为0.1nM-100μM。
7.根据权利要求6所述的利格列汀在制备冠状病毒药物中的应用，其特征在于：所述利格列汀在药物中的浓度为1nM-10μM。
8.根据权利要求1所述的利格列汀在制备冠状病毒药物中的应用，其特征在于：所述药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂、喷剂、滴丸或针剂冻干粉。
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