CN116685330A

CN116685330A - 使用toll样受体激动剂的癌症疗法

Info

Publication number: CN116685330A
Application number: CN202180074939.0A
Authority: CN
Inventors: S·C·卡茨; B·F·考克斯; D·B·雅洛克
Original assignee: Tesalas Life Sciences
Current assignee: Tesalas Life Sciences
Priority date: 2020-09-22
Filing date: 2021-09-21
Publication date: 2023-09-01

Abstract

本发明的实施例提供了治疗癌症的方法以及使用局部区域疗法通过脉管系统将toll样受体(TLR)激动剂递送至肝脏中的实体瘤的方法。在一个方面，本发明涉及一种治疗肝脏的葡萄膜黑素瘤转移的方法，其包含向肝脏施用TLR9激动剂。

Description

使用toll样受体激动剂的癌症疗法

相关申请的交叉引用

本申请要求以下权益：2020年9月22日的美国临时专利申请第63/081,613号；2020年11月18日的美国临时专利申请第63/115,435号；2021年1月20日的美国临时专利申请第63/139,622号；2021年3月11日的美国临时专利申请第63/159,857号；2021年3月11日提交的临时专利申请第63/159,867号；以及2021年7月23日提交的美国临时专利申请第63/225,026号，其全部内容通过引用并入本文。

序列表

本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII副本创建于2020年9月16日，命名为A372-502_SL.txt，大小为484字节。

技术领域

本公开总体上涉及治疗癌症的方法以及使用局部区域疗法通过脉管系统将toll样受体(TLR)激动剂递送至肝脏中的实体瘤的方法。

背景技术

癌症是一种涉及细胞未受抑制的生长的毁灭性疾病，其可能导致实体瘤在皮肤和肝脏等各种器官中的生长。肿瘤可以首先存在于任何数量的器官中，或者可以是转移或从其它部位扩散的结果。

黑素瘤是一种多样的疾病，涵盖广泛的亚型和表现特征。黑素瘤是一种由黑素细胞发展而来的癌症，并且可能涉及许多亚型和表现，包括在发现黑素细胞的任何器官或组织中，如皮肤和眼睛，并且还包括转移到其它器官，如肝脏。

葡萄膜黑素瘤(UM)是最常见的原发性眼内恶性肿瘤，占原发性眼部恶性肿瘤的85至95％，占所有黑素瘤病例的3至5％。这些恶性肿瘤由葡萄膜内的黑素细胞引起，葡萄膜由虹膜、睫状体和脉络膜组成。用放射疗法或剜除术对原发性肿瘤进行确定性治疗可降低局部复发率。然而，尽管进行了有效的局部控制，转移性疾病仍发生在50％以上的患者中。转移性葡萄膜黑素瘤通常在90％以上的病例中累及肝脏并且由血液扩散引起。这种疾病的肝转移(LM)倾向已经在鼠和人类肿瘤研究中进行了评估。转移性葡萄膜黑素瘤累及的其它部位包括肺、骨、大脑、淋巴结和皮肤。存在于肝脏中的来自转移性葡萄膜黑素瘤的实体瘤(例如多灶性内脏肿瘤)尤其难以治疗。

对于转移性疾病，治疗可以分为几类，包括肝定向疗法、细胞毒性化学疗法、免疫疗法、分子靶向疗法和表观遗传修饰剂。转移性疾病的预后非常差，从最初诊断时起，1年总存活率为43％。

此外，尽管某些抗体疗法，如伊匹木单抗(ipilimumab)、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)和阿替利珠单抗(atezolizumab)，已被批准用于经由静脉内全身输注治疗皮肤黑素瘤，但这些疗法尚未被批准用于治疗转移性葡萄膜黑素瘤是安全或有效的。

因此，仍然需要一种用于治疗转移性葡萄膜黑素瘤的安全且有效的疗法。

发明内容

本发明涉及治疗癌症的方法以及使用局部区域疗法通过脉管系统将TLR激动剂递送至肝脏中的实体瘤的方法。

在一个方面，本发明涉及一种治疗肝脏的葡萄膜黑素瘤转移的方法，其包含通过肝动脉输注(HAI)经血管内装置施用TLR激动剂。根据另一实施例，肝脏的葡萄膜黑素瘤转移的治疗包含通过门静脉输注(PVI)经血管内装置施用TLR激动剂。

在一些实施例中，TLR激动剂通过压力使能药物递送(PEDD)施用，其包括通过生成、引起和/或有助于血管和/或靶组织或肿瘤内流体压力净增加的装置(如导管装置)施用治疗剂。

在一些实施例中，TLR激动剂通过压力使能装置施用，例如增加血管压力的装置。

在一些实施例中，TLR激动剂是C类CpG寡脱氧核苷酸(CpG-C ODN)。

在一些实施例中，通过血管内装置向肝脏施用TLR激动剂导致髓源性抑制细胞(MDSC)的减少或MDSC的功能改变以限制免疫抑制。

在一些实施例中，TLR激动剂是TLR9激动剂。

当结合整个说明书阅读本公开的示例性实施例的以下详细描述时，本公开的示例性实施例的这些和其它目的、特征和优点将变得显而易见。

附图说明

结合示出了本公开的说明性实施例的附图，从以下详细描述中，本公开的其它目的、特征和优点将变得显而易见。

图1示出了SD-101的结构。

图2A至2B示出了示例性TLR9激动剂和检查点抑制剂的示例性组合对肝转移的鼠模型中肿瘤进展的影响。

图3A至3D示出了示例性TLR9激动剂对MDSC群体、PD-L1和CD4和CD8群体以及在人PBMC中的活化表达的影响。

图4A至4D示出了示例性TLR9激动剂对人PMBC中NFκB和IFNα调节的细胞因子产生的影响。

图5A至5D示出了示例性TLR9激动剂对人MDSC编程的影响。

图6示出了在小鼠中发展肝转移的图解和门静脉和尾静脉给药的相应治疗方案。

图7A至7B示出了示例性TLR9激动剂对肿瘤负荷的影响。

图8A至8D示出了门控策略和示例性TLR9激动剂对MDSC群体、M-MDSC群体和G-MDSC群体的影响。

图9A至9C示出了门控策略和示例性TLR9激动剂对肝转移中M1-和M2-巨噬细胞群体的影响。

图10A至10B示出了示例性TLR9激动剂对NFκB、STAT3活化和IL6产生的影响。

图11A至11B示出了示例性TLR9激动剂的浓度对NFκB信号活性的影响。

图12示出了肝脏四个主叶的样品处理方法，其被切成1cm厚的切片。

图13A至13B分别示出了未处理和处理组织中像素强度值的代表性直方图。

图14A至14B示出了比较了通过针注射递送标记的ODN(图14A)与使用PEDD装置递送至局部动脉网络(图14B)的近红外成像。

图15A至15B示出了比较了通过针注射递送标记的ODN(图15A)与使用PEDD装置递送至局部动脉网络(图15B)的近红外成像。

图16A至16B示出了通过针和PEDD分别施用的标记的ODN 2395和SD-101的信号强度，以及两种化合物组合的信号强度。

图17A至17B示出了通过针和PEDD分别施用的标记的ODN 2395和SD-101的治疗覆盖率，以及两种化合物组合的组织体积。

图18示出了用标记的寡核苷酸灌注肝动脉后的肝酶应答。

图19示出了通过端孔导管或PEDD递送后保留在猪肝组织中的标记ODN的信号强度。

图20A至20C示出了用端孔和PEDD装置显示高程度信号重叠的猪肝组织。

图21A至21C示出了用端孔和PEDD装置显示低程度信号重叠的猪肝组织。

图22示出了端孔平均处理组织体积、PEDD平均处理组织体积和重叠共同处理组织体积的维恩图解。

图23示出了根据本发明的实施例的用于治疗葡萄膜黑素瘤肝转移的总体临床研究设计。

在整个附图中，除非另有说明，否则相同的附图标记和字符用于表示所示实施例的类似特征、元件、组件或部分。此外，虽然现在将参考附图详细描述本公开，但是结合说明性实施例进行描述，并且本公开不受附图和所附段落中所示的特定实施例的限制。

具体实施方式

实施例的以下描述提供参考数字的非限制性代表性实例以具体描述本发明的不同方面的特征和教导。所描述的实施例应当被认为能够与来自实施例的描述的其它实施例分开地或组合地实现。阅读实施例描述的本领域普通技术人员应该能够理解本发明的不同描述的方面。对实施例的描述应该有助于将本发明理解到这样的程度，即，未被具体涵盖但在阅读了实施例的描述的本领域技术人员的知识范围内的其它实现将被理解为与本发明的应用一致。

Toll样受体激动剂

Toll样受体是一种可检测微生物病原体相关分子模式(PAMP)的模式识别受体。TLR刺激，如TLR9刺激，不仅可以提供广泛的先天免疫刺激，而且还可以特异性地解决肝脏中免疫抑制的主要驱动因素。TLR1-10在人中表达并识别多种不同的微生物PAMP。在这方面，TLR9可以应答于未甲基化的CpG-DNA，包括微生物DNA。CpG是指胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸l的基序。TLR9在B细胞、浆细胞样树突细胞(pDC)、活化的嗜中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞、T细胞和MDSC中组成型表达。TLR9也在非免疫细胞中表达，包括角化细胞和肠道、宫颈和呼吸上皮细胞。TLR9可以在内体内结合其激动剂。可以通过MYD88/IkB/NfκB进行信号传导以诱导促炎细胞因子基因表达。通过IRF7的平行信号传导途径诱导刺激适应性免疫应答的1型和2型干扰素(例如IFN-α、IFN-γ等)。此外，TLR9激动剂可以诱导细胞因子和IFN的产生以及抗原呈递树突细胞的功能成熟。

根据一个实施例，TLR9激动剂可以减少和重新编程MDSC。MDSC是肝脏中免疫抑制的关键驱动因素。MDSC还驱动其它抑制细胞类型(如T调节细胞(Treg)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和癌症相关成纤维细胞(CAF))的扩增。MDSC可以下调免疫细胞并干扰免疫治疗剂的有效性。此外，高MDSC水平通常预示着癌症患者的不良预后。在这方面，减少、改变或消除MDSC被认为提高了宿主免疫系统攻击癌症的能力以及免疫疗法诱导更有益的治疗应答的能力。在一个实施例中，TLR9激动剂可以将MDSC转化为免疫刺激性M1巨噬细胞，将未成熟树突细胞转化为成熟树突细胞，并扩增效应T细胞以产生应答性肿瘤微环境，从而促进抗肿瘤活性。

根据一个实施例，可以开发模拟微生物CpG-DNA的免疫刺激性质的合成CpG-寡核苷酸(CPG-ON)用于治疗用途。根据一个实施例，寡核苷酸是寡脱氧核苷酸(ODN)。存在许多不同的CpG-ODN分类类型，例如A类、B类、C类、P类和S类，它们共享某些结构和功能特征。在这方面，A类CPG-ODN(或CPG-A ODN)与pDC成熟相关，对B细胞几乎没有影响，并且IFNα诱导程度最高；B类CPG-ODN(或CPG-B ODN)强烈诱导B细胞增殖，活化pDC和单核细胞成熟、NK细胞活化和炎性细胞因子产生；而C类CPG-ODN(或CPG-C ODN)可以诱导B细胞增殖和IFN-α产生。此外，根据一个实施例，CPG-C ODN可以与以下属性相关联：(i)未甲基化的二核苷酸CpG基序，(ii)与侧翼核苷酸并置的CpG基序(例如AACGTTCGAA)，(iii)连接核苷酸的完全硫代磷酸酯(PS)主链(与细菌DNA中发现的天然磷酸二酯(PO)主链相反)，和(iv)自互补的回文序列(例如AACGTT)。在这方面，CPG-C ODN可能由于其回文性质而结合自身，从而产生双链双链体或发夹结构。

此外，根据一个实施例，CPG-C ODN可以包括一个或多个5'-TCG三核苷酸，其中5'-T位于离寡核苷酸的5'-端的0、1、2或3个碱基处，以及至少一个长度为至少8个碱基的回文序列，其包含一个或多个未甲基化的CG二核苷酸。一个或多个5'-TCG三核苷酸序列可以与回文序列的5'-端间隔0、1或2个碱基，或者回文序列可以含有一个或多个5'-TCG三核苷酸序列的全部或部分。在一个实施例中，CpG-C ODN的长度为12至100个碱基，优选地长度为12至50个碱基，优选地长度为12至40个碱基，或优选地长度为12至30个碱基。在一个实施例中，CpG-C ODN的长度为30个碱基。在一个实施例中，ODN的长度为至少(下限)12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、50、60、70、80或90个碱基。在一个实施例中，ODN的长度为至多(上限)100、90、80、70、60、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31或30个碱基。

在一个实施例中，至少一个回文序列的长度为8至97个碱基，优选地长度为8至50个碱基，或优选地长度为8至32个碱基。在一个实施例中，至少一个回文序列的长度为至少(下限)8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30个碱基。在一个实施例中，至少一个回文序列的长度为至多(上限)50、48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18、16、14、12或10个碱基。

在一个实施例中，CpG-C ODN可以包含SEQ ID NO:1的序列。

根据一个实施例，CpG-C ODN可以包含SD-101。SD-101是30聚体硫代磷酸寡脱氧核苷酸，具有以下序列：

5'-TCG AAC GTT CGAACG TTC GAA CGT TCG AAT-3'(SEQ ID NO:1)

SD-101原料药以钠盐形式分离。SD-101的结构如图1所示。

SD-101游离酸的分子式为C₂₉₃ H₃₆₉ N₁₁₂ O₁₄₉ P₂₉ S₂₉，并且SD-101游离酸的分子量为9.672道尔顿。SD-101钠盐的分子式为C₂₉₃ H₃₄₀ N₁₁₂ O₁₄₉ P₂₉ S₂₉ Na₂₉，并且SD-101钠盐的分子量为10,309道尔顿。

此外，根据一个实施例，CPG-C ODN序列可以对应于如美国专利第9,422,564号中所述的SEQ ID NO 172，该专利通过引用整体并入本文。

在一个实施例中，CpG-C ODN可以包含与任何前述序列(如SEQ ID NO:1)具有至少75％同源性的序列。

根据另一实施例，CPG-C ODN序列可以对应于美国专利第9,422,564号中描述的任何一种其它序列。此外，CPG-C ODN序列还可以对应于美国专利第8,372,413号中描述的任何序列，该专利也通过引用整体并入本文。

根据一个实施例，本文讨论的任何CPG-C ODN可以以其药学上可接受的盐形式存在。示例性的碱性盐包括铵盐、碱金属盐(如钠盐、锂盐和钾盐)、碱土金属盐(如钙盐和镁盐、锌盐)、与有机碱(例如有机胺)(如N-Me-D-葡糖胺、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵、胆碱、氨丁三醇、二环己胺、叔丁胺)的盐，以及与氨基酸(如精氨酸、赖氨酸等)的盐。在一个实施例中，CpG-C ODN是铵盐、钠盐、锂盐或钾盐形式。在一个优选的实施例中，CpG-C ODN是钠盐形式。CpG-C ODN可以在包含药学上可接受的赋形剂的药物溶液中提供。替代地，CpG-C ODN可以作为冻干固体提供，其随后在给药前在无菌水、盐水或药学上可接受的缓冲剂中重构。本公开的药学上可接受的赋形剂包括例如溶剂、填充剂、缓冲剂、张力调节剂和防腐剂。在一个实施例中，药物组合物可以包含赋形剂，其用作溶剂、填充剂、缓冲剂和张力调节剂中的一种或多种(例如，盐水中的氯化钠可以用作水性媒介物和张力调节剂两者)。本公开的药物组合物适于肠胃外和/或经皮给药。

在一个实施例中，药物组合物包含水性媒介物作为溶剂。合适的媒介物包括例如无菌水、盐水溶液、磷酸盐缓冲盐水和林格氏溶液。在一个实施例中，组合物是等渗的。

药物组合物可以包含填充剂。当药物组合物在给药前冻干时，填充剂特别有用。在一个实施例中，填充剂是保护剂，其有助于在冷冻或喷雾干燥期间和/或在储存期间稳定和防止活性剂降解。合适的填充剂是糖(单糖、二糖和多糖)，如蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇、葡萄糖和棉子糖。

药物组合物可以包含缓冲剂。缓冲剂控制pH以抑制活性剂在加工、储存和任选的重构过程中的降解。合适的缓冲剂包括例如包含醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐或硫酸盐的盐。其它合适的缓冲剂包括例如氨基酸如精氨酸、甘氨酸、组氨酸和赖氨酸。缓冲剂可以进一步包含盐酸或氢氧化钠。在一些实施例中，缓冲剂将组合物的pH维持在4至9的范围内。在一个实施例中，pH大于(下限)4、5、6、7或8。在一些实施例中，pH小于(上限)9、8、7、6或5。即，pH在约4至9的范围内，其中下限小于上限。

药物组合物可以包含张力调节剂。合适的张力调节剂包括例如葡萄糖、甘油、氯化钠、甘油和甘露醇。

药物组合物可以包含防腐剂。合适的防腐剂包括例如抗氧化剂和抗微生物剂。然而，在一个实施例中，药物组合物在无菌条件下制备并且在一次性容器中，因此不需要包括防腐剂。

表1描述了SD-101药物产品–16g/L的批次配方：

表1

¹基于溶液中所测量含量的数量(不包括冻干粉末中存在的水分)

*表1中的SD-101原料药反映了所有寡核苷酸含量的总和，包括SD-101。

在一些实施例中，单位剂量强度可以包括约0.1mg/mL至约20mg/mL。在一个实施例中，SD-101的单位剂量强度为13.4mg/mL。

CpG-C ODN可能含有修饰。合适的修饰可以包括但不限于3'OH或5'OH基团的修饰、核苷酸碱基的修饰、糖组分的修饰和磷酸基团的修饰。修饰的碱基可以包括在回文序列中，只要修饰的碱基通过沃森-克里克碱基配对保持对其天然补体的相同特异性(例如CpG-CODN的回文部分保持自互补)。

CpG-C ODN可以是线性的，可以是圆形的或包括圆形部分和/或发夹环。CpG-C ODN可以是单链或双链的。CpG-C ODN可以是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。

CpG-C ODN可以含有天然存在的或修饰的非天然存在的碱基，并且可以含有修饰的糖、磷酸和/或末端。例如，除了磷酸二酯键之外，磷酸酯修饰包括但不限于甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(桥接或非桥接)、磷酸三酯和二硫代磷酸酯，并且可以以任何组合使用。在一个实施例中，CpG-C ODN仅具有硫代磷酸酯键，仅具有磷酸二酯键，或磷酸二酯键和硫代磷酸酯键的组合。

还可以制备本领域已知的糖修饰，如2'-烷氧基-RNA类似物、2'-氨基-RNA类似物、2'-氟-DNA和2'-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合体以及本文所述的其它糖修饰，并与任何磷酸酯修饰组合。碱基修饰的实例包括但不限于向CpG-C ODN的胞嘧啶的C-5和/或C-6(例如，5-溴胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-碘胞嘧啶)和CpG-C ODN的尿嘧啶的C-5和/或C-6(例如，5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-碘尿嘧啶)添加吸电子部分。如上所述，在CpG-C ODN的回文序列中使用碱基修饰不应干扰沃森-克里克碱基配对所涉及的碱基的自互补性。然而，在回文序列的外部，可以使用修饰的碱基而没有这种限制。例如，2'-O-甲基-尿苷和2'-O-甲基-胞苷可以在回文序列的外部使用，而5-溴-2'-脱氧胞苷可以在回文序列的内部和外部使用。可以在回文序列内部和外部使用的其它修饰的核苷酸包括7-脱氮-8-氮杂-dG、2-氨基-dA和2-硫代-dT。

大多数ODN的双链体(即双链)和发夹形式通常处于动态平衡，发夹形式通常在低寡核苷酸浓度和较高温度下有利。共价链间或链内交联分别增加双链体或发夹对热、离子、pH和浓度诱导的构象变化的稳定性。化学交联可用于将多核苷酸锁定成双链体或发夹形式，用于物理化学和生物学表征。构象均一且以其最具活性形式(双链体或发夹形式)“锁定”的交联ODN可能比其未交联的对应物更具活性。因此，本公开的一些CpG-C ODN可以含有共价链间和/或链内交联。

制备多核苷酸和修饰的多核苷酸的技术是本领域已知的。含有磷酸二酯键的天然存在的DNA或RNA通常可以通过将适当的核苷亚磷酰胺依次偶联至在3'-端附接至固体支持物的生长中的ODN的5'-羟基基团，随后将中间体亚磷酸三酯氧化成磷酸三酯来合成。使用这种方法，一旦合成了所需的多核苷酸序列，就从支持物上除去多核苷酸，将磷酸三酯基团脱保护成磷酸二酯，并使用氨水或其它碱将核苷碱基脱保护。

CpG-C ODN可以含有磷酸修饰的寡核苷酸，已知其中一些能稳定ODN。因此，一些实施例包括稳定的CpG-C ODN。可以与ODN中的糖或糖类似物部分连接的磷衍生物(或修饰的磷酸基团)可以是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等。

CpG-C ODN可以包含一种或多种核糖核苷酸(含有核糖作为唯一的或主要的糖组分)、脱氧核糖核苷酸(含有脱氧核糖作为主要的糖组分)、修饰的糖或糖类似物。因此，除了核糖和脱氧核糖之外，糖部分可以是戊糖、脱氧戊糖、己糖、脱氧己糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖和糖类似物环戊基。糖可以是吡喃糖基或呋喃糖基形式。在CpG-C寡核苷酸中，糖部分优选地为核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖或2'-0-烷基核糖的呋喃糖苷，并且糖可以以任一异头构型连接到相应的杂环碱基。这些糖或糖类似物和其中这些糖或类似物与杂环碱基(核酸碱基)附接的相应核苷的制备本身是已知的，因此不需要在此描述。在CpG-C ODN的制备中也可以进行糖修饰并与任何磷酸酯修饰组合。

掺入CpG-C ODN中的杂环碱基或核酸碱基可以是天然存在的主要嘌呤和嘧啶碱基(即尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤，如上所述)，以及所述主要碱基的天然存在的和合成的修饰。因此，CpG-C ODN可以包括肌苷、2'-脱氧尿苷和2-氨基-2'-脱氧腺苷中的一种或多种。

根据另一实施例，CPG-ODN是A类CPG-ODN(CPGP-A ODN)、B类CPG-ODN(CPG-B ODN)、P类CPG-ODN(CPG-P ODN)和S类CPG-ODN(CPG-S ODN)中的一种。在这方面，CPG-AODN可以是CMP-001。

在另一实施例中，CPG-ODN可以是替索托莫德(tilsotolimod)(IMO-2125)。

检查点抑制剂

根据一个实施例，本发明的TLR激动剂可以与检查点抑制剂(CPI)联合使用。检查点抑制剂可以包括程序性死亡1受体(PD-1)拮抗剂。PD-1拮抗剂可以是阻断癌细胞上表达的程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)与免疫细胞(T细胞、B细胞或NKT细胞)上表达的PD-1的结合，并且优选地还阻断癌细胞上表达的PD-L2程序性细胞死亡1配体2(PD-L2)与免疫细胞表达的PD-1的结合的任何化合物或生物分子。PD-1及其配体的替代名称或同义词包括：PD-1的PDCD1、PD1、CD279和SLEB2；PD-L1的PDCD1L1、PDL1、B7H1、B7-4、CD274和B7-H；以及PD-L2的PDCD1L2、PDL2、B7-DC、Btdc和CD273。在治疗人类个体的本发明的任何治疗方法、药物和用途中，PD-1拮抗剂阻断人PD-L1与人PD-1的结合，优选地阻断人PD-L1和PD-L2与人PD-1的结合。

根据一个实施例，PD-1拮抗剂可以包括单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段，其特异性结合PD-1或PD-L1，并且优选地特异性结合人PD-1或人PD-L1。mAb可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，并且可以包括人恒定区。在一些实施例中，人恒定区选自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区组成的组，在优选的实施例中，人恒定区是IgG1或IgG4恒定区。在一些实施例中，抗原结合片段选自由Fab、Fab'-SH、F(ab')₂、scFv和Fv片段组成的组。

根据一个实施例，PD-1拮抗剂可以包括与PD-1或PD-L1特异性结合的免疫粘附素，优选地与人PD-1或人PD-L1特异性结合的免疫粘附素，例如含有与恒定区(如免疫球蛋白分子的Fc区)融合的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的融合蛋白。

根据一个实施例，PD-1拮抗剂可以抑制PD-L1与PD-1的结合，优选地还可以抑制PD-L2与PD-1的结合。在上述治疗方法、药物和用途的一些实施例中，PD-1拮抗剂是特异性结合PD-1或PD-L1并阻断PD-L1与PD-1结合的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，PD-1拮抗剂是包含重链和轻链的抗PD-1抗体。

根据一个实施例，PD-1拮抗剂可以是纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)和西米普利单抗(cemiplimab)中的一种。根据另一实施例，纳武单抗经由外周静脉以每四周480mg的剂量(“Q4W”)静脉内(IV)施用。根据另一实施例，纳武单抗经由外周静脉以每三周1mg/kg的纳武单抗剂量(“Q3W”)静脉内(IV)施用。在又一实施例中，纳武单抗与SD-101同时、大约同时或在同一天伴随施用。在另一实施例中，在施用一个或多个周期的SD-101后，每周、每隔一周、每三周、每四周或每月施用一次纳武单抗。

根据另一实施例，CPI可以包括PD-L1拮抗剂。在这方面，PD-L1拮抗剂可以是阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)和德瓦鲁单抗(durvalumab)中的一种。

根据另一实施例，CPI可以包括CTLA-4拮抗剂。在这方面，CTLA-4拮抗剂可以是伊匹木单抗。根据另一实施例，伊匹木单抗经由外周静脉以每三周3mg/kg的剂量静脉内(IV)施用。在又一实施例中，伊匹木单抗与SD-101同时、大约同时或在同一天伴随施用。在另一实施例中，在施用一个或多个周期的SD-101后，每周、每隔一周、每三周、每四周或每月施用一次纳武单抗。

实现局部区域递送的装置

根据实施例，上述装置中的任一个可以包含用于实现向肿瘤的局部区域递送的任何装置，包括导管本身，或可以包含导管连同可与导管组合使用的其它组件(例如，过滤阀、气囊、压力传感器系统、泵系统、注射器、外部递送导管等)。在某些实施例中，导管是微导管。

在一些实施例中，该装置可以具有一个或多个属性，这些属性包括但不限于能够在血管的下游分支网络中提供治疗的均匀分布的自定心能力；能够阻断或抑制TLR激动剂的逆行流动的抗回流能力(例如，使用阀和过滤器，和/或气囊)；用于测量血管内压力的系统；以及调节血管内压力的方法，例如通过在放置时和2cc/分钟输注期间引起压力降低，以及在盐水推注期间引起压力增加。在一些实施例中，系统被设计成在整个过程中连续地监测实时压力。

在一些实施例中，可用于执行本发明的方法的装置是如在美国专利第8,500,775号、美国专利第8,696,698号、美国专利第8,696,699号、美国专利第9,539,081号、美国专利第9,808,332号、美国专利第9,770,319号、美国专利第9,968,740号、美国专利第10,813,739号、美国专利第10,588,636号、美国专利第11,090,460号、美国专利公开第2018/0193591号、美国专利公开第2018/0250469号、美国专利公开第2019/0298983号、美国专利公开第2020/0038586号和美国专利公开第2020-0383688号中所公开的装置，其全部内容通过引用并入本文。

在一些实施例中，该装置是美国专利第9,770,319号中公开的装置。在某些实施例中，该装置可以是被称为Surefire输注系统的装置。

在一些实施例中，该装置在使用期间支持血管内压力的测量。在一些实施例中，该装置是如美国专利公开号2020-0383688中公开的装置。在某些实施例中，该装置可以是被称为TriSalus输注系统的装置。在某些实施例中，该装置可以是被称为输注系统的装置。/>是一种配备有单向阀的单腔导管，可动态响应局部压力变化，例如由心动周期引起或由输注生成的局部压力变化。阀结构调节远端血管压力和血流。这又可能由于脉管系统内的接触时间增加而改变治疗分布和首过吸收。

在一些实施例中，TLR激动剂可以经由PEDD通过装置施用。在一些实施例中，可以在监测血管中的压力的同时施用TLR激动剂，其可以用于调节和校正装置在输注部位的定位和/或调节输注速率。压力可以通过例如包括一个或多个压力传感器的压力传感器系统来监测。

可以调节输注速率以改变血管压力，这可以促进TLR激动剂渗透到靶组织或肿瘤中。在一些实施例中，可以使用注射泵作为递送系统的一部分来调节和/或控制输注速率。在一些实施例中，可以使用泵系统来调节和/或控制输注速率。在一些实施例中，使用泵系统的输注速率可以为约0.1cc/分钟至约40cc/分钟，或约0.1cc/分钟至约30cc/m分钟，或约0.5cc/分钟至约25cc/分钟，或约0.5cc/分钟至约20cc/分钟，或约1cc/分钟至约15cc/分钟，或约1cc/分钟至约10cc/分钟，或约1cc/分钟至约8cc/分钟，或约1cc/分钟至约5cc/分钟。此外，使用推注输注的输注速率可以为约30cc/分钟至约360cc/分钟，或约120cc/分钟至约240cc/分钟。在一个实施例中，SD-101输注过程持续大约30至60分钟。在另一实施例中，SD-101施用约25分钟的时间段。

包含施用至肝脏的方法

在一个实施例中，本发明的方法包括治疗肝脏中的实体瘤的方法，该实体瘤例如是黑素瘤转移的肿瘤，如葡萄膜黑素瘤，所述方法包含向有需要的患者施用toll样受体激动剂，其中toll样受体激动剂通过装置以HAI方式施用至肝脏中的这种实体瘤。HAI是指将治疗输注到肝脏的肝动脉中。根据一个实施例，一种或多种toll样受体激动剂通过将装置经皮引入肝动脉的分支而引入，该装置例如导管和/或促进压力使能递送的装置。根据一个实施例，toll样受体激动剂是TLR9激动剂，并且在一些实施例中，TLR9激动剂是SD-101。在一个实施例中，患者是人类患者。

根据另一实施例，本发明的方法包括治疗肝脏中的实体瘤的方法，该实体瘤例如是黑素瘤转移的肿瘤，如葡萄膜黑素瘤，所述方法包含向有需要的患者施用toll样受体激动剂，其中toll样受体激动剂通过装置以PVI方式施用至肝脏中的这种实体瘤。PVI是指将治疗输注到肝门静脉系统中。根据一个实施例，一种或多种toll样受体激动剂通过将装置经皮引入肝门静脉系统的分支而引入，该装置例如导管和/或促进压力使能递送的装置。根据一个实施例，toll样受体激动剂是TLR9激动剂，并且在一些实施例中，TLR9激动剂是SD-101。在一个实施例中，患者是人类患者。

根据一个实施例，本发明的方法包括一种用于治疗葡萄膜黑素瘤的肝转移的方法，其中受试者具有组织学或细胞学上证实的转移性UM伴仅肝疾病或肝显性疾病。肝显性疾病可能表现为肝内转移，相对于其它器官，肝内转移占疾病的最大部分，可允许的肝外部位是肺、皮肤或皮下组织和骨。肝显性疾病也可能表现为肝内转移，相对于其它器官，肝内转移占疾病的最大部分，或如果LM的进展代表对患者生命构成显著威胁。根据另一实施例，该方法包括对十八岁或以上的男性或女性受试者给药。

根据另一实施例，本发明的方法包括一种用于治疗葡萄膜黑素瘤的肝转移的方法，其中受试者在入组前14天内未接受过先前的细胞毒性化学疗法、靶向疗法或外部放射疗法。根据另一实施例，本发明的方法包括对在研究干预的第一剂量前30天内没有接受过先前免疫检查点阻断治疗并且没有进行中的免疫介导的2级或更高级别的AE的受试者给药。根据另一实施例，将本发明的方法施用于从未接受过先前免疫检查点阻断治疗的受试者。根据本发明的一个实施例，方法还包括对从未接受过使用永久性栓塞材料的先前栓塞HAI疗法的受试者给药。在另一实施例中，本发明的方法包括先前已经进行过少转移性肝病的手术切除或射频消融的受试者。

根据另一实施例，本发明的方法包括一种用于治疗葡萄膜黑素瘤的肝转移的方法，其中受试者没有既往恶性肿瘤病史或其它并发的恶性肿瘤，除非恶性肿瘤在临床上不显著。在另一实施例中，根据本发明的方法治疗的受试者可能没有正在进行的治疗。在又一实施例中，受试者是临床稳定的。

在另一实施例中，本发明的方法可以包括对根据RECIST v.1.1标准在肝脏中患有可测量疾病的受试者给药。在另一实施例中，本发明的方法可以包括对在筛查时表现出东部肿瘤协作组(“ECOG”)表现评分(“PS”)为0至1的受试者给药。在另一实施例中，根据本发明的方法施用治疗的受试者在筛查时具有由研究人员估计的大于3个月的预期寿命。在另一实施例中，受试者具有≤480msec的QTc间期。

在另一实施例中，来自先前癌症疗法的所有相关的临床上显著的药物相关毒性在治疗之前得到缓解。在本实施例中，缓解为≤1级或患者的治疗前水平。在另外的实施例中，受试者可能患有在替代疗法中控制的2级脱发和内分泌病。

在另一实施例中，本发明的方法可以包括对在筛查时具有足够器官功能的受试者给药。在一个实施例中，具有足够器官功能的受试者可以表现出以下中的一种或多种：(i)血小板计数>100,000/μL，(2)血红蛋白≥8.0g/dL，(3)白细胞计数(WBC)>2,000/μL(4)血清肌酸酐≤2.0mg/dL，除非实测肌酐清除率>40mL/分钟/1.73m²，(5)总胆红素和直接胆红素≤2.0×正常上限(ULN)和碱性磷酸酶≤5×ULN，(6)对于有记录的吉尔伯特病患者，总胆红素高达3.0mg/dL，(7)ALT和AST≤5×ULN，以及(8)筛查时凝血酶原时间/国际标准化比值(INR)或活化部分凝血活酶时间(aPTT)检测结果≤1.5×ULN(仅适用于未接受抗凝治疗的患者；接受抗凝治疗的患者应在研究干预的第一剂量之前稳定剂量至少4周)。

根据另一实施例，本发明的方法还可用于治疗由其它癌症引起的肝转移，例如结肠直肠癌(即结肠直肠癌肝转移)、胰腺癌，如胰腺导管腺癌(即胰腺导管腺癌肝转移)。

根据另一实施例，肿瘤是不可切除的。

根据另一实施例，本发明的方法可以与其它癌症治疗剂(如免疫调节剂、肿瘤杀伤剂和/或其它靶向治疗剂)一起施用。

根据一个实施例，TLR9疗法可以与细胞疗法联合施用，从而通过调节免疫系统实现细胞疗法。

在一个实施例中，上述对肝脏给药的方法旨在导致toll样受体激动剂穿透整个实体瘤，穿透整个器官或基本上穿透整个肿瘤。在一个实施例中，这些方法增强toll样受体激动剂对有需要的患者的灌注，包括通过克服肿瘤的间质流体压力和固体应激。在另一实施例中，通过将肿瘤完全暴露于治疗剂，遍及整个器官或其部分的灌注可以为疾病的治疗提供益处。在一个实施例中，这些方法能够更好地将toll样受体递送至难以进入体循环的肿瘤区域。在另一实施例中，与经由外周静脉或经由直接肿瘤间注射的常规全身性递送相比，这些方法将较高浓度的toll样受体激动剂递送至这种肿瘤中，而将较少的toll样受体激动剂递送至非靶组织。在一个实施例中，这些方法导致实体瘤的大小减小、生长速率降低或缩小或消除。

本发明的方法还可以包括在进行HAI之前绘制通向肝脏的右叶和左叶的血管的图，或者选择性地输注到特定的扇区或节段中，并且在必要时，闭塞不通向肝脏或者不是目标的血管。在一些实施例中，在输注之前，患者可以例如经由股总动脉途径进行标测血管造影。

用于绘制体内血管和递送治疗剂的方法是本领域普通技术人员所熟知的。例如，可以通过使用微弹簧圈栓塞来实现闭塞，这允许执业医生阻塞脱靶动脉或血管，从而优化修饰细胞向肝脏的递送。可以根据需要进行微弹簧圈栓塞，如在施用第一剂量的TLR9激动剂之前进行，以促进包含TLR9激动剂的药物组合物的最佳输注。在另一实施例中，可以使用无菌海绵(例如GELFOAM)。在这方面，可以切割无菌海绵并将其推入导管中。在另一实施例中，无菌海绵可以作为颗粒提供。

在一些实施例中，TLR9激动剂(如SD-101)的剂量可以是约0.01mg、约0.03mg、约0.05mg、约0.1mg、约0.3mg、约0.5mg、约1mg、约1.5mg、约2mg、约2.5mg、约3mg、约3.5mg、约4mg、约4.5mg、约5mg、约5.5mg、约6mg、约6.5mg、约7mg、约7.5mg或约8mg。在一些实施例中，SD-101以12mg、16mg和20mg的剂量施用。施用毫克量的SD-101(例如约2mg)描述了施用约2mg的图1所示的组合物。例如，这种量的SD-101(例如约2mg的量)也可以存在于含有除这种量的SD-101之外的材料的组合物中，如其它相关和不相关的化合物。也考虑了其它药学上可接受的盐的当量摩尔量。

在一些实施例中，TLR9激动剂(如SD-101)的剂量可以在约0.01mg至约10mg之间、在约0.01mg至约8mg之间，和在约0.01mg至约4mg之间。在一些实施例中，TLR9激动剂(如SD-101)的剂量可以在约2mg至约10mg之间、在约2mg至约8mg之间，和在约2mg至约4mg之间。在一些实施例中，TLR9激动剂(如SD-101)的剂量可以小于约10mg、小于约8mg、小于约4mg或小于约2mg。这种剂量可以每天、每周或每隔一周施用。在一个实施例中，SD-101的剂量递增地增加，例如通过施用约2mg，然后约4mg，然后约8mg。

在一些实施例中，本发明的方法可以包含施用包含周期的给药方案，其中一个或多个周期包含经由HAI和PEDD施用SD-101。如本文所用，“周期”是给药顺序的重复。在一个实施例中，一个周期包含每个周期三个周剂量(即在三个连续周内每周施用一次SD-101)。在一个实施例中，根据本发明的治疗周期可以包含SD-101给药期，随后是“停药”期或休息期。在另一实施例中，除了每个周期三个周剂量之外，该周期进一步包含一周、两周、三周或四周作为每周施用SD-101后的休息期。在又一实施例中，除了每个周期三个周剂量之外，该周期进一步包含约三十八天作为每周施用SD-101后的休息期。在另一实施例中，整个周期包含约五十二天。在另一实施例中，给药方案包含至少一个、至少两个或至少三个周期或更长。

在一些实施例中，本发明涉及TLR9激动剂在制备用于治疗肝脏中的实体瘤的药物中的用途，该实体瘤例如是黑素瘤转移的肿瘤，如葡萄膜黑素瘤，所述方法包含向有需要的患者施用TLR9激动剂，其中TLR9激动剂通过装置以HAI方式施用至肝脏中的这种实体瘤。

在一些实施例中，通过HAI以0.5mg的剂量施用SD-101用于治疗转移性葡萄膜黑素瘤，并且在一些实施例中，通过调节压力的装置(即PEDD)进一步施用SD-101。在一些实施例中，SD-101以0.5mg的剂量经HAI通过与检查点抑制剂组合的调节血管压力的装置施用，其中检查点抑制剂是纳武单抗。在其它实施例中，SD-101以0.5mg的剂量通过HAI和通过调节压力的装置与伊匹木单抗组合施用。在一些实施例中，SD-101以0.5mg的剂量通过HAI和通过调节压力的装置与伊匹木单抗和纳武单抗组合施用。

在一些实施例中，通过HAI以2mg的剂量施用SD-101用于治疗转移性葡萄膜黑素瘤，并且在一些实施例中，通过调节压力的装置(即PEDD)进一步施用SD-101。在一些实施例中，SD-101以2mg的剂量经HAI通过与检查点抑制剂组合的调节血管压力的装置施用，其中检查点抑制剂是纳武单抗。在其它实施例中，SD-101以2mg的剂量通过HAI和通过调节压力的装置与伊匹木单抗组合施用。在一些实施例中，SD-101以2mg的剂量通过HAI和通过调节压力的装置与伊匹木单抗和纳武单抗组合施用。

在一些实施例中，通过HAI以4mg的剂量施用SD-101用于治疗转移性葡萄膜黑素瘤，并且在一些实施例中，通过调节压力的装置(即PEDD)进一步施用SD-101。在一些实施例中，SD-101以4mg的剂量经HAI通过与检查点抑制剂组合的调节血管压力的装置施用，其中检查点抑制剂是纳武单抗。在其它实施例中，SD-101以4mg的剂量通过HAI和通过调节压力的装置与伊匹木单抗组合施用。在一些实施例中，SD-101以4mg的剂量通过HAI和通过调节压力的装置与伊匹木单抗和纳武单抗组合施用。

在一些实施例中，通过HAI以8mg的剂量施用SD-101用于治疗转移性葡萄膜黑素瘤，并且在一些实施例中，通过调节压力的装置(即PEDD)进一步施用SD-101。在一些实施例中，SD-101以8mg的剂量经HAI通过与检查点抑制剂组合的调节血管压力的装置施用，其中检查点抑制剂是纳武单抗。在其它实施例中，SD-101以8mg的剂量通过HAI和通过调节压力的装置与伊匹木单抗组合施用。在一些实施例中，SD-101以8mg的剂量通过HAI和通过调节压力的装置与伊匹木单抗和纳武单抗组合施用。

在一些实施例中，本发明的方法导致靶病变的治疗。在该实施例中，本发明的方法可能导致完全应答，包含所有靶病变的消失。在一些实施例中，本发明的方法可能导致部分应答，包含靶病变的最长直径的总和减少至少30％，以基线最长直径总和作为参考。在一些实施例中，本发明的方法可能导致稳定的靶病变疾病，包含既不充分收缩以符合部分应答的条件，也不充分增加以符合进行性疾病的条件，以自治疗开始以来最小的最长直径作为参考。在这样的实施例中，进行性疾病的特征在于靶病变的最长直径总和增加至少20％，以自治疗开始或出现一个或多个新病变以来记录的最小最长直径总和作为参考。总和必须显示5mm的绝对增加。

在另一实施例中，本发明的方法导致对非靶病变的治疗。在该实施例中，本发明的方法可能导致完全应答，包括所有非靶病变的消失。在一些实施例中，本发明的方法导致一种或多种非靶病变的持续存在，而不导致完全应答或进行性疾病。在这样的实施例中，进行性疾病的特征在于存在的非靶病变的明确进展，和/或一个或多个新病变的出现。

在一些实施例中，本发明的方法导致有益的总应答率，如根据RECIST v.1.1的总应答率。在那些实施例中，本发明的方法导致的总体应答是完全应答，其中受试者表现出对靶病变的完全应答、非靶病变的完全应答，并且没有新的病变。在其它实施例中，本发明的方法导致的总体应答是部分应答，其中受试者表现出对靶病变的完全应答、对非靶病变的非完全应答和非进行性疾病，并且没有新的病变。在其它实施例中，本发明的方法导致的总体应答是部分应答，其中受试者表现出对靶病变的部分应答、对非靶病变的非进行性疾病，并且没有新的病变。在另一实施例中，本发明的方法导致的总体应答是稳定疾病，其中受试者表现出稳定的靶病变疾病、非靶病变的非进行性应答，并且没有新的病变。

在一些实施例中，本发明的方法导致总体应答的持续时间增加。在一些实施例中，总体应答的持续时间从完全应答或部分应答(以最先记录的为准)满足测量标准的时间开始测量，直到客观地记录复发性或进行性疾病的第一天(将自治疗开始以来记录的最小测量值作为进行性疾病的参考)。总体完全应答的持续时间可以从首次满足完全应答的测量标准的时间开始测量，直到客观记录进行性疾病的第一天。在一些实施例中，稳定疾病的持续时间从治疗开始直到满足进展标准来测量，以自治疗开始以来记录的最小测量值(包括基线测量值)作为参考。

在其它实施例中，本发明的方法导致提高的总存活率。例如，可以从登记日期到死亡时间计算总存活率。在最终疗效分析的数据截止之前仍存活或在研究结束前退出的患者将在他们最后已知存活的那天进行审查。

在其它实施例中，本发明的方法导致无进展存活。例如，可以从记录复发的日期(或疾病发展的其它明确指标)或死亡日期(以先发生者为准)开始计算无进展存活。未记录复发且在最终疗效分析数据截止前仍存活或在研究结束前退出的患者将在记录无复发的最后一次放射学证据日期进行审查。

在一些实施例中，本发明的方法导致有益的总应答率，如根据mRECIST的总应答率。在那些实施例中，本发明的方法导致的总体应答是完全应答，其中受试者表现出对靶病变的完全应答、非靶病变的完全应答，并且没有新的病变。在其它实施例中，本发明的方法导致的总体应答是部分应答，其中受试者表现出对靶病变的完全应答、对非靶病变的非完全应答和不完全应答，并且没有新的病变。在其它实施例中，本发明的方法导致的总体应答是部分应答，其中受试者表现出对靶病变的部分应答、对非靶病变的非进行性疾病，并且没有新的病变。在另一实施例中，本发明的方法导致的总体应答是稳定疾病，其中受试者表现出稳定的靶病变疾病、非靶病变的非进行性应答，并且没有新的病变。

在一些实施例中，本发明的方法导致有益的总应答率，如根据iRECIST的总应答率。

根据另一实施例，本发明的方法包括一种用于治疗葡萄膜黑素瘤的肝转移的方法，其中SD-101的施用导致肿瘤负荷的减少。在一些实施例中，肿瘤负荷减少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。

根据另一实施例，本发明的方法包括一种用于治疗葡萄膜黑素瘤的肝转移的方法，其中SD-101的施用导致肿瘤进展的降低。在一些实施例中，肿瘤进展降低约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。

根据另一实施例，本发明的方法包括一种用于治疗葡萄膜黑素瘤的肝转移的方法，其中SD-101的施用重新编程肝MDSC区室以使得能够免疫控制肝转移和/或通过消除MDSC改善对全身性抗PD-1疗法的应答。在一些实施例中，本发明的方法在控制MDSC方面是优异的。在一些实施例中，本发明的方法包括一种用于治疗葡萄膜黑素瘤的肝转移的方法，其中SD-101的施用降低MDSC细胞(CD11b+Gr1+)、单核细胞MDSC(M-MDSC；CD11b+Ly6C+)细胞，或粒细胞的MDSC(G-MDSC；CD11b+LY6G+)细胞的频率。根据另一实施例，本发明的方法增强了M1巨噬细胞。根据另一实施例，本发明的方法减少了M2巨噬细胞。

在另一实施例中，本发明的方法增加了NFκB磷酸化。在另一实施例中，本发明的方法增加了IL-6。在另一实施例中，本发明的方法增加了IL10。在另一实施例中，本发明的方法增加了IL-29。在另一实施例中，本发明的方法增加了IFNα。作为另一实施例，本发明的方法降低了STAT3磷酸化。

本发明将在以下实例中进一步说明和/或展示，这些实例仅出于说明/展示的目的给出并且无论如何不旨在限制本发明。

实例1

在本实例中，假设示例性TRL9激动剂的区域血管内输注将增强对全身性输注CPI的应答性。

在这方面，用TLR9激动剂，即ODN-2395(30μg/小鼠)的区域递送，用或不用CPI(例如抗PD-1抗体)(250μg/小鼠)的腹膜内递送来处理具有确定的MC38-CEA-Luc LM的小鼠。用0.5e6 MC38-CEA-Luc细胞在脾内攻击八至十二周的雄性C57/BL6小鼠一周。通过IVIS测量生物发光，并在D0时将小鼠随机分组，然后在D0、D+3和D+6时经由IP用/不用250μg/小鼠的抗PD1抗体经由PV用30μg/小鼠的ODN2395处理。经由PV用PBS处理的小鼠用作对照。在D+2、D+4、D+7、D+10和D+12监测肿瘤进展。

图2A至2B示出了示例性TLR9激动剂和CPI的组合对肿瘤进展的影响。如图所示，与抗PD-1(p<0.01)或对照(例如PBS)处理(p<0.05)相比，组合处理对LM生长的控制显著更高。在图2A中，PBS(PV)、ODN 30μg(PV)、抗PD-1 250μg(IP)+PBS(PV)和抗PD-1 250μg(IP)+ODN30μg(PV)示出在图中(从左到右，PBS最接近Y轴)。在图2B中，在D+2、D+4、D+7、D+10和D+12通过IVIS成像监测肿瘤生长。通过双因素ANOVA，随后通过Tukey事后检验分析肿瘤进展。在该图中，显示了对照、抗PD-1、ODN和抗PD-1+ODN随时间的相对于D0的变化倍数，其中对照示出相对于D0的最大变化倍数，抗PD-1+ODN示出最小变化倍数。

为了研究TLR9活化对人MDSC(hu-MDSC)的影响，用ODN-2395或SD-101处理健康供体外周血单核细胞(PBMC)。如图3A至3D所示，通过流式细胞术(FC)分析测定，发现两者都以非线性剂量依赖性的方式减少了hu-MDSC(CD11b+CD33+HLADR-)群体，并增加了PD-L1的表达。在这项研究中，从白细胞减少库系统(LRS)室分离人PBMC。1e6/ml PBMC用递增浓度(0.04至10μM)的SD-101、ODN2395和对照ODN5328(1μM)处理48小时。在图3A中，示出了用于MDSC和PD-L1表达的表型分析的门控策略。在图3B至3C，评估了MDSC群体及其相应的PD-L1表达。使用具有三次重复的四个供体，并且数据表示为平均值±SEM。在图3D中，通过FC评估(a)CD4、(b)、CD8(c)和CD69。使用具有三次重复的三个供体。这些图证明用ODN2395或SD-101刺激TLR9抑制PBMC生成MDSC。

此外，通过使用Luminex，证明ODN-2395和SD-101增强IL-29、IFNα和NFκB以及下游细胞因子IL-6和IL-10的表达。在图4A至4D，人PBMC用递增剂量的(0.04至10μM)的SD-101(左框)、(0.04至3μM)ODN2395(右框)和对照ODN5328(1μM)处理48小时。使用Luminex分析来分析细胞上清液中的IL-29(图4A)、IFNα(图4B)、IL-6(图4C)和IL-10(图4D)。使用两个供体和两个复制品。NT、对照ODN和增加的剂量(0.04至3μM)在每组的X轴上从左至右示出。图3A至3D示出了用ODN2395或SD-101刺激TLR9增强NFκB和IFNα调节的细胞因子产生。

此外，为了研究SD-101在调节hu-MDSC从人PBMC分化中的作用，在SD-101存在或不存在的情况下用IL6+GM-CSF处理人PBMC，如图5A至5D所示。在这项研究中，用20ng/ml的IL6和GM-CSF在有/没有0.3μM SD-101的情况下，间歇地或一次处理人PBMC 7天，持续48小时。在图5A中，示出了MDSC(CD11b+CD33+HLADR-)表型分析的门控策略。在图5B中，示出了处理方案。在图5C中，示出了TLR9A对MDSC及其亚群的影响。在图5D中，在IL6和GM-CSF存在下将PBMC分化成MDSC，并且用/不用0.3μM SD-101处理一次持续48小时，并且在7天后，进行FC以监测MDSC群体(八个供体)。数据表示为平均值±SEM。在这方面，通过使用FC分析，发现SD-101阻断由IL6+GM-CSF诱导的hu-MDSC发育，优先限制更具免疫抑制性的单核细胞MDSC亚型，并且还驱动M1巨噬细胞极化。此外，SD-101处理48小时仅一次就足以抑制hu-MDSC分化两周。因此，显示用SD-101刺激TLR9抑制人MDSC编程。

总之，TLR9刺激增强了检查点疗法在鼠模型中控制肝转移的能力。TLR9激动剂抑制PBMC衍生的MDSC并增强MDSC PD-L1表达而不影响T细胞群体。ODN2395和SD-101以双相方式调节IFNα、IL29(IFNα依赖性细胞因子)、IL6和IL10(NFκB依赖性细胞因子)的产生。SD-101抑制MDSC编程并且单次处理足以引起这种抑制作用。

因此，体外和体内的研究结果均表明，LM模型中的区域TLR9刺激通过消除MDSC改善了对全身性抗PD-1疗法的应答性，其中对血液hu-MDSC的作用在体外得到证实。此外，MDSC中应答TLR9刺激而增加的PD-L1表达进一步增强抗PD-1作用。因此，将TLR9激动剂的区域输注与全身性抗PD-1药剂组合通过抑制MDSC编程来改善对抗PD-1疗法的应答性可用于治疗肝肿瘤和提供肝内免疫抑制。

实例2

在本实例中，假设TRL9激动剂的区域血管内输注将重新编程肝脏MDSC区室，以实现肝转移瘤(LM)的免疫控制。评估C类TLR9激动剂(例如ODN-2395)在抑制LM进展及其对肝脏MDSC群体的影响中的作用。具体地，将ODN-2395的区域血管内输注与ODN-2395的全身性递送在控制LM进展和对肝脏MDSC群体大小的影响方面进行比较。

经由脾内途径用2.5e6 MC38-CEA-Luc细胞攻击C57/BL6小鼠。一周后，经由门静脉(PV：区域)用1、3、10或30μg的ODN-2395处理小鼠，或通过尾静脉(TV)用30μg静脉内(全身性)处理小鼠。通过鼠门静脉施用药剂导致对动物肝脏的区域施用。在ODN施用后24和48小时，通过评估生物发光来测量肿瘤负荷。分离CD45+细胞，并进行FACS分析以定量MDSC、单核细胞MDSC(M-MDSC)和M1-巨噬细胞亚群以及TLR9下游的信号事件。

图6示出了用于开发LM和治疗方案的图解/方法。经由脾内途径用2.5e6 MC38-CEA-Luc细胞攻击八至十二周龄雄性C57/BL6小鼠，使其生长一周。通过IVIS测定生物发光值，并相应地将小鼠随机分组并用1、3、10、30μg/小鼠的ODN-2395经由PV和30μg/小鼠的ODN-2395经由TV处理。对于随后的处理后D+2的研究，处死小鼠，采集肝脏以分离CD45⁺细胞。然后评估分离的CD45⁺NPC的MDSC和巨噬细胞。

图7A至7B示出了ODN-2395对肿瘤进展的影响。具体地，图7A描绘了1、3、10、30μg/小鼠的ODN-2395经由PV和30μg/小鼠的ODN-2395经由TV在处理当天(第0天)、第1天和第2天的肿瘤生长/负荷。通过双因素ANOVA，随后通过Tukey事后检验(*p<0.05)分析肿瘤进展。此外，图7B描述了经由PV和TV通过30μg ODN2395处理的肿瘤负荷的生物发光和P值。如图7A至7B所示，经由PV施用的30μg ODN-2395(与TV相比)显著减少了肿瘤负荷(p<0.01)。

图8A至8D示出了ODN-2395对LM中MDSC群体的影响。在这方面，图8A示出了通过FACS分析从LM分离的CD45⁺细胞的门控策略。此外，图8B、8C和8D分别示出了对经由PV的1、3、10、30μg/小鼠的ODN-2395和经由TV的30μg/小鼠的ODN-2395测量的MDSC细胞(CD11b+Gr1+)、单核细胞MDSC(M-MDSC；CD11b+Ly6C+)细胞和粒细胞MDSC(G-MDSC；CD11b+LY6G+)细胞。如图8B和8C所示，与经由TV接受30μg ODN-2395的小鼠相比，经由PV的30μg ODN-2395在控制MDSC和M-MDSC方面更为优越，表明增加的肿瘤抑制性TME，其可以有利地被ODN-2395重编程，特别是当经由PV递送30μg ODN-2395时。

图9A至9C示出了ODN-2395对LM中M1-和M2-巨噬细胞群体的影响。在这方面，图9A示出了用于分析从LM分离的CD45+细胞的M1-和M2-巨噬细胞的门控策略。具体地，示出了表型分析。图9B和9C示出了对经由PV的1、3、10、30μg/小鼠的ODN-2395和经由TV的30μg/小鼠的ODN-2395测量的M1-巨噬细胞细胞群体(F4/80⁺CD38⁺EGR2^-)和M2-巨噬细胞细胞群体(F4/80⁺CD38^-EGR2⁺)。在这方面，与经由TV接受30μg相比，经由PV接受ODN-2395的小鼠具有显著增加的M1巨噬细胞群体和减少的M2群体。这一数据表明除MDSC外，ODN-2395，特别是经由PV的30μg，极化的CD11b+F4/80+单核细胞朝向促炎性/抗肿瘤发生性M1巨噬细胞和减少的促血管生成性M2群体。

图10A至10B示出了ODN-2395对NFκB信号传导的影响。具体地，图10A示出了通过PV和TV的30μg ODN2395的pNFκB(p65^S536)、总NFκB、pSTAT3^Y705、STAT3和IL-6的蛋白质印迹，其中GAPDH用作蛋白质对照。此外，图10B描述了通过PV和TV的30μg ODN-2395的光密度分析。在这方面，与TV注射相比，30μg ODN-2395在经由PV输注时增加NFκB磷酸化，伴随着LM中IL-6的增加和STAT3磷酸化的减少。

图11A至11B示出了ODN-2395浓度对NFκB信号活性的影响，其中，在基于报告子的测定中，HEK293-蓝细胞用ODN-2395和SD-101以增加的剂量(0.004至10μM)处理21小时。这样做是为了评估ODN-2395在经由TLR9活化NFκB信号传导中的剂量依赖性作用。在这方面，图11A中的释放分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)通过测量650nm处的吸光度来确定。此外，图11B描述了氯喹(Chq)对NFκB信号活性的影响。在这方面，将细胞用氯喹(1μg/ml)预处理45分钟，然后添加增加浓度(0.012至3μM)的ODN-2395 21小时，并测量650nm处的吸光度。图11B描述了用TNFα处理的细胞在650nm处的吸光度，其中有/没有Chq预处理。如图11B所示，氯喹抑制TLR9激动剂介导的NFκB活化，表明ODN-2395通过与TLR9相互作用活化NFκB途径。

鉴于上述，确定30μg ODN-2395的体内PV递送减少了肿瘤负荷；降低了MDSC频率(主要是免疫抑制性更强的M-MDSC亚群)；以及增强了促炎性/抗肿瘤发生性M1巨噬细胞，伴随免疫抑制性M2巨噬细胞的减少。此外，在分子水平上，ODN-2395增加了NFκB的磷酸化以及IL6表达并降低了STAT3的磷酸化。另外，体外SEAP测定证实ODN-2395介导的NFκB活化是TLR9依赖性的。

总之，在24小时时，经由PV施用的30μg ODN-2395在减少肿瘤负荷方面更有效(与TV相比)并且持续长达48小时。ODN-2395的区域递送也降低了MDSC的频率，主要是LM中免疫抑制性更强的M-MDSC亚群。此外，ODN-2395的区域递送还增强了促炎性/抗肿瘤发生性M1巨噬细胞。另外，使用NFκB依赖性可溶性碱性磷酸酶测定(例如SEAP)，确定ODN-2395剂量依赖性地增强NFκB转录因子活性(p<0.001)。此外，肿瘤裂解物的蛋白质印迹数据表明，相对于IV，通过PV递送ODN显著增加了NFκB(pP65)活性和IL-6的产生，并降低了STAT3活性。

实例3

在本实例中，对家猪进行SD-101HAI/PEDD一般毒理学研究。本研究使用导管进行直接肝动脉给药，剂量为0(媒介物)，体积为10mL/kg/天。待评估的剂量为0(媒介物)、2、4和8mg SD-101。在第0、7和14天对2只猪/组进行三次SD-101给药，在第15天进行尸检。在整个研究中进行标准评估，包括临床观察、体重和食物消耗。在给药期之前和第二次和第三次给药SD-101之后进行完整的兽医身体检查。

在第0天和第14天收集用于毒代动力学(TK)分析的系列血液样品(和至多2种代谢物)，用于计算SD-101暴露和处置。在这些天的同一天还采集了样品，以便进行可能的抗药物抗体(ADA)分析。在预处理和第0天(给药前)和第14天收集血清样品用于细胞因子分析。在预处理和尸检前进行全面的血液学、临床化学和凝血检测。确定以下器官重量，并进行显微镜组织病理学检查：肝脏(4叶)、肺、脾、胸腺、肾脏、心脏、淋巴结(引流和非引流)、肠相关淋巴组织、骨髓、大脑和大体病变。在肝脏(4个叶)、肺、脾、胸腺、肾脏、心脏、淋巴结(引流和非引流)、肠相关淋巴组织、骨髓、大脑和大体病变中测定SD-101和至多2种代谢物的组织水平。在本研究的所有猪中，没有证据表明将SD-101输注到肝动脉后会产生肝毒性。

除上述之外，还进行了一项重复研究，其中动物接受单次给药0、0.5、4或8mg剂量的SD-101。与前期研究一致，未观察到与治疗相关的不良反应。重要的是，血清药代动力学分析表明，猪HAI后SD-101的全身水平比皮下注射后灵长类研究中观察到的低100倍。

实例4

在本实例中，研究了经由PEDD/HAI(例如使用输注系统)施用TLR9激动剂与经由针注射施用TLR9激动剂之间的比较。具体地，该研究集中于施用途径(经由针注射直接注射入肝组织与局部区域PEDD输注)对荧光标记的Toll样受体9(TLR9)C类激动剂SD-101(Cy5.5-SD-101)和工具分子寡脱氧核苷酸(ODN)2395寡聚物(IRD800-ODN 2395)的肝内定位。

为了评估PEDD装置对治疗分布的影响，基于肝脏脉管系统、细胞结构和内部器官结构相对于人肝脏的相似性选择猪模型。猪模型已被广泛用于研究治疗剂的局部递送。肝脏血管解剖结构与PEDD装置(直径1.5至3.5mm)的尺寸范围指示兼容。

这项研究是对8至11周龄雌性约克夏杂交猪进行的，体重范围为45至65kg。

合成TLR9激动剂SD-101序列寡聚物并将其与Cy5.5(ex.685nm，em.706nm)荧光团缀合。

合成TLR9激动剂ODN 2395序列寡聚物并将其与IRDye800(ex.791nm，em.809nm)荧光团缀合。

研究设计

总共选择8只健康雌性猪用于研究。第一队列动物(n＝4)经由HAI用PEDD装置(目录号TNV-21120-35)接受IRD800-ODN 2395，随后针注射Cy5.5-SD-101。第二队列动物(n＝4)经由HAI用PEDD装置接受Cy5.5-SD-101，随后针注射IRD800-ODN 2395。

针注射

在超声引导下，将一根21号、15cm长的经皮进入针插入到肝脏的右外侧或右内侧叶中。然后用手以0.3至0.6mL/秒的速率注射3mL体积的寡聚物溶液。该速率和体积与使用针注射治疗剂到肿瘤中的临床实践一致。

HAI

使用输注系统进行HAI。/>是一种配备有单向阀的单腔导管，可动态响应局部压力变化，例如由心动周期引起或由输注生成的局部压力变化。阀结构调节远端血管压力和血流。这又可能由于脉管系统内的接触时间增加而改变治疗分布和首过吸收。

使用Seldinger技术通过股动脉进入。在该部位固定了一根5F导管鞘。使用5F血管造影导管进行血管造影以鉴定肝动脉解剖结构。然后选择为左内侧和/或左外侧叶供血的直径为1.5-至3.5-mm的血管(平均2.59mm±0.21mm SE)。追踪输注系统进入靶血管位置。使用连接至Quantien压力监测器的有创血压(IBP)换能器测量通过输注系统内腔(微阀远端)和通过血管造影导管内腔(微阀近端)的压力。然后将10mL治疗注射器放入注射泵中，并通过/>装置以2ml/分钟的速率输注溶液，总持续时间为5分钟。

血液样品收集

手术和治疗对肝酶(丙氨酸转氨酶[ALT]和天冬氨酸转氨酶[AST])的影响并进行评估。在干预前、装置置入靶血管后，HAI后即刻(t＝0)抽血，其后每10分钟抽血一次，共90分钟。

组织制备

在输注和收集血液样品后处死动物并取出肝脏。分离肝脏的每个叶，并使用PearlTrilogy成像系统进行近IR成像以鉴定药物摄取的模式。然后将每个叶切成1cm厚的切片(图12)，并使用Pearl系统在两个组织面上分别成像(85μm分辨率，700nm，800nm和白光通道)。对整个肝脏体积进行分析，以确定组织内是否存在ODN工具化合物。

治疗信号定量

由Pearl成像系统产生的组织图像由单独的700nm和800nm荧光通道组成。在图像中，对于背景样品制备板、正常未处理的肝组织和处理的肝组织观察到不同的发射强度水平。开发了定制设计的MATLAB图形用户界面(GUI)来鉴定这些离散的信号区域(图13A和13B)。对取自每只动物肝脏未处理区域的切片(n＝3)进行成像以产生像素发光强度值的直方图。确定与样品制备板相关的像素强度的“低”强度(I)值极限。在未处理的非靶组织中测量的最大像素强度处确定“高”强度值极限。取低(n＝3)和高(n＝3)测量值的平均值，以确定组织阈值。然后基于阈值处理组织切片。

对于700nm(Cy5.5-SD-101)和800nm(IRD800-ODN 2395)工具化合物，建立了由大于“高”阈值的像素强度鉴定的处理靶组织产生的信号。通过对满足这些标准的像素的lu求和来计算以发光单位(lu)计的总信号强度。这产生的数据与针对针注射(对于IRD800-ODN2395，n＝4，对于Cy5.5-SD-101，n＝4，总共n＝8次测量)和HA输注(对于IRD800-ODN2395，n＝4，对于Cy5.5-SD-101，n＝4，总共n＝8次测量)观察到的信号相关。确定每个切片两侧的平均lu。然后计算每个受试者的所有切片的这些测量值的总和，然后在95％置信区间下使用双样品等效性检验比较两种输注方法的总lu。

通过取每个切片两侧的显示强度大于“高”阈值的像素数的平均值来计算覆盖体积。然后将该值转换成所有组织切片的组织体积(85μm x 85μm像素x 1cm切片深度)(针注射(对于IRD800-ODN2395，n＝4，对于Cy5.5-SD-101，n＝4，总共n＝8次测量)和HAI(对于IRD800-ODN2395，n＝4，对于Cy5.5-SD-101，n＝4，总共n＝8次测量))。然后在95％置信区间下使用双样品等效性检验比较两种输注方法的组织体积。

结果

组织成像

当使用PEDD装置(图14B和图15B)在局部动脉网络中递送治疗时，肝组织的近红外成像显示标记的ODN分布模式相对于针注射(图14A和图15A)的明显差异。

治疗剂递送

对每个ODN在肝组织中记录的总信号进行分析。使用PEDD装置(n＝4，46483±4285lu SE)输注时，标记ODN 2395测得的信号强度显著大于通过针注射(n＝4，16438±4793lu SE)(p＝0.003)(图16A)。由于动物之间较高的可变性，标记SD-101(n＝4，51511±21267lu SE)的信号强度与针注射(n＝4，22112±12648lu SE)(p＝0.15)没有显著差异(图16A)。通过PEDD递送的两种ODN的组合信号强度(n＝8，48997±10088lu SE)显著大于通过针注射递送的ODN的组合信号强度(n＝8，19275±6352lu SE)(p＝0.015)(图16B)。

治疗覆盖率

对每个ODN在肝组织中记录的总信号进行分析。使用PEDD装置(n＝4，159.2±36.6cm³ SE)输注时，标记ODN 2395测得的组织覆盖率显著高于通过针注射(n＝4，15.7±3.3cm³ SE)(p＝0.015)(图17A)。标记的SD-101的组织覆盖率(n＝4，38.8±10.9cm³ SE)也显著大于针注射(n＝4，11.3±4.7cm³ SE)(p＝0.04)(图17A)。通过PEDD递送的两种化合物的组合信号强度(n＝8，99.0±28.8cm³ SE)显著大于通过针注射递送的两种化合物的组合信号强度(n＝8，13.5±2.9cm³ SE)(p＝0.011)(图17B)。

肝酶水平

使用Minitab软件(伊利诺伊州芝加哥Minitab公司(Minitab LLC,Chicago,IL))进行配对t检验以确定AST或ALT水平相对于术前基线水平是否发生显著变化。在血液收集过程中没有观察到AST或ALT的显著变化(表2和图18)。

表2

ALT＝丙氨酸转氨酶；AST＝天冬氨酸转氨酶；SEM＝平均值的标准误差。^a然后使用t-检验比较两种输注方法的组织体积。

本研究的结果进一步强化了直接注射的局限性。在肝脏内注射的治疗剂在组织内表现出相对有限的扩散，通常局限于一至两个1cm厚的肝脏部分。这种分布模式不足以治疗多灶性弥漫性疾病。

PEDD提供了一种替代的治疗递送模式。PEDD使用配备有单向微型阀结构的导管系统进行。当放置在血流中时，阀物理地调节血流和压力。在装置放置后保留向前的血流，允许治疗剂向下游迁移到靶血管网络中。在输注期间，可以在动脉网络内局部生成压力，而没有回流到非靶组织中的风险。

在本研究中，使用PEDD装置处理正常猪肝组织，目的是定量标记ODN序列的分布和组织摄取。使用肝组织的1cm切片的定量近IR成像，对暴露于并保留标记化合物的组织的全部体积进行定量。PEDD输注后暴露于ODN的组织体积比通过针注射暴露的组织体积大7倍以上(分别为99.0±28.8cm3 SE与13.5±2.9cm3)。出乎意料地，总发光强度(治疗摄取的量度)在PEDD治疗的组织中也显著更高(48997±10088lu SE PED与19275±6352lu SE针注射，增加2.5倍)。

预期直接针注射将全部体积的治疗剂递送至靶组织中，从而提高递送效率。然而，观察到相对于PEDD明显更低的发光强度。这可能与称为回流的现象有关，当输注液围绕针移动并从针道流出时会导致回流。有几个因素会影响这种现象的严重程度，如针插入速率、插入角度、输注速率、针直径和组织压力。回流与注射到肿瘤中的治疗剂的疗效降低有关。我们假设输注的ODN体积的大部分经历了通过针道进入腹部的回流，导致较低的组织滞留。

PEDD装置物理调节血流和局部血管压力，可能促成研究中观察到的高水平ODN滞留。在初始放置时，装置诱发的压力梯度从阀近端的96.8mmHg±6.2mmHg SE到阀远端的57.6mmHg±8.3mmHg SE(n＝8测量值)。压力的降低也会导致较慢的血流速度。在输注期间，治疗剂可能经历与组织更长的接触时间，从而导致强烈吸收。

与传统导管系统相比，PEDD装置的使用导致肿瘤组织中显著更多的MAA沉积，而显著减少向正常组织的递送。本研究中治疗的正常猪肝可能对PEDD装置诱导的压力梯度有应答，导致一定程度的血流改向。

然而，在当前模型中不存在肿瘤组织，因此未观察到患病组织状态的血流差异。

在输注标记的ODN后90分钟的过程中进行AST和ALT测量。这一持续时间已被证明足以辨别施用已知肝毒素(如四氯化碳)后酶水平的显著升高。尽管本研究中施用的标记寡核苷酸的剂量预计在临床前模型中是亚治疗剂量，但这些结果进一步表明PEDD的施用途径不会导致肝酶的显著升高。在整个研究过程中没有观察到肝脏毒性的迹象。

总之，本研究旨在比较经由传统直接针注射递送近IR标记的ODN与使用导管系统通过PEDD技术输注的情况。目的是定量信号的强度和信号的体积作为药物滞留和组织分布的指标。在这方面，使用PEDD//>的药物递送显著改善了信号强度(药物滞留指数)和暴露于药物的组织体积(药物分布的指数)。这种治疗覆盖率的显著增加可能是治疗弥漫性疾病的关键因素。这样的方法可以允许治疗同时达到宏观和微观转移，否则使用传统针注射治疗将是不切实际的或不可能的。

实例5

本研究的目的是评估施用途径(经由端孔导管与局部区域PEDD输注)对荧光标记的Toll样受体9(TLR9)C类激动剂SD-101(Cy5.5-SD-101和IRDye800CW-SD-101)的肝内定位。

在递送研究的化合物之后，使用近红外(近IR)成像分析肝组织以比较两种递送模式。近IR成像利用相对组织透明度的光谱窗口，并且已经在临床上广泛地用于癌组织的解剖标测和鉴定。实现了治疗分布和浓度的定量全器官分析。

材料和方法

试验动物

这项研究是对8至11周龄雌性约克夏杂交猪进行的，体重范围为45至60kg(伊利诺伊州尤因的Oak Hill遗传学公司(Oak Hill Genetics,Ewing,IL))。

寡核苷酸(ODN)供试品

合成TLR9激动剂SD-101序列寡聚物并将其与IRDye800CW(ex.767nm，em.791)荧光团缀合。

研究设计

总共选择8只健康雌性猪用于研究。所有动物接受两次治疗性输注，第一次输注使用端孔导管进行，随后在第一次输注完成后15分钟用PEDD装置(目录号TNV-21120-35，科罗拉多州威斯敏斯特的TriSalus生命科学公司(TriSalus Life Science,Westminster CO))进行第二次输注。供试品输注顺序交替进行，第一次输注时，四只动物分别通过端孔导管接受Cy5.5-SD-101或IRD800CW-SD-101输注，第二次输注时，四只动物分别通过PEDD导管接受Cy5.5-SD-101或IRD800CW-SD-101输注。

作为本研究设计的一部分，未切换装置顺序。这是由于PEDD输注导致的血管生理学可能的短期(15至30分钟)变化混淆了与端孔导管相关的血液动力学模式，并使血管痉挛的机会最小化，从而阻止了及时进行第二次输注。

供试品制备

将冻干的供试品颗粒重悬于浓度为2.5nmol/ml的不含DNase的纯水中。然后将ODN浓缩物等分到1cc的试管中并在使用前储存在-60至-80℃。

在施用时，将各自的冷冻ODN浓缩物解冻。用9mL无菌盐水溶液稀释ODN浓缩物以产生含有2.5nmol化合物的10mL总体积，并在输注前储存在10mL聚丙烯注射器(加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学公司(BD Bioscience,San Jose,CA))中。选择剂量以提供最佳成像信号，并预测其为亚治疗剂量。使用Pearl Trilogy成像系统(内布拉斯加州林肯的Li-Cor公司(Li-Cor,Lincoln NE))对含有ODN的注射器进行成像，以定量给药前输注液的初始发光强度并确保样品组之间剂量的一致性。

局部肝动脉输注

使用Seldinger技术通过股动脉进入。将5F导管鞘(Pinnacle，新泽西州萨默塞特的泰尔茂株式会社(Terumo Medical Corporation,Somerset,NJ))固定在该部位。使用5F血管造影导管(Glidecath，新泽西州萨默塞特的泰尔茂株式会社)进行血管造影以鉴定肝动脉解剖结构。然后选择为左内侧和/或左外侧叶供血的直径为1.5-至3.5-mm的血管(平均2.98mm±0.13mm SE)。然后跟踪端孔导管至目标位置(各种，0.018"-0.021"ID，(Direxion，Rebar-18，Renegade，马萨诸塞州马尔伯勒的波士顿科学公司(Boston Scientific,Marlborough,MA))，(Excelsior 1018，加利福尼亚州弗里蒙特的史赛克神经介入公司(Stryker Neurovascular,Fremont CA))和(Transit，佛罗里达州迈阿密湖的Cordis公司(Cordis,Miami Lakes,FL)))。

有创血压(IBP)换能器(TruWave PX600，加利福尼亚州尔湾市的爱德华兹生命科学公司(Edwards Lifesciences Corp,Irvine CA))连接到Quantien压力监测器(伊利诺斯州雅培科技园的雅培公司(Abbott.Abbott Park,IL)，用于测量通过输注系统内腔(在远端尖端)和通过血管造影导管内腔(在输注内腔近端)的压力。然后将10mL治疗注射器置于注射泵(NE-1000，纽约法明代尔的新时代泵系统公司(New Era Pump SystemsInc.Farmingdale,NY))中，通过端孔导管以2mL/分钟的速率输注第一份供试品溶液，总持续时间为5分钟。该速率和体积与HA输注的临床实践一致。输注后，使装置在原位保持5分钟，然后取出。

然后将输注系统跟踪至靶血管内完全相同的位置，如血管造影所证实。以与替代颜色通道ODN相同的方式进行第二次输注。输注完成后，使PEDD保持在原位5分钟。

组织制备

取出装置后处死动物，并取出肝脏。分离肝脏的每个叶，并使用Pearl Trilogy成像系统进行近IR成像以鉴定药物摄取的模式。然后如实例4(图12)所述将每个叶切成1cm厚的切片，并使用Pearl系统在两个组织面上分别成像(85μm分辨率，700nm，800nm和白光通道)。对整个肝脏体积进行分析，以确定组织内是否存在ODN工具化合物。

治疗信号定量

根据实例4(图13A至13B)中描述的方法进行治疗信号定量。通过为图像内的每个像素分配坐标来评估输注区域内处理的组织的重叠。对于红色和绿色通道显示高于“高”阈值的信号的像素被认为是两个处理重叠的区域。针对绿色通道信号存在、红色通道信号存在和重叠的绿色和红色信号存在的区域对像素进行定量。

结果

供试品组织吸收

肝脏近IR成像用于定量通过端孔和PEDD装置递送的吸收ODN供试品的信号强度和分布(n＝4/装置/标记ODN)。使用Minitab软件(伊利诺伊州芝加哥的Minitab公司)中的双样品学生t检验对数据进行分析。当通过PEDD递送时，两种ODN制品显示相同的信号增加趋势(表3)。合并两种ODN制品的信号强度测量值(每个装置n＝8)表明，当通过PEDD递送时信号强度显著增加(图1。p＝0.033)。

表3

图19表示通过端孔导管或PEDD递送后保留在肝组织中的标记ODN的信号强度。

另外，使用端孔装置与PEDD装置处理正常猪肝时，未观察到组织覆盖率存在显著差异(表4)。

表4

尽管递送装置对处理组织的总体积没有显著影响，但标记的ODN在输注之间的分布没有完全一致(表5)。一些动物在两次输注之间的分布模式中表现出高度的同源性(图20A至20C)而其它样品表现出不均匀分布(图21A至21C)。例如，图20A至20C示出了显示来自端孔和PEDD装置输注的高程度信号重叠的组织：(a)图20A示出了使用端孔导管递送的IRD800CW-SD-101的800nm绿色通道分布(b)图20B示出了由PEDD递送的Cy5.5-SD-101的700nm红色通道分布，以及(c)图20C示出了说明与输注装置的分布重叠的合成图像。图21A至20C示出了显示来自端孔和PEDD装置输注的低程度信号重叠的组织：(a)图21A示出了使用端孔导管递送的Cy5.5-SD-101的700nm红色通道分布(b)图21B示出了由PEDD递送的IRD800CW-SD-101的800nm绿色通道分布，以及(c)图21C示出了说明与输注装置的分布重叠的合成图像。图22示出了比较端孔平均处理组织体积、PEDD平均处理组织体积和重叠共同处理组织体积的维恩图解。

表5

压力调制

装置上配备的可扩张微型阀用于调制局部血管压力。单向阀生成局部压力梯度，相对于阀远端的压力，阀近端的存在更高的压力。阀近端平均压力(通过基础导管测量)为87±4mmHg，而远端血管压力显著低于50±7mmHg(p＝0.0001)，表示血管压力降低43％。端孔对血管压力没有显著影响，测得的近端压力为93±6mmHg，远端压力为88±9mmHg。

应注意的是，在本研究中，装置顺序未发生变更，其中首先进行端孔输注，其次进行PEDD输注。指定5分钟的时间段以允许血液中存在的任何标记的ODN循环通过器官，之后将PEDD装置放置在血管内进行第二次输注。该程序通常导致两次输注彼此在15分钟内进行。较长的循环周期可能从组织中洗去一些标记的SD-101，导致PEDD输注相对于端孔输注的信号强度更高。然而，预期这种影响将在比从血管内快速清除物质更长的时间段内发生，这在实验设计的清除期中得到解释。在以前的研究中，使用装置以相同的方式输注Cy5.5-SD-101(n＝4)，然而在器官分析之前允许血液循环至少90分钟。与本研究中受试者经历的5分钟周期相比，经历90分钟长循环周期的受试者的信号强度没有显著差异(分别为51,511±21267lu SE与85,272±16,523(p＝0.265))。

结论

本研究旨在比较经由传统端孔导管输注递送近IR标记的ODN与使用导管系统通过PEDD技术输注的情况。目的是定量信号的强度和信号的体积作为药物滞留和组织分布的指标。

与端孔装置相比，PEDD/的药物递送显著增加了信号强度(药物滞留指数)。这可能与放置/>引起的血管内压力和流量调制有关，从而导致供试品的组织吸收率更高。尽管在相同位置输注，但端孔导管和/>之间的组织覆盖模式也存在差异。血流对血管内局部压力和输注内腔位置的变化很敏感。附接到/>装置的微型阀倾向于使装置的输注内腔在血管内自动居中，同时生成血压和血流的局部下降。/>装置的这些物理特征可能导致本研究中观察到的血流重新分布和相关治疗沉积。

实例6

在该实例中，施用TLR9激动剂SD-101的肝脏定向输注，目的是提高对4期UM的CPI疗法的应答率和改善UM转移性肿瘤，例如肝转移(LM)。在这方面，SD-101可用于治疗所有UMLM病变。此外，通过SD-101与CPI系统输注组合的远端效应，肝外病变也可能受益于增强的免疫应答性。

该研究具有两个阶段，即第1阶段和第1b阶段。在这方面，第1阶段的主要目的是确定单独使用SD-101的PEDD/HAI的最大耐受剂量(MTD)或最佳剂量、SD-101与纳武单抗联合使用的MTD或最佳剂量，以及SD-101与伊匹木单抗和纳武单抗联合使用的MTD或最佳剂量的安全性并对其进行鉴定。此外，次要目的是确定在研究的第1b阶段部分中应该使用单一药剂CPI还是双药剂CPI。关于第1b阶段，主要目的是评估对PEDD/HAI SD-101与全身性(即静脉内(IV))免疫检查点阻断组合的实体瘤应答评估标准(RECIST)v1.1总体应答率(ORR)和12个月总体成功率(OS)(共同主要终点)。此外，次要目的是(i)根据用于免疫治疗的RECIST(iRECIST)ORR、mRECIST ORR、RECIST 1.1肝特异性应答率(HRR)、应答持续时间(DOR)、总体无进展存活PFS和临床受益率(完全应答[CR]+部分应答[PR]+SD)评估疗效以及(ii)评估SD-101与CPI联合的所选MTD或最佳剂量的安全性/毒性。此外，还有探索性目的：(i)评估RECIST v1.1肝特异性无进展存活(HPFS)；(ii)评估SD 101的PEDD/HAI后LM在有或无全身性IV CPI输注的情况下的病理学应答以及与成像应答评分的相关性；(iii)评估PEDD/HAI后SD 101的肝肿瘤及血浆水平；(iv)使用配对的基线和处理中的肝肿瘤和正常肝活检评估处理对髓源性抑制细胞(MDSC)、淋巴细胞和细胞因子谱的肿瘤内免疫效应；(v)使用CTC、循环细胞因子和其它免疫相关因子的连续血液取样评估处理的外周免疫药效学作用；(vi)评估单一药剂SD 101经由PEDD/HAI的远位效应；(vii)评估ECOG PS随时间推移相对于基线的变化；(viii)使用EORTC-QLQ-C30工具评估生活质量相对于基线的变化。

研究的总体设计可参见图23。本研究为开放标签、多中心和非随机研究。

如下文进一步详细描述的，在第1阶段中，入组前哨队列以确定经由PEDD/HAI递送的SD-101的安全性，在患者体内进行两剂量的剂量递增前哨队列患者接受2次输注(间隔2周)，其中第一次输注包括第一剂量水平(0.5mg)，第二次输注包括第二剂量水平(2mg)，在进入试验队列之一之前进行毒性评估。前哨队列中的患者入组错开7天。在不存在剂量限制性毒性(DLT)的情况下，每位患者将有资格在第二次输注时间点转换到剂量水平为1(即队列A，第8天剂量)的队列A。在前哨队列完成后，单独施用递增剂量的SD-101(队列A)，与纳武单抗一起施用(队列B)，以及与组合的伊匹木单抗和纳武单抗一起施用(队列C)。当将CPI添加到SD-101时，队列B和队列C从低于MTD或队列A最佳剂量的一个剂量水平开始优化安全性。队列C在队列B完成后开始。将采用标准3+3剂量递增设计来确定MTD。

在确定PEDD/HAI的SD-101的MTD或最佳剂量以及哪种CPI方案是可耐受的之后，该方法进行到第1b阶段。第1b阶段中的患者接受选自与单一药剂或双药剂检查点阻断组合的第1阶段的SD-101剂量。除了第1阶段中队列B和C的应答率外，第1b阶段中单一或双重CPI治疗联合SD-101的选择可考虑安全性数据。SD-101在两个周期内施用，对于第1阶段队列A、B和C和第1b阶段，每个周期施用三周剂量。对于前哨队列，SD-101将在1个小周期内施用，由间隔2周递送的两次输注组成。在每位患者第一次输注SD-101后，需要留院观察或入院治疗。如果第一次SD-101剂量耐受性良好，则治疗医生可自行决定是否进行进一步的过夜观察或入院治疗，以进行后续的SD-101输注。如果后续输注是在门诊病人的基础上进行的，如果临床情况稳定，则可以在出院回家前将在输注后观察患者至少6小时。如果在第一次输注后出现任何与SD-101PEDD/HAI相关的2级事件需要住院治疗，则可在每次后续SD-101输注后对患者进行过夜观察或入院治疗。

入选标准

根据一个实施例，为了入选研究，患者必须满足以下所有入选标准：

1.筛查时年龄≥18岁的男性或女性

2.能够理解研究并在任何研究程序之前提供书面知情同意书

3.具有组织学或细胞学证实的转移性UM，仅伴有肝脏或肝脏显性疾病。肝脏显性疾病定义为：

a.第1阶段，队列A－相对于其它器官，肝内转移占疾病的最大部分，可允许的肝外部位是肺、皮肤或皮下组织和骨。

b.第1阶段，队列B和C和第1b阶段－相对于其它器官，肝内转移占疾病的最大部分，或如果LM的进展代表对患者生命构成显著威胁。

4.入组前14天内未接受过先前的细胞毒性化疗、靶向治疗或外部放射疗法

5.仅第1阶段：在研究干预的第一剂量前30天内没有接受过先前免疫检查点阻断治疗并且没有进行中的免疫介导的2级或更高级别的AE

仅第1b阶段：从未接受过先前免疫检查点阻断治疗

6.先前从未使用永久性栓塞材料进行栓塞HAI治疗。注：允许在本研究的第1阶段和第1b阶段对少转移性肝病进行事先手术切除或射频消融术。接受消融治疗的肝脏病变不应被视为靶病变，除非自治疗以来有明显进展。

7.无恶性肿瘤的既往史或其它并发的恶性肿瘤，除非恶性肿瘤在临床上不明显，不需要正在进行的治疗，并且患者在临床上是稳定的

8.根据RECIST v.1.1标准，患有可测量的肝脏疾病

9.筛查时ECOG PS为0至1

10.根据研究人员的估计，在筛查时预期寿命>3个月

11.具有QTc间期≤480毫秒

12.在研究治疗给药前，必须缓解(至≤1级或患者的治疗前水平)所有与先前癌症疗法相关的具有临床意义(根据研究人员的判断)的药物相关毒性(允许替代治疗控制的2级脱发和内分泌病)。

13.筛查时具有充足的器官功能，证据如下：

·血小板计数>100,000/μL

·血红蛋白≥8.0g/dL

·白细胞计数(WBC)>2,000/μL

·血清肌酐≤2.0mg/dL，除非测得的肌酐清除率>40mL/分钟/1.73m²

·总胆红素和直接胆红素≤2.0×正常上限(ULN)和碱性磷酸酶≤5×ULN。对于有记录的吉尔伯特病的患者，允许总胆红素高达3.0mg/dL。

·ALT和AST≤5×ULN

·筛查时凝血酶原时间/国际标准化比值(INR)或活化部分凝血活酶时间(aPTT)检测结果≤1.5×ULN(仅适用于未接受抗凝治疗的患者；接受抗凝治疗的患者应在研究干预的首次剂量之前稳定剂量至少4周)

注：研究人员判断排除性结果与患者临床状态不符的实验室测试可以重复一次，以达到合格目的。

14.具有生育能力的女性必须是非妊娠的和非哺乳期女性或绝经后女性，并且在筛查时和在研究干预的第一剂量之前的血清人绒毛膜促性腺激素(hCG)妊娠试验结果为阴性。

·具有生育能力的女性必须同意在整个研究期间避免与男性伴侣发生性行为，或者如果与未绝育的男性伴侣发生性行为，则必须同意从筛查开始使用高效的避孕方法，并同意在最后一剂研究干预后的100天内继续使用此类预防措施。

·与具有生育能力的女性发生性行为的未绝育男性必须同意使用有效的避孕方法，并在整个研究的第1天和最后一剂研究干预后的30天内避免捐献精子。

第1阶段

单独的第1阶段患者队列如下：

前哨队列－使用标准3+3设计的SD-101单一疗法的PEDD/HAI患者体内剂量递增队列，随后在不存在DLT的情况下转换为队列A(参见下文)：

●输注#1(前哨第1天)：0.5mg(n＝3至6)

●输注#2(前哨第15天)：2mg(n＝3至6)

前哨队列中的患者入组错开7天。在前一名患者完成第一次SD-101输注后7天内，没有任何新患者入组。

在每位患者输注#1后，安全审查委员会(SRC)可以会面审查第11天的临床数据，并确定是否可以增加输注#2的剂量。在每位患者输注#2后，SRC可以会面审查第18天的临床数据，在不存在DLT的情况下，并且在SRC确认后，患者有资格过渡到2mg剂量水平的队列A。如果对安全性解释存在分歧，则独立审查员的决定可以确定结果。

队列A－SD-101单一疗法的PEDD/HAI的剂量递增队列(2个周期，1个剂量/周×3周，每个周期)，使用标准3+3设计，随后使用任选的扩展组来鉴定SD-101单独的最大耐受剂量(MTD)或最佳剂量，并估计单一疗法应答率：

●剂量水平1：2mg(n＝3至6)

●剂量水平2：4mg(n＝3至6)

●剂量水平3：8mg(n＝3至6)

每个剂量水平的前2名患者的入组可以错开至少48小时。此外，假设对最多三个剂量水平的SD-101(2、4和8mg)进行研究，队列A中可使用最少19名和最多28名患者。可根据安全性和反应数据增加额外的增量剂量水平(增量为4mg)。在SD-101单一疗法MTD或最佳剂量下十名患者的扩展组可以与队列B同时进行。

队列B－SD-101的PEDD/HAI的标准3+3设计剂量再递增队列(2个周期，1个剂量/周×3周，每个周期)，联合每四周480mg静脉内(IV)纳武单抗(Q4W)，以确定SD-101与单剂纳武单抗的MTD或最佳剂量：

●剂量水平1：考虑到这种组合具有增强肝脏毒性的潜力，纳武单抗与SD-101的PEDD/HAI组合的剂量递增开始于低于来自队列A的MTD或最佳剂量的1个剂量水平(即MTD-1或最佳剂量-1)(n＝3至6)

●剂量水平2：纳武单抗与SD-101的PEDD/HAI在队列A(n＝3至6)的MTD或最佳剂量下联合使用，或如果MTD-1或最佳剂量-1不耐受，可递减至MTD-2或最佳剂量-2

每个剂量水平的前2名患者的入组可以错开至少48小时。假设在队列B中对最多2个剂量水平的SD-101与纳武单抗的联合使用进行研究，则在队列B中需要最少6名和最多12名患者。接受SD-101联合纳武单抗的最多十名患者的任选扩展组可以与队列C同时进行。由10名患者组成的任选队列B1，以队列A(n＝3至6)的MTD或最佳剂量测试单剂伊匹木单抗与SD-101的PEDD/HAI的联合使用；或如果在队列B中不耐受MTD-1或最佳剂量-1，则队列B1递减至MTD-2或最佳剂量-2。鉴于纳武单抗和伊匹木单抗具有不同的作用机制(靶向PD-1对CTLA-4)，如果纳武单抗的生物学活性低，则在进行队列C之前可能需要对单剂伊匹木单抗进行研究。

队列C－SD-101的PEDD/HAI的标准3+3设计剂量再递增研究(2个周期，1个剂量/周×3周，每个周期)，联合全身性IV伊匹木单抗3mg/kg和全身性IV纳武单抗1mg/kg，每三周一次(Q3W)，共四个剂量，随后是纳武单抗480mg全身性IV Q4W，以确定SD-101与双药剂CPI的MTD或最佳剂量：

●剂量水平1：伊匹木单抗和纳武单抗联合SD-101的PEDD/HAI，低于队列B(n＝3至6)的MTD或最佳剂量1个剂量水平

●剂量水平2：伊匹木单抗和纳武单抗与SD-101的PEDD/HAI在队列B(n＝3至6)的SD-101的MTD或最佳剂量下联合使用，或如果MTD-1或最佳剂量-1不耐受，则可递减至MTD-2或最佳剂量-2。

假设对最多2个剂量水平的SD-101(首先是MTD-1或最佳剂量-1，然后是队列B的MTD或最佳剂量，或如果MTD-1/最佳剂量-1是不耐受的，则是MTD-2/最佳剂量-2)进行研究，则在队列C中可能需要最少6名和最多12名患者。每个剂量水平的前2名患者的入组可以错开至少48小时。如果需要额外数据来决定单药剂和双药剂CPI联合经由PEDD/HAI的SD-101进行第1b阶段，则可以入组由10名患者组成的任选扩展队列。

第1b阶段

第1b阶段可以在完成队列B或队列C并由SRC审查数据之后进行。该阶段将根据关于SD-101剂量和CPI方案的决定进行。在第1b阶段中使用两阶段设计以确定在SD-101MTD或最佳剂量+单药剂或双药剂CPI下的应答比例是否足够高以保证进一步测试。

该研究的第1b阶段部分预期多达40名参与者。使用具有最小总样品的两阶段设计(称为Minimax设计；Simon 1989)。在第一阶段，将入组22名患者，并且如果观察到3个或更多个应答，则将第1b阶段队列扩展至总共40名患者以进一步评估疗效。如果在第一阶段观察到2个或更少的应答，将停止该队列的入组。如果应答总数>7，治疗将保证进一步测试。可以在50名患者接受治疗后进行中期分析以评估总体应答率(ORR)。

给药持续时间

SD-101给药的持续时间(第1阶段和第1b阶段的所有参与者)：

前哨队列－最多7剂SD-101(包括过渡到队列A后接受的剂量)

队列A、B、C和第1b阶段－最多6剂(最多2个SD-101周期，每个周期3周剂量)。基于毒性或耐受性，可以施用较少剂量或周期的SD-101。接受至少1次PEDD/HAI剂量的SD-101的所有患者将被认为是可评估的。

CPI给药持续时间

第1阶段、前哨队列和队列A：不适用

第1阶段、队列B和任选扩展队列：长达12个月的纳武单抗480mg Q4W

第1阶段、任选队列B1：全身性IV伊匹木单抗3mg/kg Q3W，4剂

第1阶段、队列C和任选扩展队列：(i)全身性IV纳武单抗1mg/kg Q3W，4剂，然后480mg/kg Q4W长达十二个月，以及(ii)全身性IV伊匹木单抗3mg/kg Q3W，4剂。

第1b阶段：根据第1阶段数据确定的长达12个月的CPI方案

干预施用

干预和计划剂量水平总结在下表6中。

表6

*SD-101的单位剂量强度仅反映SD-101寡聚物。

输注SD-101

SD-101溶液经由肝动脉系统输注，任选地使用输注系统。可以使用股动脉或肱动脉/桡动脉入路。由治疗介入放射学专家的判断，对可能干扰治疗递送的肝中血管瘤、分流血管或其它血管病变进行栓塞。对于SD-101输注程序，在50-mL注射器(治疗剂量)和含有治疗冲洗所需体积(10mL)的100-mL小瓶中制备和递送药物，两者均为治疗浓度，可如下表7所述提供。

表7

*可以根据安全性和应答数据添加

**SD-101的单位剂量强度(13.4mg/mL)仅反映SD-101寡聚物。

根据一个实施例，用于SD-101治疗疗程的过程工作流可以包括以下：(i)通过Seldinger技术经股动脉进入患者脉管系统；(ii)使用压力袋准备肝素化盐水冲洗(除非患者禁忌)；(iii)将肝素化盐水管路附接至基础导管，并确保在整个手术过程中持续冲洗；(iv)将有创血压换能器(IBP)连接到患者监护仪；(v)跟踪装置到目标治疗位置；(vi)附接高压管路并冲洗换能器和管路，确保不存在气泡；(vii)将高压管路附接到输注系统的毂；(viii)允许压力读数稳定并记录平均远端血管压力；(ix)断开高压管路与/>输注系统的连接，并将管路保持在无菌区域，以便进行后续压力测量；(x)将10-mL预充注射器与旋塞阀连接并进行冲洗，直到高压管路完全充满治疗剂，溶液从管路末端流出；(xi)将50-mL注射器连接至高压管路；(xii)将50-mL注射器置于注射泵中；(xiii)输注前，用10-mL预充注射器冲洗旋塞阀远端，直到液体流出旋塞阀；(xiv)将/>输注系统的毂与旋塞阀连接，将旋塞阀旋转到位，从50-mL治疗注射器中进行输注；(xv)将10-mL预充注射器更换为1-mL盐水推注射器；(xvi)用注射泵以2-mL/分钟的速率从50-mL注射器输注计算体积的治疗剂(50-mL/#部位)2分钟(例如4mL体积)；(xvii)将旋塞阀旋转至1-mL注射器，并以2-mL/秒的速率(例如0.5秒的持续时间)手动输注1-mL盐水等分试样，从而在肝动脉输注中生成正压并促进治疗剂摄取到肿瘤中；(xviii)在推注输注之后，旋转旋塞阀以从50-mL注射器继续输注；(xix)以2-mL/分钟的速率输注剩余计算体积的治疗剂；(xx)输注完所需体积(显示在泵上)后，暂停进一步输注，断开高压管路与/>输注系统的连接；(xxi)清除为后续输注准备的登记递送体积；以及(xxii)对于剩余的选择性输注重复步骤(iv)至(xxi)。

在一个实施例中，待施用的50.0mL体积是按肝脏的每个节段或扇区分配的。在一个实施例中，每个节段或扇区的输注体积的计算可以在SD-101输注程序之前(基于程序前MRI或CT扫描)或在与SD-101输注相同的疗程期间(基于上述血管造影术)进行。在一个实施例中，50-mL治疗剂量可以分配如下：将3×10mL输注至右肝叶的靶血管，将2×10mL输注至左肝叶的靶血管。此外，可以基于可测量疾病的位置和靶血管直径调节10-mL等分试样的分布。在另一实施例中，如下计算每节段或扇区的输注体积：(灌注肝脏体积/总肝脏体积)*40+(灌注节段中估计的肿瘤体积/肝脏中估计的总肿瘤体积)*10)。在一个实施例中，为初始SD-101输注程序确定的每个节段或扇区的计划SD-101体积应被用作每个后续SD-101输注程序的计划体积。

肿瘤应答评估

所有患者可以接受磁共振成像(MRI)和正电子发射断层扫描(PET)/计算机断层扫描(CT)进行成像，以评估肝脏和其它部位的疾病程度，以及肝脏活检和循环肿瘤细胞(CTC)和循环细胞因子以及其他免疫相关因子的测定。肿瘤应答可以使用实体瘤中的标准应答评估标准(RECIST)v1.1标准通过放射成像测量。正式应答评分(RECIST v1.1)可以在第84天进行评估。LM应答通过腹部CT或MRI进行评估，而肝外病变将通过全身PET/CT扫描进行评估。在第168天确定最终应答评分，以确保排除假进展并确认初始应答。此后每90天进行一次成像过程。尽可能使用MRI和造影进行肝脏成像评估

可以进行四次肝活检：

●第1阶段前哨队列－在2mg SD-101输注前的第15天和输注后的第15天(对于肿瘤组织中的SD-101水平)获得初始活检

●第1阶段队列A、B和C以及第1b阶段：在第一次输注SD-101前的第1天和输注后的第1天(对于肿瘤组织中的SD-101水平)，在SD-101的第二周期开始时(在SD-101输注#4之前)和在第100天获得基线活检。病理学反应可以根据局部临床试验机构病理学家的审查以及肿瘤样品内坏死和纤维化的评分进行评估。

药代动力学

在PEDD/HAI之后，可以收集血液样品以表征SD-101全身暴露。无法对纳武单抗或伊匹木单抗浓度进行采样或测试。

SD-101的肿瘤水平可以在LM的输注后活检样本中测量，这些标本是为肿瘤反应评估而获得的，并且来自前哨队列的第15天和队列A、B和c的第1天的额外输注后活检。

药效学

可以收集血液样品用于测量CTC、循环细胞因子和其它免疫相关因子，包括IFN-α和IFN-γ相关基因特征，这可能比这类治疗剂的药代动力学评估更能提供信息。

安全性

安全性评估包括不良事件(AE)、临床实验室测试、生命体征、身体检查和心电图(ECG)。

在SD-101周期期间或在第4周期最后一次SD-101剂量后1周内观察到的下列情况被视为DLT，并认为其可归因于研究干预(SD-101或CPI疗法)和/或PEDD装置：

●≥4级细胞因子释放综合征(CRS)

●7天内未恢复至≤2级

●根据美国国家癌症研究所(NCI)不良事件通用术语标准(CTCAE)

●根据NCI CTCAE的3级CRS，在7天内未恢复至≤2级

●根据NCI CTCAE，自身免疫性AE≥3级

●根据NCI CTCAE，过敏反应AE≥3级

●7天内未恢复至≤2级的4级血液学AE

●任何器官系统中根据NCI CTCAE的任何4级AE

在SD-101的任一周期期间出现DLT的患者可以永久停止研究干预，除非提供足够的理由证明替代方法(例如临床上指示的剂量修改)在给定特定DLT的情况下是合理安全的。可以根据临床实践对患者进行治疗并监测毒性的消退。

SD-101和/或CPI治疗可因严重或危及生命的输注相关反应而永久中断。当患者出现3级或更高级别的免疫介导反应时，需要中断、延迟或停止SD-101和/或CPI疗法。当患者满足下述条件之一或出现不符合方案规定的停止规则的异常肝脏化学物质时，如果研究人员认为这对患者最有利，则需要停止用于异常肝脏试验的SD-101和/或CPI疗法。

●患者临床上患有黄疸

●患者有凝血病迹象

●患者具有门静脉高压的临床证据，包括但不限于腹水或静脉曲张出血

在本研究中，所有患者可以在治疗开始后接受至少1年的安全性随访。可在单独的长期随访方案中评估入组研究的所有患者超过1年的总体存活率(OS)。

出于除疾病进展以外的原因(例如毒性、撤回同意书)中止研究治疗的患者可继续每90天进行一次预定的肿瘤评估，直到患者死亡、经历疾病进展(肝内或肝外)或开始进一步全身性癌症疗法(以先发生者为准)。

抢救药物和治疗

研究中心将提供将在当地获得的免疫调节抢救药物。可以使用以下抢救药物：

药物

1.IL 6受体抗体托珠单抗(Tocilizumab)4至8mg/kg全身性IV超过60分钟治疗CRS，可根据临床指示重复

2.全身静脉推注甲泼尼龙2mg/kg，然后每6至12小时静脉推注0.5mg/kg治疗CRS等级>2或神经功能障碍。第一剂可以在不咨询研究人员或指定人员的情况下给予；然而，后续剂量必须在咨询研究人员或指定人员后给予。

3.考虑1至2剂抗TNFα药剂(英利昔单抗(infliximab)或依那西普(etanercept))。这些益处是未知的，但是由于TNFα可能急剧升高，因此值得在疾病过程的早期考虑。

4.依那西普25mg SC，每周两次，共2剂，间隔3至4天(0.4mg/kg，每周两次，最多25mg/剂

5.英利昔单抗剂量10mg/kg全身性IV每周×2剂

干预

1.内镜胆管造影术和支架置入

2.经皮胆管造影术和支架置入

尽管在研究期间的任何时间都允许使用抢救药物，但是如果可能和临床上合适的话，应该在进行研究干预后延迟使用抢救药物至少6小时。必须记录抢救药物给药的日期和时间，以及抢救药物的名称和给药方案。

明显归因于疾病进展、与研究药物无关或预期用于研究的合格患者群体的不良事件不被认为是DLT。

细胞因子释放综合征的评估

研究人员或指定人员将评估每位患者是否存在严重CRS。CRS分级将基于NCICTCAE v5.0确定。

成像

将在前哨队列、队列A、队列B和队列C的时间点通过X线片测量疾病程度。筛查评估必须包括腹部和骨盆的MRI(口服/全身性IV Eovist造影剂，除非有禁忌症)和脑扫描(全身性IV造影剂或MRI的CT)。除腹部和骨盆的MRI外，还应获得胸部的螺旋CT扫描。如果MRI在医学上是禁忌的或由医生自行决定，则可使用三期全身IV造影对胸部，腹部和骨盆进行CT扫描。如果进行PET/CT扫描，研究的CT部分必须与全对比度CT扫描的标准一致。尽可能使用MRI和Eovist造影剂进行肝脏成像以评估LM，同时使用PET/CT评估肝脏外疾病。在整个研究过程中必须使用与筛查相同的成像方法。

任何可评估或可测量的疾病必须在筛查时记录并在每次随后的肿瘤评估时重新评估。对于可测量疾病的患者，将根据RECIST v1.1评估应答。局部成像读数将用于第1阶段期间的应答评估。在第1b阶段期间，可以进行应答评估的独立中心评审(ICR)。

根据研究人员的判断，如果怀疑PD，可以在任何时间进行成像。另外，将对次要终点数据集进行mRECIST和iRECIST评估，但不纳入正式应答评分。

ECOG体力状态

ECOG PS量表将用于评估疾病如何影响患者的日常生活活动和照顾自己的能力。在每个指定时间点，合格的临床试验机构人员将按照以下量表对患者进行评级：

0.完全活跃，能够不受限制地进行所有病前活动

1.体力活动受限，但能走动，能从事轻度或久坐的工作，如轻度家务劳动、办公室工作

2.能走动，能够完全自理，但不能进行任何工作活动；起身并超过50％的清醒时间

3.只能有限的自理能力；超过50％的清醒时间限制在床上或椅子上

4.完全丧失功能；不能进行任何自理；完全限制在床上或椅子上

5.死亡

除非在AE的无指导提问过程中报告，否则不会将变更(即恶化)记录为AE。

RECIST v1.1定义

可测量疾病－至少存在1个可测量病变。如果可测量疾病限于孤立性病变，则应通过细胞学/组织学证实其肿瘤性质。

可测量病变－可在至少1个维度上精确测量的病变，最长直径≥10mm(CT扫描切片厚度≤5mm)。

不可测量的病变－所有其它病变，包括小病变(最长直径<10mm)，以及真正不可测量的病变(如软脑膜疾病、腹水、胸膜/心包积液、炎性乳腺疾病、皮肤或肺部淋巴管受累、无法通过可再现成像技术测量的腹部肿块)。

基线记录

所有可测量病变最多每个器官2处病变，共5处病变，代表所有受累器官，应确定为靶病变，并在基线时记录和测量。

应根据靶病变的大小(直径最长的病变)和通过一致成像技术进行准确重复测量的适用性选择靶病变。

计算所有靶病变(非结节)的最长直径(LD)总和，并报告为基线LD总和。基线LD总和将用作参考，用于在疾病的可测量维度上表征客观的肿瘤反应。

所有其它病变(或疾病部位)应确定为非靶病变，并在基线时记录。无需对这些病变进行测量，但在整个随访过程中应注意是否存在这些病变。

评估靶病变

完全应答(CR)：所有靶病变消失

部分应答(PR)：靶病变的LD总和至少减少30％，以基线LD总和作为参考。

进行性疾病(PD)：靶病灶LD总和至少增加20％，以自治疗开始或出现1个或多个新病灶以来记录的最小LD总和作为参考。总和必须显示在5mm上的绝对增加。

稳定疾病(SD)：既没有足够的收缩来证明PR合格，也没有足够的增加来证明PD合格，以自治疗开始以来的最小总和LD作为参考。

评估非靶病变

完全应答(CR)：所有非靶病变消失

非CR/非PD：一个或多个非靶病变的持续性

进行性疾病(PD)：现有非靶病变的明确进展，和/或一个或多个新病变的出现。

根据以下评估RECIST 1.1中完全应答、部分应答和稳定疾病方面的总体存活率：

表8

总应答持续时间

总体应答的持续时间从CR或PR满足测量标准的时间(以先记录者为准)开始测量，指定客观地记录复发性或PD的第一天(将自治疗开始以来记录的最小测量值作为PD的参考)。总CR的持续时间从首次满足CR的测量标准的时间开始测量，直到客观记录PD的第一天。SD持续时间：稳定疾病从治疗开始直到满足进展标准进行测量，以自治疗开始以来记录的最小测量值总和(包括基线测量值)作为参考。

总体存活率

对于所有患者，将从入组日期到死亡时间计算OS。在最终疗效分析的数据截止之前仍存活或在研究结束前退出的患者将在他们最后已知存活的那天进行审查。

无进展存活率

对于所有患者，将从入组日期到记录复发(或疾病发展的其它明确指标)的CT扫描时间或死亡日期(以先发生者为准)开始计算PFS。未记录复发且在最终疗效分析数据截止前仍存活或在研究结束前退出的患者将在记录无复发的最后一次放射学证据日期进行审查。

改良RECIST(mRECIST)

肝细胞癌的mRECIST定义如下：

完全应答(CR)＝所有靶病变中瘤内动脉增强消失

部分应答(PR)＝活(动脉期增强)靶病变的直径总和至少减少30％，以靶病变的直径基线总和为参考

稳定疾病(SD)＝任何不符合PR或进行性疾病的病例

进行性疾病(PD)＝活(增强)靶病变的直径总和增加至少20％，以自治疗开始以来记录的活(增强)靶病变的直径最小总和作为参考

根据以下评估mRECIST中完全应答、部分应答和稳定疾病方面的总体存活率：

表9

缩写：CR＝完全应答；PR＝部分应答；IR＝不完全应答；SD＝稳定疾病；PD＝进行性疾病。

来源：Lencioni R,Llovet JM.《肝细胞癌的改良RECIST(mRECIST)评估(ModifiedRECIST(mRECIST)assessment for hepatocellular carcinoma)》《肝病论文集(Sem LiverDis.)》2010；30:52-60。

基于免疫疗法的RECIST 1.1(iRECIST)

还将通过iRECIST评估应答。简而言之，RECIST和iRECIST之间的主要差异在Seymour等人2017中解释如下：“用于确定客观肿瘤应答的原理在很大程度上与RECIST 1.1无变化，而iRECIST的主要变化是如果在下一次肿瘤收缩评估中遵循RECIST 1.1进展，则‘重置标准’的概念。iRECIST基于RECIST 1.1原则定义iUPD；但iUPD需要确认；确认是基于观察到首先鉴定进展的病变类别(即靶、非靶疾病)中的大小(或新病变的数量)的进一步增加，或先前未满足RECIST 1.1进展标准的病变类别中的进展(由RECIST 1.1定义)。然而，如果进展没有如上所述得到证实，而是肿瘤收缩(与基线相比)满足iCR、iPR或iSD的标准，则重置该标准，使得iUPD必须再次发生(与最低值相比)，然后在下一次评估时确认(通过进一步生长)待分配的iCPD。如果肿瘤大小/程度与iUPD没有变化，则时间点应答将再次为iUPD。这种方法允许鉴定、进一步理解和更好地表征非典型应答，如在假进展后出现的延迟应答。”

表10

缩写：iCPD＝确认的免疫PD；iCR＝免疫完全应答；iPR＝免疫部分应答；iSD＝免疫稳定疾病；iUPD＝未确认的免疫PD；NL＝新病变；NT＝非靶；PD＝进行性疾病；SOM＝测量总和；TP＝时间点

*应用RECIST 1.1原理。如果没有出现假进展，则CR、PR和SD的RECIST 1.1和iRECIST类别将是相同的。**在任何病变类别中。***之前在本TP之前的评估中鉴定。

来源：Seymour L,Bogaerts J,Perrone A,Ford R,Schwartz LH,Mandrekar S等人《iRECIST：免疫疗法试验中使用的应答标准指南(iRECIST:guidelines for responsecriteria for use in trials testing immunotherapeutics)》《柳叶刀肿瘤学(LancetOncol.)》2017；18(3):E143-E152。

在该实例中，SD-101经由HAI/PEDD向两名人类患者施用。用输注系统将SD-101施用于人类患者。在这方面，对第一名患者施用.5mg剂量的SD-101，对第二名患者施用2.0mg剂量的SD-101。患者的生物样本如下获得：

●第1天－输注前细胞因子、PK、ADA、免疫相关因子

●第1天－输注后PK(15、30分钟、1、2、4、6小时)

●第8天－细胞因子、免疫相关因子

●第15天－输注前细胞因子、PK、免疫相关因子

●第15天－输注后PK(15、30分钟、1、2、4、6小时)

●第15天－输注前肝活检

●第15天－输注后肝活检

TS-PERIO-01治疗总结

患者101-001完成了前哨队列(SD-101剂量为0.5mg和2mg)，是第一位经由PEDD/HAI接受SD-101的患者。另外，在前哨第15天进行SD-101输注前和输注后的肝活检。在多个时间点收集相关血液样本，包括细胞因子、包括MDSC水平的免疫相关因子、PK和ADA样本。该患者已被安全审查委员会批准在2mg剂量下过渡到队列A。患者未出现任何与SD-101PEDDHAI相关的SAE。

患者101-002完成了前哨队列(0.5mg和2mgSD-101剂量，经由PEDD/HAI)。另外，在前哨第15天进行SD-101输注前和输注后的肝活检。在多个时间点收集相关血液样本，包括细胞因子、包括MDSC水平的免疫相关因子、PK和ADA样本。计划召开一次安全性审查委员会会议，以确定患者是否可以在2mg剂量下过渡到队列A。患者未出现任何与SD-101相关的SAE。

以上仅说明了本公开的原理。鉴于本文的教导，对所描述的实施例的各种修改和变更对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，应当理解，本领域技术人员将能够设计出许多系统、布置和程序，这些系统、布置和程序虽然未在本文中明确示出或描述，但是体现了本公开的原理，并且因此可以在本公开的精神和范围内。本领域普通技术人员应当理解，各种不同的示例性实施例可以彼此一起使用，也可以与其互换使用。另外，包括说明书在内的本公开中使用的某些术语在某些情况下可以同义地使用，包括但不限于例如数据和信息。应当理解，虽然这些词语和/或可以彼此同义的其它词语在本文中可以同义地使用，但是可以存在这样的情况，即这些词语可以不旨在同义地使用。此外，在上述现有技术知识没有明确地通过引用并入本文的程度上，其全文明确地并入本文。所参考的所有出版物通过引用整体并入本文。

序列表

<110> 神火医药公司D.B.A.特萨乐斯生命科学公司

<120> 使用TOLL样受体激动剂的癌症疗法

<130> A372-502

<140>

<141>

<160> 1

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 1

tcgaacgttc gaacgttcga acgttcgaat 30

Claims

1.一种用于治疗葡萄膜黑素瘤的肝转移的方法，其包含向有需要的受试者施用治疗有效量的具有以下结构的toll样受体9激动剂：5'-TCG AAC GTT CGA ACG TTC GAA CGT TCGAAT-3'(SEQ ID NO:1)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述TLR9激动剂通过装置以肝动脉输注(HAI)的方式施用。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述TLR9激动剂通过装置以门静脉输注(PVI)的方式施用。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述TLR9激动剂的治疗有效量以选自由0.5mg、1mg、2mg、4mg或8mg组成的组施用。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述TLR9激动剂能够通过导管装置施用。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述导管装置包含动态应答于局部压力变化的单向阀。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述TLR9激动剂通过所述导管装置经由压力使能药物递送施用。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述TLR9激动剂以约1cc/分钟至约5cc/分钟的输注速率施用。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述TLR9激动剂施用约25分钟的时间段。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述TLR9激动剂与一种或多种检查点抑制剂联合施用，其中所述检查点抑制剂在施用所述TLR9激动剂的同时、之前或之后全身施用。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种检查点抑制剂包括纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)和西米普利单抗(cemiplimab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)和德瓦鲁单抗(durvalumab)和伊匹木单抗(ipilimumab)中的至少一种。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述TLR9激动剂的施用包含给药方案，所述给药方案包含周期，其中所述周期中的一个或多个包含通过肝动脉输注经由导管装置施用所述TLR9激动剂，随后全身性施用检查点抑制剂。

13.根据权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种检查点抑制剂包括纳武单抗、派姆单抗和西米普利单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗和德瓦鲁单抗和伊匹木单抗中的至少一种。