CN116656630A - 重组鸭瘟病毒疫苗及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供重组鸭瘟病毒疫苗及其构建方法和应用。本发明提供两株重组鸭瘟病毒疫苗株，rDEV dH5/H7‑1和rDEV dH5/H7‑2，包括在鸭病毒性肠炎病毒DEV基因组的LORF3和LORF2基因之间，SORF3和US2基因之间的间隔区中插入的一个或多个抗原编码序列。本发明还涉及两株重组鸭瘟病毒疫苗株的构建方法，以及两株重组鸭瘟病毒疫苗株用于制备预防鸭病毒和/或细菌感染导致的疾病的疫苗的应用。本发明的重组鸭瘟病毒疫苗不影响DEV的免疫效果，同时提供对其它鸭病毒和/或细菌感染导致的疾病的免疫保护。
Description
技术领域
本发明属于重组病毒疫苗领域，更具体地属于重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗领域。
背景技术
鸭病毒肠炎（Duck virus enteritis，DVE），又名鸭瘟，由鸭病毒性肠炎病毒（Duckenteritis virus，DEV）引起，可导致不同年龄鸭、天鹅、鹅等水禽最高达100%死亡率。根据国际病毒分类委员会（ICTV）最新分类，DEV属于马立克病毒属，疱疹病毒科的α疱疹病毒亚科。DEV直径约120-130 nm，呈球状，有包膜，包括双层脂质包膜、无定形外皮、二十面体衣壳和线性双链DNA（图1-2）。DEV的基因组大小约158kb，与其他疱疹病毒相似，基因组由一个长独特区（UL）和一个短独特区（US）通过之间的内部重复序列（IRS），以及短独特区末端的末端重复序列（TRS）通过共价结合的方式组合而成。基因组包含78个开放阅读框（ORF），在78个ORF中，大多数ORF（65个）位于UL区域，11个ORF位于US区域，剩余的两个ORF位于IRS和TRS区域。该病在荷兰首次报道（Baudet，1923），之后在印度、比利时、法国、中国、美国、泰国、英国、丹麦、匈牙利、德国和越南均有爆发（Sandhu 和Leibovitz，1997）。各种日龄的鸭均有易感性，可导致死亡和种鸭产蛋量的显著下降。该病毒主要通过接触传播，其次被污染的水域、饲料、鸭舍等环境也可引起感染。该病全球都有分布，死亡率和临床症状严重程度因动物种类和毒株而有所不同。感染DEV的鸭通常在出现临床症状的1-5天后开始死亡，并有部分鸭在没有充分表现出临床表现的情况下就死亡。当临床症状明显时，尤其是大日龄鸭会出现血管损伤、淋巴器官损伤、消化道黏膜炎症、严重腹泻和实质器官退行性损伤等，并最终导致死亡。部分鸭伴有其他临床症状，包括畏光、极度口渴、食欲不振、共济失调、流鼻涕、羽毛凌乱、水样腹泻以及头部、颈部肿大和身体震颤等现象出现。
上世纪60年代，我国研究人员通过在鸡胚进行连续传代，成功的研制了弱毒疫苗，并在我国广泛应用，沿用至今，为我国养鸭业鸭瘟的防控发挥了关键作用。
疱疹病毒基因组巨大，复制非必须区域多，可容纳外源基因片段长，被认为是良好的重组疫苗载体。中国广泛应用的DEV疫苗株是由强毒株在鸡胚中连续传代致弱而成，在过去60多年中被用作预防鸭瘟，安全有效。过去十多年，DEV弱毒疫苗株被广泛用作表达雁型目禽类其它疫病保护性抗原的重组疫苗载体平台，且效果良好。目前，构建重组DEV方法主要包括粘粒系统（fosmid system construction）、同源重组、细菌人工染色体（BAC）和CRISPR/Cas9基因编辑系统等方法。
前期研究中，发明人基于粘粒救毒系统（fosmid system construction）成功构建了表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭瘟病毒rDEV-us78HA，该重组病毒能够诱导快速有效的对H5亚型禽流感强毒和DEV强毒免疫保护，田间试验进一步研究表明用其按照鸭瘟疫苗株免疫程序免疫鸭，可诱导终身对流感强毒和鸭瘟强毒的免疫保护，无免疫空白期。另有报道表明，利用CRISPR/ Cas9系统，构建了同时表达 H5N1亚型禽流感HA基因和坦布苏病毒膜蛋白（PrM）和糖蛋白（E）基因的DEV重组病毒，并对其作为三价疫苗的潜力进行了评估，免疫保护效果良好。
根据当前全球和我国禽流感流行和监测情况，以及使用多价H5和H7禽流感疫苗现状，研制多价H5和H7亚型禽流感病毒HA基因重组鸭瘟疫苗具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种能够使无特定病原鸭（SPF鸭）产生针对多种禽流感病毒重要抗原的HA抗体，同时还不影响DEV的免疫效果的多价重组疫苗。
本发明的技术方案为：鸭瘟病毒重组株（Duck virusenteritis Recombinantstrain）rDEV dH5/H7-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202315。
上述所述的rDEV dH5/H7-1在制备预防或治疗鸭病毒性肠炎病毒或禽流感病毒导致的鸭疾病的疫苗或药物中的用途。
鸭瘟病毒重组株（Duck virusenteritis Recombinant strain）rDEV dH5/H7-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202316。
上述所述的rDEV dH5/H7-2在制备预防或治疗鸭病毒性肠炎病毒或禽流感病毒导致的鸭疾病的疫苗或药物中的用途。
一种疫苗，含有上述所述的rDEV dH5/H7-1或rDEV dH5/H7-2。
构建鸭瘟病毒重组株的方法，包括如下步骤：
（1）构建包含鸭病毒性肠炎病毒DEV基因组的粘粒组合，
（2）在相应粘粒中对应鸭病毒性肠炎病毒DEV基因组的US7与US8基因之间的间隔序列中插入SEQ ID No:1所示核苷酸序列的HA抗原表达框，在US8与US1基因之间的间隔序列中插入SEQ ID No:2所示核苷酸序列的HA抗原表达框，在LORF3与LORF2之间的间隔序列中或SORF3与US2基因之间的间隔序列中插入SEQ ID No:3所示核苷酸序列的HA抗原表达框，得到重组突变粘粒；
（3）将重组突变粘粒与步骤（1）的未重组粘粒一起转染宿主细胞，拯救获得鸭瘟病毒重组株。
进一步地，所述US7与US8基因之间的间隔序列如SEQ ID No:4所示，US8与US1基因之间的间隔序列如SEQ ID No:5所示，LORF3与LORF2之间的间隔序列如SEQ ID No:6所示，SORF3与US2基因之间的间隔序列如SEQ ID No:7所示。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次证明在DEV基因组的US7与US8、US8与US1、LORF3与LORF2之间的间隔区和US7与US8、US8与US1、SORF3与US2之间的间隔区，以两种组合的插入形式，能同时分别稳定插入3种以SV40为启动子的HA基因表达框架。构造出两株重组病毒均能在体外良好表达HA基因。用其对SPF鸭进行一次免疫后不但能提供与原疫苗株DEV相当的免疫效果，且HA基因在SPF鸭体内能得到良好的表达，能诱导良好的免疫效果，能抵抗禽流感强毒的攻击。
保藏信息：
鸭瘟病毒重组株（Duck virusenteritis Recombinant strain）rDEV dH5/H7-1，于2023年3月13日保藏在中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202315。
上述所述的rDEV dH5/H7-1在制备预防或治疗鸭瘟或禽流感的疫苗或药物中的用途。
鸭瘟病毒重组株（Duck virusenteritis Recombinant strain）rDEV dH5/H7-2，于2023年3月13日保藏在中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202316。
附图说明
图1：构建的pFOS5us78 SV40 HA质粒图谱；
图2：构建的pENTR SV40质粒图谱；
图3：构建的pENTR sv40-ha（H5N6）质粒图谱；
图4：构建的pENTR sv40-ha（H5N1）质粒图谱；
图5：构建的pENTR sv40-ha（H7N9）质粒图谱；
图6：构建的pFOS5 us-78/81-SV40HA质粒图谱；
图7：构建的pFOS4-lorf3/ lorf2-SV40HA质粒图谱；
图8：构建的pFOS5us-us7/8-us8/1-sorf3/us2-SV40 HA质粒图谱；
图9：鸭病毒性肠炎病毒感染性克隆拯救重组病毒示意图；
图10：重组病毒HA基因在CEF中的表达间接免疫荧光检测结果图及蛋白质印迹（western blot）检测结果图；
图11：重组病毒HA基因在CEF中的表达蛋白质印迹（western blot）检测结果图；1：接种rDEV dH5/H7-1的CEF，2：接种rDEV dH5/H7-2的CEF；3：接种DEV疫苗株的CEF；4：CEF；M:蛋白分子质量标准；（a）使用抗GZ/S4184（H5N6）血清检测HA蛋白，GADPH蛋白作为参照；（b）使用抗LN/SD007（H5N1）血清检测HA蛋白，GADPH蛋白作为参照；（c）使用抗GX/SD098（H7N9）血清检测HA蛋白，GADPH蛋白作为参照；
图12：PCR检测外源表达框架在两株重组鸭瘟病毒中的存在情况；
图13：重组病毒诱导SPF鸭HI抗体的水平；
图14：rDEV dH5/H7-1和rDEV dH5/H7-2对鸭瘟病毒强毒攻毒保护情况。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
实施例1.依照申请人前期公开的专利CN 102277367 A中的方法构建出DEV疫苗株病毒(CVCC AV1222) (GeneBank EU082088)的5个以pCC1 Fos为载体的粘粒，5粘粒分别命名为pFOS1、pFOS2、pFOS3、pFOS4、pFOS5，该5粘粒克隆所包含的DEV DNA片段两端都含有FseI-Sbf I-Pme I接头，能相互重叠，且能拼接覆盖全DEV基因组，其中pFOS1含有CVCC AV1222基因组的第1-44511位序列，pFOS2含有CVCC AV1222基因组的第38245-77308位序列，pFOS3含有CVCC AV1222基因组的第68314-109887的序列，pFOS4含有CVCC AV1222基因组的第103945-143040为序列，pFOS5含有CVCC AV1222基因组的第119308- 158091位序列（它们的重叠和覆盖模式参见图9）。
实施例2. 重组突变粘粒的构建
2.1 在DEV基因组的US7、US8基因之间的间隔区中插入SV40-HA表达框架(SEQ IDNO：1)的重组突变粘粒的构建
在所选择的5粘粒组成员pFOS5中DEV基因组的US7和US8基因之间的间隔区（SEQID NO：4）中，具体地，US7和US8基因之间的间隔区共223bp，本研究中，该间隔区缺失了其中第108至111位的四个核苷酸，代之以插入SV40-HA表达框架 (SV40-HA表达框架的核苷酸序列为SEQ ID NO：1)，构建1个重组突变粘粒，pFOS5us78 SV40 HA（该突变粘粒的图谱如图1所示）。
FOS5us78 SV40 HA粘粒的构建过程简述如下：
2.1.1 pUC ccdB kan的构建：
用表1所示的三对引物（由TaKaRa公司合成）分别对Invitrogen公司GatewayVector Conversion System with One Shot ccdB Survival 2 T1 Competent Cells试剂盒中提供的“RfA”(其中基因为aatR1-氯霉素-ccdB-aatR2)基因进行多重PCR扩增。
其具体过程简述如下：分别用tR1和tR2，以及ccdB1和ccdB2这两对引物从ReadingFrame Cassette A中扩增得到aatR1基因及ccdB- aatR2基因，其反应条件为：95℃ 5min -35*（94℃ 45s - 54℃ 45s - 72℃ 45s） - 72℃ 10min。然后用P6K1和P6K2这对引物从pMOD6质粒（购自EPICENTRE公司）中扩增到卡那霉素抗性基因，其反应条件为：95℃ 5min -35*（94℃ 45s - 54℃ 45s - 72℃ 45s） - 72℃ 10min。分别纯化这三个片段DNA，并以此三个片段共同作为模板，以tR1和ccdB2作为引物，扩增得到RfKan基因，即其基因为aatR1-卡那霉素-ccdB-aatR2，其反应条件为：95℃ 5min - 35*（94℃ 45s - 54℃ 45s - 72℃1.5min） - 72℃ 10min。
并将得到的“RfKan”片段利用XbaI和HindIII克隆入pUC18载体（购自TaKaRa公司）中，获得pUC ccdB kan。
表1：用于克隆“Rfkan”(其中基因为aatR1-卡那霉素-ccdB-aatR2)基因的PCR引物
2.1.2 pFOS5 us78 Kan ccdB粘粒的构建：
用表2所示的引物US78ccd1和US78ccd2（由TaKaRa公司合成）从上述构建的pUCccdB kan中扩增带有重组臂的ccdB基因，其PCR反应条件为：95℃ 5min - 35*（94℃ 45s -54℃ 45s - 72℃ 2min） - 72℃ 10min。用Gene Bridges公司的Counter-Selection BACModification Kit试剂盒将所扩增的片段克隆入pFOS5粘粒中，获得pFOS5 us78Kan ccdB粘粒，即在pFOS5粘粒的US7和US8基因间插入ccdB和卡那霉素抗性基因。
表2：用于从pUC ccdB kan中扩增带有重组臂的ccdB基因的引物
2.1.3 pENTR SV40质粒的构建：
为方便后续试验，本研究将Invitrogen公司Gateway Vector Conversion Systemwith One Shot ccdB Survival 2 T1 Competent Cells试剂盒中提供的pENTR-gus质粒（购自Invitrogen公司）做了以下改造：将pENTR-gus中的gus基因删除，而加入了一个带有多克隆酶切位点的SV40表达框。SV40表达框主要由SV40 Promoter、MluI、KpnI、XbaI、SalI、AccI、SmaI、NotI和SV40 polyA基因构成，如图2所示。首先用表3所示的两对引物Promoterf、Promoter r和polyA f、polyA r，通过Overlap PCR构建并扩增带有多克隆酶切位点的SV40表达框，PCR模板为pSI质粒（购自Promega公司），其中pSI质粒包含SV40 Promoter 和SV40 polyA。再用表3所示的pENTRSV40 f和pENTRSV40 r两条引物，以pENTR-gus为模板扩增载体pENTR（去掉pENTR-gus中的gus基因）。最后用BamHI（购自New England Biolabs）酶切将SV40表达框连入pENTR载体，成功构建pENTR SV40，如图2所示。
表3：用于将pENTR-gus改造成pENTR SV40的引物
2.1.4 pENTR sv40-ha（H5N6）质粒的构建：
用表4所示的引物pENTRha1和pENTRha2，扩增已缺失掉碱性裂解位点的HA基因，该HA基因来源于2017年从贵州分离的H5N6亚型禽流感病毒株（其详细名称为A/duck/Guizhou/S4184/2017 (H5N6)），由本发明人所在的国家禽流感参考实验室保存，该实验室是国内合法保存禽流感病毒的机构），也就是目前用于禽流感防治的H5N6亚型禽流感病毒的种毒HA基因。用Mlu I和Sal I（购自New England Biolabs）酶切将该已缺失掉碱性裂解位点的HA基因连入上述构建的pENTR SV40质粒中，获得pENTR sv40-ha（H5N6），如图3所示。
表4：用于构建pENTR sv40-ha（H5N6）的引物
2.1.5 pFOS5us78 SV40 HA粘粒的构建：
将pFOS5us78 Kan ccdB和pENTR sv40-ha（H5N6）利用Invitrogen公司GatewayVector Conversion System with One Shot ccdB Survival 2 T1 Competent Cells试剂盒的作用，使pENTR sv40-ha（H5N6）中的sv40-ha表达框架替换pFOS5us78 Kan ccdB中的kan ccdB基因，从而获得在US7和US8之间的间隔区中插入sv40-ha表达框（核苷酸序列为SEQ ID NO：1）的粘粒pFOS5us78 SV40 HA，如图1所示。
2.2 在pFOS5us78 SV40 HA粘粒的DEV基因组US8和US1基因之间的间隔区中插入SV40-HA表达框架(SEQ ID NO：2)的双表达框的重组突变粘粒的构建
在2.1构建的pFOS5us78 SV40 HA粘粒的DEV基因组的US8和US1基因之间的间隔区（SEQ ID NO：5）中，具体地，US8和US1基因之间的间隔区共861bp，本研究中，在该间隔区第97和98位之间插入SV40-HA表达框架 (核苷酸序列为SEQ ID NO：2)，构建1个重组突变粘粒，pFOS5 us-78/81-SV40HA（该突变粘粒的图谱如图6所示）。
pFOS5 us-78/81-SV40HA粘粒的构建过程简述如下：
2.2.1 pFOS5 us78 SV40HA-81 Kan ccdB粘粒的构建
用表5所示的引物US81ccd1和US82ccd2（由吉林库美生物科技有限公司合成）从2.1.2构建的pFOS5 us78 Kan ccdB中扩增带有重组臂的ccdB Kan基因，其PCR反应条件为：98℃ 30s - 35*（98℃ 10s - 62℃ 30s - 72℃ 1min） - 72℃ 10min。用Gene Bridges公司的Counter-Selection BAC Modification Kit试剂盒将所扩增的片段克隆入2.1构建的pFOS5us78 SV40 HA粘粒中，获得pFOS5 us78 SV40HA-81 Kan ccdB粘粒，即在pFOS5us78SV40 HA粘粒的DEV基因组的US8和US1基因之间插入ccdB和卡那霉素抗性基因。
表5：用于从pFOS5 us78 Kan ccdB中扩增带有重组臂的ccdB Kan基因的引物
2.2.2 pENTR sv40-ha（H5N1）质粒的构建：
用表6所示的引物pENTRha3和pENTRha4，扩增已缺失掉碱性裂解位点的HA基因，该HA基因来源于2017年从辽宁分离的H5N1亚型禽流感病毒株（其详细名称为A/chicken/Liaoning/SD007/2017 (H5N1)），由本发明人所在的国家禽流感参考实验室保存，该实验室是国内合法保存禽流感病毒的机构）。用Mlu I和Sal I（购自New England Biolabs）酶切将该已缺失掉碱性裂解位点的HA基因连入2.1.3构建的pENTR SV40中（Mlu I和Sal I酶购自New England Biolabs公司），获得pENTR sv40-ha（H5N1），如图4所示。
表6：用于构建pENTR sv40-ha（H5N1）的引物
2.2.3 pFOS5 us-78/81-SV40HA粘粒的构建
将pFOS5 us78 SV40HA-81 Kan ccdB和pENTR sv40-ha（H5N1）利用Invitrogen公司Gateway Vector Conversion System with One Shot ccdB Survival 2 T1 CompetentCells试剂盒的作用，使pENTR sv40-ha（H5N1）中的sv40-ha表达框架替换pFOS5 us78SV40HA-81 Kan ccdB中的kan ccdB基因，从而获得在粘粒pFOS5 us78 SV40HA-81 KanccdB的DEV基因组的US8和US1之间的间隔区的第97和98位之间插入sv40-ha表达框（SEQ IDNO:2）的双表达框粘粒pFOS5 us-78/81-SV40HA。
2.3 pFOS4-lorf3/ lorf2-SV40HA粘粒的构建
将pFOS4- lorf3/ lorf2 Kan ccdB和pENTR sv40-ha利用Invitrogen公司Gateway Vector Conversion System with One Shot ccdB Survival 2 T1 CompetentCells试剂盒的作用，使pENTR sv40-ha中的sv40-ha表达框架替换pFOS4- lorf3/ lorf2Kan ccdB中的kan ccdB基因，从而获得在LORF3和LORF2之间的间隔区中插入sv40-ha表达框（SEQ ID No:3）的粘粒pFOS4-lorf3/ lorf2-SV40HA（质粒图谱见图5），具体地，所述sv40-ha表达框架替换所述DEV基因组LORF3和LORF2之间的间隔区（SEQ ID NO：6）的第104到128位的核苷酸片段。
2.3.1 pFOS4- lorf3/ lorf2 Kan ccdB粘粒的构建
用表7所示的引物LORF3ccd1和LORF2ccd2（由吉林库美生物科技有限公司合成）从2.1.2构建的pFOS5 us78 Kan ccdB中扩增带有重组臂的ccdB Kan基因，其PCR反应条件为：98℃ 30s - 35*（98℃ 10s - 62℃ 30s - 72℃ 1min） - 72℃ 10min。用Gene Bridges公司的Counter-Selection BAC Modification Kit试剂盒将所扩增的片段克隆入pFOS4粘粒中，获得pFOS4- lorf3/ lorf2 Kan ccdB粘粒，即在pFOS4粘粒的DEV基因组的LORF3和LORF2基因之间插入ccdB和卡那霉素抗性基因。
表7：用于从pFOS5 us78 Kan ccdB中扩增带有重组臂的ccdB Kan基因的引物
2.3.2 pENTR sv40-ha（H7N9）质粒的构建：
用表8所示的引物pENTRha5和pENTRha6，扩增已缺失掉碱性裂解位点的HA基因，该HA基因来源于2017年从广西分离的H7N9亚型禽流感病毒株（其详细名称为A/chicken/Guangxi/SD098/17（H7N9）），由本发明人所在的国家禽流感参考实验室保存，该实验室是国内合法保存禽流感病毒的机构）。用Mlu I和Sal I（购自New England Biolabs）酶切将该已缺失掉碱性裂解位点的HA基因连入2.1.3构建的pENTR SV40中（Mlu I和Sal I酶购自NewEngland Biolabs公司），获得pENTR sv40-ha（H7N9），如图5所示。
表8：用于构建pENTR sv40-ha（H7N9）的引物
2.3.3 pFOS4-lorf3/ lorf2-SV40HA粘粒的构建
将pFOS4- lorf3/ lorf2 Kan ccdB和pENTR sv40-ha（H7N9）利用Invitrogen公司Gateway Vector Conversion System with One Shot ccdB Survival 2 T1 CompetentCells试剂盒的作用，使pENTR sv40-ha（H7N9）中的sv40-ha表达框架替换pFOS4- lorf3/lorf2 Kan ccdB中的kan ccdB基因，从而获得在粘粒pFOS4- lorf3/ lorf2 Kan ccdB的DEV基因组的LORF3和LORF2之间的间隔区（SEQ ID NO：6）的第104和128位之间插入sv40-ha表达框（SEQ ID No.3）的单表达框粘粒pFOS4-lorf3/ lorf2-SV40HA，如图7所示。
2.4 在pFOS5 us-78/81-SV40HA粘粒的DEV基因组SORF3和US2基因之间的间隔区中插入SV40-HA表达框架(SEQ ID NO：3)的三表达框的重组突变粘粒的构建
在2.2构建的pFOS5 us-78/81-SV40HA粘粒的DEV基因组的SORF3和US2基因之间的间隔区（SEQ ID NO：7）中，具体地，SORF3和US2基因之间的间隔区共475bp，本研究中，在该间隔区第72和88位之间插入SV40-HA表达框架 (核苷酸序列为SEQ ID NO：3)，构建1个重组突变粘粒，pFOS5us-us7/8-us8/1-sorf3/us2-SV40 HA（该突变粘粒的图谱如图8所示）。
pFOS5us-us7/8-us8/1-sorf3/us2-SV40 HA粘粒的构建过程简述如下：
2.4.1 pFOS5us-us7/8-us8/1-sorf3/us2-Kan ccdB粘粒的构建
用表9所示的引物SORF3ccd1和US2ccd2（由吉林库美生物科技有限公司合成）从2.1.2构建的pFOS5 us78 Kan ccdB中扩增带有重组臂的ccdB Kan基因，其PCR反应条件为：98℃ 30s - 35*（98℃ 10s - 62℃ 30s - 72℃ 1min） - 72℃ 10min。用Gene Bridges公司的Counter-Selection BAC Modification Kit试剂盒将所扩增的片段克隆入2.2构建的pFOS5 us-78/81-SV40HA粘粒中，获得pFOS5us-us7/8-us8/1-sorf3/us2-Kan ccdB粘粒，即在pFOS5 us-78/81-SV40HA粘粒的DEV基因组的SORF3和US2基因之间插入ccdB和卡那霉素抗性基因。
表9：用于从pFOS5 us78 Kan ccdB中扩增带有重组臂的ccdB Kan基因的引物
2.4.2 pFOS5us-us7/8-us8/1-sorf3/us2-SV40 HA粘粒的构建
将pFOS5 us78 SV40HA-81 Kan ccdB和2.3.2中构建的pENTR sv40-ha（H7N9）利用Invitrogen公司Gateway Vector Conversion System with One Shot ccdB Survival 2T1 Competent Cells试剂盒的作用，使pENTR sv40-ha（H7N9）中的sv40-ha表达框架替换pFOS5us-us7/8-us8/1-sorf3/us2-Kan ccdB中的kan ccdB基因，从而获得在粘粒pFOS5us78 SV40HA-81 Kan ccdB的DEV基因组的SORF3和US2之间的间隔区（SEQ ID NO：7）的第72和88位之间插入sv40-ha表达框（SEQ ID No.3）的三表达框粘粒pFOS5us-us7/8-us8/1-sorf3/us2-SV40 HA。
实施例3. 重组病毒的拯救
参照Reddy SM（2002）的方法，分别将pFOS1、pFOS2、pFOS3、pFOS4-lorf3/lorf2-SV40HA、pFOS5 us-78/81-SV40HA五个粘粒和pFOS1、pFOS2、pFOS3、pFOS4，pFOS5us-us7/8-us8/1-sorf3/us2-SV40 HA五个粘粒，以两种组合的形式，分别将其五个粘粒共转染次代鸡胚成纤维细胞CEF。其中各个粘粒与DEV基因组的关系如图9所示。
其中CEF的制备方法如下：取9-10日龄SPF鸡胚，用酒精棉球消毒后，用碘酊擦拭气室部位，脱碘后无菌取出鸡胚，放置到盛有Hank’s液（购自HyClone）的平皿中洗涤，并去除头、四肢和内脏，用剪刀剪碎。用0.25%的胰酶（4 mL/胚）在37℃水浴中消化4-5 min，弃去胰酶，用Hank’s液洗涤2次。加入适量的含血清与双抗生素(青霉素 100 u/mL，链霉素 100mg/mL，二者购自Sigma公司)的M199营养液（购自HyClone），吹打使细胞分散，用四层纱布过滤后制成106-107细胞/毫升的细胞悬液，最后分装于培养瓶中37℃培养。然后，参照ReddySM（2002）的方法分别将上述构建好的粘粒以两种组合形式，其中每种组合各具有包含DEV基因组的5个粘粒，共转染次代CEF，转染6-9天后可观察到细胞圆缩等典型病变的出现。拯救出2株重组病毒，由pFOS1、pFOS2、pFOS3、pFOS4-lorf3/lorf2-SV40HA、pFOS5 us-78/81-SV40HA五个粘粒拯救出的重组病毒命名为rDEV dH5/H7-1，由 pFOS1、pFOS2、pFOS3、pFOS4，pFOS5us-us7/8-us8/1-sorf3/us2-SV40五个粘粒拯救出的重组病毒命名为 rDEV dH5/H7-2，两株重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株于2023年3月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC，中国武汉，武汉大学），保藏编号分别为CCTCC V202315和V202316。
实施例4. 重组病毒HA表达免疫荧光及蛋白质印迹（western blot）鉴定
将拯救的两株重组病毒rDEV dH5/H7-1和rDEV dH5/H7-2和亲本病毒DEV分别接种次代CEF。待80%细胞出现病变时用间接免疫荧光和蛋白质印迹（western blot）检测方法检测HA基因的表达情况。
其中间接免疫荧光步骤简述如下：使用10日龄的SPF鸡胚制备CEF细胞，细胞制备24h时将其传代于T75cm2后待用，将两株重组病毒以MOI=0.01接种于传代后的CEF细胞中，同时设置空白对照。细胞培养箱培养48-72h，肉眼观察细胞病变程度70-80%时，弃掉上清，加入5ml PBS清理一遍，收集细胞及上清将其均匀地吹散开，500g离心5min，使用ddH2O将5×SDS loading buffer稀释成1×SDS loading buffer，加入600ul重悬细胞后，98℃变性10min，4℃冷却10min。结果如图10所示，两株重组病毒均能在CEF中良好的表达HA蛋白。
将蛋白点样于10%的蛋白胶中进行SDS-PAGE电泳，80V 30min待Maker分开后，150V80min。而后开始转膜，300mA 90min，将蛋白转入PVDF膜上。转膜后用PBS洗膜5min，洗1次。加入5%脱脂乳，室温，摇床缓慢封闭90分钟，PBST摇床清洗5分钟，重复1次；加入一抗，即3种AIV的HA单因子血清（1:500稀释），4℃，摇床缓慢过夜孵育，PBST摇床清洗5分钟，重复4次后弃掉液体；将FITC标记的羊抗鸡IgG二抗 进行1: 1000稀释后，37℃避光孵育1小时，PBST摇床清洗5分钟，重复4次。最后将洗好的膜放入PBST中，用红外扫膜仪拍照记录。结果如图11所示。两株重组病毒均能在CEF中稳定的表达HA蛋白。
实施例5. 遗传稳定性检测
将两株重组病毒rDEV dH5/H7-1和rDEV dH5/H7-2在CEF中连续传15代，使用总DNA提取试剂盒提取总DNA。用引物JUS78-F/ JUS78-R、JUS81-F/ JUS81-R和JLORF3-F/JLORF2-R 鉴定重组病毒rDEV dH5/H7-1中的 H5和 H7亚型 HA基因存在情况，用引物JUS78-F/JUS78-R、JUS81-F/ JUS81-R和JSORF3-F/JUS2-R 鉴定重组病毒rDEV dH5/H7-2中的 H5和H7亚型 HA基因存在情况。插入US7和US8基因之间的HA表达框鉴定所用引物为JUS78-F：5’-ACG CAA ATT ATG TCG TTG TT -3’和 JUS78-R：5’- TTG AGG TTC CGT AGT CTG G -3’；插入US8和US1基因之间的HA表达框鉴定所用引物为：JUS81-F：5’-CGAGTTCTCCGTTCCACCATA-3’和JUS81-R：5’-AAGTTGGCATTAACACAAAGCG-3’；插入LORF3和LORF2基因之间的HA表达框鉴定所用引物为：JLORF3-F: 5’- TAGACGCTAACAATGGC-3’和JLORF2-R: 5’-GACAAGCCTATACGGTA-3’；插入SORF3和US2基因之间的HA表达框鉴定所用引物为：JSORF3-F:5’-AGCTCAGGATAATCCTCC-3’和JUS2-R: 5’-GTTGTATAGCCTGTTAGC -3’，并均对其进行测序分析，未见缺失或突变的发生。
PCR鉴定结果如图12所示，表明HA基因可以一直稳定存在。
实施例6. 血凝抑制实验抗体效价（HI抗体）诱导情况
将两株重组病毒rDEV dH5/H7-1和rDEV dH5/H7-2和亲本DEV分别按105TCID50感染2周龄的SPF鸭，首次免疫后3周采用相同剂量进行二次免疫（由哈尔滨兽医研究所动物房提供，公母各5只，体重约200克）10只，每周采血，分离血清，测其血凝抑制抗体（HI抗体）。
步骤如下：于96孔血凝板中倍比稀释血清，之后加入4单位抗原（即禽流感病毒），所述抗原分别用A/duck/Guizhou/S4184/2017 (H5N6) , A/chicken/Liaoning/SD007/2017 (H5N1)和A/chicken/Guangxi/SD098/17（H7N9）毒株（由本发明人所在国家禽流感参考实验室保存）制备，室温下作用30分钟，之后加入25微升鸡红细胞（由本研究室按常规方法制备）。观察结果。
结果如图 13所示。重组病毒rDEV dH5/H7-1和rDEV dH5/H7-2免疫后第一周HI抗体效价较低，第二周即有一定数量的SPF鸭HI抗体转阳，且在免疫后第3周达到较高值，二次免疫后，抗H5N6、H5N1和H7N9亚型禽流感病毒的HI抗体水平快速升高。作为对照的用亲本DEV感染SPF鸭的HI抗体均为0。
实施例7. 动物实验
两株重组病毒rDEV dH5/H7-1和rDEV dH5/H7-2和亲本DEV分别以105TCID50免疫2周龄SPF鸭，其中DEV病毒免疫组8只；两株重组病毒rDEV dH5/H7-1和rDEV dH5/H7-2两个免疫组，各4组，8只/组（由哈尔滨兽医研究所动物房提供，每组公母各4只，体重约200克）。2周后分别用100LD50的DEV强毒(CVCC AV1222，购自中国兽医药品监察所)；和106EID50的A/duck/Guizhou/S4184/2017 (H5N6) ,A/chicken/Liaoning/SD007/2017 (H5N1)和A/Duck/FuJian/SE0195/2018（H7N2）三株流感病毒攻击（由本发明人所在的国家禽流感参考实验室保存，该实验室是国内合法保存禽流感病毒的机构），观察重组病毒对DEV强毒及流感的保护效果。
结果显示：针对鸭病毒性肠炎强毒，用重组病毒rDEV dH5/H7-1和rDEV dH5/H7-2和亲本DEV疫苗株免疫的鸭子均得到100%保护，对照组6天之内全部死亡，其结果如图14所示；针对禽流感，两株重组病毒免疫组的鸭子无死亡，无排毒，而对照组的鸭子均出现了排毒，且有死亡。其结果如表14所示。
表10：重组对流感病毒攻毒保护情况
1.本实验使用了2周龄的SPF鸭。如表所示，用105TCID50 rDEV dH5/H7-1和rDEVdH5/H7-2免疫SPF鸭，并用PBS作为对照。然后在接种后2周用106EID50的GZ/S4184（H5N6）、LN/SD007(H5N1)和FJ/SE0195(H7N2)进行鼻内攻击。
2.在感染后第3天、第5天或第7天从所有存活的鸭子中收集拭子，用于鸡胚中的病毒滴定。显示的滴度是感染病毒的鸭子的平均值±标准差。“/”表示动物在该时间点死亡。
Claims (7)
1.鸭瘟病毒重组株（Duck virusenteritis Recombinant strain）rDEV dH5/H7-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202315。
2. 权利要求1所述的rDEV dH5/H7-1在制备预防或治疗鸭病毒性肠炎病毒或禽流感病毒导致的鸭疾病的疫苗或药物中的用途。
3. 鸭瘟病毒重组株（Duck virusenteritis Recombinant strain）rDEV dH5/H7-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202316。
4. 权利要求3所述的rDEV dH5/H7-2在制备预防或治疗鸭病毒性肠炎病毒或禽流感病毒导致的鸭疾病的疫苗或药物中的用途。
5. 一种疫苗，含有权利要求1所述的rDEV dH5/H7-1或权利要求3所述的rDEV dH5/H7-2。
6.构建鸭瘟病毒重组株的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）构建包含鸭病毒性肠炎病毒DEV基因组的粘粒组合，
（2）在相应粘粒中对应鸭病毒性肠炎病毒DEV基因组的US7与US8基因之间的间隔序列中插入SEQ ID No:1所示核苷酸序列的HA抗原表达框，在US8与US1基因之间的间隔序列中插入SEQ ID No:2所示核苷酸序列的HA抗原表达框，在LORF3与LORF2之间的间隔序列中或SORF3与US2基因之间的间隔序列中插入SEQ ID No:3所示核苷酸序列的HA抗原表达框，得到重组突变粘粒；
（3）将重组突变粘粒与步骤（1）的未重组粘粒一起转染宿主细胞，拯救获得鸭瘟病毒重组株。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述US7与US8基因之间的间隔序列如SEQID No:4所示，US8与US1基因之间的间隔序列如SEQ ID No:5所示，LORF3与LORF2之间的间隔序列如SEQ ID No:6所示，SORF3与US2基因之间的间隔序列如SEQ ID No:7所示。
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