CN116675620A - No供体化合物及其制备方法、药物组合物和应用 - Google Patents

No供体化合物及其制备方法、药物组合物和应用 Download PDF

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CN116675620A CN202210160994.8A CN202210160994A CN116675620A CN 116675620 A CN116675620 A CN 116675620A CN 202210160994 A CN202210160994 A CN 202210160994A CN 116675620 A CN116675620 A CN 116675620A
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Abstract

本发明公开了一类NO供体化合物及其制备方法、药物组合物和应用。该化合物结构如式I。该类NO供体化合物及其药物组合物作为缺氧激活型NO供体，可制备为用于治疗心肌缺氧损伤类疾病的药物，所制备药物在细胞水平和动物水平均可以发挥药效，并且该类化合物合成方法简便，易操作。

Description

NO供体化合物及其制备方法、药物组合物和应用
技术领域
本发明涉及一类NO供体化合物及其制备方法、药物组合物和应用，尤其涉及一类可制备为治疗心肌缺氧损伤类疾病药物的NO供体化合物及其制备方法、药物组合物和应用。
背景技术
冠心病是由冠状动脉器质性狭窄或阻塞造成心肌组织缺血(细胞水平缺氧)引起的心肌损伤，亦称缺血性心脏病。据2020年我国心血管病中心发布的数据报告显示，国内患冠心病等心血管疾病的人数已高达2.9亿。目前冠心病的高发病率和致死率对民众的健康造成了严重的威胁。由于一氧化氮(NO)供体药物可在体内释放外源性NO分子促进血管扩张，因此常用于治疗缺血引起的冠心病。不过现有药物缺乏对缺氧的选择性，不能集中在缺氧部位释放足量的NO，因而带来严重的副作用。
近年来缺氧激活型前药被广泛关注，它可促进活性药物基团在缺氧微环境中选择性的释放，从而降低脱靶毒性。鉴于缺氧是引起心肌损伤的重要因素，将这一设计理念应用于NO供体药物的结构设计中获得缺氧激活型前药，是提高这类药物疗效和减少副作用的有效方法。硝基还原酶(NTR)存在于哺乳动物的心脏、肝、肾、肺、脑组织中，它可在厌氧条件下由NADPH和NADH提供氢催化硝基芳香族化合物还原。因此，硝基芳香族化合物是一种公认的缺氧激活基团，可用于缺氧激活型前药的设计。这是因为缺氧细胞中的NTR可选择性地还原芳环上的硝基，进而通过分子内的电子转移促进前药释放出活性药物基团。由于NTR在缺氧细胞中高表达，可有效促进前药中的活性药物基团在缺氧微环境中集中释放，因此利用硝基芳香族化合物的缺氧激活特性，将其与NO供体结合得到前药，使其在缺氧激活下释放足量的NO，对治疗冠心病等心血管疾病具有重要意义。
发明内容
发明目的：为了解决现有NO供体药物治疗心肌缺氧损伤疗效不佳、副作用大等问题，本发明旨在提供一类可在缺氧微环境中有效改善心肌缺氧损伤的NO供体化合物及其制备方法、药物组合物和应用。
技术方案：作为本发明涉及的第一方面，本发明的NO供体化合物具有式I的结构：
其中：
R1为硝基时，R2为氢、卤素或C1-C4烷基，R3为氢、卤素或C1-C4烷基；
R2为硝基时，R1为氢、卤素或C1-C4烷基，R3为氢、卤素或C1-C4烷基。
本发明将缺氧激活基团硝基芳香族化合物通过连接基团与NO供体分子键联，得到缺氧激活型NO供体化合物。
优选，所述结构中：
R1为硝基，R2为氢、卤素或甲基，R3为氢。
更具体地，所述的NO提供化合物选自以下任一化合物：
作为本发明涉及的第二方面，所述的NO供体化合物的制备方法为将化合物1与化合物2经酰化反应得到化合物I，具体合成步骤如下：
(1)4-羟基(N-甲基)苯胺半硫酸盐与NaNO2在乙酸存在下反应得化合物1；步骤(i)中，反应温度为0℃，溶剂为乙酸(AcOH)，反应时间为3h；
(2)苯甲醇衍生物与二(三氯甲基)碳酸酯(三光气，BTC)在N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)存在下反应得化合物2；步骤(ii)中，反应温度为室温，溶剂为四氢呋喃(THF)，反应时间为5h；
(3)化合物1和化合物2在N,N-二异丙基乙胺存在下反应得产物I；步骤(iii)中，反应温度为室温，溶剂为二氯甲烷(DCM)，反应时间为5h。
其中，R1、R2、R3的定义如前所述。
作为本发明涉及的第三方面，本发明的药物组合物包含所述NO供体化合物以及药学上可接受的载体。
所述NO供体化合物可以添加药学上可接受的载体制成常见的药用制剂，如片剂、胶囊、糖浆、悬浮剂或注射剂，制剂可以加入香料、甜味剂、液体/固体填料、稀释剂等常用药用辅料。
作为本发明涉及的第四方面，本发明的NO供体化合物、药物组合物可制备为治疗心肌缺氧损伤类疾病的药物，上述化合物为缺氧激活型NO供体化合物，用于改善缺氧条件下的心肌细胞活力，具体用于治疗冠心病。上述化合物可在缺氧微环境中的细胞里释放NO，有效改善心肌缺氧损伤。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
(1)该类NO供体化合物、药物组合物可在缺氧条件下有效释放NO，释放量最高达40％以上，并且可以改善心肌细胞的活力，在体内外均可作为缺氧激活型NO供体；
(2)该类NO供体化合物、药物组合物应用广泛，可制备为治疗心肌缺氧损伤类疾病的药物；所述药物在细胞水平和动物水平均可以发挥药效，并且治疗效果更优异；
(3)化合物制备方法简便、易操作。
附图说明
图1a为化合物在常氧条件下对心肌细胞H9c2的活力改善作用；
图1b为化合物在缺氧条件下对心肌细胞H9c2的活力改善作用；
图2为化合物I1在缺氧造模小鼠心脏中的NO释放水平；
图3为小鼠心脏中的mTORC1、TSC2-P蛋白表达水平。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1：N-甲基-N-亚硝基对苯酚(化合物1)的制备
避光条件下向50mL乙酸中加入4-羟基(N-甲基)苯胺半硫酸盐(1.722g,10.0mmol)并超声使之溶解。在冰水浴冷却下向乙酸溶液中滴入溶于10ml水的亚硝酸钠(1.380g,20.0mmol)溶液，滴加完后冰水浴下继续反应3h。反应完后将反应液转移至烧杯中，加入50mL水，用饱和碳酸氢钠水溶液调节pH至7，然后用乙酸乙酯萃取该水溶液，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，旋干得产物1.46g，产率96％。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ9.79(s,1H),7.41(d,J＝8.8Hz,2H),6.89(d,J＝8.8Hz,2H),3.38(s,3H)ppm.
实施例2：氯甲酸对硝基苄酯(化合物2a)的制备
将对硝基苄醇(0.168g,1.1mmol)和BTC(0.296g,1.0mmol)溶于20mL无水四氢呋喃中，在冰水浴冷却下加入N,N-二异丙基乙胺(0.142g,1.1mmol)，在氮气保护下反应30min。然后在室温下反应5h。反应完毕，浓缩反应液，用少量无水四氢呋喃除去多余的光气，加无水二氯甲烷后直接用于下一步反应。
实施例3：4-((甲基亚硝基)氨基)苯基(4-硝基苄基)碳酸酯(化合物I1)的制备
将化合物1(0.152g,1.0mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.258g,2.0mmol)溶于20mL无水二氯甲烷中，在冰水浴冷却下将实施例2中获得的含化合物2a的无水二氯甲烷溶液缓慢滴入上述溶液中。滴完后撤去冰水浴，室温下反应5h。反应液分别用0.5M稀盐酸、水、饱和食盐水各洗涤3次，分出有机相，用无水硫酸钠干燥过夜，然后旋蒸浓缩，得到黄色固体，用乙酸乙酯和石油醚混合溶剂重结晶，得淡黄色晶体285mg，产率86％。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ8.28–8.30(m,2H),7.74–7.76(m,2H),7.70–7.72(m,2H),7.45–7.48(m,2H),5.46(s,2H),3.44(s,3H)ppm.13C NMR(150MHz,DMSO-d6):δ153.15,150.02,147.87,143.07,140.37,129.32,124.15,122.79,121.20,69.03,32.14ppm.HRMS(m/z)(ESI):calcd for C15H14N3O6[M+H]+:332.08,found:332.11.
实施例4：4-((甲基亚硝基)氨基)苯基(2-氯-4-硝基苄基)碳酸酯(化合物I2)的制备
参照实施例2和3所述方法，采用2-氯-4-硝基苄醇为原料，得到化合物I2，淡黄色晶体，产率23％。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ8.38-8.39(d,J＝2.3Hz,1H),8.28-8.30(dd,1H),7.88-7.90(d,J＝8.5Hz,1H),7.71–7.72(m,2H),7.46-7.48(m,2H),5.49(s,2H),3.44(s,3H)ppm.13C NMR(150MHz,DMSO-d6):δ152.99,149.95,148.49,140.41,140.18,133.62,131.17,124.78,122.96,122.77,121.25,66.92,32.20ppm.HRMS(m/z)(ESI):calcd forC15H13ClN3O6Na[M+Na]+:388.03,found:388.10.
实施例5：4-((甲基亚硝基)氨基)苯基(2-甲基-4-硝基苄基)碳酸酯(化合物I3)的制备
参照实施例2和3所述方法，采用2-甲基-4-硝基苄醇为原料，得到化合物I3，淡黄色晶体，产率45％。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ8.15-8.16(d,J＝2.2Hz,1H),8.10-8.14(dd,J＝8.4,2.4Hz,1H),7.71-7.73(d,J＝2.2Hz,1H),7.68–7.70(m,2H),7.45–7.48(m,2H),5.44(s,2H),3.44(s,3H),2.47(s,3H)ppm.13C NMR(150MHz,DMSO-d6):δ153.11,150.01,147.78,141.17,140.37,139.16,129.71,125.06,122.80,121.49,121.21,67.66,32.17,18.77ppm.HRMS(m/z)(ESI):calcd for C16H15N3O6[M+H]+:346.10,found:346.10.
实施例6：4-((甲基亚硝基)氨基)苯基(2-硝基苄基)碳酸酯(化合物I4)的制备
参照实施例2和3所述方法，采用2-硝基苄醇为原料，得到化合物I4，淡黄色晶体，产率73％。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ8.17-8.19(dd,1H),7.85-7.88(m,1H),7.79–7.80(m,1H),7.70–7.73(m,2H),7.68–7.69(m,1H),7.45–7.47(m,2H),5.65(s,2H),3.44(s,3H)ppm.13C NMR(150MHz,DMSO-d6):δ153.04,149.98,147.82,140.40,134.85,130.81,130.25,130.06,125.49,122.77,121.24,67.09,32.16ppm.HRMS(m/z)(ESI):calcd for C15H14N3O6[M+H]+:332.09,found:332.02..
实施例7：4-((甲基亚硝基)氨基)苯基(2-硝基-4-氯苄基)碳酸酯(化合物I5)的制备
参照实施例2和3所述方法，采用2-硝基-4-氯苄醇为原料，得到化合物I5，淡黄色晶体，产率46％。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ8.26-8.27(d,J＝2.2Hz,1H),7.94-7.96(dd,1H),7.81-7.83(d,J＝8.4Hz,1H),7.70–7.72(m,2H),7.45–7.46(m,2H),5.62(s,2H),3.44(s,3H)ppm.13C NMR(150MHz,DMSO-d6):δ152.94,149.96,148.47,140.42,134.51,134.21,131.84,129.81,125.32,122.75,121.24,66.53,32.15ppm.HRMS(m/z)(ESI):calcd forC15H13ClN3O6Na[M+Na]+:388.03,found:388.00.
实施例8：4-((甲基亚硝基)氨基)苯基(2-硝基-4-溴苄基)碳酸酯(化合物I6)的制备
参照实施例2和3所述方法，采用2-硝基-4-溴苄醇为原料，得到化合物I6，淡黄色晶体，产率33％。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ8.36-8.37(d,J＝2.1Hz,1H),8.07-8.09(dd,1H),7.73-7.75(d,J＝8.3Hz,1H),7.70–7.72(m,2H),7.44–7.46(m,2H),5.60(s,2H),3.44(s,3H)ppm.13C NMR(150MHz,DMSO-d6):δ152.94,149.96,148.49,140.42,137.45,131.94,130.19,128.03,122.75,122.16,121.24,66.58,32.15.HRMS(m/z)(ESI):calcd forC15H13BrN3O6[M+H]+:431.98,found:431.90.
实施例9：4-((甲基亚硝基)氨基)苯基(2-硝基-4-甲基苄基)碳酸酯(化合物I7)的制备
参照实施例2和3所述方法，采用2-硝基-4-甲基苄醇为原料，得到化合物I7，淡黄色晶体，产率51％。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ8.00–8.01(m,1H),7.70–7.72(m,2H),7.66-7.67(d,J＝0.9Hz,2H),7.43–7.46(m,2H),5.60(s,2H),3.44(s,3H),2.44(s,3H)ppm.13C NMR(150MHz,DMSO-d6):δ153.04,149.99,147.77,140.57,140.38,135.29,130.22,127.75,125.56,122.74,121.20,67.02,32.12,20.74ppm.HRMS(m/z)(ESI):calcd for C16H16N3O6[M+H]+:346.10,found:345.90.
实施例10：4-((甲基亚硝基)氨基)苯基(2-硝基-5-氯苄基)碳酸酯(化合物I8)的制备
参照实施例2和3所述方法，采用2-硝基-5-氯苄醇为原料，得到化合物I8，淡黄色晶体，产率37％。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ8.21-8.23(d,J＝8.8Hz,1H),7.83-7.84(d,J＝2.3Hz,1H),7.76-7.79(dd,1H),7.71–7.73(m,2H),7.46–7.48(m,2H),5.65(s,2H),3.44(s,3H)ppm.13C NMR(150MHz,DMSO-d6):δ152.82,149.98,146.36,140.43,139.48,133.27,130.05,129.67,127.63,122.76,121.23,66.56,32.14ppm.HRMS(m/z)(ESI):calcd forC15H13ClN3O6Na[M+Na]+:388.03,found:388.00.
实施例11：4-((甲基亚硝基)氨基)苯基(2-硝基-5-甲基苄基)碳酸酯(化合物I9)的制备
参照实施例2和3所述方法，采用2-硝基-5-甲基苄醇为原料，得到化合物I9，淡黄色晶体，产率48％。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ8.09-8.11(d,J＝8.4Hz,1H),7.72-7.73(d,J＝2.2Hz,1H),7.71-7.72(d,J＝2.3Hz,1H),7.57–7.58(m,1H),7.48–7.49(m,1H),7.46-7.47(d,J＝2.3Hz,1H),7.45-7.46(d,J＝2.2Hz,1H),5.63(s,2H),3.44(s,3H),2.47(s,3H)ppm.13C NMR(150MHz,DMSO-d6):δ153.00,150.01,145.93,145.49,140.40,130.95,130.47,130.26,125.70,122.78,121.24,67.21,32.15,21.53ppm.HRMS(m/z)(ESI):calcd for C16H15N3O6Na[M+Na]+:368.09,found:368.10.
实施例12：Griess法检测化合物在常氧或缺氧下与心肌细胞H9c2作用后的NO释放水平
将心肌细胞H9c2复苏，使用DMEM培养基进行培养，放入二氧化碳培养箱中培养使其贴壁生长。待细胞达到合适密度后，接种于多孔板中，放入二氧化碳培养箱中，在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养24h至细胞贴壁，弃掉上清液，加入新鲜DMEM培养基2mL，然后加入一定浓度(5、10、15μM)的化合物和对照品药物硝酸异山梨酯。在常氧培养箱(37℃、21％O2)或缺氧培养箱(37℃、1％O2)培养4h之后，去除上清液，然后将板内细胞分别收集于1.5mL离心管中，1000rpm，离心5min，弃掉上清液，加入1mL PBS重悬细胞，再次离心，弃掉PBS，离心管中加入100μL细胞裂解液(NO测定专用)，冰上放置半分钟，然后4℃下13300rpm离心5min，收集上清液。取50μL上清液于96孔板中，每种样品设置三个平行组，先后加入50μLGriess试剂I和50μLGriess试剂II。在540nm波长下用全波长酶标仪测定每孔OD值，NO浓度通过标准曲线计算出，结果见表1和表2。
表1.常氧下心肌细胞H9c2经化合物处理4h后的NO释放量
*.NO释放量＝实测NO浓度/计算NO浓度，数据以三次独立实验的平均SD表示：*p<0.05，
**p<0.01；
a.表示未测，b.按释放量的1/2计算。
表2.缺氧下心肌细胞H9c2经化合物处理4h后的NO释放量
*.NO释放量＝实测NO浓度/计算NO浓度，数据以三次独立实验的平均SD表示：*p<0.05，
**p<0.01；
a.表示未测，b.按释放量的1/2计算。
表1和表2的数据表明，在常氧下不同浓度的化合物处理心肌细胞后导致NO在细胞中的释放量很小，都低于化合物I2的最大释放量(＜3.34％，10μM)；但在缺氧下，除化合物I5-I9外，不同浓度的化合物I1-I4处理心肌细胞后可有效导致NO在细胞中的释放，释放量在20.15％～45.45％之间，表现为缺氧激活型NO供体。对照品硝酸异山梨酯(ISDN)无论在常氧还是缺氧下处理心肌细胞后，均释放出一定量的NO；其在常氧下导致NO在细胞中的释放量较大，高达41.63％(10μM)，在缺氧下也可导致NO在细胞中的释放，但释放量小于常氧下的释放量，低于化合物I2和I3的释放水平。
实施例13：化合物在常氧或缺氧下对心肌细胞H9c2的活力改善作用
用5mL PBS清洗细胞两次，加入1mL胰酶消化单层培养心肌细胞H9c2，用含血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔5000-10000个细胞接种于96孔培养板中，每孔培养基体积100μL，边缘孔用灭菌后的纯水填充。将培养板移入二氧化碳培养箱中，在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养24h至细胞贴壁，将孔内的100μL培养基吸出，加入50μL新鲜培养基，分别给予不同浓度的化合物和对照品药物硝酸异山梨酯。每孔加药50μL，设3个平行组和1个常氧不加药组作为对照。(浓度梯度为10，1，0.1，0.01，0.001μM)。常氧培养组在正常培养箱中于5％CO2、37℃条件下孵育4h；缺氧组置于缺氧培养箱(O2浓度≤1％)中37℃条件下孵育4h，培养完成后每孔加入10μL的CCK8试剂，常氧培养箱中继续培养4h。终止培养，在酶标仪450nm处测量各孔的吸光值，计算各浓度下心肌细胞的细胞存活率，结果见图1a和图1b。
在常氧条件下(见图1a)，化合物I1-I9随着浓度的增加，除化合物I4在1μM下对细胞的活力有微小提高外，其它化合物对细胞的活力没有任何改善，相反它们在高浓度10μM时对细胞的活力还有所影响，表现出较小的毒性。在缺氧条件下(见图1b)，化合物I1-I4在0.001～10μM浓度范围内均能显著恢复缺氧细胞的活力，并且随着化合物浓度的增加有所提高，而化合物I5-I9对恢复缺氧细胞活力的没有明显作用。对照药物硝酸异山梨酯在常氧条件下对细胞的活力没有任何改善，在缺氧条件下，仅在高浓度时表现出一定的能力，但不如化合物I1-I4。结合表1和表2数据，该类缺氧激活型NO供体化合物I1-I4在缺氧条件下，可有效释放NO，在一定浓度区间可改善心肌细胞的活力，其活性优于现有药物硝酸异山梨酯。该有益效果也在动物水平实验中得以验证。
实施例14：NO检测试剂盒检测化合物I1在缺氧造模小鼠心脏中NO的释放水平
(a)药品与试剂及实验动物
NO检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司，上海)，缺氧造模及给药小鼠、空白对照组小鼠心脏组织匀浆，6-8周雄性昆明小鼠。
(b)实验原理
NO具有化学活性，在体内迅速转化为NO3 -和NO2 -，NO2 -进一步转化为NO3 -。采用griess试剂将NO3 -还原为NO2 -，NO2 -在540nm处有特征吸收，用酶标仪检测540nm处的吸光度，用标准曲线换算NO浓度。
(c)实验操作
(1)缺氧模型(85mg/kg异丙肾上腺素)，给药组在缺氧造模前腹腔注射20mg/kg化合物I1；
(2)12000转离心15min收集心脏组织匀浆蛋白；
(3)配置NO检测试剂盒中的工作液，将工作液加入各组蛋白，孵育后用酶标仪检测，由此分析各组NO的含量，结果见图2。
如图2所示，在对小鼠进行缺氧造模及给药后，化合物I1组心脏内NO水平显著高于其它两组。
实施例15：Western blot法研究化合物I1对心肌缺氧小鼠的心肌损伤标志物蛋白表达水平的调节作用
(a)药品与试剂及实验动物
Western Blot制胶试剂盒(碧云天生物技术有限公司，上海)、蛋白定量用BCA检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司，上海)，电离缓冲液、湿转液、一抗(anti-TSC2-P,Abgent,1:1000,A-AP3825a；anti-mTORC1,Abcam,1:1000,ab120224；anti-GAPDH,BioworldTechnology,1:500,AP0063)、二抗(Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)HRP,1:3000,BioworldTechnology,BS13278)，6-8周雄性昆明小鼠。
(b)实验原理
根据Western Blot条带分析蛋白表达水平的变化。
(c)实验操作
(1)提取小鼠心脏组织蛋白，12000转离心15min收集蛋白，用BCA试剂盒对蛋白进行定量，加入loading buffer沸水中煮5min备用；
(2)制备SDS-PAGE胶，上样分离蛋白条带；
(3)将蛋白条带转移到PVDF膜后，牛奶封闭、依次孵一抗、二抗，利用化学发光显影仪可视化蛋白条带，由此分析各组蛋白表达的变化，结果见图3。
如图3所示，由空白组小鼠、缺氧模型小鼠、给药加缺氧造模组小鼠的心脏分别提取蛋白样本进行Western blot实验。与空白组相比，缺氧模型组小鼠TSC2-P表达下调引起mTORC1蛋白表达显著上调，表明模型组出现明显的心肌损伤。20mg/kg化合物I1预处理的小鼠心脏mTORC1表达恢复到接近正常组水平，表明该化合物具有优良的抗心肌缺氧损伤作用。

Claims (10)

1.一种NO供体化合物，其特征在于，具有式I的结构：
其中：
R1为硝基时，R2为氢、卤素或C1-C4烷基，R3为氢、卤素或C1-C4烷基；
R2为硝基时，R1为氢、卤素或C1-C4烷基，R3为氢、卤素或C1-C4烷基。
2.根据权利要求1所述的NO供体化合物，其特征在于，所述结构中：
R1为硝基，R2为氢、卤素或甲基，R3为氢。
3.根据权利要求1所述的NO提供化合物，其特征在于，选自以下任一化合物：
4.一种权利要求1～3任一所述的NO供体化合物的制备方法，其特征在于，将化合物1与化合物2经酰化反应得到化合物I，
其中，R1、R2、R3的定义如权利要求1～3任一所述。
5.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1～3任一所述的NO供体化合物以及药学上可接受的载体。
6.一种权利要求1～3任一所述的NO供体化合物在制备治疗心肌缺氧损伤类疾病药物中的应用。
7.一种权利要求5所述的药物组合物在制备治疗心肌缺氧损伤类疾病药物中的应用。
8.根据权利要6或7所述的应用，其特征在于，所述化合物为缺氧激活型NO供体化合物。
9.根据权利要6或7所述的应用，其特征在于，所述药物用于改善缺氧条件下的心肌细胞活力。
10.根据权利要6或7所述的应用，其特征在于，所述疾病为冠心病。
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