CN116671631A - 储氢牡蛎钙在防治ⅱ型糖尿病的特殊医学用途食品、保健品及药品中的应用 - Google Patents

储氢牡蛎钙在防治ⅱ型糖尿病的特殊医学用途食品、保健品及药品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了储氢牡蛎钙在防治Ⅱ型糖尿病的特殊医学用途食品、保健品及药品中的应用，涉及生物学和医药学技术领域，储氢牡蛎钙在防治Ⅱ型糖尿病的特殊医学用途食品、保健品及药品中的应用，使用储氢牡蛎钙作为固态的载氢剂，能够与水反应产生氢气，可持续释放高浓度氢气，对防治Ⅱ型糖尿病起到显著效果。

Description

储氢牡蛎钙在防治Ⅱ型糖尿病的特殊医学用途食品、保健品 及药品中的应用
技术领域
本发明涉及生物学和医药学技术领域，具体是储氢牡蛎钙在防治Ⅱ型糖尿病的特殊医学用途食品、保健品及药品中的应用。
背景技术
Ⅱ型糖尿病(diabetes mellitus type 2，T2DM)是一种血糖水平升高的慢性代谢疾病，患者表现出高血糖症状，引发高血糖的主要原因是由胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足引起。T2DM患者会表现出疲劳、视力模糊、过度口渴、饥饿感及排尿增加。糖尿病发展过程中会引起严重的并发症，包括脂肪肝、肾脏功能衰竭、血脂异常诱发心血管疾病、线粒体功能障碍及氧化损伤导致代谢器官功能异常等疾病发生，累及全身，给人们的生活带来巨大的挑战。2017年世界糖尿病(diabetes mellitus,DM)患病人口约为4.25亿(20～79岁)，预计到2045年，糖尿病患病人数将增长至6.29亿。近十年，T2DM全球患病率不断上升，2045年估计中国将有超过1.2亿人患有T2DM。而研究发现，引起T2DM快速增长的原因与快速现代化相关的不健康饮食和生活方式因素(包括久坐行为的增加)密切相关。
现有技术的缺点：目前临床的药物治疗会出现毒副作用，并且会出现严重的肾衰竭，现有的富氢水治疗是一种无副作用的治疗方法，但存在氢气在水中不稳定，不能长时间保存，会很快的逸散掉，不能长时间在体内发挥作用的缺点，因此，无法高效发挥氢气的抗氧化作用。而我们使用储氢牡蛎钙作为固态的载氢剂，能够与水反应产生氢气，可以较长时间维持高浓度氢气的持续释放，可以在生物体内发挥强有力抗氧化治疗作用。
发明内容
本发明的目的在于提供储氢牡蛎钙在防治Ⅱ型糖尿病的特殊医学用途食品、保健品及药品中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：包括使用储氢牡蛎钙作为固态的载氢剂，能够与水反应产生氢气，可持续释放高浓度氢气。
进一步地，其储氢牡蛎钙治疗可以显著的降低附睾脂肪和肾周脂肪重量。
进一步地，其储氢牡蛎钙显著的降低空腹血糖水平和改善葡萄糖耐受。
进一步地，其储氢牡蛎钙治疗可以显著的降低血清中FFA、TG和TC的水平。
进一步地，其储氢牡蛎钙治疗可以显著的降低肝脏组织中TG和TC的水平及抑制肝脏和肌肉组织中脂质的合成，并促进棕色脂肪组织脂质代谢。
进一步地，其储氢牡蛎钙治疗可以显著的降低肾脏组织中炎性因子的表达水平。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.储氢牡蛎钙治疗可以显著的降低附睾脂肪和肾周脂肪重量，在储氢牡蛎钙治疗Ⅱ型糖尿病导致肥胖或者其他因素导致肥胖中的减肥应用。
2.储氢牡蛎钙治疗治疗可以显著的降低空腹血糖水平和改善葡萄糖耐受，在储氢牡蛎钙治疗Ⅱ型糖尿病或葡萄糖耐受疾病的应用。
3.储氢牡蛎钙治疗降低血清中FFA、TG和TC的水平，在治疗预防心血管、高血脂和脂肪肝等疾病的应用。
4.储氢牡蛎钙治疗可以显著的降低肝脏组织中TG和TC的水平及抑制肝脏和肌肉组织中脂质的合成，并促进棕色脂肪组织脂质代谢，在防治Ⅱ型糖尿病导致的脂肪肝及其它因素导致的脂肪肝方面应用。
5.储氢牡蛎钙治疗可以显著的降低肾脏组织中炎性因子的表达水平，在防治T2DM引发的肾病及其它肾脏炎症疾病的应用。
附图说明
图1为储氢牡蛎钙(HOP)体外持续释放氢气情况；
图2为储氢牡蛎钙(HOP)治疗对db/db小鼠过程中，可减轻肾周脂肪和附睾脂肪重量；
图3为储氢牡蛎钙(HOP)治疗促进db/db小鼠胰岛素的分泌及激活肌肉AKT信号通路，改善小鼠葡萄糖耐受；
图4为储氢牡蛎钙(HOP)治疗db/db小鼠，降低血清中TG(甘油三脂)、TC(胆固醇)及FFA(游离脂肪酸)水平；
图5为储氢牡蛎钙(HOP)治疗db/db小鼠，降低肝脏组织血清中TG(甘油三脂)、TC(胆固醇)积累及抑制肝脏和肌肉组织脂质合成，并促进棕色脂肪组织脂质代谢；
图6为储氢牡蛎钙(HOP)治疗db/db小鼠，降低脑、肌肉和心脏组织的活性氧(ROS)及氧化应激；
图7为储氢牡蛎钙(HOP)治疗db/db小鼠改善肝脏和脑组织线粒体功能；
图8为储氢牡蛎钙(HOP)治疗降低了db/db小鼠肾脏组织中炎性因子水平。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，实施例中采用的lepr db突变小鼠(db/db)是常见的糖尿病小鼠模型。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了阐明HOP在体内对T2DM的治疗效果，设计的实验方案为：给db糖尿病小鼠灌胃HOP，通过检测血糖，血脂，肝脏组织中脂质的累积及关键代谢组织的脂代谢，关键代谢组织中活性氧水平及抗氧化蛋白来评价HOP在治疗T2DM中的应用。
请参阅图1～8，本发明实施例中，HOP体外释放氢气的检测方法：准确称取不同剂量的储氢牡蛎钙粉末，用水分别配制浓度为30mg/mL，100mg/mL，300mg/mL的储氢牡蛎钙水溶液5mL置于20mL的小烧饼中，轻轻搅拌混合均匀后，密封烧杯口，待检测时打开烧杯，用氢电极检测水溶液中氢气的浓度。分别检测1h，4h，8h，24h，48h，72h，96h，120h，144h，168h，192h储氢牡蛎钙释放氢气的浓度，同时测定溶液的PH。
动物模型：
(1)Ⅱ型糖尿病模型：
购买选择4-5周龄大小的db小鼠12只，在适应环境后，将小鼠随机分为2组：
A.db 8
B.db+储氢牡蛎钙(HOP，300mg/kg，预防组) 4
在小鼠适应环境后，分别给予实验组小鼠(B组)300mg/kg的储氢牡蛎钙，A组给予等剂量的生理盐水。
(2)动物实验方案分组：
在db小鼠的血糖显著升高后，将上述A组db小鼠进行随机分组2组，然后给分别给予C组储氢牡蛎钙(HOP)对糖尿病小鼠进行治疗干预：
A.db/db 5
B.db/db+HOP-P(300mg/kg，预防组) 4
C.db/db+HOP-T(300mg/kg，治疗组) 3
动物适应环境后，然后灌胃储氢牡蛎钙，老鼠体重和进食量每周记录2次，实验持续时间为4个月，随机血糖，空腹血糖，出现明显效果后，小鼠禁食过夜后，处死小鼠，收集各种代谢组织(脑，心脏，肝脏，肌肉，脂肪(棕色脂肪，附睾脂肪和肾周脂肪)，肾脏)，胰腺，血清。其中固定肝脏，白色脂肪(若观察到明显区别),肾脏固定。
实验方法
1).活性氧(ROS)水平测定
(1)H2DCF-DA储存液配制：H2DCF-DA试剂配制成10mmol/L的储存液，如表1，配置过程中需注意避光，配制好的储备液分装成小份，置于-20℃避光保存。
(2)组织中活性氧的测定：称取20mg组织，用剪刀剪碎，然后使用预定的PBS清洗一遍，重新加入200μL的预冷PBS，使用组织研磨器进行研磨，研磨匀浆后，4℃，1000g离心10min，取上清，然后重复离心一次，收取上清到心的1.5mL离心管，取10μL加入到96孔板，然后将H2DCF-DA试剂用PBS稀释1000倍，每孔加入100μL，将96孔板避光37℃孵育30min,放入酶标仪进行荧光检测，设定激发光和发射光为485nm和538nm；同时将测定上清样品进行BCA蛋白定量；组织中ROS含量为荧光OD值与相应蛋白含量的比值。
2).蛋白质印记
从细胞裂解液中提取总蛋白，在SDS-PAGE胶进行蛋白质分离，并印染至PVDF薄膜上。1％牛血清白蛋白封闭1小时后，用特定的一抗在4oC孵育过夜。第二天，用辣根过氧化物酶交联的二抗室温孵育1小时后，将条带在加强的化学发光仪上进行显影(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)。
Anti-TFAM(D5C8,#8076s)抗体，Anti-β-Actin(8H10D10，#3700S)抗体和Anti-GAPDH(14C10，#2118S)抗体，PPARγ(2435S)抗体，FAS(3189S)抗体，α-Tubulin(3873S)抗体，Anti-P-ACC(#3661s)抗体，Anti-ACC(3676S)抗体购自Cell Signaling Technology(Danvers,MA)。Anti-NDUFS3(ComplexⅠ，#459130)抗体，Anti-SDHB(ComplexⅡ，#459230)抗体，Anti-UQCRC1(ComplexⅢ，#45914)抗体，Anti-MTCO1(ComplexⅣ，#459600)抗体，Anti-ATP Synthase Subunit Alpha(ComplexⅤ，#459240)抗体购自Invitrogen(Meridian,USA)。Anti-DRP1(
611113)抗体和Anti-OPA1(612607)抗体购自BD Biosciences(Mexico,US)。Anti-MFN1(D-10，sc-166644)抗体，Anti-MFN2(F-5，sc-515647)抗体，Anti-NQO1(H-9，Sc-376023)抗体，Anti-SOD1(24，Sc-101523)抗体，Anti-SOD2(E-10，Sc-137254)抗体和Anti-catalase(F-17，Sc-34285)抗体，PPARα(sc-9000)抗体，SREBP1(Sc13551)抗体购自SantaCruz Biotechnology(Dallas,TX)。Anti-KEAP1(#60027-1-Ig)抗体和Anti-NRF2(#66504-1-Ig)抗体购自Proteintech(Rosemont,IL)。CPT1A(A5307)抗体,UCP1(A5857)抗体，UCP3(A16996)抗体购自ABclonal(Wuhan,China)。
3).实时定量PCR
使用TriPure Isolation Reagent(Roche,Basel,Switzerland)从细胞中提取总RNA，然后利用试剂盒(BioRad,Hercules,CA,USA)反转录成cDNA。使用iQ SYBR GreenSupermix(BioRad)进行PCR反应，并利用CFX Connect real-time PCR detection system(BioRad)进行数据分析。目标基因的引物经设计、合成后，用灭菌超纯水溶解成100μM的储备液，-20℃保存。临用前将上、下游引物混合，稀释10倍后得终浓度为10μM的应用液。TG和TC水平的测定
根据购买的南京建成公司的检测试剂盒中的操作说明书，检测血清中和肝脏组织中TG和TC水平，具体操作步骤按照说明书进行操作。
4)口服糖耐量实验(OGTT)
小鼠葡萄糖耐受量(Glucose tolerance tests,GTT)检测。小鼠禁食过夜(12小时)之后尾静脉取血并测量小鼠的血糖水平，按照1.5g/kg的剂量腹腔注射葡萄糖溶液。在葡萄糖给药前后，在规定时间点(0、15、30、60和120min)从尾静脉抽取血样，血糖仪测量血糖水平并记录实验数据。
5)胰岛素敏感性实验(ITT)
小鼠胰岛素耐受量(Insulin tolerance test,ITT)检测，小鼠禁食6小时之后，测量小鼠血糖记录为0点，腹腔注射胰岛素(0.75U/kg)。在胰岛素给药之后15、30、60和120min从尾静脉抽取血样，使用血糖仪测量血糖水平并记录实验数据。
6)组织HE切片染色
首先将组织样本使用4％的多聚甲醛固定，然后石蜡包埋。包埋完成后切片厚度在4-8μm左右；样本脱蜡和水化；切片苏木素染色、分化与反蓝；切片伊红染色与脱水；HE染色样本切片风干封片；最后在显微镜下观察并拍照
7)油红染色
取适量肝脏组织，4％的多聚甲醛固定24h以上，然后冰冻切片10μm薄片,染色前蒸馏水充分洗剂；油红稀释液染色10-15分钟，避光密封；然后进行水洗，marry氏苏木素复染核，最后水洗封片，在显微镜下拍照保存。
8)线粒体提取
(1)线粒体分离介质配制：配制500mL线粒体分离介质：称取0.6g Tris base，42.79g蔗糖，0.19g EDTA二钠盐，充分溶解，调节PH至7.4。
(2)剪取黄豆粒大小的小鼠组织于1.5mL的EP管中，加PBS清洗，将残留的血液去除干净，加入一定量的含1％PSMF的线粒体分离介质，用剪刀将组织块尽量剪碎；然后使用玻璃匀浆器上下研磨60次，使细胞破碎释放线粒体；
(3)匀浆于4℃，150g，离心10min，取上清重复离心2-3次；
(4)上清于4℃，1000g离心10min，取上清重复离心2次；
(5)上清于4℃，10000g离心15min，取上清重复离心2-3次，沉淀即为线粒体；
(6)用线粒体分离介质重悬清洗线粒体沉淀3次，4℃，10000g离心15min，加入适量的含1％PSMF线粒体分离介质重悬沉淀，即为线粒体，备用；
9)线粒体功能的检测
(1)活化Seahorse探针，待探针活化好后，取细胞培养板，每孔加入3μg线粒体，然后加入线粒体呼吸液；
(2)放置在37℃无CO2培养箱中静置8-10min，待探针校正后放入机器检测；
(3)探针孔分别加入4mM ADP，1μM Oligomycin，1μM FCCP，2μM Antimycin A代谢底物和抑制剂；
(4)将含有校正液的探针放入仪器中，按程序设置进行校正，待校正完成后上机检测；
10)统计分析
使用Graphpad Prism8软件进行统计分析。首先采用Shapiro-Wilk正态性检验检验样本的正态分布。如果符合正态分布，则进一步检验方差齐性。如果数据也通过了方差齐性检验，则使用双尾Student t-text或One-way ANOVA(Tukey事后检验)计算p值；否则，使用Welch t检验或Kruskal-Wallis检验计算p值。对于不符合正态分布的样本，使用Mann-Whitney或Kruskal-Wallis非参数检验。数据以平均值±SEM表示。显著统计学意义为*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图1为HOP体外持续释放氢气情况。A为浓度为30mg/mL，100mg/mL，300mg/mL的储氢牡蛎钙水溶液在192h内持续释放氢气浓度的情况。B为浓度为30mg/mL，100mg/mL，300mg/mL的储氢牡蛎钙水溶液在192h内随氢气释放，溶液的PH监测情况(n＝3，***p<0.001)。
图2为HOP治疗对db/db小鼠过程中，可减轻肾周脂肪和附睾脂肪重量。A为HOP治疗过程中，对小鼠体重的监测。B为HOP治疗结束后，对小鼠体重增量的监测。C为HOP治疗过程中，对小鼠摄食量的监测。D为HOP治疗过程中，对小鼠饮水量的监测。E为HOP治疗结束后，对小鼠的肾周脂肪称重。D为为HOP治疗结束后，对小鼠的附睾脂肪称重(db/db,n＝5；db+HOP-P,n＝4；db/db+HOP-T,n＝3；*p<0.05)。
图3为HOP治疗促进db/db小鼠胰岛素的分泌及激活肌肉AKT信号通路，改善小鼠葡萄糖耐受。图A为HOP预防8周，治疗2周，使用罗氏血糖仪通过尾静脉采血监测小鼠的空腹血糖结果。图B为HOP预防10周，治疗4周，使用罗氏血糖仪通过尾静脉采血监测小鼠的空腹血糖结果。图C为HOP预防11周，治疗5周，使用罗氏血糖仪通过尾静脉采血监测小鼠葡萄糖耐量结果。图D为HOP预防18周，治疗10周，使用elisa试剂盒检测小鼠血清中胰岛素结果。图E为HOP治疗后，通过提取组织全蛋白使用Western blot分析P-AKT和AKT蛋白水平，使用elisa试剂盒检测小鼠血清中胰岛素结果(db/db,n＝5；db+HOP-P,n＝4；db/db+HOP-T,n＝3；*p<0.05，**p<0.01；***p<0.001)。
图4为HOP治疗db/db小鼠，降低血清中TG(甘油三脂)、TC(胆固醇)及FFA(游离脂肪酸)水平。图A为HOP预防8周，治疗2周，使用碧云天商品化TG和TC试剂盒检测血清中TG和TC结果。图B为HOP预防13周，治疗7周，使用碧云天商品化TG和TC试剂盒检测血清中TG和TC结果。图C为HOP预防18周，治疗10周，使用碧云天商品化TG和TC试剂盒检测血清中TG和TC结果。图D为HOP预防18周，治疗10周，使用elisa试剂盒检测小鼠血清中FFA结果。(db/db,n＝5；db+HOP-P,n＝4；db/db+HOP-T,n＝3；*p<0.05，**p<0.01；***p<0.001)。
图5为HOP治疗db/db小鼠，降低肝脏组织血清中TG(甘油三脂)、TC(胆固醇)积累及抑制肝脏和肌肉组织脂质合成，并促进棕色脂肪组织脂质代谢。图A为HOP治疗后，使用碧云天商品化TG和TC试剂盒检测肝脏组织中TG和TC结果。图B为HOP治疗后，用4％的多聚甲醛固定肝脏组织，进行切片HE染色结果。图C为HOP治疗后，用4％的多聚甲醛固定肝脏组织，进行切片油红染色结果。图D为HOP治疗后，裂解肝脏组织蛋白，通过Western blot分析脂质合成和脂质分析相关蛋白的表达水平。图E为HOP治疗后，裂解肌肉组织蛋白，通过Western blot分析脂质合成和脂质分析相关蛋白的表达水平。图F为HOP治疗后，提取棕色脂肪组织(BAT)RNA，通过qRT-PCR分析脂质合成和脂质分析相关基因的表达水平。(db/db,n＝5；db+HOP-P,n＝4；db/db+HOP-T,n＝3；*p<0.05，**p<0.01；***p<0.001)。
图6为HOP治疗db/db小鼠，降低脑、肌肉和心脏组织的活性氧(ROS)及氧化应激。图A为HOP治疗后，通过H2DCFDA(一种标记ROS的染料)荧光染色标记脑组织活性氧水平。图B为HOP治疗后，通过H2DCFDA(一种标记ROS的染料)荧光染色标记肌肉组织活性氧水平。图C为HOP治疗后，通过H2DCFDA(一种标记ROS的染料)荧光染色标记心脏组织活性氧水平。图D为HOP治疗后，裂解脑组织蛋白，通过Western blot分析抗氧化相关蛋白的表达水平。图E为HOP治疗后，裂解肌肉组织蛋白，通过Western blot分析抗氧化相关蛋白的表达水平。图为HOP治疗后，裂解心脏组织蛋白，通过Western blot分析抗氧化相关蛋白的表达水平。(db/db,n＝5；db+HOP-P,n＝4；db/db+HOP-T,n＝3；*p<0.05，**p<0.01)。
图7为HOP治疗db/db小鼠改善肝脏和脑组织线粒体功能。图A为提取肝脏线粒体，通过seahorse检测肝脏组织氧气消化速率。图B为HOP治疗后，裂解肝脏组织蛋白，通过Western blot分析线粒体相关蛋白的表达水平。图C为HOP治疗后，裂解脑组织蛋白，通过Western blot分析线粒体相关蛋白的表达水平。图为HOP治疗后，裂解心脏组织蛋白，通过Western blot分析抗氧化相关蛋白的表达水平。(db/db,n＝5；db+HOP-P,n＝4；db/db+HOP-T,n＝3；*p<0.05，**p<0.01)。
图8HOP治疗降低了db/db小鼠肾脏组织中炎性因子水平。图为HOP治疗后，提取肾脏组织RNA，通过qRT-PCR分析炎性因子TNFα和MCP1表达水平。(db/db,n＝5；db+HOP-P,n＝4；db/db+HOP-T,n＝3；*p<0.05，***p<0.001)。
下面给出本发明实验的相关结果。
(一)HOP体外持续释放高效氢气。
为了明确储氢牡蛎钙在体外释放氢气的情况，首先准确称取不同剂量的储氢牡蛎钙粉末(HOP)，用水分别配制浓度为30mg/mL，100mg/mL，300mg/mL的储氢牡蛎钙水溶液5mL置于20mL的小烧饼中，轻轻搅拌混合均匀后，密封烧杯口，待检测时打开烧杯，用氢电极检测水溶液中氢气的浓度。分别检测1h，4h，8h，24h，48h，72h，96h，120h，144h，168h，192h储氢牡蛎钙释放氢气的浓度，同时测定溶液的PH，检测结果如图1所示，图1(A)中我们发现30mg/mL，100mg/mL，300mg/mL的储氢牡蛎钙水溶液中氢气的浓度随着时间的增加先升高后降低，并且，30mg/mL，100mg/mL，300mg/mL的储氢牡蛎钙水溶液在8h氢气的浓度达到巅峰(氢气的峰值浓度分别为520ppb，600ppb，740ppb)，随着储氢牡蛎钙浓度的增加，释放氢气的浓度也是增加的，300mg/ml储氢牡蛎钙水溶液释放氢气的浓度显著高于30mg/mL和100mg/mL，随着时间的延长，氢气的释放逐渐下降，30mg/mL储氢牡蛎钙水溶液在96h后氢气释放为0，100mg/mL的储氢牡蛎钙水溶液在120h后氢气释放为0，300mg/mL的储氢牡蛎钙水溶液在192h后氢气释放为0；PH检测检测结果如图1(B)所示，储氢牡蛎钙水溶液均呈现碱性(PH>8),且随着浓度的升高，储氢牡蛎钙水溶液的PH呈现显著性的升高，高剂量300mg/mL的储氢牡蛎钙水溶液PH大于13可以维持96h，然后开始降低，100mg/mL的储氢牡蛎钙水溶液PH大于12维持24h，之后开始逐渐降低，30mg/mL储氢牡蛎钙水溶液PH大于12维持8h，然后开始逐渐降低。
(二)HOP治疗可以降低db/db小鼠肾周脂肪和附睾脂肪重量。
为了明确储氢牡蛎钙在体内的作用效果，我们选择db/db小鼠作为研究对象，给db/db小鼠灌胃300mg/kg的HOP，在持续治疗过程中检测体重，摄食量和饮水量，最终治疗结束后，取材进行分析。图2A-D结果表明，预防组(HOP)和治疗组(HOP-T)对小鼠的体重、摄食量、饮水量及体重增量没有影响，HOP预防组可以显著的降低db/db小鼠的肾周脂肪和附睾脂肪的重量(图2E-F)。这表明HOP治疗对Ⅱ型糖尿病具有潜在的减脂效果。
(三)HOP治疗提升db/db小鼠胰岛素的分泌及激活AKT信号通路，改善小鼠葡萄糖耐受。
为了探究HOP治疗对db小鼠血糖的改善作用，我们采用尾静脉采血，用罗氏活力血糖试纸检测db小鼠的空腹血糖和葡萄糖耐量的改善作用。在HOP预防组(HOP-P)治疗8周和HOP治疗组(HOP-T)治疗2周时，可以显著的降低db/db小鼠的空腹血糖(图3A)。继续监测，发现HOP治疗组(HOP-T)治疗4周时，可以显著的降低db/db小鼠的空腹血糖(图3B)。在HOP预防组(HOP-P)治疗11周和HOP治疗组(HOP-T)治疗5周时，我们检测一次口服葡萄糖耐量(OGTT)检测，发现HOP-P和HOP-T治疗组空腹血糖显著降低，且HOP-P和HOP-T治疗组小鼠口服葡萄糖耐量(OGTT)曲线下积分面积显著降低，这表明HOP的预防和治疗均可以显著的改善db/db小鼠的葡萄糖耐受(图3C)。进一步研究发现，HOP-T治疗12周后可以显著的增加血清中insulin的水平(图3D)，这也是HOP改善血糖的重要原因之一。同时，还发现HOP预防组可以显著的提高小鼠肌肉组织中P-AKT的水平(图3E)。以上结果表明HOP对db/db小鼠的预防和治疗均可以显著改善空腹血糖和葡萄糖耐受。
(四)HOP治疗可以显著的降低db/db小鼠血脂水平。
为了探究HOP治疗对db/db小鼠血脂的改善作用，我们采用尾静脉采血，然后使用商品化甘油三脂(TG)和胆固醇(TC)检测试剂盒检测血清中甘油三脂和胆固醇的水平。在HOP预防组(HOP-P)治疗8周和HOP治疗组(HOP-T)治疗2周时，可以显著的降低db/db小鼠的空腹TG和TC的水平(图4A)。继续监测，发现在HOP预防组(HOP-P)治疗13周和HOP治疗组(HOP-T)治疗7周时，可以显著的降低db/db小鼠的血清中TG和TC的水平(图4B)。在HOP预防组(HOP-P)治疗18周，发现HOP-P治疗组血清中TG水平显著降低(图4C)。在HOP预防组(HOP-P)治疗18周和HOP治疗组(HOP-T)治疗12周，发现HOP-P治疗组血清中自由脂肪酸(Freefatty acid，FFA)水平显著降低(图4D)。以上结果表明HOP对db/db小鼠的预防和治疗均可以显著降低血脂的水平。
(五)HOP治疗可以降低db/db小鼠肝脏组织中脂质的积累及抑制肝脏和肌肉中脂质合成，促进棕色脂肪的脂肪酸代谢。
为了探究HOP治疗对db/db小鼠脂肪肝改善作用，然后使用商品化甘油三脂(TG)和胆固醇(TC)检测试剂盒检测肝脏组织中甘油三脂和胆固醇的水平。发现HOP预防组(HOP-P)治疗可以显著的降低db/db小鼠肝脏组织中TG和TC的水平(图5A)。同时，肝脏组织的HE染色和油红染色表明，HOP预防和治疗均可以降低肝脏组织脂质的积累，特别是HOP预防组的效果非常显著(图5B，C)。进一步深入研究发现，HOP治疗组可以显著的降低肝脏组织中P-ACC和肌肉组织ACC的蛋白水平，这表明HOP可以抑制肝脏和肌肉组织中脂质的合成(图5D，E)。此外，棕色脂肪中，HOP治疗组可以显著的升高Ucp1,Pparα，Pparγ，Cidea，Prdm16及Dio2等脂代谢相关基因的表达水平，HOP预防组可以显著的升高Pparα，Pparγ及Prdm16的基因表达水平，还发现HOP治疗组可以显著的增加线粒体生成相关转录因子Pgc1α的水平(图5F)。以上结果表明HOP预防治疗可以降低db/db小鼠肝脏组织中TG和TC的水平，这与HOP可以抑制肝脏组织和肌肉组织的脂质合成及促进棕色脂肪脂质代谢密切相关，HOP的治疗可为改善db/db小鼠的脂肪肝提供理论支持。
(六)HOP治疗降低了db/db小鼠脑、肌肉和心脏的组织的氧化应激。
为了探究HOP治疗对db/db小鼠关键代谢组织氧化应激的作用，我们检测了脑，肌肉和心脏等组织中活性氧的水平及抗氧化相关KEAP1-NRF2信号通路蛋白的表达水平变化。在脑组织中，与对照组db/db小鼠相比，发现HOP-T和HOP-P治疗可以显著降低脑组织中ROS水平，且抗氧化相关蛋白KEAP1、NQO1、Catalase及SOD2蛋白水平显著升高(图6A，D)；在肌肉组织中，与对照组db/db小鼠相比，发现HOP-P和HOP-T治疗可以显著降低肌肉组织中ROS水平，尽管抗氧化蛋白Catalase、SOD2及SOD1的表达是下降的，这可能与HOP的治疗显著降低ROS水平，从而降低肌肉组织的氧化应激密切相关(图6B，E)；在心脏组织中，与对照组db/db小鼠相比，发现HOP-T治疗可以显著降低心脏组织中ROS水平,且提高了SOD2蛋白的表达(图6C，F)。以上的研究结果显示，HOP的治疗可以显著的改善肌肉，心脏，脑组织中活性氧的水平，降低这些代谢组织的氧化压力，这对于保护关键代谢组织的氧化损伤具有重要的意义。
(七)HOP治疗改善肝脏和脑组织线粒体的功能。
为了进一步探究HOP治疗对肝脏和脑组织线粒体的影响，首先提取了肝脏组织的线粒体，通过Seahorse评价肝脏线粒体呼吸功能及通过WB评价肝脏组织和脑组织线粒体相关蛋白的表达水平，结果发现，HOP预防组(HOP-P)治疗可以显著的提高肝脏线粒体的最大呼吸能力，同时HOP的治疗提高线粒体蛋白TFAM、MTCO1及DRP1蛋白表达水平(图7A，B)。此外，还发现HOP-T治疗显著的提高脑组织MFN2及MTCO1蛋白表达水平(图7C)。这些结果表明，HOP的治疗可以显著改善肝脏和脑组织线粒体的功能。
(八)HOP治疗降低db/db小鼠肾脏组织中炎性因子的水平。
为了探究HOP治疗对db小鼠炎症的作用，我们检测了肾脏组织中炎性因子转录水平。在肾脏组织中，与对照组db小鼠相比，发现HOP-P治疗可以显著降低肾脏组织中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，Tnfα)和趋化因子(C-C基序)配体2(chemokine(C-Cmotif)ligand 2，Mcp1)炎性因子水平(图8)；HOP-T可以显著的降低肾脏组织中Mcp1的水平，这些结果显示，HOP治疗db小鼠可以显著的改善肾脏组织的炎症。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (6)

1.储氢牡蛎钙在防治Ⅱ型糖尿病的特殊医学用途食品、保健品及药品中的应用，其特征在于，使用储氢牡蛎钙作为固态的载氢剂，能够与水反应产生氢气，可持续释放高浓度氢气。
2.根据权利要求1的应用，其特征在于，其储氢牡蛎钙治疗可以显著的降低附睾脂肪和肾周脂肪重量。
3.根据权利要求1的应用，其特征在于，其储氢牡蛎钙显著的降低空腹血糖水平和改善葡萄糖耐受。
4.根据权利要求1的应用，其特征在于，其储氢牡蛎钙治疗可以显著的降低血清中FFA、TG和TC的水平。
5.根据权利要求1的应用，其特征在于，其储氢牡蛎钙治疗可以显著的降低肝脏组织中TG和TC的水平及抑制肝脏和肌肉组织中脂质的合成，并促进棕色脂肪组织脂质代谢。
6.根据权利要求1的应用，其特征在于，其储氢牡蛎钙治疗可以显著的降低肾脏组织中炎性因子的表达水平。
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CN102524785A (zh) * 2012-02-08 2012-07-04 姚鼎山 一种负氢离子粉体及其制备方法
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