CN116670266A - 性腺体细胞的体外衍生 - Google Patents
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Abstract
本文提供了从多能干细胞产生性腺细胞群诸如卵巢体细胞的方法。还包括性腺细胞群以及其中产生的中间细胞群。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年11月2日提交的美国临时申请63/108,666，标题为“人颗粒细胞分化(HUMAN GRANULOSA DIFFERENTIATION)”；2021年7月16日提交的美国临时申请63/222,953，标题为“性腺体细胞的体外衍生(IN VITRO DERIVATION OF GONADAL SOMATICCELLS)”的优先权，出于所有目的将其内容通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开文本总体上涉及从多能干细胞产生性腺细胞群诸如卵巢体细胞的方法。还包括性腺细胞群以及其中产生的中间细胞群。
发明内容
本文提供了一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：(a)将多能干细胞在包含激活素A的中胚层诱导培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；(b)将所述第一中间细胞群在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养第二时间段，从而产生第二中间细胞群；以及(c)将所述第二中间细胞群在包含BMP和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养第三时间段以产生所述性腺细胞群。在一些实施方案中，本文提供了一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：(a)将中胚层或中胚层样细胞在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养第一时间段从而产生第二中间细胞群；以及(b)将所述第二中间细胞群在包含BMP和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养第二时间段以产生所述性腺细胞群。在一些实施方案中，提供了一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：将中间中胚层或中间中胚层样细胞在包含BMP和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养一段时间以产生所述性腺细胞群。在一些实施方案中，所述BMP是BMP4、BMP2、BMP7、BMP15或其任何组合。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基包含BMP4。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基进一步包含卵泡抑素。
本文提供了一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：(a)将多能干细胞在包含激活素A的中胚层诱导培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；(b)将所述第一中间细胞群在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养第二时间段，从而产生第二中间细胞群；以及(c)将所述第二中间细胞群在包含卵泡抑素、BMP4和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养第三时间段以产生所述性腺细胞群。
本文还提供了一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：(a)将中胚层或中胚层样细胞在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养第一时间段从而产生第二中间细胞群；以及(b)将所述第二中间细胞群在包含卵泡抑素、BMP4和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养第二时间段以产生所述性腺细胞群。
本文还提供了一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括将中间中胚层或中间中胚层样细胞在包含卵泡抑素、BMP4和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养一段时间以产生所述性腺细胞群。
本文还提供了一种产生第一中间细胞群的方法，所述方法包括：将多能干细胞在包含激活素A和糖原合酶激酶-3抑制剂的中胚层诱导培养基中培养一段时间以产生第一中间细胞群。本文还提供了一种产生第二中间细胞群的方法，所述方法包括将中胚层或中胚层样细胞在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养一段时间，从而产生所述第二中间细胞群。本文还提供了一种产生第二中间细胞群的方法，所述方法包括：(a)将多能干细胞在包含激活素A和糖原合酶激酶-3抑制剂的中胚层诱导培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；以及(b)将所述第一中间细胞群在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)、FGF和糖原合酶激酶-3抑制剂的中间中胚层诱导培养基中培养第二时间段，从而产生所述第二中间细胞群。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第一中间细胞群和第二中间细胞群是用于产生性腺细胞群的分化多能干细胞的中间群。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第一中间细胞群中的至少一部分细胞表达Brachyury。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第二中间细胞群中的至少一部分细胞表达OSR1、PAX2或LHX。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞群中的至少一部分细胞表达FOXL2、NR2F2或RUNX1。
在任何实施方案中的一些实施方案中，将所述多能干细胞以约10,000至约40,000个细胞/cm2的密度接种。在任何实施方案中的一些实施方案中，将所述多能干细胞接种在用纤连蛋白包被的培养板中。在任何实施方案中的一些实施方案中，将所述多能干细胞接种在用基质胶包被的培养板中。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基进一步包含FGF。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基进一步包含BMP4。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基进一步包含糖原合酶激酶-3抑制剂。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基进一步包含细胞凋亡抑制剂。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中激活素A的浓度为约30ng/mL至约70ng/mL。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中激活素A的浓度为约50ng/mL。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中的FGF是FGF2。在一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中FGF2的浓度为约5ng/mL至约20ng/mL。在一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中FGF2的浓度为约12ng/mL。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中BMP4的浓度为约10ng/mL至约50ng/mL。在一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中BMP4的浓度为约30ng/mL。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中的糖原合酶激酶-3抑制剂是CHIR99021。在一些实施方案中，CHIR99021的浓度为约1μM至约5μM。在一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中CHIR99021的浓度为约3μM。
在任何实施方案中的一些实施方案中，在所述中胚层诱导培养基中，所述细胞凋亡抑制剂是Y-27632。在一些实施方案中，Y-27632的浓度为约5μM至约20μM。在一些实施方案中，Y-27632的浓度为约10μM。在任何实施方案中的一些实施方案中，在所述中胚层诱导培养基中，所述细胞凋亡抑制剂包括Chroman1、Emricasan和反式ISRIB。在一些实施方案中，所述细胞凋亡抑制剂是Chroman1并且Chroman1的浓度为约30nM至约70nM。在一些实施方案中，Chroman1的浓度为约50nM。在一些实施方案中，所述细胞凋亡抑制剂是Emricasan并且Emricasan的浓度为约2μM至约10μM。在一些实施方案中，Emricasan的浓度为约5μM。在一些实施方案中，所述细胞凋亡抑制剂是反式ISRIB并且反式ISRIB的浓度为约0.2μM至约2μM。在一些实施方案中，反式ISRIB的浓度为约0.7μM。
在任何实施方案中的一些实施方案中，在中胚层诱导培养基中培养的时间段为约24小时至约96小时。在任何实施方案中的一些实施方案中，在中胚层诱导培养基中培养的时间段为约24小时至约72小时。在任何实施方案中的一些实施方案中，在中胚层诱导培养基中培养的时间段为约56小时至约72小时。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少90％的细胞表达Brachyury。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少80％的细胞表达以下中的一种或多种：MIXL1、N-钙粘蛋白、EpCam、NCAM。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少90％的细胞表达：Brachyury、N-钙粘蛋白、EpCam和NCAM。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少90％的细胞是中胚层或中胚层样细胞。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第一中间细胞群基本上由中胚层或中胚层样细胞组成。
在任何实施方案中的一些实施方案中，在中间中胚层诱导培养基中培养之前，将第一中间细胞群重新铺板到新的纤连蛋白包被的培养板上。在一些实施方案中，在重新铺板之前将所述第一中间细胞群酶促脱附、离心并且重悬。在任何实施方案中的一些实施方案中，将所述第一中间细胞群以约5000至约25000个细胞/cm2的密度铺板。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基进一步包含FGF。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基进一步包含糖原合酶激酶-3抑制剂。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基进一步包含激活素A。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基进一步包含细胞凋亡抑制剂。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述方法包括将所述第一中间细胞群：(i)首先在具有第一浓度的所述细胞凋亡抑制剂的所述中间中胚层诱导培养基中培养，(ii)随后在具有不高于第二浓度的所述细胞凋亡抑制剂的所述中间中胚层诱导培养基中培养。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中的RAPM是RAR激动剂。在一些实施方案中，所述RAPM包括视黄酸(RA)和/或TTNPB。在一些实施方案中，所述RAPM是RA。在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中RA的浓度为约0.5μM至约2μM。在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中RA的浓度为约1μM。在一些实施方案中，所述RAPM是TTNPB。在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中TTNPB的浓度为约0.2μM至约1μM。在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中TTNPB的浓度为约0.5μM。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中的FGF是FGF2。在一些实施方案中，所述FGF2的浓度为约10ng/mL至约30ng/mL。在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中FGF2的浓度为约20ng/mL。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中的糖原合酶激酶-3抑制剂是CHIR99021。在一些实施方案中，CHIR99021的浓度为约1μM至约5μM。在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中CHIR99021的浓度为约3μM。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中激活素A的浓度为约10ng/mL至约50ng/mL。在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中激活素A的浓度为约30ng/mL。
在任何实施方案中的一些实施方案中，在所述中间中胚层诱导培养基中，所述细胞凋亡抑制剂是Y-27632。在一些实施方案中，Y-27632的浓度为约5μM至约20μM。在一些实施方案中，在所述中间中胚层诱导培养基中，所述细胞凋亡抑制剂包括Chroman1、Emricasan和反式ISRIB。在一些实施方案中，所述细胞凋亡抑制剂是Chroman1。在一些实施方案中，Chroman1的浓度为约30nM至约70nM.。在一些实施方案中，所述细胞凋亡抑制剂是Emricasan。在一些实施方案中，Emricasan的浓度为约2μM至约10μM。在一些实施方案中，所述细胞凋亡抑制剂是反式ISRIB。在一些实施方案中，反式ISRIB的浓度为约0.2μM至约2μM。
在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中的所述细胞凋亡抑制剂是Y-27632，其中所述方法包括将所述第一中间细胞群：(i)首先在包含约10μM Y-27632的中间中胚层诱导培养基中培养；以及(ii)随后在具有不高于约2μM Y-27632的中间中胚层诱导培养基中培养。在一些实施方案中，在任何实施方案中的一些实施方案中，所述方法包括将所述第一中间细胞群：(i)首先在包含约10μM Y-27632的中间中胚层诱导培养基中培养约24小时，以及(ii)随后在具有不高于约2μM Y-27632的中间中胚层诱导培养基中培养约5-6天。
在任何实施方案中的一些实施方案中，在所述中间中胚层诱导培养基中培养的时间段为约4-14天。在任何实施方案中的一些实施方案中，在所述中间中胚层诱导培养基中培养的时间段为约5-9天。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中的细胞凋亡抑制剂是Y-27632，其中在所述中间中胚层诱导培养基中培养期间，Y-27632的浓度各自为：(a)在前24小时期间为约10μM；(b)在24小时与72小时之间为不高于约2μM；(c)在72小时与120小时之间为不高于约0.5μM；或者(d)在120小时后为不高于约0.1μM。在任何实施方案中的一些实施方案中，将所述第一中间细胞群在包含细胞凋亡抑制剂的中间中胚层诱导培养基中培养约24小时，并且其中在约24小时之后，首先将所述培养基的一部分用不包含所述细胞凋亡抑制剂的中间中胚层诱导培养基替换。在一些实施方案中，所述培养基的一部分为所述培养基的约80％。在一些实施方案中，所述方法进一步包括随后的培养基替换，其中所述培养基替换包括在培养开始24小时后，每约48小时将所述培养基的一部分替换。在一些实施方案中，在每次随后的培养基替换中所述培养基的一部分为所述培养基的约80％。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少90％的细胞表达以下中的一种或多种：OSR1、PAX2、LHX1和RUNX1。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少90％的细胞表达以下中的两种或更多种：OSR1、PAX2、LHX1和RUNX1。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少90％的细胞表达OSR1、PAX2和LHX1。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少90％的细胞是中间中胚层或中间中胚层样细胞。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述第二中间细胞群基本上由中间中胚层或中间中胚层样细胞组成。
在任何实施方案中的一些实施方案中，在性腺细胞诱导培养基中培养之前，将第二中间细胞群重新铺板到新的纤连蛋白包被的培养板上。在一些实施方案中，在重新铺板之前将第二中间细胞群酶促脱附、离心并且重悬。在一些实施方案中，将所述第二中间细胞群以约5000至约25000个细胞/cm2的密度铺板。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基进一步包含RAPM。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中的RAPM是RAR激动剂。在一些实施方案中，所述RAPM包括视黄酸(RA)和/或TTNPB。在一些实施方案中，所述RAPM是RA。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中RA的浓度为约0.5μM至约2μM。在一些实施方案中，所述RAPM是TTNPB。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中TTNPB的浓度为约0.2μM至约1μM。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基进一步包含细胞凋亡抑制剂。在一些实施方案中，在所述性腺细胞诱导培养基中，所述细胞凋亡抑制剂是Y-27632。在一些实施方案中，Y-27632的浓度为约5μM至约20μM。在一些实施方案中，Y-27632的浓度为约10μM。在一些实施方案中，在所述性腺细胞诱导培养基中，所述细胞凋亡抑制剂包括Chroman1、Emricasan和反式ISRIB。在一些实施方案中，所述细胞凋亡抑制剂是Chroman1并且Chroman1的浓度为约30nM至约70nM。在一些实施方案中，Chroman1的浓度为约50nM。在一些实施方案中，所述细胞凋亡抑制剂是Emricasan并且Emricasan的浓度为约2μM至约10μM。在一些实施方案中，Emricasan的浓度为约5μM。在一些实施方案中，所述细胞凋亡抑制剂是反式ISRIB并且反式ISRIB的浓度为约0.2μM至约2μM。在一些实施方案中，反式ISRIB的浓度为约0.7μM。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基进一步包含卵泡抑素。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中卵泡抑素的浓度为约10ng/mL至约50ng/mL。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中卵泡抑素的浓度为约25ng/mL。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中的BMP包括BMP4、BMP2、BMP7、BMP15或其任何组合。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基至少包含单独的或与另一种BMP组合的BMP4。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中包含的唯一BMP是BMP4。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中BMP的总浓度为约5ng/mL至约20ng/mL或约20ng/mL至约70ng/mL。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中BMP的总浓度为约10ng/mL或约50ng/mL。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中BMP4的浓度为约5ng/mL至约20ng/mL。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中BMP4的浓度或约20ng/mL至约70ng/mL。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中BMP4的浓度为约10ng/mL或约50ng/mL。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中的FGF包括FGF2、FGF9、FGF10、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19或其任何组合。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基至少包含单独的或与另一种FGF组合的FGF2。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中包含的唯一FGF是FGF2。在一些实施方案中，FGF的浓度为约1ng/mL至约10ng/mL或约5ng/mL至约25ng/mL。在一些实施方案中，FGF的浓度为约5ng/mL或约10ng/mL。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中的FGF是FGF2。在一些实施方案中，所述FGF2的浓度为约1ng/mL至约10ng/mL。在一些实施方案中，所述FGF2的浓度为约5ng/mL至约25ng/mL。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中FGF2的浓度为约5ng/mL或约10ng/mL。
在任何实施方案中的一些实施方案中，在性腺细胞诱导培养基中培养的时间段为约5天至约21天。在任何实施方案中的一些实施方案中，在性腺细胞诱导培养基中培养的时间段为约7天至约14天。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞群包含卵巢体细胞。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞群由卵巢体细胞组成。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少20％的细胞是FOXL2阳性细胞。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少20％的细胞是NR2F2阳性细胞。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少20％的细胞是KRT19阳性细胞。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞群的至少90％是FOXL2阳性细胞、NR2F2阳性细胞、和/或KRT-19阳性细胞。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞群基本上由FOXL2阳性细胞、NR2F2阳性细胞、和/或KRT-19阳性细胞组成。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述FOXL2阳性细胞包括颗粒细胞。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述NR2F2阳性细胞包括基质细胞和/或颗粒细胞。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述KRT-19阳性细胞包括卵巢上皮细胞。
在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的性腺细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含RAPM的方法产生的相应性腺细胞群相比，以下的一项或多项：(I)所述性腺细胞群中表达NR2F2的细胞的量增加；和/或(II)所述性腺细胞群中表达FOXL2的细胞的量增加；和/或(III)所述性腺细胞群中表达RUNX1的细胞的量增加；和/或(IV)所述性腺细胞群中表达WNT6的细胞的量增加；和/或(V)所述性腺细胞群中表达NR5A1的细胞的量增加；和/或(VI)所述性腺细胞群中表达OSR1的细胞的量增加；和/或(VII)所述性腺细胞群中表达LHX9的细胞的量增加；和/或(VIII)所述性腺细胞群中表达EMX2的细胞的量增加。
在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的性腺细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的RAPM的方法产生的相应性腺细胞群相比，以下一项或多项：(I)所述性腺细胞群中表达NR2F2的细胞的量增加；和/或(II)所述性腺细胞群中表达FOXL2的细胞的量增加；和/或(III)所述性腺细胞群中表达RUNX1的细胞的量增加；和/或(IV)所述性腺细胞群中表达WNT6的细胞的量增加；和/或(V)所述性腺细胞群中表达NR5A1的细胞的量增加；和/或(VI)所述性腺细胞群中表达OSR1的细胞的量增加。
在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的性腺细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应性腺细胞群相比，以下一项或多项：(I)所述性腺细胞群中表达NR2F2的细胞的量增加；和/或(II)所述性腺细胞群中表达FOXL2的细胞的量增加；和/或(III)所述性腺细胞群中表达RUNX1的细胞的量增加；和/或(IV)所述性腺细胞群中表达WNT6的细胞的量增加；和/或(V)所述性腺细胞群中表达NR5A1的细胞的量增加；和/或(VI)所述性腺细胞群中表达OSR1的细胞的量增加；和/或(VII)所述性腺细胞群中表达LHX9的细胞的量增加；和/或(VIII)所述性腺细胞群中表达EMX2的细胞的量增加。
在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的性腺细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应性腺细胞群相比，以下一项或多项：(I)所述性腺细胞群中表达NR2F2的细胞的量增加；和/或(II)所述性腺细胞群中表达FOXL2的细胞的量增加；和/或(III)所述性腺细胞群中表达RUNX1的细胞的量增加；和/或(IV)所述性腺细胞群中表达WNT6的细胞的量增加；和/或(V)所述性腺细胞群中表达NR5A1的细胞的量增加；和/或(VI)所述性腺细胞群中表达OSR1的细胞的量增加；和/或(VII)所述性腺细胞群中表达LHX9的细胞的量增加；和/或(VIII)所述性腺细胞群中表达EMX2的细胞的量增加。
在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的第二中间细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含RAPM的方法产生的相应第二中间细胞群相比，以下一项或多项：(I)所述第二中间细胞群中LHX1表达的量增加；和/或(II)所述第二中间细胞群中PAX2表达的量增加；和/或(III)所述第二中间群中WT1表达的量增加；和/或(IV)所述第二中间细胞群中RUNX1表达的量增加；和/或(V)所述第二中间细胞群的活力增加；和/或(VI)所述第二中间细胞群的细胞形态更均匀。
在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的第二中间细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的RAPM的方法产生的相应第二中间细胞群相比，以下一项或多项：(I)所述第二中间细胞群中LHX1表达的量增加；和/或(II)所述第二中间细胞群中PAX2表达的量增加；和/或(III)所述第二中间群中WT1表达的量增加；和/或(IV)所述第二中间细胞群中RUNX1表达的量增加；和/或(V)所述第二中间细胞群的活力增加；和/或(VI)所述第二中间细胞群的细胞形态更均匀。
在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的第二中间细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应第二中间细胞群相比，以下一项或多项：(I)所述第二中间细胞群中LHX1表达的量增加；和/或(II)所述第二中间细胞群中PAX2表达的量增加；和/或(III)所述第二中间群中WT1表达的量增加；和/或(IV)所述第二中间细胞群中RUNX1表达的量增加；和/或(V)所述第二中间细胞群的活力增加；和/或(VI)所述第二中间细胞群的细胞形态更均匀。
在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的第二中间细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应第二中间细胞群相比，(I)所述第二中间细胞群中LHX1表达的量增加；和/或(II)所述第二中间细胞群中PAX2表达的量增加；和/或(III)所述第二中间群中WT1表达的量增加；和/或(IV)所述第二中间细胞群中RUNX1表达的量增加；和/或(V)所述第二中间细胞群的活力增加；和/或(VI)所述第二中间细胞群的细胞形态更均匀。
在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的第二中间细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含RAPM的方法产生的相应第二中间细胞群相比，以下一项或多项：(I)所述第二中间细胞群分化为表达NR2F2的性腺细胞的潜力增加；和/或(II)所述第二中间细胞群分化为表达FOXL2的性腺细胞的潜力增加；和/或(III)所述第二中间细胞群分化为表达RUNX1的性腺细胞的潜力增加；和/或(IV)所述第二中间细胞群分化为表达WNT6的性腺细胞的潜力增加；和/或(V)所述第二中间细胞群分化为表达NR5A1的性腺细胞的潜力增加；和/或(VI)所述第二中间细胞群分化为表达OSR1的性腺细胞的潜力增加。
在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的第二中间细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的RAPM的方法产生的相应第二中间细胞群相比，(I)所述第二中间细胞群分化为表达NR2F2的性腺细胞的潜力增加；和/或(II)所述第二中间细胞群分化为表达FOXL2的性腺细胞的潜力增加；和/或(III)所述第二中间细胞群分化为表达RUNX1的性腺细胞的潜力增加；和/或(IV)所述第二中间细胞群分化为表达WNT6的性腺细胞的潜力增加；和/或(V)所述第二中间细胞群分化为表达NR5A1的性腺细胞的潜力增加；和/或(VI)所述第二中间细胞群分化为表达OSR1的性腺细胞的潜力增加。
在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的第二中间细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应第二中间细胞群相比，以下一项或多项：(I)所述第二中间细胞群分化为表达NR2F2的性腺细胞的潜力增加；和/或(II)所述第二中间细胞群分化为表达FOXL2的性腺细胞的潜力增加；和/或(III)所述第二中间细胞群分化为表达RUNX1的性腺细胞的潜力增加；和/或(IV)所述第二中间细胞群分化为表达WNT6的性腺细胞的潜力增加；和/或(V)所述第二中间细胞群分化为表达NR5A1的性腺细胞的潜力增加；和/或(VI)所述第二中间细胞群分化为表达OSR1的性腺细胞的潜力增加。
在任何实施方案中的一些实施方案中，在通过所述方法产生的第二中间细胞群中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应第二中间细胞群相比，以下一项或多项：(I)所述第二中间细胞群分化为表达NR2F2的性腺细胞的潜力增加；和/或(II)所述第二中间细胞群分化为表达FOXL2的性腺细胞的潜力增加；和/或(III)所述第二中间细胞群分化为表达RUNX1的性腺细胞的潜力增加；和/或(IV)所述第二中间细胞群分化为表达WNT6的性腺细胞的潜力增加；和/或(V)所述第二中间细胞群分化为表达NR5A1的性腺细胞的潜力增加；和/或(VI)所述第二中间细胞群分化为表达OSR1的性腺细胞的潜力增加。
在任何实施方案中的一些实施方案中，通过所述方法产生的性腺细胞群是这样的性腺细胞群，其中：与通过其中所述性腺细胞诱导培养基包含较低浓度的RAPM的方法产生的相应性腺细胞群相比，(I)所述性腺细胞群中FOXL2表达的量减少；和/或(II)所述性腺细胞群中NR1H4和/或KITLG表达的量减少；和/或(III)所述性腺细胞群中KRT-19表达的量增加；和/或(IV)所述性腺细胞群中胞质KRT-19表达的量增加；和/或(V)所述性腺细胞群中MSLN、LRRN4和/或TMEM151A表达的量增加。
在任何实施方案中的一些实施方案中，通过所述方法产生的性腺细胞群是这样的性腺细胞群，其中：与通过其中所述性腺细胞诱导培养基不包含RAPM的方法产生的相应性腺细胞群相比，(I)所述性腺细胞群中FOXL2表达的量减少；和/或(II)所述性腺细胞群中NR1H4和/或KITLG表达的量减少；和/或(III)所述性腺细胞群中KRT-19表达的量增加；和/或(IV)所述性腺细胞群中胞质KRT-19表达的量增加；和/或(V)所述性腺细胞群中MSLN、LRRN4和/或TMEM151A表达的量增加。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺细胞群是这样的性腺细胞群，其中：与通过包括与RAPM接触较短时间段的性腺细胞诱导步骤产生的相应性腺细胞群相比，(I)所述性腺细胞群中FOXL2表达的量减少；和/或(II)所述性腺细胞群中NR1H4和/或KITLG表达的量减少；和/或(III)所述性腺细胞群中KRT-19表达的量增加；和/或(IV)所述性腺细胞群中胞质KRT-19表达的量增加；和/或(V)所述性腺细胞群中MSLN、LRRN4和/或TMEM151A表达的量增加。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述多能干细胞是哺乳动物干细胞。在一些实施方案中，所述多能干细胞是人多能干细胞。在一些实施方案中，所述多能干细胞是牛干细胞。在一些实施方案中，所述多能干细胞是鼠多能干细胞。在一些实施方案中，所述多能干细胞是胚胎干细胞或诱导多能干细胞。
在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺群包括选自以下的一个或多个群：颗粒细胞、卵巢基质细胞和上皮细胞或其组合。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺群包含颗粒细胞、卵巢基质细胞和上皮细胞的混合物。
本文提供了通过所提供的任何方法产生的性腺细胞群。在一些实施方案中，所述性腺群包括选自以下的一个或多个群：颗粒细胞、卵巢基质细胞和上皮细胞或其组合。在一些实施方案中，所述性腺群包含颗粒细胞、卵巢基质细胞和上皮细胞的混合物。
本文提供了通过所提供的任何方法产生的第一中间细胞群。
本文提供了通过任何所提供的实施方案产生的第二中间细胞群。
所提供的实施方案为：
1.一种产生颗粒细胞的方法，所述方法包括：
将多能干细胞在存在激活素A、糖原合酶激酶-3抑制剂和ROCK抑制剂的情况下培养以产生初期中胚层样细胞(iMeLC)，
将所述iMeLC在存在FGF2、糖原合酶激酶-3抑制剂和ROCK抑制剂的情况下培养第一时间段，
降低所述iMeLC培养中的ROCK抑制剂的量并且然后将所述iMeLC培养第二时间段以产生中间中胚层细胞，以及
将所述中间中胚层细胞在存在卵泡抑素、BMP4、FGF2和ROCK抑制剂的情况下培养以产生所述颗粒细胞。
2.根据实施方案1所述的方法，其中所述糖原合酶激酶-3抑制剂是CHIR99021。
3.根据实施方案1或2所述的方法，其中所述ROCK抑制剂是Y-27632或CET。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中将所述多能干细胞培养约56至72小时。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中将所述多能干细胞培养约65小时。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中将多能干细胞在包含激活素A、糖原合酶激酶-3抑制剂和ROCK抑制剂的培养基中培养，并且其中每约24小时将所述培养基用新鲜培养基替换。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述第一时间段为约24小时。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述第二时间段为约5或6天。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中将所述iMeLC在包含所述FGF2、糖原合酶激酶-3抑制剂和ROCK抑制剂的培养基中培养第一时间段，并且其中在所述第一时间段后，将所述培养基的一部分用包含FGF2和糖原合酶激酶-3抑制剂但不包含ROCK抑制剂的培养基替换。
10.根据实施方案9所述的方法，其中所述培养基的一部分为所述培养基的约80％。
11.根据实施方案9或10所述的方法，其中所述方法进一步包括在所述第二时间段期间，每约48小时替换所述培养基的第二部分。
12.根据实施方案11所述的方法，其中所述培养基的第二部分为所述培养基的约80％。
13.根据实施方案11-12中任一项所述的方法，其中将所述中间中胚层细胞培养约5-7天的时间段。
14.根据实施方案11-13中任一项所述的方法，其中将所述中间中胚层细胞在包含卵泡抑素、BMP4、FGF2和ROCK抑制剂的培养基中培养，并且其中每约24至48小时将所述培养基的一部分用新鲜培养基替换。
15.根据实施方案11-14中任一项所述的方法，其中所述iMeLC表达Brachyury。
16.根据实施方案11-13中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层细胞表达OSR1、PAX2和LHX1。
17.根据实施方案11-16中任一项所述的方法，其中所述颗粒细胞表达FOXL2和连接蛋白43。
18.根据实施方案11-17中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是人诱导多能干细胞。
19.一种群，所述群包含通过根据实施方案11-18中任一项所述的方法产生的颗粒细胞。
在任何所提供的实施方案中，包括所提供的任何方法或群的实施方案，(a)所述培养步骤中的一步或多步包括贴壁培养；和/或(b)所述培养步骤中的一步或多步包括3维类器官培养。在一些实施方案中，所述培养步骤中的一步或多步包括贴壁培养。在一些实施方案中，所述培养步骤中的一步或多步包括3维类器官培养。
在所提供的任何实施方案中的一些中，在体外进行所述方法。在一些实施方案中，所述方法产生体外干细胞衍生的性腺细胞群。在特定实施方案中，所述细胞是体外干细胞衍生的性腺体细胞群，诸如卵巢体细胞群(OSC)。
本文还提供了一种体外干细胞衍生的性腺体细胞群，所述体外干细胞衍生的性腺体细胞群包含表达FOXL2的细胞、表达NR2F2的细胞和/或表达KRT-19的细胞。在一些实施方案中，所述性腺体细胞群是卵巢体细胞群。在一些实施方案中，所述群至少包含表达FOXL2的第一细胞类型、表达NR2F2的第二细胞类型和表达KRT-19的第三细胞类型。在一些实施方案中，所述细胞群中至少20％的细胞是FOXL2阳性细胞。在一些实施方案中，所述细胞群中至少20％的细胞是NR2F2阳性细胞。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少20％的细胞是KRT19阳性细胞。在一些实施方案中，(a)所述细胞群中至少20％的细胞是FOXL2阳性细胞；和/或(b)所述细胞群中至少20％的细胞是NR2F2阳性细胞；和/或(c)所述性腺细胞群中至少20％的细胞是KRT19阳性细胞。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中的至少90％是FOXL2阳性细胞、NR2F2阳性细胞和/或KRT-19阳性细胞；任选地其中：所述性腺体细胞群基本上由FOXL2阳性细胞、NR2F2阳性细胞和/或KRT-19阳性细胞组成。在一些实施方案中，所述FOXL2阳性细胞包括颗粒细胞；所述NR2F2阳性细胞包括卵巢基质细胞和/或颗粒细胞；并且所述KRT-19阳性细胞包括卵巢上皮细胞。
在任何所提供的性腺体细胞群的实施方案的一些中，所述细胞群是从多能干细胞分化的。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺体细胞群是在包括以下的方法中衍生的：(a)将多能干细胞在包含激活素A的中胚层诱导培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；(b)将所述第一中间细胞群在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养第二时间段，从而产生第二中间细胞群；以及(c)将所述第二中间细胞群在包含BMP和FGF以及任选地卵泡抑素的性腺细胞诱导培养基中培养第三时间段以产生所述性腺细胞群。
在任何实施方案中的一些实施方案中，将所述性腺体细胞群被冷冻保存或者已经被冷冻保存。在一些实施方案中，提供了包含性腺体细胞群的组合物。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含冷冻保护剂。
附图说明
通过参考以下附图公开了本发明的代表性实施方案。应当理解，所描绘的实施方案不限于所示出的精确细节。
图1A和图1B示出了中胚层诱导的表征，展示了iMeLC的形态(图1A)；用荧光标记的抗Brachyury抗体染色iMeLC和未诱导的细胞(图1B)。
图2A-图2D示出了中间中胚层诱导的特征，展示了IM细胞在培养第5天的形态(图2A)；分化期间OSR1在iPSC、iMeLC和IM中的表达模式(图2B)；分化期间PAX2在iPSC、iMeLC和IM中的表达模式(图2C)；以及分化期间LHX1在iPSC、iMeLC和IM中的表达模式(图2D)。
图3A-图3C示出了性腺细胞分化的特征，展示了性腺细胞在培养第7天的形态(图3A)，在颗粒细胞中高度表达的转录因子FOXL2的染色(图3B)；对FOXL2(图3C第二行)和连接蛋白43(图3C第三行)染色的IM、肾细胞和颗粒细胞的代表性免疫荧光图像。
图4示出了从iPSC体外性腺细胞分化期间的CD24表达模式。
图5A-图5C示出了视黄酸(RA)在IM诱导中的作用。RA/TTNPB处理导致增加的细胞存活率和均匀的细胞形态(图5A)，其中IM标记物-LHX1、PAX2-的表达随着RA和CHIR浓度的递增而显示出更高的表达(图5B)。IM谱系的其他标记物-WT1和RUNX1-的表达随着RA或TTNPB浓度的递增而显示出相似的增加(图5C)。
图6A-图6E示出了视黄酸(RA)处理的IM细胞展现出更好的存活和性腺体细胞分化的诱导。图6A展示了在任何阶段没有RA处理的大量RNAseq实验，体外性腺体细胞展现出颗粒细胞标记物-FOXL2、RUNX1、NR2F2、WNT6和KRT19-的表达增加。图6B示出了在颗粒细胞的长期培养中，经RA处理的细胞展现出更好的存活和更高的FOXL2和RUNX1表达。图6C是针对颗粒细胞的FOXL2和NR2F2的免疫荧光染色。图6D示出了在第二中间细胞群分化期间用RA连续处理导致KRT19表达增加。图6E示出了在性腺体细胞培养的第28天针对KRT19的免疫荧光染色。
图7示出了颗粒细胞标记物Foxl2、卵巢基质细胞Nr2f2和卵巢上皮细胞KRT19的qRT-PCR。将鼠分化方案第13天的表达与添加或视黄酸(RA)的基础颗粒细胞基础培养基进行比较。包括阳性和阴性对照，分别作为e13小鼠卵巢和mPSC。
图8示出了在颗粒细胞诱导7天后的鼠分化方案的第13天的免疫荧光染色，示出了除了颗粒细胞基础培养基生长因子之外添加和不添加1μM视黄酸处理的细胞数量和Foxl2、NR2F2和KRT19的表达水平。
图9A示出了用不同FGF家族成员诱导卵巢体细胞(OSC)后双能卵巢体细胞祖细胞的标记物的相对表达水平。图9B示出了用不同FGF家族成员诱导OSC后成熟卵巢颗粒细胞的标记物的相对表达水平。
图10A示出了用不同BMP同种型诱导OSC后双能卵巢体细胞祖细胞的标记物的相对表达水平。图10B示出了用不同BMP同种型诱导OSC后成熟卵巢颗粒细胞标记物的相对表达水平。
图11A示出了类固醇生成酶CYP19A1在OSC分化的不同阶段(iPSC阶段；IM D5-中间中胚层的第5天；OSC D7基础-颗粒细胞基础培养基中OSC诱导的第7天；OSC D7-颗粒细胞双倍培养基中OSC诱导的第7天)的相对表达。图11B示出了当将OSC用指示量的dhT处理24小时(左四个条)或48小时(右两个条)时分泌的雌二醇。
图12A、图12C和图12E示出了用指示量的卵泡抑素(Foll)、FGF2(FGF)和BMP4(BMP)诱导OSC后，双能卵巢体细胞祖细胞的标记物GATA4的相对表达水平。图12B、图12D、图12F示出了用指示量的卵泡抑素(Foll)、FGF2(FGF)和BMP4(BMP)诱导OSC后，成熟卵巢颗粒细胞的标记物FOXL2的相对表达水平。
图13A展示了一组免疫荧光图像，其指示当在不存在视黄酸(RA)的情况下诱导OSC时，颗粒细胞标记物FOXL2和卵巢上皮细胞标记物KRT19的表达。图13B展示了一组免疫荧光图像，其指示当在存在500nM视黄酸(RA)的情况下诱导OSC时，颗粒细胞标记物FOXL2和卵巢上皮细胞标记物KRT19的表达。图13C和图13D分别示出了当在指示浓度的RA中诱导OSC时，颗粒细胞标记物FOXL2和卵巢上皮细胞标记物KRT19的相对表达水平。图13E和图13F分别示出了在存在指示浓度的RA的情况下诱导OSC持续指示的持续时间时，颗粒细胞标记物FOXL2和卵巢上皮细胞标记物KRT19的相对表达水平。
图14A和图14B分别示出了前200个高度可变基因的热图以及归一化且经处理的数据的主组分分析，指示从第一中间阶段到第二中间阶段之间以及从第二中间阶段到OSC之间的过渡期间基因表达谱的变化。图14C示出了在此实验中分析的多于10,000个细胞的组中观察到的具有增加的表达的不同基因簇。图14D、图14E、图14F、图14G分别地示出了在用基础颗粒细胞培养基(基础)、双倍颗粒细胞培养基(双倍)并且有或没有视黄酸处理(RA)的性腺体细胞诱导(OSC诱导)的第7天和第14天时细胞的双能性腺体细胞标记物、卵巢基质细胞标记物、颗粒细胞标记物、和卵巢上皮细胞标记物的表达。
图15示出了指示卵巢体细胞(表达GATA4和NR5A1的细胞)以及卵巢上皮/间皮细胞(表达KRT19的细胞)的存在的免疫荧光图像。
具体实施方式
在一些方面，本公开文本涉及从多能干细胞产生性腺细胞群诸如卵巢体细胞的方法。还包括性腺细胞群以及其中产生的中间细胞群。
将在本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用以其整体并入，其并入程度如同将每个单独出版物通过引用单独并入一般。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开申请和其他出版物中阐述的定义相反或在其他方面不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
本文所用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
通用技术
本文所述或参考的技术和程序通常是本领域技术人员充分理解和使用常规方法通常使用的，例如像在以下文献中所述的广泛使用的方法：Molecular Cloning:ALaboratory Manual(ambrook等人,第4版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,2012)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑,2003)；丛书Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；PCR 2:A PracticalApproach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑,1995)；Antibodies,ALaboratory Manual(Harlow和Lane编辑,1988)；Culture of Animal Cells:A Manual ofBasic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney,第6版,J.Wiley andSons,2010)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑,1984)；Methods in MolecularBiology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编辑,Academic Press,1998)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,Plenum Press,1998)；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,J.Wiley and Sons,1993-8)；Handbook ofExperimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑,1996)；Gene TransferVectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；PCR:ThePolymerase Chain Reaction,(Mullis等人编辑,1994)；Current Protocols inImmunology(J.E.Coligan等人编辑,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑,J.Wiley and Sons,2002)；Immunobiology(C.A.Janeway等人,2004)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty编辑,IRLPress,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean编辑,Oxford University Press,2000)；Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编辑,Harwood Academic Publishers,1995)；和Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人编辑,J.B.LippincottCompany,2011)。
定义
出于解释本说明书的目的，以下定义将适用并且在适当时，以单数形式使用的术语也包括复数并且反之亦然。在下文列出的任何定义与通过引用并入本文的任何文献发生冲突的情况下，应该以列出的定义为准。
除非另有指示，否则如本文所用的单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数个指示物。
应理解，本文描述的本发明的方面和实施方案包括“包含方面和实施方案”、“由方面和实施方案组成”和/或“基本上由方面和实施方案组成”。
如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知晓的相应值的通常误差范围。在本文中提及“约”某值或参数包括(并且描述)涉及该值或参数本身的实施方案。
如本文所用的术语“同质的”是指在整个结构或组成上一致或均匀的物质。在一些例子中，所述术语是指在给定群内具有一致的成熟状态、标记物表达或表型的细胞。
如本文所用，术语“抑制”可以指阻断、减少、消除或以其他方式拮抗特定靶标的存在或活性的行为。例如，抑制Tau蛋白的磷酸化可以指导致降低、减少、拮抗消除、阻断或以其他方式减弱Tau蛋白磷酸化的任何行为。抑制可以指部分抑制或完全抑制。在其他例子中，核酸表达的抑制可以包括但不限于核酸转录的减少、mRNA丰度的减少(例如，mRNA转录沉默)、mRNA的降解、mRNA翻译的抑制等。
如本文所用，术语“抑制”可以指降低、减少、禁止、限制、减轻或以其他方式减弱特定靶标的存在或活性的行为。抑制可以指部分抑制或完全抑制。例如，抑制Tau蛋白的磷酸化可以指导致降低、减少、禁止、限制、减轻或以其他方式减弱Tau蛋白磷酸化的任何行为。在其他例子中，核酸表达的抑制可以包括但不限于核酸转录的减少、mRNA丰度的减少(例如，mRNA转录沉默)、mRNA的降解、mRNA翻译的抑制等。
如本文所用，术语“增强”可以指改善、增强、增高或以其他方式增加特定靶标的存在或活性的行为。例如，增强类固醇生成可以指导致改善、增强、增高或以其他方式增加类固醇生成的任何行为。
如本文所用，术语“调节(modulate)”可以指改变(changing)、改变(altering)、变化(varying)或以其他方式修改特定靶标的存在或活性的行为。例如，调节信号传导通路可以包括但不限于导致改变(changing)、改变(altering)、变化(varying)或以其他方式修改信号传导通路的活性的任何行为。在一些例子中，“调节”是指增强特定靶标的存在或活性。在一些例子中，“调节”是指抑制特定靶标的存在或活性。例如，调节视黄酸信号传导的量可以包括但不限于抑制或增强视黄酸信号传导的量。
如本文所用，术语“诱导”可以指启动、促进、刺激、建立或以其他方式产生结果的行为。例如，诱导突变基因的表达可以指导致启动、促进、刺激、建立或以其他方式产生所希望的突变基因表达的任何行为。在其他例子中，诱导核酸的表达可以包括但不限于核酸转录的启动、mRNA翻译的启动等。在一些例子中，诱导胚层可以指导致或设计用于导致启动、促进、刺激、建立或以其他方式产生所希望的胚层衍生的任何行为。
除非进一步定义，否则如本文所用，“干细胞”是指任何非体细胞。不是终末分化或终末定型的细胞的任何细胞都可以称为干细胞。这包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、造血干细胞、祖细胞和部分分化的祖细胞。干细胞可以是全能干细胞、多能干细胞或多潜能干细胞。出于本申请的目的，具有分化为两种不同类型的细胞的潜力的任何细胞均被视为干细胞。
如本文所用，“药学上可接受的”或“药理学上可相容的”意指不是生物学上或其他方面非期望的材料，例如，所述材料可以掺入施用给患者的药物组合物中而不引起任何显著的非期望的生物作用或以有害方式与其所处组合物的其他组分中的任一种相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂优选满足毒理学和生产测试的要求标准和/或根据由美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug administration)编制的非活性成分指南(InactiveIngredient Guide)被包含。
对于本文所述的任何结构和功能特征，确定这些特征的方法在本领域中是已知的。
性腺后代细胞的衍生、分化和成熟
人iPSC已经成为人类疾病建模的强大工具，并且在靶标发现和药物开发方面具有巨大的转化研究潜力。
尽管最近的进展表明卵母细胞可以在体外从多能干细胞产生，但是这些衍生的细胞仍需要适当的体细胞环境才能完全发育为生殖细胞。只有当与正确组成的卵巢体细胞组合时，早期原始生殖细胞或体外衍生的原始生殖细胞样细胞才能成熟为配子。本文提供了从多能干细胞产生性腺细胞群诸如特别是卵巢体细胞的方法。在一些实施方案中，所提供的细胞群可以用于支持体外卵母细胞发育(诸如与体外配子发生有关)的方法中。
干细胞分化的进展经由可通过基因表达变化鉴定的多个阶段。描述了通过一系列稳定的稳定状态逐步转化干细胞来产生性腺细胞(诸如卵巢体细胞)的方法。在一些实施方案中，优化条件以获得最大纯度和效率，以便获得纯的同质卵巢体细胞培养物。在其他实施方案中，优化条件以获得某些异质卵巢体细胞培养物，所述异质卵巢体细胞培养物包含颗粒细胞、卵巢基质细胞和卵巢上皮细胞。在一些实施方案中，本文提供了颗粒细胞分化的两个关键中间步骤。在一些实施方案中，本文提供了卵巢体细胞分化的两个关键中间步骤。在一些实施方案中，两个关键中间步骤包括使多能干细胞首先分化为中胚层中间体，然后分化为中间中胚层群，然后驱动细胞成为性腺细胞群(诸如卵巢体细胞、OSC)。
在一些实施方案中，本文所述的方案可以用于来自不同哺乳动物(诸如但不限于人、小鼠、牛)的不同干细胞系。对于稳健的分化，通过改变诱导剂(例如，细胞因子或小分子)的浓度和持续时间，可以在每个步骤优化某些标记物的表达。更重要的是，由于不同卵巢体细胞类型(诸如但不限于颗粒细胞、上皮细胞和基质细胞)的精确平衡和组织可能是形成功能性“微型卵巢”以促进配子产生和成熟所必需的，所以通过改变诱导剂的浓度和持续时间来优化卵巢体细胞的最终组成。本文的发现支持，使用不同浓度的特定化合物(诸如但不限于视黄酸和糖原合酶激酶3)以及在中间中胚层诱导和/或性腺细胞群诱导期间孵育的不同时间表明产生性腺细胞群，所述性腺细胞群包括卵巢体细胞的各种组装，包括颗粒细胞、上皮细胞和基质细胞。将如本文说明书中展示的此类优化置于将处理不同遗传背景的细胞系的稳健通用方法的方案中。此类方法和细胞群还可以定制并且促进通过不同方案产生的多能干细胞衍生的卵母细胞的发育和成熟。
衍生性腺细胞群
产生性腺细胞群和中间细胞群的方法
在一些方面，本文提供了从多能干细胞产生性腺体细胞群的方法。在一些实施方案中，本文提供了一种产生性腺体细胞群的方法，所述方法包括：(a)将多能干细胞在包含激活素A的中胚层诱导培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；(b)将所述第一中间细胞群在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养第二时间段，从而产生第二中间细胞群；以及(c)将所述第二中间细胞群在包含BMP和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养第三时间段以产生所述性腺细胞群。
在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基进一步包含卵泡抑素。
在一些方面，本文提供了从多能干细胞产生性腺细胞群的方法。在一些实施方案中，本文提供了一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：(a)将多能干细胞在包含激活素A的中胚层诱导培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；(b)将所述第一中间细胞群在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养第二时间段，从而产生第二中间细胞群；以及(c)将所述第二中间细胞群在包含卵泡抑素、BMP4和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养第三时间段以产生所述性腺细胞群。
在一些实施方案中，提供了一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：(a)将中胚层或中胚层样细胞在包含RAPM的中间中胚层诱导培养基中培养第一时间段从而产生第二中间细胞群；以及(b)将所述第二中间细胞群在包含BMP和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养第二时间段以产生所述性腺细胞群。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基进一步包含卵泡抑素。在一些实施方案中，提供了一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：(a)将中胚层或中胚层样细胞在包含RAPM的中间中胚层诱导培养基中培养第一时间段从而产生第二中间细胞群；以及(b)将所述第二中间细胞群在包含卵泡抑素、BMP4和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养第二时间段以产生所述性腺细胞群。
在一些实施方案中，提供了一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：将中间中胚层或中间中胚层样细胞在包含BMP和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养一段时间以产生所述性腺细胞群。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基进一步包含卵泡抑素。在一些实施方案中，本文提供了一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括将中间中胚层或中间中胚层样细胞在包含卵泡抑素、BMP4和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养一段时间以产生所述性腺细胞群。
在一些实施方案中，提供了一种产生第一中间细胞群的方法，所述方法包括：将多能干细胞在包含激活素A和糖原合酶激酶-3抑制剂的中胚层诱导培养基中培养一段时间以产生第一中间细胞群。
在一些实施方案中，提供了一种产生第二中间细胞群的方法，所述方法包括：将中胚层或中胚层样细胞在包含RAPM的培养基中培养一段时间，从而产生第二中间细胞群。
在一些实施方案中，提供了一种产生第二中间细胞群的方法，所述方法包括：(a)将多能干细胞在包含激活素A和糖原合酶激酶-3抑制剂的培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；(b)将所述第一中间细胞群在包含RAPM、FGF和糖原合酶激酶-3抑制剂的培养基中培养第二时间段，从而产生第二中间细胞群。
在根据本文所述任一种方法的一些实施方案中，
性腺细胞群和中间细胞群
在一些方面，提供了一种体外干细胞衍生的性腺体细胞群，所述体外干细胞衍生的性腺体细胞群包含表达FOXL2的细胞、表达NR2F2的细胞和/或表达KRT-19的细胞，任选地其中所述性腺体细胞群是卵巢体细胞群。在一些实施方案中，所述性腺体细胞群是通过包括以下的方法产生的：(a)将多能干细胞在包含激活素A的中胚层诱导培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；(b)将所述第一中间细胞群在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养第二时间段，从而产生第二中间细胞群；以及(c)将所述第二中间细胞群在包含BMP和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养第三时间段，从而产生所述性腺细胞群。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基进一步包含卵泡抑素。
还提供了通过本文所述方法产生的性腺细胞群以及中间细胞群。在一些实施方案中，本文提供了通过包括以下的方法产生的性腺细胞群：(a)将多能干细胞在包含激活素A的中胚层诱导培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；(b)将所述第一中间细胞群在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养第二时间段，从而产生第二中间细胞群；以及(c)将所述第二中间细胞群在包含卵泡抑素、BMP4和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养第三时间段，从而产生所述性腺细胞群。在一些实施方案中，本文提供了通过包括以下的方法产生的性腺细胞群：(a)将多能干细胞在包含激活素A的中胚层诱导培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；(b)将所述第一中间细胞群在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养第二时间段，从而产生第二中间细胞群；以及(c)将所述第二中间细胞群在包含BMP和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养第三时间段，从而产生所述性腺细胞群。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基进一步包含卵泡抑素。
在一些实施方案中，本文提供了通过包括以下的方法产生的性腺细胞群：(a)将中胚层或中胚层样细胞在包含RAPM的中间中胚层诱导培养基中培养第一时间段从而产生第二中间细胞群；以及(b)将所述第二中间细胞群在包含卵泡抑素、BMP4和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养第二时间段，从而产生所述性腺细胞群。在一些实施方案中，本文提供了通过包括以下的方法产生的性腺细胞群：(a)将中胚层或中胚层样细胞在包含RAPM的中间中胚层诱导培养基中培养第一时间段从而产生第二中间细胞群；以及(b)将所述第二中间细胞群在包含BMP和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养第二时间段，从而产生所述性腺细胞群。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基进一步包含卵泡抑素。
在一些实施方案中，提供了通过包括以下的方法产生的性腺细胞群：将中间中胚层或中间中胚层样细胞在包含卵泡抑素、BMP4和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养一段时间以产生所述性腺细胞群。在一些实施方案中，提供了通过包括以下的方法产生的性腺细胞群：将中间中胚层或中间中胚层样细胞在包含BMP和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养一段时间以产生所述性腺细胞群。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基进一步包含卵泡抑素。
在一些实施方案中，提供了通过包括以下的方法产生的第一中间细胞群：将多能干细胞在包含激活素A和糖原合酶激酶-3抑制剂的中胚层诱导培养基中培养一段时间，从而产生第一中间细胞群。
在一些实施方案中，提供了第二中间细胞群，所述方法包括：将中胚层或中胚层样细胞在包含RAPM的培养基中培养一段时间，从而产生第二中间细胞群。
在一些实施方案中，提供了通过包括以下的方法产生的第二中间细胞群：(a)将多能干细胞在包含激活素A和糖原合酶激酶-3抑制剂的培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；(b)将所述第一中间细胞群在包含RAPM、FGF和糖原合酶激酶-3抑制剂的培养基中培养第二时间段，从而产生第二中间细胞群。
诱导培养基、分化方案和前体细胞
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，所述多能干细胞是人多能干细胞或鼠多能干细胞。在一些实施方案中，所述多能干细胞是胚胎干细胞或诱导多能干细胞。在一些实施方案中，所述多能干细胞是哺乳动物多能干细胞。在一些实施方案中，所述多能干细胞是鼠或人多能干细胞。在一些实施方案中，所述多能干细胞是鼠多能干细胞。在一些实施方案中，所述多能干细胞是人多能干细胞。在一些实施方案中，所述多能干细胞是牛多能干细胞。
在一些实施方案中，将所述多能干细胞以约10,000至约40,000个细胞/cm2的密度接种。在一些实施方案中，
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中激活素A的浓度为约30ng/mL至约70ng/mL。在一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中激活素A的浓度为约50ng/mL。在一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中激活素A的浓度约为以下任一个：5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200、300、400或500ng/mL或介于其之间的任何浓度之一。在一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中激活素A的浓度约为以下任一个：约30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68或70ng/mL或介于其之间的任何浓度之一。
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基进一步包含FGF。在一些实施方案中，所述FGF是以下中的一种或多种：FGF2、FGF4或FGF9，在一些实施方案中，所述FGF是FGF2。在一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基包含FGF2，其中FGF2的浓度约为以下中的任一个：0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100ng/mL或介于其之间的任何浓度之一。在一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中FGF2的浓度为约5ng/mL至约20ng/mL。在一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中FGF2的浓度为约12ng/mL。
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基进一步包含BMP4。在一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中BMP4的浓度约为以下中的任一个：5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200、300、400或500ng/mL或介于其之间的任何浓度之一。在一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中BMP4的浓度约为以下中的任一个：约10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50ng/mL或介于其之间的任何浓度之一。在一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中BMP4的浓度为约10ng/mL至约50ng/mL。在一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中BMP4的浓度为约30ng/mL。
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基进一步包含糖原合酶激酶-3抑制剂。在一些实施方案中，所述糖原合酶激酶-3抑制剂是CHIR99021。在一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中CHIR99021的浓度约为以下中的任一个：0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0μM或介于其之间的任何浓度之一。在一些实施方案中，CHIR99021的浓度为约1μM至约5μM。在一些实施方案中，CHIR99021的浓度为约3μM。
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基进一步包含细胞凋亡抑制剂。在一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中的所述细胞凋亡抑制剂是Y-27632。在一些实施方案中，Y-27632的浓度约为以下中的任一个：0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100ng/mL或介于其之间的任何浓度之一。在一些实施方案中，Y-27632的浓度为约5μM至约20μM。在一些实施方案中，Y-27632的浓度为约10μM。在一些实施方案中，所述中胚层诱导培养基中的所述细胞凋亡抑制剂包括Chroman1、Emricasan和反式ISRIB。在一些实施方案中，Chroman1的浓度为约30nM至约70nM，Emricasan的浓度为约2μM至约10μM，和/或反式ISRIB的浓度为约0.2μM至约2μM。在一些实施方案中，Chroman1的浓度为约50nM，Emricasan的浓度为约5μM，和/或反式ISRIB的浓度为约0.7μM。
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，在中胚层诱导培养基中培养的时间段约为以下中的任一个：12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96、120、144、168、192小时或介于其之间的任何长度之一。在一些实施方案中，在中胚层诱导培养基中培养的时间段至少约为以下中的任一个：12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96、120、144、168、192小时。在一些实施方案中，在中胚层诱导培养基中培养的时间段为约24小时至约96小时。在一些实施方案中，在中胚层诱导培养基中培养的时间段为约24小时至约72小时。在一些实施方案中，在中胚层诱导培养基中培养的时间段为约56小时至约72小时。
在一些实施方案中，在中间中胚层诱导培养基中培养之前，将所述第一中间细胞群重新铺板到新的纤连蛋白包被的培养板上；任选地其中在重新铺板之前将所述第一中间细胞群酶促脱附、离心并且重悬。在一些实施方案中，将所述第一中间细胞群以约5000至约25000个细胞/cm2的密度铺板。在一些实施方案中，将所述第一中间细胞群以约25000至约75000个细胞/cm2的密度铺板。在一些实施方案中，将所述第一中间细胞群以约75000至约150000个细胞/cm2的密度铺板。在一些实施方案中，将所述中胚层或中胚层样细胞以约5000至约25000个细胞/cm2的密度铺板。在一些实施方案中，将所述中胚层或中胚层样细胞以约25000至约75000个细胞/cm2的密度铺板。在一些实施方案中，将所述中胚层或中胚层样细胞以约75000至约150000个细胞/cm2的密度铺板。
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中的RAPM是RAR激动剂。在一些实施方案中，所述RAPM包括视黄酸(RA)和/或TTNPB。在一些实施方案中，所述RAPM是RA。在一些实施方案中，所述RAPM是TTNPB。在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中RA的浓度约为以下中的任一个：0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0μM或介于其之间的任何浓度之一。在一些实施方案中，TTNPB的浓度约为以下中的任一个：0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、20.0μM或介于其之间的任何浓度之一。在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中RA的浓度为约0.5μM至约2μM，和/或所述中间中胚层诱导培养基中TTNPB的浓度为约0.2μM至约1μM。在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中RA的浓度为约1μM；和/或所述中间中胚层诱导培养基中TTNPB的浓度为约0.5μM。
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基进一步包含FGF。在一些实施方案中，所述FGF是以下中的一种或多种：FGF2、FGF4或FGF9，在一些实施方案中，所述FGF是FGF2。在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基包含FGF2，其中FGF2的浓度约为以下中的任一个：0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、60、70、80、90、100ng/mL或其之间的任一浓度。在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中FGF2的浓度为约10ng/mL至约30ng/mL。在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中FGF2的浓度为约20ng/mL。
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基进一步包含糖原合酶激酶-3抑制剂。在一些实施方案中，所述糖原合酶激酶-3抑制剂是CHIR99021。在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中CHIR99021的浓度约为以下中的任一个：0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0μM或介于其之间的任何浓度之一。在一些实施方案中，CHIR99021的浓度为约1μM至约5μM。在一些实施方案中，CHIR99021的浓度为约3μM。
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，最终卵巢体细胞群的不同组成可以在不同浓度和暴露持续时间的诱导剂(诸如生长因子或小分子)下实现。
在一些实施方案中，不同浓度和暴露持续时间的RAPM和/或糖原合酶激酶-3抑制剂可用于所述第二中间细胞群的衍生。在一些实施方案中，当在衍生期间使用不同浓度和暴露持续时间的RAPM和/或糖原合酶激酶-3抑制剂时，由此产生的第二中间细胞群的发育潜力变得不同。在一些实施方案中，所述RAPM包括视黄酸(RA)和/或TTNPB。在一些实施方案中，所述RAPM是RA。在一些实施方案中，所述RAPM是TTNPB。
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基进一步包含细胞凋亡抑制剂。在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中的所述细胞凋亡抑制剂是Y-27632。在一些实施方案中，Y-27632的浓度约为以下中的任一个：0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100ng/mL或介于其之间的任何浓度之一。在一些实施方案中，Y-27632的浓度为约5μM至约20μM。在一些实施方案中，Y-27632的浓度为约10μM。在一些实施方案中，所述中间中胚层诱导培养基中的所述细胞凋亡抑制剂包括Chroman1、Emricasan和反式ISRIB。在一些实施方案中，Chroman1的浓度为约30nM至约70nM，Emricasan的浓度为约2μM至约10μM，和/或反式ISRIB的浓度为约0.2μM至约2μM。在一些实施方案中，Chroman1的浓度为约50nM，Emricasan的浓度为约5μM，和/或反式ISRIB的浓度为约0.7μM。在一些实施方案中，在任何实施方案中的一些实施方案中，所述方法包括将所述第一中间细胞群：(i)首先在包含约10μM Y-27632的中间中胚层诱导培养基中培养；以及(ii)随后在具有不高于约2μMY-27632的中间中胚层诱导培养基中培养。在一些实施方案中，在任何实施方案中的一些实施方案中，所述方法包括将所述第一中间细胞群：(i)首先在包含约10μM Y-27632的中间中胚层诱导培养基中培养约24小时，(ii)随后在具有不高于约2μM Y-27632的中间中胚层诱导培养基中培养约5-6天。
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，在中间中胚层诱导培养基中培养的时间段约为以下中的任一个：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、28、30、35、42、49天或介于其之间的任何长度之一。在一些实施方案中，在中间中胚层诱导培养基中培养的时间段至少约为以下中的任一个：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、28、30、35、42、49天。在一些实施方案中，在中间中胚层诱导培养基中培养的时间段为约4天至约14天。在一些实施方案中，在中间中胚层诱导培养基中培养的时间段为约5天至约9天。
在一些实施方案中，在性腺细胞诱导培养基中培养之前，将所述第二中间细胞群重新铺板到新的纤连蛋白包被的培养板上；任选地其中在重新铺板之前将所述第二中间细胞群酶促脱附、离心并且重悬。在一些实施方案中，将所述第二中间细胞群以约5000至约25000个细胞/cm2的密度铺板。在一些实施方案中，将所述第二中间细胞群以约25000至约75000个细胞/cm2的密度铺板。在一些实施方案中，将所述第二中间细胞群以约75000至约150000个细胞/cm2的密度铺板。在一些实施方案中，将所述中胚层或中胚层样细胞以约5000至约25000个细胞/cm2的密度铺板。在一些实施方案中，将所述中间中胚层或中间中胚层样细胞以约5000至约25000个细胞/cm2的密度铺板。在一些实施方案中，将所述中间中胚层或中间中胚层样细胞以约25000至约75000个细胞/cm2的密度铺板。在一些实施方案中，将所述中间中胚层或中间中胚层样细胞以约75000至约150000个细胞/cm2的密度铺板。
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中卵泡抑素的浓度约为以下中的任一个：0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、50、60、70、80、90、100、200、500ng/mL或介于其之间的任何浓度之一。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中卵泡抑素的浓度为约10ng/mL至约50ng/mL。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中卵泡抑素的浓度为约25ng/mL。
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，所述性腺诱导培养基中BMP4的浓度约为以下中的任一个：5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200、300、400或500ng/mL或介于其之间的任何浓度之一。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中BMP4的浓度约为以下中的任一个：0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或介于其之间的任何浓度。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中BMP4的浓度约为以下中的任一个：30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68或70ng/mL或介于其之间的任何浓度之一。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中BMP4的浓度为约5ng/mL至约20ng/mL。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中BMP4的浓度为约30ng/mL至约70ng/mL。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中BMP4的浓度为约10ng/mL。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中BMP4的浓度为约50ng/mL。
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中的BMP包括BMP4、BMP2、BMP7、BMP15或其任何组合。在一些实施方案中，所述性腺诱导培养基中BMP的浓度约为以下中的任一个：5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200、300、400或500ng/mL或介于其之间的任何浓度之一。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中BMP的浓度约为以下中的任一个：0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或介于其之间的任何浓度。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中BMP的浓度约为以下中的任一个：30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68或70ng/mL或介于其之间的任何浓度之一。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中BMP的浓度为约5ng/mL至约20ng/mL。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中BMP的浓度为约30ng/mL至约70ng/mL。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中BMP的浓度为约10ng/mL。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中BMP的浓度为约20ng/mL。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中BMP的浓度为约50ng/mL。
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中的FGF是以下中的一种或多种：FGF2、FGF4或FGF9。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中的FGF是FGF2。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基包含FGF2，其中FGF2的浓度约为以下中的任一个：0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、60、70、80、90、100ng/mL或介于其之间的任何浓度之一。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中FGF2的浓度为约1ng/mL至约10ng/mL。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中FGF2的浓度为约5ng/mL至约25ng/mL。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中FGF2的浓度为约1ng/mL至约10ng/mL。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中FGF2的浓度为约5ng/mL至约25ng/mL。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中FGF2的浓度为约5ng/mL。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中FGF2的浓度为约10ng/mL。
在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中的FGF包括：FGF2、FGF4、FGF9、FGF10、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19或其任何组合。在一些实施方案中，FGF的浓度约为以下中的任一个：0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、60、70、80、90、100ng/mL或介于其之间的任何浓度之一。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中FGF的浓度为约1ng/mL至约10ng/mL。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中FGF的浓度为约5ng/mL至约25ng/mL。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中FGF的浓度为约1ng/mL至约10ng/mL。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中FGF的浓度为约5ng/mL至约25ng/mL。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中FGF的浓度为约5ng/mL。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中FGF的浓度为约10ng/mL。
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，所述性腺培养基进一步包含RAPM。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中的RAPM是RAR激动剂。在一些实施方案中，所述RAPM包括视黄酸(RA)和/或TTNPB。在一些实施方案中，所述RAPM是RA。在一些实施方案中，所述RAPM是TTNPB。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中RA的浓度约为以下中的任一个：0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0μM或介于其之间的任何浓度之一。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中TTNPB的浓度约为以下中的任一个：0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、20.0μM或介于其之间的任何浓度之一。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中RA的浓度为约0.5μM至约2μM，和/或所述性腺细胞诱导培养基中TTNPB的浓度为约0.2μM至约1μM。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中RA的浓度为约1μM；和/或所述性腺细胞诱导培养基中TTNPB的浓度为约0.5μM。
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基进一步包含细胞凋亡抑制剂。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中的细胞凋亡抑制剂是Y-27632。在一些实施方案中，Y-27632的浓度约为以下中的任一个：0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100ng/mL或介于其之间的任何浓度之一。在一些实施方案中，Y-27632的浓度为约5μM至约20μM。在一些实施方案中，Y-27632的浓度为约10μM。在一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基中的细胞凋亡抑制剂包括Chroman1、Emricasan和反式ISRIB。在一些实施方案中，Chroman1的浓度为约30nM至约70nM，Emricasan的浓度为约2μM至约10μM，和/或反式ISRIB的浓度为约0.2μM至约2μM。在一些实施方案中，Chroman1的浓度为约50nM，Emricasan的浓度为约5μM，和/或反式ISRIB的浓度为约0.7μM。
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，在性腺细胞诱导培养基中培养的时间段约为以下中的任一个：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、28、30、35、42、49、56、63、70天,或介于其之间的任何长度之一。在一些实施方案中，在性腺细胞诱导培养基中培养的时间段至少约为以下中的任一个：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、28、30、35、42、49、56、63、70天。在一些实施方案中，在性腺细胞诱导培养基中培养的时间段为约5天至约21天。在一些实施方案中，在性腺细胞诱导培养基中培养的时间段为约7天至约14天。
在一些实施方案中，本文提供了一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：(a)将多能干细胞在包含50ng/mL激活素A、约3μM CHIR99021的中胚层诱导培养基中培养约56至约72小时，从而产生第一中间细胞群，其中所述第一中间细胞群中至少约80％的细胞表达Brachyury；(b)将所述第一中间细胞群在包含约1μM RA、约3μM CHIR99021和约20ng/mLFGF2的中间中胚层诱导培养基中培养约5至9天，从而产生第二中间细胞群，其中所述第二中间细胞群中至少约80％的细胞表达PAX2；以及(c)将所述第二中间细胞群在包含约25ng/mL卵泡抑素、约10ng/mL BMP4和约5ng/mL FGF的性腺细胞诱导培养基中培养约7天至约14天，从而产生所述性腺细胞群，其中所述性腺细胞中至少约20％的细胞表达FOXL2和/或NR2F2。
性腺细胞群和中间细胞群的表征
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，所述性腺细胞群的特征可以在于一种或多种表达标记物。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少一部分细胞表达以下中的一种或多种：FOXL2、NR2F2、WNT6、KITLG和NR1H4。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少一部分细胞表达以下中的一种或多种：NR2F2、GPC3和COL1A1。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少一部分细胞表达以下中的一种或多种：NR2F2、GPC3和COL1A1。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少一部分细胞表达以下中的一种或多种：KRT-19和UPK3B。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少一部分细胞表达以下中的一种或多种：FOXL2、NR2F2和KRT-19。
在一些实施方案中，第一性腺细胞群中至少约以下任一个的细胞表达FOXL2：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少约20％的细胞表达FOXL2。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少约50％的细胞表达FOXL2。
在一些实施方案中，第一性腺细胞群中至少约以下任一个的细胞表达NR2F2：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少约20％的细胞表达NR2F2。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少约50％的细胞表达NR2F2。
在一些实施方案中，第一性腺细胞群中至少约以下任一个的细胞表达RUNX1：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少约20％的细胞表达RUNX1。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少约50％的细胞表达RUNX1。
在一些实施方案中，第一性腺细胞群中至少约以下任一个的细胞表达LGR5：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少约20％的细胞表达LGR5。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少约50％的细胞表达LGR5。
在一些实施方案中，第一性腺细胞群中至少约以下任一个的细胞表达WNT6：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少约20％的细胞表达WNT6。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少约50％的细胞表达WNT6。
在一些实施方案中，第一性腺细胞群中至少约以下任一个的细胞表达KITLG：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少约20％的细胞表达KITLG。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少约50％的细胞表达KITLG。
在一些实施方案中，第一性腺细胞群中至少约以下任一个的细胞表达NR1H4：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少约20％的细胞表达NR1H4。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少约50％的细胞表达NR1H4。
颗粒细胞在成熟后会变为类固醇生成的-这些细胞能够将雄激素(诸如睾酮)转化为雌激素(诸如雌二醇)。负责类固醇生成的关键酶中的一种是芳香化酶-CYP19A1。
在一些实施方案中，第一性腺细胞群中至少约以下任一个的细胞表达CYP19A1：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少约20％的细胞表达CYP19A1。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少约50％的细胞表达CYP19A1。
在一些实施方案中，所述性腺细胞群在用二羟基-睾酮(dhT)处理后分泌雌二醇。在一些实施方案中，在用dhT处理后成熟性腺细胞群的雌二醇分泌水平比未处理细胞的雌二醇分泌水平高至少约以下任一个：10％、20％、50％、80％、100％、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍或1000000倍。在一些实施方案中，在用dhT处理后成熟性腺细胞群的雌二醇分泌水平比双能性腺细胞群的雌二醇分泌水平高至少约以下任一个：10％、20％、50％、80％、100％、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍或1000000倍。在一些实施方案中，在用dhT处理后成熟性腺细胞群的雌二醇分泌水平比表达中胚层标记物的中间细胞群的雌二醇分泌水平高至少约以下任一个：10％、20％、50％、80％、100％、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍或1000000倍。在一些实施方案中，在用dhT处理后成熟性腺细胞群的雌二醇分泌水平比表达中间中胚层标记物的中间细胞群的雌二醇分泌水平高至少约以下任一个：10％、20％、50％、80％、100％、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍或1000000倍。在一些实施方案中，在用dhT处理后成熟性腺细胞群的雌二醇分泌水平比多能干细胞的雌二醇分泌水平高至少约以下任一个：10％、20％、50％、80％、100％、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍或1000000倍。
在一些实施方案中，第一性腺细胞群中至少约以下任一个的细胞表达GPC3：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少约20％的细胞表达GPC3。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少约50％的细胞表达GPC3。
在一些实施方案中，第一性腺细胞群中至少约以下任一个的细胞表达COL1A1：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少约20％的细胞表达COL1A1。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少约50％的细胞表达COL1A1。
在一些实施方案中，第一性腺细胞群中至少约以下任一个的细胞表达KRT19：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少约20％的细胞表达KRT19。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少约50％的细胞表达KRT19。
在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少90％的细胞是FOXL2阳性细胞、NR2F2阳性细胞、和/或KRT-19阳性细胞。在一些实施方案中，所述性腺细胞群基本上由FOXL2阳性细胞、NR2F2阳性细胞、和/或KRT-19阳性细胞组成。在一些实施方案中，所述FOXL2阳性细胞包括颗粒细胞。在一些实施方案中，所述NR2F2阳性细胞包括基质细胞和/或颗粒细胞。在一些实施方案中，所述KRT-19阳性细胞包括卵巢上皮细胞。
在一些实施方案中，所述性腺细胞群包含卵巢体细胞(OSC)。在一些实施方案中，所述性腺细胞群是卵巢体细胞群。在一些实施方案中，所述性腺细胞群包含双能性腺体细胞(诸如双能卵巢体细胞)。在一些实施方案中，所述双能性腺体细胞表达以下中的一种或多种：GATA4、WT1、LHX9和ZFPM2。在一些实施方案中，所述性腺细胞群包含成熟卵巢体细胞。在一些实施方案中，所述性腺细胞群包含以下中的一种或多种：颗粒细胞、卵巢基质细胞和/或卵巢上皮细胞。在一些实施方案中，所述颗粒细胞表达以下一种或多种：FOXL2、KITLG和/或NR1H4。在一些实施方案中，所述卵巢基质细胞表达NR2F2。在一些实施方案中，所述卵巢上皮细胞表达以下一种或多种：KRT19、MSLN、TMEM151A和/或LRRN4。
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，所述第一中间细胞群的特征可以在于一种或多种表达标记物。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少一部分细胞表达以下中的一种或多种：Brachyury、MIXL1、N-钙粘蛋白、ECPAM、NCAM。
在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少一部分细胞表达Brachyury。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少一部分细胞表达MIXL1。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少一部分细胞表达N-钙粘蛋白。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少一部分细胞表达EpCam。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少一部分细胞表达NCAM。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少一部分细胞表达GSC。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少一部分细胞表达以下中的两种或更多种：Brachyury、MIXL1、N-钙粘蛋白、EpCam、NCAM。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少一部分细胞表达以下中的三种或更多种：Brachyury、MIXL1、N-钙粘蛋白、EpCam、NCAM。
在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约以下任一个的细胞表达Brachyury：30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约80％的细胞表达Brachyury。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约90％的细胞表达Brachyury。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约95％的细胞表达Brachyury。
在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约以下任一个的细胞表达MIXL1：30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约80％的细胞表达MIXL1。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约90％的细胞表达MIXL1。
在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约以下任一个的细胞表达N-钙粘蛋白：30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约80％的细胞表达N-钙粘蛋白。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约90％的细胞表达N-钙粘蛋白。
在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约以下任一个的细胞表达EPCAM：30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约80％的细胞表达EPCAM。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约90％的细胞表达EPCAM。
在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约以下任一个的细胞表达N-钙粘蛋白：30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约80％的细胞表达N-钙粘蛋白。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约90％的细胞表达N-钙粘蛋白。
在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约以下任一个的细胞表达NCAM：30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约80％的细胞表达NCAM。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约90％的细胞表达NCAM。
在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约以下任一个的细胞表达GSC：30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约80％的细胞表达GSC。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约90％的细胞表达GSC。
在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约以下任一个的细胞是中胚层细胞：30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约以下任一个的细胞是中胚层样细胞：30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，中胚层样细胞可以指在体内展示相应中胚层的一种或多种标记物的细胞。在一些实施方案中，中胚层样细胞可以指在体内具有相应中胚层的一些或全部发育潜能的细胞。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约90％的细胞是中胚层细胞。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约90％的细胞是中胚层样细胞。在一些实施方案中，所述第一中间细胞群中至少约90％的细胞是中胚层细胞或中胚层样细胞。
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，所述第二中间细胞群的特征可以在于一种或多种表达标记物。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少一部分细胞表达以下中的一种或多种：OSR1、PAX2、LHX1和RUNX1。
在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少一部分细胞表达OSR1。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少一部分细胞表达PAX2。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少一部分细胞表达LHX1。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少一部分细胞表达WT1。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少一部分细胞表达SALL1。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少一部分细胞表达GSC。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少一部分细胞表达以下中的一种或多种：OSR1、PAX2、LHX1、RUNX1、WT1和SALL1。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少一部分细胞表达以下中的两种或更多种：OSR1、PAX2、LHX1、RUNX1、WT1和SALL1。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少一部分细胞表达以下中的三种或更多种：OSR1、PAX2、LHX1、RUNX1、WT1和SALL1。
在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少约以下任一个的细胞表达LHX1：30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少约90％的细胞表达LHX1。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少约95％的细胞表达LHX1。
在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少约以下任一个的细胞表达PAX2：30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少约90％的细胞表达PAX2。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少约95％的细胞表达PAX2。
在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少约以下任一个的细胞表达OSR1：30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少约80％的细胞表达OSR1。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少约90％的细胞表达OSR1。
在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少约以下任一个的细胞表达RUNX1：30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少约80％的细胞表达RUNX1。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少约90％的细胞表达RUNX1。
在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少约以下任一个的细胞表达WT1：30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少约80％的细胞表达WT1。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少约90％的细胞表达WT1。
在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少约以下任一个的细胞表达SALL1：30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少约80％的细胞表达SALL1。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少约90％的细胞表达SALL1。
在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少约以下任一个的细胞是中间中胚层细胞：30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少约以下任一个的细胞是中间中胚层样细胞：30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％。在一些实施方案中，中间中胚层样细胞可以指在体内展示相应中间中胚层的一个或多个标记物的细胞。在一些实施方案中，中胚层样细胞可以指在体内具有相应中间中胚层的一些或全部发育潜能的细胞。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少约80％的细胞是中间中胚层细胞。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少约90％的细胞是中间中胚层样细胞。在一些实施方案中，所述第二中间细胞群中至少90％的细胞是中间中胚层细胞和/或中间中胚层样细胞。
在一些实施方案中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含RAPM的方法产生的相应第二中间细胞群相比，(I)所述第二中间细胞群分化为表达NR2F2的性腺细胞的潜力增加；和/或(II)所述第二中间细胞群分化为表达FOXL2的性腺细胞的潜力增加；和/或(III)所述第二中间细胞群分化为表达RUNX1的性腺细胞的潜力增加；和/或(IV)所述第二中间细胞群分化为表达WNT6的性腺细胞的潜力增加；和/或(V)所述第二中间细胞群分化为表达NR5A1的性腺细胞的潜力增加；和/或(VI)所述第二中间细胞群分化为表达OSR1的性腺细胞的潜力增加；和/或(VII)所述第二中间细胞群分化为表达DLK1的性腺细胞和/或表达GPC3的性腺细胞的潜力增加；和/或(VIII)所述第二中间细胞群分化为表达LHX9的性腺细胞的潜力增加；和/或(IX)所述第二中间细胞群分化为表达KRT19的性腺细胞的潜力增加。
在一些实施方案中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的RAPM的方法产生的相应第二中间细胞群相比，(I)所述第二中间细胞群分化为表达NR2F2的性腺细胞的潜力增加；和/或(II)所述第二中间细胞群分化为表达FOXL2的性腺细胞的潜力增加；和/或(III)所述第二中间细胞群分化为表达RUNX1的性腺细胞的潜力增加；和/或(IV)所述第二中间细胞群分化为表达WNT6的性腺细胞的潜力增加；和/或(V)所述第二中间细胞群分化为表达NR5A1的性腺细胞的潜力增加；和/或(VI)所述第二中间细胞群分化为表达OSR1的性腺细胞的潜力增加；和/或(VII)所述第二中间细胞群分化为表达DLK1的性腺细胞和/或表达GPC3的性腺细胞的潜力增加；和/或(VIII)所述第二中间细胞群分化为表达LHX9的性腺细胞的潜力增加；和/或(IX)所述第二中间细胞群分化为表达KRT19的性腺细胞的潜力增加。
在一些实施方案中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应第二中间细胞群相比，(I)所述第二中间细胞群分化为表达NR2F2的性腺细胞的潜力增加；和/或(II)所述第二中间细胞群分化为表达FOXL2的性腺细胞的潜力增加；和/或(III)所述第二中间细胞群分化为表达RUNX1的性腺细胞的潜力增加；和/或(IV)所述第二中间细胞群分化为表达WNT6的性腺细胞的潜力增加；和/或(V)所述第二中间细胞群分化为表达NR5A1的性腺细胞的潜力增加；和/或(VI)所述第二中间细胞群分化为表达OSR1的性腺细胞的潜力增加；和/或(VII)所述第二中间细胞群分化为表达DLK1的性腺细胞和/或表达GPC3的性腺细胞的潜力增加；和/或(VIII)所述第二中间细胞群分化为表达LHX9的性腺细胞的潜力增加；和/或(IX)所述第二中间细胞群分化为表达KRT19的性腺细胞的潜力增加。
在一些实施方案中，与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应第二中间细胞群相比，(I)所述第二中间细胞群分化为表达NR2F2的性腺细胞的潜力增加；和/或(II)所述第二中间细胞群分化为表达FOXL2的性腺细胞的潜力增加；和/或(III)所述第二中间细胞群分化为表达RUNX1的性腺细胞的潜力增加；和/或(IV)所述第二中间细胞群分化为表达WNT6的性腺细胞的潜力增加；和/或(V)所述第二中间细胞群分化为表达NR5A1的性腺细胞的潜力增加；和/或(VI)所述第二中间细胞群分化为表达OSR1的性腺细胞的潜力增加；和/或(VII)所述第二中间细胞群分化为表达DLK1的性腺细胞和/或表达GPC3的性腺细胞的潜力增加；和/或(VIII)所述第二中间细胞群分化为表达LHX9的性腺细胞的潜力增加；和/或(IX)所述第二中间细胞群分化为表达KRT19的性腺细胞的潜力增加。
在一些实施方案中，可以在性腺体细胞群的衍生中调节RAPM的浓度和暴露持续时间。在一些实施方案中，当在衍生期间调节RAPM的浓度和暴露持续时间时，由此产生的性腺体细胞群的细胞命运和组成变得不同。在一些实施方案中，所述RAPM包括视黄酸(RA)和/或TTNPB。在一些实施方案中，所述RAPM是RA。在一些实施方案中，所述RAPM是TTNPB。
在一些实施方案中，所述RAPM是RA。在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，所述性腺细胞诱导培养基包含至少约以下任一个的浓度的RA：0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0μM或介于其之间的任何浓度之一。在一些实施方案中，在存在RA(以上述任一种浓度，诸如但不限于0.1、0.5或1.0μM)的情况下进行性腺细胞诱导持续至少约以下任一个：2、4、6、8、10、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、72、96、120、144、168、192或240小时。
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，与通过其中所述性腺细胞诱导培养基包含较低浓度的RAPM的方法产生的相应性腺细胞群相比，(I)所述性腺细胞群中FOXL2表达的量减少；和/或(II)所述性腺细胞群中NR1H4和/或KITLG表达的量减少；和/或(III)所述性腺细胞群中KRT-19表达的量增加；和/或(IV)所述性腺细胞群中胞质KRT-19表达的量增加；和/或(V)所述性腺细胞群中MSLN、LRRN4和/或TMEM151A表达的量增加。
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，与通过其中所述性腺细胞诱导培养基不包含RAPM的方法产生的相应性腺细胞群相比，(I)所述性腺细胞群中FOXL2表达的量减少；和/或(II)所述性腺细胞群中NR1H4和/或KITLG表达的量减少；和/或(III)所述性腺细胞群中KRT-19表达的量增加；和/或(IV)所述性腺细胞群中胞质KRT-19表达的量增加；和/或(V)所述性腺细胞群中MSLN、LRRN4和/或TMEM151A表达的量增加。
在根据本文所述的任何方法或细胞群的一些实施方案中，与通过包括与RAPM接触较短时间段的性腺细胞诱导步骤产生的相应性腺细胞群相比，(I)所述性腺细胞群中FOXL2表达的量减少；和/或(II)所述性腺细胞群中NR1H4和/或KITLG表达的量减少；和/或(III)所述性腺细胞群中KRT-19表达的量增加；和/或(IV)所述性腺细胞群中胞质KRT-19表达的量增加；和/或(V)所述性腺细胞群中MSLN、LRRN4和/或TMEM151A表达的量增加。
还提供了通过所提供的任何方法产生的性腺细胞群(例如，卵巢体细胞)。
本文还提供了一种体外干细胞衍生的性腺体细胞群，所述体外干细胞衍生的性腺体细胞群包含表达FOXL2的细胞、表达NR2F2的细胞和/或表达KRT-19的细胞。在一些实施方案中，所述性腺体细胞群是卵巢体细胞群。在一些实施方案中，所述群至少包含表达FOXL2的第一细胞类型、表达NR2F2的第二细胞类型和表达KRT-19的第三细胞类型。在一些实施方案中，所述细胞群中至少20％的细胞是FOXL2阳性细胞，诸如所述群中至少25％、至少30％、至少40％或至少50％的细胞是FOXL2阳性细胞。在一些实施方案中，所述细胞群中至少20％的细胞是NR2F2阳性细胞，诸如所述群中至少25％、至少30％、至少40％或至少50％的细胞是NR2F2阳性细胞。在一些实施方案中，所述性腺细胞群中至少20％的细胞是KRT19阳性细胞，诸如所述群中至少25％、至少30％、至少40％或至少50％的细胞是KRT192阳性细胞。在一些实施方案中，(a)所述细胞群中至少20％的细胞是FOXL2阳性细胞；和/或(b)所述细胞群中至少20％的细胞是NR2F2阳性细胞；和/或(c)所述性腺细胞群中至少20％的细胞是KRT19阳性细胞。在一些实施方案中，(a)所述细胞群中约20％-40％的细胞是FOXL2阳性细胞；和/或(b)所述细胞群中约20％-40％的细胞是NR2F2阳性细胞；和/或(c)所述性腺细胞群中约20％-40％的细胞是KRT19阳性细胞。在一些实施方案中，所述性腺细胞群的至少85％是FOXL2阳性细胞、NR2F2阳性细胞、和/或KRT-19阳性细胞。在一些实施方案中，所述性腺细胞群的至少90％是FOXL2阳性细胞、NR2F2阳性细胞、和/或KRT-19阳性细胞。在一些实施方案中，所述性腺细胞群的至少95％是FOXL2阳性细胞、NR2F2阳性细胞、和/或KRT-19阳性细胞。在一些实施方案中，所述性腺体细胞群基本上由FOXL2阳性细胞、NR2F2阳性细胞、和/或KRT-19阳性细胞组成。在一些实施方案中，所述FOXL2阳性细胞包括颗粒细胞；所述NR2F2阳性细胞包括卵巢基质细胞和/或颗粒细胞；并且所述KRT-19阳性细胞包括卵巢上皮细胞。
在任何所提供的性腺体细胞群的实施方案的一些中，所述细胞群是从多能干细胞分化的。在一些实施方案中，可以通过本文提供的任何方法产生性腺体细胞群(例如，卵巢体细胞)。在任何实施方案中的一些实施方案中，所述性腺体细胞群是在包括以下的方法中衍生的：(a)将多能干细胞在包含激活素A的中胚层诱导培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；(b)将所述第一中间细胞群在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养第二时间段，从而产生第二中间细胞群；以及(c)将所述第二中间细胞群在包含BMP和FGF以及任选地卵泡抑素的性腺细胞诱导培养基中培养第三时间段以产生所述性腺细胞群。
在任何实施方案中的一些实施方案中，将所述性腺体细胞群被冷冻保存或者已经被冷冻保存。在一些实施方案中，提供了包含性腺体细胞群的组合物。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含冷冻保护剂。在所提供的任何实施方案中的一些中，所述方法进一步包括用冷冻保护剂(也称为冷冻保存剂)配制性腺细胞群，诸如通过所提供的方法产生或收获的细胞群。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂选自甘油、丙二醇、二甲亚砜(DMSO)或其组合。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂包括DMSO。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂是DMSO。
在一些实施方案中，所述配制品缓冲液含有冷冻保存剂。在一些实施方案中，用含有1.0％至30％ DMSO溶液(诸如5％至20％ DMSO溶液或5％至10％ DMSO溶液)的冷冻保存溶液配制细胞。在一些实施方案中，所述冷冻保存溶液是或包含例如含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。在一些实施方案中，冷冻保存溶液是或含有例如至少或约7.5％ DMSO。在一些实施方案中，所述方法包括一个或多个处理步骤，所述处理步骤可以涉及洗涤分化的细胞以替代冷冻保存溶液中的细胞。在一些实施方案中，在培养基和/或溶液中冷冻(例如，冷冻保存或冷冻保护)细胞，所述培养基和/或溶液具有终浓度为或为约12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5.0％ DMSO，或在1％与15％之间、在6％与12％之间、在5％与10％之间、或在6％与8％之间的DMSO。在特定实施方案中，在培养基和/或溶液中冷冻(例如，冷冻保存或冷冻保护)细胞，所述培养基和/或溶液具有终浓度为或为约5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％或0.25％的HSA，或者在0.1％与-5％之间、在0.25％与4％之间、在0.5％与2％之间或在1％与2％之间的HSA。在一些实施方案中，将通过所述方法产生的性腺细胞群(例如，卵巢体细胞)用约10％ DMSO配制。在一些实施方案中，先前已经冷冻保存或储存所述一种或多种组合物，并且在进一步使用之前将其解冻。
示例性实施方案
所提供的实施方案为：
1.一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：
(a)将多能干细胞在包含激活素A的中胚层诱导培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；
(b)将所述第一中间细胞群在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养第二时间段，从而产生第二中间细胞群；以及
(c)将所述第二中间细胞群在包含BMP和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养第三时间段以产生所述性腺细胞群。
2.一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：
(a)将多能干细胞在包含激活素A的中胚层诱导培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；
(b)将所述第一中间细胞群在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养第二时间段，从而产生第二中间细胞群；以及
(c)将所述第二中间细胞群在包含卵泡抑素、BMP4和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养第三时间段以产生所述性腺细胞群。
3.一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：
(a)将中胚层或中胚层样细胞在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养第一时间段从而产生第二中间细胞群；以及
(b)将所述第二中间细胞群在包含BMP和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养第二时间段以产生所述性腺细胞群。
4.一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：
(a)将中胚层或中胚层样细胞在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养第一时间段从而产生第二中间细胞群；以及
(b)将所述第二中间细胞群在包含卵泡抑素、BMP4和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养第二时间段以产生所述性腺细胞群。
5.一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：
将中间中胚层或中间中胚层样细胞在包含BMP和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养一段时间以产生所述性腺细胞群。
6.一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：
将中间中胚层或中间中胚层样细胞在包含卵泡抑素、BMP4和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养一段时间以产生所述性腺细胞群。
7.一种产生第一中间细胞群的方法，所述方法包括：将多能干细胞在包含激活素A和糖原合酶激酶-3抑制剂的中胚层诱导培养基中培养一段时间以产生第一中间细胞群。
8.一种产生第二中间细胞群的方法，所述方法包括：
将中胚层或中胚层样细胞在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养一段时间，从而产生所述第二中间细胞群。
9.一种产生第二中间细胞群的方法，所述方法包括：
(a)将多能干细胞在包含激活素A和糖原合酶激酶-3抑制剂的中胚层诱导培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；以及
(b)将所述第一中间细胞群在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)、FGF和糖原合酶激酶-3抑制剂的中间中胚层诱导培养基中培养第二时间段，从而产生所述第二中间细胞群。
10.根据实施方案1-4和9中任一项所述的方法，其中所述第一中间细胞群中的至少一部分细胞表达Brachyury。
11.根据实施方案1-4、8和9中任一项所述的方法，其中所述第二中间细胞群中的至少一部分细胞表达OSR1、PAX2或LHX。
12.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞群中的至少一部分细胞表达FOXL2、NR2F2或RUNX1。
13.根据实施方案1、2、7和9-11中任一项所述的方法，其中将所述多能干细胞以约10,000至约40,000个细胞/cm2的密度接种。
14.根据实施方案1、2、7和9-13中任一项所述的方法，其中将所述多能干细胞接种在用纤连蛋白包被的培养板中。
15.根据实施方案1、2、7和9-13中任一项所述的方法，其中将所述多能干细胞接种在用基质胶包被的培养板中。
16.根据实施方案1-15中任一项所述的方法，其中所述中胚层诱导培养基进一步包含FGF。
17.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述中胚层诱导培养基进一步包含BMP4。
18.根据实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述中胚层诱导培养基进一步包含糖原合酶激酶-3抑制剂。
19.根据实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述中胚层诱导培养基进一步包含细胞凋亡抑制剂。
20.根据实施方案1-19中任一项所述的方法，其中所述中胚层诱导培养基中激活素A的浓度为约30ng/mL至约70ng/mL。
21.根据实施方案20所述的方法，其中所述中胚层诱导培养基中激活素A的浓度为约50ng/mL。
22.根据实施方案16-21中任一项所述的方法，其中所述中胚层诱导培养基中的FGF是FGF2。
23.根据实施方案22所述的方法，其中所述中胚层诱导培养基中FGF2的浓度为约5ng/mL至约20ng/mL，任选地其中所述中胚层诱导培养基中FGF2的浓度为约12ng/mL。
24.根据实施方案17-23中任一项所述的方法，其中所述中胚层诱导培养基中BMP4的浓度为约10ng/mL至约50ng/mL，任选地其中所述中胚层诱导培养基中BMP4的浓度为约30ng/mL。
25.根据实施方案18-24中任一项所述的方法，其中所述中胚层诱导培养基中的糖原合酶激酶-3抑制剂是CHIR99021。
26.根据实施方案25所述的方法，其中CHIR99021的浓度为约1μM至约5μM。
27.根据实施方案26所述的方法，其中所述中胚层诱导培养基中CHIR99021的浓度为约3μM。
28.根据实施方案19-27中任一项所述的方法，其中在所述中胚层诱导培养基中：
(A)所述细胞凋亡抑制剂是Y-27632，任选地其中Y-27632的浓度为约5μM至约20μM；或者
(B)所述细胞凋亡抑制剂包括Chroman1、Emricasan和反式ISRIB，任选地其中Chroman1的浓度为约30nM至约70nM，Emricasan的浓度为约2μM至约10μM，并且反式ISRIB的浓度为约0.2μM至约2μM。
29.根据实施方案28所述的方法，其中在所述中胚层诱导培养基中：
(A)Y-27632的浓度为约10μM；或者
(B)Chroman1的浓度为约50nM，Emricasan的浓度为约5μM，并且反式ISRIB的浓度为约0.7μM。
30.根据实施方案1-29中任一项所述的方法，其中在中胚层诱导培养基中培养的时间段为约24小时至约96小时。
31.根据实施方案30所述的方法，其中在中胚层诱导培养基中培养的时间段为约24小时至约72小时。
32.根据实施方案31所述的方法，其中在中胚层诱导培养基中培养的时间段为约56小时至约72小时。
33.根据实施方案1-32中任一项所述的方法，其中所述第一中间细胞群中至少90％的细胞表达Brachyury。
34.根据实施方案1-33中任一项所述的方法，其中所述第一中间细胞群中至少80％的细胞表达以下中的一种或多种：MIXL1、N-钙粘蛋白、EpCam、NCAM。
35.根据实施方案1-34中任一项所述的方法，其中所述第一中间细胞群中至少90％的细胞表达：Brachyury、N-钙粘蛋白、EpCam和NCAM。
36.根据实施方案1-35中任一项所述的方法，其中所述第一中间细胞群中至少90％的细胞是中胚层或中胚层样细胞。
37.根据实施方案36所述的方法，其中所述第一中间细胞群基本上由中胚层或中胚层样细胞组成。
38.根据实施方案1-37中任一项所述的方法，其中在中间中胚层诱导培养基中培养之前，将所述第一中间细胞群重新铺板到新的纤连蛋白包被的培养板上；任选地其中在重新铺板之前将所述第一中间细胞群酶促脱附、离心并且重悬。
39.根据实施方案38所述的方法，其中将所述第一中间细胞群以约5,000至约25,000个细胞/cm2的密度铺板。
40.根据实施方案1-39中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基进一步包含FGF。
41.根据实施方案1-40中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基进一步包含糖原合酶激酶-3抑制剂。
42.根据实施方案1-41中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基进一步包含激活素A。
43.根据实施方案1-42中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基进一步包含细胞凋亡抑制剂。
44.根据实施方案43所述的方法，其中所述方法包括将所述第一中间细胞群
(i)首先在具有第一浓度的所述细胞凋亡抑制剂的所述中间中胚层诱导培养基中培养，
(ii)随后在具有不高于第二浓度的所述细胞凋亡抑制剂的所述中间中胚层诱导培养基中培养。
45.根据实施方案1-44中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基中的RAPM是RAR激动剂，任选地其中所述RAPM包括视黄酸(RA)和/或TTNPB。
46.根据实施方案1-45中任一项所述的方法，其中：
(a)所述RAPM是RA，其中所述中间中胚层诱导培养基中RA的浓度为约0.5μM至约2μM；和/或
(b)所述RAPM是TTNPB，其中所述中间中胚层诱导培养基中TTNPB的浓度为约0.2μM至约1μM。
47.根据实施方案46所述的方法，其中：
(a)所述中间中胚层诱导培养基中RA的浓度为约1μM；和/或
(b)所述中间中胚层诱导培养基中TTNPB的浓度为约0.5μM。
48.根据实施方案40-47中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基中的FGF是FGF2，其中所述FGF2的浓度为约10ng/mL至约30ng/mL。
49.根据实施方案48所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基中FGF2的浓度为约20ng/mL。
50.根据实施方案41-49中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基中的糖原合酶激酶-3抑制剂是CHIR99021，其中CHIR99021的浓度为约1μM至约5μM。
51.根据实施方案50所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基中CHIR99021的浓度为约2μM或约3μM。
52.根据实施方案42-51中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基中激活素A的浓度为约10ng/mL至约50ng/mL。
53.根据实施方案52所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基中激活素A的浓度为约30ng/mL。
54.根据实施方案43和46-53中任一项所述的方法，其中在所述中胚层诱导培养基中：
(A)所述细胞凋亡抑制剂是Y-27632，其中Y-27632的浓度为约5μM至约20μM；或者
(B)所述细胞凋亡抑制剂包括Chroman1、Emricasan和反式ISRIB，其中Chroman1的浓度为约30nM至约70nM，Emricasan的浓度为约2μM至约10μM，并且反式ISRIB的浓度为约0.2μM至约2μM。
55.根据实施方案45-54中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基中的所述细胞凋亡抑制剂是Y-27632，其中所述方法包括将所述第一中间细胞群：
(i)首先在包含约10μM Y-27632的中间中胚层诱导培养基中培养；以及
(ii)随后在具有不高于约2μM Y-27632的中间中胚层诱导培养基中培养。
56.根据实施方案45-55中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述第一中间细胞群(i)首先在包含约10μM Y-27632的中间中胚层诱导培养基中培养约24小时，
(ii)随后在具有不高于约2μM Y-27632的中间中胚层诱导培养基中培养约5-6天。
57.根据实施方案1-56中任一项所述的方法，其中在所述中间中胚层诱导培养基中培养的时间段为约4-14天。
58.根据实施方案1-57中任一项所述的方法，其中在所述中间中胚层诱导培养基中培养的时间段为约5-9天。
59.根据实施方案1-58中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基中的细胞凋亡抑制剂是Y-27632，其中在所述中间中胚层诱导培养基中培养期间，Y-27632的浓度：
(a)在前24小时期间为约10μM；
(b)在24小时与72小时之间为不高于约2μM；
(c)在72小时与120小时之间为不高于约0.5μM；或者
(d)在120小时之后为不高于约0.1μM。
60.根据实施方案44-59中任一项所述的方法，其中将所述第一中间细胞群在包含细胞凋亡抑制剂的中间中胚层诱导培养基中培养约24小时，并且其中在约24小时之后，首先将所述培养基的一部分用不包含所述细胞凋亡抑制剂的中间中胚层诱导培养基替换。
61.根据实施方案60所述的方法，其中所述培养基的一部分为所述培养基的约80％。
62.根据实施方案60或61所述的方法，其中所述方法进一步包括随后的培养基替换，其中所述培养基替换包括在培养开始24小时后，每约48小时将所述培养基的一部分替换。
63.根据实施方案62所述的方法，其中在每次随后的培养基替换中所述培养基的一部分为所述培养基的约80％。
64.根据实施方案1-63中任一项所述的方法，其中所述第二中间细胞群中至少90％的细胞表达以下中的一种或多种：OSR1、PAX2、LHX1和RUNX1。
65.根据实施方案1-64中任一项所述的方法，其中所述第二中间细胞群中至少90％的细胞表达以下中的两种或更多种：OSR1、PAX2、LHX1和RUNX1。
66.根据实施方案1-65中任一项所述的方法，其中所述第二中间细胞群中至少90％的细胞表达OSR1、PAX2和LHX1。
67.根据实施方案1-66中任一项所述的方法，其中所述第二中间细胞群中至少90％的细胞是中间中胚层或中间中胚层样细胞。
68.根据实施方案67所述的方法，其中所述第二中间细胞群基本上由中间中胚层或中间中胚层样细胞组成。
69.根据实施方案1-68中任一项所述的方法，其中在性腺细胞诱导培养基中培养之前，将所述第二中间细胞群重新铺板到新的纤连蛋白包被的培养板上；任选地其中在重新铺板之前将所述第二中间细胞群酶促脱附、离心并且重悬。
70.根据实施方案69所述的方法，其中将所述第二中间细胞群以约5,000至约25,000个细胞/cm2的密度铺板。
71.根据实施方案1-70中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基进一步包含RAPM。
72.根据实施方案1-71中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基进一步包含细胞凋亡抑制剂。
73.根据实施方案1、3、5和10-72中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基进一步包含卵泡抑素。
74.根据实施方案1-73中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基中卵泡抑素的浓度为约10ng/mL至约50ng/mL。
75.根据实施方案74所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基中卵泡抑素的浓度为约25ng/mL。
76.根据实施方案1、3、5和10-75中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基中的BMP包括BMP4、BMP2、BMP7、BMP15或其任何组合。
77.根据实施方案1、3、5和10-76中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基中BMP的总浓度为约5ng/mL至约20ng/mL或约20ng/mL至约70ng/mL。
78.根据实施方案77所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基中BMP的总浓度为约10ng/mL或约50ng/mL。
79.根据实施方案1-78中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基中BMP4的浓度为约5ng/mL至约20ng/mL或约20ng/mL至约70ng/mL。
80.根据实施方案79所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基中BMP4的浓度为约10ng/mL或约50ng/mL。
81.根据实施方案1-80中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基中的FGF包括FGF2、FGF9、FGF10、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19或其任何组合。
82.根据实施方案1-81中任一项所述的方法，其中FGF的浓度为约1ng/mL至约10ng/mL或约5ng/mL至约25ng/mL。
83.根据实施方案82所述的方法，其中FGF的浓度为约5ng/mL或约10ng/mL。
84.根据实施方案1-83中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基中的FGF是FGF2，其中所述FGF2的浓度为约1ng/mL至约10ng/mL或约5ng/mL至约25ng/mL。
85.根据实施方案84所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基中FGF2的浓度为约5ng/mL或约10ng/mL。
86.根据实施方案71-85中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基中的RAPM是RAR激动剂，任选地其中所述RAPM包括视黄酸(RA)和/或TTNPB。
87.根据实施方案86所述的方法，其中：
(a)所述RAPM是RA，其中所述性腺细胞诱导培养基中RA的浓度为约0.5μM至约2μM；和/或
(b)所述RAPM是TTNPB，其中所述性腺细胞诱导培养基中TTNPB的浓度为约0.2μM至约1μM。
88.根据实施方案72-87中任一项所述的方法，其中在所述性腺细胞诱导培养基中：
(A)所述细胞凋亡抑制剂是Y-27632，任选地其中Y-27632的浓度为约5μM至约20μM；或者
(B)所述细胞凋亡抑制剂包括Chroman1、Emricasan和反式ISRIB，任选地其中Chroman1的浓度为约30nM至约70nM，Emricasan的浓度为约2μM至约10μM，并且反式ISRIB的浓度为约0.2μM至约2μM。
89.根据实施方案88所述的方法，其中在所述性腺细胞诱导培养基中：
(A)Y-27632的浓度为约10μM；或者
(B)Chroman1的浓度为约50nM，Emricasan的浓度为约5μM，并且反式ISRIB的浓度为约0.7μM。
90.根据实施方案1-89中任一项所述的方法，其中在性腺细胞诱导培养基中培养的时间段为约5天至约21天。
91.根据实施方案90所述的方法，其中在性腺细胞诱导培养基中培养的时间段为约7天至约14天。
92.根据实施方案1-91中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞群包含卵巢体细胞。
93.根据实施方案1-92中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞群由卵巢体细胞组成。
94.根据实施方案1-93中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞群中至少20％的细胞是FOXL2阳性细胞。
95.根据实施方案1-94中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞群中至少20％的细胞是NR2F2阳性细胞。
96.根据实施方案1-95中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞群中至少20％的细胞是KRT19阳性细胞。
97.根据实施方案1-96中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞群中的至少90％是FOXL2阳性细胞、NR2F2阳性细胞、和/或KRT-19阳性细胞。
98.根据实施方案97所述的方法，其中所述性腺细胞群基本上由FOXL2阳性细胞、NR2F2阳性细胞、和/或KRT-19阳性细胞组成。
99.根据实施方案97或98所述的方法，其中所述FOXL2阳性细胞包括颗粒细胞；其中所述NR2F2阳性细胞包括基质细胞和/或颗粒细胞；并且其中所述KRT-19阳性细胞包括卵巢上皮细胞。
100.根据实施方案1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含RAPM的方法产生的相应性腺细胞群相比，
(I)所述性腺细胞群中表达NR2F2的细胞的量增加；和/或
(II)所述性腺细胞群中表达FOXL2的细胞的量增加；和/或
(III)所述性腺细胞群中表达RUNX1的细胞的量增加；和/或
(IV)所述性腺细胞群中表达WNT6的细胞的量增加；和/或
(V)所述性腺细胞群中表达NR5A1的细胞的量增加；和/或
(VI)所述性腺细胞群中表达OSR1的细胞的量增加；和/或
(VII)所述性腺细胞群中表达LHX9的细胞的量增加；和/或
(VIII)所述性腺细胞群中表达EMX2的细胞的量增加。
101.根据实施方案1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的RAPM的方法产生的相应的性腺细胞群相比，
(I)所述性腺细胞群中表达NR2F2的细胞的量增加；和/或
(II)所述性腺细胞群中表达FOXL2的细胞的量增加；和/或
(III)所述性腺细胞群中表达RUNX1的细胞的量增加；和/或
(IV)所述性腺细胞群中表达WNT6的细胞的量增加；和/或
(V)所述性腺细胞群中表达NR5A1的细胞的量增加；和/或
(VI)所述性腺细胞群中表达OSR1的细胞的量增加。
102.根据实施方案1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应的性腺细胞群相比，
(I)所述性腺细胞群中表达NR2F2的细胞的量增加；和/或
(II)所述性腺细胞群中表达FOXL2的细胞的量增加；和/或
(III)所述性腺细胞群中表达RUNX1的细胞的量增加；和/或
(IV)所述性腺细胞群中表达WNT6的细胞的量增加；和/或
(V)所述性腺细胞群中表达NR5A1的细胞的量增加；和/或
(VI)所述性腺细胞群中表达OSR1的细胞的量增加；和/或
(VII)所述性腺细胞群中表达LHX9的细胞的量增加；和/或
(VIII)所述性腺细胞群中表达EMX2的细胞的量增加。
103.根据实施方案1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应的性腺细胞群相比，
(I)所述性腺细胞群中表达NR2F2的细胞的量增加；和/或
(II)所述性腺细胞群中表达FOXL2的细胞的量增加；和/或
(III)所述性腺细胞群中表达RUNX1的细胞的量增加；和/或
(IV)所述性腺细胞群中表达WNT6的细胞的量增加；和/或
(V)所述性腺细胞群中表达NR5A1的细胞的量增加；和/或
(VI)所述性腺细胞群中表达OSR1的细胞的量增加；和/或
(VII)所述性腺细胞群中表达LHX9的细胞的量增加；和/或
(VIII)所述性腺细胞群中表达EMX2的细胞的量增加。
104.根据实施方案1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含RAPM的方法产生的相应第二中间细胞群相比，
(I)所述第二中间细胞群中LHX1表达的量增加；和/或
(II)所述第二中间细胞群中PAX2表达的量增加；和/或
(III)所述第二中间群中WT1表达的量增加；和/或
(IV)所述第二中间细胞群中RUNX1表达的量增加；和/或
(V)所述第二中间细胞群的活力增加；和/或
(VI)所述第二中间细胞群的细胞形态更均匀。
105.根据实施方案1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的RAPM的方法产生的相应第二中间细胞群相比，
(I)所述第二中间细胞群中LHX1表达的量增加；和/或
(II)所述第二中间细胞群中PAX2表达的量增加；和/或
(III)所述第二中间群中WT1表达的量增加；和/或
(IV)所述第二中间细胞群中RUNX1表达的量增加；和/或
(V)所述第二中间细胞群的活力增加；和/或
(VI)所述第二中间细胞群的细胞形态更均匀。
106.根据实施方案1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应第二中间细胞群相比，
(I)所述第二中间细胞群中LHX1表达的量增加；和/或
(II)所述第二中间细胞群中PAX2表达的量增加；和/或
(III)所述第二中间群中WT1表达的量增加；和/或
(IV)所述第二中间细胞群中RUNX1表达的量增加；和/或
(V)所述第二中间细胞群的活力增加；和/或
(VI)所述第二中间细胞群的细胞形态更均匀。
107.根据实施方案1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应第二中间细胞群相比，
(I)所述第二中间细胞群中LHX1表达的量增加；和/或
(II)所述第二中间细胞群中PAX2表达的量增加；和/或
(III)所述第二中间群中WT1表达的量增加；和/或
(IV)所述第二中间细胞群中RUNX1表达的量增加；和/或
(V)所述第二中间细胞群的活力增加；和/或
(VI)所述第二中间细胞群的细胞形态更均匀。
108.根据实施方案1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含RAPM的方法产生的相应第二中间细胞群相比，
(I)所述第二中间细胞群分化为表达NR2F2的性腺细胞的潜力增加；和/或
(II)所述第二中间细胞群分化为表达FOXL2的性腺细胞的潜力增加；和/或
(III)所述第二中间细胞群分化为表达RUNX1的性腺细胞的潜力增加；和/或
(IV)所述第二中间细胞群分化为表达WNT6的性腺细胞的潜力增加；和/或
(V)所述第二中间细胞群分化为表达NR5A1的性腺细胞的潜力增加；和/或
(VI)所述第二中间细胞群分化为表达OSR1的性腺细胞的潜力增加。
109.根据实施方案1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的RAPM的方法产生的相应第二中间细胞群相比，
(I)所述第二中间细胞群分化为表达NR2F2的性腺细胞的潜力增加；和/或
(II)所述第二中间细胞群分化为表达FOXL2的性腺细胞的潜力增加；和/或
(III)所述第二中间细胞群分化为表达RUNX1的性腺细胞的潜力增加；和/或
(IV)所述第二中间细胞群分化为表达WNT6的性腺细胞的潜力增加；和/或
(V)所述第二中间细胞群分化为表达NR5A1的性腺细胞的潜力增加；和/或
(VI)所述第二中间细胞群分化为表达OSR1的性腺细胞的潜力增加。
110.根据实施方案1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应第二中间细胞群相比，
(I)所述第二中间细胞群分化为表达NR2F2的性腺细胞的潜力增加；和/或
(II)所述第二中间细胞群分化为表达FOXL2的性腺细胞的潜力增加；和/或
(III)所述第二中间细胞群分化为表达RUNX1的性腺细胞的潜力增加；和/或
(IV)所述第二中间细胞群分化为表达WNT6的性腺细胞的潜力增加；和/或
(V)所述第二中间细胞群分化为表达NR5A1的性腺细胞的潜力增加；和/或
(VI)所述第二中间细胞群分化为表达OSR1的性腺细胞的潜力增加。
111.根据实施方案1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应第二中间细胞群相比，
(I)所述第二中间细胞群分化为表达NR2F2的性腺细胞的潜力增加；和/或
(II)所述第二中间细胞群分化为表达FOXL2的性腺细胞的潜力增加；和/或
(III)所述第二中间细胞群分化为表达RUNX1的性腺细胞的潜力增加；和/或
(IV)所述第二中间细胞群分化为表达WNT6的性腺细胞的潜力增加；和/或
(V)所述第二中间细胞群分化为表达NR5A1的性腺细胞的潜力增加；和/或
(VI)所述第二中间细胞群分化为表达OSR1的性腺细胞的潜力增加。
112.根据实施方案1-111中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述性腺细胞诱导培养基包含较低浓度的RAPM的方法产生的相应性腺细胞群相比，
(I)所述性腺细胞群中FOXL2表达的量减少；和/或
(II)所述性腺细胞群中NR1H4和/或KITLG表达的量减少；和/或
(III)所述性腺细胞群中KRT-19表达的量增加；和/或
(IV)所述性腺细胞群中胞质KRT-19表达的量增加；和/或
(V)所述性腺细胞群中MSLN、LRRN4和/或TMEM151A表达的量增加。
113.根据实施方案1-111中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述性腺细胞诱导培养基不包含RAPM的方法产生的相应性腺细胞群相比，
(I)所述性腺细胞群中FOXL2表达的量减少；和/或
(II)所述性腺细胞群中NR1H4和/或KITLG表达的量减少；和/或
(III)所述性腺细胞群中KRT-19表达的量增加；和/或
(IV)所述性腺细胞群中胞质KRT-19表达的量增加；和/或
(V)所述性腺细胞群中MSLN、LRRN4和/或TMEM151A表达的量增加。
114.根据实施方案1-111中任一项所述的方法，其中：与通过包括与RAPM接触较短时间段的性腺细胞诱导步骤产生的相应性腺细胞群相比，
(I)所述性腺细胞群中FOXL2表达的量减少；和/或
(II)所述性腺细胞群中NR1H4和/或KITLG表达的量减少；和/或
(III)所述性腺细胞群中KRT-19表达的量增加；和/或
(IV)所述性腺细胞群中胞质KRT-19表达的量增加；和/或
(V)所述性腺细胞群中MSLN、LRRN4和/或TMEM151A表达的量增加。
115.根据实施方案1-114中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是哺乳动物干细胞。
116.根据实施方案1-115中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是人多能干细胞。
117.根据实施方案1-115中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是牛干细胞。
118.根据实施方案1-115中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是鼠多能干细胞。
119.根据实施方案115-118中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是胚胎干细胞或诱导多能干细胞。
120.根据实施方案1-6和10-119中任一项所述的方法，其中所述性腺群包含选自以下的一个或多个群：颗粒细胞、卵巢基质细胞和上皮细胞或其组合。
121.根据实施方案1-6和10-120中任一项所述的方法，其中所述性腺群包含颗粒细胞、卵巢基质细胞和上皮细胞的混合物。
122.一种性腺细胞群，所述性腺细胞群通过根据实施方案1-6和10-121中任一项所述的方法产生。
123.根据实施方案122所述的性腺细胞群，其中所述性腺群包含选自以下的一个或多个群：颗粒细胞、卵巢基质细胞和上皮细胞或其组合。
124.根据实施方案122或实施方案123所述的性腺细胞群，其中所述性腺群包括颗粒细胞、卵巢基质细胞和上皮细胞的混合物。
125.一种第一中间细胞群，所述第一中间细胞群通过根据实施方案7和13-119中任一项所述的方法产生。
126.一种第二中间细胞群，所述第二中间细胞群通过根据实施方案6-11和13-119中任一项所述的方法产生。
127.一种产生颗粒细胞的方法，所述方法包括：
将多能干细胞在存在激活素A、糖原合酶激酶-3抑制剂和ROCK抑制剂的情况下培养以产生初期中胚层样细胞(iMeLC)，
将所述iMeLC在存在FGF2、糖原合酶激酶-3抑制剂和ROCK抑制剂的情况下培养第一时间段，
降低所述iMeLC培养中的ROCK抑制剂的量并且然后将所述iMeLC培养第二时间段以产生中间中胚层细胞，以及
将所述中间中胚层细胞在存在卵泡抑素、BMP4、FGF2和ROCK抑制剂的情况下培养以产生所述颗粒细胞。
128.根据实施方案127所述的方法，其中所述糖原合酶激酶-3抑制剂是CHIR99021。
129.根据实施方案127或128所述的方法，其中所述ROCK抑制剂是Y-27632或CET。
130.根据实施方案127-129中任一项所述的方法，其中将所述多能干细胞培养约56至72小时。
131.根据实施方案127-130中任一项所述的方法，其中将所述多能干细胞培养约65小时。
132.根据实施方案127-131中任一项所述的方法，其中将多能干细胞在包含激活素A、糖原合酶激酶-3抑制剂和ROCK抑制剂的培养基中培养，并且其中每约24小时将所述培养基用新鲜培养基替换。
133.根据实施方案127-132中任一项所述的方法，其中所述第一时间段为约24小时。
134.根据实施方案127-133中任一项所述的方法，其中所述第二时间段为约5或6天。
135.根据实施方案127-134中任一项所述的方法，其中将所述iMeLC在包含所述FGF2、糖原合酶激酶-3抑制剂和ROCK抑制剂的培养基中培养第一时间段，并且其中在所述第一时间段后，将所述培养基的一部分用包含FGF2和糖原合酶激酶-3抑制剂但不包含ROCK抑制剂的培养基替换。
136.根据实施方案135所述的方法，其中所述培养基的一部分为所述培养基的约80％。
137.根据实施方案135或136所述的方法，其中所述方法进一步包括在所述第二时间段期间，每约48小时替换所述培养基的第二部分。
138.根据实施方案137所述的方法，其中所述培养基的第二部分为所述培养基的约80％。
139.根据实施方案127-138中任一项所述的方法，其中将所述中间中胚层细胞培养约5-7天的时间段。
140.根据实施方案127-139中任一项所述的方法，其中将所述中间中胚层细胞在包含卵泡抑素、BMP4、FGF2和ROCK抑制剂的培养基中培养，并且其中每约24至48小时将所述培养基的一部分用新鲜培养基替换。
141.根据实施方案127-140中任一项所述的方法，其中所述iMeLC表达Brachyury。
142.根据实施方案127-139中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层细胞表达OSR1、PAX2和LHX1。
143.根据实施方案127-142中任一项所述的方法，其中所述颗粒细胞表达FOXL2和连接蛋白43。
144.根据实施方案127-143中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是人诱导多能干细胞。
145.一种群，所述群包含通过根据实施方案127-144中任一项所述的方法产生的颗粒细胞。
146.根据实施方案1-145中任一项所述的方法或群，其中：
(a)所述培养步骤中的一步或多步包括贴壁培养；和/或
(b)所述培养步骤中的一步或多步包括3维类器官培养。
147.根据实施方案1-146中任一项所述的方法或群，其中所述培养步骤中的一步或多步包括贴壁培养。
148.根据实施方案1-147中任一项所述的方法或群，其中所述培养步骤中的一步或多步包括3维类器官培养。
149.一种体外干细胞衍生的性腺体细胞群，所述体外干细胞衍生的性腺体细胞群包含表达FOXL2的细胞、表达NR2F2的细胞和/或表达KRT-19的细胞，任选地其中所述性腺体细胞群是卵巢体细胞群。
150.根据实施方案149所述的性腺体细胞群，其中所述群至少包含表达FOXL2的第一细胞类型、表达NR2F2的第二细胞类型和表达KRT-19的第三细胞类型。
151.根据实施方案149或150所述的性腺体细胞群，其中：
(a)所述细胞群中至少20％的细胞是FOXL2阳性细胞；和/或
(b)所述细胞群中至少20％的细胞是NR2F2阳性细胞；和/或
(c)所述性腺细胞群中至少20％的细胞是KRT19阳性细胞。
152.根据实施方案149-151中任一项所述的性腺体细胞群，其中所述性腺细胞群的至少90％是FOXL2阳性细胞、NR2F2阳性细胞、和/或KRT-19阳性细胞；任选地其中：
所述性腺体细胞群基本上由FOXL2阳性细胞、NR2F2阳性细胞、和/或KRT-19阳性细胞组成。
153.根据实施方案151或152所述的性腺体细胞群，其中所述FOXL2阳性细胞包括颗粒细胞；其中所述NR2F2阳性细胞包括卵巢基质细胞和/或颗粒细胞；并且其中所述KRT-19阳性细胞包括卵巢上皮细胞。
154.根据实施方案149-153中任一项所述的性腺体细胞群，其中所述细胞群是在包括以下的方法中衍生的：
(a)将多能干细胞在包含激活素A的中胚层诱导培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；
(b)将所述第一中间细胞群在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养第二时间段，从而产生第二中间细胞群；以及
(c)将所述第二中间细胞群在包含BMP和FGF以及任选地卵泡抑素的性腺细胞诱导培养基中培养第三时间段以产生所述性腺细胞群。
实施例
通过参考以下非限制性实施例可以更好地理解本申请，所述实施例被提供为本申请的示例性实施方案。提出以下实施方案以便更充分地说明实施方案，然而不应以任何方式解释为限制本申请的宽广范围。虽然已在本文中示出和描述了本申请的某些实施方案，但是将显而易见的是此类实施方案仅以举例的方式提供。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替换。应当理解，本文所述的实施方案的各种替代方案可以用于实践本文所述的方法。
实施例1：培养基配制品
在一些实施方案中，至少约为以下任一个：30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％，制备以下培养基用于以下提供的一个或多个实施例中。
表1：GK2培养基配制品
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表2：IM培养基配制品
表3：颗粒细胞基础培养基配制品
表4：颗粒细胞双倍培养基配制品
表5：颗粒细胞BMP7培养基配制品
表6：替代50ng分化配制品
表7：CHIR分化培养基配制品
表8：MEF培养基配制品
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表9：iMeLC培养基配制品
实施例2：iMeLC细胞的产生
干细胞分化的进展经由可通过基因表达变化鉴定的多个阶段。描述了通过一系列稳定的模拟胚胎卵巢的胚胎发育的稳定状态逐步转化干细胞来产生卵巢体细胞的方法。对于每个步骤，优化条件以获得最大纯度和效率，以便获得纯的同质卵巢体细胞培养物。在颗粒细胞分化中鉴定了两个关键中间步骤以及这些步骤中的每个步骤的标记物基因。用两种不同的干细胞系测试以下方案。对于稳健的分化，通过改变诱导剂(例如，细胞因子或小分子)的浓度和持续时间，在每个步骤优化某些标记物的表达。将此类优化置于将处理不同遗传背景的细胞系的稳健通用方法的方案中。
在处理细胞之前，将12孔板的每个孔用610μL纤连蛋白溶液包被并且在37℃下孵育1小时，所述溶液纤连蛋白是用600μL PBS(在室温下)+10μL纤连蛋白(1mg/ml；Millipore，FC010，在冰上保持)制备的。之后，将培养基从人诱导多能干细胞(hiPSC)中去除，并且将细胞用PBS(室温)轻轻洗涤。然后去除PBS，并且将500μL 1:1TrypLE Select+500μL 0.5mM EDTA溶液(37℃)添加到每个iPSC孔中，然后在37℃下孵育2-3min。然后通过将1mL MEF培养基注射到孔中，将细胞从孔中取出，并且然后通过将其移液3-5次，重悬到单细胞悬浮液中。将细胞计数并且然后在1200rpm下离心5min。将离心的细胞重悬于GK2培养基中以获得约10x 106个细胞/mL。将细胞再次计数并且将70K个细胞X待诱导的孔数转移到1.5mL管(或者如果收集许多孔，则转移到15mL)中。将这些hiPSC离心并且重悬于iMeLC培养基中以获得约70k个细胞/mL。
将纤连蛋白包被溶液从包被的孔中去除，并且将孔用PBS洗涤一次。将含70kiPSC的1mL iMeLC培养基添加到孔中。在37℃与5％ CO2下，将铺板的细胞在培养箱中培养56-72小时(优选65小时)。每24小时更换iMeLC培养基。从一个12孔板产生约200万-400万个iMeLC/孔。
iMeLC的特征在于转录因子诸如Brachyury的表达。使用荧光标记的抗体来检测iMeLC中的蛋白质表达。图1A示出了在相位衬度成像下iMeLC的形态，并且图1B示出了在诱导干细胞后48h时Brachyury的高表达(下图)。未用CHIR和激活素(中图)处理的细胞显示出低至无Brachyury表达。
实施例3：IM细胞的产生
将iMeLC的培养延长至65小时，以确保同质iMeLC群，其然后被诱导为IM细胞。IM细胞的特征在于PAX2、OSR1和LHX1的表达。鉴定培养条件，以将IM细胞的培养延长至几代和多周。这能够扩增IM细胞并且还提供了纯的同质培养物，其可以分化为下游谱系。此外，可以将大量IM细胞冷冻，以确保在接下来的步骤中对颗粒细胞的可再现分化进行优异的分批控制。
去除来自实施例2的孔中的iMeLC培养基，并且将孔用1mL PBS洗涤。将500μLTrypLE添加到每个孔中，并且将板在37℃下孵育2min。将500μL MEF培养基添加到每个孔中并且上下移液3次以获得单细胞悬浮液。将悬浮液转移到1.5mL管中(或者如果收集许多孔，则转移到15mL中)，并且将剩余的细胞用另外500μL MEF培养基收集。
将细胞悬浮液在1200RPM下离心5min，并且弃去上清液。将离心的细胞重悬于1mlGK2培养基中并且将细胞计数。将约720,000个细胞(来自24孔板：30,000个细胞/孔)添加到12mL IM培养基(如实施例1中制备的，但是不含ROCK抑制剂)中。添加12μL ROCK抑制剂Y-27632(1000X)或36μL CET(3:1000)(培养基中CET的终浓度：50nM Chroman1，5uMEmricasan，0.7uM反式ISRIB)以获得60,000个细胞/mL。将500μL溶液置于纤连蛋白包被的24孔板的每个孔(约30,000个细胞/孔)中。将板培养24小时，并且然后将培养基的80％用不含ROCK抑制剂的新鲜IM培养基替换。每隔一天再次替换培养基的80％，直到细胞汇合(约5-6天)。一旦细胞汇合，将细胞传代至新鲜纤连蛋白包被的24孔板，传代后至少50,000个细胞/孔(25k/cm2)。每个24孔板产生约400万-500万个IM细胞。
图2示出了在相位衬度成像下培养物中第5天IM细胞的形态。将细胞针对OSR1、PAX2和LHX1进行染色；IM细胞(图2B-图2D中的每个的下图)显示出与iPSC和iMeLC相比所有测试的标记物的高表达。信号的单峰分布表示培养物中IM细胞的纯度和同质性。
实施例4：颗粒细胞和分化为其他谱系
从IM细胞中去除耗尽的培养基，并且在室温下将细胞用500uL PBS洗涤。添加200μL TrypLE(在37℃下)并且将细胞在37℃下孵育2min。将300μL MEF培养基(室温)添加到每个孔中并且上下移液3次以获得单细胞悬浮液。将悬浮液转移到15mL管中。将剩余的细胞用另外500μL MEF培养基收集。将转移的细胞在1200RPM下离心5min，并且弃去上清液。将细胞重悬于1ml GK2培养基中并且将细胞计数。
将500μL含ROCK抑制剂(如前所述的Y-27或CET)的分化培养基(约30,000个细胞)添加到纤连蛋白包被的24孔板的每个孔中。用以下分化培养基中的每一种进行单独实验(在37℃下)：颗粒细胞基础培养基、颗粒细胞双倍培养基、颗粒细胞BMP7、替代分化培养基(50ng FGF9)、CHIR分化培养基和IM(对照)。
在每种情况下，将板培养24小时，并且然后将分化培养基的80％用新鲜培养基替换。每隔一天再次替换培养基的80％，直到细胞汇合(约5-6天)。一旦细胞汇合，重复所述过程以将IM细胞传代至新鲜纤连蛋白包被的24孔板，传代后至少30,000个细胞/孔(15k个细胞/cm2)。在颗粒细胞分化约5-7天后，每个24孔板产生200万-400万个颗粒细胞。
在分化的第7天，收集细胞以进行标记颗粒细胞的转录因子FOXL2染色。图3A示出了颗粒细胞的形态(左)。图3B示出了在不同培养条件中FOXL2+细胞的分布，其中在颗粒细胞分化中FOXL2+细胞的百分比最高。针对FOXL2和连接蛋白43的免疫荧光染色示出了与IM和肾细胞相比，颗粒细胞中FOXL2的表达(图3C)。
实施例5：颗粒细胞分化的中间阶段的鉴定
IM细胞是多能祖细胞，其可以分化为多个谱系，包括卵巢体细胞。卵巢体细胞有多种类型；鉴定出定型为卵巢体细胞谱系并且可以分化为这些细胞类型的一种或多种祖细胞。CD24被鉴定为在早期分化中高度表达的细胞表面标记物，但随着细胞定型为卵巢体细胞命运，其表达会减弱。这为我们提供了颗粒细胞分化用于下游应用的指导轨迹。
实施例6：从人多能干细胞产生中间中胚层和胚胎卵巢体细胞，包括Foxl2+颗粒细胞培养基配制品
表10：IM诱导培养基配制品
A.表达代表中胚层的标记物的第一中间细胞群的产生。
将12孔板用610μL纤连蛋白溶液包被并且在37℃下孵育1小时，所述溶液纤连蛋白是用600μL PBS(在室温下)+10μL纤连蛋白(1mg/ml；Millipore，FC010，在冰上保持)制备的。之后，将培养基从人诱导多能干细胞(hiPSC)中去除，并且将细胞用PBS(室温)轻轻洗涤。然后去除PBS，并且将500μL 1:1TrypLE Select添加到每个iPSC孔中，然后在37℃下孵育2-3min。然后通过将1mL MEF培养基注射到孔中，将细胞从孔中取出，并且然后通过将其移液3-5次，重悬到单细胞悬浮液中。将细胞计数并且然后在1200rpm下离心5min。将离心的细胞重悬于GK2培养基中以获得约10x 106个细胞/mL。将细胞再次计数并且将60K个细胞X待铺板的孔数转移到1.5mL管(或者如果收集许多孔，则转移到15mL)中。将这些hiPSC离心并且重悬于iMeLC培养基(参见表9)(中胚层诱导培养基)中以获得约60k个细胞/mL。
将纤连蛋白包被溶液从包被的孔中去除，并且将1mL含60k iPSC的iMeLC培养基添加到孔中。在37℃与5％ CO2下，将铺板的细胞在培养箱中培养56-72小时(优选65小时)。每24小时更换iMeLC培养基。从一个12孔板产生约200万-400万个iMeLC/孔。
iMeLC的特征在于转录因子诸如Brachyury的表达。使用荧光标记的抗体来检测iMeLC中的蛋白质表达。图1A示出了在相位衬度成像下iMeLC的形态，并且图1B示出了在诱导干细胞后48h时Brachyury的高表达(下图)。未用CHIR和激活素(中图)处理的细胞显示出低至无Brachyury表达。
B.表达代表中间中胚层的标记物的第二中间细胞群的产生。
将第一中间细胞群(表达代表中胚层的标记物)的孔中的iMeLC培养基去除并且将孔用1mL PBS洗涤。将500μL TrypLE添加到每个孔中，并且将板在37℃下孵育2min。将500μLMEF培养基添加到每个孔中并且上下移液3次以获得单细胞悬浮液。将悬浮液转移到1.5mL管中(或者如果收集许多孔，则转移到15mL中)，并且将剩余的细胞用另外500μL MEF培养基收集。
将细胞悬浮液在1200RPM下离心5min，并且弃去上清液。将离心的细胞重悬于1mlGK2培养基中并且将细胞计数。将约720,000个细胞(来自24孔板：30,000个细胞/孔)添加到12mL IM诱导培养基(如表10中制备的，但是不含ROCK抑制剂)中。添加12μL ROCK抑制剂Y-27632(1000X)或36μL CET(3:1000)(培养基中CET的终浓度：50nM Chroman1，5uMEmricasan，0.7uM反式ISRIB)以获得60,000个细胞/mL。将500μL溶液置于纤连蛋白包被的24孔板的每个孔(约30,000个细胞/孔)中。将板培养24小时，并且然后将培养基的80％用不含ROCK抑制剂的新鲜IM诱导培养基替换。每隔一天再次替换培养基的80％，直到细胞汇合(约5-6天)。一旦细胞汇合，将细胞传代至新鲜纤连蛋白包被的24孔板，传代后至少50,000个细胞/孔(25k/cm2)。每个24孔板产生约400万-500万个第二中间细胞。
为了进一步确定GSK3抑制剂和视黄酸途径调节因子(RAPM)对诱导第二中间细胞群的功效的影响，在重新铺板如上所述的第一中间细胞群之后，将细胞用含递增水平的RAPM和GSK抑制剂的IM诱导培养基孵育。视黄酸(RA)处理的IM细胞示出了更好的存活和性腺体细胞分化的诱导(数据未示出)。
图5A示出了将第一中间细胞群在包含根据表10的GK2培养基、FGF2和CHIR以及0.5μM、1μM或2μM RAPM TTNPB的IM诱导培养基中孵育后，在相位衬度成像下第5天的所得第二中间细胞群的形态。如图5A所示，RA浓度的增加导致细胞存活率增加和均匀的细胞形态。
图5B示出了将第一中间细胞群在包含根据表10的GK2培养基和所述浓度的FGF2；1μM、2μM或3μM GSK3抑制剂CHIR；以及50nM、100nM、500nM或1μM RA的IM诱导培养基中孵育后，所得第二中间细胞群中中间中胚层标记物LHX1和PAX2的表达。如图5B所示，RA和/或CHIR浓度的增加导致LHX1(上图)和PAX2(下图)的表达增加。
图5C示出了将第一中间细胞群在包含根据表10的GK2培养基和所述浓度的FGF2；0.5μM、1μM或2μM GSK3抑制剂CHIR；以及0μM、0.1μM、0.5μM或1μM RA或TTNPB的IM诱导培养基中孵育后，所得第二中间细胞群中中间中胚层标记物WT1和RUNX1的表达。如图5C所示，RA和/或CHIR浓度的增加导致WT1(左图)和RUNX1(右图)的表达增加。
C.性腺体细胞的产生
根据上述方案产生表达代表中间中胚层的标记物的第二中间细胞群，其中将第一中间细胞群在包含根据表10的GK2培养基和所述浓度的FGF2；0.5μM、1μM或2μMGSK3抑制剂CHIR；以及0μM、0.1μM、0.5μM或1μM RA或TTNPB的IM诱导培养基中孵育。
从表达代表中间中胚层的标记物的第二中间细胞群中去除耗尽的培养基，并且在室温下将细胞用500uL PBS洗涤。添加200μL TrypLE并且将细胞在37℃下孵育2min。将300μL MEF培养基(室温)添加到每个孔中并且上下移液3次以获得单细胞悬浮液。将悬浮液转移到15mL管中。将剩余的细胞用另外500μL MEF培养基收集。将转移的细胞在1200RPM下离心5min，并且弃去上清液。将细胞重悬于1ml GK2培养基中并且将细胞计数。
将约60,000个在上述每种条件下产生的第二中间群细胞重构于500μL含ROCK抑制剂(如前所述的Y-27632或CET)的分化培养基中，并且重新铺板到纤连蛋白包被的24孔板的相应孔中。将来自第二中间群(在不同浓度的CHIR和RAPM下产生)的分别重新铺板的细胞在有或没有进一步补充500nM RA的根据表3的颗粒细胞基础培养基中孵育。
将细胞纵向收集进行RNA-seq分析、免疫荧光染色和流式细胞术。如在大量RNAseq实验中所测定的，图6A表明，在任何阶段都不存在RA处理的情况下，所得性腺细胞显示性腺体细胞标记物-FOXL2、RUNX1、NR2F2、WNT6和KRT19的表达增加，其中FOXL2是标记颗粒细胞的转录因子。图6B表明，在长期培养中，在包含RA的分化培养基中孵育导致存活率增加(在截止分化的D21时，未经RA处理的细胞未存活)，并且颗粒细胞标记物FOXL2和RUNX1表达增加。
如图6C中的免疫荧光染色所示，在第二中间细胞群产生期间IM诱导培养基中较高浓度的RA导致性腺细胞群中较高水平的FOXL2阳性细胞和NR2F2阳性细胞。我们同时观察到在RA处理的情况下KRT19的表达增加，如图6D所示。这也通过连续RA处理28天的细胞中针对KRT19的免疫染色得到了证实。我们观察到在第二中间细胞群和性腺体细胞的产生期间，RA处理的长度与浓度之间的良好平衡导致FOXL2阳性细胞和KRT19阳性细胞的可变％(数据未示出)，可以利用这一点来实现用于下游应用的理想异质性。
实施例7：从小鼠多能干细胞产生中间中胚层和胚胎卵巢体细胞，包括Foxl2+颗粒细胞
使用人多能干细胞设计的颗粒细胞分化方案适用于小鼠模型系统，并且导致从小鼠多能干细胞诱导Foxl2+颗粒样细胞。在2维组织培养环境中，将小鼠多能干细胞用生长因子处理，以重演早期卵巢发育。首先，将细胞引导至第一中间细胞群，然后引导至第二中间细胞群，并且然后引导至胚胎卵巢体细胞命运。在每个阶段，通过qRT-PCR和蛋白质染色分析细胞，以评价阶段特异性标记物的基因和蛋白质表达。
A.第一鼠中间细胞群的体外产生
使用先前公开的技术(Chow等人npg Regenerative Medicine 2020，PMID：32351711)培养、维持和分离小鼠多能干细胞。在开始向第一中间细胞群诱导的诱导之前，将24孔板用0.5mL稀释于DMEM-F12的100μg/mL基质胶在室温下包被1小时或在4℃下包被过夜。然后将50,000个小鼠多能干细胞接种到引发培养基中的24孔板的每个孔中。使细胞在5％CO2、37℃下的培养箱中生长48小时。然后将细胞用鼠中胚层诱导培养基(表14)处理48小时。通过qRT-PCR和免疫染色，所得细胞表达高水平的中胚层标记物brachyury(数据未示出)。
B.第二鼠中间细胞群的体外产生
将第一中间细胞群用室温无菌PBS洗涤1x，然后用鼠中间中胚层诱导培养基(表15)处理48-72小时。通过qRT-PCR，所得细胞表达中间中胚层标记物Pax2和Lhx1(数据未示出)。
C.小鼠胚胎卵巢体细胞的体外产生
将第二鼠中间细胞群用室温无菌PBS洗涤1x，然后用鼠性腺细胞诱导培养基(基础培养基或补充有1μM RA的基础培养基；表16)处理7天。收获所得细胞以进行RT-PCR分析和免疫荧光染色。在用或不用RA处理的细胞上针对Foxl2的免疫荧光染色揭示了添加1μM视黄酸导致表达Foxl2蛋白的细胞总数增加(图8，最左图)。如通过qRT-PCR测定的，图7示出了与胚胎卵巢细胞相比，所得诱导的性腺细胞表达相当或更高水平的颗粒细胞标记物(Foxl2)、基质细胞标记物(Nr2f2)和卵巢上皮细胞标记物(KRT19)。如图8中的免疫染色所示，所得诱导性腺细胞表达颗粒细胞的蛋白标记物(Foxl2)、基质细胞的蛋白标记物(Nr2f2)和卵巢上皮细胞的蛋白标记物(Krt19)。
培养基配制品：
表11
表12
| GK15基础培养基 | 总体积：25 | ml |
| GMEM | 20.225 | ml |
| KSR | 3.75 | ml |
| B-巯基乙醇(55mM) | 0.025 | ml |
| Glutamax | 0.25 | ml |
| 青霉素/链霉素 | 0.25 | ml |
| 非必需氨基酸(NEAA) | 0.25 | ml |
| 丙酮酸钠 | 0.25 | ml |
表13
| 鼠引发培养基 |
| N2B27基础培养基 |
| 12ng/mlFgf2 |
| 20ng/ml激活素A |
| 1％多物种敲除血清 |
表14
| 鼠中胚层诱导培养基 |
| N2B27 |
| 4％KSR |
| 30ng/ml Bmp4 |
| 10ng/ml激活素A |
| 12ng/mlFgf2 |
表15
表16
| 鼠性腺细胞诱导培养基 | 25000 | μL |
| GK15基础培养基 | 25000 | μL |
| 卵泡抑素(25μg/mL) | ||
| BMP4(50μg/mL) | ||
| 热稳定FGF2(10ng/mL) | ||
| 视黄酸(1μM) |
实施例8：用不同BMP同种型诱导OSC：
此实施例展示了各种BMP同种型在从第二中间群中诱导性腺体细胞(诸如卵巢体细胞-OSC)的能力方面的作用。在包含不同BMP同种型的颗粒细胞双倍培养基中诱导性腺体细胞，并且在所得细胞中测量双能性腺标记物的表达以及颗粒细胞标记物的表达。
根据实施例6中所述的方案产生表达代表中胚层的标记物的第一中间细胞群和表达中间中胚层的标记物的第二中间细胞群。
将来自第二中间群的重新铺板的细胞在含20ng/mL的BMP4、BMP2、BMP7或BMP15的根据表17的颗粒细胞双倍培养基(也称为性腺细胞诱导培养基或OSC诱导培养基)中孵育。在所得细胞中通过qPCR测量双能性腺标记物(WT1、LHX9、GADD45G和GATA4)以及颗粒细胞标记物(FOXL2、NR1H4和KITLG)的表达。
如图9A所示，与用包含BMP4的培养基的OSC诱导相比，在用包含BMP2、BMP7或BMP15的培养基的OSC诱导中，双能性腺标记物的表达相当或更高。
如图9B所示，与用包含BMP4的相应培养基的OSC诱导相比，在用包含BMP2、BMP7或BMP15的培养基的OSC诱导中，颗粒细胞标记物的表达相当或更高。
这些结果表明，使用包含BMP4、BMP2、BMP7、BMP15或其组合的颗粒细胞双倍培养基可以诱导OSC。
表17：具有不同BMP同种型的颗粒细胞双倍培养基
实施例9：用不同成纤维细胞生长因子(FGF)家族成员诱导OSC：
成纤维细胞生长因子(FGF)是对于多种多样的过程中的信号传导事件很重要的一大家族蛋白质。此实施例展示了各种FGF家族成员在从第二中间群中诱导性腺体细胞(诸如卵巢体细胞-OSC)的能力方面的作用。简言之，在包含不同FGF的颗粒细胞双倍培养基中诱导性腺细胞，并且在所得细胞中测量双能性腺标记物的表达以及颗粒细胞标记物的表达。
根据实施例6中所述的方案产生表达代表中胚层的标记物的第一中间细胞群和表达中间中胚层的标记物的第二中间细胞群。
将来自第二中间群的重新铺板的细胞在含相同浓度的FGF2、FGF9、FGF10、FGF16、FGF17、FGF18或FGF19的根据表18的颗粒细胞双倍培养基(也称为性腺细胞诱导培养基或OSC诱导培养基)中孵育。在所得细胞中测量双能性腺标记物(WT1、LHX9、GADD45G和GATA4)以及颗粒细胞标记物(FOXL2、NR1H4和KITLG)的表达。
如图10A所示，与用包含FGF2的相应培养基的OSC诱导相比，在用包含FGF9、FGF10、FGF16、FGF17、FGF18和FGF19的培养基的OSC诱导中，双能性腺标记物的表达相当或更高。
如图9B所示，与用包含BMP4的相应培养基的OSC诱导相比，在包含FGF9、FGF10、FGF16、FGF17、FGF18和FGF19的培养基的OSC诱导中，颗粒细胞标记物的表达相当。
这些结果表明，使用包含FGF2、FGF9、FGF10、FGF16、FGF17、FGF18或FGF19或其组合的颗粒细胞双倍培养基可以诱导OSC。
表18：具有不同BMP同种型的颗粒细胞双倍培养基
| 颗粒细胞双倍培养基 | 最终 |
| GK2培养基 | |
| 卵泡抑素 | 5ng/mL |
| BMP4 | 20ng/mL |
| FGF-(FGF2、FGF9、FGF10、FGF16、FGF17、FGF18或FGF19) | 10ng/mL |
| 通过将诱导剂添加到GK2培养基中来新鲜制备 | |
| Rock抑制剂 | 10μM |
实施例10：由多能干细胞诱导的OSC是功能性的：
颗粒细胞在成熟后会变为类固醇生成的-这些细胞能够将雄激素(诸如睾酮)转化为雌激素(诸如雌二醇)。负责类固醇生成的关键酶中的一种是芳香化酶-CYP19A1。
为了测定由多能干细胞产生的性腺体细胞(诸如卵巢体细胞-OSC)是否是功能性的，通过qPCR测定CYP19A1的表达，并且通过ELISA测量雌二醇的类固醇生成。
根据实施例6中所述的方案产生表达代表中胚层的标记物的第一中间细胞群和表达中间中胚层的标记物的第二中间细胞群以及OSC。
在诱导7天后通过qPCR测量OSC中CYP19A1的表达。如图11A所示，在由基础诱导培养基(基础)产生的OSC中，CYP19A1的表达增加，并且在由含有两倍于基础诱导培养基的生长因子(双倍)的诱导产生的OSC中，CYP19A1的表达进一步增加。
为了进一步证明颗粒细胞的这种功能，通过ELISA测量用二羟基-睾酮(dhT)处理OSC后培养基中分泌的雌二醇。如图11B所示，在24h孵育后，观察到的培养基中的雌二醇水平在较高dHT处理浓度的情况下增加。此外，与用50ng/ml dHT处理OSC时的24h孵育相比，观察到随着孵育时间的延长(48h)，雌二醇水平进一步增加。
结果表明，使用上述实施例中的OSC诱导方案的方法可以产生成熟的颗粒细胞。实施例11：对于OSC诱导，逐步调整BMP4、卵泡抑素和FGF的浓度：
在某些初始实验中，使用包含10ng/ml BMP4、25ng/ml卵泡抑素和5ng/ml FGF2的培养基诱导性腺体细胞(诸如卵巢体细胞-OSC)以测试第二中间群的分化潜能。在OSC诱导中测试BMP4、卵泡抑素和FGF的各种浓度逐步调整，并且检查所得细胞的双能性腺标记物的表达以及颗粒细胞标记物的表达。
根据实施例6中所述的方案产生表达代表中胚层的标记物的第一中间细胞群和表达中间中胚层的标记物的第二中间细胞群。基于实施例6中所述的方案诱导OSC，但是测试了各种浓度的BMP4、卵泡抑素和FGF。
BMP4
首先通过改变BMP4浓度来测试OSC诱导条件。没有任何BMP4的诱导导致存活较差，但是所有其他测试浓度的BMP4导致相似的相当形态。通过qPCR测试所得细胞的双能性腺细胞标记物(GATA4)以及颗粒细胞标记物(FOXL2)的基因表达(分别为图12A和图12B)。GATA4的表达在较高BMP4浓度的情况下增加，并且在测试条件下，FOXL2表达在10ng/ml BMP4处出现峰值。
对于随后的实验，基于祖细胞和成熟OSC群的表达结果，将20ng/ml BMP4用于OSC诱导测试。
卵泡抑素
然后在OSC诱导中测试四种不同浓度的卵泡抑素，如前所述，BMP4的浓度保持恒定在20ng/ml。通过qPCR测试所得细胞的双能性腺细胞标记物(GATA4)以及颗粒细胞标记物(FOXL2)的基因表达(分别为图12C和图12D)。图12C中的GATA4表达表明，在不存在卵泡抑素的情况下，有可能从祖细胞产生OSC。还通过FOXL2表达检查成熟OSC的产生。如图12D所示，在较高浓度的卵泡抑素下观察到FOXL2表达的微小增加。在随后的实验中，进一步探索在不存在卵泡抑素的情况下或在较低浓度的卵泡抑素下的OSC诱导。
FGF2
然后在OSC诱导中测试五种不同浓度的FGF2，其中BMP4的浓度保持恒定在20ng/mL并且去除卵泡抑素(0ng/mL)。通过qPCR测试所得细胞的双能性腺细胞(GATA4)以及颗粒细胞(FOXL2)的基因表达(分别为图12E和图12F)。如图12E和图12F所示，GATA4表达和FOXL2表达两者均在20ng/mL FGF2时达到饱和。
结果
如上BMP4、卵泡抑素和FGF2的综合浓度逐步调整所示，结果表明在测试条件下，BMP4促进了祖细胞群(双能性腺细胞)，但是对于OSC的作用似乎在20ng/ml下达到饱和。类似地，我们发现在测试条件下FGF2对祖细胞以及成熟群的产生的作用在20ng/ml下达到饱和。在另一方面，尽管完全去除卵泡抑素似乎增加GATA4的表达，但是表达GATA4的祖细胞也可能潜在地产生除OSC以外的其他谱系。因此，还基于FOXL2表达的结果检查卵泡抑素浓度的影响。在25ng/ml卵泡抑素下，观察到FOXL2表达的微小增加，但是FOXL2表达在较高浓度的卵泡抑素的情况下未增加。结果表明，在没有卵泡抑素的情况下以及在如所测试的各种浓度的卵泡抑素的情况下，可以进行OSC诱导。将需要进一步的实验来了解卵泡抑素在OSC诱导中的相关性。
实施例12：RA时间和浓度梯度对成为前颗粒细胞(pre-granulosa)与上皮细胞的细胞命运的影响：
从我们以前的实验中已经显示如果在性腺体细胞(诸如卵巢体细胞-OSC)诱导期间RA存在多于2天，则更多细胞表达更高水平的KRT19以及胞质KRT19，所有这些都指示上皮/间皮细胞的比例更高。在另一方面，如果在OSC诱导期间不存在RA，则表达FOXL2的细胞的比例将更高，这指示颗粒细胞的比例更高。
为了进一步了解OSC诱导期间RA对上皮/间皮细胞与颗粒细胞之间精细平衡的影响，我们创建了RA从0μM到10μM的10步浓度梯度。随着RA浓度的递增，我们观察到FOXL2染色阳性的细胞核的百分比减少以及KRT19染色的相应增加(在RA浓度约500nM处达到峰值)(图13A、图13B、图13C、图13D)。接下来，我们测试暴露于RA的长度是否会影响表达FOXL2的细胞与表达KRT19的细胞之间的平衡，其中在三种不同RA浓度-100nM、500nM和1μM-下进行测试。对于1/4的孔，我们没有添加任何RA，对于接下来的1/4的孔，我们在前20h内添加RA，对于另外1/4的孔，我们添加RA持续48h，并且对于其余的1/4，我们继续RA暴露持续实验长度(7天)。在D7将所有细胞固定并且针对FOXL2和KRT19染色。通过FOXL2阳性细胞核的百分比定量FOXL2表达；而通过相对于基于DAPI染色的细胞核数量归一化的KRT-19染色的平均强度测量KRT-19表达。
与先前观察到的趋势相似，即使短暂暴露于RA也导致KRT19阳性细胞增加和FOXL2阳性细胞减少(图13E，图13F)。结果证实，在OSC诱导期间，即使短脉冲或低浓度的RA也足以诱导和增加上皮/间皮细胞。
实施例13基于以下基因表达谱的OSC的表征：标记物基因的qPCR；单细胞RNAseq和大量RNAseq：
为了在基因表达水平上表征OSC，我们收集了纵向样品以进行大量RNAseq实验。将细胞作为iPSC(在第一和第二中间阶段(即，第一和第二中间细胞群))和OSC(在OSC诱导的D7和D14，用或不用视黄酸处理)快速冷冻。前200个高度可变基因的热图以及归一化且经处理的数据的主组分分析表明，在从第一中间阶段到第二中间阶段以及从第二中间阶段到OSC的转变期间，基因表达谱发生剧烈变化(图14A和图14B)。我们观察到视黄酸处理的OSC在针对调节激素水平和细胞增殖富集的基因簇中展现出增加的表达(图14A)，为了进一步表征分化OSC的异质性，我们收集了第2天和第7天的用或不使用视黄酸处理的OSC，并且根据制造商的方案使用10X基因组学平台对其进行单细胞分析。在此实验中分析的多于10,000个细胞中观察到，存在五个不同的表达增加的基因簇。我们观察到如通过标记物基因表达表征的，这些簇对应于前颗粒细胞、分裂前颗粒细胞、基质细胞、增殖祖细胞和上皮细胞(图14C)。此外，为了验证这些基于测序的基因表达读数，我们对生物潜能性腺标记物-GATA4、WT1、LHX9和ZFPM2；基质细胞标记物-NR2F2；颗粒细胞标记物-FOXL2、KITLG和NR1H4；和上皮细胞标记物-KRT19、TMEM151A和LRRN4进行了qPCR测定(分别为图14D、图14E、图14F、图14G)。我们观察到在基础或双倍条件下，在用或不用视黄酸处理的情况下的OSC诱导后，这些基因中的大多数基因在第7和第14天表达增加。
实施例14诱导的卵巢体细胞上的qPCR和免疫荧光测定：
根据实施例6中所述的方案产生表达代表中胚层的标记物的第一中间细胞群和表达中间中胚层的标记物的第二中间细胞群。基于实施例6中所述的方案诱导性腺体细胞(诸如卵巢体细胞-OSC)。
为了进一步验证OSC的同一性，我们分析了颗粒细胞标记物基因-FOXL2和双能性腺基因-LHX9和WT1的基因表达。所有这三种基因的表达均在较长培养持续时间下上调。我们还看到成熟颗粒细胞的标记物-KITLG和NR1H4的表达在较长培养持续时间下增加(数据未示出)。
虽然qPCR测定在评估大量的基因表达方面是有效的，但是它不能适当证明培养物中存在的细胞类型的异质性。为了评估OSC分化中不同细胞类型的异质性以及定位，对细胞聚集体进行切片并且染色以进行免疫荧光成像。如图15所示，诱导卵巢体细胞(诸如通过表达GATA4的细胞和表达NR5A1的细胞所示)，以及卵巢上皮/间皮细胞(如通过表达KRT-19的细胞所示)。
结果表明，分化方案可以用于从多能干细胞中衍生所述的体细胞类型。
本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，所提供的实施例例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对所述组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践这样的变化，并且所述变化意图落入本公开文本的范围内。
Claims (154)
1.一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：
(a)将多能干细胞在包含激活素A的中胚层诱导培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；
(b)将所述第一中间细胞群在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养第二时间段，从而产生第二中间细胞群；以及
(c)将所述第二中间细胞群在包含BMP和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养第三时间段以产生所述性腺细胞群。
2.一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：
(a)将多能干细胞在包含激活素A的中胚层诱导培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；
(b)将所述第一中间细胞群在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养第二时间段，从而产生第二中间细胞群；以及
(c)将所述第二中间细胞群在包含卵泡抑素、BMP4和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养第三时间段以产生所述性腺细胞群。
3.一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：
(a)将中胚层或中胚层样细胞在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养第一时间段从而产生第二中间细胞群；以及
(b)将所述第二中间细胞群在包含BMP和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养第二时间段以产生所述性腺细胞群。
4.一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：
(a)将中胚层或中胚层样细胞在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养第一时间段从而产生第二中间细胞群；以及
(b)将所述第二中间细胞群在包含卵泡抑素、BMP4和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养第二时间段以产生所述性腺细胞群。
5.一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：
将中间中胚层或中间中胚层样细胞在包含BMP和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养一段时间以产生所述性腺细胞群。
6.一种产生性腺细胞群的方法，所述方法包括：
将中间中胚层或中间中胚层样细胞在包含卵泡抑素、BMP4和FGF的性腺细胞诱导培养基中培养一段时间以产生所述性腺细胞群。
7.一种产生第一中间细胞群的方法，所述方法包括：将多能干细胞在包含激活素A和糖原合酶激酶-3抑制剂的中胚层诱导培养基中培养一段时间以产生第一中间细胞群。
8.一种产生第二中间细胞群的方法，所述方法包括：
将中胚层或中胚层样细胞在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养一段时间，从而产生所述第二中间细胞群。
9.一种产生第二中间细胞群的方法，所述方法包括：
(a)将多能干细胞在包含激活素A和糖原合酶激酶-3抑制剂的中胚层诱导培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；以及
(b)将所述第一中间细胞群在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)、FGF和糖原合酶激酶-3抑制剂的中间中胚层诱导培养基中培养第二时间段，从而产生所述第二中间细胞群。
10.根据权利要求1-4和9中任一项所述的方法，其中所述第一中间细胞群中的至少一部分细胞表达Brachyury。
11.根据权利要求1-4、8和9中任一项所述的方法，其中所述第二中间细胞群中的至少一部分细胞表达OSR1、PAX2或LHX。
12.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞群中的至少一部分细胞表达FOXL2、NR2F2或RUNX1。
13.根据权利要求1、2、7和9-11中任一项所述的方法，其中将所述多能干细胞以约10,000至约40,000个细胞/cm2的密度接种。
14.根据权利要求1、2、7和9-13中任一项所述的方法，其中将所述多能干细胞接种在用纤连蛋白包被的培养板中。
15.根据权利要求1、2、7和9-13中任一项所述的方法，其中将所述多能干细胞接种在用基质胶包被的培养板中。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述中胚层诱导培养基进一步包含FGF。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述中胚层诱导培养基进一步包含BMP4。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述中胚层诱导培养基进一步包含糖原合酶激酶-3抑制剂。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述中胚层诱导培养基进一步包含细胞凋亡抑制剂。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述中胚层诱导培养基中激活素A的浓度为约30ng/mL至约70ng/mL。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述中胚层诱导培养基中激活素A的浓度为约50ng/mL。
22.根据权利要求16-21中任一项所述的方法，其中所述中胚层诱导培养基中的FGF是FGF2。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述中胚层诱导培养基中FGF2的浓度为约5ng/mL至约20ng/mL，任选地其中所述中胚层诱导培养基中FGF2的浓度为约12ng/mL。
24.根据权利要求17-23中任一项所述的方法，其中所述中胚层诱导培养基中BMP4的浓度为约10ng/mL至约50ng/mL，任选地其中所述中胚层诱导培养基中BMP4的浓度为约30ng/mL。
25.根据权利要求18-24中任一项所述的方法，其中所述中胚层诱导培养基中的糖原合酶激酶-3抑制剂是CHIR99021。
26.根据权利要求25所述的方法，其中CHIR99021的浓度为约1μM至约5μM。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述中胚层诱导培养基中CHIR99021的浓度为约3μM。
28.根据权利要求19-27中任一项所述的方法，其中在所述中胚层诱导培养基中：
(A)所述细胞凋亡抑制剂是Y-27632，任选地其中Y-27632的浓度为约5μM至约20μM；或者
(B)所述细胞凋亡抑制剂包括Chroman1、Emricasan和反式ISRIB，任选地其中Chroman1的浓度为约30nM至约70nM，Emricasan的浓度为约2μM至约10μM，并且反式ISRIB的浓度为约0.2μM至约2μM。
29.根据权利要求28所述的方法，其中在所述中胚层诱导培养基中：
(A)Y-27632的浓度为约10μM；或者
(B)Chroman1的浓度为约50nM，Emricasan的浓度为约5μM，并且反式ISRIB的浓度为约0.7μM。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中在中胚层诱导培养基中培养的时间段为约24小时至约96小时。
31.根据权利要求30所述的方法，其中在中胚层诱导培养基中培养的时间段为约24小时至约72小时。
32.根据权利要求31所述的方法，其中在中胚层诱导培养基中培养的时间段为约56小时至约72小时。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述第一中间细胞群中至少90％的细胞表达Brachyury。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述第一中间细胞群中至少80％的细胞表达以下中的一种或多种：MIXL1、N-钙粘蛋白、EpCam、NCAM。
35.根据权利要求1-34所述的方法，其中所述第一中间细胞群中至少90％的细胞表达：Brachyury、N-钙粘蛋白、EpCam和NCAM。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述第一中间细胞群中至少90％的细胞是中胚层或中胚层样细胞。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述第一中间细胞群基本上由中胚层或中胚层样细胞组成。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中在中间中胚层诱导培养基中培养之前，将所述第一中间细胞群重新铺板到新的纤连蛋白包被的培养板上；任选地其中在重新铺板之前将所述第一中间细胞群酶促脱附、离心并且重悬。
39.根据权利要求38所述的方法，其中将所述第一中间细胞群以约5,000至约25,000个细胞/cm2的密度铺板。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基进一步包含FGF。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基进一步包含糖原合酶激酶-3抑制剂。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基进一步包含激活素A。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基进一步包含细胞凋亡抑制剂。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述方法包括将所述第一中间细胞群
(i)首先在具有第一浓度的所述细胞凋亡抑制剂的所述中间中胚层诱导培养基中培养，
(ii)随后在具有不高于第二浓度的所述细胞凋亡抑制剂的所述中间中胚层诱导培养基中培养。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基中的RAPM是RAR激动剂，任选地其中所述RAPM包括视黄酸(RA)和/或TTNPB。
46.根据权利要求1-45中任一项所述的方法，其中：
(c)所述RAPM是RA，其中所述中间中胚层诱导培养基中RA的浓度为约0.5μM至约2μM；和/或
(d)所述RAPM是TTNPB，其中所述中间中胚层诱导培养基中TTNPB的浓度为约0.2μM至约1μM。
47.根据权利要求46所述的方法，其中
(c)所述中间中胚层诱导培养基中RA的浓度为约1μM；和/或
(d)所述中间中胚层诱导培养基中TTNPB的浓度为约0.5μM。
48.根据权利要求40-47中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基中的FGF是FGF2，其中所述FGF2的浓度为约10ng/mL至约30ng/mL。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基中FGF2的浓度为约20ng/mL。
50.根据权利要求41-49中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基中的糖原合酶激酶-3抑制剂是CHIR99021，其中CHIR99021的浓度为约1μM至约5μM。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基中CHIR99021的浓度为约2μM或约3μM。
52.根据权利要求42-51中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基中激活素A的浓度为约10ng/mL至约50ng/mL。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基中激活素A的浓度为约30ng/mL。
54.根据权利要求43和46-53中任一项所述的方法，其中在所述中胚层诱导培养基中：
(A)所述细胞凋亡抑制剂是Y-27632，其中Y-27632的浓度为约5μM至约20μM；或者
(B)所述细胞凋亡抑制剂包括Chroman1、Emricasan和反式ISRIB，其中Chroman1的浓度为约30nM至约70nM，Emricasan的浓度为约2μM至约10μM，并且反式ISRIB的浓度为约0.2μM至约2μM。
55.根据权利要求45-54中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基中的所述细胞凋亡抑制剂是Y-27632，其中所述方法包括将所述第一中间细胞群：
(i)首先在包含约10μM Y-27632的中间中胚层诱导培养基中培养；以及
(ii)随后在具有不高于约2μM Y-27632的中间中胚层诱导培养基中培养。
56.根据权利要求45-55中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述第一中间细胞群：
(i)首先在包含约10μM Y-27632的中间中胚层诱导培养基中培养约24小时，
(ii)随后在具有不高于约2μM Y-27632的中间中胚层诱导培养基中培养约5-6天。
57.根据权利要求1-56中任一项所述的方法，其中在所述中间中胚层诱导培养基中培养的时间段为约4-14天。
58.根据权利要求1-57中任一项所述的方法，其中在所述中间中胚层诱导培养基中培养的时间段为约5-9天。
59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层诱导培养基中的细胞凋亡抑制剂是Y-27632，其中在所述中间中胚层诱导培养基中培养期间，Y-27632的浓度：
(a)在前24小时期间为约10μM；
(b)在24小时与72小时之间为不高于约2μM；
(c)在72小时与120小时之间为不高于约0.5μM；或者
(d)在120小时之后为不高于约0.1μM。
60.根据权利要求44-59中任一项所述的方法，其中将所述第一中间细胞群在包含细胞凋亡抑制剂的中间中胚层诱导培养基中培养约24小时，并且其中在约24小时之后，首先将所述培养基的一部分用不包含所述细胞凋亡抑制剂的中间中胚层诱导培养基替换。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述培养基的一部分为所述培养基的约80％。
62.根据权利要求60或61所述的方法，其中所述方法进一步包括随后的培养基替换，其中所述培养基替换包括在培养开始24小时后，每约48小时将所述培养基的一部分替换。
63.根据权利要求62所述的方法，其中在每次随后的培养基替换中所述培养基的一部分为所述培养基的约80％。
64.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中所述第二中间细胞群中至少90％的细胞表达以下中的一种或多种：OSR1、PAX2、LHX1和RUNX1。
65.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中所述第二中间细胞群中至少90％的细胞表达以下中的两种或更多种：OSR1、PAX2、LHX1和RUNX1。
66.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中所述第二中间细胞群中至少90％的细胞表达OSR1、PAX2和LHX1。
67.根据权利要求1-66中任一项所述的方法，其中所述第二中间细胞群中至少90％的细胞是中间中胚层或中间中胚层样细胞。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述第二中间细胞群基本上由中间中胚层或中间中胚层样细胞组成。
69.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其中在性腺细胞诱导培养基中培养之前，将所述第二中间细胞群重新铺板到新的纤连蛋白包被的培养板上；任选地其中在重新铺板之前将所述第二中间细胞群酶促脱附、离心并且重悬。
70.根据权利要求69所述的方法，其中将所述第二中间细胞群以约5,000至约25,000个细胞/cm2的密度铺板。
71.根据权利要求1-70中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基进一步包含RAPM。
72.根据权利要求1-71中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基进一步包含细胞凋亡抑制剂。
73.根据权利要求1、3、5和10-72中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基进一步包含卵泡抑素。
74.根据权利要求1-73中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基中卵泡抑素的浓度为约10ng/mL至约50ng/mL。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基中卵泡抑素的浓度为约25ng/mL。
76.根据权利要求1、3、5和10-75中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基中的BMP包括BMP4、BMP2、BMP7、BMP15或其任何组合。
77.根据权利要求1、3、5和10-76中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基中BMP的总浓度为约5ng/mL至约20ng/mL、或约20ng/mL至约70ng/mL。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基中BMP的总浓度为约10ng/mL或约50ng/mL。
79.根据权利要求1-78中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基中BMP4的浓度为约5ng/mL至约20ng/mL或约20ng/mL至约70ng/mL。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基中BMP4的浓度为约10ng/mL或约50ng/mL。
81.根据权利要求1-80中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基中的FGF包括FGF2、FGF9、FGF10、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19或其任何组合。
82.根据权利要求1-81中任一项所述的方法，其中FGF的浓度为约1ng/mL至约10ng/mL或约5ng/mL至约25ng/mL。
83.根据权利要求82所述的方法，其中FGF的浓度为约5ng/mL或约10ng/mL。
84.根据权利要求1-83中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基中的FGF是FGF2，其中所述FGF2的浓度为约1ng/mL至约10ng/mL或约5ng/mL至约25ng/mL。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基中FGF2的浓度为约5ng/mL或约10ng/mL。
86.根据权利要求71-85中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞诱导培养基中的RAPM是RAR激动剂，任选地其中所述RAPM包括视黄酸(RA)和/或TTNPB。
87.根据权利要求86所述的方法，其中
(c)所述RAPM是RA，其中所述性腺细胞诱导培养基中RA的浓度为约0.5μM至约2μM；和/或
(d)所述RAPM是TTNPB，其中所述性腺细胞诱导培养基中TTNPB的浓度为约0.2μM至约1μM。
88.根据权利要求72-87中任一项所述的方法，其中在所述性腺细胞诱导培养基中：
(A)所述细胞凋亡抑制剂是Y-27632，任选地其中Y-27632的浓度为约5μM至约20μM；或者
(B)所述细胞凋亡抑制剂包括Chroman1、Emricasan和反式ISRIB，任选地其中Chroman1的浓度为约30nM至约70nM，Emricasan的浓度为约2μM至约10μM，并且反式ISRIB的浓度为约0.2μM至约2μM。
89.根据权利要求88所述的方法，其中在所述性腺细胞诱导培养基中：
(A)Y-27632的浓度为约10μM；或者
(B)Chroman1的浓度为约50nM，Emricasan的浓度为约5μM，并且反式ISRIB的浓度为约0.7μM。
90.根据权利要求1-89中任一项所述的方法，其中在性腺细胞诱导培养基中培养的时间段为约5天至约21天。
91.根据权利要求90所述的方法，其中在性腺细胞诱导培养基中培养的时间段为约7天至约14天。
92.根据权利要求1-91中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞群包含卵巢体细胞。
93.根据权利要求1-92中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞群由卵巢体细胞组成。
94.根据权利要求1-93中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞群中至少20％的细胞是FOXL2阳性细胞。
95.根据权利要求1-94中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞群中至少20％的细胞是NR2F2阳性细胞。
96.根据权利要求1-95中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞群中至少20％的细胞是KRT19阳性细胞。
97.根据权利要求1-96中任一项所述的方法，其中所述性腺细胞群的至少90％是FOXL2阳性细胞、NR2F2阳性细胞、和/或KRT-19阳性细胞。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述性腺细胞群基本上由FOXL2阳性细胞、NR2F2阳性细胞、和/或KRT-19阳性细胞组成。
99.根据权利要求97或98所述的方法，其中所述FOXL2阳性细胞包括颗粒细胞；其中所述NR2F2阳性细胞包括基质细胞和/或颗粒细胞；并且其中所述KRT-19阳性细胞包括卵巢上皮细胞。
100.根据权利要求1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含RAPM的方法产生的相应性腺细胞群相比，
(I)所述性腺细胞群中表达NR2F2的细胞的量增加；和/或
(II)所述性腺细胞群中表达FOXL2的细胞的量增加；和/或
(III)所述性腺细胞群中表达RUNX1的细胞的量增加；和/或
(IV)所述性腺细胞群中表达WNT6的细胞的量增加；和/或
(V)所述性腺细胞群中表达NR5A1的细胞的量增加；和/或
(VI)所述性腺细胞群中表达OSR1的细胞的量增加；和/或
(VII)所述性腺细胞群中表达LHX9的细胞的量增加；和/或
(VIII)所述性腺细胞群中表达EMX2的细胞的量增加。
101.根据权利要求1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的RAPM的方法产生的相应的性腺细胞群相比，
(I)所述性腺细胞群中表达NR2F2的细胞的量增加；和/或
(II)所述性腺细胞群中表达FOXL2的细胞的量增加；和/或
(III)所述性腺细胞群中表达RUNX1的细胞的量增加；和/或
(IV)所述性腺细胞群中表达WNT6的细胞的量增加；和/或
(V)所述性腺细胞群中表达NR5A1的细胞的量增加；和/或
(VI)所述性腺细胞群中表达OSR1的细胞的量增加。
102.根据权利要求1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应的性腺细胞群相比，
(I)所述性腺细胞群中表达NR2F2的细胞的量增加；和/或
(II)所述性腺细胞群中表达FOXL2的细胞的量增加；和/或
(III)所述性腺细胞群中表达RUNX1的细胞的量增加；和/或
(IV)所述性腺细胞群中表达WNT6的细胞的量增加；和/或
(V)所述性腺细胞群中表达NR5A1的细胞的量增加；和/或
(VI)所述性腺细胞群中表达OSR1的细胞的量增加；和/或
(VII)所述性腺细胞群中表达LHX9的细胞的量增加；和/或
(VIII)所述性腺细胞群中表达EMX2的细胞的量增加。
103.根据权利要求1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应性腺细胞群相比，
(I)所述性腺细胞群中表达NR2F2的细胞的量增加；和/或
(II)所述性腺细胞群中表达FOXL2的细胞的量增加；和/或
(III)所述性腺细胞群中表达RUNX1的细胞的量增加；和/或
(IV)所述性腺细胞群中表达WNT6的细胞的量增加；和/或
(V)所述性腺细胞群中表达NR5A1的细胞的量增加；和/或
(VI)所述性腺细胞群中表达OSR1的细胞的量增加；和/或
(VII)所述性腺细胞群中表达LHX9的细胞的量增加；和/或
(VIII)所述性腺细胞群中表达EMX2的细胞的量增加。
104.根据权利要求1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含RAPM的方法产生的相应第二中间细胞群相比，
(I)所述第二中间细胞群中LHX1表达的量增加；和/或
(II)所述第二中间细胞群中PAX2表达的量增加；和/或
(III)所述第二中间群中WT1表达的量增加；和/或
(IV)所述第二中间细胞群中RUNX1表达的量增加；和/或
(V)所述第二中间细胞群的活力增加；和/或
(VI)所述第二中间细胞群的细胞形态更均匀。
105.根据权利要求1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的RAPM的方法产生的相应第二中间细胞群相比，
(I)所述第二中间细胞群中LHX1表达的量增加；和/或
(II)所述第二中间细胞群中PAX2表达的量增加；和/或
(III)所述第二中间群中WT1表达的量增加；和/或
(IV)所述第二中间细胞群中RUNX1表达的量增加；和/或
(V)所述第二中间细胞群的活力增加；和/或
(VI)所述第二中间细胞群的细胞形态更均匀。
106.根据权利要求1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应第二中间细胞群相比，
(I)所述第二中间细胞群中LHX1表达的量增加；和/或
(II)所述第二中间细胞群中PAX2表达的量增加；和/或
(III)所述第二中间群中WT1表达的量增加；和/或
(IV)所述第二中间细胞群中RUNX1表达的量增加；和/或
(V)所述第二中间细胞群的活力增加；和/或
(VI)所述第二中间细胞群的细胞形态更均匀。
107.根据权利要求1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应第二中间细胞群相比，(I)所述第二中间细胞群中LHX1表达的量增加；和/或
(II)所述第二中间细胞群中PAX2表达的量增加；和/或
(III)所述第二中间群中WT1表达的量增加；和/或
(IV)所述第二中间细胞群中RUNX1表达的量增加；和/或
(V)所述第二中间细胞群的活力增加；和/或
(VI)所述第二中间细胞群的细胞形态更均匀。
108.根据权利要求1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含RAPM的方法产生的相应第二中间细胞群相比，
(I)所述第二中间细胞群分化为表达NR2F2的性腺细胞的潜力增加；和/或
(II)所述第二中间细胞群分化为表达FOXL2的性腺细胞的潜力增加；和/或
(III)所述第二中间细胞群分化为表达RUNX1的性腺细胞的潜力增加；和/或
(IV)所述第二中间细胞群分化为表达WNT6的性腺细胞的潜力增加；和/或
(V)所述第二中间细胞群分化为表达NR5A1的性腺细胞的潜力增加；和/或
(VI)所述第二中间细胞群分化为表达OSR1的性腺细胞的潜力增加。
109.根据权利要求1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的RAPM的方法产生的相应第二中间细胞群相比，
(I)所述第二中间细胞群分化为表达NR2F2的性腺细胞的潜力增加；和/或
(II)所述第二中间细胞群分化为表达FOXL2的性腺细胞的潜力增加；和/或
(III)所述第二中间细胞群分化为表达RUNX1的性腺细胞的潜力增加；和/或
(IV)所述第二中间细胞群分化为表达WNT6的性腺细胞的潜力增加；和/或
(V)所述第二中间细胞群分化为表达NR5A1的性腺细胞的潜力增加；和/或
(VI)所述第二中间细胞群分化为表达OSR1的性腺细胞的潜力增加。
110.根据权利要求1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基不包含糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应第二中间细胞群相比，
(I)所述第二中间细胞群分化为表达NR2F2的性腺细胞的潜力增加；和/或
(II)所述第二中间细胞群分化为表达FOXL2的性腺细胞的潜力增加；和/或
(III)所述第二中间细胞群分化为表达RUNX1的性腺细胞的潜力增加；和/或
(IV)所述第二中间细胞群分化为表达WNT6的性腺细胞的潜力增加；和/或
(V)所述第二中间细胞群分化为表达NR5A1的性腺细胞的潜力增加；和/或
(VI)所述第二中间细胞群分化为表达OSR1的性腺细胞的潜力增加。
111.根据权利要求1-99中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述中间中胚层诱导培养基包含较低浓度的糖原合酶激酶-3抑制剂的方法产生的相应第二中间细胞群相比，(I)所述第二中间细胞群分化为表达NR2F2的性腺细胞的潜力增加；和/或
(II)所述第二中间细胞群分化为表达FOXL2的性腺细胞的潜力增加；和/或
(III)所述第二中间细胞群分化为表达RUNX1的性腺细胞的潜力增加；和/或
(IV)所述第二中间细胞群分化为表达WNT6的性腺细胞的潜力增加；和/或
(V)所述第二中间细胞群分化为表达NR5A1的性腺细胞的潜力增加；和/或
(VI)所述第二中间细胞群分化为表达OSR1的性腺细胞的潜力增加。
112.根据权利要求1-111中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述性腺细胞诱导培养基包含较低浓度的RAPM的方法产生的相应性腺细胞群相比，
(I)所述性腺细胞群中FOXL2表达的量减少；和/或
(II)所述性腺细胞群中NR1H4和/或KITLG表达的量减少；和/或
(III)所述性腺细胞群中KRT-19表达的量增加；和/或
(IV)所述性腺细胞群中胞质KRT-19表达的量增加；和/或
(V)所述性腺细胞群中MSLN、LRRN4和/或TMEM151A表达的量增加。
113.根据权利要求1-111中任一项所述的方法，其中：与通过其中所述性腺细胞诱导培养基不包含RAPM的方法产生的相应性腺细胞群相比，
(I)所述性腺细胞群中FOXL2表达的量减少；和/或
(II)所述性腺细胞群中NR1H4和/或KITLG表达的量减少；和/或
(III)所述性腺细胞群中KRT-19表达的量增加；和/或
(IV)所述性腺细胞群中胞质KRT-19表达的量增加；和/或
(V)所述性腺细胞群中MSLN、LRRN4和/或TMEM151A表达的量增加。
114.根据权利要求1-111中任一项所述的方法，其中：与通过包括与RAPM接触较短时间段的性腺细胞诱导步骤产生的相应性腺细胞群相比，
(I)所述性腺细胞群中FOXL2表达的量减少；和/或
(II)所述性腺细胞群中NR1H4和/或KITLG表达的量减少；和/或
(III)所述性腺细胞群中KRT-19表达的量增加；和/或
(IV)所述性腺细胞群中胞质KRT-19表达的量增加；和/或
(V)所述性腺细胞群中MSLN、LRRN4和/或TMEM151A表达的量增加。
115.根据权利要求1-114中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是哺乳动物干细胞。
116.根据权利要求1-115中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是人多能干细胞。
117.根据权利要求1-115中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是牛干细胞。
118.根据权利要求1-115中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是鼠多能干细胞。
119.根据权利要求115-118中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是胚胎干细胞或诱导多能干细胞。
120.根据权利要求1-6和10-119中任一项所述的方法，其中所述性腺群包含选自以下的一个或多个群：颗粒细胞、卵巢基质细胞和上皮细胞或其组合。
121.根据权利要求1-6和10-120中任一项所述的方法，其中所述性腺群包含颗粒细胞、卵巢基质细胞和上皮细胞的混合物。
122.一种性腺细胞群，所述性腺细胞群通过根据权利要求1-6和10-121中任一项所述的方法产生。
123.根据权利要求122所述的性腺细胞群，其中所述性腺群包含选自以下的一个或多个群：颗粒细胞、卵巢基质细胞和上皮细胞或其组合。
124.根据权利要求122或权利要求123所述的性腺细胞群，其中所述性腺群包含颗粒细胞、卵巢基质细胞和上皮细胞的混合物。
125.一种第一中间细胞群，所述第一中间细胞群通过根据权利要求7和13-119中任一项所述的方法产生。
126.一种第二中间细胞群，所述第二中间细胞群通过根据权利要求6-11和13-119中任一项所述的方法产生。
127.一种产生颗粒细胞的方法，所述方法包括：
将多能干细胞在存在激活素A、糖原合酶激酶-3抑制剂和ROCK抑制剂的情况下培养以产生初期中胚层样细胞(iMeLC)，
将所述iMeLC在存在FGF2、糖原合酶激酶-3抑制剂和ROCK抑制剂的情况下培养第一时间段，
降低所述iMeLC培养中的ROCK抑制剂的量并且然后将所述iMeLC培养第二时间段以产生中间中胚层细胞，以及
将所述中间中胚层细胞在存在卵泡抑素、BMP4、FGF2和ROCK抑制剂的情况下培养以产生所述颗粒细胞。
128.根据权利要求127所述的方法，其中所述糖原合酶激酶-3抑制剂是CHIR99021。
129.根据权利要求127或128所述的方法，其中所述ROCK抑制剂是Y-27632或CET。
130.根据权利要求127-129中任一项所述的方法，其中将所述多能干细胞培养约56至72小时。
131.根据权利要求127-130中任一项所述的方法，其中将所述多能干细胞培养约65小时。
132.根据权利要求127-131中任一项所述的方法，其中将多能干细胞在包含激活素A、糖原合酶激酶-3抑制剂和ROCK抑制剂的培养基中培养，并且其中每约24小时将所述培养基用新鲜培养基替换。
133.根据权利要求127-132中任一项所述的方法，其中所述第一时间段为约24小时。
134.根据权利要求127-133中任一项所述的方法，其中所述第二时间段为约5或6天。
135.根据权利要求127-134中任一项所述的方法，其中将所述iMeLC在包含所述FGF2、糖原合酶激酶-3抑制剂和ROCK抑制剂的培养基中培养第一时间段，并且其中在所述第一时间段后，将所述培养基的一部分用包含FGF2和糖原合酶激酶-3抑制剂但不包含ROCK抑制剂的培养基替换。
136.根据权利要求135所述的方法，其中所述培养基的一部分为所述培养基的约80％。
137.根据权利要求135或136所述的方法，其中所述方法进一步包括在所述第二时间段期间，每约48小时替换所述培养基的第二部分。
138.根据权利要求137所述的方法，其中所述培养基的第二部分为所述培养基的约80％。
139.根据权利要求127-138中任一项所述的方法，其中将所述中间中胚层细胞培养约5-7天的时间段。
140.根据权利要求127-139中任一项所述的方法，其中将所述中间中胚层细胞在包含卵泡抑素、BMP4、FGF2和ROCK抑制剂的培养基中培养，并且其中每约24至48小时将所述培养基的一部分用新鲜培养基替换。
141.根据权利要求127-140中任一项所述的方法，其中所述iMeLC表达Brachyury。
142.根据权利要求127-139中任一项所述的方法，其中所述中间中胚层细胞表达OSR1、PAX2和LHX1。
143.根据权利要求127-142中任一项所述的方法，其中所述颗粒细胞表达FOXL2和连接蛋白43。
144.根据权利要求127-143中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是人诱导多能干细胞。
145.一种群，所述群包含通过根据权利要求127-144中任一项所述的方法产生的颗粒细胞。
146.根据权利要求1-145中任一项所述的方法或群，其中：
(a)所述培养步骤中的一步或多步包括贴壁培养；和/或
(b)所述培养步骤中的一步或多步包括3维类器官培养。
147.根据权利要求1-146中任一项所述的方法或群，其中所述培养步骤中的一步或多步包括贴壁培养。
148.根据权利要求1-147中任一项所述的方法或群，其中所述培养步骤中的一步或多步包括3维类器官培养。
149.一种体外干细胞衍生的性腺体细胞群，所述体外干细胞衍生的性腺体细胞群包含表达FOXL2的细胞、表达NR2F2的细胞和/或表达KRT-19的细胞，任选地其中所述性腺体细胞群是卵巢体细胞群。
150.根据权利要求149所述的性腺体细胞群，其中所述群至少包含表达FOXL2的第一细胞类型、表达NR2F2的第二细胞类型和表达KRT-19的第三细胞类型。
151.根据权利要求149或150所述的性腺体细胞群，其中：
(a)所述细胞群中至少20％的细胞是FOXL2阳性细胞；和/或
(b)所述细胞群中至少20％的细胞是NR2F2阳性细胞；和/或
(c)所述性腺细胞群中至少20％的细胞是KRT19阳性细胞。
152.根据权利要求149-151中任一项所述的性腺体细胞群，其中所述性腺细胞群的至少90％是FOXL2阳性细胞、NR2F2阳性细胞、和/或KRT-19阳性细胞；任选地其中：
所述性腺体细胞群基本上由FOXL2阳性细胞、NR2F2阳性细胞、和/或KRT-19阳性细胞组成。
153.根据权利要求151或152所述的性腺体细胞群，其中所述FOXL2阳性细胞包括颗粒细胞；其中所述NR2F2阳性细胞包括卵巢基质细胞和/或颗粒细胞；并且其中所述KRT-19阳性细胞包括卵巢上皮细胞。
154.根据权利要求149-153中任一项所述的性腺体细胞群，其中所述细胞群是在包括以下的方法中衍生的：
(a)将多能干细胞在包含激活素A的中胚层诱导培养基中培养第一时间段以产生第一中间细胞群；
(b)将所述第一中间细胞群在包含视黄酸途径调节因子(RAPM)的中间中胚层诱导培养基中培养第二时间段，从而产生第二中间细胞群；以及
(c)将所述第二中间细胞群在包含BMP和FGF以及任选地卵泡抑素的性腺细胞诱导培养基中培养第三时间段以产生所述性腺细胞群。
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