CN116698803A - 一种荧光光片快速三维显微成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种荧光光片快速三维显微成像方法。该方法提供一种筛选样品信号区域并跳过无信号区域的方法，在原有成像过程基础上增加了初步扫描与筛选信号区域的数据处理过程。初步筛选过程是在正式成像之前先粗略地扫描兴趣区域(ROI)的整个厚度，而后扫描得到的数据经过处理得到筛选信号区域的结果，即在成像深度上找到样品的边界，后续进行正式成像时将依据此边界来决定是否需要拍摄该ROI并定义起始拍摄位置与结束拍摄位置。利用本发明提供的快速成像方法，能够显著提升成像速度，并减小源数据量，提升整体图像数据获得与处理的效率。
Description
技术领域
本发明涉及光学显微三维成像领域，尤其涉及一种荧光光片快速三维显微成像方法。
背景技术
荧光光片显微成像技术是一种典型的光学显微三维成像技术，它利用限制在焦平面附近的光片逐层对样品扫描来获得样品的三维荧光图像。荧光光片显微镜采用的光片可以是由激光束经过柱透镜产生的扁平状的覆盖整个成像视野的静态光片，也可以是激光束经过扫描振镜等光学元件在成像视野区域形成的动态的虚拟光片。
CN 115113384 A与文献(Yanlu Chen等,A Versatile Tiling Light SheetMicroscope for Imaging of Cleared Tissues,Cell Reports,Volume 33,Issue 5,2020,108349,ISSN 2211-1247)公开了平铺光片荧光显微成像技术(本发明的实施及验证即基于该平铺光片荧光显微成像技术)，该技术通过产生可以调节空间位置的光片对视场进行分割成像，从而提升了空间分辨率、光学层析能力，并且提供了可行的光片形状、位置、角度的校准方案。但无论是荧光光片显微成像技术还是平铺光片荧光显微成像技术，其均是将设定区域内的所有兴趣区域(ROI)的整个设计深度上用光片进行逐个扫描成像，对于没有样品的区域依然耗费了成像时间与图像存储空间，而且冗余的数据也对处理也造成了麻烦，造成了时间与存储资源的浪费，降低了图像获得的有效率。对于越大体量的成像任务，这样的成像方式造成的限制越多。
上述现有的平铺光片显微技术及其他基于荧光成像的逐层扫描三维显微成像技术，因为其对整个设定区域内的所有ROI的整个深度进行成像，成像范围是一个规则的立方体，而生物样本多是不规则形态，上述的成像方式对没有样品区域同样进行了拍摄，导致信息获取效率较低，增大了成像时长与数据量。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种荧光光片快速三维显微成像方法，成像过程中通过筛选兴趣区域内有样品的范围即筛选样品信号区域从而跳过无样品信号区域，在原有成像过程基础上增加了初步扫描与筛选信号区域的数据处理过程。
本发明首先提供了一种荧光光片快速三维显微成像方法，其包括如下步骤：
S1:对样品所在区域进行ROI划分，设置初步扫描与正式成像所需的参数；
S2：按扫描顺序对各ROI进行初步扫描和正式成像，包括：
S21:先对当前ROI进行初步扫描；对初步扫描获得的当前ROI的图像数据进行处理，获得边界位置信息，判断当前ROI是否为空ROI；
S22：若当前ROI为空ROI，则不对当前ROI进行正式成像并执行步骤S24；若当前ROI非空，则进入步骤S23对当前ROI进行正式成像；
S23:将样品移动到当前ROI的边界起始位置，载入设定的正式成像的参数，使用正式成像所需的步长，移动样品并拍摄直至到达当前ROI的边界终止位置；完成正式成像后进入步骤S24；
S24：判断当前ROI是否为最后一个ROI；若不为最后一个ROI，则按扫描顺序移动到下一个ROI并返回步骤S21；若为最后一个R0I，则结束步骤S2；
S3：所有ROI扫描和成像完毕；对于每个ROI，光片显微镜在z方向上连续拍摄形成一个三维图像堆叠stack，最终通过对各个ROI的stack进行拼接，得到样品的三维图像。
作为本发明的优选方案，所述S1中，ROI即为兴趣区域，所述兴趣区域为矩形区域，通过设定的矩形网格对样品所在区域进行划分得到各ROI。
作为本发明的优选方案，所述S1中，初步扫描与正式成像所需的参数均包括光片的粗细、长度、位置，以及z方向上样品的移动步长；其中，初步扫描与正式成像时，光片的粗细、长度相同；初步扫描时，z方向上样品的步长为正式成像时n倍；n的值根据样品的性质设定，可选择20～50；
初步扫描时，光片在光的传播方向即y方向的位置设置在ROI的中心位置附近；正式成像时若采用平铺光片方案，则使用多个y方向不同位置的一组光片依次扫描平铺以覆盖整个视野，正式成像时若不采用平铺光片方案，则直接使用初步扫描所用的光片扫描整个视野。
作为本发明的优选方案，所述S2中，初步扫描时，光片先沿着x方向快速扫过样品完成ROI当前深度的扫描；完成当前深度扫描后，按深度方向上的步长移动样品，并继续进行下一深度层的扫描，如此逐层扫描直至该ROI扫描完毕，深度方向即为z方向；
对初步扫描获得的当前ROI的图像数据进行处理，具体为：初步扫描所得图像数据在深度方向上连续拍摄形成一个三维图像堆叠stack；通过最大强度投影(MIP)，将三维图像堆叠stack向xz平面或者yz平面进行投影，得到xz MIP与yz MIP，它们都是二维数字图像，对其进行特征值提取，从而对样品的边界做出判定。
作为本发明的优选方案，所述的进行特征值提取，从而对样品的边界做出判定，具体为：对xz MIP与yz MIP数据向z轴求特征值，所述的特征值为均值或标准差；之后将两个方向的对应特征值分布取均值，得到综合的特征值即均值或标准差沿z方向分布曲线；然后，引入阈值对该分布曲线进行二值化处理，得到二值化的z向强度分布；对二值化分布进行噪声滤除与冗余扩展，得到边界位置信息。
作为本发明的优选方案，所述使用阈值将特征值一维分布二值化中的阈值为人工设置阈值、自动设置阈值与挑选阈值。进一步的，所述的人工设置阈值为：对相似样品在同一装置中获得的源数据进行分析，得到边界处特征值的信息，并依此得到阈值；所述的自动设置阈值为：使用二值化算法将特征值一维分布二值化；所述的挑选阈值为：在做成像实验前的观察阶段，人工地寻找几个“有信号”与“无信号”的位置，在有无、信号的边界区域，连续移动几个位置获得各自的特征值数据，之后计算出最终所要设定的阈值；阈值计算结果是对“有信号”特征值组的最小值与“无信号”特征值组最大值进行比较并对比较结果分段赋予不同比例系数而得。
作为本发明的优选方案，所述的噪声滤除为：使用深度方向上连续有信号区域的长度作为叠加的阈值，对二值化结果进行处理，滤除连续长度较短的有信号区域；所述的冗余扩展为：对噪声滤除后的边界计算结果向两侧各扩展一定的长度，以保证不漏掉信号区域。
作为本发明的优选方案，正式成像时，使用一个光片或在y向上不同中心位置的多个光片平铺来覆盖整个视野；每个深度的正式成像包括在一个或多个不同中心位置的光片下通过沿x方向扫描样品进行拍摄；完成当前深度扫描后，按深度方向上的步长移动样品，并继续进行下一深度层的扫描，如此逐层扫描直至该ROI扫描完毕，深度方向即为z方向。
作为本发明的优选方案，所述样品是经过透明化处理的生物组织，或者是在自然状态下已经透明的生物组织。
本发明能够用于透明生物组织等样品的荧光显微快速三维成像，除光片显微成像之外，还可以引申应用到共聚焦显微成像、双光子显微成像等技术中，通过在成像深度上抽取数据获得样品边界，降低成像时长与所需数据存储量。并且本发明不需要进行成像设备等硬件装置上的改动，仅需要通过软件操作更改成像程序，增加数据处理环节，数据处理的算法易移植，产业应用具有广泛性与高效性。
附图说明
图1是样品装置、图像取得装置及方位示意图。
图2是区分兴趣区域成像较大样品的横向与纵向分布示意图。
图3是使用本发明所述成像方法的总体成像流程图。
图4是初步扫描与正式成像所用光片与样品移动步长的对比示意图。
图5是基本数据处理方法流程图。
图6是将MIP作为基础数据的自动阈值方法数据处理流程图。
图7是挑选阈值方法获得阈值的处理过程示意图。
图8是使用本发明所述成像方法处理一个ROI源数据的过程的示例图。
具体实施方式
以下参照附图就本发明所涉及的成像方式和数据处理过程进行详细说明。还有，在对附图进行说明的过程中将相同的符号标注于相同要素，并省略重复的说明。另外，各个附图是为了说明用而被制作的附图，并且是以特别强调所说明的对象部位的形式被描绘的。因此，附图中的各个构件的尺寸比例并不一定与实物相一致。
图1是样品装置、图像取得装置及方位示意。其中，xy平面是光片平面，平行于图像取得装置106的光感应平面106a，是检测物镜104的焦平面，本发明中也称其为横向。光感应平面106a也是中继光学系统105的焦平面。由光源与光扫描部101及照明物镜102所生的激光束沿y轴传播，沿x轴扫描形成光片。z轴是深度方向，是光片逐层扫描的方向，本发明中也称其为纵向。本发明的实施与验证采用移动样品107的方式来调节图像接收的内容，即光片产生装置与图像取得装置在成像过程中位置保持不变，移动样品装置103中的样品来选定所要成像的区域。可选地，可以采用样品107位置不动，而整体移动光片产生装置与图像取得装置的方法达到选择成像区域的目的。基于背景技术的描述，本发明的实例采用的光片是参数操作更灵活的虚拟光片。
图2是示意性地表示区分ROI成像较大样品的横向与纵向分布。在通常的光片显微镜对较大样品的成像过程中，会区分多个ROI，通常成规则的矩形状态分布(如图2所示方格)，通过样品或光学装置的移动逐个拍摄各个ROI，对于每个ROI，光片显微镜在深度(z)方向上连续拍摄形成一个三维图像堆叠(stack)，最终通过对各个ROI的stack进行拼接，可以得到样品的三维图像。内含斜线的方格为没有样品信号的ROI与ROI内深度方向上没有样品的区域。
对于三维的由二维图像堆叠出来的stack，它的观察通常通过最大强度投影(MIP)进行，将其在xz方向或者yz方向进行投影，得到xz MIP与yz MIP，它们都是二维数字图像，可以对其进行特征值提取，从而对样品的边界做出判定。
图3是实施例使用的成像方法的总体成像流程示意。首先，根据样品及成像装置的特征设置初步扫描和正式成像所需的各项参数，如z方向上样品的移动步长，光片的位置，光片的粗细、长度等等。而后，移动到第一个ROI，载入初步扫描光片信息。该光片与正式成像时使用的光片的粗细、长度一致，可以设置在ROI的中心位置附近。对该ROI使用初步扫描设定的大步长进行成像，结束后对获得的图像数据进行处理，依据设定的数据处理算法获得边界位置信息。如果该ROI被判断为空ROI，即该区域内没有样品，若其为最后一个ROI，则样品整体成像已经完成；若非最后一个ROI，则移动样品至下一个ROI位置之后，再次进行初步扫描。在上一步中，如果边界位置信息结果显示该ROI非空，则立即将样品重新移动到该ROI的边界起始位置，再载入设定的正式成像的光片信息，使用正式成像所需的小步长，移动样品并拍摄直至到达上一步计算得到的边界终止位置。至此，该ROI的样品成像完成，若该ROI非最后一个ROI，样品随后会被移动至下一个ROI的位置，重新载入初步扫描的光片信息与样品移动步长。循环这个过程直到所有ROI成像完毕，如此，本发明的整体成像流程结束。
本发明在正式成像前增加了初步扫描与筛选信号区域的数据处理过程。初步筛选过程是在正式成像之前先粗略地扫描ROI的整个厚度，而后扫描得到的数据经过处理得到筛选信号区域的结果，即在成像深度上找到样品的边界，后续进行正式成像时将依据此边界来决定是否需要拍摄该兴ROI并定义起始拍摄位置与结束拍摄位置。
对于多色成像，初步扫描采用单色成像，其选用现有条件下样品荧光最强的颜色通道，筛选信号区域的数据处理针对该颜色通道下获取的数据进行；正式成像使用所有颜色通道，各个颜色通道依次进行成像，在当前ROI内各颜色通道的起始成像位置与结束成像位置均一致，均是由现有条件下样品荧光最强的颜色通道初步扫描数据处理而得。
图4是初步扫描与正式成像所用光片与样品移动步长的对比示意，在该示意中，正式成像采用的是平铺3个光片的平铺光片成像方案。其中，(a)图是初步扫描光片在横向与纵向上的分布示意，(b)图是正式成像光片在横向与纵向上的分布示意，光片依次在3个位置平铺以覆盖整个视野。其中，1、2、3与n+1均是光片序号，n为前述初步扫描与实际拍摄步长之比。初步扫描光片选用的是中间位置的正式成像光片的参数，光片中心位于视野中部。在z方向上，正式成像时在初步扫描移动一步的距离上要移动n次样品，即z方向上正式成像的步长是初步扫描的1/n。n的值经测试可以选择20～50范围内的整数。如此，使用3次平铺，1/n步长比的情况下，对整个stack成像，初步扫描与正式成像所用时长比为1/3n。考虑到n的取值，初步扫描的时长可以忽略不计。因此，依据样品实际边界位置进行的实际成像可以成比例地节省成像时长与数据量。
图5是初步扫描时基本数据处理方法。首先针对初步扫描stack获得的三维图像灰度数据分别向xz平面与yz平面两个投影方向做MIP，再分别对两个MIP数据向z方向求均值或标准差等特征值，之后将两个方向的对应特征值分布取均值，得到综合的特征值即均值或标准差沿z方向分布曲线。然后，引入阈值对该分布进行二值化处理。阈值的设定可以使用人工设置阈值、自动设置阈值与挑选阈值三种方法。根据设定的灰度阈值，即高于阈值的设定为1，低于阈值的设定为0，由此得到二值化的z向强度分布。由于样品制备过程出现的问题可能会导致连续的杂质区域，也会有零散的杂质分布，相比样品荧光信号，这些都是噪声。这类噪声的荧光亮度通常很高，一般的阈值无法滤除，本发明采用z向宽度(zWidth)阈值，可以达到更有效的杂质滤除效果。使用zWidth阈值，即要设定连续信号的z向宽度，若连续的1出现次数高于该zWidth阈值，则判定为样品区域，反之，则判断为杂质区域而后滤除。经过zWidth阈值处理，得到滤除一定宽度杂质带的二值化的z向强度分布。在上述基础上，为了判断的稳定性与可靠性，针对得到的边缘值，额外添加余量，增大冗余。此外，如果前述阈值方法使用的是自动阈值设置方法，则需要在zWidth阈值滤除杂质带之后，对二值化处理之前的z向强度分布数据进行双向一阶微分运算，通过边缘处的斜率来预估边缘处的扩充值，对边界结果进行进一步的冗余扩展。基于上述步骤，最终的边界位置信息即可获得。
除了上述的基本数据处理方法，还可不再对MIP求沿z的均值或标准差等特征值分布，而只利用MIP来做自动阈值计算的数据基础，图6显示了这一处理过程。将初步扫描获得的三维图像数据向xz或yz平面方向做MIP之后，对MIP直接使用自动阈值算法进行分析，得到阈值，从而进行二值化处理。之后进行如同前述基本数据处理方法一样的zWidth阈值、一阶微分扩充边界及添加余量等步骤，得到最终的边界结果。
图7是挑选阈值方法获得阈值的处理过程示意。挑选阈值方法是在做成像实验前的观察阶段人工地寻找几个“有信号”与“无信号”的典型位置，主要是在有无信号的边界区域，连续移动几个位置即可获得各自的标准差等特征值数据，之后点击计算就可以算出最终所要设定的阈值。阈值计算结果是对“有信号”特征值组的最小值与“无信号”特征值组最大值进行比较并对比较结果分段赋予不同比例系数而得。因为不同的成像系统、不同处理方法的不同样品，其信号的强弱、分布都不同，设定统一的阈值显然不能满足要求，但是如果在当次实验中根据样品的实际情况快速算出阈值。即本发明所述的挑选阈值方法，则是一种可以广泛应用且出错率很低的边界识别方法。因为阈值生成逻辑的关系，选定有信号区域的时候要尽量挑选边界区域，也就是有信号区域到无信号区域的过渡区域，这样对最终阈值的计算准确性有更高的保证。
本发明所述快速三维成像方法的边界处理方法之一是自动阈值设定方法。自动阈值设定就是成像程序自己判断该以怎样的阈值来分割图像。本发明采用的自动阈值算法是最大类间方差法(inter-class variance)。针对获得的MIP的沿z向的标准差或均值的分布，使用最大类间方差算法得到二值化分布。因为自动阈值算法没有人为干预，为降低信号丢失的概率，本发明在边界判断结果中加入冗余量，如图5所示，冗余量的设定包含人工设定余量与基于一阶微分计算得到的增量两个部分。
可选地，自动阈值方法可以采用其他的自动阈值算法，例如聚类法(Clustering)、最大熵法(Entropy)、均匀性度量法(Metric)、矩守恒法(Moments Preserving)等。
此外，本发明所述快速三维成像方法的边界处理方法之一是基于经验设定阈值的方法。虽然经验阈值法对特定成像系统特定处理方式的特定样品来讲是可以得到不丢失样品信息的滤除无信号区域的，但是将这种方法移植到其他的成像装置、其他处理方法、或者其他类型的样品的时候，需要进行比较大量的前期实验或者数据分析以获取合适的经验阈值。因而，基于经验的阈值设定方法在初始设置时会有较大的工作量。
图8示例性地展示了使用本发明所述成像方法处理一个ROI源数据的过程。经过初步扫描获得的涡虫细胞三维图像数据向侧边方向做MIP，到二维的深度方向上的图像信息，对其按行求特征值标准差，可以得到一维的特征值分布。此例中采用的阈值方法是自动阈值法，其对一维特征值分布数据进行分析，得到二值化结果。其中，1代表判断有样品信号的深度位置，0代表判断没有样品信号的位置。在此基础上，使用zWidth阈值滤除边缘的不连续的噪声，获得连续的样品分布区域。而后，通过增加余量与边界微分值的方法进行冗余扩展，最终得到正式成像所需的起始与终止拍摄深度位置，从而获得最终的成像结果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种荧光光片快速三维显微成像方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1:对样品所在区域进行ROI划分，设置初步扫描与正式成像所需的参数；
S2：按扫描顺序对各ROI进行初步扫描和正式成像，包括：
S21:先对当前ROI进行初步扫描；对初步扫描获得的当前ROI的图像数据进行处理，获得边界位置信息，判断当前ROI是否为空ROI；
S22：若当前ROI为空ROI，则不对当前ROI进行正式成像并执行步骤S24；若当前ROI非空，则进入步骤S23对当前ROI进行正式成像；
S23:将样品移动到当前ROI的边界起始位置，载入设定的正式成像的参数，使用正式成像所需的步长，移动样品并拍摄直至到达当前ROI的边界终止位置；完成正式成像后进入步骤S24；
S24：判断当前ROI是否为最后一个ROI；若不为最后一个ROI，则按扫描顺序移动到下一个ROI并返回步骤S21；若为最后一个R0I，则结束步骤S2；
S3：所有ROI扫描和成像完毕；对于每个ROI，光片显微镜在z方向上连续拍摄形成一个三维图像堆叠stack，最终通过对各个ROI的stack进行拼接，得到样品的三维图像。
2.根据权利要求1所述的荧光光片快速三维显微成像方法，其特征在于，所述S1中，ROI即为兴趣区域，所述兴趣区域为矩形区域，通过设定的矩形网格对样品所在区域进行划分得到各ROI。
3.根据权利要求1所述的荧光光片快速三维显微成像方法，其特征在于，所述S1中，初步扫描与正式成像所需的参数均包括光片的粗细、长度、位置，以及z方向上样品的移动步长；其中，初步扫描与正式成像时，光片的粗细、长度相同；初步扫描时，z方向上样品的步长为正式成像时n倍；n选择20～50；
初步扫描时，光片在光的传播方向即y方向的位置设置在ROI的中心位置；正式成像时若采用平铺光片方案，则使用y方向上不同位置的一组光片依次扫描平铺以覆盖整个视野，正式成像时若不采用平铺光片方案，则直接使用初步扫描所用的光片扫描整个视野。
4.根据权利要求1所述的荧光光片快速三维显微成像方法，其特征在于，所述S2中，初步扫描时，光片先沿着x方向快速扫过样品完成ROI当前深度的扫描；完成当前深度扫描后，按深度方向上的步长移动样品，并继续进行下一深度层的扫描，如此逐层扫描直至该ROI扫描完毕，深度方向即为z方向；
对初步扫描获得的当前ROI的图像数据进行处理，具体为：初步扫描所得图像数据在深度方向上连续拍摄形成一个三维图像堆叠stack；通过最大强度投影(MIP)，将三维图像堆叠stack向xz平面或者yz平面进行投影，得到xz MIP与yz MIP，它们都是二维数字图像，对其进行特征值提取，从而对样品的边界做出判定。
5.根据权利要求4所述的荧光光片快速三维显微成像方法，其特征在于，所述的进行特征值提取，从而对样品的边界做出判定，具体为：对xz MIP与yz MIP数据向z轴求特征值，所述的特征值为均值或标准差；之后将两个方向的对应特征值分布取均值，得到综合的特征值即均值或标准差沿z方向分布曲线；然后，引入阈值对该分布曲线进行二值化处理，得到二值化的z向强度分布；对二值化分布进行噪声滤除与冗余扩展，得到边界位置信息。
6.根据权利要求5所述的荧光光片快速三维显微成像方法，其特征在于，所述使用阈值将特征值一维分布二值化中的阈值为人工设置阈值、自动设置阈值与挑选阈值。
7.根据权利要求6所述的荧光光片快速三维显微成像方法，其特征在于，
所述的人工设置阈值为：对相似样品在同一装置中获得的源数据进行分析，得到边界处特征值的信息，并依此得到阈值；
所述的自动设置阈值为：使用二值化算法将特征值一维分布二值化；
所述的挑选阈值为：在做成像实验前的观察阶段，人工地寻找几个“有信号”与“无信号”的位置，在有无、信号的边界区域，连续移动几个位置获得各自的特征值数据，之后计算出最终所要设定的阈值；阈值计算结果是对“有信号”特征值组的最小值与“无信号”特征值组最大值进行比较并对比较结果分段赋予不同比例系数而得。
8.根据权利要求5所述的荧光光片快速三维显微成像方法，其特征在于，所述的噪声滤除为：使用深度方向上连续有信号区域的长度作为叠加的阈值，即zWidth阈值，对二值化结果进行处理，若连续的1出现次数高于该zWidth阈值，则判定为样品区域，反之，则判断为杂质区域而后滤除，得到滤除一定宽度杂质带的二值化的z向强度分布；
所述的冗余扩展为：对噪声滤除后的边界结果向两侧各扩展一定的长度，以保证不漏掉信号区域，其中，对使用自动阈值方法得到的边界结果，额外增加一阶微分结果扩充边界范围。
9.根据权利要求1所述的荧光光片快速三维显微成像方法，其特征在于，S23中，正式成像时，使用一个光片或在y向上不同中心位置的多个光片依次平铺来覆盖整个视野；每个深度的正式成像包括在一个或多个不同中心位置的光片下通过沿x方向扫描样品进行拍摄；完成当前深度扫描后，按深度方向上的步长移动样品，并继续进行下一深度层的扫描，如此逐层扫描直至该ROI扫描完毕，深度方向即为z方向。
10.根据权利要求1所述的荧光光片快速三维显微成像方法，其特征在于，若成像为多色成像，则初步扫描采用单色成像，其选用样品荧光最强的颜色通道；正式成像使用所有颜色通道，各个颜色通道依次进行成像，当前ROI内各颜色通道的起始成像位置与结束成像位置均一致，均是由样品荧光最强的颜色通道初步扫描数据处理而得。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100208955A1 (en) * | 2005-11-30 | 2010-08-19 | Mehes Gabor | Method and device for automatically analyzing biological samples |
| CN106290283A (zh) * | 2016-09-09 | 2017-01-04 | 华中科技大学 | 一种快速获取生物组织图像数据的方法 |
| US20180246309A1 (en) * | 2017-02-24 | 2018-08-30 | Institut National D'optique | Scan-based imaging with variable scan speed using predictions of region-of-interest positions |
| CN109407293A (zh) * | 2018-10-31 | 2019-03-01 | 浙江大学 | 基于双振镜双物镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置和方法 |
| CN113551614A (zh) * | 2021-06-29 | 2021-10-26 | 南京理工大学 | 基于光谱分布特性的三维形貌干涉测量快速垂直扫描方法 |
-
2023
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100208955A1 (en) * | 2005-11-30 | 2010-08-19 | Mehes Gabor | Method and device for automatically analyzing biological samples |
| CN106290283A (zh) * | 2016-09-09 | 2017-01-04 | 华中科技大学 | 一种快速获取生物组织图像数据的方法 |
| US20180246309A1 (en) * | 2017-02-24 | 2018-08-30 | Institut National D'optique | Scan-based imaging with variable scan speed using predictions of region-of-interest positions |
| CN109407293A (zh) * | 2018-10-31 | 2019-03-01 | 浙江大学 | 基于双振镜双物镜的三维结构光照明超分辨显微成像装置和方法 |
| CN113551614A (zh) * | 2021-06-29 | 2021-10-26 | 南京理工大学 | 基于光谱分布特性的三维形貌干涉测量快速垂直扫描方法 |
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