CN116712560B - 一种纳米激动剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种纳米激动剂及其制备方法和应用，属于纳米生物医药领域。本申请纳米激动剂由可变形多肽进行自组装形成，可变形多肽含有依次偶联的靶向抗菌肽、功能化自组装肽、FcγR识别肽和脂肪酶响应性疏水分子，其中，功能化自组装肽能够在二次自组装中控制FcγR识别肽朝着目标病原体的表面翻转，目标病原体为被靶向抗菌肽靶向结合的病原体。本申请纳米激动剂将二次自组装中能够引导的FcγR识别肽的外翻与FcγR介导的内吞相结合，首次开发出一种兼顾病原体清除和宿主免疫功能修复的纳米激动剂，用于体内同时实现入侵病原菌的清除和受损免疫功能的修复，有望实现针对脓毒症及其继发感染的有效治疗。

Description

一种纳米激动剂及其制备方法和应用
技术领域
本申请属于纳米生物医药技术领域，尤其涉及一种纳米激动剂及其制备方法和应用。
背景技术
脓毒症具有双相病症，临床表现分为初期的炎症反应和继发的长期免疫抑制。其中，抗炎疗法可以缓解脓毒症初期的炎症反应，但随着血液培养阳性频率的增加和机会性微生物感染的发生，使得脓毒症患者体内免疫抑制和感染并发症越发凸显，感染机会性病原菌和再激活病毒的几率提高，从而极大增加患者发生继发感染的风险和死亡率。因此，修复免疫抑制阶段受损的免疫功能对脓毒症的治疗至关重要。
巨噬细胞功能受损作为造成脓毒症患者免疫功能受损和继发感染的原因之一，可以在脓毒症后期导致巨噬细胞分泌促炎因子的能力下降以及分泌抗炎因子的能力增加，使得巨噬细胞表面人白细胞抗原-DA表达降低并伴随抗菌能力受损，造成宿主免疫功能紊乱，增加患者发生继发感染的几率。目前，相关技术中可以通过过继性巨噬细胞疗法治疗经多种耐药细菌感染引起的伴随免疫抑制的脓毒症。然而，外源构建功能巨噬细胞的过程复杂且无法修复患者体内受损巨噬细胞的功能。同时，基于有机金属框架的溶酶体靶向疗法可通过释放钙和锌离子，提升杀伤藏身在巨噬细胞中的细菌，从而改善因脓毒症造成的巨噬细胞抗菌能力损伤，然而无法及时有效应对继发感染。
因此，现有单一疗法不能同时实现入侵病原菌的清除和受损免疫功能的修复，极大限制临床治疗脓毒症以及继发感染的治疗效果。
发明内容
本申请公开一种纳米激动剂及其制备方法和应用，旨在解决现有技术下治疗脓毒症以及继发感染时无法同时清除入侵病原菌和修复受损免疫功能的技术问题。
为了实现上述目的，本申请的技术方案是：
本申请的第一方面提供一种纳米激动剂。制备本申请纳米激动剂的原料含有可变形多肽；
所述可变形多肽含有依次偶联的靶向抗菌肽、功能化自组装肽、FcγR识别肽和脂肪酶响应性疏水分子，其中，所述功能化自组装肽能够在二次自组装中控制所述FcγR识别肽朝着目标病原体的表面翻转，所述目标病原体被所述靶向抗菌肽靶向结合。
结合第一方面优选地，所述靶向抗菌肽用于靶向结合革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌。
结合第一方面优选地，所述靶向抗菌肽为UBI29-41、靶向抗菌肽I序列、靶向抗菌肽II序列中的一个；
其中，所述靶向抗菌肽I序列为SEQ ID NO.1所示；所述靶向抗菌肽II序列为SEQID NO.2所示。
结合第一方面优选地，所述FcγR识别肽含有tuftsin。
结合第一方面优选地，所述功能化自组装肽的序列为SEQ ID NO.3所示。
结合第一方面优选地，所述脂肪酶响应性疏水分子为胆固醇琥珀酸单酯、马来酸单十八酯中一个。
结合第一方面优选地，所述可变形多肽具备式[i]所示的化学结构：
结合第一方面优选地，所述纳米激动剂为粒径分布在30-60nm的球形纳米颗粒。
本申请的第二方面提供第一方面所述纳米激动剂的制备方法，所述方法包括：
合成所述可变形多肽；
使所述可变形多肽溶解于有机溶剂中，形成多肽储备液；
将所述多肽储备液加入纯水中，进行自组装，即得所述纳米激动剂。
本申请的第三方面提供第一方面所述纳米激动剂在制备治疗对脓毒症及其继发感染病症的药物中的应用。
与现有技术相比，本申请的优点或有益效果至少包括：
本申请将二次自组装中引导的FcγR识别肽的外翻与FcγR介导的内吞相结合，首次开发出一种兼顾病原体控制和宿主免疫功能修复的可变形多肽基纳米激动剂，用于体内可同时实现入侵病原菌的清除和受损免疫功能的修复，从而为脓毒症的有效治疗提供一种基于可变形多肽纳米技术的全新策略。其中，本申请纳米激动剂通过由靶向抗菌肽、功能化自组装肽、FcγR识别肽和脂肪酶响应性疏水分子依次偶联形成的可变形多肽自组装形成，一方面使得纳米激动剂具备靶向结合病原菌的能力，从而能够有效将纳米激动剂富集于感染组织中并结合病原菌，实现病原菌的高效捕获、有效抑制以及感染微环境响应；另一方面可以基于纳米激动剂分子中的亲疏水作用力和非共价作用力控制二次组装行为和形态，使得FcγR识别肽能够外翻至病原菌表面并与巨噬细胞表面的FcγR结合，从而极大促进巨噬细胞对病原菌-多肽复合物的摄取和促进巨噬细胞向M1方向极化，最终实现针对脓毒症及其继发感染的高效治疗；第三方面，本申请纳米激动剂以人源性肽分子为材料设计并构建，具有较好的生物安全性，临床应用潜力大。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的TP的分子结构；
图2为本申请实施例提供的TP-C1的分子结构；
图3为本申请实施例提供的TP-C2的分子结构；
图4为本申请实施例提供的TP-C3的分子结构；
图5为本申请实施例提供的TP-C4的分子结构；
图6为本申请实施例提供的TP的MALDI-TOF-MS表征图；
图7为本申请实施例提供的BactTPNa的透射电镜图；
图8为本申请实施例提供的BactTPNa的粒径分布图；
图9为本申请实施例提供的BactTPNa+lipase共孵育后的MALDI-TOF-MS表征图；
图10为本申请实施例提供的BactTPNa-C2+lipase共孵育后的MALDI-TOF-MS表征图；
图11A为本申请实施例提供的S.aureus/P.aeruginosa分别与PBS、BactTPNa和BactTPNa-C1共孵育之后的扫面电镜图；图11B为本申请实施例提供的S.aureus/P.aeruginosa分别与PBS、BactTPNa和BactTPNa-C1共孵育之后的透射电镜图；
图12为本申请实施例提供的PBS、BactTPNa和BactTPNa-C1抑制S.aureus/P.aeruginosa生长的实验结果图，其中，12A为经PBS、BactTPNa-C1和BactTPNa处理S.aureus/P.aeruginosa后得到的细菌菌落数图；图12B为图12A中对应细菌菌落数的数据统计；
图13为本申请实施例提供的巨噬细胞摄取细菌-多肽复合物的实验结果图；
图14为本申请实施例提供的BactTPNa促进巨噬细胞重极化的结果图；
图15为本申请实施例提供的BactTPNa和BactTPNa-C1在伴有肺部感染的脓毒症小鼠主要脏器中的分布情况，其中，图15A为BactTPNa和BactTPNa-C1在主要脏器中的分布；图15B为图15A对应脏器的平均荧光强度统计。
图16为本申请实施例提供的BactTPNa治疗伴有肺部感染的脓毒症小鼠的实验结果图，其中，图16A为经不同材料处理后伴有肺部感染的脓毒症小鼠的生存曲线检测结果；图16B为经不同材料处理后伴有肺部感染的脓毒症小鼠肺部的细菌载荷统计结果；图16C为经不同材料处理后伴有肺部感染的脓毒症小鼠肺部F4/80+CD80+CD86+巨噬细胞的占比；图16D为经不同材料处理后伴有肺部感染的脓毒症小鼠肺部F4/80+CD206+巨噬细胞的占比；图16E为经不同材料处理后伴有肺部感染的脓毒症小鼠肺部CD45+CD3+CD4+T细胞的占比，图16F为经不同材料处理后伴有肺部感染的脓毒症小鼠肺部CD45+CD3+CD8+T细胞的占比；图16G为经不同材料处理后伴有肺部感染的脓毒症小鼠肺部TNF-α的含量检测；图16H为经不同材料处理后伴有肺部感染的脓毒症小鼠肺部IL-10的含量检测，图16I为经不同材料处理后伴有肺部感染的脓毒症小鼠胸腺淋巴细胞的凋亡占比；图16J为经不同材料处理后伴有肺部感染的脓毒症小鼠外周血中CD115+CD11b+MHC-Ⅱ+单核细胞的比例。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
在本实施例以下描述中，术语“和/或”用于描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，单独存在B和同时存在A和B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
在本实施例以下描述中，术语“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a，b或c中的至少一项(个)”，或，“a，b和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a，b，c，a-b(即a和b)，a-c，b-c，或a-b-c，其中a，b，c分别可以是单个，也可以是多个。
本领域技术人员应当理解，本申请实施例以下描述中，序号的先后并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
需要说明的是，本申请实施例以下描述中，没有特别指明时，所涉及的技术手段均为本领域已知的常规手段；使用的材料、试剂等均按照本领域的一般含义理解，并可以从商业途径得到；所涉及的各类序列均按照相应的氨基酸序列信息委托合成。
第一方面，本申请实施例提供一种纳米激动剂。制备纳米激动剂的原料含有可变形多肽，所述可变形多肽含有依次偶联的靶向抗菌肽、功能化自组装肽、FcγR识别肽和脂肪酶响应性疏水分子，其中，所述功能化自组装肽能够在二次自组装过程中控制所述FcγR识别肽朝着目标病原体的表面翻转，所述目标病原体被所述靶向抗菌肽靶向结合。
本领域应当理解，所述靶向抗菌肽的主要用于结合病原菌的靶头，既可以为能够结合病原菌表面特定蛋白的抗菌肽，也可以为能够通过静电作用结合于病原菌表面的抗菌肽。其中，本申请实施例的靶向抗菌肽优选为UBI29-41、靶向抗菌肽I序列、靶向抗菌肽II序列中的一个；所述靶向抗菌肽I序列为SEQ ID NO.1所示；所述靶向抗菌肽II序列为SEQ IDNO.2所示。另外，所述UBI29-41的序列为本领域公知的氨基酸序列，本申请实施例不作具体阐述。
需要说明的是，所述病原菌为引发脓毒症与其继发感染的常见细菌，具体为革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌的一种或几种。其中，革兰氏阴性菌可以为铜绿假单胞菌、大肠杆菌等；革兰氏阳性菌可以为金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等。
本领域应当理解，所述FcγR识别肽的主要作用是识别FcγR，从而促使纳米激动剂与巨噬细胞表面的FcγR结合，增强巨噬细胞对病原菌-多肽复合物的摄取能力。其中，本申请实施例的FcγR识别肽优选为tuftsin，所述tuftsin的序列为本领域公知的氨基酸序列，本申请实施例不作具体阐述。
需要说明的是，tuftsin为免疫球蛋白G的Fc段在脾脏降解产生，具有天然的促吞噬功能和免疫刺激活性，可以通过与巨噬细胞表面的FcγR结合刺激吞噬和趋化，不仅明显增强巨噬细胞对病原微生物的吞噬，而且促进炎性细胞因子的释放和体内再分布。
本领域应当理解，所述功能化自组装肽的主要作用是连接所述靶向抗菌肽与所述FcγR识别肽形成多肽段，并为含有该多肽段的二次自组装以及引导所述FcγR识别肽发生外翻提供动力，从而使得FcγR识别肽向外翻转至目标病原菌的表面。其中，本申请实施例的功能化自组装肽的序列为SEQ ID NO.3所示。
需要说明的是，SEQ ID NO.3所示的序列具体为β-淀粉样蛋白衍生的KLVFF肽的逆序列，可通过自身的氢键相互作用自组装形成β-折叠结构。
本领域应当理解，所述脂肪酶响应性疏水分子的主要作用是为可变形多肽的组装提供疏水核心，并为纳米激动剂提供细菌脂肪酶响应性。其中，本申请实施例的脂肪酶响应性疏水分子优选为胆固醇琥珀酸单酯、马来酸单十八酯中一个，胆固醇琥珀酸单酯和马来酸单十八酯均含有一个脂键，可以在细菌脂肪酶作用下发生断裂，从而实现纳米激动剂的细菌脂肪酶响应。
本申请实施例深入了解严重脓毒症和/或继发感染的发病机制时，发现继发感染的临床治疗中普遍面临难以通过单一疗法同时清除病原菌和修复宿主受损免疫功能的问题。为解决该问题，本申请实施例将纳米技术与生物免疫技术相结合之后制备出一种可变形的纳米激动剂。其中，基于所述纳米激动剂通过靶向抗菌肽、功能化自组装肽、FcγR识别肽和脂肪酶响应性疏水分子依次偶联成的可变形多肽自组装形成，从而使得本申请实施例的纳米激动剂具备以下特征与优点：
1)本申请实施例的纳米激动剂具备靶向结合病原菌的能力，能够有效使该纳米激动剂富集于感染组织并结合包裹病原菌，实现病原菌的高效捕获、有效抑制以及感染微环境响应；
2)本申请实施例的纳米激动剂同时具备亲疏水作用力和非共价作用力，从而可以基于亲疏水作用力和非共价作用力有效控制纳米激动剂的组装行为和形态(具体实施例中，纳米激动剂可以在感染部位高浓度的细菌脂肪酶酶切作用下脱去疏水核心，并借助功能化自组装肽的二次组装作用使纳米激动剂内部的tuftsin单元外翻向病原菌表面)，使得FcγR识别肽能够外翻向病原菌表面并与巨噬细胞表面的FcγR有效结合，极大促进巨噬细胞对病原菌-多肽复合物的摄取并促进巨噬细胞向M1方向极化；
3)基于所述FcγR识别肽与巨噬细胞表面FcγR的相互作用，能够使得本申请实施例的纳米激动剂具备促进巨噬细胞吞噬和向M1方向极化的能力，从而可以实现宿主免疫功能修复，使得本申请实施例的纳米激动剂同时具备清除病原菌与修复宿主免疫功能的双重效果，可用于制备治疗脓毒症及其继发感染的药物；
4)本申请纳米激动剂以人源性肽分子为材料设计并构建，具有较好的生物安全性，临床应用潜力大且临床转化应用效果好。
基于上文所述可变形多肽的优选组成以及具体的氨基酸序列。因此，所述可变形多肽具备式[i]所示的化学结构：
在一些具体实施例中，本申请制备的纳米激动剂为粒径分布在30-60nm的球形纳米颗粒，具有单分散性。其中，一般状态下，所述靶向抗菌肽位于球形纳米颗粒的外部，所述FcγR识别肽位于球形纳米颗粒的内部。同时，具体粒径可以为30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm或60nm等，本申请实施例对此不作特别的限制。
第二方面，本申请实施例提供所述纳米激动剂的制备方法，所述方法包括步骤S10-S30：
S10：合成所述可变形多肽；
S20：使所述可变形多肽溶解于有机溶剂中，形成多肽储备液；
S30：将所述多肽储备液加入纯水中，进行自组装，即得所述纳米激动剂。
其中，本申请实施例合成所述可变形多肽优选通过本领域已知的固相合成法进行合成，具体的合成方法为S101-S111：
S101：将载有第一个带保护基团的氨基酸的Wang树脂浸入DMF浸泡溶胀；
S102：将溶胀的Wang树脂浸入脱保护剂进行脱保护，并在脱除保护基团FMOC之后，DCM和DMF交替清洗Wang树脂，得到Wang树脂偶联I，茚三酮法检测证明脱保护成功，其中，脱保护剂由DMF、哌嗪、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)和甲酸按质量比为92：5：2：1混合成；
S103：使用偶联剂溶解缩合剂(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，HBTU)和氨基酸，所得混合液加入Wang树脂偶联I中反应，得到Wang树脂偶联II，茚三酮法检测证明下一个氨基酸偶联成功；
S104：根据S102-S103的操作偶联至最后一个氨基酸，得到Wang树脂偶联III；
S105：将Wang树脂偶联III浸入水合肼溶液进行脱保护，并在脱除保护基团Dde之后，加入含有HBTU和脂肪酶响应性疏水分子的偶联剂溶液，反应12-24h，得到Wang树脂偶联IV；
S106：将Wang树脂偶联IV浸入脱保护剂进行脱保护，并在脱除保护基团FMOC之后，DCM和DMF交替清洗Wang树脂偶联IV，得到Wang树脂偶联V；
S107：甲醇淋洗Wang树脂偶联V之后，抽干备用；
S108：将备用的Wang树脂偶联V浸入裂解液进行裂解之后，收集溶液并脱除溶剂，所得产物依次经冰乙醚清洗和真空干燥，即得可变形多肽，于4℃冰箱保存，其中，裂解液是由三氟乙酸、水和三异丙基硅烷按体积比为95：2.5：2.5混合成。
下面将结合具体实施例对本申请的技术方案作进一步地阐述。
实施例1
本实施例提供一种纳米激动剂(BactTPNa)的制备方法，所述方法包括S10-S30：
S10-固相合成法合成可变形多肽(TP)。
根据图1所示，该可变形多肽(TP)是由UBI29-41、FFVLK、tuftsin和胆固醇琥珀酸单酯(Chems)依次偶联形成的分子结构，其合成方法为S101-S108：
S101：将300-500mg的载有精氨酸的Wang树脂浸入8-10mL的DMF浸泡溶胀3-6h；
S102：将溶胀的Wang树脂浸入8-10mL的脱保护剂脱保护15-30min，待脱去精氨酸中的保护基团FMOC之后，DCM和DMF交替清洗Wang树脂三次，得到Wang树脂偶联I，茚三酮法检测证明脱保护成功，其中，脱保护剂由DMF、哌嗪、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)和甲酸按质量比为92：5：2：1混合成；
S103：使用8-10mL的偶联剂依次溶解相当于精氨酸10倍摩尔量的缩合剂HBTU和下一个氨基酸之后，振摇15-30min，所得混合液加入Wang树脂偶联I中，进行反应45-90min，得到Wang树脂偶联II，茚三酮法检测证明氨基酸偶联成功，其中，偶联剂由DMF与N-甲基吗啉按95：5的体积比混合成；
S104：根据S102-S103的操作偶联至最后一个氨基酸，得到Wang树脂偶联III；
S105：将Wang树脂偶联III浸入8-10mL的2％水合肼溶液脱保护3min×3次，脱除保护基团Dde之后，加入含有HBTU和胆固醇琥珀酸单酯(Chems)的偶联剂溶液，进行反应12-24h，得到Wang树脂偶联IV；
S106：将Wang树脂偶联IV浸入脱保护剂进行脱保护15-30min，并在脱除保护基团FMOC之后，DCM和DMF交替清洗Wang树脂偶联IV，得到Wang树脂偶联V；
S107：6-8mL的甲醇淋洗Wang树脂偶联V三次，抽干备用；
S108：将备用的Wang树脂偶联V浸入2-3mL的裂解液进行裂解之后，收集溶液并使用旋转蒸发仪脱除溶剂，所得产物依次经冰乙醚清洗三次和真空干燥，即得可变形多肽，并于4℃冰箱保存备用，其中，裂解液是由三氟乙酸、水和三异丙基硅烷按体积比为95：2.5：2.5混合成，裂解条件为冰水浴，300-400rpm，2-3h。
S20-制备多肽储备液。
将所述可变形多肽溶解于DMSO中，形成多肽储备液。
S30-自组装成形。
将所述多肽储备液快速加入至纯水中，超声处理30分钟，随后室温下静置2-4h进行自组装，即得所述纳米激动剂(BactTPNa)。
同时，本实施例制备多肽(TP-C1)、(TP-C2)、(TP-C3)和(TP-C4)，以及纳米激动剂(BactTPNa-C1)、(BactTPNa-C2)、(BactTPNa-C3)和(BactTPNa-C4)作为对比例，其中，对比例具备与实施例以下的区别，其余结构以及合成方法同实施例，具体而言：
根据图2所示，TP-C1是以PEG1000替换TP中的UBI29-41形成的多肽结构，其具体结构为PEG1000、FFVLK、tuftsin和Chems依次偶联成形；
根据图3所示，TP-C2是以二十二烷酸(C22)替换TP中的Chems形成的多肽结构，其具体结构为UBI29-41、FFVLK、tuftsin和C22依次偶联成形；
根据图4所示，TP-C3是以TTGG替换TP中的tuftsin形成的多肽结构，其具体结构为UBI29-41、FFVLK、TTGG和Chems依次偶联成形；
根据图5所示，TP-C4是以GGAAK替换TP中的FFVLK形成的多肽结构，其具体结构为UBI29-41、GGAAK、TTGG和Chems依次偶联成形。
为验证实施例1制备的TP和BactTPNa的结构特征与实际性能，本申请对TP和BactTPNa进行结构表征和实验分析，具体如下：
1.TP的MALDI-TOF-MS表征
本申请对TP进行MALDI-TOF-MS表征，结果为图6所示。其中，图6为TP的MALDI-TOF-MS表征图。
根据图6可知，测得TP的分子量为3407.071g/mol，其与对应多肽的理论分子离子峰加两个氢离子后的分子离子峰一致，表明TP合成成功。
2.BactTPNa的透射电镜表征
本申请对BactTPNa进行透射电镜表征，结果为图7所示。其中，图7为BactTPNa的透射电镜图。
根据图7可知，实施例1制备的BactTPNa的粒径均一，且呈单分散性。
3.BactTPNa的动态光散射表征
本申请对BactTPNa进行动态光散射表征，结果为图8所示。其中，图8为BactTPNa的粒径分布图。
根据图8可知，实施例1制备的BactTPNa的粒径为～50nm。
4.BactTPNa的细菌脂肪酶响应性评估实验
本实验的评估方法包括：分别向浓度均为30μM的BactTPNa和BactTPNa-C2溶液中加入50μL的10mg/mL的细菌脂肪酶(lipase)溶液之后，37℃的温度下振摇12h，飞行时间质谱仪检测所得溶液的分子量，结果为图9至图10所示。其中，图9为BactTPNa与lipase共孵育之后的MALDI-TOF-MS表征图；图10为BactTPNa-C2与lipase共孵育之后的MALDI-TOF-MS表征图。
根据图9至图10可知，经细菌脂肪酶(lipase)处理的BactTPNa的分子量与其脱除Chems之后的分子量一致，表明实施例1制备的BactTPNa能够响应细菌脂肪酶脱去Chems；而BactTPNa-C2不具备该功能。
5.BactTPNa结合细菌能力的评估实验
本实验的评估方法包括：将金黄色葡萄球菌(S.aureus)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)培养至对数生长期之后，取OD600为0.1的两种细菌并分别加至BactTPNa和BactTPNa-C1溶液中，37℃的温度下振摇30min，3000g的离心力离心5min，PBS清洗三次。所得产物依次经2.5％的戊二醛溶液固定过夜和梯度浓度的乙醇水溶液脱水处理之后，重悬于乙醇中。取5μL的重悬液并滴至硅片表面，干燥后喷金处理并使用扫面电镜观察，结果为图11A所示。其中，图11A为S.aureus/P.aeruginosa与PBS、BactTPNa和BactTPNa-C1共孵育之后的扫面电镜图。
将S.aureus和P.aeruginosa培养至对数生长期之后，取OD600为0.1的两种细菌分别加至BactTPNa和BactTPNa-C1溶液中，37℃的温度下振摇30min，3000g的离心力离心5min，PBS清洗三次。所得产物经1％的锇酸固定液室温固定2h之后，依次使用梯度浓度的乙醇水溶液、100％乙醇与100％丙酮的混合溶液(v:v＝1:1)、100％丙酮进行脱水处理。随后依次使用体积比为1:1和1:2的丙酮-环氧树脂包埋剂(Epon 812)溶液浸透所得样品各1h。使用体积比为1:3的丙酮-环氧树脂包埋剂溶液和100％环氧树脂包埋剂对所得产物进行过夜浸透处理。将浸透的样品依次放置于37℃、45℃和70℃的恒温孵箱中，各聚合24h后形成包埋块。使用超薄切片机将包埋块切成超薄切片并置于电镜载网上，经3％的醋酸铀—枸橼酸铅染色后，使用TEM进行观察记录，结果为图11B所示。其中，图11B为S.aureus/P.aeruginosa与PBS、BactTPNa和BactTPNa-C1共孵育之后的透射电镜图。
根据图11可知，BactTPNa能够有效结合于S.aureus和P.aeruginosa表面，表明BactTPNa具备良好的细菌结合能力；而与BactTPNa-C1共孵育后，S.aureus和P.aeruginosa的表面形貌于PBS组中细菌无明显差别，表明BactTPNa-C1不具备细菌结合能力。
6.BactTPNa抑制细菌生长的评估实验
本实验的评估方法为：将S.aureus和P.aeruginosa培养至对数生长期之后，分别取OD600为0.1的两种细菌，与1mL的30μM的BactTPNa和BactTPNa-C1共孵育1h，8000g的离心力离心5min，弃去上清，PBS清洗两次，所得产物为结合有BactTPNa或BactTPNa-C1的细菌，得到细菌-多肽复合物。然后将所得细菌-多肽复合物分散在1mL的牛肉膏蛋白胨培养基中，并将该溶液继续稀释10000倍，取50μL稀释后的溶液，置于固体牛肉膏蛋白胨培养基中涂板并培养过夜，最后记录各板中的细菌菌落数，结果为图12所示。其中，图12为BactTPNa和BactTPNa-C1抑制细菌生长的实验结果图，具体地：
图12A为经PBS、BactTPNa-C1和BactTPNa处理S.aureus/P.aeruginosa后得到的细菌菌落数图；图12B为图12A中对应细菌菌落数的数据统计。
根据图12A-图12B可知，BactTPNa能够有效抑制S.aureus和P.aeruginosa的生长，BactTPNa-C1则不具备抑制S.aureus和P.aeruginosa生长的能力。
7.巨噬细胞摄取与BactTPNa共孵育之后的细菌评估实验
本实验的评估方法为：将FITC标记的S.aureus和P.aeruginosa分别与Cy5.5标记的BactTPNa、BactTPNa-C1、BactTPNa-C2、BactTPNa-C3和BactTPNa-C4共孵育12h，所得细菌-多肽复合物SA@BactTPNas和PA@BactTPNas分散于300μL的PBS中。将50μL的SA@BactTPNas或PA@BactTPNas加入至接种有M2型BMDM的八联皿中，37℃、5％CO2的细胞培养箱中孵育20min，弃去培养基，PBS小心清洗两次，然后依次向各孔加入200μL含有3滴Hochest/mL的培养基，细胞培养箱中继续孵育20min。弃去上清，PBS清洗两次，加入200μL培养基，单光子激光共聚焦成像系统对八联皿中的样品进行观察记录，结果为图13图所示。其中，图13为巨噬细胞摄取细菌-多肽复合物的实验结果图。
根据图13可知，在SA@BactTPNa5和PA@BactTPNa5的处理组中，标记两种细菌的绿色荧光与标记纳米激动剂的红色荧光具有较好的共定位，并且均在胞质中，而阻断FcγR将显著降低BMDM对SA@BactTPNa5和PA@BactTPNa5的摄取，说明BMDM能够摄取较多SA@BactTPNa5和PA@BactTPNa5且摄取量显著高于其他组，且摄取过程是FcγR依赖的。
8.BactTPNa促进巨噬细胞重极化的评估实验
本实验的评估方法为：根据实验7的方法获取未经染料标记的细菌-多肽复合物SA@BactTPNas和PA@BactTPNas之后，取100μL加入至接种有M2型BMDM的12孔板中，37℃、5％CO2的细胞培养箱中孵育4h。PBS清洗孔中细胞两次，加入500μL胰酶/孔，置于细胞培养箱中孵育5min，加入500μL完全培养基终止胰酶消化。收集消化所得细胞，500g的离心力离心5min。弃去上清，加入100μL含有FITC anti-mouse CD206(1:100)、PE anti-mouse F4/80(1:100)、APC anti-mouse CD86(1:100)、BV421 anti-mouse CD80(1:100)的细胞染色缓冲液，4℃冰箱中避光染色30min。500g的离心力离心5min，弃去上清，PBS清洗一次，将所得细胞分散在400μL的PBS中，流式细胞仪对所得细胞表面的CD80、CD86和CD206的表达情况进行检测，结果为图14所示。
其中，图14为BactTPNa促进巨噬细胞重极化的结果图，具体地：
图14A为与SA@BactTPNas共孵育之后的F4/80+CD86+巨噬细胞的占比统计，图14B为与PA@BactTPNas共孵育之后的F4/80+CD86+巨噬细胞的占比统计图，图14C为与SA@BactTPNas共孵育之后的F4/80+CD206+巨噬细胞的占比统计，图14D为与PA@BactTPNas共孵育之后的F4/80+CD206+巨噬细胞的占比统计。
根据图14A至图14D可知，与SA@BactTPNa-C1-4共孵育之后，高表达共刺激因子CD86的BMDM(F4/80+CD86+巨噬细胞)的占比分别为24.3±4.1％、28.0±4.5％、25.3±3.0％和28.6±5.9％；与SA@BactTPNa和PA@BactTPNa共孵育之后，F4/80+CD86+的BMDM的占比显著增加，分别达到58.6±1.0％和37.4±3.1％，接近或超过其他四组的两倍。此外，经SA@BactTPNa和PA@BactTPNa处理之后，高表达CD206的BMDM(F4/80+CD206+巨噬细胞)的占比则分别下降至21.1±2.4％和17.6±1.4％，从而说明SA@BactTPNa和PA@BactTPNa均能有效促进M2型BMDM向M1方向极化。
9.BactTPNa在体内分布情况表征
具体的表征方法为：通过盲肠浆液(CS)注射法构建多菌感染诱导的伴随免疫抑制的脓毒症小鼠模型，基于此使用P.aeruginosa构建肺部感染模型。将6只健康的C57BL/6n雄性小鼠随机分成两组，每组3只。然后按照0.4g/kg的CS注射剂量分别经腹腔向各组小鼠注射100μL的CS。注射72h之后，异氟烷麻醉小鼠，并经气管向每只小鼠灌注30μL的OD600＝0.6的细菌液。并于12h之后，分别经尾静脉注射100μL的200μM经Cy5标记的BactTPNa和BactTPNa-C1；24h之后，小鼠安乐死，取其心、肝、脾、肺、肾，使用小动物光学3D活体成像系统记录各脏器的荧光强度，结果为图15所示。其中，图15为BactTPNa和BactTPNa-C1在伴有肺部感染的脓毒症小鼠主要脏器中的分布情况。具体地：
图15A为BactTPNa和BactTPNa-C1在主要脏器中的分布情况；图15B为图15A对应的平均荧光强度统计。
根据图15可知，BactTPNa主要富集于肝脏和肺部，少量富集于脾脏，心和肾脏富集极少。BactTPNa-C1则主要富集于肝脏，其他脏器富集较少。同时，注射BactTPNa的小鼠肺部的平均荧光强度显著高于注射BactTPNa-C1的小鼠，表明BactTPNa具有更强的靶向细菌感染部位的能力。此外，尽管也有较多BactTPNa富集于肝脏中，但与BactTPNa-C1不同的是，BactTPNa能够更有效地富集到小鼠的感染肺部，说明UBI29-41的存在赋予了BactTPNa较好的细菌靶向能力，这可能也是BactTPNa能够在感染肺部大量富集的主要原因。
10.BactTPNa治疗伴有肺部感染的脓毒症小鼠评价实验
本实验的评价方法为：使用盲肠浆液(CS)注射法构建多菌感染诱导的伴随免疫抑制的脓毒症小鼠模型，并基于此使用P.aeruginosa构建肺部感染模型，得到伴有肺部感染的脓毒症小鼠模型。将肺部感染的脓毒症小鼠随机分成5组，每组8只。灌注P.aeruginosa12h之后，经尾静脉分别向各组小鼠注射100μL的200μM的BactTPNa、BactTPNa-C3和BactTPNa-C4，注射100μLPBS的小鼠作为对照，记录小鼠体重和存活数量至注射CS后的第10天。类似的，在注射完纳米激动剂之后的第三天，通过平板涂布法对肺组织中的细菌载荷进行评估；通过流式细胞术对肺部组织中巨噬细胞表型和淋巴细胞情况进行检测；类似的，通过流式细胞仪评估外周血单核细胞表面MHC-Ⅱ的表达情况和胸腺淋巴细胞的凋亡情况，以及通过ELISA测定肺组织中TNF-α和IL-10的含量，结果为图16所示。其中，图16为BactTPNa治疗伴有肺部感染的脓毒症小鼠的实验结果图。具体地：
图16A为经不同材料处理后伴有肺部感染的脓毒症小鼠的生存曲线监测结果；图16B为经不同材料处理后伴有肺部感染的脓毒症小鼠肺部的细菌载荷统计结果；图16C为经不同材料处理后伴有肺部感染的脓毒症小鼠肺部F4/80+CD80+CD86+巨噬细胞的占比；图16D为经不同材料处理后伴有肺部感染的脓毒症小鼠肺部F4/80+CD206+巨噬细胞的占比；图16E为经不同材料处理后伴有肺部感染的脓毒症小鼠肺部CD45+CD3+CD4+T细胞的占比，图16F为经不同材料处理后伴有肺部感染的脓毒症小鼠肺部CD45+CD3+CD8+T细胞的占比；图16G为经不同材料处理后伴有肺部感染的脓毒症小鼠肺部TNF-α的含量检测；图16H为经不同材料处理后伴有肺部感染的脓毒症小鼠肺部IL-10的含量检测，图16I为经不同材料处理后伴有肺部感染的脓毒症小鼠胸腺淋巴细胞的凋亡占比；图16J为经不同材料处理后伴有肺部感染的脓毒症小鼠外周血中CD115+CD11b+MHC-Ⅱ+单核细胞的比例。
根据图16可知，经BactTPNa治疗可有效抑制小鼠肺部感染并提升小鼠的存活率。其中，流式结果显示，BactTPNa的治疗显著提升了肺部F4/80+CD80+CD86+巨噬细胞和CD4+T、CD8+T细胞的比例并降低F4/80+CD206+巨噬细胞的比例，并且BactTPNa的治疗能够促进小鼠外周血中单核细胞表面MHC-Ⅱ的表达，抑制胸腺和脾脏细胞的凋亡；ELISA结果显示，经BactTPNa治疗之后，小鼠肺部TNF-α的表达量升高且明显高于其他治疗组，而IL-10的表达量则明显降低，说明BactTPNa能够有效抑制小鼠肺部感染并修复受损的免疫功能，进而提升脓毒症小鼠的存活率。
本说明书中的各个实施方式采用递进的方式描述，各个实施方式之间相同或相似的部分可互相参见，每个实施方式重点说明的都是与其他实施方式的不同之处。
以上实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对本申请限制；尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，本领域普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请技术方案的范围。

Claims (5)

1.一种纳米激动剂，其特征在于，制备所述纳米激动剂的原料含有可变形多肽；
所述可变形多肽含有依次偶联的靶向抗菌肽、功能化自组装肽、FcγR识别肽和脂肪酶响应性疏水分子，其中，所述功能化自组装肽能够在二次自组装中控制所述FcγR识别肽朝着目标病原体的表面翻转，所述目标病原体被所述靶向抗菌肽靶向结合；
所述可变形多肽具备式[i]所示的化学结构：
；
[i]。
2.根据权利要求1所述的纳米激动剂，其特征在于，所述靶向抗菌肽用于靶向结合革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌。
3.根据权利要求1所述的纳米激动剂，其特征在于，所述纳米激动剂为粒径分布在30-60nm的球形纳米颗粒。
4.一种根据权利要求1-3任一所述纳米激动剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
合成所述可变形多肽；
使所述可变形多肽溶解于有机溶剂中，形成多肽储备液；
将所述多肽储备液加入纯水中进行自组装，即得所述纳米激动剂。
5.一种根据权利要求1-3任一所述纳米激动剂在制备治疗对脓毒症及其继发感染病症的药物中的应用。
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